Volltext

Intraoperative autologe Tumorzellvakzination
in die Milz oder subcutan im Maus Tumormodell
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
Dr. med.
an der Medizinischen Fakultät
der Universität Leipzig
eingereicht von:
Susan Schürer geb. Endesfelder / 15.11.1979 / Burgstädt
angefertigt an der:
Universitätsklinik Leipzig, Klinik und Poliklinik für Viszeral-, Transplantations-,
Thorax- und Gefäßchirurgie (komm. Direktoren PD Dr. Michael Bartels/Prof. Dr. Uwe
Eichfeld)
Betreuer: Prof. Dr. med. Arne Dietrich
Beschluss über die Verleihung des Doktorgrades vom: 21.04.2015
Bibliographische Beschreibung:
Schürer, Susan
Intraoperative autologe Tumorzellvakzination in die Milz oder subcutan im Maus
Tumormodell
Universität Leipzig, Dissertation
76 S., 109 Lit., 21 Abb., 8 Tab.
Referat:
In dieser Arbeit wurde in einem Maus Tumormodell untersucht, ob durch eine
intraoperative Vakzination mit gentechnisch modifizierten autologen Tumorzellen ein
antitumoraler Effekt erzielt werden kann.
Das Experiment erfolgte mit zwei Tumorzelllinien (B16 Melanom und Lewis Lung
Karzinom). Nach Implantation der Tumorzellen in C57/BL 6 Mäuse wurden diese
chirurgisch entfernt. Intraoperativ erhielten die Mäuse eine Vakzination. Dazu wurden
folgende
Impfstoffe
verwendet:
1.
subletal
bestrahlte
mIL-12
transfizierte
Tumorzellen, 2. subletal bestrahlte pRSC transfizierte Tumorzellen und 3.
frostgeschockte Tumorzellen. Die Impfung erfolgte entweder subcutan oder direkt in
die Milz. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass eine Injektion in die Milz und eine
Modifikation mit IL-12 den besten Effekt erzielt. Eine Kontrollgruppe blieb ohne
Vakzin.
Beobachtet
makroskopischen
wurde
das
Wiederauftreten
Tumorwachstum,
der
eines
Überlebenszeit
Tumors,
Zeitpunkt
bis
und
zum
die
Metastasierungsrate.
Versuchstiere ohne Rezidivtumor erhielten erneut einen Tumor. Es erfolgte eine
erneute Evaluation des Tumorwachstums, des Zeitpunktes bis zum makroskopischen
Wiederauftreten eines Tumors, der Überlebenszeit und der Metastasierungsrate.
In beiden Tumorzelllinien profitierten alle Therapiegruppen nach Tumorresektion und
Vakzination
bezüglich
Tumorrezidivrate,
Zeit
bis
zum
makroskopischen
Wiederauftreten
des
Tumors,
Überlebenszeit,
Metastasierungsrate
und
Tumorwachstumsgeschwindigkeit gegenüber der Kontrollgruppe. Vereinzelt konnten
signifikante Vorteile für die direkt in die Milz applizierte Vakzine bezüglich der
Tumorwachstumsgeschwindigkeit aufgezeigt werden. Weiterhin ergab sich eine
geringere Tumorrezidivrate, wenn IL-12 modifizierte autologe Tumorzellen nach R0
Resektion direkt in die Milz appliziert wurden.
Auch
nach
Tumorreimplantation
konnte
bezüglich
Überlebenszeit
und
Tumorwachstumsgeschwindigkeit ein Vorteil für alle Therapiegruppen gegenüber der
Kontrollgruppe herausgearbeitet werden.
Nach Impfung in die Milz zeigte sich tendenziell eine geringere Metastasierungsrate.
Intraoperative autologe Tumorzellvakzinationen konnten im Tiermodell in einem
adjuvanten Setting einen antitumoralen Effekt auslösen. Möglicherweise kann diese
Art der Impfung eine zusätzlich hilfreiche Behandlungsform zu den bisherigen
adjuvanten Chemotherapeutika werden.
Meiner Familie
Inhaltsverzeichnis
1.
Einleitung ............................................................................................................ 1
1.1 Onkogenese und Tumorimmunität ................................................................. 1
1.2 Immuntherapie von Malignomen .................................................................... 3
1.3 Antikörper und Zytokine bei systemischer Immuntherapie............................. 4
1.4 Interleukin 12 ................................................................................................. 5
1.5 Autologe Tumorzellvakzination ...................................................................... 5
1.6 Gentherapie ................................................................................................... 6
1.7 Vektoren ........................................................................................................ 7
1.8 Die Helios Gene Gun ..................................................................................... 8
1.9 Impflokalisation und Impfzeitpunkt ................................................................. 9
1.10 Die Milz ....................................................................................................... 10
1.11 Fragestellung .............................................................................................. 11
2.
Material und Methoden..................................................................................... 12
2.1 Herstellung der Vakzine ............................................................................... 13
2.2 Patronenherstellung für die Helios Gen Gun und in vito Transfektion.......... 14
2.3 Versuchsablauf ............................................................................................ 15
2.4 Überlebenszeitanalyse................................................................................. 17
2.5 Histologie ..................................................................................................... 18
2.6 Statistische Erhebung .................................................................................. 19
3.
Ergebnisse Experiment Maus Tumor Modell Melanom ................................. 21
3.1 Ergebnisse der Überlebenszeitanalyse ........................................................ 21
3.2 Ergebnisse nach Tumorresektion und Vakzination ...................................... 22
3.2.1 Unabhängig vom R-Status ................................................................. 22
3.2.2 Ergebnisse nach R0-Resektion ......................................................... 26
3.2.3 Ergebnisse nach R1/2-Resektion ...................................................... 31
3.3 Ergebnisse nach Tumorreimplantation ........................................................ 33
4.
Ergebnisse Experiment Maus Tumormodell Lewis Lung Karzinom ............ 37
4.1 Ergebnisse der Überlebenszeitanalyse ........................................................ 37
4.2 Ergebnisse nach Tumorresektion und Vakzination ...................................... 38
4.2.1 Unabhängig vom R-Status ................................................................. 38
4.2.2 Ergebnisse nach R0-Resektion ......................................................... 40
4.2.3 Ergebnisse nach R1/2-Resektion ...................................................... 43
4.3 Ergebnisse der Überlebenszeitanalyse nach Tumorreimplantation ............. 46
5.
Ergebniszusammenfassung ............................................................................ 50
5.1 Ergebnisse Melanom ................................................................................... 51
5.2 Ergebnisse Lewis Lung Karzinom ................................................................ 52
6.
Diskussion ........................................................................................................ 54
7.
Zusammenfassung ........................................................................................... 60
8.
Anhänge und Verzeichnisse ............................................................................ 62
8.1 Literaturverzeichnis ...................................................................................... 62
8.2 Abbildungsverzeichnis ................................................................................. 72
9.
Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit .............................. 73
10. Lebenslauf......................................................................................................... 74
11. Danksagung ...................................................................................................... 76
Einleitung
1. Einleitung
1.1
Onkogenese und Tumorimmunität
Die Tumorentstehung ist gekennzeichnet durch ein multifaktorielles Geschehen,
welches noch nicht völlig erklärt werden kann. (29, 88)
Es ist jedoch allgemein akzeptiert, dass die Krebsentstehung das Ergebnis eines
mehrstufigen Prozesses auf der Basis von vorbestehenden genetischen Defekten
und Veränderungen (z.B. Mutation, Deletion, Chromosomentranslokationen) ist. Bei
Akkumulation
dieser Prozesse
kann
es,
beim
Fehlen
von
verschiedenen
Reparaturmechanismen, zur Entartung der Zelle kommen. Der Übergang von einer
normalen Zelle zu einer Tumorzelle (maligne Transformation) ist durch einen
zunehmenden Verlust der Zelldifferenzierung gekennzeichnet.
Ein gängiges Modell zur Beschreibung der Entwicklung von Tumoren ist das
Mehrstufenmodell der Tumorgenese nach Schirrmacher (88). Es erfolgt die
allgemeine Untergliederung in Initiation, Promotion und Progression. In der
Initiationphase, dem ersten Schritt der Onkogenese, entstehen aus normalen Zellen
durch irreversible Schädigung des genetischen Materials potentielle Tumorzellen, die
sich phänotypisch nicht von den umliegenden, normalen Zellen, unterscheiden. In
der Promotionsphase proliferiert die initiierte Zelle zu einem morphologisch
erkennbaren, präneoplastischen Zellklon (benigner Tumor). Im letzten Schritt, der
Progressionsphase, wird die Umwandlung des benignen Tumors zum malignen
Tumor
beschrieben
und
die
Fähigkeit
der
Metastasierung
(Primär-
und
Sekundärtumor). Es wird angenommen, dass der Übergang von der Promotions- in
die Progressionsphase durch eine veränderte Genexpression ausgelöst wird. Die
irreversible DNA-Schädigung in der Initiationsphase beruht auf einer Kumulation
genetischer Mutationen durch Einwirkung von exogenen und endogenen Faktoren.
Umwelteinflüsse (UV-Strahlung, ionisierte Strahlung), bestimmte Viren und eine
große Anzahl von karzinogenen Substanzen können nach heutigem Wissen DNA
Läsionen auslösen. Kanzerogene Substanzen sind z.B. polyzyklische aromatische
Kohlenwasserstoffe, Nitrosamine, oder auch epigenetische Karzinogene wie Dioxine,
Phtalate, Östrogene oder Asbest.
1
Einleitung
Die Manifestation der DNA-Läsion und der daraus resultierenden malignen
Transformation hängt im Wesentlichen von Abwehr- und Reparaturmöglichkeiten auf
zellulärer Ebene ab.
Im Laufe der Evolution konnte sich keine spezielle antitumorale Immunität
entwickeln.
Immunreaktionen
gegen
Tumore
werden
der
T-Zell-vermittelten
Immunantwort zugeordnet. Die Art der Immunreaktion wird jedoch nur bis zu einer
gewissen Qualität gegenüber der Tumorzelle wirksam, die oft nicht ausreicht, um
diese zu vernichten (106).
Das Immunsystem besitzt unspezifische und spezifische Abwehrmechanismen zur
Erkennung tumorspezifischer Antigene (TSA) und tumorassoziierter Antigene (TAA).
Zu den spezifischen Immunreaktionen gehören die zellulären und humoralen
Abwehrmechanismen (85).
Die zelluläre Immunität wird von zytotoxischen T-Zellen, Natürlichen Killerzellen (NKZellen) und von Makrophagen vermittelt. Diese können spontan atypische Zellen
zerstören. Die zytotoxische Wirksamkeit der NK-Zellen wird durch die Interleukine
IL-2, IL-12 und INF-gamma erhöht.
Die humorale Immunität beginnt mit einer Antikörperreaktion, durch die anschließend
das Komplementsystem aktiviert wird. Nach Lyse erfolgt die Opsionierung und
Phagozytose durch die Zellen des retikuloendothelialen Systems.
Tumorzellen sind in der Lage, sich der Kontrolle des Immunsystems zu entziehen
(„tumor escape mechanismen“). Dies kann auf verschieden Wegen erfolgen (85).
Beispielsweise:
1. Durch keine oder nur geringe Antigenität.
2. Durch Immuntoleranz (einem Überangebot (Hochzonentolerant) oder einer
kontinuierlichen Präsentation niedriger Antigendosen (Niedrigzonentoleranz).
3. Durch das Fehlen von Oberflächenrezeptoren zur Antigenerkennung.
4. Durch Sekretion immunsuppressorischer Substanzen.
5. Anergie
oder
Suppression
Tumorerkrankung
im
der
Rahmen
Immunsystems
der
Kachexie
(bei
mit
fortgeschrittener
einer
zusätzlichen
Schwächung der Immunsystems, dem sogenannten „burn out“ (85, 88, 89,
106).
2
Einleitung
1.2
Immuntherapie von Malignomen
Gute Ergebnisse wie die Behandlung von Infektionskrankheiten mittels Impfung, z.B.
zur
Aktivierung
des
Immunsystems,
blieben
bis
jetzt
im
Bereich
der
Malignombekämpfung weitgehend aus. In fortgeschrittenen Tumorstadien kommen
klassische Therapieoptionen oft an ihre Grenzen des Möglichen und führen zu
unbefriedigenden Ergebnissen.
Dies regt die Wissenschaft zur weiteren intensiveren Suche nach alternativen
Therapieoptionen wie zum Beispiel im Bereich der Gen- und Immuntherapie an.
Erste
Versuche
die
Kräfte
des Immunsystems
zur
Bekämpfung
maligner
Tumorerkrankungen zu nutzen, gab es schon gegen Ende des 19. Jh. (82). Die
Geschichte der klinischen Erprobung von Immuntherapieverfahren wurde stets durch
den Wissensstand um die zellulären und molekularen Interaktionen zwischen
Tumorzellen und Immunsystem bestimmt. Rückschläge in diesem Bereich lassen
sich im Nachhinein durch die komplexen Zusammenhänge zwischen Tumor und Wirt
erklären. Zu den derzeit größten Fortschritten gehört beispielsweise die HybridomTechnologie, bei der es möglich wird, monoklonale Antikörper herzustellen.
Bereits
seit
zwei
Jahrzehnten
kommen
Immuntherapieverfahren
in
der
Tumortherapie zum Einsatz. Beispielsweise ist die Verwendung von Antikörpern, die
gegen tumorassoziierte Antigene gerichtet sind, zur Therapie von Lymphomen,
Leukämien, Mammakarzinomen, kolorektalen Karzinomen oder Kopf-Hals-Tumoren
in Kombination mit konventionellen Verfahren möglich (85).
Die prophylaktische Impfung Gesunder kann das Auftreten virusbedingter Malignome
verhindern. Die Impfung gegen HPV 16 und 18 vermindert das Risiko, an einem
Zervixkarzinom zu erkranken. Ein geeigneter Impfstoff ist seit 2006 zugelassen.
Die Impfung mit Tumorantigenen bei bereits eingetretener Erkrankung konnte bisher
noch nicht in die Standardtherapie aufgenommen werden. Die erhoffte Effektivität
dieser Form der Impfung konnte an nur wenigen Beispielen belegt werden.
Die heutigen Kenntnisse in diesem Bereich ermöglichen es, weitere, noch bessere
immunologische Therapiekonzepte zu entwickeln.
3
Einleitung
1.3
Antikörper und Zytokine bei systemischer Immuntherapie
Die Immuntherapie von Karzinomen beschäftigt sich mit der Suche nach der
optimalen
Immunantwort
für
entartete
Zellen,
da
humorale
und
zelluläre
Immunantworten, sofern sie stattgefunden haben, im Krebspatienten oft nicht
ausreichen, um das Tumorwachstum zu verhindern. Ziel der Immuntherapie ist eine
Verbesserung der Präsentation von Tumorantigenen für Immunisierungszwecke oder
die Entwicklung effektiverer und zielgenauere Antikörper gegen Tumorzellen.
Zunehmenden Stellenwert gewinnt die Therapie mit spezifischen Antikörpern. Das
erste eingesetzte Präparat war Panorex (Edrecolomab), welches ein muriner
Antikörper gegen das Oberflächenglykoprotein 17-1 A ist (3). Häufig exprimiert wird
dieser beim Kolonkarzinom. Bei nur begrenzter Ansprechrate ergaben sich Nachteile
aus den Nebenwirkungen. Dies konnte damit begründet werden, dass es sich um
keinen humanen Antikörper handelt und dass dieses Antigenepitop auch auf anderen
epithelialen
Zellen
exprimiert
wird
(76).
Neuere
Präparate
wie
Herceptin
(Trastuzumab) bei HER2 exprimierenden Mammakarzinom zeigen bei weniger
Nebenwirkung bessere klinische Effekte (50, 101).
Die systemische Gabe von Zytokinen führt zu einer Aktivierung des Immunsystems.
Die palliative Gabe von IL-2, IL-12 oder INF-alpha auch in Kombination mit autologen
Tumorlysaten
konnten
sich
im
klinischen
Alltag
beim
Melanom
oder
Nierenzellkarzinom etablieren (23, 24), nicht jedoch als adjuvante Therapie (63).
Weitere Therapieansätze befinden sich im tierexperimentellen Stadium. Kishida
verabreicht Expressionsplasmide für IL-21 und IL-15 intravenös bei einem
Lymphommodell der Maus und konnte damit gute Therapieeffekte erzielen (46). Ein
weiteres Beispiel von Heinzerling zeigt einen guten Effekt beim Melanommodell der
Maus nach intramuskulärer Injektion von Genen, die für IL-12 kodieren. Die
systemischen Nebenwirkungen waren sehr gering (36).
Der Vorteil der lokalen Immuntherapie ist das geringe Auftreten von systemischen
Nebenwirkungen. In vielen Versuchen wird der lokale, auch intratumorale,
Gentransfer mit den Genen für die Interleukine IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, INFgamma und GM-CSF verwendet. Meist handelt es sich dabei um Monotherapien,
zunehmend rücken jedoch Kombinationen zweier Gene in den Mittelpunkt.
Insbesondere wurden Versuche mit IL-2 oder IL-12 durchgeführt, da diese eine
4
Einleitung
wichtige Funktion bei der Aktivierung der zellulären Abwehr einnehmen (14, 30, 31,
102).
1.4
Interleukin 12
IL-12 ist strukturell ein Heterodimer, das aus zwei Untereinheiten von 35 kDa und 40
kDa besteht. Es wird überwiegend von Makrophagen, dentritischen Zellen und BLymphozyten synthetisiert und stellt ein wichtiges Bindeglied der Immunregulation
dar. Seine biologische Hauptwirkung besteht darin, T-Zellen und NK-Zellen zu
aktivieren, insbesondere die Zytokinproduktion (INF- gamma) zu steigern. Bei der THelferzell-Subpopulation bewirkt IL-12 eine Verstärkung der Th1-Zellaktivierung und
eine Inhibition der Th2-Zellen. Th1-Zellen wirken gegen intrazelluläre Erreger wie
Viren und bestimmte Bakterien. Die Th1-Zellen gehören zur zellulären Abwehr und
weisen tumorspezifische zytotoxische Eigenschaften auf. IL-12 wird als Adjuvanz für
Krebsimpfstoffe durchaus empfohlen. In Tierexperimenten konnte ein direkter
antitumoraler Effekt nachgewiesen werden (80, 95). Uekusa konnte zeigen, dass
nach Tumorzellvakzination in Mäusen und Behandlung mit anti IL-12 eine TZellinfiltration in den Tumoren ausblieb, im Gegensatz dazu eine T-Zellinfiltration
auftrat ohne anti IL-12 (99).
1.5
Autologe Tumorzellvakzination
Maligne Tumore weisen verschiedene tumorassoziierten Antigenen (TAA) auf. Die
Sicherheit, dass alle Tumorzellklone und somit alle potentiellen Antigene in einem
Impfstoff enthalten sind, bietet die frische „whole cell“ Tumorzellvakzine. Das heißt,
die Herstellung erfolgt direkt aus dem Tumor, autolog, ohne zwischenzeitliche
Zellkultur.
Noch nicht geklärt ist, ob die Verabreichung allogener Tumorzellen und die
theoretisch
zu
erwartende
additive
Abstoßungsreaktion
Vorteile
gegenüber
autologen Impfstoffen bietet (2). Der Vorteil bei allogenen Impfstoffen ist die
Möglichkeit, diese labortechnisch in relativ großen Mengen herzustellen und dadurch
gut standardisierte Bedingungen für klinische Studien zu schaffen (7). Ihr Nachteil
liegt in der geringen bis fehlenden Spezifität gegenüber dem individuellen Tumor. Die
Herstellung autologer „individueller“ Tumorzellvakzine ist dagegen immer mit einem
erheblichen Personal- und Laboraufwand verbunden. Bei geplanter wiederholter
5
Einleitung
Impfung mit einem vitalen Impfstoff nach einer Operation mit Tumorzellentnahme ist
eine Zellkultur unumgänglich.
Die Wirksamkeit autologer Tumorzellvakzine wurde in vielen Tierexperimenten
untersucht. Dabei kristallisieren sich zwei Modelle heraus. Zum einen die primäre
Vakzination
mit
anschließender
Tumorimplantation
und
Untersuchung
der
Anwachsrate von Tumoren. Ge z.B. zeigte in einem Lebertumormodell der Maus,
dass durch Vakzination mit IL-2 und B7.1 (CD80) modifizierten Tumorzellen die
Tumoranwachsrate geringer war (30). Die Kombination beider Gene war dabei
vorteilhafter als nur ein Gen. Ähnliches konnte auch beim Ovarialkarzinom
beobachtet werden mit B7.1 und Interferon-gamma (78). Ein anderes Modell
erscheint
praxisrelevanter,
wenn
erst
nach
Tumorimplantation
und
(ggf.
