Einfluss der beiden endogenen Peptide Angiotensin II und

Aus der Medizinischen Universitätsklinik
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
Abteilung für Kardiologie und Angiologie
Ärztlicher Direktor Prof. Dr. Hanjörg Just
E INFLUSS DER BEIDEN ENDOGENEN P EPTIDE
ANGIOTENSIN II UND E NDOTHELIN -1
AUF DIE
K ONTRAKTILITÄT ISOLIERTER K ARDIOMYOZYTEN
VON MENSCHLICHEM
V ORHOF - UND V ENTRIKELGEWEBE
INAUGURAL - DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg i. Br.
Vorgelegt 1998
von Caroline Rummer
geboren in Bonn
Dekan
Prof. Dr.Dr.h.c. H. E. Blum
1. Gutachter
Prof. Dr. Ch. Holubarsch
2. Gutachter
Prof. Dr. D. Kececioglu
Jahr der Promotion
2000
meinen Eltern
Inhaltsverzeichnis
4
INHALTSVERZEICHNIS
I EINLEITUNG
8
I.1 DEFINITION UND PATHOGENESE DER HERZINSUFFIZIENZ
9
I.2 REGULATIONSMECHANISMEN DER MYOKARDIALEN KONTRAKTILITÄT
10
I.2.1 REGULATIONSMECHANISMEN BEIM GESUNDEN HERZ
10
I.2.2 ALTERATION DER PHYSIOLOGISCHEN REGULATIONSMECHANISMEN BEI HERZINSUFFIZIENZ 11
I.3 THERAPIE DER HERZINSUFFIZIENZ
13
I.4 ROLLE DER VASOAKTIVEN PEPTIDE BEI HERZINSUFFIZIENZ
16
I.5 ANGIOTENSIN II : GRUNDLAGEN
17
I.5.1 SYNTHESE VON ANGIOTENSIN II
17
I.5.2 DAS KARDIALE RENIN-ANGIOTENSIN-SYSTEM
17
I.5.3 SIGNALÜBERTRAGUNG VON ANGIOTENSIN II ÜBER DEN AT1-REZEPTOR
20
I.5.4 W IRKUNGEN VON ANGIOTENSIN II
22
I.6 ENDOTHELIN : GRUNDLAGEN
25
I.6.1 SYNTHESE DER ENDOTHELINE
25
I.6.2 DAS KARDIALE ENDOTHELIN-SYSTEM
26
I.6.3 SIGNALÜBERTRAGUNG VON ENDOTHELIN-1
28
I.6.4 W IRKUNGEN VON ENDOTHELIN-1
29
I.7 OFFENE FRAGEN UND FRAGESTELLUNG DIESER ARBEIT
33
I.7.1 OFFENE FRAGEN
33
I.7.2 FRAGESTELLUNG DIESER ARBEIT
34
Inhaltsverzeichnis
5
II MATERIAL UND METHODEN
35
II.1 UNTERSUCHTES GEWEBE
35
II.1.1 GEWEBE AUS NICHT-INSUFFIZIENTEM ATRIUM DEXTRUM
35
II.1.2 GEWEBE VON PATIENTEN MIT TERMINALER HERZINSUFFIZIENZ
35
II.1.3 VENTRIKELPROBEN LINKSVENTRIKULÄR
36
II.1.4 MEDIKATION DER PATIENTEN
36
II.2 LÖSUNGEN UND VERWENDETE SUBSTANZEN
37
II.2.1 TYRODEN, LOW CALCIUM, ENZYMLÖSUNG
37
II.2.2 W IRKUNG VON 2,3-BUTANEDIONE-MONOXIME UND NITRILOTRIACETIC-SÄURE
37
II.2.3 SUBSTANZEN
38
II.3 TRANSPORT
39
II.3.1 VENTRIKEL- UND VORHOFMYOKARD AUS DER UNIVERSITÄTSKLINIK FREIBURG
39
II.3.2 BIOPSIE-MATERIAL AUS FREIBURG
39
II.3.3 MYOKARD AUS DEM HERZZENTRUM BAD OEYNHAUSEN
39
II.4 PRÄPARATION
40
II.4.1 LINKSVENTRIKULÄRES GEWEBE
40
II.4.2 VORHOFGEWEBE
40
II.5 ZELLISOLIERUNG
41
II.6 MESSUNG DER KONTRAKTILITÄT DER ISOLIERTEN MYOZYTEN
42
II.6.1 VERSUCHSAUFBAU
42
II.7 VERSUCHSABLAUF
48
II.7.1 DOSIS-W IRKUNGSKURVE MIT CALCIUMIONEN
49
II.7.2 ISOPROTERENOL-DOSIS-W IRKUNGSKURVEN
49
II.7.3 ANGIOTENSIN II DOSIS-W IRKUNGSKURVEN
50
II.7.4 ENDOTHELIN-DOSIS-W IRKUNGSKURVE
50
II.8 AUSWERTUNG
52
II.8.1 NORMIERUNG DER DATEN
52
Inhaltsverzeichnis
6
II.8.2 STATISTISCHE AUSWERTUNG
53
III ERGEBNISSE
54
III.1 EINFLUSS DER EXTRAZELLULÄREN CALCIUMKONZENTRATION AUF DIE
KONTRAKTILITÄTSPARAMETER LINKSVENTRIKULÄRER MYOZYTEN
54
III.2 EINFLUSS VON ISOPROTERENOL AUF DIE KONTRAKTILITÄTSPARAMETER
LINKSVENTRIKULÄRER MYOZYTEN
58
III.3 UNTERSUCHUNGEN ZUR ANGIOTENSIN II - WIRKUNG AUF DEN RECHTEN VORHOF
62
III.3.1 EINFLUSS VON ANGIOTENSIN II AUF DIE KONTRAKTILITÄTSPARAMETER ATRIALER MYOZYTEN63
III.3.2 EINFLUSS DES ANGIOTENSIN II - REZEPTORANTAGONISTEN LOSARTAN AUF DIE
ANGIOTENSIN II -W IRKUNG
66
III.4 EINFLUSS VON ANGIOTENSIN II AUF DIE KONTRAKTILITÄTSPARAMETER
LINKSVENTRIKULÄRER MYOZYTEN
68
III.5 UNTERSUCHUNGEN ZUR ENDOTHELIN-1-WIRKUNG AM RECHTEN VORHOF
71
III.5.1 EINFLUSS VON ENDOTHELIN-1 AUF DIE KONTRAKTILITÄTSPARAMETER ATRIALER
MYOZYTEN
72
III.5.2 EINFLUSS DES ENDOTHELIN-1-REZEPTORANTAGONISTEN BQ 123 AUF DIE
ENDOTHELINWIRKUNG
75
III.6 UNTERSUCHUNGEN ZUR ENDOTHELIN-1- WIRKUNG AM VENTRIKEL
77
IV DISKUSSION
80
IV.1 METHODE ZUR GEWINNUNG VON ISOLIERTEN KARDIOMYOZYTEN
80
IV.2 ÜBERPRÜFUNG DER ISOLIERTEN KARDIOMYOZYTEN AUF KONTRAKTILE RESERVEN UND
INTAKTE REZEPTOREN
83
IV.2.1 CALCIUM-W IRKUNGSANALYSE
83
IV.2.2 ISOPROTERENOL-W IRKUNGSANALYSE
84
IV.3 EINFLUSS VON ANGIOTENSIN II AUF DIE KONTRAKTILITÄT HUMANER KARDIOMYOZYTEN
86
IV.3.1 ANGIOTENSINWIRKUNG AN HUMANEN ATRIALEN KARDIOMYOZYTEN
86
IV.3.2 ANGIOTENSINWIRKUNG AN HUMANEN VENTRIKELKARDIOMYOZYTEN
87
Inhaltsverzeichnis
7
IV.4 EINFLUSS VON ENDOTHELIN-1 AUF DIE KONTRAKTILITÄT HUMANER KARDIOMYOZYTEN
90
IV.4.1 ENDOTHELINWIRKUNG AN HUMANEN RECHTSATRIALEN KARDIOMYOZYTEN
90
IV.4.2 ENDOTHELIN-1-W IRKUNG AN HUMANEN LINKSVENTRIKULÄREN KARDIOMYOZYTEN
91
IV.5 PHYSIOLOGISCHE BEDEUTUNG VON ANGIOTENSIN II UND ENDOTHELIN-1
95
V ZUSAMMENFASSUNG
100
VI ABBILDUNGSVERZEICHNIS
101
VII TABELLENVERZEICHNIS
102
VIII LITERATUR
103
IX LEBENSLAUF
128
X DANKSAGUNGEN
129
Einleitung
8
I Einleitung
Die Herzinsuffizienz ist eine sehr verbreitete Krankheit in den Industrienationen.
Therapiestrategien, die hauptsächlich die Hämodynamik verbessern, müssen nicht
zwangsweise die Progredienz der Erkrankung aufhalten. In den letzten Jahren
kamen Ideen auf, daß die Herzinsuffizienz nicht nur die Folge hämodynamischer
Dysregulationen sei, sondern daß die endogenen neurohumoralen Mechanismen
eine zentrale Rolle in der Entstehung und der Progredienz dieser Erkrankung
spielen.
Seit der Entdeckung eines lokalen intrakardialen Angiotensin-Systems, das über
Rezeptoren und Peptidsynthese verfügt, hat die Bedeutung der Therapieschemata
zugenommen, die in dieses System hemmend eingreifen. Angiotensin II führt über
Wasser- und Natriumretention zu ungünstigen hämodynamischen Bedingungen.
