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Aus der Medizinischen Universitätsklinik Abteilung Innere Medizin III
Der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
Die Bedeutung leukozytärer Subpopulationen für die
Arteriogenese im Kaninchenhinterlauf
Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
vorgelegt 2004
von
Sebastian Grundmann
geboren in Hamburg
Dekan: Prof. Dr. Christoph Peters
1. Gutachter: Prof. Dr. Cristoph Bode
2. Gutachter: Prof. Dr. Jürgen Hennig
Jahr der Promotion: 2006
Meinen Eltern
Inhaltsverzeichnis
1
EINLEITUNG ............................................................................................................................................. 1
1.1
1.1.1
1.1.2
1.1.3
1.2
1.3
1.4
1.4.1
1.4.2
1.4.3
1.5
1.5.1
1.5.2
1.5.3
1.6
1.6.1
1.6.2
1.6.3
1.7
1.7.1
1.7.2
1.7.3
1.8
1.8.1
1.8.2
1.8.3
1.8.4
OKKLUSIVE GEFÄßKRANKHEITEN: DER EPIDEMIOLOGISCHE HINTERGRUND ........................................ 2
Akuter Myokardinfarkt .................................................................................................................... 2
Zerebrovaskuläre Insuffizenz .......................................................................................................... 3
Periphere arterielle Verschlusskrankheit........................................................................................ 4
THERAPEUTISCHE OPTIONEN BEI PERIPHERER ARTERIELLER VERSCHLUSSKRANKHEIT ........................ 4
KOLLATERALARTERIEN: HISTORISCHER RÜCKBLICK .......................................................................... 6
DAS WACHSTUM VON BLUTGEFÄßEN ................................................................................................... 7
Vaskulogenese ................................................................................................................................. 7
Angiogenese .................................................................................................................................... 8
Arteriogenese ................................................................................................................................ 10
ZIRKULIERENDE ZELLEN .................................................................................................................... 12
Monozyten ..................................................................................................................................... 12
Granulozyten ................................................................................................................................. 13
Lymphozyten.................................................................................................................................. 14
STIMULATION DER ARTERIOGENESE DURCH LEUKOZYTENSPEZIFISCHE ZYTOKINE ............................ 15
Monocyte Chemoattractant Protein 1 ........................................................................................... 15
Granulocyte-Monocyte Colony Stimulating Factor ...................................................................... 17
Transforming Growth Factor-ß1 ................................................................................................... 18
GRANULOZYTEN- UND LYMPHOZYTENSPEZIFISCHE ZYTOKINE .......................................................... 19
Interleukin-8.................................................................................................................................. 19
Neutrophil Activating Protein-2.................................................................................................... 20
Lymphotactin................................................................................................................................. 21
ADHÄSIONSMOLEKÜLE IN DER ARTERIOGENESE ................................................................................ 22
Selektine ........................................................................................................................................ 23
Integrine ........................................................................................................................................ 24
Immunglobulinartige Adhäsionsmoleküle ..................................................................................... 26
Cadherine...................................................................................................................................... 27
2
ZIELSETZUNG ........................................................................................................................................ 28
3
MATERIAL UND METHODEN............................................................................................................. 29
3.1
MATERIAL .......................................................................................................................................... 29
3.1.1
Versuchstiere................................................................................................................................. 29
3.1.2
Operationsmaterial ....................................................................................................................... 29
3.1.3
Medikamente ................................................................................................................................. 29
3.1.4
Implantierbare Pumpen................................................................................................................. 30
3.1.5
Mikrosphärenanaylse .................................................................................................................... 30
3.1.6
Kontrastmittelherstellung.............................................................................................................. 30
3.1.7
Standardpuffer und Medien........................................................................................................... 31
3.1.8
Histologische Reagenzien ............................................................................................................. 31
3.1.9
Reagenzien zur Durchflusszytometrie ........................................................................................... 32
3.1.10
Verbrauchsmaterial.................................................................................................................. 32
3.1.11
Antikörper................................................................................................................................. 33
3.1.12
Zytokine .................................................................................................................................... 34
3.1.13
Geräte....................................................................................................................................... 34
3.1.14
Software.................................................................................................................................... 34
3.2
METHODEN ......................................................................................................................................... 35
3.2.1
Behandlung der Versuchstiere ...................................................................................................... 35
3.2.2
Hämodynamische Messungen ....................................................................................................... 37
3.2.3
Hämatologische Bestimmung der leukozytären Integrinexpression.............................................. 43
3.2.4
Histologischer Teil ........................................................................................................................ 45
4
ERGEBNISSE ........................................................................................................................................... 47
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
ALLGEMEINER TIEREXPERIMENTELLER VERLAUF .............................................................................. 47
DURCHFLUSSZYTOMETRISCHE BESTIMMUNG DER LEUKOZYTÄREN INTEGRINEXPRESSION ................ 47
HISTOLOGISCHE BETRACHTUNG DER GEFÄßMORPHOLGIE VON KOLLATERALARTERIEN .................... 53
IMMUNHISTOCHEMISCHE QUANTIFIZIERUNG DER LEUKOZYTEN-TRANSMIGRATION .......................... 54
ANGIOGRAFISCHE DARSTELLUNG DES KOLLATERALEN GEFÄßSYSTEMS ............................................ 60
HÄMODYNAMISCHE BESTIMMUNG DER KONDUKTANZ DES KOLLATERALEN GEFÄßSYSTEMS ............ 62
Inhaltsverzeichnis
5
DISKUSSION ............................................................................................................................................ 64
5.1
EIGNUNG DES KANINCHENHINTERLAUFMODELLS ZUR ARTERIOGENESEMESSUNG .......................... 64
5.1.1
Arteriogenese oder Angiogenese?................................................................................................. 64
5.1.2
Periphere Arteriogenesemodelle in anderen Spezies .................................................................... 65
5.1.3
Wieso kein koronararterielles Arteriogenesemodell? ................................................................... 68
5.2
WIRKTEN DIE VERWENDETEN ZYTOKINE SPEZIFISCH?........................................................................ 70
5.2.1
Die durchflusszytometrische Integrinquantifizierung ................................................................... 70
5.2.2
Die quantitative Histologie ........................................................................................................... 71
5.3
BEEINFLUSST DIE ZYTOKINBEHANDLUNG DAS KOLLATERAL-ARTERIENWACHSTUM?........................ 73
5.3.1
Interpretation der Hinterlaufsangiographien................................................................................ 73
5.3.2
Interpretation der Konduktanzmessungen..................................................................................... 74
5.4
DIE BEDEUTUNG DER EINZELNEN LEUKOZYTENPOPULATIONEN FÜR DIE ARTERIOGENESE ................ 76
5.4.1
Monozyten/Makrophagen sind wichtige Mediatoren des Kollateralarterienwachstums .............. 77
5.4.2
Chemoattraktion und Aktivierung von neutrophilen Granulozyten allein hat keinen Einfluss auf
die Arteriogenese......................................................................................................................................... 78
5.4.3
T-Lymphozyten sind für die Arteriogenese nicht von kritischer Bedeutung .................................. 79
6
AUSBLICK ................................................................................................................................................ 82
6.1
6.2
POTENTIELLE UNERWÜNSCHTE NEBENWIRKUNGEN DER PRO-ARTERIOGENEN THERAPIE ................... 82
KLINISCHE STUDIEN ........................................................................................................................... 83
7
ZUSAMMENFASSUNG........................................................................................................................... 85
8
LITERATURVERZEICHNIS ................................................................................................................. 86
9
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ............................................................................................................. 95
10
DANKSAGUNG ........................................................................................................................................ 97
11
LEBENSLAUF .......................................................................................................................................... 98
12
ERKLÄRUNG ......................................................................................................................................... 101
Einleitung
1
1 Einleitung
___________________________________________________________________________
Okklusive Gefäßerkrankungen sind in der westlichen Welt die Todesursache Nummer eins.
Obwohl in Europa, den USA und Australien die Mortalität der koronaren Herzkrankheit seit
den 70er Jahren des vorigen Jahrhunderts langsam sinkt, gewinnen ischämische
Herzkrankheiten, der Schlaganfall und die periphere arterielle Verschlusskrankheit weltweit
gesehen jedoch zunehmend an Bedeutung [72]. Bis auf den afrikanischen Kontinent südlich
der Sahara sind sie mittlerweile weltweit die führende Todesursache. Durch die technischen
Entwicklungen der letzten Jahrzehnte stehen mittlerweile wirkungsvolle therapeutische
Möglichkeiten zu Verfügung, doch auch die Etablierung der perkutanen transluminalen
Koronarangioplastie in der klinischen Praxis und die Verfeinerung der Bypass-Chirurgie
konnten den Krankheiten des Gefäßsystems ihren Schrecken nicht nehmen.
Viele Patienten sind für eine solche chirurgische oder invasiv-kardiologische Therapie nicht
geeignet oder können nicht langfristig geheilt werden.
Restenose von dilatierten
Gefäßabschnitten und Verschluss von Gefäßtransplantaten stellen bisher noch unzureichend
gelöste Probleme dar. Mit ihren enormen Ansprüchen an die technischen Möglichkeiten und
an die Ausbildung des Arztes werden diese Therapieansätze zudem für viele Patienten
außerhalb der industrialisierten Welt noch für lange Zeit unzugänglich bleiben.
Die Suche nach einer kurativen pharmakologischen Behandlungsoption hat also auch durch
die Erfolge der invasiven Revaskularisationstechniken nicht an Bedeutung verloren.
Die Progression atherosklerotischer Wandläsionen der Herzkranzgefäße führt zu einem
langsamen Verschluss des Gefäßlumens, die folgende Minderperfusion des Myokards zu
Angina pectoris Beschwerden des Patienten. Besonders die Ruptur eines solchen
atherosklerotischen Plaques und der akute thrombotische Verschluss des Gefäßes führen oft
zum Tod durch Myokardinfarkt.
Nicht immer jedoch hat ein Verschluss einer Koronararterie den Tod des Patienten zu Folge.
Seit der Anwendbarkeit der Koronarangiographie am Patienten ist dem Kliniker bekannt, dass
auch Patienten mit hochgradigsten Gefäßstenosen manchmal nur über minimale Beschwerden
klagen und auch einen kompletten Gefäßverschluss ohne Infarkt überleben können. Diese
Patienten weisen Umgehungskreisläufe auf, die die verschlossenen Gefäße in der Versorgung
des Myokardareals ersetzen. Solche Gefäße werden als Kollateralgefäße bezeichnet ( und
finden in der Literatur oft unter dem griffigen englischen Terminus „natural bypass“
Erwähnung. Wie bei chirurgischen Bypassoperationen verbinden sie offene Gefäße mit dem
Einleitung
2
postokklusiven Verlauf der verschlossenen Arterie und sichern somit die Versorgung der
betroffenen Gewebsterritorien.
Während die ursprüngliche Ausstattung des Organismus mit kleinlumigen arteriolären
Anastomosen gemeinhin als Relikt des embryonalen Gefäßplexus interpretiert wird, sind
funktionelle Kollateralgefäße keine zufällige anatomische Variante, sondern das Produkt
eines aktiven, adaptiven Gefäßwachstums aus diesen prä-existenten Verbindungen. Eine
solche Proliferation braucht Zeit, und bei den meisten Patienten kann das Wachstum von
Kollateralgefäßen nicht mit dem Krankheitsverlauf mithalten. Die kollaterale Blutversorgung
hat keine Zeit sich zu entwickeln oder verbleibt langfristig insuffizient und kann ein
Fortschreiten der Erkrankung bis hin zum Infarkttod nicht verhindern.
In den letzten Jahren wurde viel Arbeit in die Erforschung der grundlegenden Mechanismen
des Gefäßwachstums investiert.
Die mögliche pharmakologische Stimulation des Wachstums von kollateralen Blutgefäßen am
Herzen, im zerebrovaskulären System und im peripheren Gefäßsystem ist das Gebiet der
Arteriogeneseforschung.
Nach
langjähriger
Grundlagenforschung
ist
dieser
Forschungsbereich mittlerweile bis zur klinischen Erprobung einzelner Substanzen
fortgeschritten. Die grundlegenden Mechanismen dieses vaskulären Proliferationsprozesses
bleiben jedoch weiterhin größtenteils unverstanden und sind Gegenstand intensiver
Forschungsarbeit.
1.1 Okklusive
Gefäßkrankheiten:
Hintergrund
Der
epidemiologische
Neben ihren Auswirkungen auf die Lebensqualität und Mortalität von Hunderttausenden von
Patienten
allein
in
Deutschland
sind
okklusive
Gefäßkrankheiten
und
ihre
Behandlungsmöglichkeiten auch ein bedeutender sozioökonomischer Faktor.
Das statistische Bundesamt lieferte zuletzt 1995 einen epidemiologischen Überblick über
ganz Deutschland [114].
1.1.1
Akuter Myokardinfarkt
1995 starben 87739 Menschen in Deutschland am akuten Myokardinfarkt (AMI). An
ischämischen Herzkrankheiten allgemein verstarben im selben Jahr 183 736 Personen. Der
Einleitung
Myokardinfarkt ist damit die häufigste Todesursache.
3
44,3 % der Todesfälle betrafen
Frauen. Bis zum Alter von 69 Jahren sind überwiegend Männer betroffen, ab dem Alter von
70 Jahren gleicht sich diese Geschlechtspräferenz aus. Das durchschnittliche Sterbealter liegt
bei Männern mit 70,7 Jahren unter dem der Frauen mit 79,9 Jahren.
Seit den achtziger Jahren sinkt die Sterblichkeit am AMI stetig, wofür neben den Fortschritten
in der kardiologischen und kardiochirurgischen Therapie auch die bessere Kontrolle von
Risikofaktoren verantwortlich gemacht wird.
Nach dem Überleben eines Infarktes ist der weitere Verlauf jedoch oft komplikationsreich.
5% erleiden einen Re-infarkt innerhalb des ersten halben Jahres und 40% berichten über
rekurrierende Beschwerden. 20% leiden unter Postinfarktdepressionen.
Die koronare Herzkrankheit ist auch die häufigste Ursache für eine Einschränkung der
ventrikulären Pumpfunktion.
Bei jedem zehnten Patienten entwickelt sich eine
Herzinsuffizienz und eine konsekutive chronische Behinderung [114].
Die resultierenden Kosten von Infarktereignissen sind in ihrer Komplexität nur schwer zu
überblicken. Allein die direkten Behandlungskosten für akute Myokardinfarkte beliefen sich
1994 auf 2,87 Mrd. Euro. Um eine Vorstellung über die direkten und indirekten Kosten von
KHK-Fällen über die verbleibende Lebenszeit der Patienten zu verschaffen, berechnete
Klever-Deichert die Kosten aller im Basisjahr prävalenten Fälle über die erwartete
Restlebenszeit der Patienten fort [72]. Für alle KHK-Patienten im Jahre 1996 sind dies 18,5
Mrd. Euro direkte Kosten und 36,5 Mrd. Euro indirekte Kosten durch Arbeitsausfälle und
Berentung, insgesamt 56,5 Mrd. Euro. Pro KHK-Patient beliefen sich die durchschnittlichen
Kosten über die verbleibende Lebenszeit auf 62500 Euro.
1.1.2
Zerebrovaskuläre Insuffizenz
Über die Inzidenz zerebrovaskulärer Erkrankungen in Deutschland stehen nur Schätzungen
zur Verfügung [114].
Für Westdeutschland wurde in den achtziger Jahren des vorigen
Jahrhunderts berechnet, dass 317 von 100 000 Einwohnern jährlich einen Schlaganfall
erleiden.
Auch zur Prävalenz von Apoplexopfern gibt es für Deutschland keine verlässlichen Zahlen.
Internationale Studien geben Werte zwischen 500 und 800 pro 100 000 Einwohnern an.
Anders als beim Myokardinfarkt ist die Letalität innerhalb des ersten Tages relativ gering. Im
ersten Monat versterben allerdings je nach Schwere der Erkrankung zwischen 5 und 25 % der
Einleitung
Betroffenen.
4
Insgesamt starben 1995 im Westen Deutschlands 93 Personen je 100 000
Einwohner, im Osten 133 Personen je 100 000.
Die direkten Behandlungskosten wurden 1994 auf 6,1 Mrd. Euro geschätzt.
1.1.3
Periphere arterielle Verschlusskrankheit
Etwa 3,3 Mio. Deutsche sind an peripherer arterieller Verschlusskrankheit erkrankt, 60%
davon Männer. Jedes Jahr erkranken in Deutschland etwa 100 000 Patienten neu.
Unter den Todesursachen spielt die pAVK mit 17800 Todesfällen 1995 nur eine
untergeordnete Rolle, da sie im allgemeinen nicht unmittelbar zum Tode führt. Die meisten
Patienten versterben an der begleitenden Erkrankung der Koronargefäße.
Auswirkung
auf
die
Lebensqualität
der
Betroffenen
ist
sie
jedoch
In ihrer
dramatisch.
Schätzungsweise 22 000 Gliedmaßen werden jährlich in Deutschland aufgrund von arterieller
Verschlusskrankheit amputiert. 1995 wurden in der Statistik 43 000 Schwerbehinderte wegen
krankheitsbedingtem Teilverlust von Extremitäten geführt. Besonders Patienten mit einem
Diabetis mellitus leiden an einer pAVK als Spätfolge ihrer Erkrankung. Auch bei optimaler
Einstellung entwickelt eine Vielzahl von Diabetispatienten eine sich peripher manifestierende
Makroangiopathie.
1995 wurden insgesamt etwa 131 000 Patienten wegen peripherer Gefäßkrankheiten stationär
behandelt. Die gesamten direkten Kosten werden für 1995 auf 2,2 Mrd. Euro geschätzt.
1.2 Therapeutische Optionen
Verschlusskrankheit
bei
peripherer
arterieller
Zur Therapie von chronischen okklusiven Gefäßkrankheiten stehen im Wesentlichen drei
Möglichkeiten
zur
Verfügung:
Die
konservative
medikamentöse
Therapie,
die
interventionelle perkutane transluminale Angioplastie (PTA) mit dem optionellen Einbringen
eines endoluminalen Stents, sowie als chirurgische Verfahren die Embolektomie oder die
Bypass-Operation. Besonders in der pharmakologischen Therapie der pAVK werden die
therapeutischen Grenzen deutlich: Die Progression der Erkrankung lässt sich nur selten
verhindern.
Neben der Kontrolle der allgemeinen kardiovaskulären Risikofaktoren und der Anregung
eines regelmäßigen Trainingsprogramms umfasst die Basistherapie die Gabe eines
Thrombozytenaggregationshemmers, meist Aspirin.
Obwohl die CAPRIE-Studie einen
Einleitung
5
positiven Effekt von Clopidogrel gegenüber Aspirin hinsichtlich der Prävalenz von
Myokardinfarkt oder Schlaganfall zeigte, ist der Einsatz dieser Substanz bisher durch ihre
hohen Kosten limitiert [17]. Neuere Ergebnisse unserer Gruppe legen auch einen Vorteil von
Clopidogrel versus Aspirin hinsichtlich der spontanen Entwicklung von Kollateralarterien
nahe [58]: Mit Clopidogrel behandelte Kaninchen entwickeln eine bessere Kollateralisierung
als ASS behandelte Tiere, vermutlich aufgrund einer geringeren Inhibition des
inflammatorischen
arteriogenen
Wachstumsprozesses.
Der
Anwendungsbereich
von
Clopidogrel wird sich voraussichtlich in naher Zukunft auf weitere kardiovaskuläre
Indikationen erweitern.
Weitere spezielle Pharmaka sind zur Therapie der Claudicatio intermittens zugelassen,
aufgrund des teils noch relativ unklaren klinischen Vorteils in ihrer Anwendung jedoch
begrenzt.
Während in Frankreich viele Patienten mit durchblutungsfördernden Mitteln
behandelt werden, ist diese Therapieform im anglo-amerikanischem Raum nicht sehr
verbreitet [90].
Intravenöse Prostaglandininfusion konnte in Studien Ruheschmerz und
ischämische Ulzerationen bessern, die Ergebnisse sind noch teils inkonstant und die
Anwendung von stabilen Prostaglandinderivaten wie Iloprost erst ab Fontaine-Stadium III
indiziert.
Die
erfolgversprechendsten
Phosphodiesteraseinhibitoren
mit
momentan
vasodilatatorischer
hemmender Wirkung wie Cilostazol [6].
verfügbaren
und
Substanzen
sind
thrombozytenaggregations-
Die vielfältigen Nebenwirkungen und
Kontraindikationen dieser Substanzen sind jedoch zu beachten.
Aufgrund der geringen
Erfolgschancen einer konventionellen konservativen Therapie ist die chirurgische oder
interventionelle Revaskularisation die Therapie der Wahl bei Patienten mit extremitätenbedrohender Ischämie.
Bei stabiler Claudicatio intermittens mit geringem Amputationsrisiko ist die chirurgische
Intervention jedoch nur selten indiziert.
Sobald allerdings die Gefahr einer bleibenden
Behinderung durch Extremitätenverlust zunimmt, sollte ein operatives Vorgehen erwogen
werden. Zwei grundsätzliche Verfahren stehen zur Wahl: Die Thrombendarteriektomie und
die Bypassoperation.
Außer bei klar begrenzt lokalisierten Stenosen ist hier dem
chirurgischen Bypass der Vorzug zu geben [90]. Mit einem autologen Venentransplantat lässt
sich auch im infrapoplitealen Stromgebiet nach 5 Jahren noch eine Offenheitsrate von 70-80%
erzielen
[7].
Die Langzeitergebnisse der endovaskulären Katheterintervention sind den
chirurgischen Verfahren unterlegen, nach drei Jahren liegt die Restenoserate von
infrainguinalen Stents über 40% [90]. Die wesentlichen Vorteile der PTA liegen jedoch in der
weit geringeren Invasivität des Verfahrens und der Wiederholbarkeit der Eingriffe.
Bei
Einleitung
6
geeigneten kurzstreckigen Stenosen fällt die primäre Wahl deshalb meist auf die
Katheterintervention.
Die Restenose als die wichtigste Langzeitkomplikation der Stentimplantation lässt sich durch
die neuen beschichteten Stents vermutlich wirkungsvoll reduzieren.
Solche lokale
Pharmakotherapie erreicht hohe lokalisierte Substanzkonzentrationen ohne signifikante
systemische Effekte [47].
Besonders das Immunsupprimivum Sirolimus scheint
vielversprechend. In der ersten großen multizentrischen Studie in 238 Patienten konnte die
Restenoserate (Stenose > 50%) durch sirolimusbeschichtete Stents sechs Monate nach
Intervention von 27% in der Kontrollgruppe auf 0% in der Serolimusgruppe reduziert werden
[82].
Auch im Langzeitverlauf zeigen sich in bisher kleinen Patientenkollektiven erhöhte
Offenheitsraten [36].
Durch die Weiterentwicklung dieser Ansätze könnte eines der
entscheidenden Probleme der perkutanen Intervention gelöst werden.
1.3 Kollateralarterien: Historischer Rückblick
Der schweizer Arzt und Allgemeingelehrte Albrecht von Haller beschrieb 1757 bei seinen
Sektionen am menschlichen Herzen, dass Koronararterien durch ein Netz von kleinen
Arterien untereinander verbunden sind. Gängige Lehrmeinung in den folgenden
Jahrhunderten wurde jedoch die von zahlreichen Anatomen bestätigte Auffassung, dass
Koronararterien anatomisch gesehen Endarterien sind. Unter anderem vertraten Henle, Hyrtle
und Cohnheim diese Meinung [13].
Zu Beginn des 20. Jahrhunderts gelangte Spalteholz aufgrund pathologischer Studien zu der
Erkenntnis, dass präformierte Kollateralgefäße am menschlichen Herzen bestehen.
Schlesinger widersprach dieser These 1938, da er Kollateralgefäße nur in 4% seines
Sektionsgutes fand.
Letztendlich konnten erst Longland 1953 am Bein und Fulton 1965 am Herzen die These der
anatomischen Endarterien mit überlegenen Techniken widerlegen. Longland begründete auch
die mittlerweile etablierte Definition von Kollateralen als arterioläre Verbindungen mit
Stamm, Mittelzone und Wiedereintritt ins distale Stromgebiet. Fulton beschrieb Kollateralen
als Verbindungen von geringem Durchmesser, zum größten Teil nur 20-200 µm, die auch bei
Gesunden nachgewiesen werden konnten.
Tsuchiya und Baroldi untersuchten auch
arteriosklerotisch veränderte Koronargefäße und fanden deutlich größere Kollateralen bis zu 2
mm Durchmesser [103]. Die Veränderung von Kollateralgefäßen als adaptiver Prozess an
Einleitung
7
Krankheit rückte damit in den Mittelpunkt des Interesses.
In Deutschland hat sich
insbesondere Schaper große Verdienste durch die Erforschung des Wachstumsmechanismus
von Kollateralgefäßen am Herzen und in der peripheren Zirkulation erworben. Er zeigte 1971
erstmals, dass die Entwicklung von weitlumigen Kollateralen ein morphologischer
Wachstumsprozess und nicht nur funktionelle Vasodilatation ist [108]. Mit fortschreitendem
Verständnis
versuchte
man,
die
speziellen
Vorgänge
dieses
vaskulären
Proliferationsprozesses besser gegen andere Formen von Gefäßwachstum abzugrenzen.
1.4 Das Wachstum von Blutgefäßen
Lebendes Gewebe ist von der Versorgung mit Sauerstoff abhängig. Diese Versorgung erfolgt
in den allermeisten Fällen über das Blut, welches über Blutgefäße in jeden Bereich des
menschlichen Körpers fortgeleitet wird. Blutgefäße entwickeln sich auch nach Abschluss der
Embryonalentwicklung weiter. Sie passen sich veränderten Bedürfnissen an, können aber bei
Tumorerkrankungen und Krankheiten des entzündlichen Formenkreises auch überschießend
proliferieren oder als Blutversorger insuffizient werden [19]. Viele Fachbereiche haben sich
deshalb mit der Erforschung der vaskulären Wachstumsmechanismen beschäftigt.
1.4.1
Vaskulogenese
In der frühen Embryonalentwicklung differenzieren sich zuerst im extraembryonalen
Mesoderm von Dottersack und Chorion hemangioblastische Vorläuferzellen sowohl zu
hämatopoetischen Stammzellen als auch zur umgebenden endothelialen Gefäßstruktur. Diese
in-situ Entwicklung von kapillären Netzwerken aus Vorläuferzellen während der
Embryonalentwicklung wird als Vaskulogenese bezeichnet. Ob dieser Vorgang auch im
adulten Organismus stattfindet, ist umstritten. Intraembryonal ist die in-situ Gefäßbildung
von der Blutbildung getrennt [24]. Carmeliet hält Vaskulogenese auch postembryonal für
möglich [19], während andere Autoren diesen Begriff für die Ontogenese reservieren [107].
In der fortschreitenden Embryonalentwicklung wird die in-situ-Manifestierung der Vaskulatur
durch Sprossungsprozesse abgelöst, bei der sich bereits differenzierte endotheliale Rohre zu
komplexeren Netzwerken verzweigen [24]. VEGF und seine Rezeptoren Flk-1 und Flt-1
spielen bei beiden Prozessen eine prominente Rolle [97].
Einleitung
8
Die weiteren von diesem nun präformierten Netzwerk ausgehenden Wachstumsprozesse
werden, ob prä- oder postpartal, meist unter dem Terminus „Angiogenese“ zusammengefasst.
1.4.2
Angiogenese
Angiogenese ist ein integraler Bestandteil wichtiger physiologischer Prozesse wie
Wundheilung oder Schwangerschaft.
Ursprünglich eingeführt zur Beschreibung der
vaskulären Adaptation in der Plazenta rückt heute besonders die Bedeutung in pathologischen
Vorgängen wie Neoplasien, diabetischer Retinopathie und Entzündungsprozessen in den
Vordergrund.
