Übungsanleitung: Bakteriophage Lambda
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DAGZ-BOKU: WS2011/12 Version 11 (09. 09. 2011) 1 Übungsanleitung: Bakteriophage Lambda Das Beispiel besteht aus zwei Teilen. A) Im Teil A soll der Ausgang der Infektion von E. coli Stämmen mit unterschiedlichen Phagenvektoren beobachtet werden. Die Ergebnisse sollen im Licht der Genotypen der Wirte und Phagen diskutiert werden. B) In Teil B soll die in vivo Plasmid-Exzision durchgeführt werden (Cre-lox vermittelte Exzision aus λTriplEx) Zu Beginn werden Platten mit folgenden E. coli Wirtsstämmen ausgegeben: (Bezüglich genetischer Nomenklatur für E. coli: siehe Beilage der Kolloquiumsunterlagen) A: Interaktion von Phagen mit E. coli Wirtsstämmen C600: (hfl+) lacY1 leuB6 supE44 thi-1 thr-1 tonA21 (mcrB+) FC600hfl: hflA::Tn10 lacY1 leuB6 supE44 thi-1 thr-1 tonA21 mcrB- F(Anmerkung Transposon Tn10 (Tetracyclin-Resistenz) zerstört durch Insertion das hflA Gen) XL1-Blue: recA1 endA1 gyrA96 hsdR17 (rk- mk+) lac- relA1 supE44 thi-1 [F´ proAB lacIq Z∆M15 Tn10] (auf dem modifizierten F-Episom, das auch Tetrazyklin-Resistenz vermittelt, befindet sich das Gen welches für das zur alpha-Komplementation (Slang: „Blau-Weiß Selektion“) notwendige lacZ Fragment kodiert) Y1090r-: araD139 hsdR (rk- mk+) mcrA- (mcrB+) rpsL supF trpC22::Tn10 ∆lacU169 ∆lon (pMC9- lacIq) R Das Plasmid pMC9 vermittelt Amp und führt zu Überexpression des lac-Repressors (ohne IPTG R Induktion keine Expression der Phagen-Fusionsproteine). Das Tn10 Transposon vermittelt Tet . ∆lon – Defekt in einer Protease erhöht Stabilität der Fusionsproteine. B: In vivo Exzision BM25.8: für die Cre-lox vermittelte in vivo Exzision supE44 thi ∆(lac-proAB) hsdR (rk- mk-) [F´ traD36 proAB+ lacIq Z∆M15] λimm434 (KanR) P1 (camR) Der Stamm enhält einen lysogenen Lambda (selektierbar mit Kanamycin-Resistenz, vermittelt Resistenz gegen Lambda-Lyse) und einen lysogenen P1 Phagen (markiert mit ChloramphenicolResistenz, exprimiert das Cre-Gen). (Für die Beschriftung von Verdünnungen etc. werden folgende Abkürzungen vorgeschlagen: C: C600; H: C600hfl; X: XL1-Blue; Y: Y1090r-; B: BM25.8) DAGZ-BOKU: WS2011/12 Version 11 (09. 09. 2011) 2 Weiters werden folgende Phagensuspensionen mit (vom Tutor angegebenen) Titer ausgegeben (kann sich ändern!). Es sind dies (vorgeschlagene Kurzbezeichnung): Teil A: Phage Titer pfu/ml (Bez.) Anmerkung λgt10 O leerer Phagenvektor λgt10-L L λgt10 mit Tomate RPL3 cDNA λgt11-A A Anonyme Reis-cDNA in λgt11 Vektor EMBL3-L E genomischer Klon von Tomate RPL3 in EMBL3 Teil B: Cre-loxP vermittelte Plasmid-Exzision Phage λTriplEx Titer pfu/ml (Bez.) Anmerkung T leerer Phagenvektor λTriplEx Genotypen der Phagen: siehe Beilage Kolloquiums-Unterlagen (Current Protocols) DAGZ-BOKU: WS2011/12 Version 11 (09. 09. 