Auch scheint Angiotensin II als Wachstumsfaktor die Herzhypertrophie zu
stimulieren. Das trägt zur Progredienz der Erkrankung bei. Therapeutisch kommen
derzeit
Angiotensin-Konversionsenzym-Hemmstoffe
(ACE-Inhibitoren)
und
die
Angiotensin-Rezeptorenblocker (AT II-Rezeptorenblocker) zum Einsatz. Für die
ACE-Inhibitoren hat sich herausgestellt, daß sie in der Lage sind, die Mortalität zu
senken, zudem konnte die Symptomatik der Patienten gebessert werden. Da die
ACE-Inhibitoren möglicherweise die Angiotensin II-Produktion im Herzen nicht
vollständig hemmen können, weil Angiotensin I zusätzlich über Chymasen
konvertiert werden kann, nimmt für die kardiale Funktion die Bedeutung von AT IIRezeptorenblockern zu. Dazu muß geklärt werden, welchen Einfluß Angiotensin II
hinblicklich der Funktionalität auf die kardialen Strukturen hat, insbesondere auf die
Kardiomyozyten, die für die Kontraktilität verantwortlich sind.
Noch nicht geklärt ist die Bedeutung des Endothelin-Systems für das menschliche
Herz. Endothelin wurde als derzeit potentester Vasokonstriktor von Yanagisawa
entdeckt, mittlerweile hat man auch für dieses Peptid Rezeptoren an humanen
Kardiomyozyten
gefunden.
Derzeit
werden
erste
Studien
mit
Endothelin-
Rezeptorenblockern am Menschen durchgeführt. Doch ist auch hier nicht klar,
welche
Endothelin-Funktionen
man
mit
diesen
Medikamenten
an
den
Kardiomyozyten blockiert. Möglicherweise induziert man mit der Therapie negativinotrope Effekte, da an myokardialen Streifenpräparaten eine Kraftzunahme unter
Endothelin-Inkubation zu sehen war.
Einleitung
9
Bisher fanden Untersuchungen zur Wirkung dieser endogenen Peptide vor allem an
Herzmuskel-Streifenpräparaten statt. In dieser Arbeit sollen die Wirkungen von
Angiotensin II und Endothelin-1 auf isolierte menschliche Kardiomyozyten aus
Vorhof- und Ventrikelmyokard untersucht werden.
I.1 Definition und Pathogenese der Herzinsuffizienz
Die Herzinsuffizienz ist ein klinisches Syndrom, das durch verschiedene Ursachen
hervorgerufen werden kann. Als Herzinsuffizienz wird derjenige Zustand definiert, bei
dem das Herz trotz ausreichendem venösen Rückfluß nicht mehr in der Lage ist, den
gesamten Organismus seinen Bedürfnissen entsprechend mit Blut zu versorgen [97].
Die Störung der Pumpfunktion entsteht entweder durch eine direkte myokardiale
Veränderung (z. B. Ischämie, Myokarditis, dilatative Kardiomyopathie) oder
extramyokardial (z.B. Koronare Herzkrankheit, Herzklappenvitien, Hypertonus), was
dann sekundär zu einer Herzinsuffizienz führt. Allen Ursachen gemeinsam sind die
verminderte Auswurfleistung des Herzens. Dadurch staut sich das Blut in den
Lungenkreislauf (Linksherzinsuffizienz) und/oder in den venösen Kreislauf (Rechts-,
bzw. Globalherzinsuffizienz) zurück. Der arterielle Perfusionsdruck der peripheren
Organe nimmt ab, reflektorisch wird dieser Druckabfall mit unterschiedlichen
neurohormonalen Kompensationsmechanismen beantwortet [59]. Dadurch wird der
periphere Widerstand erhöht, als Folge steigt die Nachlast; diese stellt für das
Myokard eine deutliche Mehrbelastung dar. Bleibt dieser Zustand bestehen, kommt
es über kurz oder lang zur Dekompensation.
Die Herzinsuffizienz ist eine häufige Erkrankung vor allen in den Industrienationen;
jährlich erkranken weltweit etwa 15 Millionen Menschen [14].
Die Prognose dieser Krankheit ist ungünstig. So starben, untersucht in einer groß
angelegten Studie (Framingham-Studie), innerhalb der ersten zwei Jahre nach
Diagnosestellung 38% der weiblichen und 37% der männlichen Erkrankten. Nach
sechs Jahren waren vom beobachteten Kollektiv nur noch 33% der Frauen und 18%
der Männer am Leben [129, 65].
Einleitung
10
I.2 Regulationsmechanismen der myokardialen Kontraktilität
I.2.1 Regulationsmechanismen beim gesunden Herz
Im Falle eines Mißverhältnisses zwischen angebotener und für den Metabolismus
der Organe notwendigen Blutmenge, z.B. unter Mehrbelastung, versucht der Körper
kurzfristig
über
eine
Kontraktilitätssteigerung
des
Herzmuskels
dieses
auszugleichen. Hierfür kommen vier Regulationsmechanismen in Frage:
• Frank-Starling Mechanismus: führt bei Vorlaststeigerung zu einer Dehnung der
Sarkomere, dadurch wird die Kontraktionskraft des Herzmuskels erhöht [196].
• Aktivierung des Sympathikus und Freisetzung von Noradrenalin: führt im
Kardiomyozyt zu einer Rezeptor- vermittelten, cAMP-abhängigen Steigerung der
Kontraktilität des Herzmuskels [154].
• positive Kraft-Frequenz-Beziehung: eine Erhöhung der Herzfrequenz über das
sympathische
Nervensystem
führt
zu
einer
Calcium-abhängigen
Kontraktilitätssteigerung.
• Aktivierung vasoaktiver Peptide: es kommt zu erhöhten Plasmaspiegeln
vasoaktiver Peptide, beispielsweise von Angiotensin II und Endothelin-1.
Einleitung
I.2.2 Alteration
11
der
physiologischen
Regulationsmechanismen
bei
Herzinsuffizienz
Es ist bekannt, daß diese physiologischen Regulationsmechanismen bei der
Herzinsuffizienz zum Teil verändert sind.
Der Frank-Starling-Mechanismus kann nur bis zu einer bestimmten Grenze wirksam
sein, ist aber auch am insuffizienten Herz nachgewiesen worden [85]. Bei
anhaltender hämodynamischer Belastung kommt es zu einer Überdehnung der
Sarkomere und somit zur Dilatation des Ventrikels. Die somit massiv erhöhte
Wandspannung kann durch Hypertrophie des Muskels nicht mehr kompensiert
werden, es besteht nun eine Gefügedilatation mit erhöhtem Bindegewebsanteil und
veränderter Myokardfaseranordnung [83].
Auch die arterielle Versorgung des hypertrophierten Ventrikels wird schlechter, da
zum einen das Blutgefäßwachstum nicht Schritt hält, zum anderen durch die erhöhte
Wandspannung die Perfusion erschwert ist. Durch positiv inotrope und chronotrope
Effekte, wie sie durch die neurohumoralen Regulationsmechanismen zustande
kommen, wird der myokardiale Sauerstoffverbrauch zusätzlich gesteigert [178].
Es kommt auch zu Veränderungen des Myozyten-Phänotypes. So verändern sich die
transmembranären Signalübertragungen, z.B. werden β1-Rezeptoren vermindert
exprimiert [23, 24]. Es kommt zu einer Verschiebung der inhibitorischen G-Proteine
[20, 58], was durch eine geringere Stimulation der Adenylatcyclase zu einem
verminderten Gehalt an cAMP und folglich zu einer geringeren Ansprechbarkeit des
Myokards auf Katecholamine führt. Auch die Regulation der Calciumhomöostase
2+
ändert sich; so nimmt die Expression der sakroplasmatischen Ca -ATPase ab und
die Expression des membranären Na+/Ca2+-Austauschers zu [83].
Am insuffizienten Herzen ist auch die Kraft bei zunehmender Herzfrequenz
vermindert (negative Kraft-Frequenz-Beziehung) [145, 157, 158].
Die dauerhafte Aktivierung neurohumoraler Mechanismen (Renin-AngiotensinAldosteron-System, Endothelin, Vasopressin, Sympathikus) führt einerseits durch
Vasokonstriktion zu einem erhöhten peripheren Widerstand, andererseits zu einer
vermehrten Salz- und Wasserretention. Das hat ein erhöhtes intravasales Volumen
zur Folge und führt zu einer vermehrten Arbeitsbelastung und zur Hypertrophie des
Myokards [154]. Erhöhte Konzentrationen von Angiotensin und Endothelin wirken
Einleitung
12
auch als Wachstumsfaktoren für Kardiomyozyten und Fibroblasten, was zu einem
Umbauprozeß im Herzmuskelgewebe und einer Funktionsminderung führt [10, 93,
119, 180, 198].
Durch Dehnung der Vorhöfe und Ventrikel, aber auch durch erhöhte Plasmaspiegel
von Endothelin-1 und Angiotensin II [72] kommt es zur Freisetzung kardialer
Gewebshormone. Dehnung der Vorhöfe hat die Freisetzung von ANF (Atrialer
Natriuretischer Faktor), Dehnung der Ventrikel die Freisetzung von BNP (brain
natriuretic peptide) zur Folge. Beide Hormone wirken vasodilatorisch und
natriuretisch-diuretisch,
indem
sie
das
Renin-Angiotensin-Aldosteron-System
hemmen. Mit zunehmender Herzinsuffizienz steigt der Spiegel beider Hormone im
Serum an. Durch Down-Regulation der renalen Rezeptorendichte und Überwiegen
der vasokonstriktorisch wirkenden Hormone (Angiotensin II, Noradrenalin) wird die
Wirkung beider Hormone überspielt. ANF und BNP scheinen auch ein sicherer
Marker für kardiale Hypertrophie zu sein. Unter Einwirkung von Angiotensin und
Endothelin in kombinierten Kulturen von Kardiomyozyten und Fibroblasten
neonataler Ratten steigt die Produktion von ANF und BNP signifikant an [72, 73].
Die oben genannten Veränderungen lassen sich nicht alle eindeutig als günstig oder
ungünstig für die Herzfunktion einstufen. Eine über längere Zeit anhaltende
hämodynamische Überlastung und die neurohumorale Überstimulation führen zur
weiteren Verschlechterung, es entsteht eine chronisch progressive Erkrankung.
Einleitung
13
I.3 Therapie der Herzinsuffizienz
Es gibt verschiedene pharmakologische Ansätze, die Herzinsuffizienz zu behandeln.