Das Wachstum von Kapillaren ist ein hypoxieabhängiger Prozess. Einen Sauerstoffmangel
beantworten viele Zelltypen mit der Expression von angiogen wirksamen Signalmolekülen
wie VEGF und Angiopoietin-1. Die hypoxieabhängige frühe Signaltransduktion ist noch zu
großen Teilen ungeklärt. Die Hochregulation des hypoxia-inducible-factor-1 in Abhängigkeit
von physiologischen Sauerstoffpartialdruckabfällen ist jedoch gut beschrieben [133]. Neben
der HIF-1 abhängigen verstärkten Expression ist auch eine erhöhte mRNA-Stabilität für die
stärkere Nachweisbarkeit von VEGF in hypoxischem Gewebe verantwortlich [97].
Vasodilatation ist einer der frühesten Schritte der Angiogenese [27] und führt NO-abhängig
zu einer Hochregulation von Wachstumsfaktoren. VEGF, zuerst beschrieben als Vascular
Permeability Factor, induziert eine Extravasation von Plasmaproteinen und fluidem Volumen
als extravasale Matrix für migrierende Endothelzellen. Degradationsenzyme der MatrixMetalloproteinasenfamilie schaffen Raum für neue Kapillaren und induzieren wiederum
weitere Signalmoleküle wie bFGF, VEGF und IGF-1 [27]. Die Teilung, Migration und
Reorganisation von Endothelzellen in vivo wird im wesentlichen von parakrin sezerniertem
VEGF initiiert und reguliert. Dieses Signalmolekül wird in verschiedenen Splice-Varianten
exprimiert, die unterschiedliche biologische Funktionalität besitzen. Während VEGF121 und
VEGF165 das Kapillarlumen erweitern, wirkt VEGF189 hier entgegengesetzt lumenverengend.
VEGF bindet an zwei verschiedene membranständige Rezeptoren der Tyrosinkinasefamilie,
den VEGF-Rezeptor-1 (Flt-1), der in löslicher Form auch sezerniert wird (sFlt), und den
VEGF-Rezeptor-2 (Flk-1, KDR). Nicht nur Endothelzellen und ihre Vorläufer, sondern auch
andere Zelltypen exprimieren diese Rezeptoren, z.B. Monozyten den VEGFR1, der hier auch
Funktionalität besitzt. Die teils paradoxe Interaktion der Rezeptoren und ihrer verschiedenen
Liganden resultiert letztendlich in der Organisation von neuen kapillären Netzwerken und
einer besseren Verteilung des angebotenen Blutflusses im Gewebe. Blutgefäße größeren
Kalibers mit einer glattmuskulären Gefäßwand entwickeln sich nicht direkt Hypoxie abhängig
Einleitung
[30]
und
nach
der
Embryonalphase
durch
9
Wachstum
aus
bereits
angelegten
Gefäßverbindungen.
Angiogenese ist von großer klinischer Bedeutung, allerdings vor allem auch als
pathologischer Prozess: Maligne Neoplasien sind für Wachstum und Metastasierung auf den
Anschluss an die Blutversorgung angewiesen und können das Einsprossen von Kapillaren
stimulieren oder auch hemmen. Besonders die grundlegenden Arbeiten aus der Gruppe von
Judah Folkman haben zum Verständnis der Bedeutung von Angiogenese in der Onkologie
beigetragen [38, 39].
Die Entdeckung, dass physiologische Inhibitoren des kapillären
Gefäßwachstums wie Angiostatin das Wachstum von malignen Tumoren unterdrücken kann
[89], eröffnete das weite Forschungsfeld der Anti-Angiogenese. Grundlegende Hypothese
dieses onkologischen Therapieansatzes ist, dass besonders Karzinommetastasen zu zwei
Zeitpunkten obligat auf Angiogenese angewiesen sind:
Erstens findet typische
Metastasierung erst nach Neovaskularisation des Primärtumors statt, und zweitens müssen
ausgeschwemmte
Tumorzellnester
vaskularisiert werden [37].
zur
Versorgung
in
ihrem Zielgebiet
wiederum
Der Anschluss an die kapilläre Blutversorgung könnte der
entscheidende Faktor für den weiteren Verlauf einer metastasierten Tumorerkrankung sein
und eine Reihe von bekannten klinischen Phänomenen verständlich machen. Metastasen des
Mammakarzinoms können viele Jahre latent bleiben, wachsen aber nach ihrer klinischen
Entdeckung mit derselben Proliferationsrate wie Filiae, die nur Monate nach Resektion des
Primärtumors auftreten.
Folkman postulierte, dass zunächst die Erkrankung in eine
minderversorgte Ruhephase eintritt und erst nach suffizienter Angiogenese fortschreiten kann.
Erst der „angiogenic switch“ von Tumorzellen zum angiogenen Phänotyp ermöglicht die
Proliferation.
Dieser
genetische
Mammakarzinomen sichtbar:
Unterschied
ist
in
der
Histopatholgie
von
Tumorzellen umringen die neuen Kapillarsprossen und
Endothelzylinder [37]. In Tiermodellen konnte auch gezeigt werden, dass die Resektion des
Primärtumors das Wachstum von Metastasen induzieren kann. Der Primarius hatte durch
Sekretion von anti-angiogenen Faktoren wie Thrombospondin und Angiostatin die
Metastasenangiogenese suprimiert.
Auch wenn die Entwicklung einer anti-angiogenen Therapie langsamer fortschreitet, als die
ersten Erfolge erhoffen ließen, so ist ihr Potential als mögliche adjuvante Therapie
vielsprechend.
Einleitung
1.4.3
1.4.3.1
10
Arteriogenese
Der Begriff Arteriogenese
Der Begriff Arteriogenese beschreibt die Entwicklung von Kollateralarterien aus
präexistenten arteriolären Verbindungen.
Über die Notwendigkeit einer nominativen
Abgrenzung zum Begriff Angiogenese besteht in der Literatur Uneinigkeit und einige
Autoren verwenden den Begriff Angiogenese global für jede Form von Gefäßwachstum.
Auch wenn es sich streng philologisch beim Kollateralarterienwachstum nicht um eine
Genesis, also eine de novo-Entstehung handelt, so setzt sich der Begriff in Anbetracht der
offensichtlichen mechanistischen Unterschiede zur Angiogenese in der Fachliteratur immer
mehr durch.
Wie oben dargelegt, war die Präexistenz von interarteriellen Verbindungen am Herzen lange
Zeit Gegenstand kontroverser Diskussion.
Über die
Bedeutung von maturierten
Kollateralgefäßen für den Verlauf von koronaren Herzkrankheiten bestand jedoch bald
Einigkeit. In den 1980er Jahren konnte der koronare Kollateralstatus und die Mortalität von
Myokardinfarkten in Studien gut korreliert werden [9, 88]. Natürliche Arteriogenese rettet
Gewebe und Leben.
Besonders eindrücklich wird diese Tatsache beim Krankheitsbild der Aortenisthmusstenose,
bei dem das grösste Gefäß des menschlichen Körpers, die Aorta, durch Kollateralen ersetzt
werden kann.
Als Verbindungsgefäße dienen hier hauptsächlich die Arterien der
Thoraxwand, besonders auch die Interkostalarterien. Auch die heterogene adaptive Reaktion
wird bei dieser Erkrankung deutlich. Während sich bei einigen Patienten die Aortenstenose
früh und dramatisch manifestiert, bleiben andere lange Zeit weitgehend unauffällig.
Abb. 1 Diese NMR-Aufnahme in koronarer Schichtung stammt
von einem 30jährigen Mann, der als gesunder Proband der
Kontrollgruppe an einer NMR-Studie teilnahm.
Trotz eines
vollständigen Verschlusses des Aortenisthmus war dieser Patient
beschwerdefrei und spielte aktiv Fußball. Die deutlich sichtbaren
geschlängelten Interkostalarterien hatten die Versorgung der unteren
Körperhälfte übernommen.
(Abbildung überlassen von Dr. N. van Royen, AMC Amsterdam,
Niederlande)
Einleitung
1.4.3.2
11
Scherkraft
Lebende Zellen sind permanent verschiedenen Stressoren ausgesetzt. Krankheit, Verletzung
und Änderungen der zellulären Umgebung setzen einen Zellverbund unter Stress, und je nach
Auslöser kann dieser chemischen oder physikalischen Charakters sein. Die zelluläre Antwort
auf Stress ist eine in der Evolution hochkonservierte Reaktion, ähnlich in Pro- und
Eukaryonten und reicht von der Expression von Hitzeschockproteinen über die Aktivation
verschiedener Signalkaskaden bis zum apoptotischen Zelltod [11].
Der Blutfluss durch ein arterielles Gefäßsystem wirkt als biomechanischer Stress.
Verschiedene physikalische Größen wirken auf die Gefäßwand: Blutdruck, hydrostatische
Drücke, Dehnung und Scherstress. Der Anstieg der axialen Flussgeschwindigkeit von der
Gefäßwand zur Lumenmitte ist als Scherrate definiert.
In Abhängigkeit von der
Blutviskosität µ bestimmt die Scherrate dv/dr den laminar auf das Endothel wirkenden
Scherstress als τ = dv/dr * µ, definiert als Kraft pro Fläche mit der Einheit dyn/cm² im CGSSystem.
Im Vergleich zum zirkumferentiellen Dehnungsstress des Gefäßes in der Größenordnung von
106 - 107dyn/cm² ist der Scherstress mit physiologischen Werten um 20 bis 30 dyn/cm² eine
relativ schwache Kraft.
Bei chronischem Verschluss eines arteriellen Hauptgefäßes steigt der prästenotische
Blutdruck an und der systemisch-periphere Druckgradient nimmt zu. Nun wird auch die
Kapazität in arteriolären Verbindungen gefordert, in denen ohne Stenose nur geringer oder
oszillierender Fluss herrschte. Mit dem Anstieg der axialen Flussgeschwindigkeit nimmt auch
der Scherstress in diesen kollateralen Blutgefäßen zum selben Endstromgebiet zu.
Die
primäre Reaktion auf Flusserhöhung ist NO-vermittelte Vasodilatation, welche den
Gefäßdurchmesser
funktionell
erhöht
und
Scherstress
reduziert.
Bei
arteriellen
Verschlusskrankheiten arbeitet die funktionelle Gefäßadaptation jedoch am Ende der
vasodilatatorischen Reserve und das Endothel als primäre Mediatorstruktur bleibt permanent
erhöhten Scherkräften ausgesetzt.
Endothelzellen detektieren Scherstress durch Interaktion zwischen extrazellulärer Matrix,
Glykokalix, Integrinen und Zytoskelettelementen.
Vinculin und α-Actinin verbinden
extrazelluläre Integrine durch die Plasmamembran mit dem zytoplasmatischen F-Actin als
wichtigster kraftvermittelnder zellulärer Struktur. Die Signaltransduktion in den Nukleus
wird
über
verschiedene
MAP-Kinase-Transduktionskaskaden
vermittelt,
u.a.
den
extracellular signalrelated kinases (ERKs), den c-jun NH2 terminal kinases (JNKs) und der
p38 Kinase [11]. Stromabwärts werden verschiedene Transkriptionsfaktoren wie AP-1, NF-
Einleitung
12
κB, Sp-1 und Egr-1 aktiviert. Scherstressspezifische Transkriptionsregulation erfolgt über
verschiedene DNA-Bindungssequenzen, eine ist das shear stress responsive element (SSRE)
in der Promotorsequenz von zahlreichen an der Arteriogenese beteiligten Genen wie MCP-1,
ICAM-1 und TGF-ß [23]. Die physiologische Bedeutung dieses und anderer regulierender
Elemente wird aber durchaus kontrovers diskutiert. Die Transkriptionskontrolle ist komplex
und redundant: MCP-1 wird sowohl über Bindung des Transkriptionsfaktors NF-κB an das
SSRE in seiner Expression gestärkt, wie auch über die Bindung des c-jun/c-fos Heterodimers
AP-1 an das 12-O-tetracanoylphorbol-13-acetat response element. So führen mindestens
zwei unabhängige Signaltransduktionskaskaden zur scherstressabhängigen Promotoraktivation [11].
1.5 Zirkulierende Zellen
Infiltrierende Leukozyten als Mediatoren und Quelle von Wachstumsfaktoren sind sowohl in
der Angiogenese wie auch in der Arteriogenese von Bedeutung, wobei jedoch den einzelnen
leukozytären Subpopulationen bei den verschiedenen Prozessen eine sehr unterschiedliche
Bedeutung beigemessen wird.
1.5.1
Monozyten
Neben ihrer Funktion in der immunologischen Abwehr gegen pathogene Keime und
zahlreichen anderen Funktionen in der Homöostase des Organismus sind Monozyten und
Makrophagen für das Wachstum von Kollateralgefäßen bei arteriellem Verschluss von
entscheidender Bedeutung [3, 105, 106].
Die Arbeitsgruppe um Schaper konnte zeigen, dass Monozyten als Gewebsmakrophagen um
proliferierende Kollateralarterien der peripheren Zirkulation akkumulieren [102]. In einem im
Wesentlichen durch das leukozytäre Integrin Mac-1 und das endotheliale ICAM-1
vermitteltem
Bindungsprozess
[62]
adhärieren
zirkulierende
Monozyten
an
das
scherstressaktivierte Endothel des noch kleinlumigen Kollateralgefäßes und transmigrieren in
die Adventitia. Ob dieses Phänomen für das Wachstum der Arterien funktionelle Bedeutung
hat oder nur als zufällige Koinzidenz zu werten sei, war jedoch Anfangs unklar.
In
weiterführenden Arbeiten konnte in den darauffolgenden Jahren der Einfluss dieser
Zellpopulation auf die Arteriogenese weiter untersucht werden.
Durch die Freisetzung von Matrix-Metalloproteinasen tragen Monozyten/Makrophagen zur
für die Gefäßproliferation nötigen Gewebeumbildung bei [43]. Paravasale Makrophagen sind
Einleitung
13
die wichtigste Quelle von Wachstumsfaktoren in der Arteriogenese: Sie exprimieren und
sezernieren zahlreiche Zytokine wie GM-CSF, TNFα, bFGF und MCP-1 [3] [94] und
resultieren so letztendlich in einem noch weitgehend unverstandenen Prozess in der Teilung
der glatten Gefäßmuskelzellen und in kollateraler Gefäßproliferation .
Die Erkenntnis, dass sich der Spontanverlauf der Arteriogenese durch künstliche Applikation
von MCP-1 zur Chemoattraktion von Monozyten im Tiermodell beschleunigen lässt [59, 69],
führte
zur
intensiven
Erforschung
der
Monozytenkontribution
zur
Arteriogenese.
Verschiedene Zytokine haben mittlerweile ihre arteriogene Wirksamkeit in unterschiedlichen
Tiermodellen bewiesen. Neben MCP-1 zeigen vor allem GM-CSF [12] und TGF-ß [124] eine
starke arteriogene Potenz.
1.5.2
Granulozyten
Neutrophile Granulozyten sind Teil der immunologischen Abwehr von extrazellulären
Pathogenen. Sie dominieren die entzündliche Reaktion in inflammatorischen Reaktionen auf
Infektion und in Erkrankungen des entzündlichen Formenkreises.
Neutrophile Granulozyten als Mediatoren und Quelle von Wachstumsfaktoren und Zytokinen
des Gefäßwachstums wurden bisher primär im Kontext der Angiogenese diskutiert.
Taichman et al. zeigten, das Neutrophile in Entzündungsprozessen VEGF in ihre Umgebung
sezernieren können [115] und McCourt et al. beschrieben eine stimulierte Proliferation von
humanen Endothelzellen in vitro nach Inkubation mit aktivierten polymorphkernigen
Neutrophilen [81].
Neutrophile speichern VEGF in intrazellulären Vesikeln [44], die
Sekretion nach extrazellulär kann u.a. durch die physiologischen Agonisten TNF-α oder fMetLeu-Phe (fMLP) induziert werden. Benelli et al. beobachteten in einem in vivo MatrigelAssay in Ratten nach Granulozytenablation eine deutlich reduzierte angiogene Antwort auf
verschiedene Stimuli im Vergleich zu Kontrolltieren ohne Neutrophilendefizienz [8]. Er
zeigte auch einen deutlich negativen Effekt des Angiogeneseblockers Angiostatin auf die
Neutrophilenmigration und deutete dies als einen antiinflammatorischen Wirkmechanismus in
der Angiogenesehemmung durch Angiostatin.
Neutrophile exprimieren jedoch auch zahlreiche Proteine mit Bedeutung für die
Arteriogenese. Sie sezernieren aktivationsabhängig TGF-ß und TNF-α [51, 95] und sind in
physiologischen und pathologischen Prozessen entscheidend für Matrixdegradation und
Gewebeumbauprozesse.
Über Sekretion proteolytischer Enzyme lockern sie die
Einleitung
14
extrazelluläre Matrix zur Zellmigration und schaffen Platz für Zellproliferation und neue
Gewebestrukturen.
Ihre physiologische Funktion in zahlreichen Bereichen der inflammatorischen Reaktion deckt
sich somit teilweise mit jener der Monozyten/Makrophagen-Zelllinie in der Arteriogenese.
Bei der beschriebenen Bedeutung von Neutrophilen in der Angiogenese stellt sich die Frage,
welche Bedeutung dieser Zellpopulation für die Arteriogenese zuzumessen ist.
1.5.3
Lymphozyten
Während maturierte B-Zellen nach Stimulation Antikörper sezernieren, sind T-Lymphozyten
entscheidende Mediatoren der Abwehr gegen virale und andere intrazelluläre Erreger sowie in
der immunologischen Reaktion auf maligne Neoplasien.
Neben direkt zellaggressiven
Funktionen sind sie besonders für die Regulation und Koordination der spezifischen Abwehr
von Bedeutung. Zahlreiche neuere Arbeiten der Angiogeneseforschung legen jedoch auch
eine Bedeutung außerhalb des immunologischen Systems nahe.
Kultivierte CD4+ T-Lymphozyten exprimieren den heparin-binding epidermal growth factor
und sowohl CD4+ als CD8+ T-Zellen synthetisieren bFGF [10], beides Substanzen mit
angiogener Potenz. Freeman et al. konnten zeigen, dass auch VEGF hypoxieabhängig in
relevanten Konzentration von CD4+ und CD+ T-Lymphozyen sezerniert wird [40].
Iijima
beschrieb die aktivationsabhängige VEGF-Transkription in T-Lymphozyten aus peripherem
Blut auf mRNA-Ebene [65].
Auch in vivo-Ergebnisse aus verschiedenen Tiermodellen, besonders aus der Arbeitsgruppe
von Isner in Boston, legen eine Bedeutung von T-Lymphozyten für die Angiogenese nahe.
Rivard et al. beobachteten eine altersabhängig reduzierte Angiogenese in Kaninchen und
Mäusen nach Femoralarterienresektion und korrelierten im Mausmodell die Anzahl
infiltrierender T-Lymphozyten in ischämischen Gewebe mit der Kapillardichte [98].
Auch knock-out-Modelle mit reduzierter Angiogenese wie ApoE-/- Mäuse zeigen eine
geringere Anzahl infiltrierender T-Lymphozyten in ischämischen Gewebe [28]. In derselben
Studie beschrieben Couffinhal et al. die Entwicklung von ischämischen Fußnekrosen nach
radikaler Femoralarterienresektion in athymischen Nacktmäusen ohne funktionelle TLymphozyten, während C57BL6/J Mäuse als genetischer Backgroundstamm keine Nekrosen
aufwiesen. Histologisch waren nur vereinzelte neovaskularisierte Territorien zu erkennen.
Daraus schlussfolgerten die Autoren eine kritische Bedeutung von T-Lymphozyten als Quelle
Einleitung
von VEGF in der Angiogenese.
15
Da neben der reduzierten Kapillardichte auch ein
eingeschränkter Blutfluss zum Hinterlauf in der Dopplerflussmessung festzustellen war, wird
auch ein Einfluss von T-Lymphozyten auf Kollateralarterienwachstum nahe gelegt. Stabile et
al. griffen diesen Gedanken in einem ischämischen Hinterlaufmodell in CD4-knock-outMäusen auf und beobachteten in diesem Stamm einen reduzierten Laser-Doppler-Fluss im
Vergleich zu Kontrollen. Daraus schlossen die Autoren einen indirekt positiven Einfluss von
CD4+ Lymphozyten auf die Arteriogenese durch sekundäre Chemoattraktion von Monozyten.
In einer vorhergehenden Studie unserer Arbeitsgruppe fanden wir in einem reinen
Arteriogenesemodell mit intakten Kollateralarterienursprüngen unter Lymphozytendefizienz
im Nacktmausmodell bei maximaler Vasodilatation keine reduzierte Arteriogenese in
mikrosphärenbasierten Perfusionsmessungen [49]. Weitere Experimente in anderen Modellen
waren zur Klärung der lymphozytären Beteiligung an der Arteriogenese nötig.
1.6 Stimulation der Arteriogenese durch leukozytenspezifische
Zytokine
Nach deskriptiver Betrachtung der Monozytenfunktion in der Arteriogenese lag der Versuch
nahe, durch therapeutische Beeinflussung dieser Zellpopulation das Kollateralarterienwachstum zu stimulieren und so mögliche pharmakologische Behandlungs-strategien für die
verschiedenen Formen der arteriellen Verschlusskrankheiten zu entwickeln.
Tatsächlich
gelang es 1997 der Arbeitsgruppe von Schaper, den Spontanverlauf der Arteriogenese nach
Femoralarterienligatur
im
Kaninchenhinterlauf
durch
lokale
Applikation
monozytendominant wirksamen Zytokins MCP-1 signifikant zu stimulieren [69].
des
Höfer
zeigte 2001 mit überlegener Messtechnik, dass die verbesserten Konduktanzwerte im
wesentlichen auf einer Beschleunigung des Spontanverlaufs beruhen, während die
Langzeitergebnisse der Monotherapie keine signifikante Besserung der Hinterlaufsperfusion
zeigen konnten [59]. Mittlerweile ist für mehrere Zytokine mit unterschiedlich spezifischer
Wirkung auf Monozyten ein positiv therapeutischer Effekt auf das Kollateralarterienwachstum im Tiermodell gezeigt worden.
1.6.1
Monocyte Chemoattractant Protein 1
1989 wurde aus einer LPS stimulierten myeolomonozytären Zelllinie ein neuer monocyte
chemotactic and activating factor (MCAF) isoliert und kloniert [42] und im selben Jahr auch
Einleitung
16
unter dem Namen MCP-1 aus mononukleären Zellen aus humanem Blut aufgereinigt [136].
Als 76 AS-Protein mit zwei Cytein-AS in direkter Bindung gehört es der CC-Familie der
Zytokine an.
MCP-1 wird von einem breiten Spektrum an Zelltypen freigesetzt, darunter Zellen der
inflammatororischen Reaktion, der Tumorabwehr und Zellen der Atherosklerosebildung
[137]. Zu den Quellen gehören mononukleäre Blutzellen, Endothelzellen und Fibroblasten.
Die MCP-1 Produktion lässt sich durch eine Vielzahl anderer Zytokine induzieren, darunter
IL-1, TNFα, PDGF und GM-CSF. Auch mechanischer Scherstress ist in vitro ein potenter
Induktor von MCP-1 in humanen Endothelzellen [112] und führt zur verstärkten Adhäsion
von Monozyten an kultiviertes Endothel [132].
Nach ersten positiven Ergebnissen von lokaler MCP-1 Therapie zur Stimulation der
Arteriogenese im Kaninchen wurde der stark arteriogene Effekt dieses Zytokins in
zahlreichen weiteren Tiermodellen verifiziert: Auch in hyperlipidämischen WatanabeKaninchen waren die positiven Ergebnisse auf die kollaterale Konduktanz reproduzierbar,
ohne dass ein signifikanter Einfluss auf Serumlipide und Progression der systemischen
Atherosklerose festzustellen war [125].
Atheroskleroseparameter
machten
Die hohe Standardabweichung der evaluierten
jedoch
weitere
Experimente
nötig.
In
hypercholesterinämischen ApoE knock-out-Mäusen ist die arteriogene Potenz von MCP-1
zwar im Vergleich zum Wildtyp reduziert, aber noch eindeutig nachweisbar [123].
In
derselben Arbeit konnten jedoch auch erstmalig systemische Effekte und eine
Verschlechterung der Atherosklerose und Plaque-Stabilität als signifikante Nebenwirkung der
lokalen arteriogenen Therapie gezeigt werden, und es wurde deutlich, dass bei der Suche nach
klinisch anwendbaren arteriogenen Substanzen auch die potentiellen Nebenwirkung kritisch
betrachtet werden müssen.
Auch im Großtiermodell des Schweins ist in einer neuen, auf Ultraschallflussmessung
basierenden
Messanordnung
der
deutlich
positive
Effekt
von
MCP-1
auf
das
Kollateralarterienwachstum nachweisbar [129]. Interessanterweise reichte hier eine kurze
Behandlungsdauer von 2 Tagen aus, um einen vergleichbaren Effekt zu erzielen, wie er nach
zweiwöchiger Dauerinfusion erreicht wurde.
Trotz seiner starken arteriogenen Potenz verbietet das starke Nebenwirkungprofil momentan
die Anwendung von MCP-1 im Rahmen von klinischen Studien. Die arteriogene Potenz von
MCP-1 ist jedoch auch für das mechanistische Verständnis der Arteriogenese von Bedeutung.
Der deutlich positive Effekt dieser monozytenwirksamen Substanz spricht für die Bedeutung
von Monozyten/Makrophagen als Mediatoren der Arteriogenese [69].
Einleitung
17
MCP-1 wirkt als CC-Chemokin jedoch nicht ausschließlich auf Monozyten. Besonders die
chemotaktische Wirkung auf T-Lymphozyten ist prominent und zeigte sich in vitro in einigen
Versuchen sogar der lymphotaktischen Wirkung von Interleukin-8 überlegen [100]. Auch in
vivo spielt MCP-1 eine kritische Rolle in der durch T-Zellen vermittelten Infektabwehr [64].
Unter chronisch entzündlichen Bedingungen in Ratten kommt es auch auf neutrophilen
Granulozyten zu einer Expression der MCP-1-Rezeptoren CCR1 und CCR2 und zu einer
gerichteten Migration von Neutrophilen auf einen MCP-1 Stimulus [70]. Die arteriogene
Wirkung von MCP-1 ist somit also nicht beweisend für die alleinige Bedeutung von
Monozyten als essentielle Mediatoren der Arteriogenese. Besonders ein verstärkter, durch TLymphozyten vermittelter Effekt unter MCP-1 Behandlung könnte die Stimulation des
Kollateralarterienwachstums erklären.
In dieser Arbeit diente MCP-1 als Positivkontrolle zur Stimulation der Arteriogenese im
Kaninchenhinterlaufmodell.
1.6.2
Granulocyte-Monocyte Colony Stimulating Factor
Infiltrierende Monozyten sind entscheidende Mediatoren der Arteriogenese. Nach Freisetzung
aus dem Knochenmark zirkulieren sie für maximal 12-72 Stunden im Blutkreislauf. Nach der
Transmigration in das paravasale Bindegewebe von Blutgefäßen ist die durchschnittliche
Lebensspanne
dieser
Zellpopulation
jedoch
relativ
kurz
und
von
spezifischen
Wachstumsfaktoren abhänging [80]. Ohne den Einfluss antiapoptotischer Zytokine stirbt ein
Großteil der Zellen den physiologischen Zelltod (Apoptose).
Dies verhindert eine
unspezifische oder überschießende inflammatorische Reaktion einer Umgebung ohne
antiapoptotische Faktoren.
Walsh et al. schlagen vor, dass schon während der
transendothelialen Migration über eine fas-Ligand-Rezeptor-Bindung zwischen Endothel und
Monozyt die Apoptose induziert werden kann [101, 130].