Tumorresektion) eine Vakzination erfolgt. Nishitani et al. (70) zeigten in ihren
Versuchen nach Tumorimplantation und subcutaner Vakzination (mit IL-12 und
autologen
Tumorzellen)
eine
Tumorregression
und
verlängertes
Überleben
gegenüber der Kontrollgruppe. In zahlreichen humanen Studien werden die
Erkenntnisse aus den tierexperimentellen Studien weitergeführt. Beispiele dafür sind
Slingluff mit einer Phase II Studie beim Melanom oder Nagayama mit seinem
Versuch einer Vakzination mit dentritischen Zellen, die vorher mit einem autologen
Tumorlysat inkubiert wurden (68, 82). Auch Schirrmacher (90) sammelte in einem
Review zahlreiche Phase II Studien von virusmodifizierten autologen Tumorzellen in
verschiedenen Enitäten. Viele der Autoren konnten in ihren Untersuchungen positive
Effekte für diese Methode aufzeigen ohne nennenswerte Nebenwirkungen.
1.6
Gentherapie
Die Identifizierung molekulargenetischer Grundlagen zahlreicher Erkrankungen hat
dazu geführt, dass auch auf therapeutischer Seite gezielt gegen diese bekannten
Aberrationen Strategien entwickelt wurden (38). Die Entwicklung derartiger neuer
Therapieformen
auf
molekulargentischer
Basis
wird
zusammenfassend
als
Gentherapie bezeichnet (38). Das Prinzip der Gentherapie ist, funktionierende Gene
in Zellen einzubringen, um defekte oder fehlende Gene zu ersetzen, defekte Gene
auszuschalten oder eine Überexpression zu bewirken.
Die Geschichte der Gentherapie ist noch relativ jung. Anfang der 80iger Jahre
führten
wissenschaftliche
Arbeiten
zu
der
Erkenntnis,
dass
komplexe
Krankheitsbilder auf den Ausfall von bestimmten Genen zurückzuführen seien
6
Einleitung
könnten (z.B. Thalassämie). 1981 wurde dann der erste virale Vektor beschrieben,
der dazu genutzt wurde, defekte Gene in Zellen durch intakte Gene zu ersetzen oder
auch neue Gene einzusetzen. Ende der 80iger Jahre wurden dann erste
Genmarkierungsuntersuchungen durchgeführt (38). Auf diesem Weg kann man
beispielsweise Lymphozyten markieren, bevor sie in den Tumor einwandern und auf
diese Art eine Immunreaktion gegen den Tumor auslösen (38).
Die Gentherapie insgesamt ist ein sehr heterogenes Gebiet, dennoch kann man zwei
große Bereiche unterscheiden. Ein Bereich beschäftigt sich mit der Addition von
Genen, z.B. der Substitution defekter Tumorsuppressorgene, also der Gene, die ein
Tumorwachstum verhindern sollen. Der Ausfall z.B. des Tumorsuppessorgens p53
oder des Retinoblastom (Rb)-Gens ist häufig ein wichtiger Schritt in der
Tumorentstehung (49).
Auch eine Überexpression von Genen kann als Therapie dienen, um beispielsweise
das Immunsystem gezielt zu stimulieren, zur besseren Bekämpfung von Tumorzellen
(49). Weiterhin kann man gentechnisch eine gezielte Induktion der Apoptosen
einleiten, auf diesem Weg sollen Tumorzellen ausgeschaltet werden. Dies geschieht
über die Expression eines Suizidgens im Tumor.
Der zweite große Bereich beschäftigt sich mit dem gezielten Ausschalten von Genen.
Dabei handelt es sich um Gene, die zu stark exprimiert werden und zur
Tumorentstehung führen (z.B. erb2B-Gen).
1.7
Vektoren
Unter Vektoren versteht man ein Transportvehikel zur Übertragung von FremdNukleinsäure (DNA oder RNA) in eine lebende Empfängerzelle.
Als Vektoren können verschiedene Vehikel dienen, wie z.B. Plasmide oder
modifizierte Viren (Adenoviren, Retroviren). Nachteil der viralen Vektoren ist deren
eigene Antigenität, die eingeschränkte Transportkapazität, eine nicht sicher
einschätzbare Transfektionseffizienz und das Rekombinationsrisiko der Viren (23).
Die einfachste Transfektion ist die Injektion der nackten DNA in das Gewebe
(Plasmid). Nachteil hierbei ist die geringe Aufnahme in die Zelle und der relativ
schnelle Abbau. Weiterhin gibt es die effektiveren Methoden der chemischen und
physikalischen Transfektion. Bei der chemischen Methode werden Plasmide mit Hilfe
von kationischen Lipiden in die Zielzelle eingeschleust. Die Effektivität dieser
Lipotransfektion ist jedoch abhängig von der Zielzelle.
7
Einleitung
Der ballistische Gentransfer unter der Verwendung einer Genkanone zählt zu den
physikalischen Methoden. Dabei werden die Plasmide an mikroskopisch kleine
Goldpartikel geheftet und in die Zielzelle geschossen, ohne diese zu zerstören. Auch
bei dieser Methode ist der relativ schnelle intrazelluläre Abbau der Fremd-DNA zu
beobachten.
Vorteile
Nichtvorhandensein
bieten
von
die
Antigenität
einfache
und
Wiederholbarkeit
Toxizität
der
und
Partikel.
das
Eine
Transfektionseffizienz wie bei viralen Vektoren kann jedoch nicht erreicht werden
(12, 72, 82).
Der ideale Vektoren sollte folgende Eigenschaften besitzen:
1. Keine Pathogenität
2. Keine Antigenität
3. Hohe Transportkapazität
4. Hohe Transfektionseffektivität
5. Möglichkeit des selektiven Einbringens in eine bestimmte Zelle
6. Lange Expressionsdauer
1.8
Die Helios Gene Gun
Beim Gentransfer mit der Genkanone handelt es sich um ein physikalisches
Verfahren, welches 1987 erstmals von Sanford zur Transfektion von Pflanzenzellen
beschrieben wurde (81). Die DNA wird dabei an mikroskopisch kleine Goldpartikel
geheftet (0,6-1,6µm). Gold ist ein inertes Metall ohne lokale und systemische
Toxizität (23). Die beladenen Partikel werden von der inneren Oberfläche eines
beschichtetem Plastikröhrchens mit einem Heliumdruckimpuls (500 psi) beschleunigt
und in die Zielzelle geschossen (60, 97). Die DNA gelangt so in das Zytoplasma oder
direkt in den Zellkern und wird dort von den Goldpartikeln abgestreift.
Der konische Lauf der Genkanone dient dazu, die Zielfläche in einem definierten
Umfang zu vergrößern. Der sogenannte Spacer auf dem Lauf der Genkanone
ermöglicht die Einhaltung eines definierten Abstandes und eine Reduktion des
Gasimpulses an der Zieloberfläche. Die Trefferfläche der Genkanone entspricht
einem Kreis von 1,5 cm Durchmesser. Die Infiltrationstiefe bei einer in vivoTransfektion beträgt 0,2 mm und bis zu 0,9 mm bei nekrotischen Gewebe (86).
8
Einleitung
In zahlreichen Untersuchungen konnte die Transfektionseffektivität dieser Methode
bestätigt werden (18, 47, 70, 72, 80, 81, 94). Transgene Zytokine werden am
effektivsten am 3. und 4. Tag nach Transfektion exprimiert (47, 79, 80).
Abbildung 1: Helios gene gun (Campbell, Malcolm "The Helios gene gun by BioRad." 2001)
1.9
Impflokalisation und Impfzeitpunkt
Je nach Impfstoff und Immunisierungsart (passiv oder aktiv) werden verschiedene
Applikationsformen angewandt. Man unterscheidet intradermale, subcutane oder
intramuskuläre
Injektionen
(24,
47,
87).
In
Tierversuchen
wurden
auch
intraperitoneale, intravenöse oder auch eine direkte Applikation in lymphatische
Strukturen wie den Lymphknoten oder die Milz beschrieben. Über die Wirkung der
Impfung nach unterschiedlicher Darreichungsform gibt es sehr wenige Informationen
in der Literatur. Bekannt ist jedoch, dass der Impfstoff einen zügigen Kontakt mit dem
lymphatischen System haben sollte, um eine Immunreaktion auszulösen. In einem
Maus-Tumor-Modell mit einem radioaktiv markierten Melanom B16 Impfstoff wurde
deutlich, dass nach intravenöser Applikation des Impfstoffs ein rasches Anfluten in
gut vaskularisierten Organen wie Lunge, Leber und Nieren zu beobachten war. Nach
48 Stunden erfolgte eine sekundäre Anreicherung in die Milz (26). Nach subcutaner,
intramuskulärer und intraperitonealer Impfung wurde eine Anreicherung in der TZellregion von lokalen Lymphknoten beobachtet. Gegenüber der intravenösen
Applikationsart hatte die subcutane und intraperitoneale Impfung einen Vorteil
bezüglich des Tumorwachstums. Daraufhin erfolgten Versuche mit direkter
Applikation in die Lymphknoten oder die Milz (52). Nach Injektion in die Milz
9
Einleitung
benötigte man nur 0,005% des Impfstoffes im Vergleich zur subcutanen Applikation,
um eine T-zelluläre Immunantwort auszulösen. Ursachen liegen sicher in dem
reichlichen Vorhandensein von antigenpräsentierenden Zellen in der Milz und der
Reaktivität der T-Lymphozyten.
Der hohe Umsatz an T-Zellen, die differenzierte Organstruktur, die eine sequenzielle
Exposition der Antigene an den entsprechenden Strukturen ermöglicht, und das
Vorkommen co-stimulatorischer Moleküle machen lymphatische Organe zu einem
geeigneten Ort für Impfungen (52).
Eine Vakzination von Tumorzellen wird gewöhnlich im Intervall postoperativ
durchgeführt. Normale Impfungen sollten generell im Wochenabstand ohne Stress,
wie dem einer Operation, erfolgen. Der Grund dafür liegt in einer geringeren
Ansprechrate
und
erhöhtem
Nebenwirkungsrisiko
(12,
19,
65).
Bei
einer
postoperativen Vakzination ergeben sich Nachteile durch die Lagerung der Zellkultur
und dem damit verbundenen Verlust der Polyklonalität der Tumoren. Wichtiges
antigenes Material geht verloren. Zudem kommt es mit steigender Zahl der
Zellpassagen zur Veränderung in der Genexpression, was einen möglichen EpitopShift auf den Tumorzellen bewirkt. Bisher liegen nur wenig Daten zur intraoperativen
Tumorzellimpfung vor (23, 93).
1.10 Die Milz
Die Milz gehört zu den Organen des lymphatischen Systems. Die Aufgabe der Milz
ist
vielseitig,
neben
Hämofiltration,
Ersatzerythropoese,
Blutmauserung
und
Eisenspeicherung hat sie weiterhin wichtige Funktionen in der immunologischen
Abwehr von Antigenen. Hierbei spielen B-, T-Lymphozyten und Makrophagen eine
entscheidende Rolle. Bei angeborener Asplenie kommt es zu einer verringerten
Primärantwort.
Die Milz ist ein zellreiches parenchymatöses Organ, welches aus 2 unterschiedlichen
Kompartimenten besteht, der roten und weißen Pulpa. Die weiße Pulpa besteht aus
den
periarteriellen
Lymphozytenscheiden
und
den
Milzfollikeln.
Die
Lymphozytenscheiden bestehen vorwiegend aus T-Zellen und eingestreuten
dentritischen Zellen. Nach Antigenkontakt kommt es zu einer regen Proliferation von
Immunoblasten und später von Plasmazellen. Die Milzfollikel beherbergen vor allem
B-Lymphozyten und B-Immunoblasten, T-Helferzellen, dentritische Zellen und
Makrophagen.
10
Einleitung
Die rote Pulpa besteht aus dem Milzretikulum, einem Maschenwerk aus
fibroblastischen und histiozytären Retikulumzellen, sowie retikulären Fasern. In den
verdichteten Maschen der Pulpastränge sind alle Arten von Blutzellen (Erythrozyten,
Granulozyten u.a.) sowie Makrophagen und Plasmazellen (B-Zellen) vorhanden (84).
1.11 Fragestellung
Tumorzellvakzinationen erfolgten in bisherigen Untersuchungen meist subcutan im
postoperativen Intervall. Für die polyklonalen Tumorzellen bedeutet dies einen
langen Weg über Zellkulturen und den möglichen Verlust vieler Klone des Tumors.
In
der
vorliegenden
Arbeit
wird
ein
möglicher
antitumoraler
Effekt
nach
intraoperativer autologer Tumorzellvakzination untersucht. Bei der Vakzine handelt
es sich um einen im stand-by hergestellten whole-cell-Impfstoff. Das heißt, die
Impfstoffherstellung erfolgt noch während der Operation aus dem resezierten Tumor,
mit dem Ziel, möglichst alle Klone des Tumors zu erhalten.
Weiterhin soll festgestellt werden, ob eine autologe Tumorzellvakzination direkt in die
Milz effektiver ist als eine subcutane Impfung. In Voruntersuchungen mit geringer
Fallzahl konnte gezeigt werden, dass es zu einer vermehrten Aktivierung des
Immunsystems nach Vakzination eines mit IL-12 modifizierten Impfstoffes direkt in
die Milz kommt. (93)
In dieser weiterführenden Arbeit soll dieser Effekt in größerer Fallzahl und mit einer
zweiten Tumorzelllinie untersucht und herausgearbeitet werden. Dabei kommen ein
gentechnisch mit IL-12 transfiziertes Vakzin, frostgeschockte Tumorzellen und ein
Vakzin mit einem Leerplasmid zum Einsatz.
Die besten Effekte wurden für die Gruppe mit IL-12 transfizierten Vakzin welche
direkt in die Milz appliziert wurden, erwartet. Die Injektion der IL-12 sezernierenden
Tumorzellen sollte ein bewusstes Lenken in Richtung zelluläre Abwehr bewirken.
Zu untersuchen waren folgende Punkte:
1. Tumorrezidivrate nach Tumorresektion und Vakzination
2. Tumorgrößenzunahme
3. Überlebenszeitanalyse
4. Metastasierungsrate
5. Unterschiede bezüglich Impflokalisation und Vakzin
11
Material und Methoden
2. Material und Methoden
Versuchstiere
Herkunft/Hersteller
C57/BL6 Maus
Medizinisches Experimentelles Zentrum der
Universität Leipzig
Tumorzellen
B16 Melanom
DKFZ Tumorzell- und Datenbank Heidelberg
Lewis Lung Karzinom
DKFZ Tumorzell- und Datenbank Heidelberg
Hilfsmittel für Tierversuch
Rasierapparat: Favorita II
Aesculap
Äther für Narkosezwecke
Injektionsspritzen: Omnica 20
(Ketamin und Faustan)
B. Braun
Vicyl 4-0
Ethicon
Monovetten EDTA KE 2,7 ml
Sarstedt
Vortexer
Material für die Zellkultur
RPMI 1640 Medium Seromed
Biochrom
Zusätze:
Fetales Kälberserum [FKS]
Gibco/BRL
L-Glutamin
Gibco/BRL
Gentamycin
Jenapharm
Einfriermedium
(10% DMSO, 40% FKS, 50% RPMI 1640)
Apotheke der Universität Leipzig
Pufferlösung:
PBS (pH = 7,3)
Apotheke der Universität Leipzig
Zellkulturflasche
50 ml, 300 ml, 500 ml
Fa. Greiner
Brutschrank 37°C
Tiefkühlschrank -80°C
Material für die Helios Gene Gun
Gold-Mikropartikel 0,6 µg
BioRad (München)
Polyvinylpyrrolidon [PVP]
BioRad (München)
Ethanol (99,996%)
Merck (München)
0,05 M Spermidin (in H2O)
SIGMA (München)
12
Material und Methoden
1 M CaCl2
Apotheke der Universität Leipzig
mIL-12-Gen
Max-Delbrück-Centrum (Berlin; Prof. Blankenstein)
pRSC-Plasmid
Arizona Cancer Center, Tucson (Prof. Hersh)
Eppendorf tubes 1,5 ml
Eppendorf (München)
Tefzel-Röhre
BioRad (München)
Tubing-prep-station
BioRad (München)
Stickstoff Reinheitsstufe 4
Linde
Tubing cutter mit Klingen
BioRad (München)
Patronen-Auffangbehälter
BioRad (München)
Helios Gene Gun
BioRad (München)
Abstandshalter
BioRad (München)
Patronenmagazin
BioRad (München)
Helium Reinheitsstufe 4
Linde
Petrischalen
Greiner
2.1
Herstellung der Vakzine
Die Herstellung der Vakzine erfolgte in beiden Zelllinien durch die gleiche
Vorgehensweise. 1x105 Melanomzellen bzw. 1x106 Lewis Lung Karzinomzellen
wurden in 20µl RPMI 1640 Nährmedium (Zusätze: 10% FKS, Glutamin und 10 mg/ml
Gentamycin) auf dem Boden einer six well plate kreisförmig (ca. 1,5 cm)
ausgestrichen.
Nach
einer
kurzen
Verdunstungsphase
ohne
vollständige
Austrocknung erfolgte der Beschuss mit einem 200 psi Heliumimpuls aus der Helios
Gen Gun, welches mIL-12 bzw. das Leerplasmid pRSC enthielt. Ein Flüssigkeitsfilm
würde bei Beschuss der Zellen diese zu sehr auseinander treiben. Weiterhin besteht
die Gefahr des unerwünschten Abbremsens der Partikel über den Zellen. Ein
Abstandshalter an der Helios Gene Gun ermöglichte es, dass alle Zellen mit der
gleichen
Entfernung
transfiziert
werden
konnten.
Zur
Überprüfung
der
Transfektionseffektivität kamen fluoreszierende Proteine zum Einsatz (93).
Im Anschluss daran wurden die Zellen eingesammelt, gewaschen, in 2 ml complete
RPMI 1640 resuspendiert und mit einer Dosis von 60 Gy subletal bestrahlt. (Gamma
Stahler, Klinik für Strahlentherapie und Radioonkologie der Universität Leipzig)
Die bestahlten, transfizierten Tumorzellen wurde drei Mal mit PBS gewaschen und in
Injektionsspritzen (Omnica-20 Einmalspritzen mit Kanüle) für die Vakzination
bereitgestellt. Um eine Verklumpung der Zellen zu vermeiden, wurden diese auf Eis
gelagert und ständig durch einen Vortexer bewegt. Für die Vakzination standen 20
13
Material und Methoden
µl (entsprechend 1x105 Zellen beim Melanom bzw. 1x106 Zellen beim Lewis Lung
Karzinom) durch Resuspendieren bereit.
Die Herstellung der frostgeschockten Vakzine erfolgte nach dreimaligen Waschen in
PBS und einer Resuspension der Zellen in einer Konzentration von 5x10 6 Zellen/ml
in PBS. Zum Schockfrosten wurden diese Zellen drei Mal für 5 Minuten bei -80°C
eingefroren und anschließend im Wasserbad bei 37°C in 10 Minuten aufgetaut. Die
fertigen, mit Vakzin beladenen Injektionsspritzen wurden ebenfalls auf Eis und in
Bewegung gelagert.
Folgende Vakzine standen zur Verfügung:
1. mIL-12 transfizierte Tumorzellen + subletale Bestrahlung
2. mit dem Leerplasmid pRSC transfizierte Tumorzellen + subletale Bestrahlung
3. frostgeschockte Tumorzellen
2.2
Patronenherstellung für die Helios Gen Gun und in vito Transfektion
Die Zubereitung der Patronen erfolgte kalkuliert für eine Beschuss mit 0,5mg Gold
und 1,5µg Plasmid-DNA pro Transfektion, entsprechend der Vorschriften des
Herstellers der Genkanone.
Für den Ansatz wurden 35mg Goldpartikel in 100µl (0,05mmol/l) Spermidin in
Suspension gebracht. Bei feiner Verteilung des Goldes wurden 105µl der
entsprechenden Plasmid-DNA-Lösung (Konzentration von 1 mg/ml) hinzupipettiert.
Zur Präzipitation der Partikel wurden 100µl CaCl² unter leichtem Schwenken
hinzugegeben. Nach einer Inkubationszeit von 10 min bei Raumtemperatur wurde
das Wasser von der Goldsuspension durch dreimaliges Resuspendieren mit
hochreinem Ethanol (99,996%) und Zentrifugation in der Microfuge getrennt. Die
Anwendung von hochreinem Ethanol ist erforderlich, da ein zu hoher Wasseranteil zu
einer Verklumpung der Suspension führt und die Patronen unbrauchbar machen
würde.