Bei der akuten Herzinsuffizienz kommen Katecholamine und Hemmstoffe der
Phosphodiesterase III [189] zum Einsatz. Hiermit wird ein positiv inotroper Effekt
erzielt.
Bei der chronischen Herzinsuffizienz wird mit herzwirksamen Glykosiden [109]
versucht, die myokardiale Kontraktilität zu verbessern und der hämodynamischen
Belastung anzupassen. Bisher konnte kein eindeutig positiver Effekt auf die
Mortalität nachgewiesen werden. In einer randomisierten Doppelblindstudie wurde
Digoxin gegen Placebo getestet. Die Mortalität änderte sich bei den mit Digoxin
behandelten Patienten nicht, doch mußten sie
weniger oft
wegen
einer
Verschlechterung ihrer Herzinsuffizienz hospitalisiert werden [6, 81, 176].
Diuretika [12] und Vasodilatantien [37] (ohne Angiotensin-KonversionsenzymHemmstoffe) senken die Vor- und Nachlast des Herzens. Zumindest für die
Vasodilatantien ist nachgewiesen worden, daß durch ihren Einsatz die Mortalität
gesenkt werden kann [36].
Durch die Therapie mit niedrig dosierten β-Rezeptoren-Blockern versucht man bei
herzinsuffizienten Patienten der adrenergen Überstimulation entgegenzuwirken [54].
Es kommt zwar durch die niedrig eingesetzten Konzentrationen zu einer weiteren
Abnahme
der
myokardialen
bradykardisierende
Wirkung
Kontraktilität,
der
doch
Sauerstoffbedarf
wird
durch
gesenkt.
die
günstige
Zudem
wird
wahrscheinlich die Down-Regulation der β-Rezeptoren und der nachgeschalteten GProteine vermindert [79]. Beides könnte Ursache für die beobachtete Besserung der
klinischen Symptomatik sein [50]. Mittlerweile laufen einige Mortalitätsstudien, die die
Wirkung von β-Rezeptorenblockern untersuchen. In der MDC-Studie (The Metoprolol
in Dilated Cardiomyopathy Trial Study) [5] wurde beobachtet, daß nach einem Jahr
in der Metoprolol-Gruppe signifikant weniger Patienten herztransplantiert werden
mußten und nach drei Jahren mehr Patienten noch lebten. Zudem stieg in der
Metoprolol-Gruppe die Lebensqualität signifikant an, während sich die Patienten in
der Placebo-Gruppe nicht besser fühlten [222]. In einer weiteren Mortalitätsstudie
wurde die Wirkung von Bisoprolol auf die Hämodynamik untersucht (CIBIS: Cardiac
Insufficiency Bisoprolol Study). Hier wurden 557 Patienten in einer Placebokontrollierten Studie beobachtet. In der Bisoprolol-Gruppe sank die Herzfrequenz
Einleitung
14
signifikant, die linksventrikuläre Verkürzungsfraktion nahm signifikant zu. Beides
korrelierte mit einer verminderten Mortalität [108]. Schadlich et al. [188] errechneten
auch einen wirtschaftlichen Vorteil für die Bundesrepublik Deutschland, wenn
Patienten mit Herzinsuffizienz auch mit Bisoprolol therapiert werden. Nun läuft eine
Folgestudie (CIBIS II), in der der primäre Endpunkt das Versterben des Patienten ist,
der aufgrund seiner ischämischen oder dilatativen Kardiomyopathie zusätzlich zu
Diuretika und Angiotensin-Konversionsenzym-Hemmern mit Bisoprolol behandelt
wird [4]. Aktuell wurde nun von Gottlieb et al. [68] eine Studie veröffentlicht, in der
Patienten, die nach einem Herzinfarkt mit β-Rezeptorenblockern behandelt wurden,
von dieser Therapie profitierten; die Mortalität sank um 40%. In der APSIS-Studie
(The Angina Prognosis Study in Stockholm) verglichen Rehnqvist et al. die Wirkung
von Calciumantagonisten mit der von β-Rezeptorenblockern an 809 Patienten unter
70 Jahren mit stabiler Angina pectoris [174]. Sie konnten in Hinblick auf die
Mortalität, kardio- und cerebrovaskuläre Komplikationen und psychosomatische
Symptome keinen signifikanten Unterschied entdecken.
Eine breite Anwendung in der Therapie der Herzinsuffizienz finden die Hemmstoffe
des Renin-Angiotensin-Systems. Sie reduzieren nicht nur die Mortalität und sind hier
den reinen Vasodilatantien überlegen [37], sondern verbessern deutlich die
Symptome [175] und vermindern die kardiale Hypertrophie [147]. Zum Einsatz
kommen zum einen Angiotensin-Konversionsenzym-Hemmstoffe, zum anderen
spezifische Angiotensin-1-Rezeptoren-Blocker. In einer groß angelegten Studie, die
zur Zeit noch läuft, wurde bei Patienten über 65 Jahre, die bisher keine ACEHemmstoffe einnahmen, die Wirkung von Captopril (ACE-Inhibitor) gegenüber
Losartan (AT-Rezeptorantagonist) geprüft [161]. Bisher konnte in der LosartanGruppe eine geringere Mortalität und bessere Verträglichkeit des Medikaments
beobachtet werden. Brooksbay et al. [25] führen die verminderte Mortalität unter
anderem darauf zurück, daß Losartan im Gegensatz zu Captopril nicht die QT-Zeit in
der Herzaktion verlängert und somit das Risiko maligner Arrhythmien mit folgendem
plötzlichen Herztod vermindert ist. In einer weiteren Pilot-Studie (RESOLVD pilot
study) werden der Rezeptorenblocker Candesartan, der ACE-Hemmstoff Enalapril
und die Kombination beider Medikamente überprüft. In der Kombinationsgruppe
ließen sich günstige Effekte feststellen: der Aldosteronspiegel und der Blutdruck
sanken, die BNP-Expression wurde supprimiert und das ventrikuläre Remodeling
vermindert.
Einleitung
15
Neuerdings wird auch in klinischen Studien untersucht, wie der Einsatz von
Endothelin-1-Rezeptoren-Blockern
die
Symptomatik
und
Progredienz
der
Herzinsuffizienz beeinflußt. Erste Ergebnisse besagen, daß der Einsatz von
unspezifischen Rezeptoren-Blockern zwar zur Vasodilatation, zur Verminderung der
ventrikulären Füllungsdrücke und des Pulmonalarteriendruckes [102] führt, es aber
zu erhöhten Endothelin-1-Plasmaspiegeln kommt, wahrscheinlich weil der ETBRezeptor eine Clearance-Funktion für Endothelin-1 hat [39]. Ein Vergleich zwischen
selektiven ETA- oder ETB-Blockern zeigte an Ratten, daß nur die Behandlung mit
ETA-Rezeptorenblockern
zu
günstigeren
hämodynamischen
und
inotropen
Verhältnissen führt [16].
Insgesamt konnte beobachtet werden, daß die Therapie mit Medikamenten, die die
Hämodynamik günstig beeinflussen, zwar zu einer Besserung der Symptomatik führt,
jedoch nicht die Progredienz der Herzinsuffizienz aufhalten konnte. Insofern kommt
die Vermutung auf, daß die Ursache der Progredienz nicht die hämodynamischen
Entgleisungen
sind,
sondern
die
Ursache
vielmehr
in
den
aktivierten
neurohumoralen Mechanismen zu suchen ist [155]. Therapeutische Interventionen,
die die Aktivität dieser neurohumoralen Systeme blockieren, bringen Vorteile für den
Patienten, die nicht durch eine Verbesserung der myokardialen Kontraktilität oder
eine verbesserte Ejektionsfraktion zu erklären sind, sondern auch in der
Verminderung des ventrikulären Remodelings, das zur Myokardfibrose und zum
Funktionsverlust führt.
Einleitung
16
I.4 Rolle der vasoaktiven Peptide bei Herzinsuffizienz
In
den
letzten
Jahren
wurde
zunehmend
die
Bedeutung neurohumoraler
Regulationsmechanismen bei kardiovaskulären Erkrankungen erkannt. Die Rolle des
Renin-Angiotensin-Systems wurde bezüglich seiner Rolle bei Herzinsuffizienz am
besten untersucht. Es zeigte sich, daß die Plasmaspiegel von Angiotensin II bei
Herzinsuffizienz erhöht sind [154].
Yangagisawa [226] beschrieb 1988 erstmals das Peptid Endothelin und dessen
Isolation. Es ist der potenteste bisher bekannte Vasokonstriktor. In den letzten
Jahren zeigte sich, daß es bei einer Vielzahl von Erkrankungen zu einer Aktivierung
des Endothelin-Systems kommt, unter anderem bei vielen kardiovaskulären
Erkrankungen. Beispielsweise sind die Plasmaendothelinspiegel bei Atherosklerose,
Angina Pectoris, Myokardischämie, Herzinfarkt, bei Herzinsuffizienz und dilatativen
Kardiomyopathien und nach Herztranplantationen erhöht. Über die direkte Wirkung
von Endothelin am menschlichen Myokard liegen allerdings nur unzureichende
Untersuchungen vor.
Abbildung 1: Circulus vitiosus: Synopsis der Pathogenese und Therapie der chronischen
Herzinsuffizienz.
Einleitung
17
I.5 Angiotensin II : Grundlagen
I.5.1 Synthese von Angiotensin II
Das Renin-Angiotensin-System wird über verschiedene Wege stimuliert. So kommt
es bei einer verminderten Nierenperfusion (z.B. Nierenarterienstenose, Hypotonie,
Hypovolämie, Orthostase) zu einer gesteigerten Reninausschüttung aus den
Epitheloidzellen des juxtaglomerulären Apparates der Niere. Ein weiterer Reiz ist ein
verändertes Ionenmilieu im distalen Tubulus an der Makula densa oder eine βadrenerge Stimulation, während vagale Reize die Reninsezernierung vermindern. Es
besteht ebenfalls ein humoraler Regulationsmechanismus über Vasopressin und
den Atrialen Natriuretischen Faktor, sowie eine Rückkopplung durch Angiotensin II.