Der Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) ist ein 22 kDa
Glykoprotein, welches das Wachstum, die Differenzierung und die Freisetzung von Zellen der
myeloischen Reihe aus dem Knochenmark stimuliert. [25] Außerhalb des Knochenmarks
fördert es als antiapototischer Faktor das Überleben von phagozytierenden Zellen [31]. Als
Peptid-Pharmazeutikum wird es in rekombinanter Form zur klinischen Therapie von
hämatologischen und onkologischen Krankheiten eingesetzt [1].
GM-CSF wird unter Scherstress in humanen Endothelzellen verstärkt exprimiert [73].
Buschmann et al. konnten zeigen, dass die exogene Applikation von GM-CSF in das
Einleitung
18
kollaterale Gefäßsystem die Arteriogenese signifikant stimuliert [12]. Die Kombination von
GM-CSF und MCP-1 blieb im Gegensatz zur Solotherapie beider Substanzen auch in einem
chronischen Verschlussmodell mit Therapiebeginn drei Wochen nach Ligatur der A.
femoralis noch wirksam. Diese Kombinationstherapie des monozyten-attraktiven Chemokins
MCP-1 mit dem antiapoptotischen Faktor GM-CSF erreicht nach vier Wochen 78% der
Konduktanz eines nichtokkludierten Hinterlaufs und ist der bisher wirksamste Ansatz zur
therapeutischen Stimulation der Arteriogenese.
Auch in einem neuen zerebralen Ischämiemodell der Ratte lässt sich das Wachstum von
Umgehungskreisläufen des Circulus Willisii durch GM-CSF stimulieren und impliziert so
eine mögliche Anwendung in der Schlaganfallprophylaxe [14].
Im Gegensatz zum ebenfalls stark arteriogenen MCP-1 haben CSFs einen eher günstigen
Einfluss auf die systemische Atherosklerose.
LDL-Plasmalevel werden unter GM-CSF-
Therapie unter anderem LDL-rezeptorabhängig reduziert [66], und GM-CSF verringert die
Anzahl arteriosklerotischer Läsionen in heriditär hyperlipidämischen Watanabe-Kaninchen
[111]. Dieses günstige Nebenwirkungsprofil zusammen mit der bestehenden Zulassung für
hämato-onkologische Indikationen machen GM-CSF zu einem bevorzugten Kandidaten für
die Erprobung in klinischen Studien zur arteriogenen Therapie.
1.6.3
Transforming Growth Factor-ß1
Die aktive Form des TGF-ß1 ist ein 25 kDa Homodimer der Transforming Growth Factor
Familie. Als 55 kDa Vorläuferform sezerniert, wird es durch Proteolyseschritte aktiviert und
von seinem Bindungsprotein freigesetzt [4].
In Tiermodellen der koronaren Herzkrankheit ist TGF-ß1 in der nichtinfarzierten Grenzregion
deutlich vermehrt [134]. Auch in der apoplektischen Penumbra im Gehirn des Menschen, der
noch vitalen Randzone des Infarktgebiets, ist die Expression von TGF-ß1 vermehrt
nachzuweisen [74].
Van Royen et al. zeigten, dass eine verstärkte TGF-ß1 – Expression nach arteriellem
Verschluss um proliferierende Kollateralarterien herum zu lokalisieren ist [124].
Immunhistologisch war TGF-ß1 sowohl in der extrazellulären Matrix als auch in
infiltrierenden Zellen nachzuweisen.
In einer Versuchsanordnung zur experimentellen
Stimulation des Kollateralarterienwachstums im Kaninchenhinterlauf wurde in derselben
Arbeit gezeigt, dass sich die Arteriogenese durch lokale Applikation von TGF-ß1 signifikant
Einleitung
19
stimulieren lässt. Dieser Effekt ist vermutlich wiederum von infiltrierenden Zellen vermittelt:
TGF-ß1 aktiviert Monozyten und fördert die monozytäre Adhäsion über eine verstärkte
Expression des leukozytären Integrins Mac-1 [124].
Der Einfluss von TGF-ß1 auf die Angiogenese wird kontrovers diskutiert [91]. Neuere
Ergebnisse sprechen gegen einen signifikanten pro-angiogenen Effekt in vivo [124].
Auch die Bedeutung von TGF-ß1 für die Atheroskleroseentwicklung ist nicht eindeutig
geklärt. Trotz seiner Eigenschaft als inflammatorisches Zytokin scheint TGF-ß1 wohl eher
anti-atherogene Effekte zu haben: Serumkonzentrationen von TGF-ß1 sind in Patienten mit
fortgeschrittener Atherosklerose reduziert [48].
Diese günstig erscheinenden Wirkungsprofile auf Angiogenese und Atherosklerose machen
TGF-ß1 als möglichen zukünftigen Kandidaten für klinische Studien interessant.
1.7 Granulozyten- und Lymphozytenspezifische Zytokine
Die Wirkprofile der vorgestellten arteriogenen Substanzen MCP-1, GM-CSF und TGF-ß1
sind keineswegs auf Zellen der Monozyten/Makrophagenreihe beschränkt, bzw. sie erstrecken
sich sogar auf die gesamte myeloische Zellpopulation (GM-CSF). Sie sind im engeren Sinne
also nicht zellspezifisch wirksam.
Arteriogene Zytokine zeigen jedoch eine gewisse
Wirkungspräferenz für Monozyten in vitro und in vivo.
Auch die nichtmonozytären Zellreihen (Granulozyten, Lymphozyten) haben ihr spezifisch
wirksames Zytokinprofil.
1.7.1
Interleukin-8
In den frühen 1980er Jahren wurden verschiedene Zytokine mit granulozytenattraktiver
Wirkung isoliert, und unter dem Namen Monocyte Derived Neutrophil Chemotactic Factor
(MDNDF), Granulocyte Chemotactic Peptide (GCP) sowie Neutrophil Activating Protein-1
veröffentlicht. 1989 erkannte Larsen, dass es sich bei all diesen neuen Zytokinen und dem TLymphocyte Chemotactic Factor (TCF) um ein und dieselbe Substanz handelt.
Die
Benennung des Moleküls wurde zu Interleukin-8 vereinheitlicht [137].
Interleukin-8 wird als 99 AS-Precursor-Molekül synthetisiert und proteolytisch zur 8 KDa 72
AS – Form prozessiert und sezerniert.
Aminosäuren bindet es an Heparin.
Aufgrund seines hohen Gehalts an basischen
Einleitung
20
Interleukin-8 ist Ligand der heptahelikalen Chemokin-Rezeptoren CXCR-1 und CXCR-2.
Während CXCR-2 ein weites Spektrum anderer Liganden bindet (Groα, Groβ, NAP-2), ist der
CXCR-1 hochselektiv für Interleukin-8 sensibel. Ein neutrophiler Granulozyt präsentiert über
20000 IL-8 Bindungsstellen pro Zelle, T-Lymphozyten durchschnittlich nur 300.
Eine Vielzahl von Zelltypen ist zur Freisetzung von IL-8 in der Lage, darunter Monozyten,
Endothelzellen, Fibroblasten und T-Lymphozten. Die quantitative Expression unterscheidet
sich in den Zelltypen (hohe Expressionsraten in Endothelzellen, geringere in Monozyten und
Fibroblasten) und kann unter anderem durch TNFα, LPS, IL-2, IL-3, IL-6 und IFNγ induziert
werden. TGFβ, IL-4, IL-10 und Immunmodulatoren wie Cyclosporin A supprimieren die IL8 Expression.
Als pluripotentes Zytokin wirkt IL-8 auf unterschiedliche Zelltypen.
Besonders auf
neutrophile Granulozyten ist ein vielfältiges Wirkspektrum beschrieben: Neben Chemotaxis
[99], der Sekretion lysosomaler Enzyme [119] und zytosolischen Ca++ Freisetzung [119]
fördert es auch die Expression von Adhäsionsmolekülen der Integrinfamilie [32]. Auf TLymphozyten ist besonders die chemotaktische Wirkung prominent [75]. In vitro wurde auch
eine verstärkte Adhäsion von Monozyten an endotheliale Zellschichten beschrieben [45], ob
dieser Effekt jedoch auch im Organismus eine funktionelle Bedeutung hat, ist unklar.
Chemotaktische Effekte und Aktivierung von Monozyten in vivo sind für IL-8 nicht
beschrieben. Auch nicht-leukozytäre Zellen werden von IL-8 beeinflusst. So werden u.a.
Keratinozyten zur Proliferation angeregt und glatte Bronchialmuskelzellen kontrahieren sich
unter IL-8 Stimulation [137].
Zusammenfassend lässt sich IL-8 als neutrophilen- und lymphozytenchemoattraktive
Substanz ohne signifikante in vivo-Effekte auf Monozyten beschreiben.
1.7.2
Neutrophil Activating Protein-2
Für das dem IL-8 strukturell verwandte Zytokin NAP-2 wird eine wichtige Bedeutung in den
frühesten
Stadien
der
inflammatorischen
Reaktion
angenommen,
da
es
durch
neutrophilenvermittelte Proteolyse sehr schnell aus Vorläuferformen freigesetzt werden kann.
Der wichtigste Vorläufer ist das conntective tissue-activating peptide III (CTAP-III) welches
von aktivierten Thrombozyten freigesetzt und nach Proteolyse von 15 N-terminalen AS zum
aktiven 70 AS NAP-2 konvertiert wird. IL-8 und GROα hingegen können erst nach erfolgter
Transkription und Translation vermehrt sezerniert werden und ermöglichen keine sofortige
Reaktion auf inflammatorische Stimuli [79]. Wie IL-8 bindet NAP-2 an den CXCR-1 und
Einleitung
21
CXCR-2, wobei NAP-2 für den CXCR-1 eine 100fach geringe Bindungsaffinität als IL-8
aufweist.
Diese unterschiedliche Rezeptorpräferenz wird auch in Unterschieden der
aktivierten Signaltransduktionskaskaden deutlich: Im Gegensatz zu IL-8 führt die Stimulation
von Granulozyten mit NAP-2 nicht zur Aktivation der Phospholipase D[76]. Wie Interleukin8 zeigt NAP-2 jedoch eine potente aktivierende Wirkung auf humane Granulozyten: Es
induziert zytosolische Ca++-Freisetzung, Exozytose und hat einen starken chemotaktischen
Effekt [131], äquipotent zu IL-8 [79]. Obwohl die Rezeptoren CXCR-1 und CXCR-2 auf
einer Vielzahl von Zelltypen einschließlich Neutrophilen, T-Lymphozyten, Monozyten,
Fibroblasten und sogar Neuronen exprimiert werden [50, 61, 131], ist NAP-2 in vivo
prädominant auf neutrophile Granulozyten wirksam [79], und signifikante Effekte auf
Monozyten und Lymphozyten sind nicht beschrieben.
1.7.3
Lymphotactin
Lymphotactin (Ltn) ist ein relativ neu entdecktes 10kDa Protein aus 92 Aminosäuren.
Ungewöhnlicherweise fehlen ihm die typischen Cysteinmotive der CC- oder CXCChemokinfamilien. Auch die abweichende chromosomale Lokalisation auf Chromosom 1
spricht für die Klassifikation von Lymphotaktin als bisher einziges Mitglied einer neuen CChemokinfamilie (CXC-Chemokine: Chromosom 4, CC-Chemokine: Chromosom 17) [71].
Es bindet an den spezifischen G-Protein gekoppelten serpentinen Rezeptor XCR-1 [61]. Auch
funktionell unterscheidet sich Lymphotactin von anderen Chemokinen:
Es zeigt eine
selektive chemotaktische Wirkung auf Lymphozyten, ohne signifikanten Effekt auf
Monozyten.
konstellation.
Lymphotactin ist das erste bekannte Zytokin mit dieser SelektivitätsNeben T-Lymphozyten transmigrieren auch NK-Zellen gegen einen
Lymphotactingradienten und intraperitoneale Injektion von Ltn führt zur Akkumulation von
T-Lymphozyten und NK-Zellen in der Maus.
Nachdem Lymphotactin primär als rein
lymphozytenwirksame Substanz beschrieben wurde, zeigen neuere Ergebnisse, dass auch
neutrophile Granulozyten den XCR-1 exprimieren und gerichtet chemotaktisch auf
Lymphotactin reagieren [63].
Inwiefern dies unter physiologischen Bedingungen von
Bedeutung ist, ist bisher noch unbekannt. Auch diese Studie bestätigt die fehlende Wirkung
auf Monozyten bei starkem lymphotaktischem Effekt.
Neben dieser bisher unbekannten Spezifitätskonstellation ist auch die fehlende Affinität für
den Duffy-Antigenrezeptor ungewöhnlich, der viele Zytokine unspezifisch bindet [52].
Einleitung
22
Aktivierte Subpopulationen von CD8+ und CD4+ T-Zellen [71] sowie NK-Zellen sind die
relevanten Quellen für Lymphotactin in vivo. B-Zelllinien exprimieren keine detektierbaren
Mengen von Lymphotactin. Aufgrund seines spezifischen Wirkprofils ist Lymphotactin ein
wichtiges Molekül in der Regulation der Lymphozytenantwort auf inflammatorische Reize
und in experimentellen Ansätzen gut zur selektiven Chemoattraktion von Lymphozyten und
NK-Zellen geeignet.
1.8 Adhäsionsmoleküle in der Arteriogenese
Die Transmigration von zirkulierenden Leukozyten aus dem Blutstrom in das paravasale
Interstitium vom wachsenden Blutgefäßen ist von der Interaktion leukozytärer und
endothelialer zellulärer Adhäsionsmoleküle (cell adhesion molecules, CAMs) abhängig.
Signalkaskaden kontrollieren die Expression und Aktivierung dieser Moleküle und die
spezifische Interaktion von Rezeptor und Ligand ist von großer Bedeutung für die
immunologische Abwehr und inflammatorische Prozessse. Auch die Leukozyteninfiltration
in der Arteriogenese wird von Adhäsionsmolekülen vermittelt.
leukozytäre
Expressionsprofil
von
CAMs
erlaubt
auch
Das signalabhängige
Rückschlüsse
auf
den
Aktivationszustand der untersuchten Zellpopulation, und die zelluläre Detektion von
Adhäsionsmolekülen ist ein gängiges Verfahren in der Durchflusszytometrie.
Die wichtigsten bisher charakterisierten Adhäsionsmoleküle werden in einer von vier großen
Proteinfamilien klassifiziert:
den Selektinen, den Integrinen, den Cadherinen und der
Immunglobulin-Superfamilie.
In einem sequentiellen Prozess sind oft Vertreter mehrerer Molekülgruppen am
Transmigrationsprozess beteiligt.
Einleitung
23
Abbildung 2
Schematische Darstellung der Leukozytenadhäsion an Endothelzellen
Nach dem Selektin-vermittelten Rolling kommt es zur festen Adhäsion durch Mac-1-ICAM-1 Interaktion
(Übernommen von der Internetseite www.rndsystems.com, R&D Systmes Inc., Minneapolis, USA unter
Belassung der englischen Beschriftung).
1.8.1
Selektine
Die Hauptvertreter dieser CAM-Gruppe, L-Selektin, P-Selektin vermitteln die initiale
Interaktion von Thrombozyten, Leukozyten und aktiviertem Endothel. Die Verbindung ist
noch inkonstant und führt zu einer charakteristischen rollenden Bewegung von Leukozyten
am Endothel (engl. „Rolling“). E-Selektin ist vermutlich in die ersten Schritte der folgenden
festen Adhäsion involviert.
Die Selektine teilen 40-60% Sequenzhomologie und eine
gemeinsame Grundstruktur aus einer NH2-terminalen C-Typ Lectinartigen Bindungsdomäne,
einer EGF-artigen Domäne, einer variablen Anzahl von Consensusrepeats, einer
transmembranären Region und einer kurzen zytoplamatischen Domäne [18].
binden an ein komplexes Ligandenspektrum.
Selektine
Sie erkennen sowohl Protein als auch
Carbohydrat-Epitope von Glykoproteinen und Glykolipiden. E-Selektin (endothelial selectin,
CD62E) bindet an sialylat-fucosylat Kohlenhydratmotive auf Leukozyten inklusive dem
sialyl-Lewisantigen X, L-Selektin und CD11/CD18. P-Selektin (platelet-selectin, CD62P)
bindet wie E-Selektin an die Lewis X und Lewis A Trisaccharide sowie u.a. an sulfatierte
Glycolipide und Polysaccharide wie Heparin. Syalil-Lewis X ist auch das funktionelle Epitop
des
P-Selektin-Glycoprotein-Liganden
1
(PSGL-1)
auf
Monozyten,
Neutrophilen,
Lymphozyten und myeloischen Zellen. L-Selektin bindet ebenfalls an SLex und SLea. Die
wichtigen Liganden
GlyCAM-1 und MadCAM-1 werden im Wesentlichen auf
Einleitung
Endothelzellen in lymphatischem Gewebe exprimiert.
24
Interessanterweise wurde der L-
Selektinligand sgp90 als der Stammzellmarker CD34 identifiziert [5].
Experimente in FT4/7 -/- Mäusen mit gestörter Selektininteraktion zeigen keine signifikante
Reduktion der Arteriogenese nach Femoralarterienligatur [60]. Diese Tiere mit genetischem
Defekt der α(1,3)Fucosytransferasen 4 und 7 zeigen ein Fehlen des P und E sialyl-Lewis XOligosaccharids und eine stark reduzierte L-Selektin-Bindungsaktivität.
Selektinvermittelte Mechanismen scheinen daher für das Kollateralarterienwachstum keine
essentielle Rolle zu spielen.
1.8.2
Integrine
Intergrine sind nicht-kovalent verbundene Heterodimere aus einer α und einer β Kette [18].
15 α und 8 β Untereinheiten wurden bisher identifiziert, deren Kombination in einer Vielzahl
von Integrinrezeptoren resultiert. Die Dimerisation ist jedoch begrenzt, in den meisten Fällen
bildet eine β-Untereinheit mit mehreren α-Untereinheiten eine Integrin-Subfamilie.
Es
können jedoch auch einzelne α-Ketten mit verschiedenen β-Ketten assoziiert sein (z.B. die
αv-Kette der Vitronectin-Rezeptors mit einer β1-, β5-, β6- oder β8-Kette).
Einleitung
Tabelle 1
α-Kette
β-Kette
anderer Name
α1
β1
VLA-1, CD49a/CD29
α2
VLA-2, CD49b/CD29
α3
VLA-3, CD49c/CD29
α4
VLA-4, CD49d/CD29
α5
VLA-5, CD49e/CD29
α6
VLA-6, CD49f/CD29
αL
β2
Mac-1, CD11b/CD18
αX
p150/55, CD11c/CD18
β3
αV
Auswahl
wichtiger
Integrin-Dimere,
modifiziert nach Gonzalez-Amaro [46]
LFA-1, CD11a/CD18
αM
αIIB
25
GPIIb/IIIa, CD41/CD61
Vitronectin-R, CD51/61
α4
β7
CD49d
Nur für fünf Mitglieder dieser großen Adhäsionsmolekülgruppe wurde eine entscheidende
Bedeutung für die Leukozytenadhäsion an das Endothel nachgewiesen: Die β2-Integrine
CD11a/CD18 (LFA-1), CD11b/CD18 (Mac-1), CD11c/CD18 (p150,95), sowie in geringerem
Maße
das
β1-Integrin
VLA-4
(α4β1)
und
α4β7.
LFA-1
wird
von
allen
Leukozytenpopulationen exprimiert, während Mac-1 in signifikanter Quantität vor allem auf
Monozyten und Makrophagen, neutrophilen Granulozyten und natürlichen Killerzellen
detektiert werden kann. p150/95 kommt in geringem Maße auf allen Zellen der myeloischen
Reihe vor, spielt jedoch keine entscheidende Rolle bei der Adhäsion an die Gefäßwand. Auch
Lymphozyten exprimieren vor allem LFA-1, während p150,95 kaum funktionelle Bedeutung
hat. Die relative Expression der ß2-Integrine ist jedoch auch vom Aktivationszustand und
Differenzierungsgrad der Zelle abhängig. Auf Monozyten und Granulozyten dominieren
LFA-1 und Mac-1 die Zell-Zellinteraktion auf Integrinebene [2]. Im Gegensatz zu LFA-1
liegt Mac-1 in ruhenden Zellen auch intrazellulär in Speichervesikeln vor und kann so auf
aktivierende Stimuli minutenschnell vermehrt membranständig präsentiert werden [18]. Die
genaue relative Bedeutung der einzelnen Integrine an verschiedenen Adhäsionsprozessen in
physiologischer Funktion ist noch nicht definitiv geklärt [67].
Einleitung
1.8.3
Die
26
Immunglobulinartige Adhäsionsmoleküle
Adhäsionsmoleküle
glykosylierte
der
Immunglobulin-Superfamilie
Transmembranproteine.
Gemeinsam
ist
sind
Ca++
ihnen
unabhängige
eine
Ig-artige
Extrazellulärdomäne mit Disulfidbrücken zwischen Cysteinsequenzen, eine transmembranäre
Kette und eine Intrazellulärdomäne, welche mit dem Zytoskelett interagieren kann [18]. Ihre
Liganden
sind
Integrine
oder
Mitglieder
der
eigenen
Superfamilie.
Für
die
Leukozytenadhäsion sind vor allem die interzellulären CAMs (ICAM-1 und -2), sowie das
vascular CAM (VCAM-1) und das platelet-endothelial CAM (PECAM-1) von Bedeutung.
Die N-terminale Domäne von ICAM-1 (CD54) ist die primäre Bindungsstelle des Integrins
LFA-1, während Mac-1 an eine zweite Position in der dritten Ig-artigen Domäne bindet [33].
ICAM-1 wird als induzierbares Antigen von Endothelzellen, Epithel und Leukozyten
exprimiert. Als einziges CAM der Immunglobulinsuperfamilie wurde für ICAM-1 das SSRE
in der Promotorregion nachgewiesen [85, 87]. Neben Scherstress [21] vermögen vor allem
verschiedene Zytokine (MCP-1, TNF-α) die ICAM-1 Expression auf dem Endothel zu
steigern. Neue Ergebnisse legen eine entscheidende Rolle von ICAM-1 für die Leukozytentransmigration in der Arteriogenese nahe: ICAM-1 knock-out-Mäuse zeigen eine reduzierte
Arteriogenese nach Femoralarterienligatur im Vergleich zu Wildtyp-Tieren.
Auch die
Blockade von ICAM-1 mittels eines monoklonalen Antikörpers führt zu einem geringeren
Kollateralarterienwachsum im Kaninchenhinterlauf [62].
ICAM-2 besitzt nur zwei Ig-Extrazellulärdomänen, welche 34% Homologie mit der LFA-1
Bindungsstelle des ICAM-1 aufweisen.
Die Mac-1 Bindungsdomäne der dritten Extra-
zellulärdomäne fehlt. ICAM-2 ist somit der zweite endotheliale Ligand für LFA-1, ist jedoch
nicht an der Mac-1 vermittelten Adhäsion beteiligt.
Auch VCAM-1 ist ein endothelialer Rezeptor für Leukozytenadhäsion und liegt als spliceVariante mit 6 oder 7 Ig-artigen Domänen vor. Seine leukozytären Liganden oder CoRezeptoren sind die α4β1 (oder VLA-4) und α4β7 Integrine. Bei einer geringen Expression
auf ruhendem Endothel, kommt es unter Bedingungen erhöhten Scherstresses zu einer stark
vermehrten Präsentation an der luminalen Zellmembran und einer entscheidenden Bedeutung
für die Adhäsion und Extravasation von Leukozyten, welche die relevanten Integrinliganden
exprimieren (Lymphozyten, Monozyten, eosinophile und basophile Granulozyten).
PECAM-1 (CD31) wird in hohem Maße an den Interzellulärjunktionen von benachbarten
Endothelzellen exprimiert und kommt auch auf Thrombozyten, Monozyten, Neutrophilen,
NK-Zellen und T-Zellpopulationen vor [84].
PECAM-1 dient sowohl der homophilen
Einleitung
27
Adhäsion (PECAM-1 einer Zelle reagiert mit demselben Molekül einer anderen Zelle) als
auch der heterophilen Adhäsion mit Molekülen der Integrin-Familie, besonders αvβ3
(CD51/CD61). Die homophile Bindung dient auch der Signalvermittlung: Das cross-linking
von mehreren PECAM-1 Molekülen auf Leukozyten führt zur verstärkten Präsentation von
CD11/CD18-Integrinen.
Die funktionelle Bedeutung von weiteren Ig-CAMs wie dem
MAdCAM-1 für die Transmigration von Leukozyten ist noch weitgehend unklar.
1.8.4
Cadherine
Die Cadherinfamilie umfasst kalziumabhängige Adhäsionsmoleküle, die besonders in der
embryonalen Gewebeorganisation von Bedeutung sind. Dazu gehören sowohl die klassischen
Cadherine als auch strukturell verwandte Adhäsionsmoleküle. Die wichtigsten Vertreter sind
N-Cadherin (Neural-Cadherin), P-Cadherin (Platelet-Cadherin) und E-Cadherin (EpithelialCadherin). Nach Bindung von Ca++ gewinnt die extrazelluläre Domäne an struktureller
Stabilität.
Die Transmembran- und die Intrazellulärdomäne sind hochkonserviert und
interagieren mit zytoplasmatischen Molekülen wie den Cateninen.
Extrazellulär binden
Cadherine homotypisch an identische Proteine an Nachbarzellen und teils an andere
Mitglieder
der
Cadherinfamilie
[92].
Sie
sind
wichtige
Elemente
Interzellulärverbindungen wie den Zonulae adherentes zwischen Endothelzellen.
von
In der
Interaktion von Leukozyten mit dem Gefäßendothel spielen sie keine entscheidende Rolle
[116].
Zielsetzung
28
2 Zielsetzung
___________________________________________________________________________
Diese Studie hat sich zum Ziel gesetzt, die Bedeutung der einzelnen LeukozytenSubpopulationen während der Arteriogenese zu untersuchen und so zur Beschreibung
möglicher Zielstrukturen für eine zukünftige arteriogene Therapie beizutragen.
Bisherige
Ergebnisse
zur
therapeutischen
Stimulation
der
Arteriogenese
mittels
leukotaktischer Zytokine legen eine besondere Bedeutung von infiltrierenden Monozyten für
das Kollateralarterienwachstum nahe. Die bisher verwendeten arteriogenen Substanzen sind
jedoch keinesfalls monozytenspezifisch wirksam sondern haben auch signifikante Effekte auf
neutrophile Granulozyten und T-Lymphozyten.
Für den Gefäßwachstumsprozess der Angiogenese wurden infiltrierende T-Lymphozyten als
kritische Quelle von Wachstumsfaktoren beschrieben, und auch neutrophilen Granulozyten
wird eine wichtige Bedeutung für die kapilläre Proliferation zugemessen. Die Bedeutung
dieser nicht-monozytären Zellpopulationen für die Arteriogenese ist jedoch unklar.
Ziel dieser Arbeit war, die Beteiligung von neutrophilen Granulozyten und T-Lymphozyten
an der Arteriogenese zu untersuchen. In einem Arteriogenesemodell in weißen Neuseeländerkaninchen sollte die arteriogene Potenz spezifisch leukotaktischer Zytokine evaluiert werden.
Dazu sollten erstens die Effekte der einzelnen Zytokine auf Leukozytenaktivation und die
leukozytären Adhäsionsmoleküle in humanem und Kaninchenblut betrachtet werden, um die
Vergleichbarkeit der selektiven Wirkung zwischen den Spezies zu verifizieren.
Zweitens waren die paravasalen Leukozytenpopulationen in der spontanen Arteriogenese zu
spezifizieren und die selektive chemotaktische Wirkung der applizierten Substanzen in vivo
immunhistologisch zu quantifizieren.
Drittens war als wichtigstes Endergebnis die kollaterale Konduktanz als Goldstandardparameter
der
Arteriogenese
in
Abhängigkeit
von
der
selektiv
leukotaktischen
Zytokinbehandlung zu bestimmen.