2011) 3 Aufgabenstellung: Teil A: Ausgehend von den angegebenen Titern sind solche Verdünnungen der Phagensuspensionen anzufertigen, daß auf Platten nach Infektion 102 bzw. 103 Plaques zu erwarten wären (im permissiven Wirt). Anmerkungen: Phagen in SM verdünnen (nie in Wasser!). Bitte berücksichtigen Sie daß im Infektionsansatz nur 100 µl Phagensuspension zum Einsatz kommen (siehe Arbeitsvorschrift Phagentiter). Die folgenden Wirte sind mit folgenden Phagen zu infizieren (siehe Tabelle): Phagen Bakterienstämme C600 (C) C600 hflA (H) XL1-Blue (X) λgt10 (O) CO2: CO3: HO2: HO3: XO2 (Teil B) Y1090r(Y) λgt10-L (L) CL2: CL3: HL2: HL3: λgt11-A (A) CA2: CA3: XA2: XA3: EMBL3 L (E) CE2: CE3: HE2: HE3: XE2: XE3: YA2: YA3: YE2: YE3: λTriplEx (T) Negativk. (N). CN HN T50 T250 (Teil B) XN YN CO2: Vorgeschlagener Code für: C600 infiziert mit λgt10, erwartet102 Plaques. Bitte weiters für jeden E. coli Stamm eine Leer-Kontrolle (Ansatz ohne Phagen! nur SM) mitführen (N...Negativkontrolle). Protokoll: Diskussion der Ergebnisse (Warum funktionieren welche Phagen nicht oder schlecht mit bestimmten Wirtsstämmen. Bitte bereits für Kolloquium überlegen welches Ergebnis erwartet wird!). Teil B: Plasmid-Exzision Für dieses Experiment wird der Wirt XL1-Blue zusätzlich auch mit dem Phagen λTriplEx infiziert. Es sollen 2 Platten hergestellt werden (eine mit etwa 50, und eine mit etwa 250 Plaques). Für den leeren λTriplEx bitte zum Topagar IPTG und X-GAL hinzufügen!. Die leeren TriplEx Phagen enthalten ein intaktes lacZ‘ Gen (α-Komplementation in XL1-Blue) und bilden in Topagar mit IPTG und X-GAL blaue Plaques, was das Ausstechen für Anfänger erleichtert. Die λTriplEx Phagen werden gemeinsam mit den Phagen des Teil A am Dienstag ausplattiert. Am Mittwoch erfolgt die Elution der Phagen aus einem ausgestochen Plaque (sehr kurz) und die Infektion des Cre-exprimierenden Stammes BM25.8. DAGZ-BOKU: WS2011/12 Version 11 (09. 09. 2011) 4 Vorschlag: Zeitplan für die Durchführung des Beispiels Teil A Montag Teil B 12:30 Arbeitsplatz übernehmen (möglichst früh beginnen!) Medien herstellen und autoklavieren (dauert! während dessen Pipetierschema für Dienstag erstellen): Topagar, Lambda Broth und SM, Platten gießen E. coli Kulturen animpfen, o/n 37° C Dienstag E. coli Stämme vorbereiten ⇒ XL1-Blue aus Teil A als Wirt Phagenverdünnungen herstellen Phagenverdünnungen Topagar vorbereiten, Gemisch herstellen, Infektion (Achtung: Topagar + IPTG + X-Gal) Infektionen o/n Kultur von BM25.8 (30°C ) Mittwoch Austechen Plaques Auszählen der Plaques (Diskussion, Protokoll) und Elution der Vorbereiten von BM25.8 Infektion von mit λTriplEx, BM25.8 Titer der eluierten Phagen Ausplattieren des Exzisionsansatzes auf LB+Amp Donnerstag Platz aufräumen, Geschirr ... Ampicillin-resistente BM25.8 Kolonien auf Platten zählen Rückgabe des Arbeitsplatzes Arbeitsvorschrift: 1) Montag: Zubereitung der Medien für die Phageninfektion Bottom Agar: 23 g/l NZCYM Broth 15 g/l Agar (pH 7.5) DAGZ-BOKU: WS2011/12 Version 11 (09. 09. 