Renin spaltet aus dem aus der Leber synthetisierten Angiotensinogen das
Dekapeptid Angiotensin I ab, das biologisch inaktiv ist. Das AngiotensinKonversionsenzym (ACE) wandelt Angiotensin I zum biologisch aktiven Angiotensin
II, einem Oktapeptid, um. ACE ist hauptsächlich im Gefäßendothel der Lunge
lokalisiert und ist mit der Bradykinin abbauenden Kinase II identisch [31]. Angiotensin
II wird durch ubiquitär vorkommende proteolytische Enzyme rasch in Angiotensin III
und weiter in inaktive Peptidfragmente umgewandelt.
I.5.2 Das kardiale Renin-Angiotensin-System
In verschiedenen Studien an Ratten- und Mäuseherzen wurden Angiotensinogen
[Lindpainter1990,St79] und die Expression seiner mRNA nachgewiesen. Im
Vergleich zur Leber waren die Protein- und mRNA-Mengen wesentlich geringer (15%), die Gen-Expression war an den Vorhöfen ausgeprägter als in den Ventrikeln
[48]. In experimentell infarzierten Rattenherzen stieg die mRNA Menge in den nichtinfarzierten hypertrophierten Regionen an, nicht jedoch in anderen Organen. Das
weist auf eine unabhängige und organspezifische Regulation der Genexpression hin.
Die Genexpression für Renin scheint bei der Ratte und der Maus im Ventrikel größer
zu sein als im Vorhof [197]. Auch das Protein Renin selbst konnte im Herzen
lokalisiert werden [172].
Das Angiotensin-Konversionsenzym wurde in zahlreichen Studien im Herzen
verschiedener Spezies nachgewiesen [1, 40, 41, 56, 116, 179, 183, 229]. Die Gen-
Einleitung
18
Expression des ACE wurde im Ratten- [30] und im menschlichen [190] Herz gezeigt.
Die exakte Lokalisation ist allerdings nicht genau bekannt; es wurde im Endokard
[182], Myokard [225], in den Herzklappen und den Vorhöfen gefunden. In einer
funktionellen Studie wurde die Enzymaktivität auch außerhalb des Endokards
gezeigt, nicht jedoch zwischen Bindegewebe und Myokard differenziert [131]. Die
Aktivität des ACE [122] und die Genexpression [190] ist bei druckbelasteten,
hypertrophierten Herzen gesteigert. Es ist nicht sicher, ob das ACE im menschlichen
Herzen eine große Bedeutung hat. Durch Hemmung des Enzyms konnte die
Angiotensin II-Synthese nur minimal blockiert werden, mit Hemmstoffen der SerinProteasen gelang dies jedoch zu 75% [213]. Kürzlich gelang die Isolation und
Klonierung einer Herz-spezifischen Chymase, die mit größter Spezifität und Effizienz
Angiotensin I zu Angiotensin II konvertiert. Vor allem in Hypoxie oder in
Streßzuständen scheint diese Chymase stark zu wirken und beispielsweise
Gefäßalterationen nach Verletzungen durch Ballondilatation und pathologische
Umbauprozesse im Herzmuskel zu unterstützen [148, 214]. Sollte dieser
Mechanismus für die kardiale Angiotensin II-Synthese von Bedeutung sein, so wird
mit ACE-Inhibitoren der Einfluß von Angiotensin II auf das Myokard nicht verhindert,
sondern möglicherweise verstärkt [26]. Allerdings gelang es an Präparaten von
menschlichem Vorhof, die Wirkung von Angiotensin I durch Blockade des ACE zu
verhindern [84].
Angiotensin I und II wurden im Myokard von Rhesusaffen nachgewiesen, wobei die
Konzentrationen im rechten Vorhof am höchsten waren, gefolgt vom rechten
Ventrikel, linken Vorhof, Septum und linken Ventrikel [117]. Beim Kaninchen [210]
und Ratten [223] gelang der Nachweis eines selbständigen kardialen ReninAngiotensin-Systems.
Kardiale Angiotensin Rezeptoren fanden sich am Herzen der Ratte, des Kaninchens,
des Meerschweinchens, der Kuh, des Huhns und des Menschen an verschiedenen
Stellen, und zwar an den Myozyten, Koronargefäßen, Reizleitungssystem,
sympathischen Nerven und Vagusganglien. Untersuchungen zeigten, daß es sich
um Hormonrezeptoren handelt. Derzeit können in verschiedenen Geweben vier
Rezeptorsubtypen nachgewiesen werden (AT1, AT2, AT3, AT4) [32, 200], wobei für
die zwei ersten Typen wiederum Subtypen abgegrenzt werden können [95, 207]. Die
cDNA für den menschlichen AT1-Rezeptor wurde 1992 geklont [202, 13]. Für den
AT2-Rezeptor gelang dies 1994 durch Tsuzuki et al. [209]. Die Subtypen haben
Einleitung
19
unterschiedliche Funktionen, im Verlaufe einer Herzinsuffizienz kommt es zu einer
Verschiebung im Verhältnis dieser Subtypen. So konnte an der Ratte gezeigt
werden, daß nach myokardialer Infarzierung selektiv die AT1-Rezeptorendichte in
den ersten sieben Tagen zunahm [130, 87, 112]. Auch am Menschen konnte ein
verändertes Verhältnis der Angiotensin II-Rezeptoren festgestellt werden. Im
normalen menschlichen Myokard ist die Rezeptorendichte im rechten Vorhof höher
als im linken Vorhof und den Ventrikeln. Im Neugeborenen- und Jugendalter ist die
Dichte wesentlich höher als beim Erwachsenen [212]. Asano et al. [9] beobachteten
an
humanem
Myokard
dagegen
eine
Abnahme
der
AT1-Rezeptoren
im
linksventrikulären Myokard. Die Abnahme war in ischämischen Herzen nicht ganz so
ausgeprägt wie in Herzen mit dilatativer Kardiomyopathie. Sie wiesen auch die
mRNA für diesen Rezeptor sowohl in den Kardiomyozyten, als auch in den NichtKardiomyozyten durch PCR nach. Regitz-Zagrosek et al. beobachteten an terminal
inszuffizienten humanen Herzen eine Abnahme der Rezeptorendichte am Vorhofund Ventrikelmyokard, auch der mRNA-Gehalt war vermindert [173]. Dabei sind aber
mehr AT2- als AT1-Rezeptoren vorhanden [151]. Da die genaue Funktion der AT2Rezeptoren noch nicht ausreichend geklärt ist, weiß man noch nicht viel über die
funktionelle Relevanz dieses Verhältnisses.
All diese Befunde machen das Vorhandensein eines kardialen Angiotensinsystems
sehr wahrscheinlich. Da auch Rezeptoren gefunden wurden, können Interaktionen
zwischen dem Renin-Angiotensin-System und dem Herz stattfinden.
Einleitung
20
I.5.3 Signalübertragung von Angiotensin II über den AT1-Rezeptor
Angiotensin II bindet an seinen Rezeptor, der an ein G-Protein gekoppelt ist. Dieses
G-Protein
aktiviert
die
Phospholipase
C
(PLC),
die
eine
Hydrolyse
von
Phosphatidylinositol-4,5-biphosphat (PIP2) zu Inositol-1,4,5-triphosphat (IP3) und
Diacylglycerol (DAG) katalysiert. Über dieses System können viele Wirkungen
vermittelt werden.
IP3 scheint die Calciumfreisetzung aus dem Sarkoplasmatischen Retikulum zu
erhöhen [150, 155]. Dieser Effekt wird allerdings nicht in allen Studien bestätigt. Es
ist
möglich,
daß
am
Sarkoplasmatischen
Retikulum
des
menschlichen
Ventrikelmyokards keine Bindungsstelle für Inositoltriphosphat vorhanden ist. Zudem
ist die Konzentration des second messenger nur vorübergehend erhöht [142], so daß
dieser Weg nicht den Hauptwirkmechanismus für die Angiotensinwirkung darstellt.
Diacylglycerol aktiviert die Proteinkinase C (PKC), die wiederum viele andere, für die
Zellfunktion wichtige Proteine phosphorylieren kann [149]. Urabe zeigte 1990 an
isolierten
Kardiomyozyten
den
engen
Zusammenhang
der
kardialen
Angiotensinwirkung und der Proteinkinase C [211]. DAG führt auch über eine
Aktivierung des spannungsabhängigen langsamen Calciumkanals zu einer erhöhten
intrazellulären Calciumkonzentration. Da dies mit einer Verlängerung des kardialen
Aktionspotentials einhergeht, kommt es zu einem erhöhten Calciumeinstrom von
extrazellulär.
Möglicherweise
ist
auch
die
Offenwahrscheinlichkeit
+
für
die
2+
Natriumkanäle erhöht, wodurch es zu einer Aktivierung des Na /Ca -Austauschers
und wieder zu einer erhöhten intrazellulären Calciumkonzentration kommt. Auch der
Na+/H+-Austauscher wird phosphoryliert, hierbei kommt es zu einem intrazellulärem
pH Anstieg und möglicherweise zu einer Affinitätserhöhung des Troponin C für
Calciumionen. Dieser Effekt wurde für Angiotensin II am Kaninchen und für
Endothelin am Frettchen gezeigt [101].
DAG in Gesellschaft mit einer erhöhten intrazellulären Calciumkonzentration
stimuliert aber auch die Transkription des Protoonkogens c-fos, das eine
Schlüsselrolle in der Kontrolle der Genexpression und der Zellproliferation hat [96].
Ebenfalls werden die Gene für c-jun, c-myc und egr-1 [181] und ras und raf [206]
aktiviert und tragen zur Hypertrophie bei.
Außer der PLC wird auch die Phospholipase A2 (PLA2) [120] und die Phosolipase D
(PLD) [60] aktiviert. Von einer Aktivierung der Src-Familie und der Janus-Kinasen
Einleitung
21
berichten Marrero [125], was einen Einfluß auf die Transkriptionsaktivität hat und
somit eine Rolle in der Entstehung der Herzmuskelhypertrophie spielt.