Viertens sollte die angiographische Darstellung des kollateralen Gefäßsystems den Verlauf
der Arteriogenese illustrieren.
Material und Methoden
29
3 Material und Methoden
___________________________________________________________________________
3.1 Material
3.1.1
Versuchstiere
Weiße Neuseeländerkaninchen (New Zealand White Rabbit), Stamm Crl: KBL(NZW)BR
Ursprünglich von den Kitayama Labs. in Nagano, Japan, gezüchtete Versuchstierrasse.
Die zwischen 2,5 bis 3 kg schweren Tiere waren ausschließlich weiblich und zwischen 11 und
13 Wochen alt.
Bezug über
3.1.2
Charles River Deutschland, Sulzfeld
Operationsmaterial
Mikrochirurgischer Bestecksatz
Aesculap, Tuttlingen
Hautdesinfiziens Cutasept G
Nahtmaterial Mersilene 3-0
Bode Chemie, Hamburg
Johnson&Johnson, St-Stevens-Woluwe, Belgien
Venenpunktionsbesteck Butterfly-22G
Abbot, Sligo, Irland
Venenverweilkatheter Braunüle 22G
Braun, Melsungen
Kanülen Sterican 20G – 26 G
Braun, Melsungen
Trachealtubus 2,5mmID 3,7mmOD
3.1.3
SIMS Portex, Kent, UK
Medikamente
Xylazin Rompun 2%
Ketamin 10%
Bayer, Leverkusen
Essex Pharma, München
Buprenorphin-HCL 0,324mg Temgesic Injektionslösung
Roche, Basel, Schweiz
Heparin Liquemin N25000
Roche, Basel, Schweiz
Propofol Disoprivan 2% Emulsion i.v.
Physiologische Natriumchloridlösung 0,9%
Adenosinmonophosphat
AstraZeneca, Gloucestershire, UK
Fresenius, Bad Homburg
Sigma, St.Louis, Missouri, USA
Material und Methoden
3.1.4
30
Implantierbare Pumpen
Mikropumpen Alzet 2ML1
AlzaCorporation, Palo Alto, USA
Die verwendeten osmotischen Miniaturpumpen haben ein Fassungsvermögen von 2 ml,
welches über einen Zeitraum von 7 Tagen gefördert wird (Förderrate: 10±1,5 µl/h). Durch
osmotische Quellung des Hüllkörpers bei Aufnahme von interstitieller Flüssigkeit im
Organismus wird das Pumpenlumen komprimiert und der Inhalt über ein Kathetersystem
gefördert.
3.1.5
Mikrosphärenanaylse
Mikrosphären FluoroSpheres Kit No.2
Molecular Probes, Eugene, USA
Das speziell zur Blutflussmessung kontruierte Mikrosphärenkit enthält 7 verschieden
markierte
Mikrosphären
von
15µm
Durchmesser
in
den
Farben
(Exitations-
/Emmisionsmaximum in nm) blue (365/415), crimson (625/645), red (580/605), scarlet
(645/680), orange (540/560), yellow-green (495/505) und blue-green (430/465) aus
Polysteren.
3.1.6
Kontrastmittelherstellung
Wismutbasiertes Kontrastmittel für hochauflösende post-mortem Angiographien nach Fulton:
Biron B-50
Merck, Darmstadt
Salzsäure, 32%
Merck, Darmstadt
Gelatine aus Schweinehaut
50ml Kunstoffbehälter Falcons
Fluka-Chemie, Buchs, Schweiz
BectonDickinson, Franklin Lakes, USA
150g Biron B-50 in 200ml dest. Wasser lösen. Langsam rühren, Salzsäure hinzugeben bis
Lösung klar wird. 1/6 der der Biron-Lösung in 5 l Krug mit Leitungswasser geben, mind. 30
min stehen lassen. Überstand abschütten, Bodensatz in Erlenmeyerkolben geben. Mit den
weiteren 5/6 wiederholen. Erlenmeyerkolben über Nacht stehenlassen. Überstand absaugen.
Rest aufschütteln und auf acht 50ml Behälter (Falcons) verteilen.
10 min bei 65g
zentrifugieren. Überstand absaugen. 150ml Gelatinepulver langsam in 200ml kochendem
dest. Wasser auflösen. Konstrastmittel mit gleichen Teilen auf 50 ml auffüllen. Bei 4º
Celsius lagern. Vor Anwendung in heißem Wasserbad verflüssigen.
Material und Methoden
3.1.7
31
Standardpuffer und Medien
PBS (phosphatgepufferte Salzlösung, pH 7,4)
80g NaCl
Merck, Darmstadt
4g KCl
Merck, Darmstadt
14,4g Na2HPO4
Merck, Darmstadt
2,4g KH2PO4
Merck, Darmstadt
PBS mit Milchpulver
1g Milchpulver in 100ml PBS
Milchpulver Skim Milk Powder
Fluka, Seelze
Tween-20-PBS
100µl Tween 20 in PBS lösen
Polysorbate20 (Tween 20)
Gerbu Biotech. Gailberg
Zitratpuffer
1.05g Zitronensäure in 500ml dest. Wasser lösen,
mit 10N NaOH auf pH 6.0 einstellen. Bei Raumtemp. lagern.
Zitronensäure Citrat Acid Anhydrous
Sigma, St.Louis, Missouri, USA
Natronlauge NaOH 10N
Sigma, St.Louis, Missouri, USA
Lysepuffer zur Mikrosphärenfreisetzung
SDS-Stammlösung: 1% SDS, 0,5% Natrium-Azid, 0,8% Tween-80
in 50mM pH8.0 Tris-Puffer
1mg/ml Proteinase K in SDS-Stammlösung lösen
SDS
Sigma, St.Louis, Missouri, USA
Natrium-Azid
Sigma, St.Louis, Missouri, USA
Polysorbate20 (Tween 20)
Proteinase K
3.1.8
Gerbu Biotech. Gailberg
Roche, Basel, Schweiz
Histologische Reagenzien
Gewebeeinbettmedium Tissue Tek
Sakura, Zoeterwoude, Niederlande
Material und Methoden
2-Methylbutan
Eosin
32
Roth, Karlsruhe
Thermo Skandan, Pittsburgh, USA
Hämatoxilin
Sigma, St.Louis, Missouri, USA
DNA-Färbung Hoechst 33342
Molecular Probes, Oregon, USA
Aceton 100%
Merck, Darmstadt
Ethanol 100%
Merck, Darmstadt
Formalin 4%
Merck, Darmstadt
Polyoxyethylenesorbitan (Tween 20)
Xylol
Fluka, Seelze
Einbettmedium Fluoromount-GTM
Einbettmedium Entellan
3.1.9
Sigma, St.Louis, Missouri, USA
SouthernBiotech.,Birmingham, USA
Merck, Darmstadt
Reagenzien zur Durchflusszytometrie
Whole Blood Lysing Reag.
Beckman Coulter Inc. Miami, USA
Zytometrielösung Isoton
Beckman Coulter Inc. Miami, USA
Lipopolysaccharid (LPS) L4391
Sigma, St.Louis, Missouri, USA
3.1.10 Verbrauchsmaterial
Deckgläser
Eppendorf-Gefäße, 1,5ml
Kork
Meßzylinder, Meßbecher
Objektträger Superfrost plus
Pipettenspitzen
Rührspatel
Blutentnahmeset S-Monovette 4ml AH
Röntgenfilm Scorpix Laser 2B
Merck, Darmstadt
Roth, Karlsruhe
Zitt Thoma, Freiburg
Roth, Karlsruhe
MJResearch,Waltham,USA
Roth, Karlsruhe
Hellma, Müllheim
Sarstedt, Nümbrecht
Agfa-Gevaert, Mortsel, Belgium
Material und Methoden
33
3.1.11 Antikörper
3.1.11.1
Zur Durchflusszytometrie
a) Monoclonal Mouse anti-Human CD11b: FITC, Clone 2LPM19c, gegen die Untereinheit
CD11b des Integrins Mac-1 gerichtet
Dako, Glostrup, Dänemark
b) Mouse anti-Human CD11a: FITC, Clone MEM-25, gegen die αUntereinheit CD11a des
Integrins LFA-1 gerichtet
Caltag Lab., Burlingame, USA
c) Rat anti-Human CD18: FITC, Clone YFC118.3, gegen die ß-Untereinheit des Integrins
Mac-1 gerichtet
Biozol, Eching, BRD
d) Monoclonal Mouse anti-Rabbit CD11b: FITC, Clone 198, gegen die αUntereinheit
CD11b des Integrins Mac-1 des Kaninchens gerichtet
Research Diag., Flanders, USA
e) Mouse anti-Human CD14: RPE, Clone TUK4 Dako, gegen den Scavenger-Rezeptor auf
humanen Monozyten gerichtet, Kreuzreaktion zum Kaninchen
3.1.11.2
Glostrup, Dänemark
Zur Histologie
Primärantikörper
a) Monoclonal Anti-α Smooth Muscle Actin Clone 1A4 Mouse Ascites Fluid, gegen
Zytoskelettstrukturen von glatter Gefäßmuskulatur
Sigma-Aldrich, Saint Louis, USA
b) Monoclonal Mouse anti-Human CD68, Macrophage, Clone EBM11, spezifischer Marker
für humane Makrophagen, Kreuzreaktion zum Kaninchen
Dako, Glostrup, Dänemark
c) Mouse anti-Rabbit CD11b, Clone 198, gegen die αUntereinheit des Integrins Mac-1 auf
Kaninchen gerichtet
Serotec, Oxford, UK
d) Mouse anti-Rabbit T-Lymphocytes, Clone KEN-5, gegen T-Lymphozyten des
Kaninchens gerichtet
Serotec, Oxford, UK
e) Mouse anti-Rat Ki67, Clone MIB-5, gegen den Proliferationsmarker Ki67 der Ratte
gerichtet, Kreuzreaktion zum Kaninchen
Dako, Glostrup, Dänemark
Sekundärantikörper
goat anti-mouse IgG (H+L) – Cy3 konjugiert
PA43002
amersham biosciences, Uppsalla, Schweden
Material und Methoden
34
3.1.12 Zytokine
Human MCP-1 (MCAF), Lot 086317,
Peprotech, Rocky Hill, USA
Human NAP-2, Lot 8711
Peprotech, Rocky Hill, USA
Human IL-8 (77a.a.) Lot 016182
Peprotech, Rocky Hill, USA
Human Lymphotactin, Lot 0654462
Peprotech, Rocky Hill, USA
3.1.13 Geräte
Beatmungsgerät Servo 900C
Siemens, München
Rollerpumpe S3 Doppelpumpe
Stöckert, München
Wärmeaustauscher
002-8936
Haake, Karlsruhe
Infusionspumpe Perfusor
Braun, Melsungen
Aspirationspumpe
Braun, Melsungen
Druckabnehmer Statham P32DC
Spectramed, Oxnard, USA
Ultraschall-Flusssonden Flowprobe 2
TranssonicSystems, Ithaca, USA
Flussdetektor small animal flow meter T206
TranssonicSystems, Ithaca, USA
Datenaufzeichnung Powerlab
ADInstruments, Spechbach
Durchflusszytometer Epics-XL
Beckman Coulter Inc. Miami, USA
Kryotom Leica CM 1900-Kryostat
Leica, Wetzlar
Mikroskop Leica DM RXE
Leica, Wetzlar
Vortexer MS2-Minishaker:
IKA, Staufen
Röntgenapperat bucky diagnost TH
Phillips Electronics, Amsterdam, Niederlande
3.1.14 Software
Mikroskopische Bildverarbeitung Qfluoro Software
Statistikprogramm SigmaStat 2.03
Leica, Wetzlar
SPSS, Chicago, USA
Material und Methoden
35
3.2 Methoden
3.2.1
Behandlung der Versuchstiere
Diese Studie bediente sich einer modifizierten Version des von Hoefer et. al. etablierten
Modells zur in vivo-Perfusionsmessung im Kaninchenhinterlauf [59].
3.2.1.1
Genehmigung
Dieser tierexperimentelle Teil der Studie wurde gemäß § 8 und § 5 des Deutschen
Tierschutzgesetztes von der zuständigen Komission des Regierungspräsidiums Freiburg
genehmigt und entsprach den Vorschriften des Guide for the Care and Use of Laboratory
Animals (veröffentlicht von US National Institutes of Health, Publication No.85-23,1996).
3.2.1.2
Versuchstiere
In der Literatur ist das weiße Neuseeländerkaninchen als geeignetes Versuchstier zur
Evaluation der Arteriogenese beschrieben. In Studien unserer Arbeitsgruppe zeigte es eine
mit hämodynamischen Messmethoden gut erfassbare arteriogene Reaktion auf Gefäßligatur
im Hinterlauf [59]
Diese Studie wurde an 60 Kaninchen der Rasse New Zealand White Rabbit durchgeführt. Die
Tiere waren durchschnittlich 11 bis 13 Wochen alt, wogen im Durchschnitt 2,5 bis 3,5 kg
und wurden alle vom selben Züchter bezogen.
3.2.1.3
Versuchsumgebung
Die operative Instrumentierung der Versuchstiere wurde in den der Zentralen Klinischen
Forschung
der
Universitätsklinik
Freiburg
angegliederten
tierexperimentellen
Operationsräumen durchgeführt.
Die Unterbringung der Versuchstiere erfolgte im Tierstall der Zentralen Klinischen Forschung
der Universitätsklinik Freiburg. Die Kaninchen wurden einzeln in Käfigen von ca. 50 x 70
cm gehalten. Der Raum war auf 21-23º Raumtemperatur bei 50-60% Luftfeuchtigkeit
klimatisiert und über die künstliche Beleuchtung wurde ein Zwölfstundenrhythmus
eingestellt.
Material und Methoden
3.2.1.4
36
Versuchsprotokoll
60 weiße Neuseeländerkaninchen wurden randomisiert auf fünf Gruppen verteilt (12 Tiere pro
Gruppe): PBS-Kontrollgruppe, MCP-1-Therapiegruppe, Interleukin-8-Therapiegruppe, NAP2-Therapiegruppe, Lymphotaktin-Therapiegruppe.
Pro Gruppe wurden sechs Tiere hämodynamisch evaluiert, von zwei Tieren wurden postmortem Angiographien durchgeführt.
Vier Tiere pro Gruppe dienten zur Gewinnung von
Gewebeproben zur histologischen Untersuchung. Die Tiere gingen nacheinander in Gruppen
zu sechs Tieren in den Versuch, wobei je drei hämodynamisch evaluiert wurden, eines
angiographisch beurteilt wurde und zwei das histologische Material lieferten.
Die Messergebnisse wurden sieben Tage nach Versuchsbeginn (Implantation der
Miniaturpumpe) erhoben.
3.2.1.5
Versuchsvorbereitung
Die osmotischen Minipumpen wurden gemäß Herstellerangaben am Operationstag mit zwei
ml PBS (Kontrollgruppe) oder den verschiedenen Zytokinen (Therapiegruppen) befüllt und
für 3 Stunden bei 37º Celsius in steriler Kochsalzlösung vorbereitet.
3.2.1.6
Anästhesie
Nach Einleitung der Narkose mit 0,6mg/kg KG Ketamin und 8 mg/kg KG Xylazin i.m. wurde
einer Ohrrandvene mit einer 22G-Verweilkanüle punktiert.
Zur Aufrechterhaltung der
Narkose erhielten die Tiere Ketamin 2-3 mg/kg KG und Xylazin 0,2-0,4 mg/kg KG
intravenös nach Bedarf. Unter diesem Narkoseprotokoll atmen die Tiere suffizient spontan
und müssen nicht intubiert werden.
3.2.1.7
Miniaturpumpenimplantation
Der rechte Unterbauch und der rechte Hinterlauf medial wurden rasiert. Auf dem
Operationstisch wurden die Tiere in Rückenlage fixiert und die geschorene Operationsregion
wurde aseptisch abgewaschen. Die Tiere wurden mit einem sterilen Lochtuch abgedeckt und
die Operation unter sterilen Bedingungen durchgeführt.
Die Haut am rechten medialen Oberschenkel wurde im Verlauf über der A. femoralis ca. 3 cm
lang inzidiert. Nach Durchtrennung der Faszien wurde die die A. femoralis ca. 2 cm distal
des Abgangs der A. profunda femoris über eine Länge von
2 cm nach distal stumpf
Material und Methoden
37
dargestellt. Nach distaler Ligatur wurde das Gefäß inzidiert und nach proximal mit einem
flexiblen Polyethylenekatheter kanüliert (Innendurchmesser: 1mm; Außenduchmesser: 1.5
mm). Die Spitze des Katheters wurde bis ca. 1 cm distal des Abgangs der A. profunda
femoris und der A. circumflexa femoris vorgeführt und im Gefäß eingebunden. Durch diese
Ausrichtung nach stromaufwärts erfolgt die Substanzapplikation direkt in das kollaterale
Gefäßsystem.
Die doppelte Ligatur über einen Verlauf von ca. 2 cm schränkt die
Entwicklung von unerwünschten Brückenkollateralen ein, die nur die Ligaturstelle
überspannen. Brückenkollateralen entwickeln sich aus den Vasa vasorum eines okkludierten
Gefäßes, wobei aus den kleinen versorgenden Gefäßen der Arterie ein neues Lumen entsteht.
Der Katheter wurde an die osmotische Minipumpe konnektiert. Die 5,1 mal 1,4 cm große
Pumpe mit einem Leergewicht von 5,1g wurde nach subkutaner Tunnelung vom Hautschnitt
am Oberschenkel aus unter die Bauchhaut vorgeschoben und mittels Naht fixiert.
Der
Wundverschluss erfolgte mittels Einzelknopfnähten mit nichtresorbierbarem Nahtmaterial.
Gegen den postoperativen Wundschmerz erhielten alle Tiere 0,003 mg/kgKG Buprenorphin
subkutan.
3.2.1.8
Postoperative Versorgung
Der Bereich der Operationswunde wurde mit antiseptischer Salbe versorgt. Nach Abklingen
der Narkosewirkung wurden die Tiere in ihren Stall zurückgebracht und erhielten freien
Zugang zu Wasser und Futter.
3.2.1.9
Versuchsphase
Nach einer Behandlungsphase von sieben Tagen wurde das Kollateralarterienwachstum der
behandelten Tiere untersucht.
3.2.2
3.2.2.1
Hämodynamische Messungen
Anästhesie
Zur Durchfühung der hämodynamischen Messungen wurden die Tiere wie bei der
Initialoperation anästhesiert.
Hals, linke Bauchseite, linker medialer Oberschenkel und
medialer Unterschenkel beidseits wurden rasiert.
Über einem 4 cm langen medialen Halsschnitt wurden die V. jugularis communis und die
Trachea dargestellt.
Zur Beatmung wurde die Trachea drei Knorpelspangen kaudal des
Material und Methoden
38
Ringknorpels quer inzidiert und ein Kunststofftubus eingeführt und mit Nahtmaterial fixiert.
Die Beatmung erfolgte mit den Zielgrößen einer SaO2 von 96-100% und einem ETCO2 von
35-42 mmHg mit einem Atemminutenvolumen von 1,7l bei einer Atemfrequenz von ca.
30/min.
Die rechte Vena jugularis communis wurde proximal der Jugularisgabel mit einem
Polyethylenkatheter kanüliert (Innendurchmesser: 1mm; Außenduchmesser: 1.5 mm). Über
diesen zentralvenösen Zugang wurde die Narkose mit Propofol 2% 2ml/kg/h mittels eines
Perfusionsautomaten aufrechterhalten.
Alle Tiere erhielten vor weiteren Gefäß-
manipulationen einen Bolus von 5000 Einheiten Herparin.
3.2.2.2
Operative Instrumentierung
Die Haut des medialen Unterschenkels wurde beidseits über 3 cm Länge längs inzidiert und
die A. saphena magna dargestellt und von ihren Begleitvenen freipräpariert. Die A. saphena
magna entspricht der A. tibialis posterior des Menschen und ist das wichtigste
Versorgungsgefäß für Unterschenkel und Fuß im Kaninchen. Das Gefäß wurde beidseits
direkt
proximal
des
Innenknöchels
mit
einem
druckfesten
Polyethylenkatheter
((Innendurchmesser: 0.58mm; Außenduchmesser: 0.96 mm) kanüliert.
Zur Gewinnung von Referenzproben während der Mikrosphäreninfusion wurde die A.
femoralis des linken Hinterbeines wie zur Pumpenimplantation dargestellt und mit einem
Katheter versorgt (Innendurchmesser: 1mm; Außenduchmesser: 1.5 mm).
Über den Halsschnitt wurde die linke A. carotis communis aufgesucht und stumpf aus ihrer
Gefäßscheide isoliert. Zum Aufbau eines pumpenbetriebenen Shunts zwischen A. carotis und
Aorta abdominalis wurde sie mit einem großlumigen Stahlkatheter (Innendurchmesser: 2,2
mm; Außenduchmesser: 2.5 mm) nach proximal kanüliert.
Zur Darstellung der Aorta abdominalis wurde die Haut links paravertebral vom Ansatz des
Rippenbogens bis zum Beckenkamm inzidiert.
Die schräge Bauchmuskulatur wurde
schichtweise scharf durchtrennt und Blutungen mittels Klemmen gestillt. Aorta abdominalis
und Vena cava inferior wurden retroperitoneal stumpf dargestellt ohne das Peritoneum zu
eröffnen. Die Aorta abdominalis wurde auf Höhe des 3. bis 5. Lendenwirbels mit einem
Stahlkatheter kanüliert (Innendurchmesser: 2,2 mm; Außenduchmesser: 2.5 mm).
Zur
Gewinnung des venösen Rückflusses wurde die Vena cava inferior in selber Höhe mit einem
Polyethylenkatheter instrumentiert (Innendurchmesser: 1mm; Außenduchmesser: 1.5 mm).
Material und Methoden
39
Ein Dreiwegehahn am aortalen Katheter wurde zur Messung des Perfusionsdrucks des
Shuntsystems genutzt.
Über eine Rollerpumpe wurde ein vaso-vasaler Shunt zwischen A. carotis communis und V.
cava inferior als Zufluss und Aorta abdominalis als Abfluss der Pumpe installiert. Eine
Wärmeeinrichtung hielt die Bluttemperatur bei 37º Celsius. Das für die Aufrechterhaltung
der extrakorporalen Zirkulation zusätzlich benötigte Blutvolumen von etwa 400ml wurde
durch Entbluten der zur angiographischen und histologischen Untersuchung vorgesehenen
Tiere gewonnen (siehe unten). Um eine maximale Vasodilatation zu erreichen wurde
Adenosinmonophosphat kontinuierlich mittels einer Perfusionspumpe ins Shuntsystem
infundiert (1mg/kg/min).
3.2.2.3
Perfusionsmessung
Die Katheter der A. saphenae magna und die Kanüle in der Aorta abdominalis wurden mit
Druckabnehmern konnektiert. Eine Ultraschall-Messsonde zur Messung des totalen
Blutflusses durch beide Hinterläufe wurde in das Shuntsystem integriert.
Flusswerte
wurden
kontinuierlich
mittels
eines
EDV-gestützten
Druck- und
Systems
digital
aufgezeichnet. Mittels des pumpenbetriebenen Shunts wurden die Hinterläufe bei sechs
Druckstufen mit unterschiedlich farbig fluoreszierenden Mikrosphären von 15 µm
Durchmesser perfundiert.
Tabelle 2: Perfusionsdrücke
Pumpenumdrehungen/ min Pumpenfluss (ml/min)
Mikrosphärenfarbe
17
57
scarlet
21
67
crimson
24
77
red
27
87
blue-green
31
97
orange
34
107
yellow-green
Während jeder Druckstufe wurde nach Stabilisierung der peripheren Druckwerte eine
andersfarbig markierte Mikrosphäre langsam in das Shuntsystem injiziert.
Material und Methoden
40
Aus der linken A. femoralis wurde für jede Mikrosphärenfarbe eine Blutprobe als
Referenzwert entnommen.
Eine umgekehrt arbeitende Perfusionspumpe wurde als
Saugpumpe genutzt und aspirierte 0,6ml/min für drei Minuten pro Druckstufe.
Nach der letzen Messung wurde das Tier noch für fünf Minuten weiterperfundiert und
anschließend durch Entbluten in Narkose getötet. Das Becken mit beiden Hinterläufen wurde
zur Auswertung der Flussdaten abgetrennt und bis zur weiteren Verarbeitung bei 4º Celsius
gelagert. Die osmotische Minipumpe wurde explantiert und auf komplette Förderung der
Inhaltssubstanz überprüft.
3.2.2.4
Auszählung der Mikrosphären
Zur Bestimmung des Blutflusses ins rechte Bein wurden die pro Muskelprobe enthaltenen
Mikrosphären in einem Durchflusszytometer (FACS) ausgezählt.
3.2.2.4.1
Probenentnahme und Verarbeitung
Sieben einzelne Muskeln (M. quadriceps femoris, M. adductor longus, M. adductor magnus,
M. gastrocnemius, M. soleus, M. plantaris, M. peroneus) wurden vom rechten Hinterlauf
freipräpariert und vom Knochen gelöst. Definierte Anteile wurden herausgetrennt und in
mehrere Einzelproben von je ca. 0.5 g aufgeteilt. Sowohl die vollständigen Muskeln als auch
die einzelnen Proben wurden gewogen. Die Gewebeproben wurden durch Zerhacken mit dem
Skalpell homogenisiert und auf Kunststoffröhrchen verteilt. Zur Freisetzung der
Mikrosphären wurden das Gewebe und die Blutproben in einem Lysepuffer mit Proteinase K
lysiert.
4000 fluoreszierende Mikrosphären der Farbe „blue“ wurden pro ml als interner
Standard der Lösung beigegeben. Zu jeder Gewebeprobe wurden 3ml der Proteinase-SDSLösung zugefügt. Alle Proben wurden im Wasserbad bei 50º Celsius für 5 Tage lysiert und
täglich aufgevortext. Nach 5 Tagen wurden die herausgelösten Mikrosphären abzentrifugiert
(30min bei 1000g), der Überstand abgesaugt und das Pellet in 1ml isotoner FACS-Lösung
resuspendiert.
3.2.2.4.2
Durchflusszytometrische Analyse
Die durchflusszytometrische Analyse (fluoreszenzaktivierte Zellanalyse) ist ursprünglich ein
Verfahren zur quantitativen Bestimmung von morphologischen Eigenschaften auf
Einzelzellebene. Die in Suspension vorliegenden Zellkörper werden in der Flusskammer
Material und Methoden
41
durch eine umfließende Hüllflüssigkeit vereinzelt und an einem Laserstrahl vorbeigeführt.
Die Ablenkung des monochromatischen Lichts lässt Rückschlüsse auf die Zellmorphologie zu
und die Inkubation der Zellen mit fluorochrommarkierten Antikörpern erlaubt die
Quantifizierung von Zielmolekülen anhand des emmitierten Lichtspektrums.
Anstatt Zellen kann das Durchflusszytometer auch künstliche korpuskuläre fluoreszierende
Körper analysieren.
Die zur Perfusionsmessung verwendeten Mikrosphären sind in
verschiedenden Frequenzbereichen fluoreszierende Kunstoffkugeln von 15µm Durchmesser,
die nach Applikation mit dem Blutstrom ins Perfusionsgebiet angeschwemmt werden und im
Kapillarbett verbleiben.
In herkömmlichen Verfahren zur Perfusionsmessung wurde im
Gewebelysat die Gesamtfluoreszenz aller enthaltenen Mikrosphären bestimmt [121]. Der
große Vorteil der Analyse im Durchflusszytometer ist die Messung der genauen
Mikrosphärenanzahl und nicht dieder von vielen Störfaktoren abhängigen Gesamtfluoreszenz.
