Synthase aus Methanosarcina mazei

Heterologe Produktion und
Mutationsanalyse der AiAo-ATPSynthase aus Methanosarcina mazei
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften
vorgelegt beim Fachbereich Biowissenschaften
der Johann Wolfgang Goethe-Universität
in Frankfurt am Main
von
Carolin Gloger
aus Rehburg-Loccum
Frankfurt (2014)
(D30)
http://d-nb.info/1060563258
Inhaltsverzeichnis
V
Inhaltsverzeichnis
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
III
INHALTSVERZEICHNIS
V
1
1
2
EINLEITUNG
1.1
ATP als universelle „Energiewährung" lebender Zellen
1
1.2
ATP-Synthasen - Schlüsselenzyme der Bioenergetik
3
1.3
Bakterielle F^o-ATP-Synthasen
4
1.4
Eukaryotische V^o-ATPasen
11
1.5
Archaeelle Ai Ao-ATP-Synthasen
13
1.6
Methanogene Archaeen
18
1.7
Fragestellung der Arbeit
23
MATERIAL UND METHODEN
24
2.1
Organismen, Plasmide und Oligonukleotide
24
2.1.1
Organismen
24
2.1.2
Plasmide
24
2.1.3
Oligonukleotide
26
2.2
Medien und Supplemente
2.2.1
2.3
Nährmedium für E. coli
Zellanzucht von E. coli
30
30
30
2.3.1
Stammkulturen
31
2.3.2
Reinheitskontrolle
31
2.4
Plasmidpräparation aus E. coli DH5a
2.4.1
2.5
Bestimmung der DNA-Konzentration
Auftrennung von Nukleinsäuren in Agarosegeien
2.5.1
Extraktion von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
2.6
Polymerasekettenreaktion
2.7
Generierung von Plasmid-kodierten Mutationen mittels
ortsspezifischer Mutagenese
2.7.1
Phosphorylierung von Starteroligonukleotiden
31
31
32
32
32
33
35
Inhaltsverzeichnis
2.8
Enzymatische Modifikation von Nukleinsäuren
VI
35
2.8.1
Restriktion der DNA mit Endonukleasen
35
2.8.2
Ligation von DNA-Fragmenten
35
2.9
2.10
Transformation von E. coli DH5a
Verfahren zur Proteinkonzentrationsbestimmung
2.10.1
Proteinkozentrationsbestimmung nach Bradford
2.10.2
Proteinkonzentrationsbestimmung an ganzen Zellen nach
36
36
Schmidt etal.
36
Proteinbestimmung mittels Amidoschwarz
37
Auftrennung von Proteinen im Polyacrylamid-Gel
37
2.10.3
2.11
35
2.11.1
Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese
37
2.11.2
Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese
38
2.11.3
SDS-Gelelektrophorese in zweiter Dimension
39
2.12
Verfahren zur Proteinfärbung
40
2.12.1
Unspezifische Proteinfärbung mit Coomassie
40
2.12.2
Unspezifische Proteinfärbung mit Silber
40
2.12.3
Unspezifische Proteinfärbung mit Silber für MS-Analysen
41
2.13
Immunologischer Nachweis von Proteinen
2.13.1
Immunologischer Nachweis von Proteinen nach Auftrennung
unter nativen Bedingungen
2.14
41
Versuche mit Zellsuspensionen von E. coli
42
43
2.14.1
Herstellung von Zellsuspensionen
43
2.14.2
Versuche mit Zellsuspensionen
43
2.14.3
Bestimmung des ATP-Gehalts ganzer Zellen
44
2.15
Herstellung von invertierten Membranvesikeln aus E. coli
44
2.16
Versuche mit invertierten Membranvesikeln
45
2.16.1
Messung der ATP-Synthese getrieben durch NADH-Oxidation
2.16.2
Bestimmung der NADH-Dehydrogenase-Aktivität der
invertierten Membranvesikel
45
46
2.16.3
Messung der ATP-Synthese getrieben durch ein artifizielles ApH+ ... 46
2.16.4
Messung der ATP-Synthese getrieben durch einen artifiziellen
pH-Gradienten oder ein artifizielles AIJJ
2.16.5
47
Überprüfung der Qualität invertierter Membranvesikel mittels
ACMA-Quench
48
Inhaltsverzeichnis
2.17
Reinigung der heterolog produzierten ATP-Synthase von M. mazei
Gö1 aus E. coli DK8 mittels Affinitätschromatographie
49
2.17.1
Herstellung von gewaschenen Membranen aus E. coli
49
2.17.2
Solubilisierung des Enzyms aus der Cytoplasmamembran
50
2.17.3
Ni2+-NTA-Affinitätschromatographie
50
2.17.4