Über die AT2-Rezeptoren ist bisher recht wenig bekannt. Ihnen schreibt man eine
antihypertrophe Wirkung zu.
In dem folgendem Schaubild sind die verschiedenen Transduktionswege des
Angiotensin II dargestellt.
Abbildung 2: Intrazelluläre Transduktion von Angiotensin II: potentielle Wirkmechanismen am
Kardiomyozyt. A II = Angiotensin II; R = Rezeptor; G = G-Protein; PLC = Phospholipase C; PKC =
Proteinkinase C; PIP2 = Phosphoinositolbiphosphat; IP3 = Inositoltriphosphat; DAG = Diacylglycerol
Einleitung
22
I.5.4 Wirkungen von Angiotensin II
I.5.4.1 Systemische Angiotensin II- Wirkungen
Die Hauptwirkungen von Angiotensin II sind Vasokonstriktion und Freisetzung von
Aldosteron aus der Nebennierenrinde, was zu einer Wasser- und Natrium-Retention
führt.
An
der
Hypophyse
Corticotropinfreisetzung.
stimuliert
Letztlich
Angiotensin
resultiert
ein
II
die
Vasopressin-
vermehrtes
und
zirkulierendes
Blutvolumen, eine Erhöhung des Blutdruckes und eine Steigerung der Vor- und
Nachlast des Herzens.
Diese Wirkungen kommen durch ein systemisch aktiviertes Angiotensin II zustande.
Ebenso gibt es aber auch Wirkungen, die durch ein organspezifisches (z.B. Niere,
Nebenniere, Gehirn, Gefäßwand, Herz und andere mehr) lokales Renin-AngiotensinSystem vermittelt werden. Im folgenden soll nur auf die kardialen Wirkungen
eingegangen werden.
I.5.4.2 Wirkungen von Angiotensin II auf kardiale Strukturen
Am Sinus- und AV-Knoten [182] und den Purkinje-Fasern [99] befinden sich viele
Angiotensin II-Rezeptoren. Diese weisen die für Angiotensin II typischen Effekte auf
die intrazellulären Calciumkonzentrationen nach und machen einen positiv
chronotropen Effekt am Reizleitungssystem wahrscheinlich.
An den Koronargefäßen führt Angiotensin II ebenso wie in der Peripherie zu einer
Vasokonstriktion [49].
Weiterhin stimuliert Angiotensin II die interstitielle Fibrose durch Fibroblastenwachstum und gesteigerte Kollagensynthese [220]. Auch an neonatalen Rattenkardiomyozyten wirkt Angiotensin II über den AT1-Rezeptor proliferativ und steigert
die Proteinsynthese [215, 163, 201]. Harada et al. [73] zeigten kürzlich, daß
Angiotensin
II
in
Co-Kulturen
von
neonatalen
Rattenkardiomyozyten
und
Fibroblasten zu einem Zellwachstum führt. Auch die Expression von ANF und BNP
wurde gesteigert. In reinen Kardiomyozyten-Kulturen waren diese Effekte nicht zu
sehen, ebenfalls nicht, wenn die Co-Kulturen vor der Angiotensin-Behandlung mit
den Endothelin-Rezeptorenblockern Bosentan oder BQ-123 inkubiert wurden.
1990 untersuchten Moravec et al. [138] die Wirkung von Angiotensin II auf
Muskelstreifenpräparate von normalen und insuffizienten menschlichen Vorhöfen
und von humanen insuffizienten Ventrikeln. Sie fanden einen positiv inotropen Effekt,
Einleitung
23
der am normalen menschlichen Vorhof am größten war; schwächer war der Effekt
am insuffizienten atrialen Myokard, noch weniger ausgeprägt am ventrikulären
Myokard. Zusätzliche Untersuchungen an Hamstermyokard zeigten, daß die positivinotrope Wirkung von Angiotensin II am normalen Myokard größer ist als am
insuffizienten.
Man
muß
allerdings
erwähnen,
daß
die
Versuche
unter
unphysiologischen experimentellen Bedingungen stattfanden. Darüber hinaus konnte
nur in etwa einem Drittel aller Experimente dieser Effekt nachgewiesen werden.
Im Gegensatz dazu konnten Holubarsch et al. 1993 unter physiologischen
Versuchsbedingungen einen positiv inotropen Effekt von Angiotensin II auf
menschliches Vorhofmyokard reproduzierbar nachweisen. Weder am linken, noch
am rechten ventrikulären Myokard zeigte sich ein Einfluß von Angiotensin II auf die
Inotropie [84]. Die Versuche fanden an intakten Muskelstreifenpräparaten statt.
Lefroy et al. [111] unternahmen erstmals Untersuchungen zur Angiotensin II-Wirkung
an humanen isolierten Kardiomyozyten. Sie kamen zu dem Ergebnis, daß
Angiotensin weder auf atriale, noch auf ventrikuläre Myozyten einen Effekt hat,
während sie durch Inkubation mit Isoproterenol oder erhöhten extrazellulären
Calciumkonzentrationen einen starken positiv-inotropen Effekt erzielten.
Einleitung
24
I.5.4.3 Interaktionen
des
Angiotensinsystems
mit
anderen
neurohumoralen
Systemen
Es wurden zahlreiche Mechanismen beobachtet, über welche Angiotensin II den
Sympathikus stimuliert: verstärkte Freisetzung von Katecholaminen aus den
Nervenendigungen [194], verminderte Wiederaufnahme von Noradrenalin in die
Vesikel [195, 98], Stimulation von Sympathikusganglien [2], gesteigerte Biosynthese
von
Katecholaminen
[19],
Freisetzung
von
Katecholaminen
aus
dem
Nebennierenmark [180] und Sensibilisierung der postsynaptischen Strukturen für
Katecholamine [118].
Angiotensin II interagiert über die Aktivierung der Phospholipase C und der
folgenden Phospholipidfreisetzung auch mit der Prostglandinsynthese [115]. Die
Wirkung von Prostaglandinen am Herzen sind noch wenig untersucht.
Über eine Aktivierung des Renin-Angiotensin-Systems wird Bradykinin durch das
Angiotensin-Konversionsenzym schneller abgebaut. Bradykinin hat positiv inotrope
und chronotrope Effekte am Vorhofmyokard des Meerschweinchens [146]; die
Wirkungen am menschlichen Myokard sind noch weitgehend ungeklärt. Bedeutend
werden die Effekte von Bradykinin, wenn es in höheren Konzentrationen auftritt, wie
es unter der Therapie mit Angiotensin-Konversionshemmern der Fall ist.
Neuerdings
wird
auch
ein
positiver
Effekt
von
Angiotensin
II
auf
ein
Regulatorelement des Promotors für den Endothelinrezeptor ETA diskutiert, während
allerdings die mRNA für diesen Rezeptor unter Angiotensin II-Wirkung nicht anstieg
[221].
Es läßt sich ableiten, daß das aktivierte Renin-Angiotensin-System viele direkte und
indirekte Effekte auf das Herz haben kann, die für die Entstehung und Progredienz
der Herzinsuffizienz eine Bedeutung haben können. Trotzdem ist nicht ausreichend
geklärt,
welchen
Kardiomyozyten hat.
Effekt
Angiotensin
II
direkt
auf
menschliche
isolierte
Einleitung
25
I.6 Endothelin : Grundlagen
1988 wurde durch Yanagisawa et al. [226] das 21 Aminosäuren große,
vasokonstriktorische Peptid Endothelin beschrieben. Ihnen gelang es auch, aus dem
Überstand von Schweineendothelzellen Endothelin zu isolieren, zu sequenzieren
und seine Vorstufe Präpro-Endothelin zu klonieren. Die Sequenzierung von
Endothelin zeigte eine bis dahin unbekannte Struktur, die in Homologie-Studien eine
starke Ähnlichkeit zu den Safarotoxinen, dem Gift der mittelasiatischen Schlange
Atractaspis engadensis, aufwies. Die vasokonstriktorische Wirkung von Endothelin
an arteriellen Gefäßen erwies sich in vivo als 100-fach stärker als Angiotensin II,
Vasopressin oder Neuropeptid Y und ist somit der zur Zeit potenteste bekannte
Vasokonstriktor überhaupt. Ein Jahr später wurden weitere Isopeptide entdeckt [89],
Endothelin-2 und Endothelin-3, die sich im Vergleich mit Endothelin-1 in zwei, bzw.
vier Aminosäuren unterschieden.
I.6.1 Synthese der Endotheline
Die Endotheline sind bei den Menschen auf verschiedenen Genloci codiert [8, 18,
82, 171]. Das Translationsprodukt ist ein 212 Aminosäuren langes Peptid, das
Präpro-Endothelin.
Nach
zweimaliger
Spaltung
durch
eine
spezifische
Endopeptidase und eine Carboxypeptidase entsteht das Pro- oder „Big“-Endothelin.
Diese direkte Vorstufe wird durch das sogenannte Endothelin-konvertierende Enzym
(ECE), einer neutralen Metalloprotease, zum maturen Endothelin und einem CFragment gespalten [226]. Das menschliche ECE-1-Gen exprimiert zwei Isoformen
des Enzyms: ECE-1α/a und ECE-1β/b [192, 224]. Ein weiteres Enzym wurde von
Emoto et al. beschrieben und ECE-2 genannt [51]. Kürzlich beschrieben Hasegawa
et al. ein Konversionsenzym, das spezifisch für Big-Endothelin-3 zu sein scheint, sie
nannten es ECE-3 [77].
Einleitung
26
I.6.2 Das kardiale Endothelin-System
Ebenso wie für das Angiotensin-System beschrieben, existieren in verschiedenen
Organen lokale Endothelin-Systeme. Die lokale Produktionsstelle des Endothelins ist
zumeist das Endothel des organversorgenden Gefäßsystems, von wo aus
Endothelin dann überwiegend abluminal sezerniert wird und parakrin und autokrin
wirkt [227, 218]. Für das Herz konnten Grocott-Mason
et
al.