Alle Probenröhrchen eines Tieres wurden automatisiert nach einem Standardprotokoll
gemessen.
Abb. 3
Mikrosphärenanalyse im Durchflusszytometer. Jedes detektierte Ereignis entspricht einer Mikrosphäre in der
lysierten Gewebeprobe. Die große Population blauer Mikrosphären entspricht der im Nachhinein zugegebenen
Referenzmikrosphäre.
Material und Methoden
3.2.2.5
42
Berechnung der hämodynamischen Parameter
Die Berechnung des Blutflusses durch das arterielle Kollateralsystem in die Muskelproben
berechnete sich nach folgender Formel aus der Anzahl der Mikrosphären in der Probe (Mp),
der Anzahl der Mikrosphären in der Referenzblutprobe (Mref), der Anzahl der blauen
Kontrollmikrosphären in Gewebeprobe(ISp) und Referenzprobe (ISref) als internem Standard,
dem Gewicht der Referenzblutprobe (Gref) und der Zeit, in welcher diese Referenzprobe
(Tref) aspiriert wurde:
Blutfluss (ml/ min ) =
Mp ∗ ISref ∗ Gref
ISp ∗ Mref ∗ Tref
Die Druckdifferenz berechnete sich aus der Differenz des systemischen Druckes in der
Kanüle in der Aorta abdominalis (SP) und dem peripheren Druck in der A. saphena magna
supramalleolär (PP).
∆P (mmHg) = SP – PP
Durch Ableitung aus dem Ohmschen Gesetz lässt sich aus dem Verhältnis von Blutfluss und
Druckdifferenz analog zu einem elektrischen Schaltkreis der Widerstand des Gefäßsystems
ableiten:
Gefäßwiderstand (mmHg/ml/min) =
Druckdifferenz (mmHg )
Blutfluss (ml / min)
Zielgröße unser hämodynamischen Messungen war die Konduktanz des arteriellen
Kollateralsystems von der A. profunda femoris und der A. circumflexa femoris zur A.
genualis und der A. saphena parva. Die Konduktanz oder der Leitwert G eines vaskulären
Gefäßsystems ist der Kehrwert des Gesamtwiderstandes R.
Konduktanz =
1
Gefäßwiderstand
In der empirischen Berechnung lässt sich die Konduktanz als Steigung der Widerstandskurve
der Druck-Fluss-Verhältnisse berechnen: Je steiler die Kurve, desto höher die Konduktanz.
Material und Methoden
3.2.2.6
43
Statistische Methoden
Ergebnisse wurden als Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Vergleiche zwischen
Mittelwerten wurden mittels des Student-T-Test für unpaarige Stichproben mit einem
computerisierten Statistikprogramm berechnet.
P-Werte < 0,05 wurden als statistisch
signifikant angenommen.
3.2.2.7
Post mortem-Angiographie
Die Tiere wurden wie zur Perfusionsmessung durch eine intravenöse Injektion von
Ketamin/Xylazin in die Ohrvene narkotisiert. Der Hals und die linke Bauchseite wurden
rasiert.
Nach medianem Halsschnitt wurde die rechte A. carotis communis wie zur
Perfusionsmessung
mit
einer
Stahlkanüle
kanüliert
(Innendurchmesser:
2,2
mm;
Außenduchmesser: 2.5 mm). Alle Tiere erhielten eine Bolusinjektion von 5000 Einheiten
Heparin in die Ohrvene. Anschließend wurden die Tiere über den Katheter durch Entbluten
getötet. Das Blut wurde über den Katheter in einem Glasgefäß aufgefangen und für die
hämodynamische Perfusionsmessung verwendet.
Nach Eintreten des Todes wurde die Aorta abdominals wie zur Perfusionsmessung
retroperitoneal von einem links paravertebralen Zugang aus dargestellt und mit einer
Verweilkanüle punktiert. Über eine druckluftbetriebene Pumpe wurden beide Hinterläufe mit
einem auf 37º Celsius erwärmten Kontrastmittel aus Wismut und Glycerin für 8 min bei 80
mmHg perfundiert. Zum Aushärten des Kontrastmittels wurden die Tiere anschließend für
eine Stunde mit zerstoßenem Eis bedeckt. Die Hinterläufe wurden enthäutet und oberhalb des
Beckens vom Tier abgetrennt und bis zur radiologischen Untersuchung bei –20º Celsius
eingefroren. Beide Hinterläufe wurden in Aufsicht mit einem digitalen Röntgengerät bei 53
keV 6,3mAS und 21,9ms digital aufgezeichnet und auf Film ausgedruckt.
3.2.3
Hämatologische Bestimmung der leukozytären Integrinexpression
Um eine eventuelle Korrelation von arteriogener Potenz und Wirkung auf die
Intergrinexpression von Leukozyten zu untersuchen, wurden Vollblutproben vom Menschen
in
vitro
mit
den
Adhäsionsmoleküle
verschiedenen
Mac-1
Durchflusszytometer untersucht.
Zytokinen
(CD11b/CD18)
stimuliert
und
und
LFA-1
die
Expression
(CD11a/CD18)
der
im
Material und Methoden
44
Im Kaninchenblut wurde die CD11b Expression nach in vitro Stimulation bestimmt.
3.2.3.1
Stimulation
Die gesamte Stimulation des Blutes wurde unter sterilen Kautelen durchgeführt.
Durch Punktion einer Kubitalvene eines gesunden menschlichen Probanden mit einem
kliniküblichen System wurden 8 ml venöses Blut in heparinisierte Röhrchen aspiriert. Die
Probe wurde in sterile Eppendorfer-Röhrchen in sechs Anteile zu je 1 ml verteilt und jeweils
400ng eines der vier Zytokine addiert. Eine Probe erhielt nur PBS und diente als Basiswert,
eine Probe mit 100ng/ml LPS diente als Positivkontrolle. Die Blutproben wurden bei 37º
Celsius und 5% CO2 für 2 Stunden inkubiert.
3.2.3.2
Immunzytologische Färbung
Nach Abschluss der Inkubation wurden die Proben durch Vortexen resuspendiert und jeweils
100 µl in Kunstoffröhrchen mit 200 µl der Antikörperverdünnung in PBS umgeschichtet und
vermischt. Das Blut beider Spezies wurde bei Raumtemperatur für 45 min in Dunkelheit
gefärbt. Zur besseren Identifizierung der Monozyten wurde eine simultane Doppelfärbung
gegen den scavanger-Rezeptor (CD14) als Monozytenmarker durchgeführt.
Tabelle 3: Verdünnungen der Doppelfärbung:
CD11b Färbung 5µl CD11b Antikörper + 2,5 µl CD14 Antikörper
+192,5 µl PBS
CD11a Färbung 5µl CD11b Antikörper + 2,5 µl CD14 Antikörper
+192,5 µl PBS
CD18 Färbung 5µl CD11b Antikörper + 2,5 µl CD14 Antikörper
+192,5 µl PBS
Die Erythrozytenlysierung und Zellfixation erfolgte nach Standardprotokoll mit einem
handelsüblichen Kit.
Die Proben wurden auf Eis gestellt und direkt anschließend im
Durchflusszytometer nach einem individuellen Protokoll für die Antigenquantifizierung auf
Vollblutzellen gemessen.
Material und Methoden
3.2.4
45
Histologischer Teil
3.2.4.1
Probengewinnung und Verarbeitung
Zur histologischen Analyse der Kollateralgefäße und der Quantifizierung der transmigrierten
Leukozytenpopulationen wurden vier behandelte Tiere pro Gruppe getötet und Gewebeproben
in flüssigem stickstoffgekühlten 2-Methylbutan bei -150º Celsius auf Korkscheiben
eingebettet (TissueTek Medium). Bis zur weiteren Verarbeitung wurden die Proben bei -80º
Celsius gelagert. Im Kryotom wurden serielle Gefäßscheiben von 5µm Dicke in 100µm
Abstand geschnitten und auf elektrostatisch beschichtete Objektträger aufgenommen. Alle
Schnitte wurden 30 min bei Raumtemperatur getrocknet.
3.2.4.2
Hämatoxylin-Eosin-Färbung
Zur morphologischen Analyse wurden von allen untersuchten Gefäßen Hämatoxylin-EosinFärbungen (HE) durchgeführt.
Die Objektträger wurden 3 min in Hämatoxylinlösung
inkubiert, anschließend 5 min unter fließend Wasser gewaschen und 3 min in Eosinlösung
gefärbt. Nach 2 Waschschritten in Wasser wurden die Gefäßschnitte in einer aufsteigenden
Alkoholreihe (70%, 80%, 100% je 3 min) und Xylol (10min) dehydriert und in Medium
(Entellan) eingebettet.
3.2.4.3
Zur
Immunfluoreszenzfärbung der paravasalen Leukozyten
Darstellung
und
Quantifizierung
der
transmigrierenden
Leukozyten
wurden
Gefrierschnitte der Kollateralarterien aus dem Musculus quadriceps femoris von 5µm Dicke
angefertigt und 5 min in eiskaltem Aceton fixiert.
Nach Rehydrierung in PBS wurden die
Objektträger über Nacht bei 4º Celsius in einer feuchten Kammer mit spezifischen
Antikörpern inkubiert.
Zur Darstellung von Monozyten/Makrophagen wurde ein anti-
humaner Antikörper gegen CD68 (1:50 in PBS mit Milchpulver) mit bekannter
Kreuzreaktivität im Kaninchen [109] verwendet.
T-Lymphozyten wurden mit einem
kaninchenspezifischen Antikörper (Rabbit T-Lymphocyte-antigen, 1:50 in PBS mit
Milchpulver) gefärbt. Die Mac-1 Untereinheit CD11b ist auf allen maturen myeloischen
Zellen exprimiert. Da ein spezifischer Antikörper für Granulozyten im Kaninchen nicht zur
Verfügung steht und selektive anti-humane Antikörper gegen Granulozytenmarker (CD16) im
Kaninchen eine starke Kreuzreaktivität zu anderen Zellpopulationen aufweisen, wurden in
seriellen Schnitten die CD68 negativen und CD11b positiven (1:200 in PBS mit Milchpulver)
Zellen als Granulozyten quantifiziert.
Nach drei Waschschritten in PBS wurden alle
Gefäßschnitte mit einem Cy3-fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper (1:300 in PBS mit
Material und Methoden
46
Milchpulver) gegen Mäuse-IgG1 überschichtet und 1 h bei 37º Celsius inkubiert.
Zur
besseren Darstellung der Gefäßmorphologie in der Immunfluoreszenz wurden die glatten
Gefäßmuskelzellen mit einem direkt FITC-gekoppelten Antikörper gegen sm-Actin (1:500)
eine Stunde bei 37º inkubiert. Nach einem Waschschritt in PBS-Tween 20 und 2 mal 3 min
in PBS wurden alle Objektträger 1 min mit dem DNA-Farbstoff Hoechst 33342 überschichtet,
anschließend wieder zweimal in PBS gewaschen und in Spezialmedium eingebettet
(Fluoromount).
Alle untersuchten Gefäße wurden durch Darstellung der Proliferationsaktivität als
Kollateralarterien verifiziert.
Gefrierschnitte wurden zur Antigenaufbereitung 15 min in
Zitratpuffer aufgekocht und nach Abkühlung mit einem Antikörper gegen den
Proliferationsmarker Ki67 [34] über Nacht bei 4 º Celsius inkubiert.
Die weitere
Verarbeitung und Darstellung mit einem Sekundärantikörper erfolgte analog zur
Leukozytenfärbung.
3.2.4.4
Histologische Quantifizierung
Die quantitative Histologie wurde von zwei Untersuchern unabhängig verblindet ausgezählt.
Zur Quantifierung der Leukozytentransmigration wurden pro Gruppe 4 Tiere ausgewertet und
pro Muskel durchschnittlich 12 serielle Schnitte im Abstand von 100 µm angefertigt und
gefärbt. Die einzelnen Spektalbereiche der Dreifachfärbung (Leukzyten: Cy3, sm-Actin:
FITC, Zellkerne: Hoechst33342) wurden bei einer 200-fachen Vergrößerung digital
aufgezeichnet und zu einem Kompositbild übereinandergeblendet. Alle spezifisch gefärbten
Zellen pro Gesichtsfeld wurden ausgezählt. Aus den Einzelergebnissen eines Tieres wurde
ein Mittelwert gebildet und die Standardabweichung berechnet. Das Endergebnis wurde als
Zellzahl pro mm2 angegeben.
Ergebnisse
47
4 Ergebnisse
___________________________________________________________________________
4.1 Allgemeiner tierexperimenteller Verlauf
Alle initialen chirurgischen Eingriffe verliefen komplikationslos. Nach einer postoperativen
Erholungsphase von ca. 1 Stunde bewegten sich alle Tiere ohne sichtbare Einschränkung.
Kein Tier zeigte Zeichen einer Wundinfektion, einer ischämischen Gangrän oder eine
signifikante Funktionseinschränkung der hinteren Extremität.
Nahrungsaufnahme und
Trinkverhalten waren normal. Kein Tier verstarb während der Primäroperation oder während
der Versuchsphase.
Alle implantierten Pumpen förderten ihren Inhalt und waren bei
Explantation nach einer Woche bis auf geringe Residuen entleert.
4.2 Durchflusszytometrische
Integrinexpression
Bestimmung
der
leukozytären
Um die zellselektive Wirkung der verwendeten Zytokine auf die Expression von
Adhäsionsmolekülen als wichtigen Mediatoren der Arteriogenese zu untersuchen, bestimmten
wir die stimulationsabhängige Expression der Integrin-Untereinheiten CD11b (Mac-1
Untereinheit), CD11a (LFA-1 Untereinheit) und CD18 (Mac-1 und LFA Untereinheit) im
humanen Vollblut mittels monoklonaler Antikörper. LPS als potenter Leukozytenaktivator
diente als Positivkontrolle.
Humane
Monozyten
ließen
sich
mit
Hilfe
der
Doppelfärbung
mit
dem
Monozyten/Makrophagenmarker CD14 gut gegen die Lymphozytenpopulation abgrenzen.
Auf humanen CD14+ Monozyten führte die Stimulation mit 100ng /ml LPS zu einer deutlich
verstärkten membranständigen Präsentation von CD11b im Vergleich zu unstimuliertem
Vollblut (Fluoreszenzeinheiten: PBS: 44,48±2,78; LPS: 74,48±9,10). Auch MCP-1 führte
konzentrationsabhängig zu einer starken Steigerung der CD11b-Expression mit einem
maximalen Effekt bei 400ng/ml (62,47±5,16 Fluoreszenzeinheiten). Die Stimulation mit je
400ng /ml Interleukin-8, NAP-2 oder Lymphotaktin zeigte keinen signifikanten Effekt auf die
monozytäre CD11b-Expression (IL-8: 43,92±6,77; NAP-2: 41,74±3,79; Ltn: 42,45±5,26
Fluoreszenzeinheiten).
CD 11b-FITC
Ergebnisse
SS
FS
Humanes Blut
Monozyten Granulozyten
48
SS
CD 14-PE
CD 14-PE
Kaninchenblut
Monozyten Granulozyten
PBS
LPS
MCP-1
IL-8
NAP-2
LTN
Abb. 4
CD11b Expression in humanem Blut und Kaninchenblut nach 2h Zytokinstimulation in vitro. Oben:
Scatterbilder der Doppelfärbung CD14 / CD11b (Humanblut). Unten: CD11b-Expression auf Monozyten und
Granulozyten nach Zytokinstimulation.
Ergebnisse
49
p<0,05
p<0,05
90
Fluoreszenzeinheiten
80
70
60
50
40
30
20
10
0
PBS
LPS 100ng
MCP-1 400ng
IL-8 400ng
NAP-2 400ng
Lymphotaktin
400ng
(A)
p<0,05
p<0,05
35
Fluoreszenzeinheiten
30
25
20
15
10
5
0
PBS
LPS 100ng
MCP-1 400ng
IL-8 400ng
NAP-2 400ng
Lymphotaktin
400ng
(B)
Diagramm 1
CD11b Expression auf Monozyten in humanem Blut (A) und Kaninchenblut (B) nach 2h
Zytokinstimulation in vitro. Neben LPS als Positivkontrolle führt nur MCP-1 zu einer signifikant höheren
Expression der Mac-1 Untereinheit CD11b im Vergleich zu PBS-stimuliertem Kontrollblut. Die Zytokine
zeigen in beiden Spezies vergleichbare Effekte.
Ergebnisse
50
p<0,05
p<0,05
p<0,05
Fluoreszenzeinheiten
70
60
50
40
30
20
10
0
PBS
LPS 100ng
MCP-1 400ng
IL-8 400ng
NAP-2 400ng
Lymphotaktin
400ng
(A)
p<0,05
p<0,05
p<0,05
40
Fluoreszenzeinheiten
35
30
25
20
15
10
5
0
PBS
LPS 100ng
MCP-1 400ng
IL-8 400ng
NAP-2 400ng
Lymphotaktin
400ng
(B)
Diagramm 2
CD11b Expression auf Granulozyten in humanem Blut (A) und Kaninchenblut (B) nach 2h
Zytokinstimulation in vitro. Neben LPS als Positivkontrolle führte die Stimulation mit den CXC-Chemokinen
Interleukin-8 und NAP-2 zu einer signifikanten Steigerung der CD11b Expression in beiden Spezies.
Ergebnisse
51
In humanem Vollblut wurde auch die aktivierungsabhängige Expression der CD11aUntereinheit von
LFA-1 als zweitem wichtigen leukoyztärem Integrin betrachtet.
Auf
Monozyten zeigte lediglich die Positivkontrolle LPS eine signifikante geringe Steigerung der
CD11a-Expression. Keines der selektiven Zytokine vermochte nach 2 oder 4 Stunden die
CD11a-Expression auf Monozyten signifikant zu steigern (PBS:
38,96±3,08;
IL-8:
33,98±1,28;
NAP-2:
33,52±1,16;
33±0,82;
Lymphotaktin:
MCP-1:
33,26±1,34
Fluoreszenzeinheiten). Auf Granulozyten vermochte neben LPS lediglich Interleukin-8 die
CD11a-Expression geringfügig zu erhöhen (PBS:
8,66±0,21 Fluoreszenzeinheiten).
7,86±0,11;
LPS:
9,32±0,13;
IL-8:
Der geringe positive Effekt von NAP-2 (8,02±013
Fluoreszenzeinheiten) blieb im Vergleich zu Kontrollblut nicht signifikant. MCP-1 wie auch
Lymphotaktin zeigten ebenfalls keinen signifikanten Unterschied zu PBS-behandeltem Blut
(MCP-1: 7,72±0,13; Lymphotaktin: 7,58±0,13 Fluoreszenzeinheiten).
Fluoreszenzeinheiten
p<0,05
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
PBS
LPS 100ng
MCP-1 400ng
IL-8 400ng
NAP-2 400ng
Lymphotaktin
400ng
(A)
p<0,05
Fluoreszenzeinheiten
p<0,05
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
PBS
LPS 100ng
MCP-1 400ng
IL-8 400ng
NAP-2 400ng
Lymphotaktin
400ng
(B)
Diagramm 3
CD11a Expression auf Monozyten (A) und Granulozyten (B) in humanem Blut nach 2h Zytokinstimulation
in vitro. Neben LPS als Positivkontrolle führte nur die IL-8 Stimulation zu einer signifikanten Zunahme der
LFA-1 Untereinheit CD11a auf Granulozyten.
Ergebnisse
52
Die Expression der β-Intergrinuntereinheit CD18 korrelierte gut mit der relativen CD11b
Steigerung und nicht mit den CD11a-Messwerten nach Zytokinstimulation. Auf humanen
Monozyten entsprach die selektive Zytokinwirkung dem in der CD11b-Messung bestimmten
Effekt (PBS: 45,73±3,40; LPS: 89,62±4,70; MCP-1: 63,30±1,68; IL-8: 52,47±4,80;
NAP-2: 51,73±1,86; Lymphotaktin: 51,37±2,76 Fluoreszenzeinheiten). Auf Granulozyten
konnten, wie auch in der CD11b Quantifizierung gemessen, neben LPS nur IL-8 und NAP-2
die CD18-Expression signifikant steigern (PBS: 33,86±2,99; LPS: 132,36±13,75; MCP-1:
42,44±2,58;
IL-8:
85,24±6,32;
NAP-2:
55,04±3,21;
MCP-1 400ng
IL-8 400ng
Lymphotaktin:
37,28±2,74
Fluoreszenzeinheiten).
p<0,05
Fluoreszenzeinheiten
p<0,05
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
PBS
LPS 100ng
NAP-2 400ng
Lymphotaktin
400ng
(A)
p<0,05
p<0,05
p<0,05
Fluoreszenzeinheiten
160
140
120
100
80
60
40
20
0
PBS
LPS 100ng
MCP-1 400ng
IL-8 400ng
NAP-2 400ng
Lymphotaktin
400ng
(B)
Diagramm 4
CD18 Expression auf Monozyten (A) und Granulozyten (B) in humanem Blut nach 2h Zytokinstimulation in
vitro. Die zytokinabhängige Expression der β-Unterheit der Mac-1 (CD11b/CD18) und LFA-1 (CD11a/CD18)
Adhäsionsmoleküle korreliert gut mit den CD11b-Messwerten und nicht mit der CD11a-Expression.
Ergebnisse
4.3 Histologische Betrachtung
Kollateralarterien
Vor
der
immunhistochemischen
Darstellung
53
der
von
Gefäßmorphologie
transmigrierten
Leukozyten
von
um
Kollateralarterien wurde die Morphologie der wachsenden Gefäße studiert und ihre
Proliferation durch Nachweis des Zellteilungsmarkers Ki67 verifiziert.
In der HE-Färbung zeigten sich typische morphologische Gemeinsamkeiten der
Kollateralarterien: In dichter Nachbarschaft befanden sich meist Nerven und venöse Gefäße,
die keine Proliferationsaktivität zeigen.
Die Intima der Kollateralarterien war zellreich, die
einzelnen Endothelzellen morphologisch heterogen und wölbten sich teils massiv ins
Gefäßlumen vor. Die glatten Gefäßmuskelzellen der Media zeigten teils eine unregelmäßige
Form und eine schräge Abweichung von der zirkulären Orientierung in ruhenden Arterien.
Besonders in der Media zeigte die Ki67-Färbung eine deutliche Proliferationsaktivität,
während in ruhenden Arterien Zellteilungen auf einzelnen Gefäßschnitten nur sehr vereinzelt
zu erkennen sind. In der aufgelockerten und verbreiterten Adventitia waren schon in der
Lichtmikroskopie vereinzelt Leukozyten abzugrenzen.
V
N
A
(A)
(B)
Abbildung 5
A Hematoxylin-Eosinfärbung einer kleinen Kollateralarterie 7 Tage nach Femoralarterienligatur. Die Intima
ist verdickt, die Media aufgelockert, in der Adventita lassen sich mehrkernige Zellkonglomerate abgrenzen, die
wahrscheinlich Makrophagen darstellen. Die enge Nachbarschaft zu Vene (V) und Nerv (N) legt die
Entwicklung aus einem präexistenten Gefäß nahe.
B Ki67-Immunhistochemische Färbung einer großen Kollateralarterie. Teilende Zellen sind an der roten
Kernfärbung erkennbar, ruhende Zellen sind in der Kernfärbung mit Hoechst33342 blau. Neben den grün
dargestellten glatten Gefäßmuskelzellen und dem lumennahen Endothel ist auch in der Adventitia
Teilungsaktivität erkennbar.
Ergebnisse
54
4.4 Immunhistochemische Quantifizierung der Leukozytentransmigration
Zur Analyse der Zytokinwirkung auf die Leukozytentransmigration in vivo wurden pro
Gruppe 4 Tiere intraarteriell mit den verschiedenen Substanzen behandelt und nach einer
Woche Gewebeproben aus dem Vastus intermedius quadriceps entnommen. Die paravasalen
Leukozyten um Kollateralarterien wurden mit spezifischen Antikörpern dargestellt. Da ein
spezifischer Marker für Kaninchengranulozyten nicht zur Verfügung steht, wurden die
CD11b positiven, CD68 negativen Zellen als Granulozyten gezählt.
Auch bei PBS behandelten Kontrolltieren fanden sich nach Femoralarterienligatur relativ
zahlreiche CD68+ Monozyten/Makrophagen im paravasalen Interstitum (Zellen/mm2:
14,99±1,19).
Unter lokaler Applikation von MCP-1 nahm die Anzahl paravasaler
Monozyten/Makrophagen auf das durchschnittlich Vierfache zu (Zellen/mm2: 62,14±2,68).
Auch Interleukin-8 Therapie resultierte in einer signifikant höheren Anzahl paravasaler
CD68+ Zellen (Zellen/mm2: 27,33±3,49). NAP-2 und Lymphotaktintherapie hatten keinen
signifikanten Effekt auf die Akkumulation von Monozyten/Makrophagen (Zellen/mm2:
NAP-2: 16,42±0,72, Lymphotaktin: 15,10±1,43).
p<0,05
p<0,05
70
60
Zellen/mm2
50
40
30
20
10
0
PBS
MCP-1
IL-8
NAP-2
Lymphotactin
Diagramm 5
Anzahl CD68+ Makrophagen um Kollateralarterien 7 Tage nach Femoralarterienligatur. Durch MCP-1 oder
Interleukin-8 Infusion ließ sich die Monozytentransmigration signifikant stimulieren.
Betrachtet man in der CD11b-Färbung die Gesamtheit der paravasalen myeloischen Zellen, so
zeigt sich ein stark positiver Effekt von MCP-1, gefolgt von Interleukin-8 und NAP-2.
Ergebnisse
55
Lymphotaktinbehandlung zeigte keinen signifikanten Unterschied zur Kontrollbehandlung
mit PBS (Zellen/mm2: PBS: 23,38±0,96; MCP-1: 87,96±2,18; IL-8: 62,21±2,65; NAP-2:
37,54; Lymphotaktin: 21,38±0,75). Subtrahiert man in seriellen Schnitten in 5µm Abstand
die Anzahl der CD68+ Monozyten/Makrophagen von der Gesamtheit der CD11b+ Zellen, so
entspricht die Differenz näherungsweise der Granulozytenpopulation. Hier zeigte sich, dass
Granulozyten in Kontrolltieren etwa ein Drittel der paravasalen Leukozyten ausmachen
(Zellen/mm2: 7,71±0,57). Unter MCP-1 Applikation nahm die Granulozytenakkumulation
signifikant zu (Zellen/mm2: 25,91±1,50), jedoch in geringerem Maße als die Akkumulation
von Monoyzten/Makrophagen. Die Behandlung mit Interleukin-8 zeigte den stärksten Effekt:
Die Anzahl paravasaler Granulozyten wurde annähernd vervierfacht (Zellen/mm2:
34,30±1,98). NAP-2 als zweites granulozytenpräferentes Zytokin führte ebenfalls zu einer
signifikanten Steigerung der Granulozytenakkumulation, während Lymphotaktin keinen
signifikanten Effekt im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigte (Zellen/mm2: NAP-2:
21,12±0,33; Lymphotaktin: 6,37±1,58).
p<0,05
p<0,05
p<0,05
100
90
Zellen/mm²
80
70
60
50
40
30
20
10
0
PBS
Diagramm 6
MCP-1
IL-8
NAP-2
Lymphotactin
Anzahl CD11b+ Zellen in der Adventitia von Kollateralarterien im Vastus intermedius quadriceps pro mm2 7
Tage nach Femoralarterienligatur. Diese Population umfasst sowohl Makrophagen als auch Granulozyten. Die
Behandlung mit MCP-1 führte zur stärksten Zunahme CD11+ Zellen.
Ergebnisse
56
p<0,05
p<0,05
40
p<0,05
35
Zellen/mm²
30
25
20
15
10
5
0
PBS
MCP-1
IL-8
NAP-2
Lymphotactin
Diagramm 7
Anzahl CD11b+CD68- Granulozyten pro mm2 7 Tage nach Femoralarterienligatur. Sowohl MCP-1 als auch
IL-8 und NAP-2 Infusion vermögen die Transmigration von Granulozyten in die Adventitia von
Kollateralarterien signifikant zu stimulieren.