Gelfiltration
51
2.17.5
Bestimmung der ATPase-Aktivität
52
2.18
Elektronenmikroskopische Aufnahmen
52
2.19
Identifikation von Proteinen mittels „Peptide Mass Fingerprinting"
53
2.20
LILBID-Massenspektrometrie
53
2.21
Rekonstitution der ATP-Synthase in Proteoliposomen
54
2.22
Überproduktion und Reinigung von MalE-Fusionsproteinen
54
2.22.1
2.23
3
VII
Entfernen der MalE-Fusionsdomäne
Chemikalien und Enzyme
ERGEBNISSE
3.1
55
55
57
Heterologe Expression, Produktion und Funktionsanalyse der
ATP-Synthase aus M. mazei
3.1.1
Heterologe Expression und Optimierung der Kodon-Nutzung
3.1.2
ATP-Synthese an ganzen Zellen getrieben durch einen artifiziellen
57
57
pH-Gradienten
58
3.1.3
NADH-getriebene ATP-Synthese an invertierten Membranvesikeln
60
3.1.4
Bestimmung der NADH-Dehydrogenase-Aktivität der
invertierten Membranvesikel
3.1.5
64
Untersuchungen zur Identifizierung des Kopplungsions
mittels lonophorstudien
65
3.1.6
ATP-Synthese nach Oxidation alternativer Elektronendonoren
67
3.1.7
Durch ein artifizielles ApH+- getriebene ATP-Synthese an
invertierten Membranvesikeln
3.1.8
Durch ein artifizielles ApH getriebene ATP-Synthese an
invertierten Membranvesikeln
3.1.9
68
70
Durch ein artifizielles AIJJ getriebene ATP-Synthese an
invertierten Membranvesikeln
71
Inhaltsverzeichnis
3.1.10
3.2
ATP-Hydrolyse an Membranen von E. coli DK8
VIII
72
Klonierung, heterologe Produktion und Reinigung der A1A0-ATPSynthase von M. mazei
3.2.1
75
Anfügen eines Hexahistidintags an die A-Untereinheit der
ATP-Synthase
75
3.2.2
Heterologe Produktion der HiSöATP-Synthase von M. mazei
78
3.2.1
Isolierung der ATP-Synthase mittels Ni2+-NTAAffinitätschromatographie
3.3
Analyse der gereinigten ATP-Synthase
3.3.1
Identifizierung der einzelnen Untereinheiten mittels PMF-MS
3.3.2
Native Gelelektrophorese zur Analyse der Komplexbildung der
79
84
84
AiAo-ATP-Synthase
85
3.3.3
EM-Aufnahmen der gereinigten AiAo-ATP-Synthase
86
3.3.1
LILBID-MS
87
3.3.2
Gelfiltration
90
3.4
Rekonstitution der gereinigten AiAo-ATP-Synthase in Proteoliposomen .... 91
3.4.1
ATP-Synthese an Proteoliposomen
92
3.4.2
EM-Aufnahmen der Proteoliposomen
93
3.4.3
Variation der Reinigungsbedingungen
93
3.5
Generierung und Untersuchung einzelner ATP-Synthase-Mutanten
95
3.5.1
Mutationen in der c-Untereinheit
95
3.5.2
Mutationen in der a-Untereinheit
100
3.5.3
Mutationen in den peripheren Stielen
102
3.6
ATP-Synthase-Aktivitäten an Membranen von E. coli DK8 pRT1
105
3.6.1
ATP-Hydrolyse an Membranen von E. coli DK8 pRT1
105
3.6.2
Nachweis der ATPase in Membranen von E. coli DK8 pRT 1
105
3.6.3
ATP-Synthese an invertierten Membranvesikeln von E. coli DK8
pRT1
3.7
Analysen zur Funktion von ahaG
106
108
3.7.1
Nachweis der Transkription von ahaG
109
3.7.2
In silico Strukturanalyse von AhaG
110
3.7.3
Analyse des Einflusses der Deletion von ahaG
110
3.7.4
Generierung von Antikörpern gegen AhaG
115
Inhaltsverzeichnis
4
DISKUSSION
4.1
4.1.1
4.3
118
Heterologe Produktion und Charaktersierung der A^o-ATP-Synthase
von M. mazei
4.2
IX
ATP-Hydrolyse an Membranvesikeln von E. coli DK8
118
122
Ein-Schritt-Reinigung der heterolog produzierten ATP-Synthase
von M. mazei aus E. coli DK8
124
Herstellung und Analyse von Mutanten
126
4.3.1
Mutationen der c-Untereinheit
4.3.2
Mutationen innerhalb der membranständigen Domäne der
4.3.3
126
a-Untereinheit
127
Mutationen im Bereich des Stators
132
4.4
Analysen zur Funktion von ahaG
137
4.5
Untersuchungen zur Natur des Kopplungsions
139
5
ZUSAMMENFASSUNG
147
6
LITERATURVERZEICHNIS
149
7
ANHANG
164
DANKSAGUNG
179
LEBENSLAUF
180