[71]
ein
organspezifisches System nachweisen. Doch bestehen auch eigene Systeme für
große Gefäße [226], die Lunge und Milz [18], die Niere [121], die Leber [177], den
Uterus [29], das Auge [123], den Magen [153], die Blase [205] und für die
Nervenzellen [110, 64, 186, 187].
Tønnessen et al. [203] untersuchten herzinsuffiziente Ratten auf ihren mRNA-Gehalt
und Lokalisation für Präpro-Endothelin und Endothelin. Sie fanden heraus, daß der
Präproendothelin-mRNA-Gehalt in insuffizienten Herzen 3,5-fach, in Infarktregionen
sogar 6,4-fach erhöht war. Die mRNA für den Endothelinvorläufer war hauptsächlich
im Granulationsgewebe lokalisiert. Auch das Peptid Endothelin war vornehmlich in
Infarktregionen nachzuweisen, zum einen in Entzündungszellen, zum anderen in
intakt gebliebenen Kardiomyozyten. Bertolozzi [15] konnte die Expression von mRNA
für Präpro-Endothelin in druckbelasteten Schweineherzen nachweisen.
Präpro-Endothelin wird durch eine Furin-ähnliche Endopeptidase zu Big-Endothelin
gespalten [126].
Plumpton et al. [162] veröffentlichten 1996 eine Studie, in der sie die Expression der
Endothelin-Isoformen und deren Vorläufer immunhistochemisch im humanen
Myokard nachwiesen. Sie fanden alle drei Isoformen des Endothelins, BigEndothelin-1 und das C-Fragment von Big-Endothelin-1. In Extrakten aus humanen
Endokard-Endothel-Zellen
fanden
die
Autoren
höhere
Konzentrationen
von
Endothelin-1 und seinen Vorläufern. Die PCR zeigte mRNA für Endothelin-1 und -2
im linken Ventrikel, Endothelin-3- mRNA konnte nicht nachgewiesen werden. Insgesamt zeigen die Ergebnisse dieser Studie, daß Endothelin-1 die vorherrschende
Isoform im menschlichen Herz ist und besonders von den Endothelzellen im Herz
gebildet wird.
Auch die mRNA für das Endothelin-Konversionsenzym-1 konnte mittels PCR im
humanen Herz nachgewiesen werden. Fukuchi et al. [62] konnten durch
Immunreaktions-Untersuchungen das ECE-1 in Kardiomyozyten und im Endothel
Einleitung
27
intramyokardialer Gefäße nachweisen. Barnes et al. [11] fanden das ECE sowohl auf
der Zelloberfläche der Kardiomyozyten als auch intrazellulär. Bohnemeier et al. [21]
zeigten kürzlich, daß ECE-1 im rechten Vorhof von Patienten, die einen Herzinfarkt
erlitten, mehr exprimiert wurde, als bei Patienten, die keinen Infarkt hatten. Zudem
wurde ECE-1 bei Patienten, die mit Betablockern therapiert wurden, geringer
exprimiert als bei Patienten ohne diese Medikation. Morawietz et al. [139] fanden
einen erhöhten mRNA-Gehalt für ECE-1 in Vorhofgewebe von terminal-insuffizienten
menschlichen Herzen.
Es wurden bisher zwei verschiedene Endothelin-Rezeptoren, ETA und ETB, bei
Menschen und Säugetieren nachgewiesen [7, 184]. Auch die mRNA für diese
Rezeptoren wurde 1993 von Molenaar et al. [136] im menschlichen Myokard analog
zur lokalen Endothelin-Synthese gefunden. Die Rezeptoren haben Ähnlichkeit mit
dem Photorezeptor Rhodopsin und anderen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren
[191, 88]. Der sogenannte ETA-Rezeptor bindet ET-1 und ET-2 mit größerer Affinität
als ET-3 [89, 7]. Im menschlichen Myokard ist überwiegend dieser Rezeptor
exprimiert [136]. Der ETB -Rezeptor bindet alle Endothelin-Isoformen mit etwa
gleicher Affinität [185]. Im Reizleitungssystem ist vornehmlich dieser Rezeptortyp zu
finden. In den Koronargefäßen kommen beide Subtypen gleichermaßen vor [167,
66]. Die Rezeptorenverteilung in den Organen variiert stark. Am menschlichen
Ventrikelmyokard werden 59% ETA - und 41% ETB -Rezeptoren exprimiert [160],
zwischen linkem und rechtem Ventrikel besteht kein Unterschied. Bei dilatativer
Kardiomyopathie kommt es zu einer Zunahme der Gesamtrezeptorendichte mit
selektiver Zunahme des ETA-Rezeptorsubtyps. Die Zunahme betraf vor allem den
linken Ventrikel. Bei ischämischer Kardiomyopathie kam es zu einer geringen, nicht
signifikanten Abnahme der Gesamtrezeptorendichte, wobei die Rezeptorenverteilung
unbeeinflußt blieb. Ponicke et al. [164] untersuchten Herzen mit chronischer
Herzinsuffizienz u.a. im Hinblick auf die Rezeptorendichte und fanden keinen
signifikanten Unterschied zwischen normalen und insuffizienten Herzen, wobei nicht
zwischen ischämischer und dilatativer Kardiomyopathie unterschieden wurde.
Die weitere Charakterisierung der Rezeptorsubtypen gelang durch die Entwicklung
spezifischer Rezeptorantagonisten. BQ-123 beispielsweise bindet selektiv an ETARezeptoren [91, 92], PD-143893 [35] oder Ro46-2005 [33] binden selektiv an ETB Rezeptoren. Bosentan bindet unselektiv an beiden Rezeptoren. Zur Zeit werden
erste klinische Studien mit dem Rezeptorenblocker Bosentan durchgeführt [102].
Einleitung
28
I.6.3 Signalübertragung von Endothelin-1
Die Mechanismen der Endothelin-Signaltransduktion scheinen sich der Vermittlung
anderer
G-Protein-gekoppelter
Rezeptoren,
wie
beispielsweise
auch
dem
Angiotensin II-Rezeptor, zu ähneln. Die Bindung von Endothelin-1 an EndothelinRezeptoren induziert via Gq-Proteine die Aktivierung von PLC, die PIP2 in IP3 und
DAG spaltet [217, 52]. DAG wiederum aktiviert die PKC [70], die durch
Phosphorylierung vielfältige Funktionsproteine reguliert [57] (s.oben). So können die
Effekte durch eine vermehrte Calciumfreisetzung aus dem Sarkoplasmatischen
+ +
Retikulum durch IP3 zustande kommen. Der Na /H -Austauscher wird durch die PKC
aktiviert und führt zur Alkalinisierung des Zellinneren. So wird die Sensitivität der
Myofilamente gegenüber Calcium gesteigert. Der vasokonstriktorische Effekt scheint
dagegen über die Aktivierung spannungsabhäniger Calciumkanäle zustande zu
kommen. In der folgenden Abbildung sind mögliche Transduktionswege graphisch
dargestellt.
Abbildung 3: Intrazelluläre Transduktion von Endothelin-1: potentielle Wirkmechanismen am
Kardiomyozyt. ET-1 = Endothelin-1; R = Rezeptor; Gq = Gq-Protein; PLC = Phospholipase C; PKC =
Proteinkinase C; PIP2 = Phosphoinositolbiphosphat; IP3 = Inositoltriphosphat; DAG = Diacylglycerol
Einleitung
29
I.6.4 Wirkungen von Endothelin-1
Es werden vielfältige Effekte von Endothelin auf die unterschiedlichsten Organsysteme beschrieben. Hier sollen nur die Wirkungen von Endothelin auf das kardiovaskuläre System beschrieben werden.
I.6.4.1 Systemische Endothelin-1-Wirkungen
Endothelin erweist sich als sehr potenter Vasokonstriktor in unterschiedlichen
Gefäßsystemen [226]. Wird Endothelin in den Blutkreislauf injiziert, kommt es
zunächst zu einem Abfall, gefolgt von einem lang anhaltenden Anstieg des
Blutdruckes [226, 44, 86]. Der initiale Blutdruckabfall kommt vermutlich über eine
ETB-Rezeptor vermittelte Freisetzung von NO, ANF und Prostacyclin (PGI2) zustande
[63, 134, 22, 44]. Danach erfolgt in den glatten Gefäßmuskelzellen eine lang
anhaltende ETA-Rezeptor vermittelte Kontraktion mit erhöhtem peripheren Gefäßwiderstand. Cowburn et al. zeigten kürzlich, daß exogenes Endothelin den arteriellen
Blutdruck und den systemischen Gefäßwiderstand steigerte und den Herzindex
senkte [39]. Auf den Pulmonalarteriendruck und den Lungengefäßwiderstand übte
Endothelin
keinen
Pulmonalarterie,
bis
Einfluß
aus.
Sie
infundierten
Plasmakonzentrationen
Endothelin-1
erreicht
waren,
wie
über
die
sie
bei
herzinsuffizienten Patienten vorliegen.
Margulies et al. zeigten 1990 erstmals, daß die Endothelinkonzentration im Plasma
von Hunden stieg, wenn die Tiere Tachykardie-induziert herzinsuffizient wurden
[124, 113]. Mittlerweile ist bekannt, daß es beim Menschen mit terminaler
Herzinsuffizienz zu einer Aktivierung des Endothelin-Systems mit erhöhten
Endothelin-1-Plasmaspiegeln kommt [128, 114]. Daß die Plasma-Endothelinspiegel
mit dem Ausmaß der pulmonalen Hypertension korrelieren, zeigten Cody et al. 1992
[34]. Lerman et al. [114] wiesen nach, daß die Endothelin-Plasmakonzentration bei
Patienten
mit
terminaler
Herzinsuffizienz
erhöht
war,
aber
nach
einer
Herztransplantation zunächst noch weiter anstieg und sich erst nach drei bis zwölf
Monaten auf einem erhöhten Niveau einpendelte. Sie diskutieren die vermehrte
Endothelin-Synthese als möglichen Adaptionsmechanismus des Herzkreislaufsystems und der Nieren nach der Herztransplantation.