In Kontrolltieren ließ sich um unbeeinflusst wachsende Kollateralarterien nur eine geringe
Anzahl von T-Lymphozyten mit einem kaninchenspezifischen Antikörper darstellen
(Zellen/mm2:
2,41±1,02).
Die Applikation von MCP-1 oder NAP-2 hatte keinen
signifikanten Einfluss auf die T-Lymphozytentransmigration (Zellen/mm2: MCP-1:
3,81±1,31; NAP-2: 2,79±0,50). Interleukin-8 und Lymphotaktin hingegen vermochten die
Anzahl paravasaler T-Lymphozyten signifikant zu steigern, wobei der stärkste Effekt unter
Lymphotaktintherapie
zu
Lymphotaktin: 12,86±2,86).
beobachten
war
(Zellen/mm2:
Interleukin-8:
6,56±3,08;
Ergebnisse
57
p<0,05
18
p<0,05
16
14
Zellen/mm2
12
10
8
6
4
2
0
PBS
MCP-1
IL-8
NAP-2
Lymphotactin
Diagramm 8
Anzahl von T-Lymphozyten pro mm2, 7 Tage nach Femoralarterienligatur. IL-8 und Lymphotactinstimulation
führen zu einer signifikant höheren Anzahl paravasaler T-Lymphozyten in der Immunhistochemie.
Abbildung 6 (nächste Seite)
Verifikation der untersuchten Arterien als Kollateralgefäße anhand der Proliferationsaktivität eine
Woche nach Femoralarterienligatur. Mitotische Zellkerne sind in der immunhistochemischen Färbung gegen
den Proliferationsmarker Ki67 rot dargestellt. Glatte Gefäßmuskelzellen erscheinen durch einen FITCmarkierten Antikörper grün, Zellkerne sind mit Hoechst33342 blau dargestellt. Hämatoxylin-Eosin Färbung
zeigt die morphologische Intaktheit der Blutgefäße.
Ergebnisse
58
Hämotoxylin-Eosin
Ki67-Zellproliferation
PBS
PBS
MCP-1
MCP-1
IL-8
IL-8
NAP-2
NAP-2
LTN
LTN
Ergebnisse
CD68+ Makrophagen
CD11b+ Zellen
59
T-Lymphozyten
PBS
PBS
PBS
MCP-1
MCP-1
IL-8
IL-8
NAP-2
NAP-2
NAP-2
LTN
LTN
LTN
MCP-1
IL-8
Abbildung 7
Vergleich der Leukozytentransmigration unter Zytokintherapie eine Woche nach Femoralarterienligatur.
Leukozytenpopulationen sind mit einem Cy3-gekoppeltem Sekundärantikörper rot dargestellt. Die glatte
Gefäßmuskulatur ist mit einem FITC-markierten Antikörper grün gefärbt, Zellkerne erscheinen in der
Hoechst33342-Färbung blau.
Ergebnisse
60
4.5 Angiografische Darstellung des kollateralen Gefäßsystems
Post mortem wurde in jeweils 2 Tieren pro Gruppe das arterielle Gefäßsystems des
Hinterlaufs mit einem auf Wismut und Gelatine basierendem Kontrastmittel dargestellt und
Röntgenaufnahmen angefertigt. Dies diente der Beurteilung des entwickelten Gefäßsystems
und der Visualisierung des Kollateralarterienverlaufs. Auf eine quantitative Auswertung
wurde aufgrund der geringen quantitativen Aussagekraft der Methode und des benötigten
großen
Gruppenumfangs
verzichtet.
Funktionelle
Perfusionsmessungen
sind
der
Angiographie zur Beurteilung der Arteriogenese weit überlegen [41]. Qualitativ zeigte sich in
unbehandelten Tieren eine vollständige Okklusion der Femoralartiere im Verlauf zwischen
den Ligaturstellen auf einer Strecke von ca. 2 cm. Der Klassifikation von Longland [78]
folgend, lassen sich zwei Gruppen von Kollateralarterien mit definiter Stamm-, Mittel-, und
Wiedereintrittszone abgrenzen: von der A. circumflexa femoris im M. quadriceps femoris zur
A. genualis ziehend und von der A. profunda femoris in den Adduktoren und ischiocruralen
Muskeln zur A. saphena parva (dem wichtigsten Blutgefäß zur unteren Extremität des
Kaninchens) verlaufend.
Besonders die von der A. profunda femoris ausgehenden
Kollateralarterien zeigten den typisch geschlängelten korkenzieherartigen Verlauf durch das
die Lumenerweiterung begleitende Längenwachstum. In der MCP-1 behandelten Gruppe
ließen sich qualitativ mehr großlumige Kollateralarterien in Korkenzieherformation
identifizieren als in der PBS-behandelten Kontrollgruppe.
Das Kaliber der einzelnen
Kollateralen war ebenfalls größer als in der Kontrollgruppe.
Anzahl und Kaliber der
Kollateralarterien in den Interleukin-8, NAP-2 und Lymphotaktin behandelten Gruppen
unterschied sich nicht wesentlich von der Kontrollgruppe.
Abbildung 8 (folgende Seite)
Post-mortem Wismutangiographien des rechten Hinterlaufs 7 Tage nach Femoralarterienligatur. A PBSbehandeltes Kontrolltier, B MCP-1 Infusion, C Interleukin-8 Infusion, D NAP-2 Infusion, E Lymphotaktin
Infusion. Während die MCP-1 Behandlung in einer sichtbar höhreren Anzahl großlumiger Kollateralarterien im
Vergleich zur Kontrollgruppe resultiert, ist zwischen den anderen Gruppen kein Unterschied erkennbar.
Ergebnisse
61
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
Ergebnisse
4.6 Hämodynamische Bestimmung
kollateralen Gefäßsystems
62
der
Konduktanz
des
Zur Untersuchung des Einflusses der Leukozytenakkumulation unter Zytokinbehandlung auf
funktionelle Parameter der Arteriogenese wurde die Konduktanz des entwickelnden
kollateralen Gefäßsystems als Goldstandardparameter mittels eines auf fluoreszierenden
Mikrosphären basierenden Perfusionsmodells bestimmt.
Bei direkter Konduktanzmessung nach akuter Okklusion der A. femoralis beträgt die
durchschnittliche Konduktanz des präexistenten Kollateralsystems direkt nach Femoralarterienligatur ca. 10 ml/min/100mmHg.
Im natürlichen Zeitverlauf unter der
Plazebobehandlung mit PBS steigen die Werte eine Woche nach Femoralarterienligatur auf
50,70±5,15 ml/min/100mmHg. Wie auch in vorausgehenden Experimenten in der Literatur
beschrieben [59], ließ sich die Arteriogenese in diesem Zeitraum durch die lokale Applikation
von MCP-1 auf das etwa sechsfache stimulieren (Konduktanz [ml/min/100mmHg]:
216,30±12,30). Im Gegensatz dazu unterschieden sich Konduktanzwerte der mit Interleukin8, NAP-2 oder Lymphotaktin behandelten Gruppen nicht signifikant von den Ergebnissen der
Kontrolltiere (Konduktanz [ml/min/100mmHg]: IL-8: 58,91±5,56; NAP-2: 66,83±8,72; Ltn:
52,80±5,37).
Diagramm 9 (folgende Seite)
Hämodynamische Perfusionsmessung des rechten Hinterlaufs 7 Tage nach Femoralarterienligatur.
A Exemplarische Druck-Flusskurven der einzelnen Therapiegruppen.
Die Steigung der
Regressionsgeraden (Regressionskoeffizient y) repräsentiert die Konduktanz des kollateralen Gefäßsystems. Der
Korrelationskoeffizient R2 von Druck und Blutfluss in den verschiedenen Perfusionsstufen repräsentiert die
Messgenauigkeit. Die Abweichungen in den Ausgangswerten auf der Druck- und Flussachse sind durch die
gering unterschiedliche Lage des Perfusionskatheters in der Aorta bedingt.
B Vergleich der mittleren Konduktanzwerte aller Tiere der einzelnen Therapiegruppen (n=6 pro Gruppe).
Nur MCP-1 Behandlung resultiert in einer signifikanten Steigerung der kollateralen Konduktanz im Vergleich
zur PBS-behandelten Kontrollgruppe.
Ergebnisse
63
20
18
MCP-1: y = 2,3046x - 40,548
R2 = 0,9159
Kollateraler Blutfluss [ml/min]
16
14
IL-8: y = 0,46x - 4,76
R2 = 0,965
12
PBS: y = 0,55x - 8,61
R2 = 0,928
LTN: y = 0,46x - 6,29
R2 = 0,899
10
NAP-2: y = 0,41x - 5,87
R2 = 0,878
8
6
4
2
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
∆P=SP-PP [mmHg]
Kollaterale Konduktanz [ml/min/100mmHg]
(A)
250
p<0,001
200
150
100
50
0
PBS
MCP-1
IL-8
NAP-2
LTN
(B)
Diskussion
64
5 Diskussion
___________________________________________________________________________
5.1 Eignung
des
Kaninchenhinterlaufmodells
Arteriogenesemessung
zur
Seit Beginn der Erforschung des adaptiven Gefäßwachstums wurde eine Vielzahl von zum
Teil sehr unterschiedlichen Tiermodellen zur Evaluation therapeutischer Eingriffe entwickelt.
Neben großen Unterschieden zwischen den Spezies hinsichtlich der anatomischen
Voraussetzungen prägt vor allem die Wahl des untersuchten vaskulären Versorgungsgebietes
(koronararteriell, zerebrovaskulär oder peripher) das methodische Vorgehen.
In der
mechanistischen Grundlagenforschung ist es mit der definitiven Abgrenzung von
Angiogenese
und
Arteriogenese
auch
wichtig
geworden,
einen
der
zwei
Gefäßwachstumsprozesse selektiv betrachten zu können.
5.1.1
Arteriogenese oder Angiogenese?
Nachdem die Gruppe um Isner das Kaninchenmodell nach Femoralarterienokklusion bereits
Mitte der 90er für Revaskularisationsstudien etabliert hatte [117, 118], beschäftigten sich erst
folgende Arbeiten der Gruppe um Schaper mit den genauen pathophysiologischen
Auswirkungen des Gefäßverschlusses in diesem Modell.
Dabei wurden experimentelle
Ansätze zur Differenzierung von Angiogenese und Arteriogenese etabliert. Mit dem Verzicht
auf eine invasive Totalresektion der A. femoralis und der Entscheidung für die relativ
atraumatische doppelte Ligatur wird ein Gefäßwachstum im Rahmen von Wundheilung oder
Gewebenekrose ausgeschlossen [68].
Durch Lage der Ligatur auf mittlerer Femurhöhe
werden zwei definierte Kollateralarterienursprünge (A. profunda femoris und A. circumflexa
femoris lat.) intakt gelassen. Das adaptive Wachstum dieser Kollateralgefäße ist zu keinem
Zeitpunkt mit einer Ischämie des umgebenden Gewebes assoziiert [30]. Ischämie-abhängige
Metabolite im M. quadriceps femoris und der Adduktorenmuskulatur (ATP, ADP, AMP,
Adenosine, Inosine, Hypoxanthine) unterschieden sich weder zu kurzfristigen noch
langfristigen Zeitpunkten von den Messwerten in Kontrolltieren ohne Gefäßokklusion. Die
Expression der Hypoxie-abhängigen Gene HIF-1α und LDH A nahm nach Femoralarterienligatur im Oberschenkel nicht zu. Obwohl die crurale Perfusion nach Femoralarterienligatur
deutlich abnimmt [68], steigen auch im distalen Perfusionsgebiet weder metabolische
Ischämieparameter noch die Hypoxie-regulierte Genexpression an [30]. Auch der wichtigste
Diskussion
65
angiogene Wachstumsfaktor VEGF oder sein Rezeptor Flt-1wird in und um Kollateralarterien
nicht vermehrt exprimiert, und die artifizielle Applikation von VEGF auch in sehr hohen
Dosen führt nur zu einer geringen Steigerung der kollateralen Konduktanz, möglicherweise
durch indirekte Effekte auf Monozyten [93]. Monozyten exprimierten Flt-1, und VEGF führt
zur verstärkten Aktivation, Integrinexpression und Transmigration von Monozyten [26, 53].
Zusammenfassend läßt sich der Kaninchenhinterlauf nach Femoralarterienligatur als
verbreitetstes und bestuntersuchtes spezifisches Arteriogenesemodell beschreiben. Ischämieabhängiges Kapillarwachstum hat keinen signifikanten Einfluss auf die Versuchsergebnisse.
5.1.2
Periphere Arteriogenesemodelle in anderen Spezies
Neben den weißen Neuseeländerkaninchen sind Modelle in drei weiteren Spezies zur
Arteriogeneseforschung
in
der
peripheren
Zirkulation
etabliert
und
verbreitet:
Kleintiermodelle in der Maus und der Ratte und das Großtiermodell in Schweinen der
deutschen Landrasse.
Der große Vorteil der Maus als Versuchstier liegt in der Verfügbarkeit einer großen Anzahl
von genetisch veränderten Mutantenstämmen. Mit ihrer Hilfe konnten besonders negative
Einflüsse auf die Arteriogenese unter kardiovaskulären Risikofaktoren wie Hyperlipidämie
[123, 125] oder bei Ausschaltung essentieller Mediatorproteine [60] untersucht werden. Auch
im Mäusemodell ist die Flussbestimmung mit Mikrosphären möglich und sollte der
unterlegenen Laser-Doppler-Flussmessung vorgezogen werden [60].
Laser-Doppler-Flussdetektoren wurden ursprünglich zur Untersuchung oberflächlicher
Gefäße und der Hautdurchblutung etabliert. Ihre Eindringtiefe betrug ca. 1-2 mm und ließ
auch in der Maus keine Betrachtung tiefer gelegener Strukturen des Hinterlaufs zu. Die
Anwendbarkeit dieser Geräte beschränkt sich heute auf Studien zur Wundheilung und der
oberflächlichen Haut.
In neueren Laser-Doppler-Scannern konnte die Eindringtiefe
signifikant verbessert werden. Besonders die Anwendung in Nacktmäusen ohne störendes
Fell und Hautpigmentation zeigte Teils recht gute Ergebnisse. Grundlegende Eigenschaften
dieser Methodik begrenzen jedoch die Aussagekraft. Durch den Doppler-Effekt wird die
Reflexion von Laserlicht durch bewegliche Teilchen in Abhängigkeit von Richtung und
Geschwindigkeit erfasst. In der Flussmessung im Tiermodell werden Erythrozyten detektiert.
Die Instrumentierung und Etablierung einer extrakorporalen Zirkulation, welche in der Maus
aus Gründen des geringen zirkulierenden Blutvolumens immer auch die Perfusion mit einer
zelllosen Lösung nötig macht, wird dadurch unmöglich.
Auf Messungen unter totaler
Diskussion
66
Vasodilatation muss deshalb verzichtet werden, Laser-Doppler kann nur zur Messung in vivo
genutzt werden.
Dabei bleibt der Einfluss der Vasoreaktivität, der Narkosetiefe, der
Umgebungstemperatur und der Haut- und Gewebeirritation in der Vorbereitung immer
unklar.
Im Vergleich zu Perfusionsmessungen mit fluoreszierenden Mikrosphären unter
maximaler Vasodilatation zeigte sich nur eine ungenügende Korrellation: Blutfluss wird
entweder über- oder unterschätzt [60]. Der große Vorteil von Laser-Doppler-Messungen liegt
jedoch unbestritten in der seriellen Anwendbarkeit zu mehreren Zeitpunkten.
Da aus den kleinlumigen peripheren Gefäßen des Unterschenkels aus messtechnischen
Gründen keine Druckmessung abzuleiten ist, muss auch bei mikrosphärenbasierten
Messungen auf eine echte Konduktanzmessung verzichtet und mit einer Bestimmung des
Perfusionsverhältnisses des okkludierten zum nichtokkludierten Bein vorlieb genommen
werden.
Da die meisten Mäusestämme bereits im natürlichen Zeitverlauf eine sehr gute Arteriogenese
mit schnellem Erreichen suffizienter Perfusion aufweisen, ist das Mäusemodell besonders für
Hemmstudien nach Gen-Ausschaltung geeignet, für Therapiestudien mit Substanzapplikation
und möglichem positiven arteriogenen Effekt jedoch dem Kaninchenmodell unterlegen.
Arteriogeneseforschung in der Ratte ist weit weniger verbreitet. Besonders die Arbeitsgruppe
um Terjung hat sich jedoch ausgiebig mit hämodynamischen Messungen in dieser Spezies
beschäftigt. Dabei lag ein besonderer Schwerpunkt der Fragestellung in der Betrachtung des
kollateralen Blutflusses unter Stressbedingungen durch Muskelarbeit.
Im ursprünglichen
Modell zur Untersuchung des Einflusses von bFGF auf den kollateralen Blutfluss wurde der
invasiv instrumentierte Hinterlauf mit radioaktiven Mikrosphären perfundiert, während durch
tetanische Elektrostimulation des Nervus ischiadicus Muskelkontraktionen der Muskulatur
induziert wurden [135].
Neben der Gewebeperfusion wurde auch die Muskelfunktion
evaluiert. Dieses sehr artifizielle Modell machte jedoch die Bestimmung des Einflusses
sekundärer Parameter wie endothelialer Funktion und interstitieller Druckerhöhung während
der Muskelkontraktion schwierig.
In einer Weiterentwicklung dieser Methodik testete
Pamela Lloyd aus derselben Arbeitsgruppe Ratten mit invasiver Instrumentierung (Katheter in
der linken Carotis communis und in der Kaudalarterie zur Gabe von Mikrosphären und
Gewinnung der Referenzproben) unter physiologischer Belastung auf dem Laufband [77]
und evaluierte so trainingsinduzierte Arteriogenese unter Belastungsbedingungen. Leider
musste ohne Bestimmung der systemisch-peripheren Druckdifferenz auf die Bestimmung der
Konduktanz verzichtet werden, und durch die bilatere Okklusion der Femoralarterien in
Diskussion
67
diesem Modell war auch die Berechnung eines Flussverhältnisses gegen eine interne
Kontrolle (eine nichtokkludierte Extremität) nicht möglich.
Es konnten deshalb nur
Maximalflüsse verglichen werden, was interindividuelle Unterschiede an Gewicht gewinnen
lässt. Prinzipiell ist jedoch die Kombination von physiologischer Belastung und invasiver
Messmethodik ein vielversprechender Ansatz, besonders wenn die oben genannten
Einschränkungen überwunden werden können.
Seit
kurzem
steht
mit
dem
Schwein
auch
ein
etabliertes
Großtiermodell
zur
Arteriogeneseforschung zur Verfügung [16, 129]. Während die präexistenten Anastomosen
als Ausgangsstrukten des Kollateralarterienwachstums in allen Spezies einschließlich des
Menschen nahezu denselben kleinen Durchmesser (30-100 µm) aufweisen, hängt der zu
erreichende ausreichende Enddurchmesser der Gefäße entscheidend von der Größe des
Organismus ab.
Während in der Maus eine Kollateralarterie schon nach wenigen
Zellteilungen ihren Endzustand erreicht hat, ist das adaptive Wachstum im Schwein und
Menschen ein sehr viel langfristiger Prozess [129]. Erst ein Großtiermodell erlaubt so valide
Übertragungen von Therapieergebnissen auf den menschlichen Patienten.
Durch die
entsprechende Größe ist auch der Einsatz üblicher klinischer Bildgebungsverfahren wie der
Kernspintomographie
oder
der
perkutanen
transluminalen
Angiographie
möglich.
Entscheidender Nachteil eines Großtiermodells ist, dass aus Kostengründen eine
mikrosphärenbasierte Flussmessung im Hinterlauf nicht möglich ist und auf perivaskuläre
Ultraschall-Doppler-Sonden zurückgegriffen werden muss.
Die Flussmessung mit Ultraschall ist ein verbreitetes und gut validiertes Verfahren.
Besonders bei perivaskulärer Anlage wird der Blutfluss durch das untersuchte Gefäß sicher
und reproduzierbar wiedergegeben und korreliert gut mit Mikrosphärendaten.
Zur
Bestimmung eines Gesamtflusses in ein abhängiges Stromgebiet über mehrere Arterien ist
diese Methodik jedoch weitaus schlechter geeignet, da aufgrund eines systemischen Fehlers je
nach anatomischer Anlage der Blutfluss entweder unter- oder überschätzt wird: Prinzipiell
kann die Doppler-Fluss-Sonde entweder proximal oder distal der Ligatur über der A.
femoralis angebracht werden. Bei hoher Anlage am proximalen Oberschenkel vor Abgang
der A. profunda femoris und der A. circumflex lateralis wird auch die Blutversorgung des
Oberschenkels mitgemessen, welche in diesem Modell unabhängig von der Kollateralisierung
ist. Bei weit distaler Anlage wird die kollaterale Perfusion unterschätzt, da ein Teil des
Gewebes bereits weiter proximal über Kollateralarterien versorgt wurde. Für die meisten
Fragestellungen wird deshalb der systemische Fehler der Überschätzung bei proximaler
Sondenanlage in Kauf genommen und eine interindividulle Vergleichbarkeit postuliert. Diese
Diskussion
68
Methode wird von einigen Arbeitsgruppen auch zur Flussmessung im Kaninchenmodell
genutzt [93]. Dies muss bei der guten Anwendbarkeit von Mikrosphären im Kaninchen
jedoch sehr kritisch betrachtet werden.
(A)
(B)
Abb. 9
Systemischer Fehler bei der Perfusionsmessung mit Ultraschall-Dopplersonden im Hinterlauf (am
Beispiel des Kaninchens). (A) Bei Messung proximal der Ligatur wird der Fluss zum schraffierten Bereich im
Oberschenkel mitgemessen und der kollaterale Fluss überschätzt. (B) Bei distaler Messung wird die kollaterale
Versorgung des distalen Oberschenkels nicht erfasst und die Kollateralisierung unterschätzt.
Aufgrund des großen operativen und finanziellen Aufwandes von Großtierexperimenten und
der geringeren Validität des Messverfahrens bleibt das Schweinemodell präklinischen Studien
und speziellen Fragestellungen vorbehalten, während die Grundlagenforschung weiterhin von
Kleintiermodellen dominiert wird.
5.1.3
Wieso kein koronararterielles Arteriogenesemodell?
Auch für das Myokardium ist das Wachstum von protektiven Kollateralarterien von großer
Bedeutung und unter den okklusiven Gefäßkrankheiten ist die koronare Herzkrankheit mit
ihrer deutlich höheren Mortatlität im Vergleich zur pAVK das anspruchsvollere Zielobjekt.
Auch pAVK-Patienten sterben letztendlich meist an ihrer begleitenden KHK. Daher liegt es
nahe, die therapeutische Förderung der Arteriogenese in einem koronararteriellen Tiermodell
zu erforschen. Dies stößt jedoch auf große technische Schwierigkeiten [120].
Koronare Kollerateralen werden tierexperimentell vor allem im Schwein und im Hund
studiert.
Die Anatomie des porcinen Koronarsystems mit drei großen Arterien ist der
Situation im Menschen sehr ähnlich, während der Hund im Wesentlichen ein funktionelles
Zweigefäßsystem hat und die rechte Koronararterie nur den rechten Ventrikel versorgt. Wie
auch der Mensch, hat das gesunde Schwein nur eine gering entwickelte kollaterale
Diskussion
69
Zirkulation. Das kanine Herz hingegen zeigt schon ohne Hauptstammstenose recht viele
epicardiale Anastomosen mit großem Entwicklungspotential. Daher wird das Schwein oft als
besseres Modell der humanen Situtation angesehen. Die Entscheidung für eine Spezies hängt
aber auch von der experimentellen Fragestellung ab [120].
In allen Tiermodellen ist die gezielte Untersuchung der Arteriogenese schwierig.
Die
Induktion einer Minderperfusion ohne akute Myokardinfarzierung ist essentiell. Der einfache
akute Verschluss eines Koronargefäßes endet wie auch beim Menschen in den meisten Fällen
letal. Das Infarktareal ist verloren und auch durch arteriogenes Wachstum nicht mehr zu
retten, obwohl natürlich ein Einfluss auf Heilungs- und Reparationsprozesse möglich scheint.
Also muss versucht werden, durch einen langsamen chronischen Verschluss vor eventuellen
Therapieversuchen das Kollateralbett vorzuformen. Die verbreitetste Methode hierzu sind
Ameroidkonstriktoren aus hygroskopischem Material, die meist operativ um das Gefäß
platziert werden und im Zeitverlauf (meist 1-3 Wochen) das Gefäßlumen durch Quellung
komprimieren. Die Verschlussrate mit dieser Methode ist jedoch variabel und inkonstant und
macht den Vergleich zwischen Gruppen schwierig. Es ist meist nicht nachzuvollziehen,
welches Tier zu welchem Zeitpunkt welchem Stenosegrad unterlag.
Ausserdem sind
Ameroidkonstriktoren mit einer variablen Infarkt- und Todesrate assoziiert, welches die klare
Abgrenzung zu Infarkmodellen schwierig macht.
Weiterhin sind die Perfusionsareale der einzelnen Koronararterien interindividuell sehr
unterschiedlich ausgeprägt. Zusätzlich sind oft alle Gefäße durch ein gering entwickeltes
komplexes Anastomosensystem verbunden. Bei intraartieller Stimulation des Wachstums
einer Arterie und bei Verschluss einer zweiten ist der Einfluss des dritten Gefäßes im System
schwierig abzuschätzen.
Neben solchen durch die anatomische Situation diktierten Hürden, sind auch die technischen
Möglichkeiten begrenzter als in der peripheren Situation. Die essentielle Gewinnung einer
Referenzprobe zur Konduktanzmessung mit Mikrosphären ist sehr viel schwieriger als im
Hinterlauf, wo eine kontralaterale Extremität als Kontrolle dienen kann.
An der Überwindung dieser technischen Schwierigkeiten wird auch in dieser Arbeitsgruppe
erfolgreich gearbeitet. Die Etablierung neuer Protokolle für pharmakologische Tierstudien ist
bereits abzusehen.
Für die Untersuchung von methodischen Fragestellungen der
Grundlagenforschung stellt das valide periphere Modell im Kaninchenhinterlauf jedoch
momentan die weit bessere Methodik dar.
Diskussion
70
5.2 Wirkten die verwendeten Zytokine spezifisch?
Zur Chemoattraktion und Aktivierung von Leukozytenpopulationen wurden in dieser Arbeit
humane rekombinante Zytokine in einem Kaninchenmodell eingesetzt.
Während die
Wirkung von humanem MCP-1 im Kaninchen auch im Kontext der Arteriogenese bereits in
der Literatur beschrieben wurde, galt dies nicht für die CXC-Chemokine Interleukin-8 und
NAP-2 sowie für humanes Lymphotaktin.
Es war daher wichtig, die beschriebene
zellpopulationsselektive Wirkung der Zytokine im Menschen auch in der Modellspezies zu
überprüfen. Dazu wurden die Zytokineffekte auf die leukozytäre Integrinexpression in vitro
und auf die Leukozytentransmigration in vivo untersucht.
5.2.1
Die durchflusszytometrische Integrinquantifizierung
Die Ergebnisse der durchflusszytometrischen Untersuchung der zytokinabhängigen Mac-1
Expression auf Monozyten und Granulozyten korrelieren gut zwischen humanem und
Kaninchenblut. Nicht nur kommt es bei beiden Spezies zu einer qualitativen Aktivierung der
jeweiligen Zellgruppe, auch die relativen Effekte der einzelnen Zytokine zueinander sind gut
vergleichbar. So zeigte z.B. Interleukin-8 auf Granulozyten in beiden Spezies eine stärkere
aktivierende Wirkungen als NAP-2.
