Aus dem Zentrum für Pathologie der Universität zu Köln Allgemeine
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Aus dem Zentrum für Pathologie der Universität zu Köln Allgemeine Pathologie und pathologische Anatomie Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. H. P. Dienes Hepatische Granulome: histopathologischer und molekularpathologischer Ansatz der Diagnose und Differentialdiagnose Inaugural-Disseration zur Erlangung der Doktorwürde der Hohen Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln vorgelegt von Judith Maria Ratering aus Münster Promoviert am 18.08.2010 Dekan: Universitätsprofessor Dr. med. J. Klösterkötter 1. Berichterstatter: Privatdozentin Dr. med. U. G. J. Drebber 2. Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. med. T. Goeser Erklärung Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Disserationsschrift ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des Manuskripts habe ich Unterstützungsleistungen von Frau Priv.-Doz. Dr. med. Uta Drebber und Frau Priv.-Doz. Dr. rer nat. M. Odenthal erhalten. Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe eines Promotionsberaters in Anspruch genommen. Dritte haben weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertationsschrift stehen. Die Disserationsschrift wurde von mir weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt. Köln, den 26.02.2010 Die in der vorliegenden Arbeit angegebenen Experimente wurden nach entsprechender Anleitung durch Frau Priv.-Doz. Dr. U. Drebber, Frau Priv.-Doz. Dr. rer. nat. M. Odenthal und Einarbeitung durch die medizinisch-technische Assistentin Frau Marion Müller von mir selbst durchgeführt. Die klinischen Daten der untersuchten Patienten wurde von mir persönlich aus dem Archiv des Zentrums für Pathologie der Universität zu Köln zusammengetragen. Danksagung Herrn Professor Dr. med. H. P. Dienes danke ich für die Möglichkeit in seinem Institut meine Dissertation zu schreiben. Mein besonderer Dank gilt Frau Priv.-Doz. Dr. med. Uta Drebber für die Überlassung des Dissertationsthemas und der zur Verfügung gestellten Sachmittel, sowie für die kritische Durchsicht des Manuskriptes. Ihr fachlicher Rat, ihre stete Hilfsbereitschaft, Herzlichkeit, Geduld und Engagement ermöglichten mir ein hervorragendes Arbeitsklima. Eine besserer Betreuung hätte ich mir nicht wünschen können. Bei Frau Priv.-Doz. Dr. rer. nat. M. Odenthal und Frau M. Müller bedanke ich mich ganz herzlich für die Einweisung in die experimentellen Techniken und für die technische Betreuung in einer immer sehr angenehmen Atmosphäre. INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG 1.1 1.2 1.2.1 1.3 1.3.1 1.3.2 1.4 1.4.1 1.4.2 1.4.3 1.4.4 GRANULOME IN DER LEBER 3 DIE CHARAKTERISTIKA DER GRANULOMATÖSEN ENTZÜNDUNG 5 GRANULOMMORPHOLOGIE 6 SPEZIELLE PATHOLOGIE DER GRANULOME IN DER LEBER 7 UNTERSCHIEDE EINZELNER GRANULOME UND GRANULOMATÖSER HEPATITIS 8 ÄTIOLOGIE HEPATISCHER GRANULOME 9 MORPHOLOGIE HEPATISCHER GRANULOME 11 MORPHOLOGIE VON GRANULOMEN BEI PRIMÄR BILIÄRER ZIRRHOSE 11 MORPHOLOGIE VON GRANULOMEN BEI TUBERKULOSE 12 MORPHOLOGIE VON GRANULOMEN BEI SARKOIDOSE 12 MORPHOLOGIE VON MEDIKAMENTEN-INDUZIERTEN GRANULOMEN 13 2 FRAGESTELLUNG DER ARBEIT 15 3 MATERIAL UND METHODEN 17 3.1 3.2 3.3 3.3.1 17 17 18 3.3.2 3.3.3 3.3.4 3.3.5 AUSWAHL DES UNTERSUCHUNGSMATERIALS HISTOPATHOLOGISCHE BEGUTACHTUNG ERREGERNACHWEIS MITTELS DNA NPCR DNA-EXTRAKTION AUS FORMALINFIXIERTEN, PARAFFINEINGEBETTETEN GEWEBEPROBEN POLYMERASE- KETTEN- REAKTION (PCR) PRIMERAUSWAHL AMPLIFIKATION DER DNA- SEQUENZEN MITTELS DER PCR AGAROSEGEL- ELEKTROPHORESE 19 20 21 26 27 4 ERGEBNISSE 29 4.1 4.1.1 ZUSAMMENSTELLUNG DES PATIENTENKOLLEKTIVS HEPATISCHE GRANULOME MIT TYPISCHEN ODER VERDÄCHTIGEN HISTOPATHOLOGISCHEN LÄSIONEN BEWERTUNG DER DNA- GÜTE FÜR EINE MOLEKULARPATHOLOGISCHE DIAGNOSTIK AUFBAU EINES PCR- NACHWEISES FÜR LISTERIA MONOCYTOGENES PRIMERDESIGNE NACHWEIS VON LISTERIA MONOCYTOGENES IM PATIENTENKOLLEKTIV VIRALE ERREGER EPSTEIN- BARR- VIRUS CYTOMEGALIEVIRUS TOXOPLASMA GONDII BAKTERIELLE ERREGER YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS, YERSINIA ENTEROCOLICA BARTONELLA HENSELAE MYKOBAKTERIUM TUBERCULOSIS, MYKOBAKTERIUM AVIUM 29 4.1.2 4.2 4.2.1 4.2.2 4.3 4.3.1 4.3.2 4.4 4.5 4.5.1 4.5.2 4.5.3 3 1 30 31 32 32 35 35 36 37 38 39 39 40 41 4.6 4.7 MEDIKAMENTENANAMNESE 42 ÜBERTRAGUNG DES DIAGNOSTISCHEN ALGORITHMUS VON DENK AUF DAS KÖLNER KOLLEKTIV 42 5 DISKUSSION 46 5.1 5.2 5.2.1 5.2.2 5.2.3 5.2.4 5.2.5 5.2.6 5.2.7 5.2.8 5.2.9 5.2.10 5.3 HEPATISCHE GRANULOME, INZIDENZ UND DIAGNOSE URSACHEN PRIMÄR BILIÄRE ZIRRHOSE (PBC) SARKOIDOSE TUBERKULOSE EBV CMV BARTONELLA HENSELAE LISTERIA MONOCYTOGENES HEPATITIS B TREPONEMA PALLIDUM YERSINIA PSEUDOTUBERKULOSIS SYSTEMATISCHE AUSWERTUNG NACH DEN VON DENK ETABLIERTEN KRITERTIEN 46 47 47 48 49 49 50 51 52 53 53 54 6 ZUSAMMENFASSUNG 57 7 LITERATURVERZEICHNIS 58 8 VORABVERÖFFENTLICHUNG 66 9 LEBENSLAUF 67 2 55 1 Einleitung 1.1 Granulome in der Leber Bei der Diagnostik und dem Management von Patienten mit Lebererkrankungen hat die Leberbiopsie - auch angesichts sich weiterentwickelnder bildgebender Verfahren, verfeinerter Untersuchungsmethoden und eines rasant zunehmenden Wissens über molekularbiologische Zusammenhänge – über Jahrzehnte ihre zentrale Bedeutung behalten. Die Leberbiopsie ist ein etabliertes diagnostisches Mittel zur Untersuchung von Lebererkrankungen. Leberbiopsien liefern ein breites Spektrum morphologischer Befunde, wovon die granulomatösen Läsionen ein immer wieder zu beobachtendes Problem darstellen. In der wissenschaftlichen Literatur wird von einer Häufigkeit zwischen 1,6% - 14,6% in unselektiven Leberbiopsien berichtet (10, 11, 27, 35, 42, 48, 59, 61, 65, 72, 84, 85, 97). Zur Klärung der Ätiologie hepatischer Granulome gehört eine sorgfältige histopathologische Begutachtung der einzelnen Granulome und des umgebenden Lebergewebes (z.B. auf Anzeichen für Hepatitis, Cholangitis, unspezifische Entzündungsreaktionen oder Gallengangsobstruktion). Da es aber eine Vielzahl von Ursachen der Granulomentstehung gibt, kann die Histomorphologie allein nicht in allen Fällen zur endgültigen Eingrenzung der Ätiologie führen. So ist die Quote hepatischer granulomatöser Läsionen ungeklärter Ätiologie (sogenannte idiopathische granulomatöse Hepatitis) in der Literatur mit 15-50% angegeben (58, 59, 61, 65, 84). Bezüglich der histopathologischen Diagnostik hat Denk (13) Leberbiopsien mit Granulomen in vier verschiedene Gruppen zusammengefasst und somit eine Interpretationshilfe für den befundenden Pathologen erstellt: 1 See the cause. Das auslösende Agens ist histologisch im Granulom nachweisbar, wie z.B. Eier von Schistosoma oder der Nachweis von säurefesten Stäbchen durch Spezialfärbungen. 2 Know the cause. Für eine korrekte histologische Interpretation müssen auch die klinischen Begleitumstände bekannt sein. So kann davon 3 ausgegangen werden, dass bei einem Patienten mit einer bekannten aktiven Lungentuberkulose histologisch nachweisbaren verkäsenden hepatischen Granulomen fast ausschließlich auch durch Mykobakterium tuberkulosis verursacht wurden, auch wenn im Granulom selber keine Mykobakterien nachweisbar sind. Ebenso kann z.B. von einer primär biliären Zirrhose (PBC) ausgegangen werden, wenn Granulome und lymphozytäre Infiltrationen an zerstörte Gallengänge angrenzen und die v. a. weiblichen Patienten in mittleren Jahren Juckreiz, erhöhte Serumspiegel alkalischer Phosphatase und antimitochondriale Antikörper (AMA) aufweisen. 3 Suspect the cause. Obwohl eine klare Diagnose fehlt, lässt sich anhand von klinischer und pathologischer Beobachtung auf die Diagnose schließen. So lässt die Beobachtung von Nekrosen in Granulomen z.B. an Tuberkulose, Histoplasmose oder Coccidioidomykose denken. 4 Cause is unknown. Dies ist leider die größte Gruppe, der Nachweis von Granulomen schränkt die möglichen Diagnosen lediglich (ein wenig) ein. Hier sollten unter Berücksichtigung der geographischen und klinischen Situation weiter Untersuchungen folgen. Insbesondere eine Tuberkulose, die immer noch zu einer häufigen Infektionskrankheit zählt, sollte ausgeschlossen werden. Diese Gruppierung spiegelt die besondere Problematik der Analyse hepatischer Granulome im Alltag des diagnostisch tätigen Pathologen und des einsendenden Klinikers wider. In der wissenschaftlichen Literatur wird von einer Granulom-Häufigkeit zwischen 1,6% - 14,6% in unselektiven Leberbiopsien berichtet (10, 11, 27, 35, 42, 48, 59, 61, 65, 72, 84, 85, 97). Verschiedene Studien zu Granulomen und granulomatöser Hepatitis wurden publiziert, diese beschäftigen sich mit dem breiten Spektrum der auslösenden Ursachen und zeigen soziokulturelle und regionale Unterschiede auf. Studien aus Europa und den USA ist zu entnehmen, dass die Sarkoidose und die primär biliäre Zirrhose (PBC) (15, 27, 48, 59, 61, 84, 97) die führenden Ursachen für Granulome in der Leber sind. Gukian (35) und Ishak (42, 43) hingegen beschreiben in ihren Studien Tuberkulose und Sarkoidose als 4 Hauptursachen. PBC und Tuberkulose sind in nahezu allen vorliegenden Studien als häufigste Ursachen der Granulomentstehung dokumentiert. Abweichend von diesen Ergebnissen ist die Studie von Satti (85) aus Saudi Arabien zu nennen, bei der in 54% der Fälle eine Schistosomiasis (20, 37) als ursächlich für die beobachteten Granulome beschrieben wurde, gefolgt von Tuberkulose (32%) und Brucellose (6,7%). MacMaster (60) geht hingegen davon aus, dass etwa ein Viertel aller granulomatösen Hepatitiden Medikamenten- induziert sind (45). Die bisher genannten Studien beschäftigen sich mit der Ursache von Granulomen bei Erwachsenen, wobei Kinder nicht grundsätzlich ausgeschlossen wurden. Dem gegenüber zeigt Collins (10) in einer rein pädiatrischen Studie, dass bei Kindern in 65% der Fälle eine Histoplasmose nachgewiesen werden konnte. 