Kiowsky [102] untersuchte Patienten mit schwerer Herzinsuffizienz hinsichtlich ihrer
Plasmaspiegel von Big-Endothelin-1 und Endothelin-1 und erkannte eine direkte
Einleitung
30
Korrelation dieser erhöhten Plasmaspiegel und dem Grad der pulmonalen
Hypertension, des pulmonalen Gefäßwiderstandes und den enddiastolischen
Füllungsdrücken beider Ventrikel. Mit zunehmendem Plasmaspiegel dieser Peptide
nahm das Herzzeitvolumen ab. Von Omland et al. [152] wird die Plasmakonzentration von Endothelin-1 für den besten prognostischen Faktor für die Mortalität
innerhalb eines Jahres nach Myokardinfarkt gehalten.
Zur Zeit werden erste klinische Studien [102] mit dem oralen nicht-selektiven
Endothelin-Rezeptorantagonisten Bosentan [33] durchgeführt. Die Studie zeigte
bisher, daß durch Bosentan, verglichen mit Placebo, eine signifikante Reduktion des
systemischen und pulmonalen Gefäßwiderstandes erreicht werden konnte, ohne daß
eine Änderung der Herzfrequenz eintrat.
I.6.4.2 Wirkung von Endothelin-1 auf das Myokard verschiedener Spezies
Kelly (Kelly 1990) beobachtete an Rattenmyozyten einen positiv-inotropen Effekt von
Endothelin-1, der hauptsächlich auf eine Calciumsensibilisierung der Myofilamente
zurückzuführen war und durch die Aktivierung des sarkolemmalen Na+/H+Antiporters und die darauffolgende Alkalinisierung im Zytosol zu erklären ist [104,
219]. Im Gegensatz dazu untersuchten Touys et al. [204] den Einfluß von Endothelin
auf den intrazellulären Calciumgehalt an isolierten Kardiomyozyten von neonatalen
und adulten Ratten mit dem Calciumindikator Fura. Die Calciumtransienten nahmen
sowohl in neonatalen Vorhof- und Ventrikelmyozyten, als auch in adulten
Ventrikelmyozyten in Abhängigkeit von der Endothelin-Dosis zu. Sowohl der
diastolische, als auch der systolische Calciumgehalt
der Zellen nahm bei einer
Endothelindosis von 10-10M signifikant zu. Die beobachteten Effekte ließen sich
durch Präinkubation mit BQ-123 selektiv blockieren.
Fujita et al. [61] wiesen 1996 an isolierten ventrikulären Kaninchenmyozyten einen
positiv-inotropen Effekt von Endothelin-1 nach, der sich ebenfalls auf einen erhöhten
Calciumtransienten zurückführen ließ und mit Indo-1 nachgewiesen wurde. Sie
zeigten auch eine erhöhte Sensitivität der Myofilamente gegenüber Calcium.
Zhu et al. demonstrierten 1997 [228] am isolierten Trabekel aus einem
Hundeventrikel einen negativ-inotropen Effekt von Endothelin-1, der sich durch
Einleitung
31
Präinkubation mit BQ-123 völlig und durch den ETB-Rezeptorantagonisten RES-7011 partiell vermeiden ließ.
Qui et al. [170] zeigten einen calciumsensibilisierenden Effekt von Endothelin-1 an
Indo-1 beladenen Myozyten von terminal insuffizienten menschlichen Herzen.
Moravec et al. [137] konnten einen leichten isometrischen Kraftzuwachs an isolierten
humanen Muskelstreifenpräparaten herzinsuffizienter Patienten zeigen. Meyer et al.
[132] beobachteten einen positiv-inotropen Effekt von Endothelin-1 an isolierten
Streifenpräparaten humaner rechter Vorhöfe,
Proteinkinase-C
und
nachfolgender
der auf
Aktivierung
des
die
Aktivierung der
Na+/H+-Antiporters
zurückzuführen war. Aber auch das intrazelluläre Calcium, durch Äquorin
nachgewiesen, stieg signifikant an. Am Ventrikelmyokard [160] dagegen war ein
positiv-inotroper Effekt zu sehen, der nicht mit einer intrazellulären Calciumerhöhung
einherging. Diese positiv-inotrope Wirkung ließ sich durch extrazelluläres Absenken
des pHs verstärken.
Auf das Reizleitungssystem hat Endothelin einen proarrhythmischen Einfluß, auf die
Koronargefäße wirkt es wie an vielen anderen Gefäßen konstriktiv.
Wie Endothelin am Kardiomyozyten des Menschen genau wirkt und welche Effekte
es an Vorhof- und Ventrikelmyokard hat, ist bisher weitgehend ungeklärt.
I.6.4.3 Interaktionen des Endothelin-1 mit anderen neurohumoralen Systemen
Bei Hunden steigerte die Infusion von Endothelin-1 nicht nur den Blutdruck, ebenfalls
stiegen die Plasmakonzentrationen von Vasopressin, Renin, Aldosteron, Epinephrin,
Norepinephrin und die des Atrialen Natriuretischen Faktors an [67, 133]. Die
Endothelin-Produktion läßt sich in vitro und in vivo durch verschiedenste Stoffe
stimulieren, z.B. durch Angiotensin II [140, 46], durch Thrombin, TGF-β, Interleukin1, Katecholamine, Kortisol und Vasopressin [140, 178].
Zusätzlich wirkt Endothelin auch als Wachstumsfaktor, der Hypertrophie induziert,
indem die Transkription von muskelspezifischen Genen und dem Proto-Onkogen cfos gesteigert wird. Auch die DNA- und Proteinsynthese werden in Rattenmyozyten
gesteigert [193, 198, 94].
Ein mitogener Effekt konnte von mehreren Autoren für Endothelin-1 nachgewiesen
werden [80, 69].
Einleitung
32
Einen Einfluß von Endothelin auf die Embryogenese wiesen Kurihara et al. und
Puffenberger et al. nach. Bei sogenannten Knock-out-Mäusen, denen das für
Endothelin-1 codierende Gen fehlte, kam es während der Entwicklung zu
kraniofacialen Mißbildungen [105]. Eine Mutation des Endothelin-B-Rezeptors
dagegen führte zu einem Megakolon, wie es beim Menschen für den Morbus
Hirschsprung typisch ist [169].
Kuwahara et al. [106] konnten an Kardiomyozyten-Kulturen von neonatalen Ratten
nachweisen, daß die Genexpression für ANF und BNP durch Cardiotrophin-1 und
Endothelin stimuliert werden kann. Cardiotrophin-1 ist ein neu entdecktes Cytokin,
das mit Endothelin zu interagieren scheint. Harada et al. [73] wiesen nach, daß dazu
eine Interaktion von Kardiomyozyten und Fibroblasten notwendig ist.
Einleitung
33
I.7 Offene Fragen und Fragestellung dieser Arbeit
I.7.1 Offene Fragen
Mittlerweile ist es Standard, die Herzinsuffizienz mit Hemmstoffen des AngiotensinKonversionsenzyms
zu
behandeln.
Angiotensin-Rezeptoren-Blocker
werden
zunehmend eingesetzt, um die Angiotensin-Wirkung direkt zu verhindern. So kommt
es nicht mehr zur Kumulation von Bradykinin, das u.a. für den Husten während der
ACE-Inhibitoren-Therapie verantwortlich gemacht wird. Zudem wird mit den
Rezeptorenblockern auch die Wirkung von demjenigen Anteil des Angiotensin II
verhindert, welcher nicht durch das Angiotensin-Konversions-Enzym produziert wird,
sondern über lokale Chymasen [214] entsteht. An Muskelstreifenpräparaten fand
man unter Angiotensin II-Einwirkung am humanen Vorhofmyokard einen positivinotropen Effekt, am Ventrikelmyokard allerdings nicht [84]. Moravec et al. zeigten
unter
unphysiologischen
Bedingungen
uneinheitliche
Ergebnisse
[138].
An
menschlichen isolierten Kardiomyozyten untersuchten bisher nur Lefroy et al. [111]
die Angiotensin-Wirkung und konnten weder an Vorhof- noch an Ventrikelmyozyten
einen Effekt entdecken. Das widerspricht den Ergebnissen, die am Streifenpräparat
von Holubarsch et al. festgestellt wurden. Sind an der positiv-inotropen Wirkung am
Vorhof doch andere Zellen als die Kardiomyozyten beteiligt?
In den letzten Jahren gewann in der Herzinsuffizienzforschung auch das EndothelinSystem an Bedeutung. Nachdem man einige für den Organismus nachteilige Effekte
gefunden
hat,
kommen
nun
in
ersten
klinischen
Studien
Endothelin-
Rezeptorenblocker zum Einsatz. Allerdings weiß man zur Zeit nicht, welche
Wirkungen Endothelin direkt auf das menschliche Herz hat. Bisher gibt es auch hier
einige Studien an Muskelstreifenpräparaten. Moravec et al. [137] fanden sowohl an
insuffizientem menschlichen Vorhof- als auch Ventrikelmyokard signifikant positivinotrope Effekte. Auch Meyer et al. [132] konnten einen allerdings nicht so
ausgeprägten positiv-inotropen Effekt auf humanes Vorhofmyokard nachweisen.
Kürzlich zeigten Pieske et al. [160] in gesundem und insuffizientem menschlichen
Myokard eine positive Inotropie; bei insuffizienten Herzen war diese niedriger als in
gesunden Herzen. An isolierten Kardiomyozyten gibt es lediglich Studien an Tieren;
für den Menschen liegen keine Ergebnisse vor.
Es ist sowohl für Angiotensin II als auch für Endotehlin-1 nicht klar, welche Wirkung
sie auf humane Kardiomyozyten haben. Dieses ist aber wichtig, will man den Effekt
Einleitung
34
durch Inhibitoren der Konversionsenzyme oder Rezeptorenblockern verhindern.
Nimmt man den Patienten durch die Therapie möglicherweise kontraktile Reserven?