Keines der CXC- oder C-Chemokine zeigte einen
unselektiven Effekt auf Monozyten oder eine Abweichung von der in menschlichen Zellen
beschriebenen Selektivität auf Integrinebene.
Die Detektion der Integrinexpression als Aktivierungsmarker schien geeignet, da für diese
Adhäsionsmoleküle eine wichtige Rolle in der Arteriogenese angenommen wird [62]. Aus
den nur zu einem singulären Zeitpunkt gewonnenen Daten dieser Arbeit sollten jedoch keine
Rückschlüsse über die funktionelle Bedeutung der einzelnen Integrine gezogen werden. So
ist die geringe zytokinabhängige LFA-1-Detektion nach zwei Stunden Stimulation
möglicherweise dadurch zu erklären, dass Mac-1 aus präformierten Vesikeln schneller
membranständig externalisiert werden kann, während diese submembranäre Speicherung für
LFA-1 nur in sehr viel geringerem Maße beschrieben ist [18].
Zur Untersuchung der
Beteiligung von Adhäsionsmolekülen an der Arteriogenese sind genetisch veränderte
Mausmodelle das besser geeignete Mittel.
Diskussion
5.2.2
71
Die quantitative Histologie
Durch die Quantifizierung der spezifisch markierten Leukozyten in seriellen histologischen
Schnitten wurde eine selektive Erhöhung von Leukozyteninfiltration unter Zytokintherapie
dargestellt. Die arbeitsaufwändige Auszählung in der Histologie nach in vivo-Therapie wurde
aus mehreren Gründen einem in vitro-Transmigrationsassay vorgezogen. Um die spezifische
Wirkung der Zytokine in unserem Tiermodell zu beweisen, sollte mit Kaninchenleukozyten
gearbeitet werden. Die Isolierung von Leukozyten aus Kaninchenblut ist technisch schwierig
und im Aufreinigungprozess mit unspezifischen Aktivierungsschritten verbunden.
Ein
eventuell positives Ergebnis unter in vitro-Bedingungen ließe nur indirekte Rückschlüsse auf
den vermuteten Effekt nach arterieller Infusion zu. Es wäre unklar, ob durch die rasche
Ausschwemmung in andere Organsysteme überhaupt ausreichende Wirkkonzentrationen im
Kollateralgefäß erreicht werden könnten [127].
Dem subjektiven Charakter
einer
beobachterabhängigen Auszählung in der Histologie wurde durch die konsequente
Verblindung der Proben Rechnung getragen.
Die histologischen Ergebnisse zeigen im Kaninchengewebe chemotaktische Substanzwirkungen, die mit den in der Literatur beschriebenen Wirkungen auf humane Zellen
übereinstimmen. Dass MCP-1-Infusion zu einer signifikant höheren Anzahl von neutrophilen
Granulozyten im Interstitium führt, ist am wahrscheinlichsten durch sekundäre Effekte zu
erklären: Die akkumulierenden Makrophagen unter MCP-1 Therapie setzen ihrerseits wieder
parakrin granulozytenattraktive Zytokine wie Interleukin-8 frei und führen so zu einer
indirekten Verstärkung der Granulozytentransmigration. Auch die signifikant höhere Anzahl
von paravasalen Makrophagen unter Interleukin-8-Therapie ist vermutlich durch einen
solchen indirekten granulozytenvermittelten Effekt zu erklären, obwohl IL-8 in vitro auch
direkt die Adhäsion von Monozyten an Endothelzellen über einen E-Selektin vermittelten
Mechanismus zu steigern vermag [45].
Da in Placebo-behandelten Kontrolltieren sowie Tieren der MCP-1 und NAP-2-Gruppe nur
eine geringe Anzahl von T-Lymphozyten im paravasalen Gewebe zu erkennen war und im
Vergleich zu CD68 und CD11b positiven Zellen fast vernachlässigbar klein erschien, liegt
schon aus diesem histologischen Ergebnis ein Rückschluss auf die möglicherweise geringe
Beteiligung an der Arteriogenese nahe. Dies ist jedoch bei nur einem untersuchten Zeitpunkt
nur sehr eingeschränkt zulässig.
Während Makrophagen nach Transmigration aus dem
Blutstrom 30-90 Tage im Interstitium ortsständig bleiben können, bevor sie in die regionalen
Lymphknoten abwandern, sind infiltrierende Lymphozyten im Gewebe einem dynamischeren
Zellumsatz unterworfen.
In histologischen Proben zu früheren Zeitpunkten nach
Diskussion
72
Femoralarterienligatur ist teilweise eine deutlich höhere Anzahl von T-Lymphozyten zu
erkennen (eigene Beobachtungen). Da die quantitative Histologie dieser Studie vor allem der
Verifikation der selektiven Zytokinwirkung dienen sollte und in Anbetracht der großen
zusätzlich benötigten Tierzahl zur Untersuchung eines zweiten Zeitpunktes, wurde auf eine
Beschreibung der Leukozyteninfiltration im zeitlichen Verlauf verzichtet.
Da ein spezifischer Antikörper gegen neutrophile Granulozyten im Kaninchen nicht zu
Verfügung
steht,
musste
eine
indirekte
Darstellung
zu
Quantifizierung
der
Granulozytenpopulation gesucht werden. Übliche Antikörper gegen humane Marker wie
CD16 zeigten in unseren Vorversuchen im Kaninchen starke unspezifische Bindungen an
Bindegewebe und quergestreifte Muskulatur. CD11b wird als Adhäsionsmolekül sowohl von
Monozyten/Makrophagen als auch von Granulozyten stark exprimiert, während Lymphozyten
in Histologie und Durchflusszytometrie keine Positivität zeigen. Da der humane Marker
CD68 auch im Kaninchen auf Makrophagen, aber nicht auf Granulozyten selektiv exprimiert
wird, stellt die Gesamtheit der CD11b positiven Zellen abzüglich der CD68 positiven Zellen
in guter Näherung die Granulozytenpopulation dar. Da beide verfügbaren Antikörper aus
dem selben Wirtstier (Maus) gewonnen wurden und nur mittels der indirekten Färbung mit
einem fluorochrommarkierten Sekundärantikörper eine ausreichende Färbeintensität erreicht
werden kann, wurden jeweils zwei konsekutive Schnitte des Gefäßes in 5µm Abstand gegen
CD11b und CD68 gefärbt und die Zahlenwerte subtrahiert. Auch wenn so keine echte
Doppelfärbung derselben Zelle erzielt werden konnte, lassen die Durchschnittswerte der
Gesamtauszählung eine quantitative Aussage über die Zellpopulationen zu.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, das für MCP-1, Interleukin-8 und NAP-2 in der
durchflusszytometrischen Analyse der Integrinexpression in humanem wie auch im
Kaninchenblut ein selektiver aktiviertender Effekt auf Monozyten (MCP-1), respektive
Granulozyten (Interleukin-8 und NAP-2), festgestellt werden konnte und die lokale
Zytokininfusion in vivo in einer
Chemoattraktion von Monozyten (MCP-1, IL-8),
Granulozyten (MCP-1, IL-8 und NAP-2) oder T-Lymphozyten (IL-8 und Lymphotaktin)
resultierte. Dies stimmt mit dem in der Literatur bekannten Wirkspektrum der Substanzen im
Menschen überein und ergänzt die teilweise vorhandenen Erkenntnisse über die Wirksamkeit
humaner Zytokine im Kaninchen [122].
Inwiefern die vermehrte Transmigration und Aktivierung dieser Zellpopulationen eine
funktionelle Bedeutung für die Arteriogenese hat, sollte durch die Analyse des
Diskussion
73
Kollateralarterienwachstums in der Angiographie und vor allem in der mikrosphärenbasierten
Konduktanzmessung evaluiert werden.
5.3 Beeinflusst die Zytokinbehandlung
arterienwachstum?
das
Kollateral-
Während in der klinischen Erforschung neuer Therapiekonzepte die Etablierung
allgemeingültiger Standards für Arteriogenesestudien vorangetrieben wird [29], ist in der
präklinischen tierexperimentellen Forschung eine Vielzahl von Methoden verbreitet, die sich
hinsichtlich ihrer Validität teils erheblich unterscheiden und nur begrenzte Vergleiche
möglich machen.
5.3.1
Interpretation der Hinterlaufsangiographien
Die visuelle Darstellung des Gefäßsystems mittels hoch-auflösenden post mortemAngiographien ist die direkteste und etablierteste Methode zur Darstellung von
Kollateralarterien und ihrem Wachstum. Gefäße ab einem Durchmesser über 30-50µm lassen
sich mit dieser Methode im Übersichtsbild visualisieren [57]. In der Vergangenheit wurde in
vielen präklinischen und klinischen Studien versucht, von Angiographien Rückschlüsse auf
den funktionellen Blutfluss zu ziehen und ein standardisiertes Klassifikationssystem für
angiographisch sichtbare Kollateralarterien wurde etabliert (Rentrop-Klassifikation) [96].
Auch in dieser Arbeit wurde die Gefäßentwicklung nach Zytokintherapie mit der einfachen
und anschaulichen klassischen Angiographiemethode untersucht. Die funktionelle Relevanz
von Angiographien ohne begleitende Perfusionsmessungen ist jedoch sehr gering.
In
Schweinen zeigte ein angiographisches Punktesystem keine signifikante Korrelation mit den
tatsächlichen Perfusionsverhältnissen in mikrosphärenbasierten Messungen [41]. In kleineren
Tierspezies wie dem Kaninchen kommen noch weitere methodische Nachteile zum Tragen:
Die im Vergleich zum Menschen und Großtieren relativ kleinlumingen und dünnwandingen
Kollateralgefäße sind in ihrem Durchmesser im radiologischen Bild stark vom Füllungsdruck
abhängig und lassen sich durch die meist gelatinebasierten post mortem-Kontrastmittel
regelrecht aufblasen. Da dem Gesetz von Hagen-Poiseuille folgend der Volumenstrom durch
ein rundes Kaliber mit der vierten Potenz des Radius zunimmt, führen kleine
Fehleinschätzungen des Gefäßdurchmessers zu großen Fehlern im abgeleiteten Blutfluss.
Diskussion
74
Auch eine einfache Orientierung an der Anzahl macht bei der Arteriogenese im Gegensatz zu
den Kapillarzählungen der Angiogenese wenig Sinn.
Während in der Angiogenese die
Mikroperfusion mit der Anzahl der Kapillaren zunimmt, kommt es in der Arteriogenese im
langfristigen zeitlichen Verlauf sogar zu einer Abnahme der initial sichtbaren Kollateralen.
Im Rahmen dieser sog. „Pruning“-Prozesse (engl. „Pruning“: Zurechtschneiden eines Baums)
ersetzt die Entwicklung weniger großlumiger Kollateralgefäße das anfänglich kollaterale
Gefäßnetz kleinlumiger Anastomosen.
Deshalb dienten die post mortem-Angiographien dieser Studie auch vor allem einer
Betrachtung des kollateralen Gefäßnetzes im Überblick, in Ergänzung der weit
aussagekräftigeren funktionellen Konduktanzmessungen. Es zeigten sich keine wesentlichen
Unterschiede
in
der
grundlegenden
Architektur
des
entwickelten
Gefäßbaums.
Kollateralursprünge und Wiedereintrittszonen waren in allen Gruppen vergleichbar. Mit der
oben diskutierten beschränkten Aussagekraft lassen sich in der MCP-1 behandelten Gruppe
im Vergleich zu Kontrolltieren und allen anderen Zytokingruppen mehr Kollateralarterien
größeren Kalibers abgrenzen. Das angiographische Gesamtbild der mit IL-8, NAP-2 und
Lymphotaktin behandelten Gruppen stimmt im Überblick mit der Kontrollgruppe überein.
Eine signifikante Reduktion sichtbarer Kollateralarterien im Vergleich zum unbehandelten
Verlauf ist ebenfalls nicht festzustellen. Die angiographische Bildgebung unterstützt so die
funktionelle Evaluation in der Konduktanzmessung.
5.3.2
Interpretation der Konduktanzmessungen
Radioaktive Mikrosphären galten lange Zeit also Goldstandard der Perfusionsmessung im
Tiermodell. In den letzten 10 Jahren wurden sie in dieser Anwendung fast vollständig von
fluoreszierenden Mikrosphären verdrängt, die sich durch größere Genauigkeit und
einfachereren Umgang auszeichnen [22, 128]. In der herkömmlichen Methodik wird in der
Auswertung nach Lyse der mikrosphärenhaltigen Gewebeprobe die Gesamtfluoreszenz aller
enthaltenen Mikrosphären eines Fluoreszenzbereichs gemessen. Die auch in dieser Arbeit
angewandte Mikrosphärenquantifikation im Durchflusszytometer erlaubt im Gegensatz dazu
die genaue Erfassung der Anzahl von bis zu 15 unterschiedlich markierten Mikrosphären und
nicht nur der ungenaueren und von Störfaktoren (Überschneidung der Fluoreszenzspektren)
abhängigen Totalfluoreszenz .
Fluoreszenzfarbstoffe werden durch Photonen einer externen Energiequelle hνEX in einen
angeregten Zustand versetzt S1’, der für etwa 1-10 Nanosekunden anhält. Dieser Prozess
Diskussion
75
unterscheidet Fluoreszenz von Chemoluminiszenz, bei der ein angeregter Zustand durch
chemische Reaktion erreicht wird. In dieser Zeit durchläuft das Molekül verschiedene
Konfirmationsänderungen und molekulare Umgebungsinteraktionen, wodurch ein Teil
Energie verloren geht und den angeregten Zustand auf das Niveau S1 reduziert. Ausserdem
kehren nicht alle angeregten Moleküle in den Grundzustand S0 zurück. Phänomene wie
„collisional quenching“, Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) und Intersystemkreuzungen beeinflussen S1.
Der sog. „Quantum yield“ beschreibt das Verhältnis der
emmitierten zu den absorbierten Photonen und ist ein relativer Parameter für das Ausmaß
dieser Prozesse.
Nach Emmision eines Photons der Energie hνEM kehrt das Fluorochrom in den Energiezustand
S0 zurück. Die Differezenz der Wellenlängen (hνEX - hνEM) wird Stokes-Shift genannt und ist
das fundamentale Prinzip der Fluoreszenzdetektion.
Quenching beschreibt nun eine Veränderung des „quantum yield“ ohne Beeinflussung des
Emmisionsspektrums. Durch FRET wird über distanz-abhängige Prozesse die Emmision
eines Fluorchroms durch die Exzitation eines anderen beeinflusst.
Durch Überlappung der
Emmisionsspektra nimmt die Komplexität des Systems mit Anzahl der Fluorchrome zu. Ein
Multikanaldetektor wie das Durchflusszytometer (4 Detektionskanäle für Fluoresenzen)
erlaubt die simultane Messung der Lichtemmission in mehreren Spektralbereichen und eine
genaue Zuordnung zu den einzelnen fluoreszierenden Mikrosphären.
Da echte Kollateralarterien im Gegensatz zum rein endothelialen Kapillarbett eine oft
ausgeprägte
Schicht
glatter
Gefäßmuskelzellen
besitzen,
müssen
funktionelle
Tonusanpassungen des Gefäßes zur Ermittlung der maximalen Konduktanz ausgeglichen
werden. Dies kann durch kurzfristigen Totalverschluss der zuführenden Hauptgefäße (z.B.
der Aorta) und Messung während der reaktiven Hyperämiephase angestrebt werden. Valide
Konduktanzmessungen
verlangen
jedoch
die
kontiunierliche
Applikation
einer
vasodilatatorischen Substanz, um während der Fluss- und Druckerhebungen einen konstant
aufgehobenen Gefäßtonus zu erreichen. Eigene Experimente haben gezeigt, dass die lokale
intraarterielle Infusion von Adenosinmonophosphat in hohen Dosen diese Ansprüche am
Besten erfüllt. Da Adenosin schnell von Erythrozyten aufgenommen wird, hat die arterielle
Applikation keinen Einfluss auf die AV-Überleitung am Herzen.
Unter natürlichen
Bedingungen führt die periphere Vasodilation zum massiven systemischen Blutdruckabfall
und lebensbedrohender Hypoperfusion der zentralen Organe. Ein solches Modell entspräche
einer Kreislaufsituation im Schockzustand, wie sie klinisch z.B. unter septischer
Diskussion
Vasodilatation zu beobachten ist.
Eine
76
Perfusionsmessung
bei
physiologischen
Perfusionsdrücken und stabiler Kreislaufsituation wäre unmöglich. Deshalb muss für valide
Perfusionsmessungen die Kreislaufleistung des Versuchstieres durch Etablierung einer
extrakorporalen
Zirkulation
und
Donorbluttransfusionen
unterstützt
werden.
Ein
pumpenbetriebenes Shuntsystem erlaubt auch die gezielte Perfusion des Hinterlaufs bei
verschiedenen Druckstufen und ermöglicht so über die Steigung der Kurve die Bestimmung
einer echten Konduktanz aus den Kapazitätswerten der einzelnen Druckstufen.
Das in dieser Studie verwendete Modell der Konduktanzmessung im Kaninchenhinterlauf
erfüllt somit die Kriterien der maximalen Vasodilation, der Perfusion bei mehreren (6
verschiedenen)
Druckstufen,
der
kontinuierlichen
Ableitung
der
peripher-zentralen
Druckdifferenz und der Flussmessung in Mikrosphärentechnik. Es ist das zurzeit valideste
verfügbare Tiermodell der Arteriogeneseforschung und wird in der Literatur allgemein für
Aussagen über das Kollateralarterienwachstum akzeptiert. In vorherigen Studien konnten
auch kleinere Unterschiede zwischen verschiedenen Therapieregimen detektiert werden [15,
30, 124].
Bei bewiesener Wirksamkeit der in dieser Studie verwendeten Zytokine auf zellulärer Ebene
sind also Aussagen über die Beeinflussung des Kollateralarterienwachstums unter
Zytokintherapie methodisch zulässig. Wie in der Literatur vorbeschrieben, führte die lokale
Applikation von MCP-1 zu einer deutlich signifikanten Steigerung der kollateralen
Konduktanz.
Die CXC-Chemokine Interleukin-8 und NAP-2 mit bewiesener chemo-
attraktiver und aktivierender Wirkung auf neutrophile Granulozyten zeigten keine signifikante
Beeinflussung des Kollateralarterienwachstums. Ebenso ließ sich die Arteriogenese durch die
kontinuierliche Infusion des Lymphozyten-chemoattraktiven C-Chemokins Lymphotactin
oder des ebenfalls lymphozytenwirksamen CXC-Chemokins Interleukin-8 nicht signifikant
beeinflussen.
5.4 Die Bedeutung der einzelnen Leukozytenpopulationen für
die Arteriogenese
Die in dieser Arbeit durch leukozytenselektive Zytokinbehandlung gewonnenen Erkenntnisse
ergänzen bestehendes Wissen über die Beteiligung von Leukozyten an arteriellen
Gefäßwachstumsprozessen.
Diskussion
5.4.1
Monozyten/Makrophagen sind
Kollateralarterienwachstums
77
wichtige
Mediatoren
des
Aus immunohistochemischen und elektronenmikroskopischen Studien ist bekannt, dass
Monozyten an das aktivierte Endothel von Kollateralarterien adhärieren und als Makrophagen
um diese proliferierenden Gefäße akkumulieren [3, 102]. Diese monozytäre Zellmigration
unterscheidet sich nur quantitativ zwischen den Spezies (hohe Zellzahlen in der Maus, eher
geringe im Kaninchen).
Auch in der Immunhistochemie dieser Arbeit sind viele
Makrophagen um Kollateralgefäße von Kontrolltieren ohne Zytokinbehandlung sichtbar und
bestätigen dieses bekannte Prinzip.
Aus diesen morphologischen Beobachtungen wurde schon früh eine potentiell wichtige
Beteiligung von Monozyten/Makrophagen an der Arteriogenese abgeleitet.
In weiteren
Arbeiten wurde gezeigt, dass Monozyten unter Einfluss des CC-Chemokins MCP-1 vermehrt
in die Adventitia von Kollateralgefäßen transmigrieren und dies einen stark positiven Einfluss
auf die Wachstumsgeschwindigkeit des kollateralen Gefäßsystems hat [59, 69].
Die
Ergebnisse der in dieser Studie als Positivkontrolle MCP-1 behandelten Tiere gehen mit
diesen Beschreibungen konform.
MCP-1 ist jedoch kein rein monozytenselektives Zytokin und wirkt auch auf andere
Leukozytenpopulationen. Es induziert Histaminausschüttung aus basophilen Granulozyten
und Mastzellen und wirkt in vitro auch chemotaktisch auf T-Lymphozyten [20]. In MCP-1
Migrationsasseys über eine separierende Endothelbarriere in vitro ist MCP-1 gar einer der
stärksten Stimulatoren, während der chemoattraktive Effekt von IL-8 durch die Endothelschicht eher reduziert wird [100]. Die histologische Quantifizierung in dieser Studie zeigte
keinen signifikanten Einfluss einer lokalen MCP-1-Therapie auf die T-Zellmigration durch
die Kollateralarterienwand in vivo. Dabei wurde allerdings nur ein Zeitpunkt, sieben Tage
nach Gefäßokklusion, untersucht. Obwohl nach IL-8 und Lymphotaktinbehandlung zu diesem
Zeitpunkt ein signifikanter Einfluss auf die Lymphozytenanzahl festzustellen war, ist ein
möglicher passagerer positiver Anstieg der Transmigration zu einem früheren Zeitpunkt nicht
auszuschließen.
Nicht zuletzt sind in der Literatur oft große Abweichungen der
chemotaktischen Wirksamkeit in vivo von Transmigrationsergebnissen mit isolierten Zellen
in vitro bekannt. Die Beteiligung von vielen anderen Zelltypen, Extrazellulärsubstanzen und
Zytokinen führen im Organismus letztendlich zu komplexeren Endresultaten.
Von Heil et al. [54] wurde die Konzentration von Leukozyten der myeloischen Reihe im
peripheren Blut von Kaninchen mit der arteriogenen Reaktion auf Femoralarterienligatur
Diskussion
78
korreliert: Nach Bolustherapie mit dem Antimetaboliten 5-Fluorouracil nahm die Anzahl von
Monozyten und Granulozyten im peripheren Blut in der Rebound-Phase ab Tag 3 nach
Zytostatikagabe signifikant zu. Gleichzeitig erreichte die kollaterale Konduktanz in der 5-FU
behandelten Grupppe etwa 50% höhere Werte als in der unbehandelten Kontrollgruppe. In
Mäusen ließ sich nach zytostatischer Myeloablation die konsekutive Hemmung der
Arteriogenese durch die Transfusion syngener CD11b+ Zellen antagonisieren. Die Autoren
ziehen aus diesen Ergebnissen den Schluss, dass eine funktionelle Verbindung zwischen der
Monozytenkonzentration im Blutbild und dem Ausmaß des Kollateralarterienwachstums nach
Femoralarterienligatur besteht. Eine Beteiligung von Granulozyten kann auch hier jedoch
nicht ausgeschlossen werden: In der Reboundphase kommt es auch zu einem starken Anstieg
der peripheren Granulozytenkonzentration, und die den Mäusen transfundierten CD11b+
Monozyten sind im Cellsorting der Maus nicht vollständig von der Granulozytenpopulation
abzugrenzen.
Die durchflusszytometrischen, immunhistochemischen und hämodynamischen Messergebnisse dieser Studie unter MCP-1-Therapie bestätigen somit die bisherige Einschätzung
von Monozyten/Makrophagen als wichtige Mediatoren des Kollateralarterienwachstums. Um
Aufschlüsse über die Beteiligung der anderen Leukozytenpopulationen zu gewinnen, wurden
aber auch erstmals die Chemoattraktion dieser Zellgruppen gezielt im Kontext der
Arteriogenese untersucht.
5.4.2
Chemoattraktion
und
Aktivierung
von
neutrophilen
Granulozyten allein hat keinen Einfluss auf die Arteriogenese
Wie Monozyten und Lymphozyten sind auch Granulozyten wichtige Mediatoren der
Angiogenese. Im Gegensatz zu diesen Zellgruppen jedoch wurde eine potentielle Beteiligung
von Granulozyten an der Arteriogenese bisher in der Literatur noch nicht diskutiert.
Dementsprechend beschränkt ist auch die Datenlage zu diesem Thema.
Wie einleitend
dargestellt, lassen funktionelle Gemeinsamkeiten von Monozyten und Granulozyten in
physiologischen und pathologischen Prozessen jedoch eine Mitwirkung an den zellulären
Umbauprozessen und als Quelle von Wachstumsfaktoren möglich erscheinen.
In dieser Arbeit wurden erstmalig Granulozyten in der Adventitia von Kollateralarterien
quantifiziert und dabei in deutlich geringerer Anzahl als Makrophagen nachgewiesen.
Während MCP-1 in der durchflusszytometrischen Antigenquantifizierung keinen Einfluss auf
die Granulozytenaktivation zeigte, konnte deren Integrinexpression durch die zwei CXC-
Diskussion
79
Chemokine Interleukin-8 und NAP-2 in Kaninchenblut signifikant gesteigert werden. Im
Gegensatz zur Makrophagenakkumulation unter MCP-1-Therapie, hatte eine Zunahme der
Anzahl paravasaler Granulozyten in der Immunhistochemie keinen signifikanten Einfluss auf
das Gefäßwachstum.
Chemoattraktion und Aktivierung von Granulozyten alleine, ohne
begleitende Effekte auf Monozyten/Makrophagen, sind nicht zur Stimulation des Kollateralarterienwachstums ausreichend. Diese Daten geben Hinweise, dass Granulozyten in ihrer
Bedeutung für die Arteriogenese den Monozyten/Makrophagen unterzuordnen sind und keine
entscheidende fördernde Funktion erfüllen.
Weiterführende definitive Beweise in
neutropenen Tieren wären anzustreben. Da jedoch keine echten Granulozyten-knock-outTiere verfügbar sind und Antikörper zur Neutrophilenreduktion die Ergebnisse oft auch durch
zusätzliche unspezifische Reaktionen beeinflussen können, stehen solche Anstrengungen vor
methodischen Schwierigkeiten.
Neben den mechanistischen Erkenntnissen über die pathophysiologischen Grundlagen der
Anpassungsprozesse nach Gefäßokklusion, legen die Ergebnisse der Stimulation mit CXCChemokinen auch nahe, dass bei der Suche nach potentiellen Substanzkandidaten für die
therapeutische Stimulation der Arteriogenese im Patienten der Forschungsschwerpunkt
weiterhin auf Zellen der monozytären Reihe gelegt werden sollte.
5.4.3
T-Lymphozyten sind für die Arteriogenese nicht von kritischer
Bedeutung
T-Lymphozyten sind an physiologischen und pathologischen Prozessen wie immunologischer
Infektionsabwehr, Wundheilung und Tumorwachstum beteiligt.
Angiogenese ist ein
gemeinsamer Faktor in vielen dieser Prozesse, und T-Lymphozyten konnten als wichtige
Quelle von angiogenen Wachstumsfaktoren nachgewiesen werden. [40] [65]. Während die
meisten dieser Erkenntnisse aus Untersuchungen der Tumorangiogenese stammen, fehlten
lange Zeit Studien über die Bedeutung von T-Lymphozyten für die Revaskularisation von
minderperfundiertem Gewebe nach Gefäßverschluss.