2011) 5 Benötigt werden für das Beispiel etwa 40 Stück 9 cm Petrischalen mit (15 bis maximal 20 ml Agar pro Platte). Vorschlag: 750 ml autoklavieren in 1l Schottflasche, – mit Rührkern! Nicht zu dick ausgießen, Top-Agar kommt noch obenauf!) Zusammensetzung von NZCYM: z.B. (Fluka 74713 od. Roth X974.1) 10 g/l N-Z Amine 5 g/l NaCl 5 g/l Yeast Extract 1 g/l Casamino Acids 2 g/l MgSO4.7 H2O (= 8 mM) Platten am Arbeitsplatz gießen und über Nacht stehen lassen. Der Agar sollte nicht zu heiß gegoßen werden (Kondenswasser am Deckel). Die Oberfäche der Platten sollte bei der Verwendung nicht feucht sein, da sich sonst der Topagar ablösen kann. Bunsenbrenner (wenn überhaupt nötig) mit Maß einsetzen – bitte die Ausgießringe der Schottflaschen nicht abfackeln! Top Agar: 23 g/l NZCYM Broth pH 7.5 6 g/l Agarose) (Einwaage ohne magnetischen Rührkern, kann Ergebnis verfälschen.) Benötigt werden 3 ml/Platte (150 ml in 250 ml Schottflasche – mit Rührkern autoklavieren!). Auskühlen lassen und bei Bedarf im Mikrowellenherd wieder aufschmelzen. Achtung: Für α-Komplementation IPTG und X-Gal zugeben! Lambda Medium: Zur Anzucht von E. coli für die Infektion mit Phage Lambda (max. 300 ml herstellen). 23 g/l NZCYM Broth pH 7.5 0.2 % Maltose (1:100 Verdünnung von 20% Stammlösung, nicht mit Stickstoffquelle autoklavieren sondern danach steril zugeben!). Die Maltose-Stammlösung wird bereitgestellt (Tutor). Suspensions Medium für Lambda: SM Phagen nie in Wasser oder EDTA hältigen Puffern verdünnen!!! Suspensionen in SM (optional mit 0.01% Gelatine) und einem Tropfen Chloroform sind auf 4°C ein Jahr ohne größere Verminderung des Titers haltbar. (Darüber hinaus ist die Lagerung bei -70°C mit 10% Glycerin oder 7% DMSO vorzuziehen). SM: 50 mM Tris.Cl pH 7.5 100 mM NaCl 8 mM MgSO4 DAGZ-BOKU: WS2011/12 Version 11 (09. 09. 2011) 6 Vorschlag: Für die Vorbereitung der Bakterienkulturen zur Infektion, aus bereitgestellten Stammlösungen 150 ml SM - Medium herstellen. Stammlösungen: 500 mM Tris.Cl pH 7.5 und 1 M NaCl 10 mM MgSO4 Vorschlag: 250 ml Lösung herstellen (bzw. 1,5l für alle 6 Kandidaten gemeinsam) und autoklavieren. Zusätzlich 6 leere 250ml Schottflaschen mitautoklavieren um später darin die drei Komponenten mischen zu können. Anmerkung zur Koordination der Übungsteilnehmer: Das Autoklaviergut ist eindeutig zu beschriften (Klebeband, wasserfester Filzstift) Den Autoklaven bitte erst starten wenn alle Teilnehmer, die das Phagenbeispiel absolvieren, mit Ihren Medien fertig sind! Jedoch soll möglichst früh gestartet werden, da sonst die Platten erst gegen Praktikumsende (17.30 Uhr) gegossen werden können. Vorsicht mit heißem Agar – Siedeverzug möglich! Im Protokol sind alle Einwaagen/Pipettierschritte anzugeben. Es wird dringend angeraten während der Wartezeit (Autoklav) das Pipetierschema für die Phagenverdünnungen zu berechnen, die Eppis zu Beschriften und mit SM zu befüllen. Bitte Phagen NICHT über Nacht als Verdünnung lagern, da dies zu starken Schwankungen führt! Inokulation der Übernachtkulturen Pro Bakterienstamm etwa 20 ml Lambda Medium in sterile 100 ml Kölbchen gießen und mit Einzelkolonie beimpfen (Mit sterilem Zahnstocher, diesen nicht einwerfen, Medium darf nicht mehr heiß sein!). Inkubation bei 37°C, 200 rpm (Brutraum 05/04) (Stamm BM25.8 kommt erst später zum Einsatz, diesen noch nicht anzüchten!) DAGZ-BOKU: WS2011/12 Version 11 (09. 