1.2 Die Charakteristika der granulomatösen Entzündung Die granulomatöse oder spezifische Entzündung ist eine Form der chronischen Entzündung, die durch Persistenz des Entzündungsreizes hervorgerufen wird. Morphologisch ist diese besondere Entzündungsform durch die Ausbildung von Granulomen gekennzeichnet. Granulome sind knötchenartige Veränderungen, die histologisch Epitheloidzellen eine mit Ansammlung von phagozytiertem, aktivierten nicht Makrophagen abbaubarem Material und und gegebenenfalls anderen Zelltypen zeigen. Epitheloidzellen sind Makrophagen (33, 46, 68), die die Fähigkeit zur Phagozytose partiell oder komplett verloren haben, dafür aber z.B. Interleukine oder Angiotensin- convertierendes Enzym (ACE) sezernieren können (13). Die Umwandlung vom Makrophagen zur Epitheloidzelle entspricht einer allergischen Reaktion vom Spättyp (Typ IV), bei der es durch Lymphokinfreisetzung antigenstimmulierter T- Lymphozyten zu einer Aktivierung bzw. Proliferation von Makrophagen kommt. Durch Verschmelzung von Epitheloidzellen und Makrophagen entstehen Riesenzellen, die durch ihre Größe, aber vor allem durch ihre Mehrkernigkeit gekennzeichnet sind. 5 An der Bildung von Granulomen können auch Lymphozyten beteiligt sein. Sie umgeben vor allem die Epitheloid- und Riesenzellen als Lymphozytensaum. Zusätzlich finden sich auch andere Zellen, wie z. B. Plasmazellen, eosinophile Granulozyten und Fibroblasten, welche vor allem im Stadium der Abheilung zu sehen sind (13). Auch kollagene Fasern sind in unterschiedlichem Maße an der Bildung von Granulomen beteiligt, sie können die Granulome vom umgebenden Gewebe abgrenzen oder sie durchziehen. Bei Erkrankungen wie z. B. Sarkoidose oder Schistosomiasis enthalten die Granulome dichte kollagene Fasern, wohingegen bei Granulomen die durch Medikamenten- Hypersensitivität entstanden sind kaum Kollagen zu finden ist (13). Je nach Größe und Ätiologie des Granuloms können in seinem Inneren auch Nekrosen beobachtet werden. So können z.B. fibrinoide Nekrosen bei der rheumatoiden Arthritis beobachtet werden. Fibrillogranuläre („verkäsende“) Nekrosen sind typisch für Tuberkulose, aber auch für Lues, Histoplasmose oder Sarkoidose. Eine Yersinieninfektion kann eine purulente Nekrose verursachen (13). Die Beteiligung von Fibrin an der Bildung eines Granuloms kann oft auch schon makroskopisch erkannt werden. Am eindrucksvollsten ist dies bei dem Fibrinring- oder Doughnut- Granulom zu erkennen, welches zuerst bei QFieber beschrieben wurde (13, 70, 91). In den letzten Jahren wurden weitere Ursachen für die Entstehung von Fibrinring- Granulomen beschrieben, so dass einige Autoren dieses als nicht spezifisch einstufen (23, 56, 66, 70, 80, 96). 1.2.1 Granulommorphologie Die Morphologie von Granulomen hinsichtlich der verschiedenen Zelltypen, Nekrosen oder der Ausbildung eines Saums aus kollagenen Fasern kann stark variieren (40). Die Ausprägung dieser Kriterien kann einen Hinweis auf das auslösende Agens geben, ist aber nicht allein dafür beweisend. Nach der zellulären Zusammensetzung kann man verschiedene Typen unterscheiden: Das Epitheloidzell-Granulom besteht aus Epitheloidzellen, Langhans- Riesenzellen und einem peripheren Lymphozytenwall. Granulome dieser Art 6 sieht man z. B. bei der Tuberkulose, bei der, im Gegensatz zur Sarkoidose, zentral eine zell- und kernfreie fibrillogranuläre („verkäsende“) Nekrose charakteristisch ist. Fremdkörper-Granulome bestehen aus Makrophagen, die Fremdkörper phagozytiert bzw. umschlossen haben und zum Teil zu FremdkörperRiesenzellen konfluiert sind. Ihre Zellkerne umgeben das fremde Material (13). Diese Granulome sind häufig von einem Fibrosering umgeben. Es kann zwischen Fremdkörpern exogener (z. B. Nahtmaterial, Silikon) und endogener (z. B. Hornschuppen, Cholesterinkristalle) Herkunft unterschieden werden. Kennzeichnend für Pseudotuberkulose-Granulome ist eine zentrale Abszedierung (granulomatös- abszedierende Entzündung) und das Vorkommen neutrophiler Granulozyten innerhalb des Granuloms. PseudotuberkuloseGranulome werden z.B. hervorgerufen durch einige Pilze oder Bakterien (z.B. Yersinien). Das rheumatische Granulom tritt unter anderem beim rheumatischen Fieber und der chronischen Polyarthritis auf und zeigt zentral eine fibrinoide Nekrose, um welche die Epitheloidzellen radiär angeordnet sind. Einige dieser Epitheloidzellen lassen einen rautenförmigen Zellkern erkennen, sie werden nach ihre Entdecker als Anitschkov- Zellen bezeichnet. 1.3 Spezielle Pathologie der Granulome in der Leber Verschiedene Autoren haben sich mit der histopathologischen Klassifikation hepatischer Granulome befasst (10, 12, 13, 55). Zu den von ihnen herausgestellten vier Haupttypen gehören: nicht- verkäsende, verkäsende, Lipogranulome und Fibrinring- Granulome. Nicht- verkäsende beobachtenden Granulome Granulomtypen gehören in der zu den Leber. am Sie häufigsten bestehen zu aus Epitheloidzellen, Lymphozyten (meist peripher zu finden) und mehrkernigen Riesenzellen. Dieser Typ ist vor allem charakteristisch für Sarkoidose, zeigt sich 7 aber auch bei medikamentös- induzierter Lebererkrankung, Vaskulitis, primär biliärer Zirrhose und diversen infektiösen Erkrankungen. Verkäsende (fibrillogranuläre) Granulome sind charakteristisch für eine Infektion mit Mykobakterium tuberkulosis, sind aber nicht immer zu sehen. Lipogranulome zeigen Makrophagen oder Epitheloidzellen, die Fettvakuloen umschließen. Sie werden häufig im Rahmen einer Steatose und Steatohepatitis gesehen. Fibrinring- Granulome zeigen eine zentrale Fettvakuole, die ringförmig von Fibrin und Epitheloidzellen umgeben ist. 1.3.1 Unterschiede einzelner Granulome und granulomatöser Hepatitis Granulomatöse unterschiedlicher Läsionen Anzahl in der Leber eingestreute können Läsionen grundsätzlich ohne als in wesentliche Entzündungsinduktion oder auch als granulomatöse Hepatitis mit hepatitischen Veränderungen, deren wesenliches Merkmal die Granulome sind, in der Leber auftreten. Diese Unterschiedlichkeit spiegelt sich in der Diktion: „Leber mit Granulomen“ versus „granulomatöse Hepatitis“ wider. Während bei dem erst genannten Bild die Granulome häufig einen Zufallsbefund darstellen können, besteht bei einer granulomatösen Hepatitis zumeist eine klinische Symptomatik mit Fieber unklarer Ursache, erhöhten Transaminasen und Hepato(spleno)megalie oder portaler Hypertension (55). Im Leberpunktat sind zahlreiche Granulome sichtbar, die meist in den Portalfeldern, aber auch im übrigen Parenchym gelegen sind. Es zeigt sich nicht das „typische“ Bild einer Hepatitis (diffuse Entzündungsreaktion im Parenchym und Infiltrationen in den Portalfeldern), sondern das einer granulomatösen Hepatitis. 8 1.3.2 Ätiologie hepatischer Granulome Zahlreiche infektiöse und nicht infektiöse Ursachen führen zur Ausbildung granulomatöser Läsionen in der Leber. Diese Ursachen zeigen eine regionale und soziokulturelle Variabilität. Zu den infektiösen Ursachen gehören Bakterien, Viren, Parasiten oder Myzeten. Unter die nicht infektiösen Ursachen fallen z.B. Überempfindlichkeitsreaktionen, Autoimmunerkrankungen, Fremdkörpermaterial, Noxen, Neoplasmen und andere (s. Tabelle 1). Das weit gestreute Ursachenspektrum erfordert breit gefächerte klinische und pathologische Untersuchungen, wie z.B. eine ausführliche Medikamentenanamnese, Blutkulturen und serologische Untersuchungen. Von Seiten der Pathologie sind Spezialfärbungen, immunhistochemische und molekularbiologische Untersuchungen (z.B. PCR) von Leberbiopsien indiziert (75). Morphologische Unterschiede in der histopathologischen Betrachtung können die Differentialdiagnosen zwar einschränken, in circa einem Drittel der Fälle bleibt die Diagnose allerdings ungewiss (22). Lefkowitch (55) hat Leitlinien aufgestellt, die die pathologische Begutachtung hinsichtlich der Ätiologie hepatischer Granulome im Zusammenhang mit der klinischen Situation des Patienten erleichtern sollen: 1. Die Lokalisation der Granulome (portal, periportal oder parenchymatös) ist von diagnostischer Bedeutung. Ebenso sollte eine eventuelle räumliche Beziehung zu Gallengängen und in den Portalfeldern gelegenen Leberarterien und -venen beachtet werden. 2. Der Granulomtyp (s.o.) spielt eine Rolle. Es sollte ein Augenmerk darauf gelegt werden, ob Nekrosen, Eier, Fremdmaterial, Fettvakuolen oder Fibrin zu sehen sind. 3. Es können auch Komplikationen auftreten, die durch Granulome verursacht werden. So kann es durch Zerstörung von Gallengängen und Leberarterien zu ischämischer Nekrose, Fibrose und Zirrhose kommen. 9 Ursachenspektrum Hepatischer GranulomeInfektiöse Ursachen Bakteriell Viral Immunologische Erkrankungen Aktinomyces CMV Immundefizienz Bartonella henselae EBV Chron. Granulom. Borrelia Hepatitis A Erkrankung Kindesalter Botryomycosis Hepatitis B Hypogammaglobinämie Brucellose Hepatitis C Polymyalgia rheumatica Granuloma inguinale Varizella Primär biliäre Zirrose Listeriose Primär sklerosierende Melioidose Cholangitis Nocardiose Rheumatisches Fieber Proprioniosis Lupus erythematodes Staphylokokken Vaskuläre Erkrankungen Syphilis Allerg. Granulomatose Tularaemie Nekrotisierende Angiitis Typhus Polyarteriitis nodosa Morbus Whipple Arteriitis temporalis Yersinia enterocolitica Wegener Granulomatose Mykobakteriell Tuberkulose Atypische Mykobakterien BCG Immunisierung, BCG Immuntherapie Lepra Parasitär Amöbiasis Ancylostoma Capillariasis Enterobius vermicularis Schistosomiasis Leishmaniose Giardiasis Strongyloidiasis Toxocariasis Rickettsien Boutonneuse Fieber Q Fieber Rickettsia conorii Fremdmaterial Anthrakotisches Pigment Barium Thorotrast Silikon Mineralöl Neoplasien Extrahepatische Tumoren Hepatozelluläres Adenom Morbus Hodgkin Non-Hodgkin Lymphome Verschiedene Gallengangsobstruktion Chronische Colitis Eosinophile Enteritis Jejuno-ilealer Bypass Porphyria cutanea tarda Sarkoidose Chlamydien Lymphopathia venereum Psittacose Fungi Aspergillose Blastomycose Candidiasis Coccidioidomycose Cryptococcus Histoplasmose Mucormycose Paracoccidiomycose Tabelle 1: Hypersensitivität Medikamente Metall (Beryllium, Kupfer, Gold) Ursachenspektrum hepatischer Granulome (7, 45, 55) 10 1.4 Morphologie hepatischer Granulome Aufgrund der Vielfältigkeit der Ursachen, die zur Granulomentstehung führen können, ist bei der diagnostischen histopathologischen Beurteilung eine genaue Kenntnis der speziellen Morphologie und ihrer Unterschiede notwendig. Im Folgenden sollen exemplarisch drei verschiedene Granulomtypen, welche die vier führenden hepatischen Granulomursachen begleiten morphologisch charakterisiert werden: 1. Granulome bei primär biliärer Zirrhose, 2. Granulome bei Tuberkulose, 3. Granulome bei Sarkoidose und 4. Granulome bei Medikamenten-Einnahme. 