Nachdem Rivard et al. in einem ischämischen Mäusemodell die Anzahl infiltrierender TLymphozyten mit der Kapillardichte und VEGF-Expression korreliert hatte [98], beschrieben
Couffinhal et al., wie einleitend bereits dargelegt, die Entwicklung von ischämischen
Fußnekrosen
in
einem
Angiogenesemodell
mit
Resektion
der
A.
femoralis
in
lymphozytendefizienten Nacktmäusen und folgerten daraus eine kritische Rolle von TLymphozyten für die Angiogenese und die Entwicklung von Kollateralarterien [28]. Wie
Diskussion
80
ebenfalls bereits diskutiert wurde, ist die Arteriogenese jedoch kein VEGF-abhängiger
Prozess, und die Erkenntnisse dieser Arbeit im ischämischen Modell mit Resektion der
Kollateralarterienurprünge aus der A. femoralis müssen auf die Angiogenese beschränkt
bleiben.
Stabile et al. betrachteten daraufhin in einem ischämischen Modell mit Femoralarterienligatur
die Kollateralarterienentwicklung in CD4 knock-out-Mäusen [113]. Im Vergleich zu
Kontrolltieren des genetischen Hintergrunds zeigte dieser Stamm nach einer Woche eine
Reduktion des kollateralen Blutflusses von etwa 25% in Laser-Doppler-Messungen.
Gleichzeitig beschrieben die Autoren eine geringere Anzahl infiltrierender Makrophagen und
niedrigere VEGF-Expression im ischämischen Gewebe. Durch Transfusion von syngenen
CD4+ Zellen des Hintergrundstammes konnten diese Effekte teilweise antagonisiert werden.
Daraus wurde ein indirekter positiver Einfluss von T-Lymphozyten auf die Arteriogenese
durch die sekundäre Attraktion von Monozyten/Makrophagen postuliert. Bei der bekannt
limitierten
Verwertbarkeit
von
Laser-Doppler-Messungen
für
Aussagen
über
die
Gesamtperfusion sind diese Ergebnisse jedoch zu hinterfragen. Besonders die verstärkte
VEGF-Expression, die postoperative Funktionsbehinderung und die geringen Unterschiede in
der Flussmessung legen nahe, dass hier im Wesentlichen die angiogene Reaktion auf
Ischämie im Unterschenkel, und nicht das Kollateralarterienwachstum im Oberschenkel
untersucht wurde.
Als Zielsetzung nennen die Autoren auch die Untersuchung von T-
Lymphozyten in einem ischämischen Hinterlaufmodell, wobei sonst zur selektiven
Betrachtung der Arteriogenese die operative Induktion einer Ischämie in der untersuchten
Gefäßetage zu vermeiden versucht wird [30, 57]. In zur Ergänzung dieser Arbeit
durchgeführten Experimenten unserer Arbeitsgruppe ergab sich in einem etablierten
Arteriogenesemodell mit intakten Kollateralarterienursprüngen in lymphozytendefizienten
Nacktmäusen keine signifikante Einschränkung der Arteriogenese im Vergleich zum
genetischem Background-Stamm [49].
Auch ischämische Nekrosen der Extremität
entwickelten sich nie. Im Gegensatz zu den Arbeiten von Stabile and Couffinhal wurde in
unseren Arbeiten das Perfusionsverhältnis des ligiertem zum nichtligierten Bein unter
maximaler Vasodilatation bei mehreren Druckstufen mit fluoreszierenden Mikrosphären
untersucht.
Die histologischen Ergebnisse dieser Arbeit zeigen nur eine geringe Anzahl infiltrierender TLymphozyten um Kollateralarterien im Oberschenkel. Sie beweisen aber eindeutig, dass die
Behandlung mit den chemotaktischen Zytokinen Interleukin-8 und Lymphotactin die TLymphozyten-Akkumulation zu steigern vermag.
Die selektive Erhöhung dieser
Diskussion
81
Zellpopulation beeinflusst jedoch das Wachstum der Gefäße selbst nicht. Weder führt also
Lymphozytendefizienz in athymischen Mäusen zu einer signifikanten Reduktion der
Arteriogenese in einem mikrosphärenbasierten Modell, noch führt eine vermehrte Anzahl von
T-Lymphozyten im Gebiet des Gefäßwachstums zu einer positiven Einflussnahme.
Die
Ergebnisse vorheriger Arbeiten spiegeln vermutlich die Beteiligung dieser Zellgruppe in einer
Angiogenesereaktion im ischämischen Gewebe wider. Ein möglicher indirekter Effekt auf
die Arteriogenese über die sekundäre Freisetzung monozytenaktivierender Zytokine erscheint
zwar logisch, reicht aber nach unseren Erkenntnissen nicht zur signifikanten Steigerung der
Arteriogenese aus.
Als potentielle Zielstrukturen einer Therapie zur Stimulation des
Kollateralarterienwachstums im Patienten haben T-Lymphozyten nach diesen Erkenntnissen
an Bedeutung verloren. Anstatt indirekte Wege zu gehen, scheint eine Konzentration auf die
primären Mediatoren, Monoyzten und Makrophagen, erfolgversprechender.
Ausblick
82
6 Ausblick
___________________________________________________________________________
6.1 Potentielle unerwünschte
arteriogenen Therapie
Nebenwirkungen
der
pro-
Während in der Literatur der letzten Jahre viele angiogene oder arteriogene Konzepte mit
einem positiven therapeutischen Einfluss auf arterielle Verschlusskrankheiten vorgestellt
wurden, beschäftigten sich nur sehr wenige Arbeiten mit einem der wichtigsten Hindernisse
vor der klinischen Anwendung: der Möglichkeit ernsthafter Nebenwirkungen [35].
Während die mögliche Förderung von Tumorangiogenese und eine ungebremste Proliferation
minderwertiger Gefäße (diabetische Retinopathie) besonders unter Angiogeneseförderung
(z.B. mit VEGF) bedrohlich erscheint [35] [56], liegt unter arteriogener Therapie besonders
eine mögliche verstärkte Progression von atherosklerotischen Gefäßläsionen als unerwünschte
Wirkung nahe. Atherosklerose ist die bei weitem wichtigste Ursache für arterielle Stenosen
und Verschlüsse, und eine Verschlimmerung dieser systemischen Erkrankung wäre
kontraproduktiv und schädlich.
Angiogenese ist ein essentieller Bestandteil der Entwicklung atherosklerotischer Plaques [83].
Da Angiogenese selbst ein atherosklerosefördernder Prozess ist, ist eine Stimulation des
Kapillarwachstums nach Ansicht vieler Autoren untrennbar mit einer Progression der
Atherosklerose verbunden [126]. Fast alle pro-angiogenen Faktoren sind auch pro-atherogen.
Im Gegensatz hierzu ist die Arteriogenese nicht direkt in die Progression von Gefäßläsionen
und Plaques involviert.
Atherosklerose und Arteriogenese teilen jedoch mechanistische
Gemeinsamkeiten: In beiden Prozessen kommt es zur Monozyteninfiltration, zur Produktion
von leukozytenattraktiven Zytokinen und Wachstumsfaktoren und zur Teilung glatter
Gefäßmuskelzellen. Für das stärkste bekannte arteriogene Zytokin MCP-1 ist eine direkt
fördernde Wirkung in der Atherosklerose seit längerem bekannt [86].
Die lokale Therapie mit MCP-1 führt in hyperlipidämischen Watanabe-Kaninchen nicht zu
einer signifikant gesteigerten atherosklerotischen Plaqueprogression. Bei allerdings sehr
hoher Standardabweichung der gemessenen Plaqueoberfläche [125] waren zusätzliche
Studien nötig.
In einer folgenden Arbeit beschrieben van Royen et al. kürzlich in ApoE- knock-out-Mäusen
erstmalig den Einfluss einer lokalen arteriogenen Therapie mit MCP-1 auf die systemische
Ausblick
83
Atherosklerose [123]. Auch unter Bedingungen einer heriditären Hyperlipidämie in der Maus
blieb der positive Effekt auf das Kollateralarterienwachstum erhalten. Jedoch führte die
lokale Therapie, mittels direkter arterieller Infusion in die A. femoralis, zu einer systemisch
nachweisbaren Erhöhung der CD11b Expression auf Monozyten, zur verstärkten
Neointimaformation in der Aorta, sowie zur Größenzunahme atherosklerotischer Plaques.
Zusätzlich nahm die Anzahl glatter Muskelzellen in Plaques unter Therapie signifikant ab,
was einen potentiell destabilisierenden Effekt von MCP-1 auf die Plaque-Integrität nahe legt.
Diese gravierenden Nebenwirkungen im Tiermodell mindern die Wahrscheinlichkeit eines
zukünftigen klinischen Einsatzes von MCP-1 zur arteriogenen Therapie. Wenn es nicht
gelingt, durch Variation des Dosisregimes oder Kombination mit protektiven Pharmaka diese
unerwünschte Substanzwirkung zu unterdrücken, scheinen andere Substanzen mit eher antiatherosklerotischen Eigenschaften vielversprechender.
GM-CSF und evtl. auch TGF-β1
scheinen hier mögliche Kandidaten zu sein [48, 111], die teilweise auch schon den Weg in
Phase-II-Studien gefunden haben [110].
6.2 Klinische Studien
Angiogene Wachstumsfaktoren waren die ersten klinisch getesteten Substanzen zur
therapeutischen Neovaskularisation.
In unkontrollierten Phase I-Studien konnte die
Sicherheit und Anwendbarkeit von VEGF und bFGF nachgewiesen und teilweise auch ein
therapeutischer Erfolg gezeigt werden.
Die einzige randomisierte, kontrollierte und verblindete Studie jedoch, die „VEGF to Improve
left Ventricular Function and Angiogenesis (VIVA)“ –Studie, zeigte nach intrakoronarer und
intravenöser Therapie mit VEGF165 keinen signifikanten Unterschied zur Placebo-behandelten
Gruppe [55]. Auch hier hatten positive Ergebnisse in unkontrollierten Phase I-Studien große
Hoffnungen geweckt.
Ein systematischer Fehler in der Wahl der therapeutischen Zielstruktur könnte die
enttäuschenden Ergebnisse der VIVA-Studie erklären:
Die Stimulation von kapillärer
Proliferation durch endotheliale Wachstumsfaktoren kann den Verschluss von großen
arteriellen Leitungsgefäßen nicht ersetzen [104].
In der Evaluation eines möglichen positiven Effekts von angiogener oder arteriogener
Therapie stößt der Untersuchende auch auf methodische Schwierigkeiten:
Klinische
Standardmethoden wie die Koronarangiograpie, die Myokardszintigraphie oder indirekte
Ausblick
84
Erhebungen wie das Belastungs-EKG sind nicht sensitiv genug, um kleinere Unterschiede in
der kollateralen Blutversorgung zu detektieren [104].
In einer 2001 veröffentlichten Studie überwinden Seiler et al. erstmalig diese systematischen
und methodischen Schwierigkeiten [110].
In einer randomisierten, doppelblinden und
Placebo-kontrollierten Studie wurde in 21 Patienten mit koronarer Herzkrankheit der Einfluss
einer intrakoronaren und subkutanen Therapie mit dem Wachstumsfaktor GM-CSF
(Molgramostim) auf die Entwicklung von funktionellen Kollateralarterien untersucht.
Als
primärer Untersuchungsparameter des kollateralen Blutflusses diente die Berechnung eines
Flussindex aus distalem koronarem Verschlussdruck und Aortendruck (Collateral Flow Index
= CFI). Mit dieser Methode lassen sich auch kleinere Unterschiede in der poststenotischen
Durchblutung detektieren. Nach zwei Wochen konnte eine signifikante Zunahme des CFI in
der GM-CSF behandelten im Vergleich zur Placebo-behandelten Gruppe festgestellt werden.
Trotz der kleinen Gruppengröße von insgesamt nur 21 Probanden weisen diese Ergebnisse
den Weg für zukünftige größere Studien. Auch die Übertragbarkeit der positiven Wirkung
von GM-CSF auf andere Stromgebiete wie die periphere Zirkulation der unteren Extremität
wird unter anderem auch an dieser Fakultät momentan untersucht.
Zusammenfassung
85
7 Zusammenfassung
__________________________________________________________________________
Die Chemoattraktion und Aktivierung von Monozyten durch spezifische Zytokine (MCP-1,
TGF-ß) vermag die Entwicklung von Kollateralarterien nach Gefäßokklusion (Arteriogenese)
signifikant zu beschleunigen. Diese Substanzen wirken jedoch nicht nur auf Monozyten, und
die Beteiligung anderer Leukozytensubpopulationen mit bekannter Bedeutung für das
Kapillarwachstum (Angiogenese) in der Arteriogenese ist weitgehend unklar. In dieser Studie
untersuchten wir den Einfluss von Granulozyten- und Lymphozytenchemoattraktion und
Aktivierung auf die Arteriogenese.
60 Neuseeländerkaninchen erhielten nach Femoralarterienligatur entweder PBS, MCP-1,
Interleukin-8 (IL-8), Neutrophil-Activating-Protein-2 (NAP-2) oder Lymphotactin (Ltn)
mittels Minipumpen lokal in das kollaterale Gefäßsystem. Während NAP-2 relativ selektiv
auf Granulozyten wirkt, übt IL-8 auch einen deutlichen Effekt auf Lymphozyten aus. Ltn
diente zur Chemoattraktion von Lymphozyten, PBS und MCP-1 als Kontrollen. Nach einer
Woche wurde die Konduktanz des kollateralen Gefäßsystems mit Mikrosphären bestimmt. Da
die Leukozytenfunktion in der Arteriogenese von der Expression leukozytärer Integrine
abhänging ist, wurde die Mac-1 und LFA-1 Expression nach Zytokinstimulation durchflusszytometrisch untersucht.
Die transmigrierten Leukozyten unter Zytokintherapie in vivo
wurden immunhistochemisch quantifiziert.
Obwohl in vivo eine signifikante Steigerung der Granulozytentransmigration nach IL-8 und
NAP-2 Infusion festgestellt wurde (Zellen/mm2: PBS=8,33±2,87, MCP-1=25,23 ±10,81, IL8=36,06±12,65, NAP-2=20,67±7,41) und durchflusszytometrisch eine Aktivation nachgewiesen werden konnte (Mac-1 Expression: PBS=21,12 ±2,11, MCP-1=24,11±2,64, IL8=32,65±2,10, NAP-2=27,30±2,25), hatte dies keinen Einfluss auf die kollaterale
Konduktanz. Ltn-Infusion stimulierte die T-Lymphozyten-Akkumulation um Kollateralarterien (Zellen/mm2: PBS=2,48±1,24, MCP-1=4,26±1,16, IL-8=6,88 ±5,28, NAP-2=
2,70±0,57, Ltn=12,80±3,50), hatte aber keinen Einfluss auf die Arteriogenese. Konduktanz
[ml/min/100mmHg]: PBS=50,70±5,15, MCP-1=216,30±12,30, IL-8=58,91±5,56, NAP-2=
66,83±8,72, Ltn= 52,80±5,37. Während die Bedeutung von Granulozyten und TLymphozyten für die Angiogenese gut beschrieben ist, ist die Chemoattraktion und
Aktivierung dieser Zellpopulationen zur Beeinflussung der Arteriogenese nicht ausreichend.
Dies bestätigt die Bedeutung von Monozyten/Makrophagen als wichtigsten leukozytären
Mediatoren des Kollateralarterienwachstums.
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Abkürzungsverzeichnis
95
9 Abkürzungsverzeichnis
___________________________________________________________________________
µg
Mikrogramm
µl
Mikroliter
A.
Arterie
AMI
akuter Myokardinfarkt
AS
Aminosäuren
bp
Basenpaare
bzw.
beziehungsweise
CAPRIE
Clopidogrel versus Aspirin in Patiens at Risk of Ischaemic Events
CD
Cluster of Differentiation
CGS
Centimeter-Gram-Sekunde
d.h.
dass heißt
DNA
Desoxyribonukleinsäure
ERKs
extracellular signalrelated kinases
et al.
et alii
FGF
Fibroblast growth factor
g
Gramm
h
Stunden
HE
Hämotoxylin-Eosin
HIF-1
Hypoxia inducible factor-1
ICAM-1
Intercellular adhesion molecule-1
IFNγ
Interferon-γ
Ig
Immunglobulin
IGF-1
Insulinlike growth factor-1
IL-8
Interleukin-8
kDa
Kilo-Dalton
KHK
koronare Herzkrankheit
LDL
Low density lipoprotein
LFA-1
Leukocyte functioning protein-1
LPS
Lipopolysaccharid
Ltn
Lymphotactin
Abkürzungsverzeichnis
MCP-1
Monocyte chemoattractant protein-1
mg
Milligramm
min
Minuten
ml
Milliliter
MMPs
Matrix-Metalloproteinasen
mRNA
Boten-Ribonukleinsäure
NAP-2
Neutrophil activating protein-2
NF-κB
Nuclear factor – κB
NK-Zellen
natürliche Killerzellen
NMR
nuklearmagnetische Resonanztomographie
pAVK
periphere arterielle Verschlusskrankheit
PDGF
Platelet derived growth factor
PSGL-1
P-Selektin Glycoprotein Ligand-1
PTA
perkutane transluminale Angioplastie
PTCA
perkutane transluminale Coronarangioplastie
RNA
Ribonukleinsäure
rpm
Umdrehungen pro Minute
RT
Raumtemperatur
sec
Sekunden
SSRE
Shear stress response element
TGFß-1
Transforming growth factor-ß1
U
Unit
u.s.w.
und so weiter
V.
Vene
VCAM-1
Vascular adhesion molecule-1
VEGF
Vascular endothelial growth factor
z.B.
zum Beispiel
96
Danksagung
97
10 Danksagung
__________________________________________________________________________
Ich danke meinem Doktorvater Professor Cristoph Bode und der Forschergruppe für
Arteriogenese unter Leitung von Dr. med. Ivo Buschmann für die Anregung dieser Arbeit und
die Gelegenheit, mit ihrer Hilfe wissenschaftliches Arbeiten kennenlernen zu dürfen.
Ganz besonderer Dank gebührt Herrn Imo Höfer für die intensive Betreung meiner
Doktorarbeit. Seine geduldige Anleitung und freundschaftliche Führung und waren für mich
die wichtigste Unterstützung.
Professor Hennig danke ich für sein Interesse an meiner Doktorarbeit und die Übernahme der
Zweitkorrektur.
Bei Dr. Niels van Royen und Herrn Stephan Schirmer möchte ich mich für ihre
Hilfsbereitschaft und Unterstützung dieser Arbeit bedanken.
Susann Ulusans danke ich für ihre stets geduldige operative Anleitung und das freundliche
Teilen ihrer veterinärmedizinischen Expertise.
Meinen Kollegen der Forschergruppe Arteriogenese Dr. Elena Ninci, Dr. Marco Jost, Dr. Eva
Buschmann, Jing Hua, Bernhard Berger, Benjamin Meder, Caroline Hartl, Jan-Philip Andert,
Stephanie Fischer, Susanne Hartmann, Caroline Kempf, Felix Hedwig und Markus Böttinger
danke ich für Rat und Hilfe und die schöne gemeinsame Zeit.
Bei den Mitarbeitern der Abteilung für Neuroradiologie und besonders Herrn Eddie Ruhno
möchte ich mich für ihre Hilfe bei der Aufnahme der Angiographien bedanken. Den
Tierpflegern der Zentralen Klinischen Forschung danke ich für die kompetente Betreuung
meiner Kaninchen.
All meinen Freunden danke ich für die schöne Studienzeit, meiner Schwester für ihren Rat
und Ulrike Fassnacht für all die glücklichen Momente der letzten Jahre.
Ganz besonders möchte ich mich bei meinen Eltern Gudrun und Ulrich Grundmann für ihr
Vertrauen, die Ermöglichung dieses Studiums und ihre liebevolle Unterstützung bedanken.
Lebenslauf
98
11 Lebenslauf
___________________________________________________________________________
ƒ
Name:
ƒ
Geburtsdatum/-ort: 14.02.1978 in Hamburg
ƒ
Familienstand:
ledig
ƒ
Eltern:
ƒ
Geschwister:
Ulrich Grundmann, Unternehmensberater
Gudrun Grundmann, Lehrerin
Franziska Grundmann, Studentin
Sebastian Benedikt Grundmann
AUSBILDUNG
ƒ
1997 Abitur an der Gesamtschule Jahn in Hamburg, Note 1.0
ƒ
1997-1998 Wehrdienst
ƒ
1998 Beginn des Studiums der Medizin an der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
ƒ
2000 Ärztliche Vorprüfung, Note: sehr gut (1.33)
ƒ
2001 1.Staatsexamen, Note: sehr gut (1.0)
ƒ
2004 2.Staatsexamen, Note: sehr gut (1.0)
ƒ
04/2004 Beginn des Praktischen Jahres (Chirurgie) in Durban/Südafrika
ƒ
06/2004 Praktisches Jahr (Chirurgie/Anästhesie) am Kreisklinikum Donaueschingen
ƒ
ab 11/2004 Praktisches Jahr (Innere Medizin) am Inselspital Bern,
Departement Herz und Gefäße (Prof. Dr. Meyer)
ƒ
04/2005 3. Staatsexamen, Note: sehr gut (1.0), Approbation als Arzt mit der Gesamtnote 1.0
PUBLIKATIONEN
ƒ
Grundmann S, Hoefer I, Ulusans S, Schirmer S, van Royen N, Bode C, Piek JJ, Buschmann I:
Tumor Necrosis Factor-α Antagonists Attenuate Adaptive Arteriogenesis in the Rabbit
American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology 2005 Oct; 289(4): H1497-H1505
ƒ
Hoefer I, Grundmann S, van Royen N, Voskuil M, Schirmer S, Ulusans S, Bode C, Buschmann I,
Piek JJ: Leukocyte subpopulations and Arteriogenesis: specific role of monocytes, lymphocytes and
granulocytes
Atherosclerosis 2005 Aug; 181 (2): 285-93
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Hoefer I, Grundmann S, , Schirmer S, van Royen N, Meder B, Bode C, Piek JJ, Buschmann I:
Aspirin but not clopidogrel reduces collateral conductance in a rabbit model of femoral artery
occlusion
J Am Coll Cardiol. 2005 Sep 20;46(6):994-1001
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Schirmer SH, Buschmann I, Jost MM, Hoefer IE, Grundmann S, Andert JP, Ulusans S, Bode C, Piek
JJ, van Royen N: Differential effects of MCP-1 and leptin on collateral flow and arteriogenesis
Cardiovasc Res 2004; 64(2): 356-64.
Lebenslauf
99
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Hoefer IE, van Royen N, Rectenwald JE, Deindl E, Hua J, Jost M, Grundmann S, Voskuil M, Ozaki
CK, Piek JJ, Buschmann IR: Arteriogenesis proceeds via ICAM-1/Mac-1- mediated mechanisms.
Circ Res 2004; 94 (9):1179-85.
ƒ
Buschmann IR, Voskuil M, van Royen N, Hoefer IE, Scheffler K, Grundmann S, Hennig J, Schaper
W, Bode C, Piek JJ: Invasive and non-invasive evaluation of spontaneous arteriogenesis in a novel
porcine model for peripheral arterial obstructive disease.
Atherosclerosis 2003 Mar;167(1):33-43
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van Royen N, Hoefer I, Bottinger M, Hua J, Grundmann S, Voskuil M, Bode C, Schaper W,
Buschmann I, Piek JJ: Local monocyte chemoattractant protein-1 therapy increases collateral artery
formation in apolipoprotein E-deficient mice but induces systemic monocytic CD11b expression,
neointimal formation, and plaque progression.
Circ Res 2003 Feb 7;92(2):218-25
PRÄSENTATIONEN
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S. Grundmann, I. Höfer, N. van Royen, S. Schirmer, S. Ulusans, S. Hartmann, J. Piek, I. Buschmann:
Leukozyten und granulozyten-attraktive Zytokine (NAP-2, IL-8): Ihr Einfluss auf die Arteriogenese.
Frühjahrstagung der Deutschen Gesellschaft für Kardiologie 2003, Mannheim
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S. Grundmann, I. Höfer, N. van Royen, S. Schirmer, S. Ulusans, S. Hartmann, J. Piek, I. Buschmann:
Direct evidence for specific contributions of leukocyte subpopulations to arteriogenesis.
European Society of Cardiology 2003, Wien
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S. Grundmann, I. Höfer, S. Ulusans, N. van Royen, S. Schirmer, I. Buschmann:
Reduzierte Arteriogenese unter Behandlung mit den Tumor necrosis factor-α Antagonisten
Infliximab und Etanercept .
Amercian Heart Association, Nov. 2004, New Orleans, U.S.A
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S. Grundmann, I. Höfer, S. Schirmer, N. van Royen, , I. Buschmann:
Aspirin but not Clopidogrel Attenuates Collateral Artery Growth in a Rabbit Hindlimb Model of
Peripheral Vascular Disease
European Society of Cardiology, Sept. 2005, Stockholm, Sweden
POSTER-PRÄSENTATIONEN
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S. Grundmann, I. Höfer, N. van Royen, S. Schirmer, S. Ulusans, I. Buschmann: Monocytes, but not
Lymphocytes or Neutrophils are essential mediators of arteriogenesis.
Jahrestagung des American College of Cardiology 2004, New Orleans, USA
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S. Grundmann, I. Höfer, S. Ulusans, S. Schirmer, N. van Royen, I. Buschmann:
Reduzierte Arteriogenese unter Behandlung mit den Tumor necrosis factor-α Antagonisten
Infliximab und Etanercept .
Frühjahrstagung der Deutschen Gesellschaft für Kardiologie 2004, Mannheim
ƒ
S. Grundmann, , I. Höfer, S. Schirmer S. Ulusans, , N. van Royen, B. Meder, I. Buschmann:
Aspirin, but not Clopidogrel, Attenuates Collateral Artery Growth Following Femoral Artery
Occlusion. An Experimental Background for the Clinical ArtNet-1 Study.
Frühjahrstagung der Deutschen Gesellschaft für Kardiologie 2005, Mannheim
Lebenslauf
100
TÄTIGKEITEN NEBEM DEM STUDIUM
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01/2002 Wissenschaftliche Hilfskraft in der Zentralen Klinischen Forschung des
Universitätsklinikums Freiburg, Forschergruppe für experimentelle und klinische Arteriogenese,
Abteilung Innere Medizin III
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06/2002 – 12/2004: Wissenschaftlicher Mitarbeiter der Perfusion Technologies GmbH in Freiburg
AUSLANDSAUFENTHALTE
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1994/95 High-school Schuljahr mit amerikanischem Schulabschluss in Wasilla, Alaska, U.S.A.
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04/2001 Famulatur am Wansbeck General Hospital, Abteilung Kardiologie, Newcastle-upon-Tyne,
Großbritannien
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03/2003 Famulatur am Perth Royal Hospital, Abteilung Anästhesiologie und Intensivmedizin, Perth,
Australien
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04/2004 - 06/2004 PJ-Aufenthalt an der Nelson Mandela Medical School, Abteilung für
Chirurgie/Notaufnahme, Durban, KwaZulu-Natal, Südafrika
WEITERE FAMULATUREN
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03/2001 Famulatur am Albertinen-Krankenhaus, Abteilung für Chirurgie, Hamburg
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07/2002 Famulatur in der internistischen Notaufnahme des Universitätsklinikums Freiburg
FÖRDERUNG
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1994/95 Vollstipendium des Deutschen Bundestages für ein Schuljahr an einer amerikanischen HighSchool in Alaska, U.S.A
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01/2003 E-fellows online-Stipendium
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10/2003 DAAD-Teilstipendium für ein Auslandstertial des Praktischen Jahres an der Universität von
KwaZulu-Natal, Durban, Südafrika
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10/2004 Reisestipendium der Wissenschaftlichen Gesellschaft der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg zum Besuch des Jahrestagung der American Heart Association in New Orleans, U.S.A
Sprachen
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Englisch: Cambridge Certificate of Proficiency in English, Grade A
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Niederländisch: Gute Kenntnisse
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Französisch: Grundkenntnisse
Erklärung
101
12 Erklärung
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Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegenden Dissertation selbstständig angefertigt und in
dieser oder ähnlicher Form noch nicht anderweitig eingereicht habe.
Freiburg, den 30. Oktober 2003