09. 2011) 7 2) Dienstag: Durchführung der Phageninfektion: Vorbereitung der Wirtsstämme: Zu den Übernachtkulturen neues Lambda Medium zugeben (auf etwa 50 ml ergänzen und nochmals 1 Stunde inkubieren, währenddessen Verdünnungen herstellen). Danach 20 ml Kultur in 50 ml Greiner Zentrifugenröhrchen ohne Stehrand überführen (und auf der Waage tarieren!). Die Zellpellets werden abzentrifugiert (10 Minuten bei 500 g. Zentrifuge unbedingt sauber hinterlassen.) Die Pellets werden in 20 ml sterilem 10 mM MgSO4 resuspendiert (Vortex, Aufbewahrung bei 4°C). (Überstände sammeln - im Ko lben autoklavieren). Anmerkung: Lambda adsorbiert auch an tote E. colis, die in stationären Kulturen in relevanter Menge vorhanden sein können. Frische Zellen die noch nicht die stationäre Phase erreicht haben wären 9 vorzuziehen. Häufig werden die Zellen in definierter Konzentration z.B. 1.5 x 10 Zellen/ml (etwa OD600=2) in 10 mM MgSO4 resuspendiert und bei 4°C gelagert. Solche Zellen können bis zu 3 Wochen verwendet werden. Vorbereitung der Phagenverdünnungen Ausgehend von den angegebenen Titern der jeweiligen Phagen (pfu/ml) sind geeignete Verdünnungsschritte vorzunehmen, sodaß die erwünschten Zahlen von Plaques/Platte resultieren (siehe Aufgabenstellung). Verdünnungen in sterilen 1.5 ml Eppendorfgefäßen durchfühen (keine größeren Verdünnungsschritte als 1:10: 100 µl Phagensuspension + 900 ml SM). Das Pipettierschema ist im Protokoll genau anzugeben! Achtung: Bitte berücksichtigen Sie, daß im Infektionsansatz nur 100 µl PhagenVerdünnung zum Einsatz kommen ...) Vorbereitung des Top-Agars: Platten mit Bottom-Agar rechtzeitig auf 37°C bringe n (besonders wichtig falls diese auf 4°C gelagert wurden!). Den Top-Agar aufschmelzen (Mikrowellenherd – Vorsicht: nicht überkochen lassen!), heiß 3 ml Portionen in sterile 15 ml Greiner Röhrchen abfüllen und diese in einem Wasserbad bei 48°C vorwärmen. Beim Abfüllen des Top-Agar in Röhrchen darauf achten, daß Agar nicht an der Wand erstarrt und unlösliche Klümpchen bildet (Röhrchen vorwärmen). Wasserspiegel im Wasserbad muß höher sein als der obere Rand des Topagars! Es wird empfohlen einige Röhrchen mehr als benötigt zu inkubieren! ACHTUNG: restlicher Top-Agar wird noch im Teil B benötigt (am Mittwoch in Schottflasche neu aufschmelzen, keinesfalls verschraubte Plastikröhrchen in den Mikrowellenherd geben!!!!). DAGZ-BOKU: WS2011/12 Version 11 (09. 09. 