Vorbereitend
trockneten
wir
eine
Tefzel-Röhre
mit
reinem
Stickstoff,
die
Flussgeschwindigkeit betrug 0,3l/min für 15 min in einer Tubing-Prep-Station
(Rotations- und Absaugvorrichtung). Die Plasmid-Gold-Suspension wurde durch
Vortexen in eine homogene Flüssigkeit überführt und anschließend blasenfrei
außerhalb der Tubing-Prep-Station in die Tefzel-Röhre hineingebracht. Es erfolgte
14
Material und Methoden
ein Wiedereinspannen der Röhre in die Tubing-Prep-Station für 1-2 min, um ein
Absetzen der Goldsuspension zu erreichen. Überstehendes Ethanol
wurde
vorsichtig abgesaugt.
Bei kontinuierlicher Drehung der Tefzel Röhre in der Tubing-Prep-Station konnte das
Plasmid-Gold-Gemisch gleichmäßig unter Stickstoffzufuhr (ca. 0,3 l/min) trockneten.
Eine spezielle Scheidevorrichtung (Tubing Cutter) teilte die Tefzel-Röhre in 0,5 inch
(1,27cm) lange Stücke. Durch optische Kontrolle konnte eine erfolgreiche
Bestückung der Patronen überprüft werden.
Die Aufbewahrung der beschichteten Abschnitte der Tefzel-Röhre erfolgte in einem
Kunststoffbehälter bei 4°C nach Beigabe von Trockenpellet und Versiegelung.
2.3
Versuchsablauf
Als Maus Tumormodell diente die C57 Black 6 (C57/BL6) Maus mit einem autologen
(initial chemisch induziert) B16 Melanom bzw. Lewis Lung Karzinom. Mit einem
Langhaarschneider wurde das Fell der Mäuse an deren linke Flanke ca. 2x2cm
wegrasiert. Danach erfolgte die intrakutane Implantation der Tumorzellen in diesem
Bereich mit einer Omnican-20 Einmalspritze.
Dazu wurden die Mäuse mit Äther narkotisiert und die Tumorzellen implantiert. Bei
exakter intradermaler Injektion zeigte sich eine Quaddel auf der Haut (Abbildung 2).
Gearbeitet wurden in 7 Versuchsgruppen, pro Gruppe 30 Mäuse (Tabelle 1).
Weibliche und männliche Tiere wurden separiert zu gleichen Anteilen. Das Alter der
Mäuse lag zwischen 12 und 18 Wochen.
Ab dem zweiten Tag nach Implantation wurden die Tiere bezüglich des Auftretens
eines Tumors untersucht. Dokumentiert wurde die Größe des Tumors (größter
Durchmesser und senkrecht dazu stehender Durchmesser).
Sieben Tage nach intradermaler Implantation wurde der entstandene Tumor mit
einem Sicherheitsabstand von ca. 2-3 mm unter Narkose (i.m.-Gabe von
Atropinsulfat
0,1
mg/kg
Körpergewicht,
Ketaminhydrochlorid
100
mg/kg
Körpergewicht und Xylazinhydrochlorid 5 mg/kg Körpergewicht) operativ entfernt.
Dokumentiert wurden die Tumorgröße und der R-Status (R0 kein Tumor sichtbar,
R1/2 für Resttumor bzw. kein Sicherheitsabstand).
Desweiteren wurde festgehalten, ob der Tumor in benachbartes Gewebe infiltriert
war. Um möglichst unabhängige Stichproben zu bekommen, erfolgte die Auswahl der
Mäuse zum Zeitpunkt der Operation und Vakzination zufällig.
15
Material und Methoden
Nach Tumorresektion konnte die Milz durch die verbliebene Bauchdeckenschicht
sichtbar gemacht werden und stand für die Vakzination bereit (Abbildung 3). Mit Hilfe
einer Omnican-20 Einmalspritze wurde der Impfstoff mit der Kanüle in die Milz
appliziert.
Dies
erfolgte
unter
Vorschieben
der
Nadel
(ca.
5-8
mm)
in
Milzlängsrichtung und Freigesetzen des Vakzins bei Rückzug der Kanüle. Bei
subcutaner Vakzination erfolgte diese nach Tumorresektion in die kontralaterale
Flanke der Versuchstiere. Kontrollgruppen erhielten nach Resektion keine Impfung.
Der Defekt der Bauchwand wurde mit 1-3 allschichtigen Einzelknopfnähten (4-0
Vicryl) verschlossen.
Abbildung 2: Intradermale Tumorzellapplikation
Abbildung 3: Darstellung der Milz
16
Material und Methoden
Gruppe
Anzahl der Mäuse
Vakzine
1 = Kontrolle
Melanom n= 30
Lewis Lung n= 30
Melanom n= 28
Lewis Lung n= 23
keine
2 = IL-12
Ort der Vakzination
IL-12 transfizierte und
Milz
subletal bestrahlte
Tumorzellen
3 = pRSC
Melanom n= 29
mit Leerplasmid pRSC
Milz
Lewis Lung n= 27
transfizierte und subletal
bestrahlte Zellen
4 = Frost
Melanom n= 22
3x bei -80°C
Milz
Lewis Lung n=22
gefriergeschockte Zellen
5 = IL-12
Melanom n= 31
IL-12 transfizierte und
subcutan
Lewis Lung n= 29
subletal bestrahlte
Tumorzellen
6 = pRSC
Melanom n= 29
mit Leerplasmid pRSC
subcutan
Lewis Lung n= 30
transfizierte und subletal
bestrahlte Zellen
7 = Frost
Melanom n= 31
3x bei -80°C
subcutan
Lewis Lung n= 30
gefriergeschockte Zellen
Tabelle 1: Therapiegruppen nach Tumorresektion und Vakzination (autologe B16 Melanom bzw. Lewis Lung
Karzinomzellen).
Abbildung 4: Skizzierung des Versuchsablaufes
2.4
Überlebenszeitanalyse
Zur Beurteilung des Auftretens eines Rezidivtumors erfolgte die Inspektion der Tiere
im Abstand von zwei Tagen. Der Tumor konnte per Palpation und Inspektion
festgestellt werden. Beim Auftreten eines Rezidivs wurde die Größe mit einem
Messschieber ermittelt. Gemessen wurde der größte Durchmesser und die Länge
90°dazu. Der Tumorquerschnitt ergab sich durch folgende Formel:
A= ¼ x π x a x b.
17
Material und Methoden
Beendet wurde die Messung, nachdem alle Mäuse mit einem Rezidivtumor
verstorben waren.
Dokumentiert wurden:
1. Tumorrezidiv ja oder nein,
2. wenn ja, Tumorgröße (Tumorquerschnitt in der Hautoberfläche
A= ¼ x π x a x b)
3. Überlebenszeit nach Tumorresektion und Vakzination und nach
Tumorreimplantation
Bei allen verstorbenen Tieren wurde eine Autopsie mit Entnahme von Lungen- und
Lebermaterial vorgenommen und auf das Vorhandensein von Metastasen überprüft.
4 Wochen nachdem die letzte Maus mit einem Rezidivtumor verstorben war, erfolgte
eine erneute Tumorreimplantation bei allen tumorfrei Überlebenden, um eine
Vermischung von alten und neuen Tumoren zu vermeiden. Bei Tumorreimplantation
erhielten
alle
Tiere
1x105
B16
Melanomzellen
bzw.
1x106
Lewis
Lung
Karzinomzellen. Die Quaddel setzten wir diesmal an die kontralaterale rechte Flanke.
Auch hier wurden im Abstand von zwei Tagen das Tumorwachstumsverhalten mit
Tumorgröße und die Überlebenszeit dokumentiert.
2.5
Histologie
Zur Beurteilung der Metastasierungsverhaltens entnahmen wir allen toten Tieren
entsprechend
Biopsien
aus
Lunge
und
Leber,
lagerten
dieses
in
einer
Einbettkassette aus Plastik (Medim) in 10%-igem Formalin. Anschließend wurde die
Plastikkassette paraffinisiert und geschnitten. Die Färbung erfolgte mit Hämatoxylin
und Eosin. Es erfolgte die Beurteilung von je 3 Schnitten pro Organ.
Durch Autolyse oder Tierfrass konnte bei einigen Tieren kein Material gewonnen
werden.
18
Material und Methoden
2.6
Statistische Erhebung
Für die statistische Auswertung standen uns folgende Parameter zur Verfügung:
1. Tumorquerschnitt in der Hautoberfläche
2. Rezidivrate
3. Zeit bis zum makroskopischen Wiederauftreten eines Rezidivs
4. Überlebenszeit
5. Metastasierung (ja/nein)
Die erhobenen Daten wurden mit den Computerprogrammen Microsoft Word Excel®
2003 und SPSS® 11.5 bearbeitet.
Eine Prüfung auf Normalverteilung der Werte erfolgte mit dem SHAPIRO-WILKSTest
(Lilliefors-Signifikanzniveau),
einer
Modifikation
des
KOLMOGOROV-
SMIRNOV-TESTs (für Stichproben bis n = 50).
Dadurch konnte nachgewiesen werden, dass bei der Versuchsgruppe Melanom
signifikante Abweichungen von der Normalverteilung vorlagen, der Versuch Lewis
Lung Karzinom erfüllte die Kriterien für eine Normalverteilung.
Als statistische Lageparameter wurde der arithmetische Mittelwert (x) und die
Standardabweichung (sd +/-), der Medianwert und das 1. und 3. Quartil sowie das
Maximum und Minimum berechnet.
Im
Experiment-Melanom
wurde
der
nichtparametrische
Kruskal-Wallis-Test
eingesetzt, der die zur einfachen Varianzanalyse analogen Hypothesen prüft. Es
wurde
untersucht,
ob
mehrere
unabhängige
Variablen
aus
der
gleichen
Grundgesamtheit stammen. Kommt es zur Ablehnung der Nullhypothese, können
weitere Unterschiede der Mittelwerte zwischen den Gruppen mit dem Mann-WhitneyU-Test bzw. Wilcoxon-Test erfasst werden.
Qualitative Merkmale und deren relative Ereignishäufigkeit werden mit Kreuztabellen
und der Prüfgröße CHI-QUADRAT-Test nach Pearson auf Signifikanz geprüft.
Das Experiment-Lewis-Lung-Karzinom erfüllte, nach Prüfung mit dem SHAPIROWILKS-Test die Kriterien für eine Normalverteilung, sodass mit dem parametrischen
Test ANOVA (Analysis of Variance) bzw. post-hoc-Test weitergearbeitet werden
konnte. Dieser überprüft, ob globale Mittelwertsunterschiede zwischen den Gruppen
vorliegen. War das der Fall, konnte eine weitere Analyse mit dem S-N-K (Student19
Material und Methoden
Newman-Keuls) oder Scheffe’-Test erfolgen, um die Gruppen im Einzelnen zu
vergleichen und Unterschiede festzustellen. Bei paarweisen Mehrfachvergleichen
testet man die Differenz zwischen gepaarten Mittelwerten. Die Ergebnisse weichen
mit p < 0,05 signifikant voneinander ab.
20
Ergebnisse Experiment Maus Tumor Modell Melanom
3. Ergebnisse Experiment Maus Tumor Modell Melanom
Nach intradermaler Implantation von Melanomtumorzellen (1x105 B16 Melanomzellen) in die linke Flanke der Mäuse zeigte sich nach 7 Tagen, zum Zeitpunkt der
Resektion, bei allen Mäusen ein Tumor. Der mittlere Tumorquerschnitt betrug ca. 0,2
cm² bei einem maximal gemessenen Durchmesser von 10 mm und minimalen
Durchmesser von 1 mm. Der makroskopisch sichtbare Tumor wurde entfernt und es
erfolgte die Vakzination mit autologen Tumorzellen nach den entsprechenden
Gruppierungen
(siehe
Material
und
Methoden).
Insgesamt
standen
200
Versuchstiere zur Verfügung. Aufgrund großer Tumoren und deren Infiltration in
Abdomen bzw. Thorax und der daraus entstandene großen Defekte kam es
perioperativ zum Verlust von 17 Versuchstieren.
3.1
Ergebnisse der Überlebenszeitanalyse
Gruppe/
Lokalisation
der
Vakzination
Kontrolle
(n= 30)
Auftreten
eines Tumorrezidivs nach
Resektion
und
Vakzination
(absolute
Anzahl der
Tiere; Prozent)
Zeit bis zum
makroskopischen
Wiederauf
treten eines
Tumors nach
Resektion
Überlebenszeit nach
Tumorresektion bei
Rezidiv
Anzahl
tumorfrei
überlebender Tiere
Tumorauftreten nach
Reimplantation
(absolute
Anzahl der
Tiere;
Prozent)
Zeit bis zum
makroskopischen
Wiederauftreten eines
Tumors nach
Reimplantation
Überlebenszeit nach
Reimplantation eines
Tumors im
Falle eines
Wachstums
6 (20%)
9,0 ± 3,8
26,0 ± 4,9
24
23 ( 96%)
7,4 ± 3,3
28,3 ± 11,8
4 (13%)
17,5 ± 9,0
28,0 ±14,3
27
24 (89%)
5,7 ± 1,4
30,6 ± 12,2
9 (31%)
22,8 ± 17,1
41,0 ± 20,4
20
20 (100%)
9,6 ± 4,2
33,6 ± 11,0
8 (26%)
12,6 ± 2,8
32,2 ± 11,7
23
23 (100%)
9,0 ± 9,3
33,5 ± 15,9
21 (23%)
20,7 ± 14,8
35,2 ± 16,6
70
67 (96%)
8,0 ± 6,2
32,5 ± 13,2
6 (27%)
13,0 ± 7,1
33,2 ± 10,7
16
16 (100%)
7,1 ± 2,2
33,1 ± 11,9
9 (31%)
19,3 ± 11,7
39,9 ± 16,7
20
19 (95%)
8,4 ± 3,5
33,0 ± 10,7
6 (21%)
14,4 ± 6,1
32,0 ± 18,5
22
22 (100%)
8,4 ± 4,5
30,4 ± 11,8
21 (27%)
17,8 ± 11,7
35,9 ± 15,3
59
58 (98%)
8,0 ± 3,7
32,0 ± 11,3
Frost
subcutan
(n= 31)
pRSC
subcutan
(n= 29)
IL-12
subcutan
(n= 31)
alle
subcutan
(n= 91)
Frost Milz
(n= 22)
pRSC Milz
(n= 29)
IL-12 Milz
(n=28)
alle Milz
21
Ergebnisse Experiment Maus Tumor Modell Melanom
(n= 79)
alle Frost
(n= 53)
alle pRSC
(n= 58)
alle IL-12
(n= 59)
10 (19%)
18,0 ± 12,9
31,1 ± 11,8
43
40 (93%)
6,25 ± 1,9
31,6 ± 12,0
18 (31%)
22,1 ± 14,6
40,4 ± 18,1
40
39 (98%)
9,0 ± 3,8
33,3 ± 10,7
14 (23%)
16,4 ± 11,7
32,2 ±14,0
45
45 (100%)
8,7 ± 7,3
32,0 ± 13,9
Tabelle 2: Mittleres Überleben mit Standardabweichung der Überlebenszeitanalyse in Tagen, unabhängig vom
R-Status nach Tumorresektion. 7 Tage nach einer Tumorimplantation wurde dieser reseziert, zum gleichen
Zeitpunkt erfolgte eine autologe Tumorzellvakzination in die Milz oder subcutan. Alle tumorfrei Überlebenden
erhielten eine zweite Tumorimplantation. Statistik: Zeit bis zum makroskopischen Wiederauftreten eines Tumors.
Globaler statistischer Unterschied signifikant (ANOVA): p=0,056, (Kruskal-Wallis-Test): p=0,021,
Einzelguppenvergleiche: (Mann-Whithney-Test): Kontrolle versus pRSC p=0,01. Zusammengefasst nach Art der
Vakzine: Globaltest. (ANOVA): p=0,056, (Kruskal-Wallis-Test) p=0,021 Einzelgruppenvergleiche: (MannWhithney-Test): Kontrolle versus pRSC p=0,011, pRSC versus IL-12 p=0,024
3.2
Ergebnisse nach Tumorresektion und Vakzination
3.2.1 Unabhängig vom R-Status
Tumorrezidivrate: Nur bedingt beurteilbar war die Auswertung der Tumorrezidivrate,
da zum Zeitpunkt der Tumorresektion die Größe und der R-Status der entfernten
Tumoren stark variierten (teilweise Infiltration in Abdomen und Thorax). Der R-Status
nimmt großen Einfluss auf die Rezidivrate.
Die geringsten Tumorrezidivraten zeigten die Gruppen Frost subcutan (13%),
Kontrolle (20%) und IL-12 Milz (21%).
Zeit bis zum makroskopischen Wiederauftreten eines Tumors: Es zeigte sich ein
visueller Vorteil für alle Therapiegruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe. Aufgrund
der geringen Anzahl und einer hohen Standardabweichung wurde auf einen
Vergleich der einzelnen Gruppen untereinander verzichtet.
Fasst man nach der Impflokalisation zusammen, wurde ein Benefit für die Gruppen
subcutan bzw. Milz gegenüber der Kontrollgruppe sichtbar.
Beim Vergleich der Vakzine untereinander ergab sich ein signifikanter Unterschied
(p<0,04) zwischen der Kontrollgruppe und pRSC.
Überlebenszeit: Bei der Betrachtung der Überlebenszeit ergaben sich keine
signifikanten Differenzen. Auffallend war, dass Mäuse der Kontrollgruppe früher
verstarben als die der Therapiegruppen. Das längste Überleben zeigte die Gruppe
22
Ergebnisse Experiment Maus Tumor Modell Melanom
pRSC subcutan. Wobei auch hier eine große Standardabweichung berücksichtigt
werden musste.
Metastasierungsrate: Alle Tiere wurden nach dem Tod auf Lungen- und
Lebermetastasen untersucht. Die Metastasierungsrate lag zwischen 7-19%. Die
geringste Rate zeigte sich bei der Gruppe pRSC Milz mit 7% und Frost Milz mit 9%.
Die höchste zeigte sich in der Gruppe IL-12 subcutan (19%)
Zwischen
Lungen-
oder
Lebermetastasen
ergaben
sich
keine
auffälligen
Unterschiede.
Tumorwachstum: Verglich man die einzelnen Gruppen miteinander, zeigte sich ein
rasches Wachstum der Tumoren der Kontrollgruppe. An den Tagen 6 und 10
konnten signifikante Unterschiede aufgezeigt werden. Den flachsten Anstieg und
somit die geringste Tumorgrößenzunahme zeigte die Gruppe pRSC Milz.
Trennte man nach Vakzin bzw. Impflokalisation, erkannte man einen Vorteil für
pRSC bzw. Milz. Deren Kurvenverlauf war flacher im Gegensatz zur Kontrollgruppe.
Besonders an den Tagen 6 und 10 ergaben sich signifikante Werte für die
Vakzination in die Milz.
23
Ergebnisse Experiment Maus Tumor Modell Melanom
Abbildung 5:. Mittleres Tumorwachstum mit Standardabweichung (Tumorquerschnitt in Hautoberfläche) der
Überlebenszeitanalyse. 7 Tage nach intradermaler Implantation eines Melanom B16 wurde der Tumor reseziert,
zum gleichen Zeitpunkt erfolgte eine autologe Tumorzellvakzination in die Milz bzw. subcutan. Darstellung der
Wachstumskurven unabhängig vom R-Status. Globaltest: (Chi-Quadrat-Test nach Pearson): Tag 6, p< 0,04, Tage
4 und 10 verfehlten knapp (p =0,098 bzw. 0,093) Einzelgruppenvergleiche: (Mann-Whitney-U-Test) Tag 6: pRSC
subcutan versus Kontrolle (p <0,05) pRSC Milz versus Kontrolle (p =0,03).