1.4.1 Morphologie von Granulomen bei primär biliärer Zirrhose Die primär biliäre Zirrhose (PBC) entspricht dem zirrhotischen Endstadium einer chronischen nichteitrigen destruierenden Cholangitis (55, 92). Es handelt sich um eine Autoimmunerkrankung mit Bevorzugung des weiblichen Geschlechtes (w:m = 9:1). Meist sind mittelalte Patientinnen betroffen. Autoantikörper gegen antimitochondriale Antikörper (AMA) werden häufig nachgewiesen. Bei der Diagnose und der Feststellung des Stadiums spielt die Leberbiopsie eine entscheidenden Rolle. In den Leberbiopsien von circa 25% aller Patienten mit PBC lassen sich Granulome finden (81). Diese sind vor allem in den lymphozytär infiltrierten und abgerundeten Portalfeldern lokalisiert und zeigen einen Bezug zu den Gallengängen (55). Diagnostisch wegweisend im Stadium I der PBC ist die sogenannte floride Gangläsion, bei der im Zentrum eines Granuloms Anteile oder Reste eines zugrundegehenden und entzündlich infiltrierten Gallenganges zu finden sind. Die Granulome sind hauptsächlich in den Portalfeldern lokalisiert, aber auch im Parenchym zu finden. Die Granulommorphologie zeigt ein weites Spektrum von wenig umschriebenen, kleinen histiozytären Aggregaten bis zu gut definierten, größeren von einem 11 Lymphozytenwall umgebenen epitheloidzelligen Granulomen. Langhans Riesenzellen können vorkommen, Nekrosen sind eher seltener zu sehen (100). 1.4.2 Morphologie von Granulomen bei Tuberkulose Mykobakterium tuberkulosis ist ein säurefestes Stäbchen, welches 1882 von Robert Koch zum ersten Mal beschrieben wurde. Die Erstinfektion verläuft meist als Lungentuberkulose, vor allem bei insuffizienter Immunabwehr kann aber auch eine Miliartuberkulose mit generalisiertem Organbefall auftreten. Hepatische Granulome, die aufgrund einer Infektion mit Mykobakterium tuberkulosis entstehen, sind sowohl in den Portalfeldern als auch im Parenchym zu finden. Die Granulome sind meist größer und können verschieden gut umschrieben sein. Es handelt sich um epitheloid- und riesenzellige Granulome, wobei Langhans- Riesenzellen typisch sind. Diese zeichnen sich durch zahlreiche in der Form eines Cs angeordnete Zellkerne aus und entstehen bei der Verschmelzung von Epithloidzellen. Eine fibrillogranuläre („verkäsende“) Nekrose ist in 29% der Proben zu entdecken (42). Verkäsungen sind allerdings nicht spezifisch für Tuberkulose, sie können auch bei Lues, Candidiasis, Cryptococcose, Histoplasmose und Coccidioidomycose auftreten (42). Tuberkelbakterien oder sogenannte säurefeste Stäbchen lassen sich mit der Ziehl- Neelsen- (ZN-) Färbung im Gewebe darstellen. Allerdings sind sie bei Leberbiopsien deutlich seltener histologisch nachzuweisen (13%) als in Sektionsproben (31%) (35). Somit schließt eine negative ZN- Färbung eine Tuberkulose nicht mit letzter Sicherheit aus. 1.4.3 Morphologie von Granulomen bei Sarkoidose Die Sarkoidose ist eine granulomatöse Systemerkrankung unbekannter Ätiologie (102), die sich in über 90% in der Lunge manifestiert, aber auch alle anderen Organe (v. a. Lymphknoten und Leber) befallen kann. Die Leber kann auch als einziges Organ befallen sein, ebenfalls kann ein Leberbefall dem 12 Lungenbefall vorausgehen. Es ist in zahlreichen Studien beschrieben, dass die Sarkoidose eine häufige Ursache hepatischer Granulome darstellt (3, 10, 15, 27, 48, 59, 61, 84, 97). Morphologisch handelt es sich um nicht verkäsende Granulome (48). In der Leber sind Sarkoidose- Granulome in den Portalfeldern sowie periportal zu finden, dort liegen sie häufig in blumenkohlartigen Klustern zusammen (43). Die Granulome enthalten Riesenzellen vom Langhans-Typ und können Asteroid- und Schaumann- Körperchen enthalten. Gallengangsläsionen, ähnlich denen bei primärer biliärer Zirrhose (83) oder akuter Cholangitis (15) durch mechanische Gallengangsobstruktionen sind in seltenen Fällen auch zu beobachten. Portale und periportale Fibrose, Fibrosebrücken und sogar zirrhotischer Umbau der Leber kann histologisch beobachtet werden (15, 42). 1.4.4 Morphologie von medikamenten-induzierten Granulomen Eine Granulombildung oder granulomatöse Entzündung in der Leber kann als Folge eines medikamentös- toxischen Leberparenchymschadens auftreten (44, 45). Mehr als 60 Medikamente, die zur Granulombildung führen können, sind bekannt (45). Dabei können Granulome in der Leber als isoliertes Phänomen oder in Zusammenhang Leberparenchymveränderungen mit wie anderen akuter oder toxisch induzierten chronischern Hepatitis, Cholestase und Steatose auftreten. In einer Studie über Leberbiopsien mit hepatischen Granulomen wurden Medikamente in 30% als Ursache der Granulmentstehung ermittelt (60). Eindeutige morphologische Kriterien medikamentös induzierter Granulome gibt es nicht, allerdings lässt der Charakter der inflammatorischen Reaktion Rückschlüsse auf die zugrundeliegende Pathogenese ziehen. Eine prominente Infiltration der Granulome durch eosinophile Granulozyten weist auf eine immunologische Idiosynkrasie hin (44). Ein typisches Medikament, dass Granulome in der Leber induzieren kann, ist Allopurinol, morphologisch sind in diesem Zusammenhang auch Fibrinring-Granulmone beschrieben. Die Anwendung von BCG (39) als Impfstoff oder Therapeutikum, kann Granulome in der Leber induzieren, in diesem Fall könnte ein Nachweis säurefester Stäbchen mittels Ziehl- Neelsen 13 Färbung möglich sein (82). Medikamente, die Ursache einer hepatischen Granulombildung sein können, werden in der Tabelle 2 aufgelistet. Allopurinol Orale Kontrazeptiva Amiodaron Oxazillin Amoxizillin-Clavulansäure Oxyphenbutazon Aprinidin Papaverin Aspirin Penizillin BCG Vaccination/Therapie Phenazone Carbamazepin Phenprocoumon Cephalexin Phenylbutazon Chlorpromazin Phenytoin Chlorpropamid Procainamid Dapsone Procarbazin Diazepam Pronestyl Diltiazem Quinidine Dimethicone Ranitidin Disopyramid Salizylazosulfapyridin Feprazone Sulfadiazine Glibenclamid Sulfadimethoxine Gold Sulfadozine-Pyrimethamine Halothan Sulfanilamide Hydralazin Sulfasalazine Interferon Sulfasuxidine Isoniazid Sulfathiazole Methimazol Tetrahydroaminoacridine Methotrexat Tocainide Methyldopa Tolbutamid Nitrofurantoin Trichlormethiazide Tabelle 2: Medikamente, die granulomatöse können (101) 14 Leberläsionen induzieren 2 Fragestellung der Arbeit Hepatische Granulome diagnostiziertes sind Phänomen ein im Alltag in unselektiven eines Pathologen häufig Leberbiopsien. Durch lichtmikroskopische Untersuchungen und Evaluation klinischer Angaben (serologische lassen Untersuchungsergebnisse, sich in einigen Fällen die Medikamentenanamnese, zugrunde Klinik) liegenden Erkrankungen diagnostizieren („know the cause“). Nichts desto trotz kann für eine Vielzahl von Granulomen auf diesem Wege keine Ursache gefunden werden („cause unknown“). Mit Fortschritten auf dem Gebiet der Molekularpathologie finden moderne molekularbiologische Untersuchungsmethoden immer mehr Eingang in die diagnostische Pathologie. Mit Hilfe dieser modernen Diagnostik gelingt es ergänzend zu lichtmikroskopischen und klinischen Untersuchungen das auslösende Agens (Virus, Bakterium) zu identifizieren. Die vorliegende Promotionsarbeit repräsentiert ein großes Patientenkollektiv mit hepatischen Granulomen aus der Leberdatei des Instituts für Pathologie der Universitätsklinik zu Köln, einem deutschlandweiten Referenzzentrum für Leberpathologie, aus einem über acht Jahre laufenden Beobachtungszeitraum. Ziel dieser Studie war es, die folgenden Fragen zu klären: • Wie hoch ist die Inzidenz hepatischer Granulome im Einsendegut des Instituts für Pathologie der Universitätsklinik zu Köln? • Ist die Inzidenz vergleichbar mit vorausgegangenen Studien in europäischen und außereuropäischen Ländern? • Welche Diagnosen lassen sich als Ursache für Granulome stellen? Dabei wird ein interdisziplinärer Ansatz gewählt, der eine histopathologische Analyse, eine Evaluation klinischer und serologischer Daten und moderne molekularpathologische Methoden umfasst. • Wie ist die Häufigkeitsverteilung der Diagnosen (einschließlich der primär biliären Zirrhose und Sarkoidose), die zur Granulomentstehung führen? 15 Diese Fragestellungen werden bearbeitet, indem der von Denk (13) entwickelte Algorithmus der Granulmon- Diagnostik auf das hier untersuchte Kollektiv übertragen wird. 16 3 Material und Methoden 3.1 Auswahl des Untersuchungsmaterials Die zu untersuchenden Fälle wurden aus dem Leberregister des Institutes für Pathologie der Universität zu Köln rekrutiert. Es wurden Leberbiopsien, Leberkeilexidate und auch Resektate zwischen 1996 und 2004, mit der Diagnose Granulome in der Leber, granulomatöse Hepatitis oder Cholangitis gesammelt. Biopsien, die lichtmikroskopisch Lipogranulome (Hinweis auf Steatosis hepatis) oder Mineralöl-Granulome (Lipidtropfen umgeben von Makrophagen und Lymphozyten) zeigten wurden aus der Studie ausgeschlossen. 3.2 Histopathologische Begutachtung Die histopathologische Beurteilung erfolgte lichtmikroskopisch. Formalinfixiertes und paraffiniertes Lebergewebe wurde in 6µm dicken Gewebsschnitten den gängigen Färbeverfahren unterzogen. Sämtliche Proben lagen in den folgenden Färbungen zur Beurteilung vor: H&E (Haematoxylin und Eosin), DPAS (Perjodsäure-Schiff-Reagenz nach Diastase), VG (Van Gieson), Fe (Eisen). Ziehl- Neelsen-Färbung wurde in 20, Whartin-Starry Färbung in 5 Fällen durchgeführt. Granulome wurden definiert als fokale Zusammenballung von Makrophagen und mehrkernigen Riesenzellen, umgeben von einem Lymphozytenwall. Die histomorphologischen Veränderungen wie Anzahl und Größe der Granulome, Lokalisation, Zellzusammensetzung, Nekrosen, Verkäsung und Begleiterscheinungen wurden quantifiziert und dokumentiert. 17 Granulomlokalisation portal Parenchym Parenchym/ portal Granulomzahl einzelne mehrere viele Granulommorphologie epitheloidzellig histiozytär epitheloidzellig/ histiozytär Nekrose ja nein Granulom- unabhängige Entzündung ja nein gering Granulom- unabhängige Fibrose ja nein gering Granulomfasern ja nein gering Granulomgröße klein mittel groß Langhanszellen ja nein Tabelle 3: 3.3 histomorphologische Begutachtung Erregernachweis mittels DNA nPCR Die Erregernachweise wurden auf genomischer Ebene durchgeführt. Dafür wurde die Gesamt- DNA aus allen Proben isoliert und eine erregerspezifische nested Polymerasekettenreaktion (nPCR)- Analyse angeschlossen. 