2011) 8 Portioniert wird mit einer 5 ml Hubpipette mit Einwegspitzen. Bitte darauf zu achten, daß der Hub der Pipette nicht von hochspritzendem Agar verlegt wird. Spitzen sparsam verwenden. Negativkontrollen (Ansätze ohne Phagen) zuletzt pipettieren. Für die 2 Platten des Teil B („Blau-Weiß Selektion“) werden in den aufgeschmolzenen Topagar kurz vor dem Ausgießen (in die Röhrchen) je 75 µl IPTG und X-Gal Stammlösungen (Tutor) pro 3 ml Topagar zugeben). IPTG: 100 mM in H2O X-Gal: 100 mM in DMSO Rechtzeitige Beschriftung der Petrischalen (Bottom Agar) nicht vergessen! (Beschriftung bitte nicht am Deckel...) Durchführung der Phageninfektion • in einem Eppendorf-Gefäß werden vereinigt und kurz gevortext: 100 µl Bakteriensuspension + 100 µl Phagensuspension • 15 bis 30 Minuten bei 37°C ohne Schütteln inkubieren (Heizblock oder 37° Raum). • danach die Suspension zum vorgewärmten Topagar pipettieren, • gut durchmischen (zuschrauben, gefühlvoll vortexen oder mehrmals invertieren) und möglichst blasenfrei auf Bottom-Agar ausgießen. • Platten etwa 5 Minuten bei RT stehen lassen. Nach dem Erstarren des Topagar’s die Platten („upside down“) in Plasiksäcken bei 37°C inkubieren (12-16 Stunden). Achtung: der Arbeitsablauf ist zwar einfach - erfordert jedoch etwas Koordination. Die Inkubationszeit soll nicht wesentlich überschritten werden, sonst mischt auch die Phagen-Nachkommenschaft des ersten Wurfes im Geschehen mit und kann das Ergebnis massiv verändern. Wenn für das Ausgießen etwa 20 Sekunden veranschlagt werden und etwa 30 Proben zu verarbeiten sind, sollte es möglich sein innerhalb der Toleranz zu bleiben. Um einen Stau am Wasserbad zu vermeiden ist es unbedingt erforderlich, daß sich die Teilnehmer, die an diesem Beispiel arbeiten, absprechen und die Infektionen etwa 30 Minuten versetzt starten. Checkliste: Sind die Platten schon beschriftet? Ist ein genügend großer Abfallbehälter (Autoklaviersack) neben dem Wasserbad vorhanden? Es wird empfohlen (eventuell mit dem Tutor) eine Testrunde Topagar leer auszugießen um eine brauchbare Geschwindigkeit des Vortex zu ermitteln (möglichst keine Luftblasen!). Übernachtkultur des E. coli Stammes BM25.8 ansetzen (etwa 15 ml Lambda-Medium inokulieren), bei 30°C (rechts im „Hefebrutraum“, Tutor fragen) mit 150 rpm schütteln. DAGZ-BOKU: WS2011/12 Version 11 (09. 09. 2011) 9 3) Mittwoch: Die Platten der Phageninfektion sollen möglichst früh von 37°C in den Kühlraum transferiert werden (kann von einem Teilnehmer bzw. notfalls auch von TA Barbara Svoboda (Hanna Weindorfer) übernommen werden. Teil B: Bitte mit Teil B beginnen und zwischendurch die Platten des Teil A auszählen Übersicht: Im Teil B werden aus 2 ausgestochenen Plaques die Phagen eluiert und die Phagensuspensionen für die Konversion eingesezt. Um bestimmen zu können, wie effizient die Prozedur ist, wird einerseits der Titer dieser eluierten Phagen bestimmt und andererseits die Infektion des Cre-Exprimierenden Stammes durchgeführt. Elution • Auf den Platten mit den TriplEx Phagen sollten blaue Plaques sichtbar sein. Ein isoliert liegender blauer (B) Plaque, und ein Plaque von einer XO Platte (λgt10 of Rasen von XL1-Blue, K...Kontrolle) werden mit sterilen Glaspasteurpipetten (mit Sauger) ausgestochen und in 400 µl SM ausgestoßen. Zur Elution und Resuspension der Phagen zuerst 2 Minuten stark vortexen und anschließend auf 37°C 1 Stunde unter Schütteln