24
Ergebnisse Experiment Maus Tumor Modell Melanom
Abbildung 6: Mittleres Tumorwachstum mit Standardabweichung (Tumorquerschnitt in Hautoberfläche) der
Überlebenszeitanalyse. 7 Tage nach intradermaler Implantation eines Melanom B16 wurde der Tumor reseziert,
zum gleichen Zeitpunkt erfolgte eine autologe Tumorzellvakzination in die Milz bzw. subcutan. Zusammengefasst
.
nach der Art der Vakzine unabhängig vom R- Status (Chi-Quadrat-Test nach Pearson) Tag 6 p<0,01, Tag 10
p<0,04 Einzelgruppenvergleiche: (Mann-Whithney-U-Test) Kontrolle versus Frost Tag 6 p<0,04, Kontrolle versus
pRSC Tage 6,8,10,12,14,16: (p=0,029 bis p<0,04); pRSC versus Frost Tag 12 p<0,04; pRSC versus IL-12 Tag 12
p<0,03 und Tage 26, 28, 30 p=0,018 bis p<0,04
25
Ergebnisse Experiment Maus Tumor Modell Melanom
Abbildung 7: Mittleres Tumorwachstum mit Standardabweichung (Tumorquerschnitt in Hautoberfläche) der
Überlebenszeitanalyse. 7 Tage nach intradermaler Implantation eines Melanom B16 wurde der Tumor reseziert,
zum gleichen Zeitpunkt erfolgte eine autologe Tumorzellvakzination in die Milz bzw. subcutan. Darstellung der
Wachstumskurven zusammengefasst nach Impflokalisation: Globaltest: (Chi-Quadrat-Test nach Pearson) Tag 6
p<0,01, Tag 10 knapp p=0,056 Einzelgruppenvergleiche: (Mann-Whithney-U-Test) Kontrolle versus Milz Tag 6
p<0,03, Tag 10 p<0,03 Kontrolle versus subcutan Tag 6 p<0,01, Tag 8 p=0,04, Tag 10 knapp p=0,055
3.2.2 Ergebnisse nach R0-Resektion
Gruppe/ Lokalisation der
Vakzination
R0-Resektion
Auftreten eines Tumorrezidivs nach Resektion
und Vakzination
(absolute Anzahl der
Tiere;Prozent)
Zeit bis zum makrosko- Überlebenszeit nach
pischen WiederaufTumorresektion bei
treten eines Tumors
Rezidiv
nach Resektion
Kontrolle (n=25)
5 (20%)
15,0 ± 10,5
26,5 ± 5,5
Frost subcutan (n= 27)
2 (7%)
25,0 ± (22,28)
37,0 ± (26,48)
pRSC subcutan (n= 21)
3 (14%)
24,0 ± 15,9
35,7 ± 10,1
IL-12 subcutan (n= 26)
5 (19%)
11,6 ± 1,7
31,4 ± 9,0
alle subcutan (n= 74)
10 (14%)
18,0 ± 10,2
33,8 ± 9,6
Frost Milz (n= 20)
5 (25%)
20,0 ± 16,1
35,0 ± 10,8
pRSC Milz (n= 24)
6 (25%)
15,0 ± 5,2
34,0 ± 14,0
IL-12 Milz (n=23)
2 (9%)
20,2 ± (18,22)
48,0 ± (34,62)
alle Milz (n= 67)
13 (19%)
17,8 ± 10,9
36,5 ± 13,4
26
Ergebnisse Experiment Maus Tumor Modell Melanom
alle Frost (n= 47)
7 (15%)
21,2 ± 13,9
35,6 ± 10,9
alle pRSC (n= 45)
9 (20%)
18,0 ± 10,0
34,6 ± 12,2
alle IL-12 (n= 49)
7 (14%)
14,0 ± 4,5
36,1 ± 13,6
Tabelle 3: Mittleres Überleben mit Standardabweichung der Überlebenszeitanalyse in Tagen nach
makroskopischer R0 Resektion. Mittleres Tumorwachstum mit Standardabweichung (Tumorquerschnitt in
Hautoberfläche) der Überlebenszeitanalyse. Darstellung nach R0-Resektion. 7 Tage nach intradermaler
Implantation von Melanomzellen B16 wurde der Tumor reseziert, zum gleichen Zeitpunkt erfolgte eine autologe
Tumorzellvakzination in die Milz bzw. subcutan.
Tumorrezidivrate: Die niedrigste Tumorrezidivrate ergab sich in den Gruppen Frost
subcutan (7%) und IL-12 Milz (9%), bei einer sonst durchschnittlichen Rate von 17%.
Fasst man die Gruppen nach Art der Vakzine bzw. Lokalisation zusammen,
bestanden visuelle Vorteile für IL-12 (14%) und subcutane Injektion (14%).
Zeit bis zum makroskopischen Wiederauftreten eines Tumors: Nach R0Resektion ergab sich ein Vorteil für alle Therapiegruppen zum Zeitraum des
Auftretens eines Tumorrezidivs gegenüber der Kontrollgruppe. Im Durchschnitt
konnte beobachtet werden, dass die Therapiegruppen 3 bis 4 Tage später ein
Rezidiv entwickelten, bei jedoch geringer Tierzahl und hoher Standardabweichung.
Bezüglich Impflokalisation bzw. Vakzinart ergaben sich keine Unterschiede.
Überlebenszeit: Nach R0-Resektion überlebten die Mäuse der Gruppe IL-12 Milz
am längsten, bei einer durchschnittlich geringeren Tumorgröße (Tabelle 3).
Sämtliche Therapiegruppen lebten im Durchschnitt 10 Tage länger als die
Kontrollgruppe.
Ein signifikanter Vorteil für ein Vakzin bestand nicht. Die Überlebenszeit nach
Vakzination in die Milz ist länger gegenüber subcutaner Injektion und der
Kontrollgruppe.
Metastasierungsrate: Die Metastasierungsrate war nach R0-Resektion relativ
gering. Werte zwischen 8% und 24% wurden erreicht. Die niedrigste Rate zeigten
sich bei den Gruppen pRSC Milz (8%), Frost Milz (10%) und IL-12 Milz (13%). Für
einen antimetastatischen Effekt könnte sprechen, dass nach Vakzination in die Milz
die geringste Metastasierungsrate auftrat. (10% bei Milzvakzination gegenüber 20%
bei subcutan).
27
Ergebnisse Experiment Maus Tumor Modell Melanom
Tumorwachstum: An den Tagen 10, 12 und 14 ergab sich ein signifikanter Vorteil
für alle Therapiegruppen gegenüber der Kontrollgruppe. Im Einzelgruppenvergleich
zeigten sich Signifikanzen an den Tagen 6, 8 und 10 für Milz versus Kontrolle
Abbildung 10.
Abbildung 8: Mittleres Tumorwachstum mit Standardabweichung (Tumorquerschnitt in Hautoberfläche) der
Überlebenszeitanalyse. Darstellung nach R0-Resektion. 7 Tage nach intradermaler Implantation von
Melanomzellen B16 wurde der Tumor reseziert, zum gleichen Zeitpunkt erfolgte eine autologe
Tumorzellvakzination in die Milz bzw. subcutan. Zur grafischen Darstellung der Gruppen Frost subcutan und IL-12
Milz war die Tieranzahl zu diesem Zeitpunkt zu gering.
28
Ergebnisse Experiment Maus Tumor Modell Melanom
Abbildung 9: Mittleres Tumorwachstum mit Standardabweichung (Tumorquerschnitt in Hautoberfläche) der
Überlebenszeitanalyse. 7 Tage nach intradermaler Implantation von Melanomzellen B16 wurde der Tumor
reseziert, zum gleichen Zeitpunkt erfolgte eine autologe Tumorzellvakzination in die Milz bzw. subcutan.
Zusammengefasst nach der Art der Vakzine nach R0-Resektion
29
Ergebnisse Experiment Maus Tumor Modell Melanom
Abbildung 10: Mittleres Tumorwachstum mit Standardabweichung (Tumorquerschnitt in Hautoberfläche) der
Überlebenszeitanalyse. 7 Tage nach intradermaler Implantation eines Melanom B16 wurde der Tumor reseziert,
zum gleichen Zeitpunkt erfolgte eine autologe Tumorzellvakzination in die Milz bzw. subcutan. Darstellung der
Wachstumskurven zusammengefasst nach Impflokalisation nach R0-Resektion Globaltest: ANOVA Tag 10, 12,
14 p<0,01, p=0,013, p<0,04. Globaltest: (Chi-Quadrat-Test nach Pearson) an den Tagen 6 und 8 p<0,05
Einzelgruppenvergleich: (Mann-Whitney-U-Test) Kontrolle versus Milz Tag 6,8,10 p=0,053 bzw. 0,028.
30
Ergebnisse Experiment Maus Tumor Modell Melanom
3.2.3 Ergebnisse nach R1/2-Resektion
Gruppe/ Lokalisation der
Vakzination
R1/2-Resektion
Auftreten eines Tumorrezidivs nach Resektion und Vakzination
(absolute Anzahl der
Tiere;Prozent)
Zeit bis zum makrosko- Überlebenszeit nach
pischen WiederaufTumorresektion bei
treten eines Tumors
Rezidiv
nach Resektion
Kontrolle (n= 5)
1 (20%)
6,0
24,0
Frost subcutan (n= 4)
2 (50%)
10,0 ± (10,1)
19 ± (14,24)
pRSC subcutan (n= 8)
6 (75%)
25,3 ± 19,4
43,7 ± 24,5
IL-12 subcutan (n= 5)
3 (60%)
27,7 ± 22,1
33,7 ± 17,8
alle subcutan (n= 17)
11 (65%)
23,2 ± 18,1
36,4 ± 21,5
Frost Milz (n= 2)
1 (50%)
8,0
24,0
pRSC Milz (n= 5)
3 (60%)
28,0 ± 17,8
51,7 ± 17,8
IL-12 Milz (n=5)
4 (80%)
10,7 ± 4,2
21,3 ± 8,1
alle Milz (n= 12)
8 (67%)
17,7 ± 14,3
34,7 ± 19,5
alle Frost (n= 6)
3 (50%)
9,3 ± 1,2
20,7 ± 5,8
alle pRSC (n= 13)
9 (69%)
26,2 ± 17,8
46,3 ± 21,7
alle IL-12 (n= 10)
7 (60%)
19,2 ± 17,0
27,5 ± 14,1
Tabelle 4: Mittleres Überleben mit Standardabweichung der Überlebenszeitanalyse in Tagen nach
makroskopischer R1/2-Resektion. 7 Tage nach intradermaler Implantation eines Melanom B16 wurde der Tumor
reseziert, zum gleichen Zeitpunkt erfolgte eine autologe Tumorzellvakzination in die Milz bzw. subcutan.
Tumorrezidivrate: Die Rezidivrate nach R1/2-Resektion schwankte zwischen 20%
und 80%. Eine genaue Beurteilung konnte aufgrund der geringen Gruppenstärke
(n=2 bis n=17) nicht erfolgen.
Zeit
bis
zum
makroskopischen
Wiederauftreten
eines
Tumors:
Die
Rezidivtumoren aller Therapiegruppen traten später auf als die der Kontrollgruppe.
Die Gruppe pRSC Milz konnte am längsten ohne Rezidiv überleben.
Überlebenszeit: Auffallend war die durchschnittlich längere Überlebenszeit der
Therapiegruppen, bei geringer Gruppenstärke und hoher Standardabweichung.
31
Ergebnisse Experiment Maus Tumor Modell Melanom
Metastasierungsrate: Gelegentlich kam es zum Auftreten von Lungenmetastasen.
Tumorwachstum: Die geringe Gruppenstärke ließ eine aussagekräftige Darstellung
des Tumorwachstums nicht zu. Bei der Betrachtung der Vakzine konnte einen Vorteil
für die Gruppen pRSC und IL-12 nur visuell verdeutlicht werden. (Abbildung 11)
.
Abbildung 11: Mittleres Tumorwachstum mit Standardabweichung (Tumorquerschnitt in Hautoberfläche) der
Überlebenszeitanalyse. Darstellung nach R1/2 Resektion. 7 Tage nach intradermaler Implantation von
Melanomzellen B16 wurde der Tumor reseziert, zum gleichen Zeitpunkt erfolgte eine autologe
Tumorzellvakzination in die Milz oder subcutan. Art der Vakzine.
Neben der Einteilung in R0 bzw. R1/2 erfolgte eine Betrachtung nach Einteilung in
„großer“/„kleiner“ Tumor (> bzw. < medianer Tumorquerschnitt bei OP von 0,05 cm²).
Weitere deutliche Unterschiede konnten nicht herausgearbeitet werden. Die
Auswertung erbrachte ähnliche Ergebnisse wie bei Unterteilung nach R-Status.
32
Ergebnisse Experiment Maus Tumor Modell Melanom
3.3
Ergebnisse nach Tumorreimplantation
Nachdem alle Versuchstiere, die einen Rezidivtumor entwickelten, verstorben waren,
erfolgte 119 Tage nach Versuchsbeginn eine erneute Tumorzellimplantation in die
rechte Flanke der Tiere.
Dokumentiert
wurden
Tumorrezidivrate,
Zeit
bis
zum
makroskopischen
Wiederauftretens des Tumors, Tumorwachstum und Metastasierungsrate.
Tumorrezidivrate: Die Rezidivrate schwankte zwischen 89% und 100% (Tabelle 2).
Ein signifikanter Unterschied zwischen den einzelnen Gruppen bestand nicht.
Zeit bis zum makroskopischen Wiederauftreten eines Tumors: Die Zeit bis zum
makroskopischen Wiederauftreten eines Tumors war für alle Gruppen gegenüber der
Kontrolle und Frost subcutan verlängert. Die Gruppe pRSC subcutan hatte mit 10
Tagen die längste tumorfreie Zeit. Gegenüber der Gruppe Frost subcutan zeigte jede
andere Gruppe ein signifikantes Verhalten. Der Impflokalisationsort bzw. die Vakzine
zeigten keinen Vorteil für eine Gruppe.
Überlebenszeit: Bezüglich der Überlebenszeit mit Tumor gab es keine signifikanten
Unterschiede. Alle Therapiegruppen lebten länger als die Kontrollgruppe.
Metastasierungsrate: Die Metastasierungsrate schwankte zwischen 9% bis 20%.
Die Gruppe IL-12 Milz hatte mit 9% Metastasierung unter den Therapiegruppen die
geringste Rate, pRSC subcutan die höchste.
Tumorwachstum: Das Tumorwachstum ist in Abbildung 12 dargestellt. Die
Signifikanzüberprüfung zeigte einen Vorteil aller Therapiegruppen gegenüber
Kontrolle und Frost subcutan. Auch der Zusammenschluss der Vakzine zeigte diesen
Vorteil. Besonders an den Tagen 5 bis 15 gab es signifikante Unterschiede mit einem
reduzierten Tumorwachstum für die Gruppen pRSC subcutan, pRSC Milz, IL-12
subcutan und IL-12 Milz. Bei den Impfstoffen IL-12 und pRSC war ebenfalls der
Vorteil zu sichtbar. Alle 7 Gruppen zeigten einen ähnlichen Kurvenverlauf, der
Anstieg
ist
bei
allen
Therapiegruppen
flacher,
was
für
eine
geringere
33
Ergebnisse Experiment Maus Tumor Modell Melanom
Wachstumszunahme im Gegensatz zur Kontrollgruppe spricht. Der Abstand
zwischen den Kurven blieb bis Therapieende konstant.
Abbildung 12: Mittleres Tumorwachstum mit Standardabweichung (Tumorquerschnitt in Hautoberfläche) der
Überlebenszeitanalyse. 7 Tage nach intradermaler Implantation von Melanomzellen B16 wurde der Tumor
reseziert, zum gleichen Zeitpunkt erfolgte eine autologe Tumorzellvakzination. Allen tumorfrei überlebten Mäusen
wurden erneut B16 Melanomzellen reimplantiert. Zeit bis zum makroskopischen Wiederauftreten eines
Rezidivtumors (ANOVA) p=0,045; Kruskal-Wallis-Test p=0,001 Einzelgruppenvergleiche: (Mann-Whithney-UTest) Kontrolle versus Frost subcutan p<0,03, Kontrolle versus pRSC subcutan p<0,03, Frost subcutan versus
Frost Milz p<0,05 Frost subcutan versus pRSC subcutan p<0,001, Frost subcutan versus pRSC Milz p=0,002,
Frost subcutan versus IL-12 subcutan und IL-12 Milz p=0,002, Frost Milz versus pRSC subcutan p<0,04, pRSC
subcutan versus IL-12 subcutan p<0,05. Tumorwachstum: Globaltest: (Chi-Quadrat-Test nach Pearson): Tage 5
bis 15 (p zwischen 0,006 bis 0,04) Einzelgruppenvergleiche (Mann-Whithney-U-Test): Kontrolle versus pRSC
subcutan Tag 5=0,042, Tag 9,11,13 (p=0,02, 0,021, 0,033); Kontrolle versus pRSC Milz Tag 13, 15 (p=0,014,
0,022); Kontrolle versus IL-12 subcutan Tage 11, 13 (p=0,031, 0,039); Frost subcutan versus pRSC subcutan
Tage 5 bis 15 (p=0,048); Frost subcutan versus pRSC Milz Tage 5 bis 15 (p=0,02); Frost subcutan versus IL-12
subcutan Tage 5 bis 15 (p=0,017); Frost subcutan versus IL-12 Milz Tage 5, 9 (p=0,043, 0,034)
34
Ergebnisse Experiment Maus Tumor Modell Melanom
Abbildung 13: Mittleres Tumorwachstum mit Standardabweichung (Tumorquerschnitt in Hautoberfläche) der
Überlebenszeitanalyse. 7 Tage nach intradermaler Implantation von Melanomzellen B16 wurde der Tumor
reseziert, zum gleichen Zeitpunkt erfolgte eine autologe Tumorzellvakzination in die Milz oder subcutan. Allen
tumorfrei überlebten Mäusen wurden erneut B16 Melanomzellen reimplantiert. Zusammengefasst nach Art der
Vakzine. Zeit bis zum makroskopischen Wiederauftreten eines Rezidivtumors (Kruskal-Wallis-Test): p=0,001,
(Mann-Whithney-U-Test): Kontrolle versus pRSC knapp p=0,054, Frost versus pRSC p<0,001, Frost versus IL-12
p=0,006 Tumorwachstum: Globaltest: (Chi-Quadrat-Test nach Pearson) Tage 5 bis 13, 15, 17 (p=0,04)
Einzelgruppenvergleiche (Mann-Whithney-U-Test) Kontrolle versus pRSC Tage 9 bis 15 (p=0,02); Kontrolle
versus IL-12 Tag 13 p=0,04; Frost versus pRSC Tage 5 bis 17 (p=0,003), Frost versus IL-12 Tage 5 bis 17
(p=0,05)
35
Ergebnisse Experiment Maus Tumor Modell Melanom
.
Abbildung 14:. Mittleres Tumorwachstum mit Standardabweichung (Tumorquerschnitt in Hautoberfläche) der
Überlebenszeitanalyse. 7 Tage nach intradermaler Implantation von Melanomzellen B16 wurde der Tumor
reseziert, zum gleichen Zeitpunkt erfolgte eine autologe Tumorzellvakzination in die Milz oder subcutan. Allen
tumorfrei überlebten Mäusen wurden erneut B16 Melanomzellen reimplantiert. Zusammengefasst nach
Impflokalisation.
36
Ergebnisse Experiment Maus Tumormodell Lewis Lung Karzinom
4. Ergebnisse Experiment Maus Tumormodell Lewis Lung Karzinom
Im Anschluss an das erste Experiment wurde ein zweiter analoger Versuch mit dem
Lewis Lung Karzinom mit 210 Versuchstieren durchgeführt.
Für die Auswertung standen 191 Tiere zu Verfügung. Infolge der Operation und
Narkose verstarben 19 Versuchstiere, meist jene mit einem ausgedehnten
Initialtumor.
4.1
Ergebnisse der Überlebenszeitanalyse
Gruppe/
Lokalisation der
Vakzination
Auftreten
eines Tumorrezidivs
nach Resektion und
Vakzination
(absolute
Anzahl der
Tiere in
Prozent)
Zeit bis zum Überlebens- Anzahl
Tumoraufmakroskopi- zeit nach
tumorfrei
treten nach
schen Wie- Tumorüberlebender Reimplanderauftreten resektion bei Tiere
tation
eines
Rezidiv
(absolute
Tumors nach
Anzahl der
Resektion
Tiere;
Prozent)
Zeit bis zum Überlebensmakroskop- zeit nach
ischen
ReimplantaWiederauf- tion eines
treten eines Tumors im
Tumors nach Falle eines
ReimWachstums
plantation
Kontrolle
(n= 30)
18 (60%)
8,1 ± 2,7
35,8 ± 9,3
12
12 (100%)
6,3 ± 3,3
45,8 ± 6,4
Frost subcutan
(n= 30)
14 (46,7%)
8,9 ± 4,3
38,5 ± 8,8
16
16 (100%)
4,4 ± 2,1
44,2 ± 12,9
pRSC subcutan
(n= 30)
16 (53,3%)
11,2 ± 7,5
39,4 ± 12,1
14
14 (100%)
6,4 ± 2,8
49,7 ± 5,4
IL-12 subcutan
(n= 29)
12 (41,4%)
8,2 ± 1,9
41,6 ± 8,4
17
17 (100%)
5,1 ± 2,8
52,2 ± 7,5
alle subcutan
(n= 89)
42 (47,2%)
9,7 ± 5,5
39,7 ± 9,9
47
47 (100%)
5,3 ± 2,6
48,6 ± 9,8
Frost Milz
(n= 22)
11 (50%)
8,2 ± 3,6
38,8 ± 14,0
11
11 (100%)
4,1 ± 1,9
45,0 ± 6,3
pRSC Milz
(n= 27)
17 (63%)
7,8 ± 2,4
36,5 ± 9,1
10
10 (100%)
4,4 ± 2,5
47,2 ± 5,0
IL-12 Milz
(n=23)
10 (43,5%)
8,4 ± 1,5
39,8 ± 6,5
13
13 (100%)
6,1 ± 3,4
49,9 ± 8,2
alle Milz
(n= 72)
38 (52,8%)
8,1 ± 2,5
38,1 ± 9,9
34
34 (100%)
4,9 ± 2,7
47,3 ± 6,7
alle Frost
(n= 52)
25 (48,1%)
8,6 ± 3,9
38,6 ± 11,1
27
27 (100%)
4,3 ± 2,0
44,5 ± 10,6
alle pRSC
(n= 57)
33 (57,9%)
9,5 ± 5,7
37,9 ± 10,6
24
24 (100%)
5,6 ± 2,8
48,7 ± 5,3
alle IL-12
(n= 52)
22 (42,3%)
8,3 ± 1,7
40,7 ± 7,4
30
30 (100)%)
5,5 ± 3,0
51,2 ± 7,7
37
Ergebnisse Experiment Maus Tumormodell Lewis Lung Karzinom
Tabelle 5: Mittleres Überleben und Standardabweichung der Überlebenszeitanalyse (Lewis Lung Karzinom) in
Tagen, unabhängig vom R-Status nach Tumorresektion. 7 Tage nach einer Tumorimplantation wurde dieser
reseziert, zum gleichen Zeitpunkt erfolgte eine autologe Tumorzellvakzination in die Milz oder subcutan. Alle
tumorfrei überlebenden Tiere erhielten eine Tumorreimplantation.