18 3.3.1 DNA-Extraktion aus formalinfixierten, paraffineingebetteten Gewebeproben Von den Paraffinblöcken wurden mit einem Mikrotom (Leica, Nussloch) je zwei bis drei 7,5 µm dicke Schnitte mit einem Einwegmesser angefertigt und in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß gegeben. Vor jedem gewebehaltigen Block wurden von einem leeren Paraffinblock zwei bis drei 7,5 µm dicke Schnitte angefertigt und in ein separates Reaktionsgefäß überführt. Diese dienten in der gesamten folgenden Prozedur als Leerprobe zur Kontrolle kontaminationsfreien Arbeitens. Zur Entparaffinierung wurden die Proben in einem Heizblock (Thermomixer compact Eppendorf, Hamburg) für fünf Minuten auf 65°C erwärmt und nach kurzem Zentrifugieren (Centrifuge 5417 C Eppendorf, Hamburg) mit 500 µl Xylol versetzt. Die Proben wurden gevortext (Vortex Genie 2, Scientific Industries), bei 65°C fünf Minuten geschüttelt und zwei Minuten bei 13000 x g zentrifugiert und der wässrige Überstand wurde abpipettiert. Dieser Vorgang wurde dreimal wiederholt. Anschließend wurde 500 µl Ethanol 100% zugegeben, gevortext, zwei Minuten bei 13000 x g zentrifugiert und der Überstand abgenommen. Dieser Prozess wurde zweimal durchgeführt. Danach wurde der Überstand abgenommen und das aus dem Paraffin gelöste Gewebsmaterial 30 Minuten bei 37°C im Brutschrank (Memmert) getrocknet. Für die weitere DNA-Exktraktion wurden pro Ansatz 295 µl Cell Lysis Solution (Puffer) und 5 µl Proteinase K (500 µg/ml Proteinasen K, Invitrogen, Karlsruhe) zugegeben. Für den Nachweis von Mykobakterien wurde von jeder Gewebeprobe eine gesonderte DNA-Extraktion durchgeführt, bei der anstelle des Cell Lysis Solution Puffers 300µl eines Proteinase - K - Puffers, bestehend aus 20mM Tris- HCl - Puffer, 5 mM EDTA und 1% SDS zugegeben wurde. Die Proben wurden über Nacht bei 65°C in einen Schüttler gegeben. Zur Extraktion (mittels DNA-extraction-kit, Purgene, Minneapolis, USA) wurden die Reaktionsgefäße am darauffolgenden Tag auf Raumtemperatur abgekühlt und kurz zentrifugiert. Anschließend wurden je 100 µl Protein Precipitation Solution zugegeben, die Proben für fünf Minuten auf Eis gestellt und zwei Minuten bei 13000 x g zentrifugiert, um die Proteine auszufällen. Der wässrige Überstand, in dem die DNA enthalten war, wurde abpipettiert und in ein neues Reaktionsgefäß gegeben. Dieses neue Reaktionsgefäß wurde zuvor mit 0,5 µl 19 Glykogen (10 mg/ml,Roche) und 300 µl Isopropanol gefüllt, um nach Zugabe der wässrig gelösten DNA diese auszufällen. Nach Durchmischen und erneuter Zentrifugation wurde der Überstand abgenommen, mit Ethanol 70% gewaschen und abpipettiert, so dass nur noch ein DNA-Pellet im Reaktionsgefäß verblieb. Das Pellet wurde bei 37°C getrocknet, mit 25 µl Hydratation Solution versetzt und ca. eine Stunde bei 65°C im Schüttler gelöst. Die Lagerung der Proben erfolgte in einem Gefrierschrank (Liebherr Comfort) bei -20°C. 3.3.2 Polymerase- Ketten- Reaktion (PCR) Die PCR wird verwendet, um eine spezifische Nukleinsäuresequenz der DNA zu vervielfältigen. Es besteht die Möglichkeit ein einziges DNA-Molekül mit spezifischen Primern zu amplifizieren. Hierzu wird je ein „forward“- (sense) und ein „reverse“- (antisense) Primer benötigt, die den gewünschten Bereich des DNA- Stranges umgeben, sowie komplementäre Oligonukleotide, die mit Hilfe der Taq- (Thermophilus aquaticus) Polymerase, einer hitztbeständigen DNAabhängigen Polymerase, zu komplementären Nukleotidsequenzen amplifiziert werden. Die eigentliche Vervielfältigung erfolgt in drei Schritten, die in 30- 40 Zyklen wiederholt werden: im ersten Schritt wird die doppelsträngige DNA durch Erhitzen auf 95°C denaturiert und in zwei Einzelstränge zerlegt. Im zweiten Schritt wird die Temperatur auf die spezifische Annealing- Temperatur (zwischen 54°C und 62°C) der Primer gesenkt, bei der die Primer mit den komplementären Sequenzen der Einzelstrang- DNA hybridisieren. Im Elongationsschritt erfolgt bei 72°C die Synthetisierung des komplementären Stranges in 5’ → 3’ Richtung durch die Taq- DNA- Polymerase. Zur Verbesserung der Sensitivität und Spezifität wurde an die erste noch eine zweite PCR angeschlossen, hierbei dienten die Amplifikate der ersten PCR als Ausgangsmaterial (sog. „nested“ PCR). Die Primer der zweiten PCR wurden so gewählt, dass ihre spezifische Sequenz innerhalb des DNA-Abschnittes lag, der von den Primern der ersten PCR flankiert wurde. So wurde erreicht, dass die Nukleotidsequenz der ersten PCR nochmals amplifiziert werden konnte. Bei der 20 PCR II der Listerien- und der Toxoplasmose- PCR wurde nur der ReversePrimer eingerückt, so dass eine „seminested“ PCR durchgeführt wurde. Die Testung auf Yersinia pseusotuberkulosis und Yersinia enterokolika wurde in einer Multiplex- PCR durchgeführt. Das bedeutet, dass in einen Reaktionsansatz die Primerpaare für beide Erregersequenzen gegeben wurden und so nur eine PCR durchgeführt werden musste, um auf beide Erreger gleichzeitig zu testen. Voraussetzung hierfür war die gleiche AnnealingTemperatur der Primer und der Ausschluss von Hybridisierungstendenzen der Primer untereinander. Des weiteren war es notwendig, dass sich die Amplifikate in ihrere Länge unterschieden, um ein spezifisches Ergebnis bei der AgaroseGelelektrophorese zu erhalten. Alle Amplifikate hatten eine Länge von maximal 300 Basenpaaren (bp). 3.3.3 Primerauswahl Die PCR zum Nachweis von Listeria monocytogenes wurde neu etabliert. Mit Hilfe des Programms NCBI/BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) wurde nach geeigneten Primerpaaren für eine nested PCR gesucht. Die Primer sollten eine Größe von 20 bis 25 Basenpaaren (bp) und die gleiche AnnealingTemperatur haben. Das Amplifikat durfte eine Länge von 300 bp nicht überschreiten, da die für die Versuche extrahierte DNA aus Paraffinblöcken gelöst und durch die Entparaffinierung, die Zelllyse und die Extraktion der DNA fragmentiert worden sein konnte. Die zu amplifizierende Sequenz musste jedoch lang genug sein, um spezifisch für einen bestimmten Erreger zu sein. Weiter sollte die Tendenz der Primer zur Selbsthybridisierung (Hair- Pins, etc.) gering sein, d. h. sie durften keine Selbst- Komplementarität besitzen. Ebenso wenig sollten die Primer untereinander hybridisieren. Außerdem sollte hierfür ein möglichst ausgewogenes Verhältnis der Basenpaare A/T und G/C eingehalten werden. Hinsichtlich dieser Vorgaben wurden die Primersequenzen mit dem Programm Net Primer (www.premierbiosoft.com/primerdesign) überprüft. 21 Alle Primer sollten eine absolute Spezifität bezüglich ihrer zu untersuchende Gen- Domäne besitzen, dies wurde mit Hilfe der Gen- Datenbank NCBI/BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) geprüft. Die PCR zum Nachweis von Listeria monocytogenes wurde als semi- nested PCR angelegt, das bedeutet, dass nur der reverse- Primer eingerückt wurde, der forward- Primer war bei der ersten und der zweiten PCR gleich. Listeria monocytogenes- Primer Primername AT Amplifikatlänge 113 bp List- F1 CCC GCC TGG TCT AAC TGG ATTT G 62 °C List- R1 GGA TGG AAA TTT GGT CGG CGT ACA 62 °C List- R2 GTA TAT CGT GAC TTA CGA GG 62 °C 95 bp Tabelle 4: Listerien-Primer mit Sequenz, Temperaturoptimum (AT) und Amplifikatlänge Für die anderen PCRs wurden die, bereits in der Routinediagnostik etablierten Primer verwendet. Tabelle 5 gibt die Sequenzen, die verwendeten Annealing- Temperaturen (AT) bei Einsatz der Primer in die PCR und die Amplifikatlänge wieder. 22 Hämochromatose- Primer Primername AT Amplifikatlänge 234 bp HS1 ATG GAT GCC AAG GAG TTC GAA CC 60°C HaD4 GCC ATA ATT ACC TCC TCA GGC AC 60°C HaD3c TTC TCA GCT CCT GGC TCT CAT C 58°C HS2 TCG AAC CTA AAG ACG TAT TGC CC 58°C 173 bp Cytomegalie- Virus- Primer Primername AT Amplifikatlänge 167 bp CMV 3 GTG ACC AAG GCC ACG ACG TT 58°C CMV 4 TCT GCC AGG ACA TCT TTC TC 58°C CMV 5 GCA GAC TATGTT GAG GAA GG 54°C CMV 6 TCG TTG CAA TCC TCG GTC AC 54°C 117 bp Epstein- Barr- Virus- Primer Primername AT Amplifikatlänge 132 gp 340 s2 GGG ACG TGA AGC AAA GAA AGT G 55°C gp 340 as1 TAG TAC TGC AGT GGG CCT CTC T 58°C gp 340 as2 TGTGCT GAC CCT TCT GCT GCT 55°C EBV-2s ACA TAG GTC TCG GCG TCA TCA T 57°C 111 Bartonella henselae- Primer Primername AT Amplifikatlänge 60 °C 223 bp BH-1F GGT TCA GAT TCA GCC TGT AAC AA BH-1R AAC TCC TAA GGT TAC TGT TTC TCC 60 °C TG BH-2F CTG ATT CAA TTG GTT TGA AGG A 60 °C BH-2R CAA TAC GCT TTG CTA GAT CAC G 60 °C 23 153 bp Yersinia enterocolica- Primer Primername AT Amplifikatlänge 173 bp ail-F1 GAA CTC GAT GAT AAC TGG GGA G 58°C ail-R1 GCC CCC AGT AAT CCA TAA AGG 58°C ail-F2 CGT TTG CTT ATA CTC ATC AGG GA 58°C ail-R2 ATT CGT TGA TGC GGA AAG ATG 58°C 114 bp Yersinia pseudotuberkulosis- Primer Primername AT Amplifikatlänge 145 bp inv-F1 CTT AGG CAA TAT GGG CGT TAT C 58°C inv-R1 CGT GAA ATT AAC CGT CAC ACT C 58°C inv-F2 GAT CAC AAT GAC GGC ACT TAT AG 58°C inv-R2 CAC TTT CAC CGT TAC TGT TGC T 58°C 75 bp Toxoplasmose- Primer Primername Toxo-B1-F1 CTT CGT CCG TCG TAA TAT CAG G AT Amplifikatlänge 62 °C 131 Toxo-B1-R-Cy5 Cy5-ACGTGACAGTGA AGA GAG GAA C 62 °C Toxo-B1-F2 62 °C 105 AT Amplifikatlänge 242 bp CTG TTC TGT TCG CTG TCT GTC T Mykobakterium tuberkulosis- Primer Primername myc F1 TGG CCA TCG TGG AAG CGA CC 66 °C myc R1 GAC CAA ACT CGG CCT GTC CG 66 °C myc F2 TGC GAG CGT AGG CGT CGG TGA 70 °C Myc R2 GAT CTC GTC CAG CGC CGC TTC 70 °C 24 124 bp Mykobakterium avium- Primer Primername AT Amplifikatlänge 180 bp AV-F1 GAC GAG GCC GAA GTC ATC TAC T 58 °C AV-R1 GAA GGA ATT CGT GGG TTT GTC T 58 °C AV-F2 AGT CAT CTA CTG GGG CCT GTA C 58 °C AV-R2 GCG GAT GTA TCA GAT GAC ACA G 58 °C 103 bp HBV (X- Gen) Primername AT Amplifikatlänge 55 °C 205 bp HBV Nr.35 ATC CTK CGC GGGACG TCC TTT GT HBV Nr.38 GAC GTG CAG AGG TGA AGC GAA GTG 55 °C C HBV Nr.36 TAC GTC CCG TCG GCG CTG AAT CC 55 °C HBV Nr.37 GTC CGG CAG ATG AGA AGG CAC AGA 55 °C 150 bp C Tabelle 5: Klassifizierung der PCR- Primer nach Namen, Sequenz, Temperaturoptimum (AT) und Amplifikatlänge 25 3.3.4 Amplifikation der DNA- Sequenzen mittels der PCR Die Amplifikation der PCR- Ansätze erfolgte mit dem Trio ThermalThermocycler der Firma Biometra (Göttingen). Für die Reaktionsansätze der ersten PCR (I) wurde ein Gesamtvolumen von 22,5 µl, für die zweite PCR (II) von 24 µl mit folgenden Komponenten zusammengestellt: PCR I extrahierte DNA bzw. PCR II 2,5µl PCR I - Produkt 1,0µl Wasser 9,0µl 10,5µl 10 µM „forward“- Primer 0,5µl 0,5µl 10 µM „reverse“- Primer 0,5µl 0,5µl 12,5µl 12,5µl Red Taq Ready Mix Tabelle 6: Reaktionsansätze der PCR I und PCR II In die PCR II für Hämochromatose wurde nur 0,5 µl des Amplifikats aus der ersten PCR eingesetzt. Da der Red Taq Ready Mix PCR Reaction Mix with MgCl2 (Sigma, Missouri, USA) aus Taq-DNA-Polymerase, Nukleotiden und Pufferlösung besteht, müssen diese Reagentien nicht gesondert zugefügt werden. Die Amplifikation erfolgte in einem Thermocycler mit Deckelheizung, in welchem die DNA zunächst 5 Minuten bei 94°C denaturiert wurde. Anschließend erfolgte die Vervielfältigung der Nukleotidsequenz in 30- 40 Zyklen (s. Tab. 5), bestehend aus einer 30 sekündigen Denaturierung bei 94°C, 30 Sekunden Annealing bei Temperaturen zwischen 54°C und 62°C (s. Annealigtemperaturen in Tab 3.4) und 30 Sekunden Elongation mit der Synthese des komplementären Stranges bei 72°C. Der letzte Elongationsschritt wurde auf 5 Minuten verlängert, die Proben anschließend abgekühlt und bei 20°C aufbewahrt. 