inkubieren (37°C Raum , Eppis auf Glasröhrchen stecken). Inzwischen kann Beispiel A ausgewertet werden. • Die Phagensuspensionen kurz abzentrifugieren und Überstände in neue Eppendorf Tubes überführen. Infektion von BM25.8: • Jeweils 200 µl zurückverdünnte Übernachtkultur mit 150 µl der Phagen-Eluate in einem sterilen 12 ml Greiner Röhrchen vereinigen (B, K, unverdünnt, Restliche Phagensuspension noch nicht wegwerfen!) - und ohne schütteln 30 Minuten auf 30°C stehen lassen. • Danach 400 µl Lambda-Medium zugeben und 1 Stunde unter heftigem Schütteln weiterinkubieren (30°C, 200 rpm). Während dieser Wartezeit wird der Titer der eluierten Phagen bestimmt. Dazu werden von den Phagensuspensionen der PlaqueElution die 1:500 und 1: 5000 Verdünnungen hergestellt und je 100 µl für die Infektion von XL1-Blue verwendet. (Prozedur wie am Vortag: Topagar aufschmelzen und 4 Röhrchen vorbereiten (ohne IPTG/X-Gal), 100 µl Phagen + 100 µl Bakteriensuspension) DAGZ-BOKU: WS2011/12 • Version 11 (09. 09. 2011) 10 Nach Ablauf der Inkubationszeit (BM25.8 + Phageneluate B bzw. K) werden je 100 µl der Ansätze (bzw. Verdünnungen davon) wie folgt auf LB+Ampicillin plattiert (vom Tutor ausgegeben) und diese bei 37°C über Nacht inkubiert: TriplEx (B): 1:100 und 1:1000 Verdünnung, λgt10 (K) unverdünnt. Anmerkung: Die integrierten P1 und Lambda Phagen sind zwar bei 37°C „ungesund“ für unseren Wirt, daher wird die Vorkultur bei 30° geführt. Sobald di e Exzision erfolgt ist, ist es aber egal, wenn beispielsweise Selektionsdruck auf Mutation des P1-Phagen (Cre-Rekombinase) besteht. • Um Abschätzen zu können in welchem Verhältnis die E. coli Zellen zu Phagen im Exzisionsansatz vorliegen, ist durch Plattieren einer Verdünnungsreihe von BM25.8 auf Platten ohne Antibiotikum (restliche Bottom Agar bzw. LB) der Titer dieser E. coli Zellen zu bestimmen. Bitte geeignete Verdünnung überlegen, um auf vernünftige Zahlen zu kommen (100300 Kolonien pro Platte): Faustregel: Eine stationäre Kultur hat gut 109 Zellen/ml. Hinweise für das das Protokoll: Teil A: Die Phagen-Plaques mit der Zählzwiebel auszählen (daraus Titer der PhagenStammlösungen berechnen, Vergleich mit dem angegebenen Titer. Beschaffenheit der Plaques (klar/trüb, eventuell Durchmesser, ungewöhnliches..) notieren. Für das Protokoll wichtig ist vor allem die Diskussion der Ergebnisse (Interaktion Phagengene/Wirtsgene: warum entstehen auf dem recA Wirt XL1-Blue keine Plaques mit rekombinantem EMBL3... Theorie und Praxis). Teil B: Bitte berechnen Sie: Wieviele Phagen befinden sich mindestens in einem Plaques (im gesamten Eluat des ausgestochenen Plaques)? Wieviele Phagen wurden zur Exzision eingesetzt, wieviele E. coli Zellen befanden sich im Ansatz? Wieviele AmpR-Kolonien wurden gezählt bzw. entstanden aus wievielen im Ansatz vorhandenen Phagen? Welche Effizienz für die Exzison ergibt sich daraus? Bei Unklarheiten bitte den Betreuer kontaktieren (Dr. Gerhard Adam, 01-47654-) 6380, UFT Tulln) bzw. Tutoren fragen. Viel Erfolg!