4.2
Ergebnisse nach Tumorresektion und Vakzination
4.2.1 Unabhängig vom R-Status
Tumorrezidivrate: Die Tumorrezidivrate schwankte zwischen 41% bis 63%. Es
bestand kein signifikanter Vorteil für eine Gruppe. Die geringsten Rezidivraten traten
bei IL-12 subcutan (41%) und IL-12 Milz (43%) auf.
Zusammengefasst nach der Art der Vakzine zeigten die IL-12 Gruppe (42%) die
geringste Rezidivrate. In der Kontrollgruppe traten mit 59% die meisten Rezidive auf
(Frost 48%, pRSC 58%).
Nach Impflokalisation geordnet ergab sich ein Vorteil für subcutane Vakzination mit
47% versus Milz 53% und Kontrolle 59%.
Zeit bis zum makroskopischen Wiederauftreten eines Tumors: Die Zeit bis zum
Wiederauftreten eines Tumors nach Resektion und Vakzination war in allen
Therapiegruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe verlängert. Die Zeit schwankte
zwischen 7 und 8 Tagen (pRSC Milz) bis 11,2 Tagen (pRSC subcutan mit hoher
Standardabweichung).
Fasst man nach der Art der Vakzine zusammen, zeigte sich die längste tumorfreie
Zeit in der Gruppe pRSC mit 9,5 Tagen (Frost 8,6 d, IL-12 8,3 d, Kontrolle 8,1 d).
Überlebenszeit: Im Falle des Auftretens eines Rezidivtumors überlebten alle
Therapiegruppen länger (zwischen 36,5 d und 41,6 d) gegenüber der Kontrollgruppe
(35,6 d). Am längsten lebte die Gruppe IL-12 subcutan (41,6 d).
Beim Zusammenschluss der Impflokalisation und Impfstoff ergaben sich keine
signifikanten Unterschiede. Die Kontrollgruppe schnitt stets am schlechtesten ab.
Metastasierungrate: Die Metastasierungsrate schwankte zwischen 75% und 100%.
Am geringsten traten Metastasen in der Gruppe pRSC Milz (75%) auf. Fasst man
nach der Art der Vakzine zusammen, erkennt man einen Vorteil für die Gruppe pRSC
(78%) gegenüber allen Gruppen (IL -12 95%; Frost 93% und Kontrolle 86%).
38
Ergebnisse Experiment Maus Tumormodell Lewis Lung Karzinom
Tumorwachstum: Im Falle eines Rezidivtumors nach Tumorresektion und
Vakzination wurde ein annähernd gleicher Verlauf der 7 Kurven beschrieben ohne
signifikante Hinweise.
Abbildung 15: Mittleres Tumorwachstum mit Standardabweichung unabhängig vom R-Status. Mittleres
Tumorwachstum mit Standardabweichung (Tumorquerschnitt in Hautoberfläche) der Überlebenszeitanalyse. 7
Tage nach intradermaler Implantation des Lewis Lung Karzinoms wurde der Tumor reseziert, zum gleichen
Zeitpunkt erfolgte eine autologe Tumorzellvakzination in die Milz oder subcutan. Darstellung unabhängig vom RStatus.
39
Ergebnisse Experiment Maus Tumormodell Lewis Lung Karzinom
4.2.2
Ergebnisse nach R0-Resektion
Gruppe/ Lokalisation der
Vakzination
R0-Resektion
Auftreten eines
Tumorrezidivs
nach Resektion
und Vakzination
(absolute Anzahl
der Tiere;
Prozent)
Zeit bis zum
makroskopischen
Wiederauftreten eines
Tumors nach Resektion
Überlebenszeit nach
Tumorresektion bei
Rezidiv
Kontrolle
(n= 20)
11 (55%)
8,4 ± 3,2
33,8 ± 8,6
Frost subcutan
(n= 19)
8 (42,1%)
7,1 ± 2,3
36,0 ± 9,4
pRSC subcutan
(n= 22)
11 (50%)
13,3 ± 8,3
42,2 ± 13,5
IL-12 subcutan
(n= 20)
11 (55%)
7,8 ± 1,5
41,0 ± 8,6
alle subcutan
(n= 61)
30 (49,2%)
9,8 ± 6,0
40,2 ± 10,9
Frost Milz
(n= 14)
6 (42,9%)
7,6 ± 2,6
50,4 ± 4,6
pRSC Milz
(n= 22)
13 (59,1%)
8,0 ± 2,6
36,8 ± 8,9
IL-12 Milz
(n= 14)
4 (28,6%)
8,8 ± 1,8
43,6 ± 5,4
alle Milz
(n= 50)
23 (46%)
8,1 ± 2,4
41,2 ± 9,2
alle Frost
(n= 33)
14 (42,4%)
7,3 ± 2,3
42,0 ± 10,5
alle pRSC
(n= 44)
24 (54,5%)
10,4 ± 6,4
39,2 ± 11,3
alle IL-12
(n= 34)
15 (44,1%)
8,1 ± 1,6
41,9 ± 7,6
Tabelle 6: Mittleres Überleben mit Standardabweichung der Überlebenszeitanalyse in Tagen nach
makroskopischer R0 Resektion. 7 Tage nach Tumorimplantation erfolgte zum gleichen Zeitpunkt eine autologe
Tumorzellvakzination in die Milz oder subcutan. Zeit bis zum makroskopischen Wiederauftreten des
Tumors:Globaltest: (ANOVA p<0,04), Einzelgruppenvetrgleiche: (Student-Newman-Keuls- Prozedur: p=0,085),
Überlebenszeit: Globaltest: p=0,04, Scheffe`Prozedur p=0,086.
Tumorrezidivrate: Die Rezidivrate schwankte in dieser Gruppe zwischen 29% und
59%. Die niedrigste Rate trat bei der Gruppe IL-12 Milz (29%) und die Höchsten in
den Gruppen pRSC Milz (59%), IL-12 subcutan (55%) und Kontrolle (55%) auf. Die
geringste Tumorrezidivrate bei der Untersuchung der Impflokalisation zeigte sich bei
allen Tieren, die in die Milz (46%) geimpft wurden (subcutan 49% und Kontrolle
55%). Signifikante Unterschiede bestanden nicht.
40
Ergebnisse Experiment Maus Tumormodell Lewis Lung Karzinom
Zeit bis zum makroskopischen Wiederauftretens eines Tumors: Die Zeit bis zum
Wiederauftretens eines Tumors nach R0-Resektion und Vakzination zeigte einen
globalen signifikanten Unterschied zwischen den Gruppen. Die Gruppen pRSC
subcutan (13 d) und pRSC Milz (9 d) zeigten hierbei die längste tumorfreie Zeit.
Fasst man nach Art der Vakzine bzw. Impflokalisation zusammen, erkennt man einen
Vorteil für die entsprechenden Therapiegruppen versus Kontrolle. Der Tumor trat hier
2 bis 3 Tage später auf.
Überlebenszeit: Im globalen Test ANOVA zeigte sich auch in der Überlebenszeit,
d.h. falls es zu einem Rezidiv kam (Zeitraum bis zum Tod), ein signifikanter
Unterschied zwischen den Gruppen. Im Durchschnitt lebten die Tiere der
Therapiegruppen 9 Tage länger als die der Kontrollgruppe. Eine Signifikanz im
Einzelgruppenvergleiche wurde hier knapp verfehlt. Auch bei Betrachtung der
Impflokalisation und Vakzinart bestätigte sich ein Vorteil für die Therapiegruppen.
Metastasierungsrate: Die Metastasierungsrate schwankte nach R0-Resektion
zwischen 75% bis 100%. Die geringsten Raten präsentierten sich in den Gruppen
pRSC Milz (75%) und Kontrolle (77%). 100%-iges Auftreten zeigten die Gruppen
Frost Milz und IL-12 Milz. Bezüglich der Differenzierung zwischen dem Auftreten von
Metastasen in der Lunge bzw. Leber konnten sich innerhalb der Gruppen keine
signifikanten Unterschiede manifestieren. In der Gruppe pRSC Milz traten die
wenigsten Lungen (70%)- und Lebermetastasen (39%) auf.
Tumorwachstum:
Abbildung
16
zeigt
den
Wachstumsverlauf.
Eine
stete
Größenzunahme war in allen Gruppen zu erkennen, wobei die größten Tumoren in
der Gruppe subcutan Frost vorkamen. Das geringste Wachstum zeigte die Gruppe
pRSC subcutan. Statistisch knapp die Signifikanz verfehlende Unterschiede wurden
an den Tagen 22 und 26 deutlich.
41
Ergebnisse Experiment Maus Tumormodell Lewis Lung Karzinom
Abbildung 16: Mittleres Tumorwachstum mit Standardabweichung (Tumorquerschnitt in Hautoberfläche) der
Überlebenszeitanalyse. 7 Tage nach intradermaler Implantation des Lewis Lung Karzinoms wurde der Tumor R0
reseziert, zum gleichen Zeitpunkt erfolgte eine autologe Tumorzellvakzination in die Milz bzw. subcutan.
Einzelgruppenvergleich (Student-Newman-Keuls): Frost subcutan versus pRSC subcutan verfehlt Signifikanz
knapp, Tag 22: p=0,072, Tag 26: p=0,065; Globaltest (ANOVA): Tag 26: p=0,077, Tag 32: p=0,051
42
Ergebnisse Experiment Maus Tumormodell Lewis Lung Karzinom
4.2.3
Ergebnisse nach R1/2-Resektion
Gruppe/ Lokalisation der
Vakzination
R1/2-Resektion
Auftreten eines
Tumorrezidivs nach
Resektion und
Vakzination (absolute
Anzahl in Prozent)
Zeit bis zum
makroskopischen
Wiederauftreten eines
Tumors nach Resektion
Überlebenszeit nach
Tumorresektion bei
Rezidiv
Kontrolle (n= 10)
7 (70%)
7,7 ± 1,8
38,6 ± 10,3
Frost subcutan
(n= 11)
6 (54,5%)
11,0 ± 5,3
41,3 ±7,8
pRSC subcutan
(n= 8)
5 (62,5%)
6,8 ± 1,8
33,2 ± 4,6
IL-12 subcutan
(n= 9)
1 (11,1)
12
48
alle subcutan
(n= 28)
12 (42,9)
9,3 ± 4,4
38,5 ± 7,7
Frost Milz
(n= 8)
5 (62,5%)
8,8 ± 4,6
27,2 ± 9,2
pRSC Milz
(n= 5)
4 (80%)
7,5 ± 1,9
35,5 ± 11,1
IL-12 Milz
(n=9)
6 (66,7%)
8,0 ± 1,3
36,7 ± 5,9
alle Milz
(n= 22)
15 (68,2%)
8,1 ± 2,8
33,2 ± 9,1
alle Frost
(n= 19)
11 (57,9%)
10,0 ± 4,9
34,9 ± 10,9
alle pRSC
(n= 13)
9 (69,2)
7,1 ± 1,8
34,2 ± 7,6
alle IL-12
7 (38,9%)
8,6 ± 1,9
38,3 ± 6,9
(n= 18)
Tabelle 7: Mittleres Überleben und Standardabweichung der Überlebenszeitanalyse in Tagen nach
makroskopischer R1/2 Resektion 7 Tage nach Tumorimplantation erfolgte zum gleichen Zeitpunkt eine autologe
Tumorzellvakzination in die Milz oder subcutan. Globaltest: (ANOVA) p<0,04 Einzelgruppenvergleich: (StudentNewman-Keuls):Frost subcutan versus pRSC subcutan verfehlt Signifikanz knapp, Tag 22 p=0,072, Tag 26
p=0,065 Globaltest: (ANOVA): Tag 26 p=0,077, Tag 32 p=0,051. Tumorrezidivrate: Chi-Quadrat-Test nach
Pearson p=0,09 für IL-12 subcutan, Chi-Quadrat-Test nach Pearson p=0,068 für Gruppe subcutan.
Tumorrezidivrate: Die Rezidivrate schwankte zwischen 11% und 80%. Wobei man
hier die geringe Gruppenstärke nach R1/2 Resektion beachten muss. Eine 11%-ige
Rezidivrate zeigte die Gruppe IL-12 subcutan (Chi-Quadrat-Test nach Pearson
p=0,09 verfehlt Signifikanz knapp), die anderen Gruppen lagen annähernd gleich bei
ca. 62 % bis 80%. Nach subcutaner Vakzination deutete sich ebenfalls ein Vorteil für
diese Gruppe an.
43
Ergebnisse Experiment Maus Tumormodell Lewis Lung Karzinom
Zeit bis zum makroskopischen Wiederauftreten eines Tumors: Signifikante
Unterschiede konnten nicht gefunden werden. Visuell beobachtete man ein
beginnendes Tumorwachstum in allen Gruppen zwischen dem 7. und 8. Tag.
Ausnahme bildete die Gruppe Frost subcutan, Tumorwachstumsbeginn ist am 11.
Tag. Zu berücksichtigen ist auch hier die relativ hohe Standardabweichung.
Überlebenszeit: Bei der Betrachtung der Überlebenszeit ergaben sich keine
signifikanten Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen. Interessant ist, dass aus
der Gruppe IL-12 subcutan ein einzelnes Versuchstier, welches ein Rezidiv
entwickelte, mit 48 Tagen am längsten überlebte. Weiterhin ließ die Gruppe Frost
subcutan einen visuellen Vorteil vermuten.
Metastasierungsrate: Neben den Gruppen pRSC subcutan (50%), pRSC Milz
(75%) und IL-12 Milz (80%) zeigten alle anderen Gruppen eine Metastasierungsrate
von 100%. Dieser Unterschied war auch statistisch auffällig (Globaltest Chi-QuadratTest nach Pearson p<0,02). Des Weiteren ergibt sich ein signifikanter Unterschied
für die Art der Vakzine. Hier zeigte sich eine geringere Rate für pRSC geimpfte Tiere
(Chi-Quadrat-Test nach Pearson p=0,006).
In der Kontrollgruppe kamen im Vergleich zu den Therapiegruppen in 100%
Metastasen vor.
Tumorwachstum: Die Betrachtung der Wachstumskurven zeigte einen flacheren
Verlauf ab dem 16. Tag für die Gruppen IL-12 Milz und Frost subcutan. Die Gruppe
IL-12
subcutan
konnte
aufgrund
niedriger
Tieranzahl
(n=1)
für
die
Übersichtsdarstellung nicht verwendet werden.
Im Zeitraum zwischen 32. und 38. Tag wurde im Vergleich der Vakzine IL-12 und
pRSC ein Vorteil für IL-12 sichtbar. Die Signifikanz wurde knapp verfehlt.
44
Ergebnisse Experiment Maus Tumormodell Lewis Lung Karzinom
Abbildung 17: Mittleres Tumorwachstum mit Standardabweichung (Tumorquerschnitt in Hautoberfläche) der
Überlebenszeitanalyse. 7 Tage nach intradermaler Implantation eines Lewis Lung Karzinoms wurde der Tumor
reseziert, zum gleichen Zeitpunkt erfolgte eine autologe Tumorzellvakzination in die Milz oder subcutan.
Zusammengefasst nach der R1/2 Resektion.
Abbildung 18: Mittleres Tumorwachstum mit Standardabweichung (Tumorquerschnitt in Hautoberfläche) der
Überlebenszeitanalyse. 7 Tage nach intradermaler Implantation eines Lewis Lung Karzinoms wurde der Tumor
45
Ergebnisse Experiment Maus Tumormodell Lewis Lung Karzinom
reseziert, zum gleichen Zeitpunkt erfolgte eine autologe Tumorzellvakzination in die Milz oder subcutan.
Zusammengefasst nach der Art der Vakzine nach R1/2-Resektion. Globaltest: (ANOVA): Tag 32 p=0,061; Tag 36
p=0,082 und Tag 38 p=0,057 verfehlen Signifikanz knapp; Tag 40 p=0,019 Einzelgruppenvergleich (StudentNewman-Keuls): Tag 32 IL-12 versus pRSC p=0,091; Tag 36 IL-12 versus pRSC p=0,094 Tag 38 IL-12 versus
pRSC p=0,058 verfehlen Signifikanz knapp (Post-Hoc-Test): Tag 40 Frost versus pRSC p=0,033, IL-12 versus
pRSC p=0,031 Die Darstellung der Wachstumskurven erfolgte bis Tag 40. Die Tieranzahl sank ab diesem Tag bei
fast allen Gruppen auf unter 3 Tiere.
4.3
Ergebnisse der Überlebenszeitanalyse nach Tumorreimplantation
Bei allen tumorfrei überlebenden Mäusen erfolgte 119 Tage (17 Wochen) nach
Tumorresektion und Vakzination eine erneute Tumorzellimplantation.
Tumorrezidivrate: Die Rezidivrate betrug 100% in allen Gruppen.
Zeit bis zum makroskopischen Wiederauftretens eines Tumors: Bis zum
Auftreten eines Tumors konnten keine signifikanten Unterschiede herausgearbeitet
werden. Im Durchschnitt dauerte es 10 Tage.
Überlebenszeit: Bei der Betrachtung der Überlebenszeit mit Tumor bis zum
Zeitpunkt des Todes ergab sich ein knapp die Signifikanz verfehlender Unterschied
zwischen den Gruppen (Globaltest ANOVA p=0,083). Die längste Überlebenszeit
kam in der Gruppe IL -12 subcutan mit 52,2 Tagen vor. Fasst man nach der Art der
Vakzine zusammen, ergab sich eine Signifikanz im Globaltest ANOVA (p=0,018).
Vergleicht man die einzelnen Gruppen untereinander, konnte ein signifikanter
Unterschied zwischen IL-12 versus Frost (Scheffe`Prozedur p=0,026) aufgezeigt
werden. Die Überlebenszeit der Gruppe Frost mit 44 Tagen ist signifikant kürzer als
die der Gruppe IL-12 mit 51,2 Tagen.
Metastasierungsrate: Bezüglich der Metatstasierungsrate ergaben sich keine
signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen. Die Rate schwankte zwischen
88% und 100%, was durch die hohe Rezidivrate zu vermuten war. Wenn auch nur
gering, war ein Vorteil für die Therapiegruppen zu verzeichnen. Gegenüber der
Kontrollgruppe, die 100% Metastasen aufzeigte, lag die Rate der therapierten Tiere
im 90%-igen Bereich.
Lungen- und Lebermetastasen traten bei allen Tieren auf, wobei mehr Metastasen in
der Lunge beobachtet wurden als in der Leber.
46
Ergebnisse Experiment Maus Tumormodell Lewis Lung Karzinom
Tumorwachstum: In der Abbildung 19 ist das Tumorwachstumsverhalten der
einzelnen Gruppen dargestellt. Signifikante Unterschiede des Tumorwachstums sind
zu Beginn und im mittleren Abschnitt der Kurven zu beobachten. Die Gruppen IL-12
subcutan und IL-12 Milz zeigten einen flacheren Kurvenverlauf und eine geringere
Tumorgröße im Gegensatz zu den Vergleichsgruppen.
Das Zusammenfassen der einzelnen Vakzine (Abbildung 20) bestärkt diese
Erkenntnis. Deutliche Vorteile für die Gruppe IL-12 konnten über nahezu den
gesamten Zeitraum beobachtet werden.
Bezüglich der Impflokalisation waren die Tage 21 bis 27 hervorzuheben, da sich in
diesem Bereich ein signifikanter Vorteil für subcutane Vakzination ergab.