26 PCR I AT PCR II AT Hämochromatose 30 Zyklen 60°C 30 Zyklen 58°C Cytomegalie- Virus 35 Zyklen 58°C 30 Zyklen 54°C Epstein- Barr- Virus 35 Zyklen 58°C 40 Zyklen 57°C Bartonella henselae 40 Zyklen 60°C 35 Zyklen 60°C Yersinia enterocolica 35 Zyklen 58°C 35 Zyklen 58°C Yersinia pseudotuberkulosis 35 Zyklen 58°C 35 Zyklen 58°C Toxoplasmose 35 Zyklen 62°C 35 Zyklen 62°C Mykobakterium tuberkulosis 35 Zyklen 66°C 32 Zyklen 70°C Mykobakterium avium 40 Zyklen 60°C 35 Zyklen 60°C HBV (X- Gen) 35 Zyklen 55°C 35 Zyklen 55°C Listeria monocytogenes 35 Zyklen 62°C 35 Zyklen 62°C Tabelle 7: primerspezifische Zyklenanzahl und Annealingtemperaturen. 3.3.5 Agarosegel- Elektrophorese Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden durch Gelelektrophorese in 3%igen Agarosegelen ihrer Größe nach aufgetrennt. Die Gele wurden hergestellt, indem 3g Agarose (Seakem LE Agarose (Biozym, Oldenburg)) in 100ml 1x TAE-Puffer (40mM Tris, 20mM Na-Acetat, 1,25mM EDTA) durch Erhitzen in einem Mikrowellengerät verflüssigt wurden. Nach Abkühlen auf ca. 65°C wurden 10µl Ethidiumbromid (10mg/ml) zugefügt und das Gel in eine Flachform mit Kammeinsätzen zur Ausbildung von Ladekammern gegossen. Nach 27 Aushärtung des Gels wurde Puffer (TAE 1X) in die Elektrophoresevorrichtung gegossen, so das das Gel vollständig von der Pufferlösung überdeckt war. Die Amplifikate wurden dann durch Einfüllen in die Aussparungen aufgetragen. Hierfür wurden 8µl des PCR-Produktes in die Kammern gegeben. Als Molekulargewichtsstandard diente der Leitmarker pUC 19 DNA/MSPI (Hpa2) Marker 23 (MBI Fermentas), der mit 1µl DNA-Probenpuffer (6x Loading Dye Solution, MBI) und 5µl TAE- Puffer versetzt und in eine Spur des Gels eingefüllt wurde. Der Marker enthält DNA-Fragmente mit den Größen 500 bp, 404 bp, 331 bp, 242 bp, 190 bp, 147 bp und 111 bp: Abbildung 1 : Leitmarker pUC 19 DNA/MSPI (Hpa2) Marker 23 (MBI Fermentas) Die Auftrennung der Fragmente erfolgte bei 120 Volt für ca. 45 min in einfachem TAE-Puffer als Laufpuffer. Die Auftrennung der Banden wurde im UV-Licht bei 302 nm mit Hilfe des Geldokumentationssystems Gel Print 2000i der Firma MWG Biotech dargestellt. 28 4 Ergebnisse 4.1 Zusammenstellung des Patientenkollektivs In einem über acht Jahre (1996- 2004) laufenden Beobachtungszeitraum wurden insgesamt 12161 Lebergewebsproben in der Leberdatei des Institutes für Pathologie der Universität zu Köln registriert (423 Nadelstanzbiopsien, 19 Leberkeilresektionen). Von diesen Fällen zeigten insgesamt 442 Fälle (3,63%) das Bild einer granulomatösen Hepatitis, Cholangitis oder auch einzelner Granulome. 215 dieser Fälle zeigten typische histologische Veränderungen einer primär biliären Zirrhose (entspricht 1,77% aller Leberbiopsien, bzw. 48,64% aller untersuchten granulomatösen Veränderungen). In 37 Fällen (0,7% aller Leberbiopsien und 8,37% der untersuchten granulomatösen Veränderungen) wurde Sarkoidose als Ursache der Granulome diagnostiziert. Bei einem Patienten wurde Q-Fieber festgestellt. Von den noch verbleibenden Fällen wurden solche ausgeschlossen, in denen Lipogranulome oder MineralölGranulome zu erkennen waren. Nach Untersuchung auf PCB, Sarkoidose und Q-Fieber verblieben 189 Biopsien, die anhand detaillierter histopathologischer Analyse, Evaluation klinischer Daten und molekularpathologischer Methoden weitergehend untersucht wurden. 92 Biopsien stammten von Männern, 97 von Frauen. Das Durchschnittsalter lag bei 52 Jahren (5 bis 78 Jahre). Die Leberenzyme GOT und GPT waren in 102 bzw. 98 Fällen verfügbar und lagen zwischen 20 bis 518 U/l für GOT und 18 bis 582 U/l für GPT. Klinisch mitgeteilte positive Luesserologie (n=2), positive Serologie für die Katzen-Kratz-Krankheit (n=1) und M. Hodgkin (n=1) könnten die bei diesen Patienten gesehenen granulomatösen Läsionen erklären. Wohingegen Hepatitis B Serostatus (n= 87) mit chronischer Hepatits B in zwei Fällen, Hepatitis C (n= 86) mit chronischer Hepatitis C bei zwei Patienten, HIV (n=1), Colitis ulcerosa (n=1) und akute myeloische Leukämie (n=1) nicht die 29 Entstehung der beobachteten Granulome erklären. Fünf der untersuchten Patienten hatten febrile Temperaturen, in 35 Fällen war eine Medikamentenanamnese vorhanden. Demographische und klinische Daten des Studienkollektivs sind in Tabelle 8 zusammengefasst. Anzahl der Fälle 189 Männer 92 Frauen 97 Alter 52 (5 bis 78) GOT verfügbar 102 GOT erhöht > 30 U/l 98 GPT verfügbar 98 GPT erhöht > 30 U/l 97 HCV- Serologie verfügbar 86 Serologie chronischer Hepatitis C 2 HBV- Serologie verfügbar 87 Serologie chronischer Hepatitis B 2 HIV- Serologie 1 Lues II- Serologie 2 Serologie der Katzen- Kratz- Krankheit 1 Colitis ulcerosa 1 akute myeloische Leukämie (AML) 1 Fieber 5 Medikamente 35 Tabelle 8: demographische und klinische Daten des Studienkollektivs 4.1.1 Hepatische Granulome mit typischen oder verdächtigen histopathologischen Läsionen In 215 Fällen (1,77% aller Biopsien und 48,64% aller Biopsien mit granulomatösen diagnostiziert Läsionen) werden. lichtmikroskopische konnte eine Diagnostisch Erscheinungsbild primär biliäre wegweisend von ist periduktalen Zirrhose das (PBC) typische Granulomen mit Gallengangszerstörungen und lymphoplasmazytären portalen Infiltrationen als 30 zirrhotisches Endstadium einer chronischen nichteitrigen destruierenden Cholangitis. Dieses Bild der PBC konnten wir in 174 Fällen feststellen. In 41 Fällen war eine Cholangitis mit portalen Granulmonen, aber ohne Gallengangszerstörung zu erkennen. Für alle diese Patienten mit PBC konnte anhand klinischer oder laborchemischer Daten entweder eine Erhöhung der antimitochondrialen Antikörper (AMA) oder antinukleären Antikörper (bei AMAnegativer PBC) oder eine Erhöhung der alkalischen Phosphatase (AP) dokumentiert werden. In 37 Fällen wurde die Diagnose einer Sarkoidose gestellt (0,30% aller Biopsien, 8,37% aller granulomatösen Läsionen). In 30 Fällen zeigte sich typische Histologie (nicht-verkäsende, epitheloidzellige Granulome ohne topographischen Bezug, kein Nachweis von Mykobakterien, Tendenz zur Fibrose). Bei 7 Patienten waren die histologischen Beobachtungen nicht eindeutig (Nekrose, Granulome ohne Fibrose), in allen Fällen war die klinische und/ oder serologische Datenlage allerdings hochgradig verdächtig für das Vorliegen einer Sarkoidose (typische hiläre Lymphadenopathie, erhöhtes Angiotensin- convertin enzyme (ACE), typische radiologische Befunde). Typische Fibrinring-Granulome konnten in einem Fall gesehen werden, die Diagnose Q-Fieber wurde durch klinische und serologische Daten bestätigt. 4.1.2 Bewertung der DNA- Güte für eine molekularpathologische Diagnostik Die weitergehend untersuchten 189 Gewebeproben waren formalinfixiert und in Paraffin eingebettet. Da durch die Extraktion die DNA fragmentiert worden sein konnte, wurde zum DNA- Nachweis und zur Bestätigung ihrer Amplifikationsfähigkeit eine PCR für Hämochromatose durchgeführt. Die Amplifikation des Hämochromatose- Genlocus war in 184 von 189 Fällen positiv. Dieses Resultat zeigt, dass in 184 Fällen die DNA- Extraktion aus den Patientenproben amplifizierbar erfolgreich war. und mittels Negativkontrollen, 31 Polymerasedie zum Kettenreaktion Beweis eines kontaminationsfreien Arbeitens zu jedem untersuchten Fall angefertigt wurden, waren stets negativ. In 15 Lebergewebsproben (3,39% der hepatischen Granulome) konnte ein infektöses Agens nachgewiesen werden, die histologischen Untersuchungen bestätigten diese Diagnosen. Diese Fälle repräsentieren die zuvor als „hepatische Granulome unbekannter Ätiologie“ bezeichneten Fälle. 4.2 Aufbau eines PCR- Nachweises für Listeria monocytogenes Zu den Kriterien, nach denen die PCR aufgebaut wurde und zu den Ansprüchen, die dabei an die Primer gestellt werden mussten, siehe 3.3.2. 4.2.1 Primerdesigne Für die Testung eines geeigneten PCR- Verfahrens zur Detektion von Listeria monocytogenes wurde als Zielsequenz in der PCR- Amplifikation ein repetitiver Sequenzbereich des fbp (fibronectin- binding protein) - Gens herangezogen. Als Vorlage für die Primerlage diente die in den Datenbanken der NCBI veröffentliche Sequenz mit der Accession- Nr.: AJ132543 von Listeria monocytogenes. 32 421 attcctttcg cgccacctag tgatgtgaaa cttaaaaaac tttttgcgaa aacgaaaaaa 481 ttaaaaattc ccgcctggtc taaactggat ttgcgcgatt atacatttta cggctggaat 541 gatatcgctc agcaacgtaa gtatatcgtg acttacgagg atggaaattt ggtcggcgta 601 caaggaacta tttctacaga gattcaaaag ggggtttgct cgatttgcca ttcgcattcg 661 aaagtatcgc tctttatggc gaaaacaaaa tcttcgagtg atggcgttta tacgacaaat Abbildung 2: Primerverteilung innerhalb des Listeria monocytogenes- Genoms. Primer der seminested- PCR: PCR I: List F1/ List R1; PCR II: List F1/ List R2 (grün: Überschneidung der reversePrimer R1 und R2 in der Genomsequenz). Listeria monocytogenes- Primer Primername AT Amplifikatlänge 113 bp List- F1 CCC GCC TGG TCT AAC TGG ATTT G 62 °C List- R1 GGA TGG AAA TTT GGT CGG CGT ACA 62 °C List- R2 GTA TAT CGT GAC TTA CGA GG 62 °C Tabelle 9: 95 bp Listeria monocytogenes- Primer und Annealingtemperaturen. Da die entworfenen Primer in ihren Schmelztemperaturen nicht exakt übereinstimmten, wurde ein Temperaturprofil angefertigt. Die PCRs wurden bei den Temperaturen 58°C, 60°C, 62°C und 64°C mit je 35 Zyklen á einer Minute durchgeführt. Hierbei erwies sich eine Annealing- Temperatur von 62°C sowohl für die erste als auch für die zweite PCR als optimal. Die Amplifikate hatten eine Größe von 113 Basenpaaren in der ersten bzw. 95 bp in der zweiten PCR: 33 Abbildung 3: Gelelektrophoretische Auftrennung einer Listerien- nested PCR (Temperaturprofil). Spur 1: Leitmarker pUC19 DNA/MspI (HpaII) Marker 23. Spuren 2-7: Produkte der PCR I (Größe 113bp). Spur 2: Wasserkontrolle 62°C. Spur 3: Positivkontrolle 62°C. Spur 4: Wasserkontrolle 64°C. Spur 5: Positivkontrolle 64°C. Spur 6: Wasserkontrolle 66°C. Spur 7: Positivkontrolle 66°C. Spuren 8-13: Amplifikate der PCR II (Größe 95 bp). Spur 8: Wasserkontrolle 62°C. Spur 9: Positivkontrolle 62°C. Spur 10: Wasserkontrolle 64°C. Spur 11: Positivkontrolle 64°C. Spur 12: Wasserkontrolle 66°C. Spur 13: Positivkontrolle 66°C. 34 Abbildung 4: Gelelektrophoretische Auftrennung einer Listerien- nested PCR (Temperaturprofil). Spur 14: Leitmarker pUC19 DNA/MspI (HpaII) Marker 23. Spuren 15-18: Amplifikate der PCR II (Größe 95 bp). Spur 15: Wasserkontrolle 58°C. Spur 16: Positivkontrolle 58°C. Spur 17: Wasserkontrolle 60°C. Spur 18: Positivkontrolle 60°C. 4.2.2 Nachweis von Listeria monocytogenes im Patientenkollektiv In drei Fällen gelang der Nachweis von Listeria monocytogenes. Das erwartete Amplifikat hat eine Größe von 95 bp. Histologisch zeigte sich eine granulomatöse Hepatitis mit multiplen kleinen Granulomen ohne das Anzeichen einer Nekrose. 4.3 Virale Erreger Für die Entstehung einer granulomatösen Hepatitis wurden als virale Erreger das Cytomegalie- und das Epstein- Barr- Virus in Betracht gezogen. 35 Für den Nachweis einer Infektion mit dem Epstein- Barr- oder dem Cytomegalie- Virus mittels Polymerase- Kettenreaktion wurden Primer aus der Routinediagnostik des Labors verwendet (s. Tabelle 5). 4.3.1 Epstein- Barr- Virus Insgesamt ließ sich bei vier der überprüften Proben ein Nachweis für eine Infektion mit dem Epstein- Barr- Virus erbringen. Die mittels PCR erzeugten Amplifikate zeigten in der gelelekrophoretischen Auftrennung Banden in Höhe der Markerbande 110 bp. Histologisch imponierten kleine im Leberparenchym gelegene histiozytäre Granulome mit sinusoidaler Lymphozyteninfiltration, Cholangitis und Endothelitis der Zentralenen. Abbildung 5: Gelelektrophoretische Auftrennung einer EBV- nested PCR. Spur 1: Leitmarker pUC19 DNA/MspI (HpaII) Marker 23. Spur 2-5: Patientenproben. Spur 6: Patientenprobe 79 36 4.3.2 Cytomegalievirus Der Nachweis einer Cytomegalie- Virus- Infektion war in zwei Fällen positiv. Um sicher zu gehen, dass jeder PCR- Schritt richtig abgelaufen ist, wurde in jedem Lauf eine sicher mit dem Cytomegalie- Virus infizierte Probe als Positivkontrolle mitgezogen. Das Amplifikat hat eine Größe von 117 bp. Die histologischen Schnitte dieser Biopsien zeigten histiozytäre Granulome im Leberparenchym, neben Mikroabszessen, cholangitis-bedingten Veränderungen und Endothelitis. Abbildung 6: Gelelektrophoretische Auftrennung einer CMV- nested PCR. Spur 1: Patientenprobe 59. Spur 2: Wasserkontrolle. Spur 3: Positivkontrolle. Spur 4: Leitmarker pUC19 DNA/MspI (HpaII) Marker 23. 37 4.4 Toxoplasma gondii Keine der untersuchten Proben, mit Ausnahme der Positivkontrolle, zeigte ein positives Ergebnis für Toxoplasma gondii. Das zu erwartende Amplifikat sollte eine Größe von 105 bp aufweisen: Abbildung 7: Gelelektrophoretische Auftrennung einer ToxoplasmosePCR. Spur 1: Leitmarker pUC19 DNA/MspI (HpaII) Marker 23. Spuren 2- 7: Patientenproben. Spur 8: Wasserkontrolle. Spur 9: Negativkontrolle. Spur 10: Positivkontrolle. 38 4.5 Bakterielle Erreger Für die Entstehung einer granulomatösen Hepatitis wurden als bakterielle Erreger Yersinia pseudotuberkulosis, Yersinia enterocolica, Bartonelle henselae, Mykobakterium tuberculosis, Mykobakterium avium und Listeria monocytogenes in Betracht gezogen. 4.5.1 Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia enterocolica Der Nachweis von Y. pseudotuberculosis und Y. enterocolica wurde mittels Multiplex- PCR durchgeführt. Eine Patientenprobe zeigte ein positives Ergebnis für Y. pseudotuberculosis. Die histologische Untersuchung dieser Probe zeigte multiple nicht-verkäsende Granulome. In keiner der untersuchten Proben, mit Ausnahme der Positivkontrolle, konnte Yersinia enterocolica nachgewiesen werden. Die Amplifikate von Y. pseudotuberculosis (75 bp) und Y. enterocolica (114 bp) zeigten in der Positivkontrolle eine Doppelbande. 39 4.5.2 Bartonella henselae In zwei der untersuchten Proben ließ sich der Nachweis einer Infektion mit Bartonella henselae erbringen. Die mittels PCR erzeugten Amplifikate zeigten in der gelelektrophoretischen Auftrennung Banden in einer Größe von 153 Basenpaaren. Lichtmikroskopisch imponierten disseminierte epitheloidzellige Granulome, von denen in allen histologischen Schnitten einige Nekrosen zeigten. Abbildung 8: Gelelektrophoretische Auftrennung einer Bartonella henselae- PCR. Spur 1: Leitmarker pUC19 DNA/MspI (HpaII) Marker 23. Spur 2: Patientenprobe 47. Spur 3: Patientenprobe 48. Spur 4: Wasserkontrolle. Spur 5: Negativkontrolle. Spur 6: Positivkontrolle. 40 4.5.3 Mykobakterium tuberculosis, Mykobakterium avium Der Nachweis von M. tuberkulosis- DNA war in drei Fällen positiv. Lichtmikroskopisch waren epitheloidzellige Granulome sowohl portal als auch extraportal zu sehen, ebenso verkäsende Nekrosen. Säurefeste Stäbchen konnten nicht mittels Ziehl-Neelsen-Färbung dargestellt werden, auch nicht retrospektiv. Das für M. tuberkulosis mittels nPCR erzeugte Amplifikat hat eine Größe von 124 bp. DNA von M. avium konnte nicht amplifiziert werden. 1 2 3 4 5 124 Abbildung 9: Gelelektrophoretische Auftrennung einer Mykobakterium tuberculosis- PCR. Spur 1: Negativkontrolle. Spur 2: Patientenprobe. Spur 3: Wasserkontrolle. Spur 4: Positivkontrolle. Spur 5: Leitmarker pUC19 DNA/MspI (HpaII) Marker 23. 41 4.6 Medikamentenanamnese Detaillierte klinische Angaben über Patientenmedikation waren in 35 Fällen vorhanden. In 11 Fällen (2,48%) liegt die Vermutung nahe, dass die beobachteten Granulome medikamenteninduziert waren. Medikamente, die bekanntermaßen granulomatöse Veränderungen in der Leber hervorrufen können sind unter anderem: Glibenclamid (n=2), orale Kontrazeptiva (n=4), Hydrochlorothiazid (n= 2), Aspirin (n=1) und Interferon (n=2). 4.7 Übertragung des diagnostischen Algorithmus von Denk auf das Kölner Kollektiv Zusammenfassend sind die Ergebnisse der Analyse der Ursachen der Granulmon-Entstehung in einem Schema des Denk´schen Algorithmus dargestellt (Abbildung 10) 42 Abbildung 10: Diagnostische Algorithmus aller untersuchten Leberbiopsien 43 Beispiele der histologischen Befunde sind in Abbildung 11 dargestellt. Abbildung 11: a) Floride Gangläsion bei der PBC mit einem epitheloidzelligen Granulom, in dessen Zentrum sich ein partiell zerstörter Gallengang befindet. In der Peripherie des Granuloms ein Lymphozytenwall (H&E, x250). b) Epitheloidzellige Granulome bei Sarkoidose in der Leber. Ausbildung einer Riesenzelle, keine Nekrose (H&E, x400). c) Verkäsende Nekrose in einem epitheloidzelligen Granulom. Positiver Nachweis von M. tuberculosis mittels PCR (H&E, x400). d) Kleine, wenig definierte histiozytäre 44 Granulome im Leberläppchen bei EBV-Hepatitis. Positiver Nachweis von EBV mittels PCR (H&E, x250). e) Lebergewebe mit der gesicherten Diagnose einer systemischen Katzenkratzkrankheit. Wenig definiertes Granulom mit granulierender Entzündung (H&E, x250). f) Fibrinring-Granulome mit Fettvakuole im Zentrum und einem Fibrinring (Pearse Färbung, x250). 45 5 Diskussion 5.1 Hepatische Granulome, Inzidenz und Diagnose Die Leberbiopsie besitzt in der Diagnostik von Patienten mit Lebererkrankungen einen hohen Stellenwert. In der Literatur wird von einer Häufigkeit granulomatöser Läsionen zwischen 1,6% - 14,6% in unselektiven Leberbiopsien berichtet (10, 11, 27, 35, 42, 48, 59, 61, 65, 72, 84, 85, 97), wohingegen z.B. granulomatöse Läsionen im Knochenmark nur in 2-3% beschrieben werden (52, 62). Die in unserem Einsendegut relativ niedrige Inzidenz hepatischer Granulome von 3,63% spiegelt die geographische und sozioökonomische Situation eines hoch industrialisierten europäischen Landes wider. Mit Fortschritten auf dem Gebiet immunologischer und viraler Diagnostik, der Verfeinerung bildgebender Verfahren, sowie durch die Vergrößerung der therapeutischen Optionen hat sich das Spektrum der zugrunde liegenden Erkrankungen, sowie die Indikation zur Leberbiopsie deutlich verändert. Während zum Beispiel in den 80er Jahren die primär biliäre Zirrhose als Ursache hepatischer Granulome unterschätzt wurde, ist sie heute in westlichen Ländern die führende Ursache hepatischer Granulome (50). Die Interpretation granulomatöser Läsionen in der Leber ist besonders schwierig und erfordert immer auch eine Kenntnis der klinischen Situation. Eine enge Zusammenarbeit und Diskussion zwischen Klinikern und Pathologen ist zur Diagnosefindung unabdingbar. So kann sich bei verschiedenen gängigen, zu Granulomen unterschiedliche führenden Grunderkrankungen Gesamtkonstellation hinsichtlich eine der grundsätzlich klinischen und pathologischen Parameter ergeben. Dies soll im Folgenden anhand wichtiger, zu Granulomen führender Entitäten, exemplarisch verdeutlicht und diskutiert werden. Die in der vorliegenden Arbeit untersuchten Leberbiopsien zeigen ein repräsentatives Spektrum von Lebererkrankungen bei zumeist erwachsenen Patienten. Beurteilt wurden die zu untersuchenden Proben durch Histomorphologie, klinische Angaben und molekularpathologische Analysen. 46 Die daraus gewonnenen Erkenntnisse wurden in Anlehnung an Denks (13) Kriterien zur Interpretation von Leberbiopsien ausgewertet. 5.2 Ursachen Urachen, die zu Granulomen in der Leber führen zeigen eine Abhängigkeit von geographischen Faktoren, so wurden in Saudi Arabien in einer größeren Untersuchung als häufigste Ursachen Schistosomiasis und Tuberkulose beschrieben, während in Nord Irland, Großbritannien und Griechenland die PBC und die Sarkoidose als häufigste Ursachen gefunden wurden (16, 27, 59, 78). In Übereinstimmung mit diesen Daten waren in unserem Kollektiv die PBC und Sarkoidose ebenfalls als häufigste Ursachen zu diagnostizieren mit 48,64% bzw. 8,37%. 