Abbildung 19: Mittleres Tumorwachstum mit Standardabweichung nach Tumorreimplantation (Tumorquerschnitt
in der Hautoberfläche) der Überlebenszeitanalyse. Nach intradermaler Implantation eines Lewis Lung Karzinoms
erfolgte eine Tumorresektion und autologe Tumorzellvakzination. Allen tumorfrei überlebenden Tieren wurde
erneut ein Lewis Lung Karzinom implantiert. Globaltest: (ANOVA):Tage 7 bis 13 p=0,004 bis 0,049, Tage 29 bis
39 p=0,001 bis 0,045 Einzelgruppenvergleiche: (Scheffe`Prozedur): IL-12 Milz versus pRSC Milz Tag 7
(p=0,074)verfehlen knapp, Kontrolle versus IL-12 subcutan Tag 35 p=0,033 (Student Newman Keuls): Kontrolle
versus IL-12 subcutan Tage 7, 23, 31, 35, 37 p=0,052 bis 0,073
47
Ergebnisse Experiment Maus Tumormodell Lewis Lung Karzinom
Abbildung 20: Mittleres Tumorwachstum mit Standardabweichung nach Tumorreimplantation (Tumorquerschnitt
in der Hautoberfläche) der Überlebenszeitanalyse. Nach intradermaler Implantation eines Lewis Lung Karzinoms
erfolgte eine Tumorresektion und autologe Tumorzellvakzination. Allen tumorfrei überlebenden Tieren wurde
erneut ein Lewis Lung Karzinom implantiert. Zusammengefasst nach der Art der Vakzine Globaltest: (ANOVA):
Tage 13, 14 p=0,016, 0,033, Tage 29 bis 49 p<0,001 bis p=0,049, Einzelgruppenvergleiche: (Scheffe`Prozedur):
IL-12 versus Frost Tag: 13, 17, 33, 35, 37, 39 p=0,003 bis p=0,063, IL-12 versus pRSC: Tage: 31, 33, 35, 37, 39,
43, 47, p=0,003 bis 0,049, IL-12 versus Kontrolle Tage 35, 37 p=0,002, p=0,049
48
Ergebnisse Experiment Maus Tumormodell Lewis Lung Karzinom
Abbildung 21: Mittleres Tumorwachstum mit Standardabweichung nach Tumorreimplantation (Tumorquerschnitt
in der Hautoberfläche) der Überlebenszeitanalyse. Nach intradermaler Implantation eines Lewis Lung Karzinoms
erfolgte eine Tumorresektion und autologe Tumorzellvakzination. Allen tumorfrei überlebenden Tieren wurde
erneut ein Lewis Lung Karzinom implantiert. Zusammengefasst nach Impflokalisation. Globaltest: (ANOVA):
Tage: 21, 23, 25, 27 p=0,025 bis p=0,047 Einzelgruppenvergleiche: (Scheffe´Prozedur): subcutan versus Milz
Tage 21, 25, 27: p=0,041, 0,03, 0,045
49
Ergebniszusammenfassung
5. Ergebniszusammenfassung
R-Status
Ergebnis Melanom
Ergebnis Lewis Lung
Karzinom
13-31%
Frost subcutan 13%
41-63%
IL-12 subcutan 41%
alle IL-12 42%
zwischen 9 und 23 Tagen
(Vorteil für alle
Therapiegruppen)
zwischen 7 und 11 Tagen
(pRSC subcutan 11 Tage)
Überlebenszeit
zwischen 26 und 41 Tagen
(pRSC subcutan 41 Tage)
zwischen 37 und 42 Tagen
(IL-12 subcutan 42 Tage)
Metastasierungsrate
zwischen 7-19%
(pRSC Milz 7% und Frost
Milz 9%)
zwischen 75-100%
(pRSC Milz 75%)
Tumorwachstum
geringste
Tumorgrößenzunahme
pRSC Milz,
pRSC bzw. Milz vs.
Kontrolle
(Tag 6 und 10 signifikant)
Tumorrezidivrate
Zeit bis zum
makroskopischen
Wiederauftreten eines
Tumors
R0
7-25%
Frost subcutan 7%, IL-12
Milz 9%
IL-12 und subcutan 14%
Kontrolle 20%
29-59%
IL-12 Milz 29%
Milz 46%, subcutan 49%
Zeit bis zu
makroskopischen
Wiederauftreten eines
Tumors
R0
alle Therapiegruppen besser
vs. Kontrolle
pRSC subcutan und pRSC
Milz längste tumorfreie Zeit
Überlebenszeit
R0
Milz am längsten
alle Therapiegruppen besser
R0
geringe Metastasierung 824%
pRSC Milz 8%, Frost Milz
10%, IL-12 Milz 13%
antimetastatischer Effekt?
(Milz 10% vs. subcutan
29%)
75-100%
pRSC Milz 75%
R0
Milz besser vs. Kontrolle
Geringstes Wachstum pRSC
subcutan
R1/2
20-80%
(wenig Tiere)
11-80%
IL-12 subcutan 11%
R1/2
alle Therapiegruppen besser
pRSC Milz am spätesten
keine Unterschiede
R1/2
alle Therapiegruppen besser
vs. Kontrolle
IL-12 subcutan lebte am
längsten
(Cave 1 Tier)
Tumorrezidivrate
alle Therapiegruppen besser
Metastasierungsrate
Tumorwachstum
Tumorrezidivrate
Zeit bis zum
makroskopischen
Wiederauftreten eines
Tumors
Überlebenszeit
50
Ergebniszusammenfassung
Metastasierungsrate
R1/2
Gelegentlich
Lungenmetastasen
pRSC subcutan 50%, pRSC
Milz 75%
R1/2
pRSC und IL-12 Vorteil
Il-12 Milz und Frost
subcutan,
IL-12 Vorteil
Tumorwachstum
Tumorrezidivrate
Zeit bis zum
makroskopischen
Wiederauftreten eines
Tumors
Überlebenszeit
Metastasierungsrate
Tumorwachstum
Tumor89-100%
reimplantation
100%
TumorpRSC subcutan längste
reimplantation tumorfreie Zeit
keine Unterschiede
Tumoralle Therapiegruppen besser
reimplantation
IL-12 subcutan am längsten
Tumor9-20%
reimplantation IL-12 Milz 9%
88-100%
(mehr Lungen-als
Lebermetastasen)
Tumoralle Therapiegruppen
reimplantation IL-12, pRSC
signifikant
IL-12 am besten,
subcutan signifikant
besser (21-27d)
Tabelle 8: Zusammenfassung der Ergebnisse (hervorgehoben sind signifikante Werte )
5.1
Ergebnisse Melanom
Insgesamt zeigte sich ein Vorteil für alle Therapiegruppen bezüglich der
Tumorrezidivrate (13%-31%), der Zeit bis zum Wiederauftreten eines Tumors, der
Überlebenszeit, der Metastasierungsrate und der Tumorwachstumsgeschwindigkeit.
Bei letzterem ergaben sich vereinzelt signifikante Vorteile für die Gruppe Milz an den
Tagen 6 und 10. Hervorzuheben sei weiterhin eine geringere Metastasierungsrate
nach Vakzination in die Milz (pRSC Milz 7%, Frost Milz 9%).
Berücksichtigt man den R0-Status, ergaben sich Vorteile für die Gruppe IL-12 Milz
bezüglich
der
Tumorrezidivrate
(9%)
und
Überlebenszeit.
Die
geringsten
Metastasierungsraten zeigten pRSC Milz (8%), Frost Milz (10%) und IL-12 Milz
(12%). Alle Therapiegruppen schnitten besser ab als die Kontrollgruppe.
Nach R1/2-Resektion ergaben sich variable Gruppenstärken zwischen n=2 bis n=17.
In der Gruppe pRSC Milz konnte die längste tumorfreie Zeit beobachtet werden (28
Tage vgl. Kontrolle 8 Tage)
Bezüglich Überlebenszeit und Tumorwachstum bestanden Vorteile für alle
Therapiegruppen gegenüber der Kontrollgruppe, insbesondere IL-12 und pRSC
zeigten visuelle Vorteile (Abbildung 11).
51
Ergebniszusammenfassung
Nach
Tumorreimplantation
betrug
die
Tumorrezidivrate
89%-100%.
Die
Metastasierungsrate war in der Gruppe IL-12 Milz mit 9% am geringsten.
Überlebenszeit
und
Tumorwachstumsrate
erbrachten
einen
Vorteil für alle
Therapiegruppen gegenüber der Kontrollgruppe. In den Gruppen IL-12 Milz, IL-12
subcutan, pRSC Milz und pRSC subcutan wird ein reduziertes Tumorwachstum
beobachtet.
5.2
Ergebnisse Lewis Lung Karzinom
Die Tumorrezidivrate nach Tumorresektion und Vakzination schwankte zwischen
41% bis 63%. Ein Benefit ergab sich für die Gruppe der mit IL-12 geimpften Tiere. In
dieser Gruppe betrug die Rezidivrate 42% (vgl. Frost 48%, pRSC 58%, Kontrolle
59%).
Bei allen Therapiegruppen trat ein Tumor später auf als in der Kontrollgruppe. Hier
schnitt die Gruppe pRSC subcutan (11 Tage) am besten ab. Das längste Überleben
nach Tumorresektion und Vakzination zeigt die Gruppe IL-12 subcutan (41,6 Tage
vgl. Kontrolle 35,8 Tage). Metastasen traten mit einer Häufigkeit von 75%-100% auf.
Nach R0-Resektion ergab sich insgesamt eine Tumorrezidivrate von 29%-59%. Am
besten präsentierte sich die Gruppe IL-12 Milz mit 29%.
Bezüglich Überlebenszeit kann ein Vorteil für alle Therapiegruppen aufgezeigt
werden. Die Metastasierungsrate nach R0-Resektion ergab 75%-100%. Wobei die
Gruppe pRSC Milz mit 75% die niedrigste Metastasierung zeigte. Alle anderen
Gruppen hatten zu 100% Metastasen. In der Gruppe pRSC Milz befanden sich mehr
Metastasen in der Leber als in der Lunge.
Nach R1/2-Resektion ergab sich eine Tumorrezidivrate von 11% und 80%, wobei IL12 subcutan die niedrigste Rate hatte. In dieser Gruppe gab es nur 1 Tier, welches
jedoch am längsten von allen Tieren jeder Gruppe mit Tumor überlebte. Die
geringste Metastasierung zeigte sich in der Gruppe pRSC subcutan mit 50% (pRSC
Milz 75%, IL-12 Milz 80%). Das Tumorwachstum zeigte insgesamt einen Vorteil für
die
Gruppe
IL-12
Milz.
Am
Tag
16
konnte
ein
signifikant
geringeres
Wachstumsverhalten gegenüber allen anderen Gruppen hervorgehoben werden.
Nach Tumorreimplantation entstanden zu 100% Rezidive. Die Überlebenszeit für IL12 beimpfte Tiere betrug mit 51,2 Tagen deutlich länger als die der Gruppe Frost (44
Tage). Metastasen traten zu 80% bis 100% auf, wobei mehr Lungen- als
Lebermetastasen gefunden worden.
52
Ergebniszusammenfassung
Für die Gruppe IL-12 Milz und IL-12 subcutan konnte im Tumorwachstumsverlauf
eine geringere Tumorgrößenzunahme beobachtet werden (Abbildung 19).
53
Diskussion
6. Diskussion
In der vorliegenden Arbeit wurde überprüft, ob durch eine intraoperative autologe
Tumorzellvakzination ein antitumoraler Effekt erzielt werden kann. Des Weiteren
wurde untersucht, ob durch die Applikation eines IL-12 sezernierenden Impfstoffs
direkt in die Milz eine stärkere Wirkung erreicht werden kann als nach subcutaner
Impfung.
Die Verwendung autologer Tumorzellen ist Gegenstand vieler Untersuchungen,
wobei andere Autoren die Vakzine meist postoperativ applizieren. Über die
Möglichkeit der Darreichung des Impfstoffes während der Operation und zusätzlich in
die Milz sind in der Literatur nur wenige Publikationen zu finden.
Unter Umgehung der Zellkultur wurde in diesem Versuch ein frischer whole cell
Impfstoff intraoperativ eingesetzt, der alle Tumorzellklone und somit potentiell das
gesamte Tumorantigenspektrum präsentiert.
Vakzinationen die im Intervall nach Tumorzellentnahme vorgenommen werden, sind
nur über Zwischenschritte einer in-vitro-Kultur möglich. Neben einem enormen
Zeitaufwand bei dieser Methode ist weiterhin von Nachteil, dass meist nur ein Klon
in-vitro heranwächst, der dann als Impfstoff dient. Dabei ist es möglich, dass dieser
einzelne Zellklon nur einen geringen Teil der Antigene des polyklonalen Tumors
präsentiert. Fraglich ist auch, ob dieser einzelne Zellklon in Metastasen des Tumors
vorkommt.
Mit
steigender
Anzahl
der
in-vitro-Zellpassagen
kommt
es
zusätzlich
zur
Veränderungen in der Genexpression und somit auch zur Veränderungen der
Expression der Antigene (76, 92).
Mit Hilfe der Genkanone ist eine Transfektion von Tumorzellen nach mechanischer
Zerkleinerung im stand by möglich (81, 97).
Im Experiment wurden jedoch keine Tumorzellproben zur Herstellung des Impfstoffes
verwendet, sondern Zellen aus derselben Kultur. 7 Tage nach Tumorimplantation
erfolgte die Herstellung der Vakzine genau aus diesen Tumorzellen. Nachdem der
Tumor reseziert wurde, standen die Zellen für eine Vakzination zur Verfügung.
54
Diskussion
Lymphatische Organe wie Lymphknoten oder Milz zeichnen sich durch das
Vorhandensein von Zellen des Immunsystems auf engstem Raum aus, dadurch
scheint dies ein geeigneter Ort, um die Vakzine direkt zu verabreichen (16, 22, 24).
Impfungen in die Milz oder Lymphknoten werden unterschiedlich diskutiert, wobei die
Mehrheit davon ausgeht, dass diese Impfungen effektiver sind als die bisherige
subcutane Variante (16, 26, 51).
Die Entwicklung tumorspezifischer T-Zellen und Antikörper nach Vakzination in die
Milz wurde in der Literatur wenig beschrieben (103, 109). Bei Zhou handelt es sich
um ein mRNA
Melanom Vakzin, welches direkt in die Milz von Versuchstieren
injiziert wurde. Das Resultat zeigte ein verzögertes Tumorwachstum und ein
signifikant verlängertes Überleben im Vergleich zur Kontrollgruppe (105). Kündig
schilderte ebenfalls eine deutliche Verstärkung der Immunantwort und einen
Überlebensvorteil nach Impfung in die Milz. In diesem Zusammenhang wurde sogar
angenommen, dass eine aufwändige Genmodifikation unter Zugabe von Adjuvantien
nicht notwendig sei (52). Bislang konnte diese Annahme nicht bestätigt werden.
Gegenteilige Untersuchungen wurden von Cayeux beschrieben. Hier kam es nach
Impfung mit nativen autologen Tumorzellen zu Veränderungen in der Milz, jedoch
ohne
eine
messbare
systemische
Immunantwort.
Beobachtet
wurde
eine
Immunsuppression (16).
Bezüglich der Vakzination in andere lymphatischen Organe wie z. B. den
Lymphknoten gibt es ebenfalls sehr wenige Daten. Jonuleit konnte in seinen
Versuchen nachweisen, dass es zu einer Steigerung der antigen-spezifischen CD4+
T-Zell- Antwort und zu einer Vermehrung von peptidspezifischen INF-gamma
produzierender CD8+ T-Zellen nach Vakzination mit gepulsten dendritischen Zellen
im Lymphknoten kommt (41). Ebenso konnte Maloy in seinen Studien zeigen, dass
nach Injektion ihrer DNA-Vakzine intramuskulär, intradermal oder in periphere
Lymphknoten eine starke Immunantwort ausgelöst wurde, wobei schon geringere
Mengen im Lymphknoten ausreichten, um CD8+ zytotoxische T-Zellen zu aktivieren
(61). Weiterhin berichtete Johansen über Impfungen von mit Peptiden versetzten
Vakzine die eine 106-fach stärkere Immunantwort nach direkter Applikation in die
Lymphknoten auslösten, als vergleichsweise nach subcutaner oder intradermaler
Gabe (40).
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen lassen ein entsprechend großes Potential
nach Vakzination in lymphatische Organe vermuten.
55
Diskussion
Unabhängig von der Impflokalisation sind heute gentechnische Modifikationen der
Tumorzellen das bevorzugte Vorgehen zur Verstärkung der Immunantwort nach
Impfung. Je nach Art und Aktivität der Zytokine, die mit dem Impfstoff verabreicht
werden, erfolgt die Steuerung des Immunsystems. Mit einer entsprechend guten
Auswahl der Zytokine können die Bedingungen für eine effektivere Immunantwort
verbessert werden (15). Welches Adjuvanz die optimale Immunisierung hervorruft, ist
dabei nicht geklärt.
In dieser Arbeit wurde das Zytokin IL-12 eingesetzt, da in der Literatur eine positive
Wirkung in der Mehrheit diskutiert wird. IL-12 wird überwiegend von Makrophagen,
dentritischen Zellen und B-Lymphozyten synthetisiert und stellt ein wichtiges
Bindeglied der Immunregulation dar. Seine biologische Hauptwirkung besteht darin,
T-Zellen und NK-Zellen zu aktivieren und insbesondere die Zytokinproduktion (INFgamma) zu steigern (71, 74, 88, 104). In Tierexperimenten konnte ein direkter
antitumoraler Effekt nachgewiesen werden (79, 95).
Weitere Versuche zeigten eine Erhöhung der CD4+ und CD8+ T-Zellen nach
Beimpfung mit IL-12 in Splenozyten (93).
Im vorliegenden Experiment erfolgte die Vakzination intraoperativ in die Milz oder
subcutan.
Als
Untersuchungsparameter
dienten
die
Überlebenszeitanalyse,
Tumorrezidivrate und Zeit bis zum makroskopischen Wiederauftreten eines Rezidivs.
In jedem Fall konnte gezeigt werden, dass nach einmaliger intraoperativer
Vakzination ein (teilweise signifikanter) antitumoraler Effekt erzielt wurde. Eine
immunsuppressive Wirkung wie bei Cayeux (16) konnte durch unsere gewonnenen
Daten nicht bestätigt werden.
Nachdem in ersten Untersuchungen (93) mit einem Melanom, eine Tendenz
bezüglich Impfung in die Milz herausgearbeitet werden konnte, jedoch mit zu
geringer Fallzahl, erfolgte nun eine Weiterführung und Aufarbeitung mit grösserer
und demzufolge aussagekräftigerer Tieranzahl und einer zweite Zelllinie (Lewis Lung
Karzinom). Um die Vergleichbarkeit der Gruppen nach der Operation zu
gewährleisten, wurden diese nach dem Status der Tumorresektion eingeteilt. Auch
dies war in Vorversuchen mit deutlich weniger Tieren nicht möglich (93). Angemerkt
sei an dieser Stelle, dass bei der Beurteilung des R-Status intraoperativ nach
makroskopisch sicherer Resektion R0 bzw. bei makroskopisch nicht sicherer
Resektion R1/2 unterschieden wurde. Eine histopathologische Untersuchung erfolgte
56
Diskussion
nicht, da ein genaues Staging bezüglich des möglichen Vorhandenseins von
Satelliten-, Lymphknoten- oder Fernmetastasen in unserem Maus Modell nicht
möglich war.
Somit ergab es sich, dass Tiere nach vermeintlicher R0-Resektion dennoch ein
Rezidiv entwickelten bzw. nach R1/2 Resektion kein Rezidiv ausbildeten. Ob dies
Residuen des Primärtumors, einer Metastase oder vom Einstichkanal der Nadel
waren, blieb hypothetisch.
Tiere, die ein Tumorrezidiv entwickelten, zeigten bezüglich tumorfreier- und
Gesamtüberlebenszeit, Tumorwachstum und Metastasierung Vorteile für alle
Therapiegruppen gegenüber der Kontrollgruppe. Unabhängig von der Rezidivrate,
die insbesondere durch den R-Status bestimmt wird, führte eine Vakzination zu
einem Überlebensvorteil.
Betrachtete man die Gruppen unter Einteilung nach der Impflokalisation, so ergab
sich für keine der Lokalisationen, subcutan oder Milz, ein signifikanter Vorteil. Nach
Vakzination in die Milz konnte eine signifikant geringere Metastasierungsrate
beobachtet werden.
Hervorzuheben sind die Ergebnisse nach R0-Resektion, da hier von einer nahezu
vollständigen Entfernung des Tumors auszugehen war, somit wäre weniger bis keine
Tumormasse vorhanden und eine adjuvante Therapie mit dem Vakzin eher
erfolgreich. Nach Zusammenfassen der beiden Tumormodelle konnten nach
Vakzination der IL-12 sezernierenden Tumorzellen in die Milz bezüglich Rezidivrate
und längstem Überleben die besten, jedoch nicht signifikanten Ergebnisse aufgezeigt
werden.