5.2.1 Primär biliäre Zirrhose (PBC) In unserer Studie zeigte sich, übereinstimmend mit Studien anderer westlicher Länder, die primär biliäre Zirrhose als führende Ursache von Granulomen in der Leber. PBC erklärte in 48,64% der untersuchten Biopsien das Vorliegen von Granulomen in der Leber. Dourakis (16) beschrieb in seiner einer großen Studie aus Griechenland für die PBC eine Inzidenz von 62%, McCluggage (59) berichtete in 55% seiner Fälle aus Nordirland über das Vorliegen einer PBC, in einer britischen Studie von Gaya (27) wurde in 23,8% die Diagnose PBC gestellt. In der gesamten analysierten Literatur wird die Inzidenz von PBC als Ursache hepatischer Granulome mit 4,5% bis 55% angegeben (27, 59, 84). Diese zum Teil doch erheblichen Unterschiede der Inzidenzen der PBC in verschiedenen Studie epidemiologische lassen Faktoren, sich wahrscheinlich Selektionskriterien und auf unterschiedliche nicht einheitliche Indikationen zur Leberbiopsie zurückführen (41). Die Leberbiopsie spielt zur Diagnose und Stadieneinteilung der PBC eine entscheidende Rolle. In circa einem Viertel der Leberbiopsien aller PBC47 Patienten lassen sich Granulome finden (81). Sehr typisch für das histopathologische Bild der primär biliären Zirrhose sind floride Gangläsionen, bei denen im Zentrum eines Granuloms Anteile oder Reste eines zugrundegehenden und entzündlich infiltrierten Gallenganges zu finden sind. Die Granulome sind hauptsächlich in den Portalfeldern lokalisiert, aber auch im Parenchym zu finden. Morphologisch zeigt sich ein weites Spektrum von wenig umschriebenen, kleinen histiozytären Aggregaten bis zu gut definierten, größeren, von einem Lymphozytenwall umgebenen, epitheloidzelligen Granulomen. 5.2.2 Sarkoidose Der zweithäufigste Gund für das Auftreten von Granulomen in der Leber ist in unserer Studie die Sarkoidose mit 8,37%. Ähnliche Ergebnisse wurden von Dourakis (16), McCluggage (59) und Gaya (27) berichtet, in der weiteren Literatur wird die Inzidenz einer Sarkoidose mit 11% bis 47% beschrieben (10, 26, 27, 29, 33, 48, 59, 84, 97, 99). Im Rahmen einer Sarkoidose kann die Leber bis zu 75 Millionen Granulome enthalten, es könne jedoch auch nur Minimalbefunde vorliegen. Morphologisch handelt es sich um nicht verkäsende Granulme (48), die meist in den Portalfeldern, sowie periportal zu finden sind und dort häufig in blumenkohlartigen Klustern zusammen liegen (43). Die Granulome enthalten Langhans- Riesenzellen und in manchen Fällen Asteroid- und SchaumannKörperchen. In seltenen Fällen kann es zu Nekrosen kommen. Typisch ist eine Faserinduktion im Randbereich der Granulome. Konfluierende Granulome können zu einer extensiven, irregulären Narbenbildung führen. Eine Zerstörung von Gallengängen kann vorkommen und morphologisch an die PBC erinnern. Ein Verlust von Gallengängen kann zu einem cholestatischen Syndrom führen. Sehr wenige Patienten haben überzeugende Eigenschaften beider Erkrankungen und es ergibt sich die Diagnose eines Overlap- Syndroms aus Sarkoidose und PBC (67). 48 5.2.3 Tuberkulose Eine TBC als Ursache hepatischer Granulome wird in der Literatur mit 1,8% bis 53% angegeben (27, 35, 42, 48, 59, 61, 65, 84, 85), abhängig vom sozioökonomischen Status des untersuchten Patientenkollektivs. In unserer Studie zeigte sich in drei Fällen (0,68%) ein positives PCR- Ergebnis, wobei bei einer Sensitivität dieser Untersuchung von 70% möglicherweise nicht alle positiven Fälle erfasst wurden. Auffallend sind auch in diesem Vergleich der Literaurrecherche die erheblichen Variationen innerhalb der Inzidenz von M. tuberkulosis als Ursache hepatischer Granulome. In einer türkischen Studie (61) über hepatische Granulome wurde die Tbc in 20% aller untersuchten Fälle als auslösendes Agens ermittelt. Dies weist einmal mehr auf die geographischen und soioökonomischen Unterschiede der diagnostisch zu berücksichtigenden Auslöser von Granulomen in der Leber hin. Durch eine Infektion mit Mykobakterium tuberkulosis hervorgerufene Granulome, sind sowohl in den Portalfeldern als auch im Parenchym zu finden. Die Granulome sind meist größer, als Granulome, die auf dem Boden einer PBC oder Sarkoidose entstehen. Es handelt sich um epitheloid- und riesenzellige Granulome, für die Langhans- Riesenzellen typisch sind. In circa einem Viertel der Fälle sind „verkäsende“ (fibrillogranuläre) Nekrosen zu beobachten (36, 79). Da Mykobakterium tuberkulosis ein säurefestes Stäbchen ist, lässt es sich mittels Ziehl- Neelsen- Färbung im Gewebe darstellen. Dies gelingt allerdings in Leberbiopsien deutlich seltener (13%) als z.B. in Obduktionsmaterial (31%). 5.2.4 EBV In vier der Biopsate (0,9%) konnte EBV-Genom nachgewiesen werden. Die Bedeutung eines positiven Ergebnisses in der PCR ist nicht ganz eindeutig, da alle seropositiven Menschen eine kleine Anzahl infizierter Lymphozyten in Blut und Gewebe besitzen, so dass nicht eindeutig zwischen einer zufälligen Infiltration des Lebergewebes durch infizierte Lymphozyten und einer 49 pathologischen Infiltration unterschieden werden kann. Es fällt aber auf, dass, bei einer Seroprävalenz von mindestens 80%, nur vier von 442 Patienten in unserem Kollektiv mit granulomatösen Hepatitiden ein positives Ergebnis in der PCR zum Nachweis von EBV- DNA zeigten. In der Literatur wird die Zahl der EBV- positiven Lymphozyten eines latenten Virusträgers mit 0,5 bis 50 in einer Million B-Lymphozyten angegeben, so dass ein positiver Lymphozyt in einem Biopsat mit circa 5000 Lymphozyten eine größere Anzahl infizierter Lymphozyten vermuten lässt und somit auch eine pathologische Korrelation. Somit ist das positive PCR- Ergebnis in den beschriebenen vier Biopsien allein nicht wegweisend und ausreichend für die Diagnose einer EBV- induzierten Hepatitis und erfordert einen weitere klinisch- serologische Abklärung. Das Epstein- Barr Virus gehört zu der Gruppe der humanpathogenen Herpesviren, es ist der Erreger der infektiösen Mononukleose mit einer Seroprävalenz von mehr als 80% in der Bevölkerung. Eine EBV-Infektion persistiert lebenslang, es besteht eine latente Infektion der B- Lymphozyten und der Zellen des Oropharynx. Die Diagnose einer EBV induzierten Hepatitis ist nicht eindeutig definiert und sollte einen Zusammenhang suchen zwischen dem klinischen Bild einer infektiösen Mononukleose, sowie einer serologischen Erhöhung der anti- VCA- IgM und leicht erhöhten Leberenzymen als Ausdruck einer Begleithepatitis (17). In diesen Fällen ist eine Leberbiopsie normalerweise nicht dringend indiziert. Zeigt sich hingegen nur eine Erhöhung der GPT und GOT, sowie ein serologischer Nachweis von IgA-anti-VAC Antikörpern, so sollte eine Leberbiopsie durchgeführt werden, um histopathologischer Veränderungen zu erkennen und EVB-DNA im Lebergewebe nachzuweisen. Histopathologisch findet sich in der Leber eine lymphozytäre Infiltration bestehend aus T- und B- Lymphozyten in den Sinusoiden und den Portalfeldern, sowie eine Proliferation der Kupffer´schen Zellen (57). In seltenen Fällen sind Leberzellnekrosen zu beobachten. 5.2.5 CMV Im vorliegenden Kollektiv wurde in zwei der Gewebeproben (0,45%) CMV- DNA nachgewiesen, hindeutend auf eine CMV- assoziierte Hepatitis. 50 Das Cytomegalie- Virus ist ebenfalls ein humanpathogenens Herpes- Virus, mit einer Durchseuchung der Bevölkerung von 40-100%, je nach sozialem Status. Eine Organbeteiligung kommt z. B im Rahmen einer Immuninsuffizienz oder bei konnataler Übertragung vor. Die Erstinfektion führt in circa einem Viertel der Fälle zu einer meist milden epitheloidzellig granulomatösen Hepatitis (51, 53) und selten dem Nachweis der typischen Eulenaugenzellen (Viruseinschlüsse in infizierten Hepatozyten). Eine Infektion bei Immuninsuffizienten verläuft schwerer, ebenfalls mit einem granulomatös hepatitischen Bild (64). Serologische Untersuchungen bei einer akuten CMV- Infektion zeigen antiCMV- IgM- Antikörper und einen mindestens vierfachen Anstieg der Anti- IgGAntikörper. Des Weiteren kann das CMV- Genom auch durch eine PCR im infizierten Gewebe nachgewiesen werden. 5.2.6 Bartonella henselae In zwei der Gewebeproben (0,45%) konnte Bartonella henselae- Genom nachgewiesen werden, bei einer Patientin wurde uns ein entsprechender Serostatus mitgeteilt. Interessant und diskussionswürdig ist in diesem Zusammenhang der Fall einer 11- jährigen Patientin (Patient Nr. 80) mit persistierendem Fieber (40°C) und allgemeinem Krankheitsgefühl, bei der anamnestisch ein enger Katzenkontakt bekannt war. Im MRT stellten sich multiple Läsionen der Leber dar. Eine explorative Laparoskopie zeigt miliarähnliche Strukturen über der gesamten Leber und Milz. Aus den laparoskopisch gewonnenen Proben ließ sich eine granulomatöse Hepatitis mit portal und periportal lokalisierten histiozytären Granulomen mit granulationsgewebiger Organisation diagnostizieren. Serologisch und mittels PCR konnte Bartonella henselae nachgewiesen werden. Das histologische Bild, das Ergebnis der molekularbiologischen Untersuchung und der Serologie entsprechen einer Leberbeteiligung bei systemischer Katzen- Kratz- Krankheit. Bartonelle henselae, früher Rochalimaea henselae, ist ein gram- negatives Stäbchen, welches 1983 von Wear (98) als Auslöser der weltweit verbreiteten Katzen- Kratz- Krankheit identifiziert wurde. Sie wird mit einer Inzidenz von 51 6,6/100000 Einwohnern in den USA beschrieben, wobei diese Inzidenz wahrscheinlich zu niedrig angesetzt ist, da viele Patienten mit einer unkompliziert verlaufenden Katzen-Kratz-Krankheit keinen Arzt aufsuchen (49, 69). 15% der Fälle zeigen einen atypischen Verlauf und können zur Hepatitis führen. Histologisch zeigten sich in unseren Fällen Leberbiopsien mit Granulomen im Läppchen oder portal lokalisiert. Histiozyten waren Hauptzellbestandteil, Nekrosen fanden sich nicht (5, 95). Eine sensitive und spezifische Methode Bartonella- DNA nachzuweisen ist die PolymeraseKettenreaktion (PCR), besonders in Kombination mit dem Southern- Blot (2, 30, 87). 5.2.7 Listeria monocytogenes Viele Lebensmittel sind mit L. monocytogenes kontaminiert, vor allem rohes Gemüse, Rohmilch und deren Produkte, sowie Fleisch und Fisch (21, 29). Eine Listerieninfektion verläuft meist klinisch inapparent, erst wenn eine größere Menge der Erreger mit der Nahrung aufgenommen wird kann es zu Symptomen kommen. Bei immunkompetenten Patienten grippeähnlichen Symptomen, bei massiver kommt es Infektion vor allem zu können auch Gastroenteritiden auftreten. Vor allem sind jedoch abwehrgeschwächte Patienten, Neugeborene, ältere Menschen und Schwangere infektionsgefährdet (9). Bei letzteren kommt es in 25% der Fälle zu Totgeburten oder neonatalen Todesfällen (28, 77, 86). Diagnostiziert wird eine Infektion mit Listeria monocytogenes durch mikroskopischen und kulturellen Erregernachweis aus Blut oder Liquor. Sword (89) und Ampel (4) konnten zeigen, dass Eisen ein Virulenzfaktor für Listeria monocytogenes ist und belegen eine klinische Assoziation von sporadischen Listerieninfektionen mit Hämochromatose (73). Bemerkenswert ist hier der Fall einer 62- jährigen Patientin mit positiver Listerien- PCR und granulomatöser Hepatitis (Patient Nr. 43), welche an einer genetischen Hämochromatose erkrankt ist. Histologisch zeigt sich hier eine akute Hepatitis mit sinusoidaler Infiltration mononukleärer Zellen, Nekrosen und Cholestase, sowie häufig auch Mikrogranulomen (6, 93). 52 Wir konnten in 0,68% (drei Fällen) der untersuchten Proben L. monocytogenesGenom nachweisen. Das positive molekularbiologische Ergebnis ist laut Greisen (34) allerdings allein nicht wegweisend, sondern erfordert eine weitere klinische und histologische oder kulturelle Abklärung. 5.2.8 Hepatitis B Die Bedeutung von Granulomen bei chronischer Hepatitis B und C wird in der Literatur kontrovers diskutiert. Während das Hepatitis C- Virus in den letzten Jahren als ein wichtiger Auslöser hepatischer Granulome identifiziert wurde (in 2-10%) und möglicherweise auf ein Therapieansprechen hindeutet (14, 18, 19, 27, 31, 32, 36, 63, 76, 94), ist der Zusammenhang zwischen einer Hepatits B Infektion und dem Auftreten hepatischer Granulome nur in wenigen Studien untersucht worden. So berichtet Tahan (90) über eine Prävalenz von Lebergranulomen bei chronischer Hepatitis B von 1,5%. Goldin (32) fand in seiner Studie in 2% der Fälle eine granulomatöse Hepatitis bei chronischer HBV- Infektion. Kanno und Murakami (47) berichteten in einem Case Report über einen 35- jährigen Patienten mit chronischer Hepatitis B und hepatischen Granulomen. In drei der untersuchten 189 Leberbiopsien (0,68%) konnte mittels PCR das Hepatitis B- Virus nachgewiesen werden. Zwei dieser Patienten zeigten ebenfalls eine positive HBV- Serologie. Für Patienten mit hepatischen Granulomen, bei denen häufige Ursachen, wie Tuberkulose, PBC oder Sarkoidose ausgeschlossen werden können, sollte auch eine chronische Hepatitis B- Infektion diskutiert werden, insbesondere wenn eine positive Serologie vorliegt. 5.2.9 Treponema pallidum Eine Mitbeteiligung der Leber bei Lues ist schon seit über 400 Jahren bekannt, die Häufigkeit einer luesassoziierten Hepatitis wird allerdings in der Literatur mit 53 unter einem Prozent angegeben (54). Histologische Leberveränderungen bei der Lues II können variieren von nicht spezifischen entzündlichen portalen Veränderungen, fokalen Zellnekrosen bis hin zu granulomatösen Veränderungen (88). Nekrotische Areale können in allen Bereichen der Leberläppchen gefunden werden, meist befinden sie sich jedoch periportal und um die Zentralvenen herum. Die Leberenzyme sind in der Regel nur leicht erhöht, eine überproportional erhöhte alkalische Phosphatase kann jedoch bei unklaren Symptomen für die Diagnose einer luesassoziierten Hepatitis richtungsweisend sein (71, 88). Unbehandelt kann es nach zwei bis fünf Jahren zur Spätsyphilis kommen, mit Organmanifestation und Bildung syphilitischer Granulome (Gummen). Zwei Patienten unseres Studienkollektivs zeigten eine serologisch nachgewiesene Lues II und erhöhte Leberwerte. Zur Abklärung dieser unklar erhöhten Leberwerte wurden Leberbiopsien durchgeführt. Histologisch zeigten sich granulomatöse Läsionen, so dass ein ätiopathologischer Zusammenhang zu diskutieren ist. 5.2.10 Yersinia pseudotuberkulosis In unserer Studie konnte in einem Fall (0,23%) DNA von Y. pseudotuberkulosis mittels PCR nachgewiesen werden. Yersinia pseudotuberkulosis- Infektionen kommen weltweit vor. Das klinische Bild einer Y. pseudotuberkulosis- Infektion ist vielfältig, am häufigsten ist ein pseudoappentizitischer Verlauf. Es kommt zu Fieber, Diarrhöen und akuter oder subakuter mesenterialer Lymphadenitis, welche sich klinisch oft nicht von einer akuten Appendizitis unterscheiden lässt (74). Diese Symptome können nach Kontakt mit erkrankten Tieren oder nach oraler Aufnahme der Erreger (über Milch, Salat, Geflügel oder kontaminiertem Wasser) auftreten (24, 25). 54 5.3 Systematische Auswertung nach den von Denk etablierten Kritertien Die Leberbiopsien wurden unter Berücksichtigung der klinischen Daten, der pathologischen und molekularpathologischen Befunde evaluiert und nach Denks (13) Kategorien dargestellt. Keine der Leberbiopsien erfüllte die Eigenschaft “see the cause” (Gruppe 1 nach Denk (13)). Als Beispiel dieser Kategorie sind Schistosomen anzuführen (8, 20) und Mykobakterien, die mittels Ziehl- Neelsen Färbung sichtbar gemacht werden. Dieses Resultat ist widersprüchlich zu Ergebnissen von Satti (85), die zeigen konnten, dass in Saudi-Arabien Schistosomen und Tuberkulose die häufigsten Ursachen der Granulomentstehung sind. In einer türkischen Studie mit einer vergleichbaren Fragestellung wurde die Tuberkulose als Hauptätiologie in 20% gefunden (61). In unserer Studie sahen wir Tuberkulose als Ursache der Granulomentstehung in 3 Fällen. Da die Diagnose nicht mittels Ziehl- Neelsen Färbung gestellt werden konnte, sondern anhand der Histologie mit bestätigender PCR, wurden diese Fälle in die Kategorie 2 nach Denk (13) „know the cause“ eingeordnet. Für diese Gruppe sind die Kenntnis der klinischen und serologischen Befunde sowie die Ergebnisse der molekularpathologischen Untersuchungen unabdingbar. Wir führten eine PCR zur Analyse infektiöser Ursachen durch und konnten in 15 Fällen Genome infektiöser Erreger nachweisen und somit die Ursache der Granulomentstehung kennen. Die Inzidenz und Ätiologie von Infektionskrankheiten ist im wesentlichen geographisch bedingt (61, 85). In der vorliegenden Studie konnte Bartonella henselae mittels PCR in der Leber nachgewiesen werden, was auf eine systemische Manifestation der Katzenkratzkrankheit hinweist, die selten beschrieben ist (5). Somit spielen infektiöse Ursachen als ätiologischer Faktor der Granulomentstehung eine wichtige Rolle. Ein molekularpathologischer Ansatz ist ein effizientes Werkzeug zur Etablierung der Diagnose. Auch wenn der Pathologe keine klare Diagnose bezüglich der Ätiologie granulomatöser Leberläsionen stellen kann, sollte er in der Lage sein, eine Verdachtsdiagnose zu äussern, die den klinisch behandelnden Ärzten das Fahnden nach der Ursache erleichtert (13). In diesem Zusammenhang sind 55 Medikamente ein wichtiger Aspekt und können in zahreichen Fällen eine Granulomentstehung erklären (55). So sind mehr als 60 verschiedene Medikamente beschrieben, die zur Granulomentstehung führen können (1, 38, 45). In 36% der Fälle konnte eine Diagnose nicht etabliert werden. Diese Biopsien wurden in die Kategorie 4 „cause unknown“ eingeordnet. Ein Teil dieser Fälle könnte möglicherweise durch die weitere intensive Abklärung der gesamten Anamnese aufgeklärt werden, ein Teil könnte zur Gruppe der sogenannten idiopathischen granulomatösen Hepatitis gerechnet werden, eine Erkrankung ohne bekannte Ursache. Wie in anderen Untersuchungen konnten wir zeigen, dass die PBC die häufigste Ursache der Granulomentstehung darstellt, gefolgt von der Sarkoidose (16). Zusammenfassend konnten wir Granulome in 3,63% der Leberbiopsien idintifizieren. Das Spektrum möglicher Ursachen der Granulomentstehung ist weit und erfordert eine ausgedehnte Analyse, sowie eine enge Zusammenarbeit zwischen Klinikern und Pathologen. Eine PCR am Lebergewebe stellt eine sinnvolle Ergänzung zur Analyse zugrundeliegender Ursachen dar. 56 6 Zusammenfassung Aus dem Archiv des Institutes für Pathologie der Universität Köln analysierten wir retrospektiv 12161 Leberbiopsien auf das Vorhandensein hepatischer Granulome. Dabei berücksichtigten wir Leberbiopsien mit Granulmonen, Leberbiopsien mit granulomatöser Hepatits und Leberbiopsien mit granulomatöser Cholangitis. Lipogranulome wie sie bei der Steatosis hepatis vorkommen, wurden nicht in die Untersuchung eingeschlossen. Das Ursachenspektrum der granulomatösen Läsionen wurde anhand der vorhandenen klinisch-anamnestischen Daten, der Histomorphologie und auch anhand einer molekularpathologischen Analyse mittels PCR zum Ermitteln von Erregerstrukturen analysiert. Zur systematischen Darstellung der Ergebnisse wählten wir die von Denk (13) etablierten Kriterien zur pathologischen Diagnose hepatischer Granulome: „see the cause, know the cause, suspect the cause, cause unknown“. Von den 12161 Leberbiopsien zeigten sich Granulome in 442 Fällen (3,63%). 215 ergaben die Diagnose einer primär biliären Zirrhose (48,64%). Zweithäufigste Ursache war die Sarkoidose in 37 Fällen (8,37%). Q-Fieber konnte in einem Fall diagnostiziert werden. Die übrigen 189 Biopsien wurden weiter aufgearbeitet. In 15 Biopsien (3,39%) konnte ein Erreger nachgewiesen werden (Bartonella Mycobakterium henselae tuberkulosis (n=2), (n=3), Listeria Yersinia monocytogenes (n=3), pseudotuberkulosis (n=1), Cytomegalievirus (n=2), Epstein-Barr-Virus (n=4)). In 35 Fällen lagen detaillierte Angaben zur Medikamentenanamnese vor, in 11 Fällen (2,49%) konnten die Medikamente der Granulomentstehung zugeordnet werden. Schließlich konnte die Diagnose in 158 Fällen (36%) nicht ermittelt werden. Die Untersuchung zeigt, dass eine umfassende interdisziplinäre Diagnostik zur Analyse hepatischer Granulome unabdingbar ist und in etwa einem Drittel der Fälle zu einer Diagnose führen kann. Trotz detaillierter Analysen mit molekularpathologischer Diagnostik konnten nicht alle Fälle endgültig gelöst werden. 57 7 Literaturverzeichnis 1. Abe M, Kumagi T, Nakanishi S, Yamagami T, Michitaka K, Abe K, Okura I, Yamashita H, Horiike N, Onji M (2002). 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