Beurteilt man die Gruppen nach Art der Vakzine ergibt sich kein signifikanter Vorteil
für IL-12 transfizierte Tumorzellen. Tendenziell zeigen sich Vorteile für IL-12
bezüglich der Tumorrezidivrate. IL-12 ist ein sonst erfolgreich genutztes Adjuvanz
(36, 104). Ein therapeutischer Effekt ergab sich auch bei der Gruppe pRSC. Das
Leerplasmid mit Tumorzellen enthält antigene DNA-Sequenzen, die eventuell diesen
Effekt hervorrufen könnte. Die geringste Wirksamkeit konnte bei frostgeschockten
Zellen beobachtet werden, was am ehesten mit dem Fehlen des Adjuvanz erklärt
werden kann. Ein Vorteil der frostgeschockten Zellen könnte sein, dass bei ihrer
Zerstörung ein mögliches intrazelluläres Antigen präsentiert wurde.
57
Diskussion
Laut Protokoll erfolgt die Tumorreimplantation 4 Wochen nach dem Tod des letzten
Tieres mit Tumor, da einige Tiere sehr spät ein Rezidiv entwickelten bzw. sie
überlebten mit Rezidivtumor sehr lange.
Ein geringer Vorteil zeigt sich für die Therapiegruppen gegenüber der Kontrollgruppe,
visuell. Der Grund dafür könnte das Ausbleiben der Langzeitimmunität nach
einmaliger Vakzination sein (51).
Im Versuch Melanom überlebten 4 Versuchstiere der Gruppen Frost subcutan (3)
und pRSC Milz (1) auch nach R0 oder R1/2-Resektion und Vakzination die
Tumorreimplantation. Normalerweise liegt die Anwachsrate beim Melanom bei ca.
100%. Möglich ist eine zufällige Begebenheit oder ein gutes Ansprechen des
Immunsystems auf die Vakzination. Mit der zweiten Tumorzelllinie konnten diese
Effekte nicht aufgezeigt werden. Die Tumoranwachsrate betrug hier 100%. Auch hier
konnten bezüglich Überlebenszeit keine signifikanten Unterschiede gezeigt werden,
jedoch visuell konnte ein Vorteil für IL-12 gezeigt werden.
Die Tiere entwickeln nach einer einmaligen Vakzination gewöhnlich keine
Langzeitimmunität. Eine Impfauffrischung (Boosterung) kann dagegen zu einer
Langzeitimmunität und stärkeren Immunantwort beitragen. Kundig fand heraus, dass
man die Effektivität eines Impfstoffes durch kontinuierliche Gabe über mehrere Tage
weiter steigern kann (51).
Eine Impfauffrischung war bei unserer Untersuchung nicht vorgesehen.
Schlussfolgernd kann durch die gewonnen Daten ausgesagt werden, dass durch das
hier verwendete Maus Tumormodell mit einer intraoperativen whole cell Vakzine ein
verlängertes Überleben der Therapiegruppen gegenüber der Kontrollgruppe erreicht
werden konnte. Für das Vakzin mit IL-12 transfizierten Tumorzellen ergaben sich
tendenzielle Vorteile für die Überlebenszeit, insbesondere im adjuvanten Ansatz
nach R0-Resektion und Applikation in die Milz. IL-12 besitzt eine zentrale Funktion
bei der Aktivierung der T-Helferzell-(TH1)-Immunantwort und der NK-Zellen, die im
Kampf gegen die Tumorzelle eine große Rolle spielen (62).
Ob die Milz letztlich ein geeigneter Ort als Impflokalisation für Tumorzellvakzine ist,
kann mit den vorliegenden Ergebnissen und nach literarischer Recherche nicht
eindeutig beurteilt werden, da jedoch tendenziell Vorteile zu erkennen sind und
diese in der wenigen Literatur positiv aufzeigt werden, sollte dies weiter untersucht
werden.
58
Diskussion
Neben der Suche nach der optimalen Lokalisation für den Impfstoff, scheint auch die
Frage nach dem besten Adjuvanz für die beste Immunreaktion nicht beantwortet. In
vielen weiteren Studien werden neben Zytokinen wie IL-12 auch apathogene Viren
als unspezifische Immunstimulatioren verwendet (37).
Ob eine intraoperative Vakzination sinnvoll ist, sollte in einem Vergleich mit einer
postoperativen Impfung mit und ohne Boosterung in gleichen Modellen untersucht
werden.
59
Zusammenfassung
7. Zusammenfassung
Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med.
Intraoperative autologe Tumorzellvakzination in die Milz oder subcutan im Maus
Tumormodell
eingereicht von
Susan Schürer geb. Endesfelder
angefertigt an der
Universitätsklinik Leipzig, Klinik und Poliklinik für Viszeral-, Transplantations-,
Thorax- und Gefäßchirurgie (komm. Direktoren PD Dr. Michael Bartels/ Prof. Dr. Uwe
Eichfeld )
betreut von
Prof. Dr. med. Arne Dietrich
Solide Tumoren haben im fortgeschrittenen Krankheitsstadium nach wie vor eine
schlechte Prognose.
Die Vorüberlegungen für diese Arbeit gingen von der Polyklonalität und Individualität
von Karzinomen aus. Aufgrund dieser Spezifität sollte in dieser Arbeit der Einsatz
einer
individuellen,
spezifischen
Immuntherapie/Vakzination
zur
Anwendung
kommen.
Als Tumormodell diente die C57/BL6 Maus mit dem autologen B16 Melanom bzw.
dem Lewis Lung Karzinom.
Es sollte untersucht werden, ob mit einem whole cell Vakzin, welches intraoperativ
(in stand by herstellbar) verabreicht wurde, ein antitumoraler Effekt erzielt werden
kann. Weiterhin wurde die Hypothese geprüft, ob durch gentechnische Veränderung
der Tumorzellen (Sekretion von IL-12) und Injektion der Vakzine in die Milz eine
Therapiesteigerung im Vergleich zur subcutanen Applikation erreicht wird.
60
Zusammenfassung
Die Vakzination von Tumorzellen wird in vielen Studien überprüft, die Applikation der
Vakzine erfolgt hierbei in der Regel postoperativ und subcutan. Postoperativ
bedeutet, dass der Impfstoff in aufwändigen Zellkulturen hergestellt wird, dabei
kommt es zum Verlust der Polyklonalität. Neben dem Verlust potentiell antigener
Klone kommt es in der Zellkultur zu einer Veränderung des Expressionsmusters der
darin heranwachsenden Zellen.
In einer Überlebenszeitanalyse sollte die Tumorrezidivrate, Tumorwachstum,
Überlebenszeit und die Metastasierung in Abhängigkeit von der Impflokalisation und
dem Impfstoff überprüft werden. Bei der Impflokalisation wird unterschieden
zwischen der Applikation in die Milz oder subcutan. Als Impfstoffe dienten
gefriergeschockte, mit dem Leerplasmid pRSC oder mit IL-12 transfizierte
Tumorzellen.
Zusammenfassend war zu beobachten, dass es Vorteile bezüglich Überlebenszeit,
Metastasierungsrate und Tumorrezidivrate für alle Therapiegruppen gab, die zum
Teil auch signifikant waren. Tendenziell waren eine verlängerte Überlebenszeit und
eine geringere Tumorgrößenzunahme nach Vakzination mit IL-12 modifizierten
Tumorzellen und eine geringere Metastasierungsrate nach Impfung direkt in die Milz
zu beobachten.
Unter Berücksichtigung des R-Status konnte dieser Effekt besonders nach R0Resektion noch deutlicher hervorgehoben werden. Alle Therapiegruppen profitierten
von der Vakzination. Die Tumorrezidivrate war nach IL-12-Milz-Impfung deutlich
geringer als in allen anderen Gruppen. Für einen antimetastatischen Effekt könnte
die niedrige Metastasierungsrate nach Impfung direkt in die Milz sprechen.
Nach R1/2-Resektion und Tumorreimplantation schnitten alle Gruppen, die mit IL-12
Tumorzellen versehen wurden, stets am besten ab. Die Milz als Impflokalisationsort
konnte auch hier im Bereich der Metastasierungrate positive Ergebnisse aufzeigen.
Die Ergebnisse waren mit kleinen Abweichungen bei beiden Tumorzelllinien ähnlich.
61
Anhänge und Verzeichnisse
8. Anhänge und Verzeichnisse
8.1
Literaturverzeichnis
1
Adamina M, Rosenthal R, Weber WP, Frey DM, Viehl CT, Bolli M, Huegli RW,
Jacob AL, Heberer M, Oertli D, Marti W, Spagnoli GC, Zajac P (2010)
Intranodal Immunization With a Vaccinia Virus Encoding Multiple Antigenic
Epitopes and Costimulatory Molecules in Metastatic Melanoma. Mol Ther
18(3):651-9
2
Arienti F, Sule-Suso J, Belli F (1996): Limited antitumor t cell response in
melanoma patients vaccinated with interleukin-2 gene-transduced allogenic
melanoma cells. Hum Gene Ther 7: 1955-63
3
Armstrong A, Eck SL (2003): EpCAM: A new therapeutic target for an old
cancer antigen. Cancer Biol Ther 2: 320-6
4
Banchereau I, Steinmann RM (1998): Dendritic cells and the control of
Immunity. Nature 392: 245-52.
5
Banchereau J, Palucka AK (2005): Dendritic cells as therapeutic vaccines
against cancer. Nat Rev Immunol 5: 296-306
6
Baral R (2005): Tumor vaccin: current trent in antigen specific immunotherapy.
India J Exp Biol 43: 389-406
7
Bocchia M, Bronte V, Colombo MP, De Vincentiis A, Di Nicola M, Forni G,
Lanata L, Lemoli RM, Massaia M, Rondelli D, Zanon P, Tura S (2000):
Antitumor vaccination: where we stand. Haematologia 85: 1172-1206
8
Bookstein R, Demers W, Gregory R, Maneval D, Park J, Wills K, (1996): P53
gene therapy in vivo of hepatocellular and liver metastatic colorectal cancer.
Semin Oncol. 23: 66-77
9
Brill TH, Kubler HR, Pohla H, Buchner A, Fend F, Schuster T, van Randenborgh
H, Paul R, Kummer T, Plank C, Eisele B, Breul J, Hartung R, Schendel DJ,
Gansbacher B (2009) Therapeutic vaccination with an interleukin-2-interferongamma-secreting allogeneic tumor vaccine in patients with progressive
castration-resistant prostate cancer: a phase I/II trial. Hum Gene Ther
20(12):1641-51
10
Burns VE, Carroll D, Ring C, Drayson M (2003): Antibody response to
vaccination and psychosocial stress in humans: relationships and mechanisms.
Vaccine 21: 2523–2534
11
Campbell, Malcolm "The Helios gene gun by BioRad." 2001
62
Anhänge und Verzeichnisse
12
Cao L, Kulmburg P, Veelken H, Mackensen A, Mezes B, Lindemann A,
Mertelsmann R, Rosenthal FM (1998): Cytokine gene transfer in cancer
therapy. Stem Cells 16 Suppl 1: 251-260
13
Li H, Jiang HJ, Ma MQ, Wei F, An XM, Ren XB. (2007).Vaccination with
allogeneic GM-CSF gene-modified lung cancer cells: antitumor activity
comparing with that induced by autologous vaccine. SourceDepartment of
Immunology, Tianjin Cancer Institute and Hospital, Tianjin Medical University,
Tianjin, China Cancer Biother Radiopharm. Dec 22(6):790-8
14
Carr-Brendel V, Markovic D, Smith M, Taylor-Papadimitriou J, Cohen EP
(1999): Immunity to breast cancer in mice immunized with X irradiated breast
cancer cells modified to secrete IL-12. J Immunother 22: 415-422
15
Cavallo F, Signorelli P, Giovarelli M, Musiani P, Modesti A, Brunda MJ,
Colombo MP, Forni G (1997): Antitumor Efficacy of Adenocarcinoma Cells
Engineered to produce Interleukin 12 (IL–12) or Other Cytokines Compared
with exogenous IL–12. Journal of the National Cancer Institut 89: 1049 – 1058
16
Cayeux S, Qin Z, Dorken B, Blankenstein T (2001) Decreased generation of
anti-tumor immunity after intrasplenic immunization. Eur J Immunol 31: 1392–
1399
17
Chen YM, Tsai CM, Perng RP (1999): Differential effects of different cytokines
on the tumorigenicity and immunogenicity of murine tumors. Zhonghua Yi Xue
Za Zhi (Taipei) 62: 807-16.
18
Cheng L, Ziegelhoffer PR, Yang NS (1993): In vivo promoter activity and
transgene expression in mammalian somatic tissues evaluated by using particle
bombardment. Proc Natl Acad Sci USA 90: 4455–4459
19
Cohen S, Miller GE, Rabin BS (2001) Psychological stress and antibody
response to immunization: a critical review of the human literature. Psychosom
Med 63: 7–18
20
Decken K, Kohler G, Palmer-Lehmann K, Wunderlin A, Mattner F, Magram J,
Gately MK, Alber G (1998) : Interleukin-12 is essential for a protective Th1
response in mice infected with cryptococcus neoformans. Infect Immun 66:
4994–5000
21
De Ridder M. (2000): Zunahme von Krebserkrankungen. Zahl wird durch die
Altersentwicklung bis 2030 um 50% steigen. www.zdf.msnbc.de/news 23.März
2000.
22
Dietrich A, Keitel R, Schönfelder M (1998): Gentherapie – Neue Möglichkeiten
der lokalen Immuntherapie maligner Tumore. Ärzteblatt Sachsen. 5: 244–249.
23
Dietrich A (2007): Effekte eines herkömmlichen in vivo Gentransfers mit
verschiedenen Genen und einer intraoperativen Tumorzellvakzination in die
Milz im Maus Tumormodell: Thesis, Leipzig University
63
Anhänge und Verzeichnisse
24
Dietrich A, Kraus K, Brinckmann U, Friedrich T, Muller A, Liebert UG,
Schoenfelder M (2002) Complex cancer gene therapy in mice melanoma.
Langenbecks Arch Surg 387: 177–182
25
Eigentler TK, Caroli UM, Radny P, Garbe C (2003): Palliative therapy of
dissiminates malignant melanoma: a systemic review of 41 randomised clinical
trails. Lancet Oncol 4: 748-59
26
Eggert AAO, Schreurs WJ, Boerman OC, Oyen WJC, de Boer AJ, Punt CJA,
Figdor CG, Adema GJ (1999): Biodistribution and Vaccine Efficiency of murine
dendritic cells are dependant on the route of administration. Canc Res. 59:
3340-45.
27
Flad HD, Gemsa D (1999): Zytokine. In Gemsa D, Kalden G (eds) Immunologie,
3rd edn. Thieme Verlag Heidelberg, NY, pp 45–67
28
Feller AC, Böcker W (2001): Die Milz. In: Böcker, Denk, Heitz (eds)
Immunologie 2.Aufl. Urban und Fischer München Stuttgart: 275-278.
29
Gan DD, Macaluso M, Cinti C, Khalili K, Giordano A (2003): How does a normal
human cell become a cancer cell? J Exp Clin Cancer Res 22: 509-516
30
Ge NL, Ye SL, Zheng N, Sun RX, Liu YK, Tang ZY (2003): Prevention of
hepatocellular carcinoma in mice by IL-2 and B7-1 genes co-transfected liver
cancer cell vaccines. World J Gastroenterol 9: 2182-5
31
Gollob JA, Veenstra KG, Parker RA, Mier JW, McDermott DF, Clancy D, Tutin
L, Koon H, Atkins MB (2003): Phase I trail of concurrent twice-weekly
recombinant human interleukin-12 plus low-dose IL-2 in patients with melanoma
or renal cell carcinoma. J Clin Oncol 21: 2564-2573
32
Gottschalk G: Das Gen und der Mensch (2000): Wallsteinverlag: 183-202
33
Grange JM, Dore JF, Coebergh JW (2005): Infection, vaccination and protection
against melanoma-a ray of hope for novel preventive and therapeutic
strategies? Eur J Cancer 41: 12-14
34
Guan X, Nishikawa M, Takemoto S, Ohno Y, Yata T, Takakura Y (2010)
Injection site-dependent induction of immune response by DNA vaccine:
comparison of skin and spleen as a target for vaccination. J Gene Med
12(3):301-9
35
Guo QY, Yuan M, Peng J, Cui XM, Song G, Sui X, Lu SB (2011): Antitumor
activity of mixed heat shock protein/peptide vaccine and cyclophosphamide plus
interleukin-12 in mice sarcoma. J Exp Clin Cancer Res. 26;30:24
36
Heinzerling L, Dummer R, Pavlovic J, Schultz J, Burg G, Moelling K (2002)
Tumor regression of human and murine melanoma after intratumoral injection of
IL-12-encoding plasmid DNA in mice. Exp Dermatol 11: 232–240
64
Anhänge und Verzeichnisse
37
Herold-Mende C, Karcher J, Dyckhoff G, Schirrmacher V (2005): Antitumor
immunization of head and neck squamous cell carcinoma patients with a virusmodified autologous tumor cell vaccine. Adv Otorhinolaryngol 62: 173-183
38
Hughes RM (2004): Strategies for cancer gene therapy. J Surg Oncol 85: 28-35
39
Imboden M, Shi F, Pugh TD, Freud AG, Thom NJ, Hank JA, Hao Z, Staelin ST,
Sondel PM, Mahvi DM (2003): Safty of interleukin-12 gene therapy against
cancer: a murine biodistribution and oxicity study. Hum Gene Ther 14: 10371048
40
Johansen P, Haffner AC, Koch F, Zepter K, Erdmann I, Maloy K, Simard JJ,
Storni T, Senti G, Bot A, Wuthrich B, Kundig TM (2005): Directintralymphatic
injection of peptide vaccine enhances immunogenicity. Eur J Immunol 35: 568574
41
Jonuleit H, Giesecke-Tuettenberg A, Tuting T, Thurner-Schuler B, Stuge TB,
Paragnik L, Kandemir A, Lee PP, Schuler G, Knop J, Enk AH (2001): A
comparison of two types of dendritic cell as adjuvants for the induction of
melanoma-specific T-cell responses in humans following intranodal injection. Int
J Cancer 93: 243–251
42
Kaplan JM (2004): New cancer vaccine approaches. Grugs today (Barc) 40:
913-929
43
Kato K, Okumura K, Yagita H (1997): Immunoregulation by B7 and IL-12 gene
transfer. Leukämia 11 Suppl 3: 572-576
44
Kathy S Wang, David A Frank, Jerome Ritz (2000): Blood. Interleukin-2
enhances the response of natural killer cells to interleukin-12 through upregulation of the interleukin-12 receptor and STAT4. No. 10: 3183:3190
45
Kikuchi T, Joki T, Saitoh S, Hata Y, Abe T, Kato N, Kobayashi A, Miyazaki T,
Ohno T (1999): Anti-tumor activity of interleukin-2 producing tumor cells and
recombinant interleukin 12 against mouse glioma cells located in the central
nervous system. Int J Cancer 80: 425-30
46. Kishida T, Asada H, Itokawa Y, Cui FD, Shin-Ya M, Yasutomi K, Ueda Y,
Yamagishi H, Imanishi J, Mazada O (2003): Interleukin (IL)-12 and IL-15
genetic gene transfer synergistically augments therapeutic antitumor immunity
and promotes regression of metastatic lymphoma. Mol Ther 8: 552-558
47
Kraus K (2002): Der Partikel-vermittelte Gentransfer einer Kombination der
Gene für Interleukin-12, Interleukin-2, Interferon-gamma und B7-1 zur Therapie
solider maligner Tumoren am Modell des murinen B16-Melanoms, Thesis,
Leipzig University
48
Kreiter S, Selmi A, Diken M, Koslowski M, Britten CM, Huber C, Tureci O, Sahin
U (2010) Intranodal vaccination with naked antigen-encoding RNA elicits potent
prophylactic and therapeutic antitumoral immunity. Cancer Res 70(22):9031-40
65
Anhänge und Verzeichnisse
49
Kuball J, Huber C, Schuler M (2001): Gertherapie solider Tumoren: Internist 42:
1321
50
Kubo M, Morisaki T, Kuroki H, Tasaki A, Yamanaka N, Matsumoto K, Nakamura
K, Onishi H, Baba E, Katano M (2003): Combination of adoptive immunotherapy
with Herceptin for patients with HER2-expressing breast cancer. Anticancer Res
23: 4443-9
51
Kundig TM (2000): Methods for increasing the immunogenicity of vaccines.
Schweiz Rundsch Med Prax 89:1477–1484
52
Kundig TM, Bachmann MF, DiPaolo C, Simard JJ, Battegay M, Lother H,
Gessner A, Kuhlcke K, Ohashi PS, Hengartner H (1995): Fibroblasts as efficient
antigen-presenting cells in lymphoid organs. Science 268: 1343–1347
53
Knowles M, Selby P, (2005): Introduction to the Cellular and molecular biology
of cancer. 4. Auflage Oxford university press
54
Li H, Jiang HJ, Ma Mq, Wie F, An XM, Ren XB (2007): Vaccination with
allogeneic GM-CSF gene-modified lung cancer cells: antitumor activity
comparing with that induced by autologous vaccine. Cancer Biother
Radiopharm: 790-8
55
Lindsay RW, Ouellette I, Arendt HE, Martinez J, Destefano J, Lopez M, Pavlakis
GN,Chiuchiolo MJ, Parks CL, King CR (2013): SIV antigen-specific effects on
immune responses induced by vaccination with DNA electroporationand
plasmid IL-12. Vaccin: 4749-58
56
Linehan DC, Goedegebuure PS, Eberlein TJ (1996): Vaccine therapy for
cancer. Ann Surg Oncol 3: 219-228
57
Lichtor T, Glick RP, Tarlock K, Moffett S, Mouw E, Cohen EP (2002):
Application of interleukin-2-secreting syngeneic/allogeneic fibroblasts in the
traetment of primary and metastatic brain tumors. Cancer Gene Ther 9: 464-46
58
Liu Y, Ehtesham M, Samoto K, Wheeler CJ, Thompson RC, Villarreal LP, Black
KL, Yu JS (2002): In situ adenoviral interleukin 12 gene transfer confers potent
and long-lasting cytotoxic immunity in glioma. Cancer Gene Ther: 9-15
59
Maclean J, Rybicki EP, Williamson AL (2005): Vaccination strategies for the
prevention of cervical cancer. Expert Rev Anticancer Ther 5: 97-107
60
Mahvi DM, Sondel PM, Yang NS, Albertini MR, Schiller JH, Hank J, Heiner J,
Gan J, Swain W, Logrono R (1997): Phase I/IB study of immunization with
autologous tumor cells transfected with the GM-CSF gene by particle-mediated
transfer in patients with melanoma or sarcoma. Hum Gene Ther 8: 875-891
61
Maloy KJ, Erdmann I, Basch V, Sierro S, Kramps TA, Zinkernagel RM, Oehen
S, Kündig TM (2001): Intralymphatic immunization enhances DNA vaccination.
Proc Natl Acad Sci USA 98: 329-30.
66
Anhänge und Verzeichnisse
62
Miguel A, Herrero MJ, Sendera L, Botella R, Algas R, Sanchez M, Alino SF
(2013): Comparative antitumor effect among GM-CSF.IL-12 and GM-CSF+IL-12
genetically modified tumor cell vaccines.Cancer Gene Ther Spain: doi
10.1038/cgt.2013.54.
63
Mohr P, Weichnthal M, Hauschild A (2003): Adjuvant therapy in melanoma.
Onkologie 26: 227-233
64
Mesa C, Fernandez LE (2004): Challenges facing adjuvants for cancer
immunotherapy. Immunol Cell Biol 82: 644–650
65
Miller GE, Cohen S, Pressman S, Barkin A, Rabin BS, Treanor JJ (2004):
Psychological stress and antibody response to influenza vaccination when is
the critical period for stress and how does it get inside the body? Psychosom
Med 66: 215–223
66
Mocellin S, Mandruzzato S, Bronte V, Lise M, Nitti D (2004): Part I: Vaccines for
solid tumours. Lancet Oncol 5: 681–689
67
Nagai H, Hara I, Horikawa T, Fujii M, Kurimoto M, Kamidono S, Ichihashi M
(2000): Antitumor effects on mouse melanoma elicited by local secretion of
interleukin-12 and their enhancement by treatment with interleukin-18. Cancer
Invest 18: 206-213
68
Nagayama H, Sato K, Morishita M, Uchimaru K, Oyaizu N, Inazawa T,
Yamasaki T, Enomoto M, Nakaoka T, Nakamura T, Maekawa T, Yamamoto A,
Shimada S, Saida T, Kawakami Y, Asano S, Tani K, Takahashi TA, Yamashita
N (2003): Results of a phase I clinical study using autologous tumor lysatepulsed moncyte-derived mature dentritic cell vaccination for stage IV malignant
menanoma patient combinde with low dose interleukin-2. Melanoma Res 13:
521-530
69
Nemunaitis J, Bohart C, Fong T, Meyer W, Edelman G, Paulson RS, Orr D, Jain
V, O’Brien J, Kuhn J, Kowal KJ, Burkeholder S, Bruce J, Ognoskie N, Wynne D,
Martineau D, Ando D (1998): Phase I trail of retroviral vector-mediated
interferon-gamma gene transfer into autologous tumor cells in patients with
metastatic melanoma: Cancer Gene Ther 5: 292-300
70
Nishitani MA, Sakai T, Kanayama HO, Himeno K, Kagawa S (2000): Cytokine
gene therapy for cancer with naked DNA. Mol Urol 4: 47-50
71
Nishitani MA, Sakai T, Ishii K, Zhang M, Nakano Y, Nitta Y, Miyazaki J,
Kanayama HO, Kagawa S, Himeno K (2002): A convenient cancer vaccine
therapy with in vivo transfer of interleukin 12 expression plasmid using gene
gun technology after priming with irradiated carcinoma cells. Cancer Gene Ther
9:156–163
72
Novakovic S, Knezevic M, Golouh R, Jezersek B (1999): Transfection of
mammalian cells by the methods of receptor mediated gene transfer and
particle bombardment. J Exp Clin Cancer Res 18: 531–536
67
Anhänge und Verzeichnisse
73
Ochsenbein AF (2005): Immunological ignorance of solid tumors. Springer
Semin Immunopathol 27: 19–35
74
Oshikawa K, Rakhmilevich AL, Shi F, Sondel PM, Yang N, Mahvi DM (2001):
Interleukin 12 gene transfer into skin distant from the tumor site elicits
antimetastatic effects equivalent to local gene transfer. Hum Gene Ther 12:
149-160
75
Park MY, Kim DR, Jung HW, Yoon HI, Lee JH, Lee CT (2010) Genetic
immunotherapy of lung cancer using conditionally replicating adenovirus and
adenovirus-interferon-beta. Cancer Gene Ther 17(5):356-64
76
Punt CJ, Nagy A, Douillard JY, Figer A, Skovsgaard T, Monson J, Barone C,
Fountzilas G, Riess H, Moylan E, Jones D, Detherling J, Colman J, Coward L,
MacGregor S (2002): Edrecolomab alone or in combination with fluorouracil and
folinic acid an the adjuvant treatment of stage III colon cancer: a randomised
study. Lancet 360: 671-7
77
Putzer BM, Rodicker F, Hitt MM, Stiewe T, Esche H (2002): Improved treatment
of pancreatic cancer by IL-12 and B 7.1 costimulation: antitumoral efficacy and
immunoregulation in a nonimmunogenetic tumor model. Mol Ther 5: 405-412
78
Quain HN, Liu GZ, Cao SJ, Feng J, Ye X (2002): The experimental study of
ovarian carcinoma vaccine modified by human B7-1 and INF-gamma genes. Int
J Gynecol Cancer 12: 80-5
79
Rakhmilevich AL, Timmins JG, Janssen K, Pohlmann EL, Sheehy MJ, Yang NS
(1999): Gene gun-mediated IL-12 gene therapy induces antitumoral effects in
the absence of toxicity: a direct comparison with systemic IL-12 protein therapy.
J Immunother 22: 135-144
80
Rakhmilevich AL, Turner J, Ford MJ, Mc Cabe D, Sun WH, Sondel PM, Grota
K, Yang NS (1996): Gene gun-mediated skin transfection with interleukin 12
gene results in regression of established primary and metastatic murine tumor.
Proc Natl Acad Sci USA 93: 6291-6296
81
Sanford JC, Klein TM (1987): Delivery of substances into cells and tissues
using a particle bombardement process. J Part Sci Technol 5: 27-37
82
Slingluff CL, Jr., Petroni GR, Yamshvhikov GV, Hibbitts S, Grosh WW,
Chianese- Bullock, KA, Bissonette EA, Barnd DL, Deacon, DH, Patterson JW,
Parekh J, Neese PY, Woodson EM, Wiernasz CJ, Merrill P (2004): Immunologic
and clinical outcomes of vaccination with a multiepitope melanome peptide
vaccine plus low-dose interleukin-2 administered either concurrently or on a
delayed schedule. J Clin Oncol 22: 4474-85
83
Schadendorf D (2002): Hat die Vakzination von Tumorpatienten eine Zukunft in
der klinischen Onkologie? Onkologie 25 (suppl 1): 38-42
68
Anhänge und Verzeichnisse
84
Schiebler T, Schmidt W., Zilles K (1999): Anatomie, Zytologie, Histologie,
Entwicklungsgeschichte, makroskopische und mikroskopische Anatomie des
Mensche: SpringerVerlag Berlin Heidelberg New York: 589-93
85
Schirrmacher V (1987): Krebs- Tumoren, Zellen, Gene: Spectrum der
Wissenschaft 2. Aufl. Heidelberg
86
Schirrmacher V (1995): Biotherapy of cancer. Perspectives of immunotherapy
and gene therapy. J Cancer Res Clin Oncol 121: 443–451
87
Schirrmacher V (1995): Tumor vaccine design: concepts, mechanisms, and
efficacy testing. Int Arch Allergy Immunol 108: 340–344
88
Schirrmacher V (1999): Tumoren: Entstehung, Metastasierung und
immunologische Abwehr. In: Gemsa D., Kalden G.(Hrsg.). Immunologie 5. Aufl.
Thieme Verlag Heidelberg, New York. 45-67
89
Schirrmacher V (2001): T-cell immunity in the induction and maintenance of a
tumour dormant state. Semin Cancer Biol 11: 285-295
90
Schirrmacher V (2005): Clinical trails of antitumor vaccination with an
autologous tumor cell vaccin modified by virus infection: improvement of patient
survival based on improved antitumor immun memory: Cancer Immunol
Immunother 54: 587-598
91
Schumacher K., Scheider B., Reich G., Stiefel T., Stoll G., Bock PR., Hanisch
J., Beuth J., (2003): Influence of postoperative complementary treatment with
lectin- standardized mistletoe extract on breast cancer patients. Anticancer Res.
23: 5081-5087
92
Smith KA, Qiu Z, Wong R, Tam VL, Tam BL, Joea DK, Quach A, Liu X, Pold M,
Malyankar UM, Bot A (2011) Multivalent immunity targeting tumor-associated
antigens by intra-lymph node DNA-prime, peptide-boost vaccination. Cancer
Gene Ther 18(1):63-76
93
Stockmar C (2004): Vakzination mit verschiedenen auch genetisch
modifizierten autologen Tumorzellen in die Milz im Maus Tumormodell. Thesis,
Leipzig University, Leipzig
94
Sun WH, Burkholder JK, Sun J, Culp J, Turner J, Lu XG, Pugh TD, Ershler W.B,
Yang NS (1995): In vivo cytokine gene transfer by gene gun reduces tumor
growth in mice. Proc Natl Acad Sci. USA 92: 2889-93
95
Sun Y, Jurgovsky K, Moller P, Alijagic S, Dorbic T, Georgieva J, Wittig B,
Schadendorf D (1999): Vaccination with IL-12 gene-modified autologous
melanoma cells: preclinical results and a first clinical phase I study. Gene
Therapy 5: 481-490
96
Storni T, Kundig TM, Senti G, Johansen P (2005): Immunity in response to
particulate antigen-delivery systems. Adv Drug Deliv Rev 57: 333–355
69
Anhänge und Verzeichnisse
97
System HGG: Instruction Manual Rev B Bio RAD, USA: 5
98
Tan C, Dannull J, Nair SK, Ding E, Tyler DS, Pruitt SK, Lee WT (2013): Local
secretion of IL-12 augments the Therapeutic impact of dendritic cell-tumor cell
fusion vaccination. J Surg Res: S0022-4804(13)00671-9
99
Uekusa Y, Gao P, Yamaguchi N et al. (2002): A role for endogenous IL-12 in
tumor immunity: IL-12 is required for the acquisition of tumor-migratory apacity
by T-cells and the development of T-cell accepting capacity in tumor masses: J
Leukoc Biol 72: 864-73
100 Vogl A, Sartorius U, Vogt T, Roesch A, Landthaler M, Stolz W, Becker B (2005):
Gene expression profile changes between melanoma metastases and their
daughter cell lines: implication for vaccination protocols. J Invest Dermatol 124:
401–404
101 Vogel CL, Franko SX: Clinical experience with trastuzumab (herceptin) (2003):
Breast J 9: 452-62
102 Wang C, Quevedo ME, Lannutti BJ, Gordon KB, Guo D, Sun W, Paller AS
(1999): In vivo gene therapy with interleukin-12 inhibt primary vascular tumor
growth and induces apoptosis in a mouse model. J Invest Dermatol 112: 775-81
103 White SA, LoBuglio AF, Arani RB, Pike MJ, Moore SE, Barlow DL, Conry RM
(2000): Induction of anti-tumor immunity by intrasplenic administration of a
carcinoembryonic antigen DNA vaccine. J Gene Med 2: 135–140
104 Wiggiton JM, Park JW, Gruys ME, Young HA, Jorcyk CL, Back TC, Brunda MJ,
Strieter RM, Ward J, Green JE, Wiltrout RH (2001): Complete regression of
established spontaneous mammary carcinoma and the therapeutic prevention
of genetically programmed neoplastic transition by IL-12/pulse IL-2:
indroduction of local T cell infiltration, Fas/Fas ligand gene expression and
mammary epithelial apoptosis. J Immunol 166: 1156-1168
105 Zhou WZ, Hoon DS, Huang SK, Fujii S, Hashimoto K, Morishita R, Kaneda Y
(1999) : RNA melanoma vaccine: induction of antitumor immunity by human
glycoprotein 100 mRNA immunization. Hum Gene Ther 10: 2719–2724
106 Zier K et al (1991): Antigen spezifische T-Zell-Immunität und Antigenpräsentierende Zellen bei malignen Erkrankungen: Diss FU Berlin: 33-44
107 Zitvogel L, Mayordomo JI, Tjandrawan T, De Leo AB, Clarke MR, Lotze MT
(1996): Therapy of murine tumors with tumor peptide-pulsed dendritic cells:
Dependence on T-cell, B7-costimulation and T helper 1 associated cytokines: J
Exp Med 183: 87-97
108 Zoller M, Matzku S (1999): Cancer therapy: new concepts on active
immunization. Immunobiology 201: 1–21
70
Anhänge und Verzeichnisse
109 Zou W (2005): Immunosuppressive networks in the tumor enviroment and their
therapeutic relevance. Nat Rev Cancer: 263-274
71
Anhänge und Verzeichnisse
8.2
Abbildung 1:
Abbildung 2:
Abbildung 3:
Abbildung 4:
Abbildung 5:
Abbildung 6:
Abbildungsverzeichnis
Helios gene gun (Campbell, Malcolm "The Helios gene gun by BioRad." 2001)
Intradermale Tumorzellapplikation
Darstellung der Milz
Skizzierung des Versuchsablaufes
Mittleres Tumorwachstum unabhängig vom R-Status (Melanom)
Mittleres Tumorwachstum unabhängig vom R-Status. Zusammengefasst nach
Art der Vakzine (Melanom)
Abbildung 7: Mittleres Tumorwachstum unabhängig vom R-Status. Zusammengefasst nach
Impflokalisation (Melanom)
Abbildung 8: Mittleres Tumorwachstum nach R0- Resektion ( Melanom)
Abbildung 9: Mittleres Tumorwachstum zusammengefasst nach der Art der Vakzine nach
R0-Resektion (Melanom)
Abbildung 10: Mittleres Tumorwachstum zusammengefasst nach der Impflokalisation nach
R0-Resektion (Melanom)
Abbildung 11: Mittleres Tumorwachstum nach R1/2-Resektion (Melanom)
Abbildung 12: Mittleres Tumorwachstum nach Tumorreimplantation (Melanom)
Abbildung 13: Mittleres Tumorwachstum unabhängig vom R-Status Zusammengefasst nach
der Art der Vakzine nach Tumorreimplantation (Melanom)
Abbildung 14: Mittleres Tumorwachstum zusammengefasst nach Impflokalisation nach
Tumorreimplantation (Melanom)
Abbildung 15: Mittleres Tumorwachstum unabhängig vom R-Status (Lewis Lung)
Abbildung 16: Mittleres Tumorwachstum nach R0-Resektion (Lewis Lung)
Abbildung 17: Mittleres Tumorwachstum nach R1/2-Resektion (Lewis Lung)
Abbildung 18: Mittleres Tumorwachstum zusammengefasst nach der Art der Vakzine nach
R1/2-Resektion (Lewis Lung)
Abbildung 19: Mittleres Tumorwachstum nach Tumorreimplantation (Lewis Lung)
Abbildung 20: Mittleres Tumorwachstum zusammengefasst nach der Art der Vakzine nach
Tumorreimplantation (Lewis Lung)
Abbildung 21: Mittleres Tumorwachstum zusammengefasst nach der Impflokalisation nach
Tumorreimplantation (Lewis Lung)
9
16
16
17
24
25
26
28
29
30
32
34
35
36
39
42
45
45
47
48
49
72
Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit
9.
Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und ohne unzulässige
Hilfe oder Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Ich
versichere, dass Dritte von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte
Leistungen für die Arbeit erhalten haben, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der
vorliegenden Dissertation stehen, und dass die vorgelegte Arbeit weder im Inland
noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form eines anderen Prüfungsverfahrens
vorgelegt wurde. Alles aus anderen Quellen von anderen Personen übernommene
Material, das in der Arbeit verwendet wurde oder auf das direkt Bezug genommen
wird, wurde als solches kenntlich gemacht. Insbesondere wurden alle Personen
genannt, die direkt an der Entstehung der vorliegenden Arbeit beteiligt waren.
Datum:
Unterschrift:
73
Lebenslauf
10.
Lebenslauf
15.11.1979
geboren in Burgstädt
Familienstand
verheiratet, 2 Kinder (7 Jahre und 4 Jahre)
Schule:
1986
Einschulung an der Grundschule in Wittgensdorf
1990-1992
Besuch der Realschule in Wittgensdorf
1992-1996
Besuch des Gymnasiums in Burgstädt
1996-1998
Besuch des Sportgymnasiums in Leipzig
1998
Abitur
1998-1999
Absolvierung FSJ Ökumenische Sozialstation Leipzig
Studium:
1999-2000
Studium der Biologie an der Universität Leipzig
2000-2006
Studium der Humanmedizin an der Universität Leipzig
2002
Ärztliche Vorprüfung
2006
Ärztliche Prüfung
74
Lebenslauf
2007-03/2008
1. Elternzeit
Beruflicher Werdegang:
04/2008-12/2011
Arbeit als Assistenzärztin für Frauenheilkunde am MVZ
nuwamed in Leipzig (Ärztlicher Leiter Dr. med. Marwan
Nuwayhid)
12/2009-12/2012
2. Elternzeit
01/2012-08/2013
Arbeit als Assistenzärztin für Frauenheilkunde am Helios
Krankenhaus in Leisnig (Chefärztin Dr. med. Katrin
Petzold)
09/2013
Arbeit als Assistenzärztin für
Frauenheilkunde am
St.Elisabeth-Krankenhaus in Leipzig (Chefärzte Dr. med
Birgit Henne, Dr. med. Dagmar Langanke, Dr. med.
Carsten Springer)
75
Danksagung
11.
Danksagung
Herrn Prof. Dr. med. Arne Dietrich danke ich für die Bereitstellung des Themas, für
seine Unterstützung, Hilfsbereitschaft und Geduld während der Anfertigung dieser
Arbeit.
Ich danke dem damaligen Team um Herrn Dr. med. Arne Dietrich, insbesondere
Herrn Dr. med. Lars Becherer und Herrn Dr. med. Christoph Stockmar für die
Zusammenarbeit bei der Durchführung des experimentellen Teils dieser Arbeit im
Labor. Ebenso herzlich danke ich Frau Dr. med. vet. Madaj-Sterba und deren
Mitarbeiterinnen am Medizinisch Experimentellen Zentrum sowie Frau Dr. med. A.
Gütz für die Befundung der histologischen Schnitte, den MTA’s Frau Vogel und Frau
Rolle sowie allen Mitarbeitern des Medizinisch Experimentellen Zentrums.
Herrn Hans Gruner danke ich für die Hilfe bei der Erstellung des Layouts.
Frau Teresa Tenbergen danke ich für das Interesse und die aufmunternden
Gespräche und das Korrekturlesen.
Herrn Dr. med. Michael Saborowski danke ich für seine Hilfsbereitschaft und die
vielen wichtigen Informationen.
Herrn Dr. phil. Axel Schürer danke ich für seine liebevolle, treue Unterstützung,
Hilfsbereitschaft, für die Ratschläge und den Glauben an das Gelingen dieser Arbeit.
76