Inwiefern werden diese durch hämodynamisch bedingte Verbesserung der
Ventrikelfunktion überlagert?
Die vorliegende Arbeit soll sich mit der Wirkung von Angiotensin II und Endothelin-1
auf die Funktion von humanen Vorhof- und Ventrikelmyozyten beschäftigen.
I.7.2 Fragestellung dieser Arbeit
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die physiologische Bedeutung der kardialen
Angiotensin II- und Endothelin-1-Wirkung hinsichtlich der kontraktilen Funktion
humaner Kardiomyozyten aufzuzeigen.
Um höhere Konzentrationen an den jeweiligen kardialen Rezeptoren zu erreichen
und um den Einfluß von anderen Zellen als Kardiomyozyten auszuschließen, wird
die Wirkung von Angiotensin II und Endothelin-1 an enzymatisch isolierten
Kardiomyozyten aus menschlichem Vorhof- und Ventrikelgewebe untersucht.
• Sind die Kardiomyozyten nach dem enzymatischen Isolationsvorgang intakt,
besitzen sie kontraktile Reserven und funktionsfähige Rezeptoren?
• Hat Angiotensin II eine Wirkung auf die Kontraktilität humaner Ventrikelmyozyten?
• Wirkt Angiotensin II positiv-inotrop auf humane Vorhofmyozyten?
• Besitzt Endothelin-1 einen Einfluß auf die Kontraktilität humaner Ventrikelmyozyten?
• Beeinflußt Endothelin-1 das Kontraktionsverhalten humaner Vorhofmyozyten?
35
II Material und Methoden
II.1 Untersuchtes Gew ebe
Die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit wurden an isolierten Kardiomyozyten
von insgesamt 20 insuffizienten Herzen und 30 rechten Vorhöfen vorgenommen.
Dabei stammten 41 Myozyten aus terminal insuffizienten Herzen und 44 Myozyten
aus
suffizienten
rechten
Vorhöfen.
Die
für
die
Versuche
relevanten
hämodynamischen Daten, sowie das Alter der Patienten und ihre Diagnose werden
bei den jeweiligen Versuchen in tabellarischer Form gezeigt.
II.1.1 Gewebe aus nicht-insuffizientem Atrium dextrum
Von 30 Patienten, die sich einer koronaren Bypassoperation unterziehen mußten,
erhielten wir einen Teil des rechten Vorhofes, das Auriculum cordis dextrum, das bei
dem Anschluß an die extrakorporale Zirkulation exzidiert wurde. Die Operationen
erfolgten in der Chirurgischen Universitätsklinik Freiburg. Alle Patienten hatten keine
klinischen Zeichen einer Herzinsuffizienz und echokardiographisch eine normale
linksventrikuläre Ejektionsfraktion.
II.1.2 Gewebe von Patienten mit terminaler Herzinsuffizienz
In diese Gruppe wurden Patienten mit terminaler Herzinsuffizienz Grad IV gemäß
dem Vorschlag der New-York-Heart-Association (NYHA) eingestuft, die sich bei
ischämischer Kardiomyopathie (ICM) oder dilatativer Kardiomyopathie (DCM) einer
orthotopen Herz- oder Herz-Lungentransplantation unterziehen mußten. Es handelte
sich um sieben Patienten mit einer ICM (5 Männer, 2 Frauen) und 13 Patienten mit
einer DCM (12 Männer, 1 Frau). Die linksventrikuläre Ejektionsfraktion lag zum
Zeitpunkt der Transplantation im Mittel bei 21,0%. Aus 20 Herzen mit terminaler
Herzinsuffizienz konnten insgesamt 29 Kardiomyozyten untersucht werden. Sie
wurden ausschließlich aus dem linken Ventrikel isoliert. Die explantierten Herzen
erhielten wir aus der Chirurgischen Universitätsklinik Freiburg (8) und vom
Herzzentrum
Nordrhein-
Material und Methoden
36
Westfalen, Bad Oeynhausen (12). Die hämodynamischen Meßdaten der Patienten
mit ICM und DCM unterschieden sich nicht signifikant.
II.1.3 Ventrikelproben linksventrikulär
Von drei Patienten, die sich einem Verschluß eines offenen Foramen ovale (1 Frau)
oder einer Kardioplastie (2 Männer) unterzogen, erhielten wir Myokardproben, die
aus operationstechnischen Gründen exzidiert werden mußten. Es gelang die
Isolation und Untersuchung von 10 Myozyten.
Zusätzlich gelang die Isolation zweier Myozyten aus einer linksventrikulären Biopsie.
Die Patientin litt an einer dilatativen Kardiomyopathie, hatte zum Zeitpunkt der
Katheteruntersuchung, die zur Transplantationsvorbereitung durchgeführt wurde,
eine EF von 30% (Votum der Ethikkommission Freiburg, Projektleiter Prof. Dr. Ch.
Holubarsch).
II.1.4 Medikation der Patienten
Von den Patienten, die sich einer koronaren Bypassoperation unterzogen, erhielten
20 Patienten herzwirksame Medikamente. Die Patienten erhielten im allgemeinen
eine Kombination aus Diuretika, Digitalis und ACE-Hemmern, gegebenenfalls
Nitrate, und Calciumantagonisten. Nach Medikamenten aufgeschlüsselt erhielten 6
Patienten Diuretika, 5 Digitalis, 12 ACE-Hemmer, 16 Nitrate, 14 β-Rezeptorenblocker
und 12 Calciumantagonisten. Die Patienten, die zur Transplantation anstanden,
erhielten folgende Medikation: 15 Diuretika, 11 Digitalis, 13 ACE-Hemmer, 5 Nitrate,
und 3 Calciumantagonisten. 3 Patienten wurden während der Wartezeit auf ein
Spenderherz katecholaminpflichtig, 8 Patienten mußten zusätzlich antiarrhythmisch
behandelt werden, davon 7 Patienten mit einem β-Rezeptorenblocker.
Material und Methoden
37
II.2 Lösungen und verw endete Substanzen
II.2.1 Tyroden, Low Calcium, Enzymlösung
Die Nährlösung, in der das Myokard transportiert wurde und mit der die isolierten
Zellen während der Experimente superfundiert wurden, ist eine modifizierte mit
Carbogen (95% O2, 5% CO2) durchperlte Krebs-Henseleit-Lösung (Tyrode). In der
Lösung sind folgende Substanzen enthalten: Na+ 144,0 mM, K+ 5,8 mM, Cl- 126 mM,
-
-
2-
HCO3 25 mM, Mg2+ 0,96 mM, H2PO4 1,29 mM, SO4
0,96 mM, Ca2+ 1,25 mM,
Glucose 11,2 mM und 10 IE/l Altinsulin (H-Insulin, Hoechst-AG). Während des
Transportes und der Präparation enthielt die Tyrode zusätzlich 30 mM 2,3Butanedione-Monoxime.
Für
die
Calcium-Dosis-Wirkungskurven
wurde
eine
phosphatfreie, 1,25 mM calciumhaltige Tyrode verwendet, KH2PO4 wurde nicht
zugegeben. Die Tyroden wurden wöchentlich frisch aus zwei höher konzentrierten
Stammlösungen hergestellt, Glucose und Insulin vor Versuchsbeginn zugegeben.
Zum Auswaschen des Calcium vor der Zellisolation wurde das präparierte Myokard
mit einer Low-Calcium-Lösung gespült, die folgende Substanzen enthielt: Na+ 120
2-
mM; K+ 5,4 mM; Cl- 125,4 mM; Mg2+ 5 mM; SO4 5 mM; Ca2+ 0,0035 mM; Pyruvat
5mM; Taurin 20 mM; HEPES 10 mM; BDM 0,02 mM; Glucose 0,02 mM. Der pH der
Lösung wurde auf 7,4 eingestellt.
Isoliert
wurden
die
Kardiomyozyten
in
einer
Enzymlösung,
die
folgende
2-
Zusammensetzung hatte: Na+ 120 mM; K+ 5,4 mM; Cl- 125,4 mM; Mg2+ 5 mM; SO4
5 mM; Pyruvat 5 mM; Taurin 20 mM; HEPES 10 mM; Glucose 0,02 mM;
Nitrilotriacetic-Säure 0,012 mM. Der pH-Wert der Enzymlösung wurde auf 7,3
eingestellt. Die Enzym- und Low Calcium Lösung wurden wöchentlich frisch aus
einer höher konzentrierten Stammlösung, die NaCl, KCl und MgSO4 enthält,
angesetzt.
II.2.2 Wirkung von 2,3-Butanedione-Monoxime (BDM) und Nitrilotriacetic-Säure
(NTA)
BDM als Zusatz zur Tyrode, in der das Myokard transportiert und präpariert wurde,
wirkt als kardioplege Lösung mit speziellen vorteilhaften Eigenschaften. Durch die
Präparation des Myokard in maximal 1mm³ kleine Würfel kommt es zu einer
Material und Methoden
38
Verletzung der Zellmembranen und so zu einer massiven Calciumfreisetzung, die zu
einer Kontraktur der Muskelzellen führt. BDM verhindert dies vermutlich durch eine
Blockierung der Calciumbindungsstellen am Troponin C und der Calciumkanäle. Die
Effekte treten sehr schnell ein und sind innerhalb kurzer Zeit durch Auswaschen
vollständig reversibel [78, 144].
NTA bildet mit Calcium- und Phosphationen einen Komplex, so daß freies Calcium in
der Lösung gebunden wird und später ausgewaschen werden kann.
II.2.3 Substanzen
II.2.3.1 Protease, Hyaluronidase, Collagenase
Die Enzyme wurden im größten analytischen Reinheitsgrad kommerziell bei der
Firma Sigma erworben. Die Aktivität der Collagenase wurde mit 0,21 U/mg
angegeben, die der Protease mit 9,9 U/mg und die Aktivität der Hyaluronidase mit
320
U/mg.
Wegen
stark
variierender
Aktivität
der
Collagenase
zwischen
verschiedenen Chargen, wurden sämtliche Versuche mit einer Collagenase aus
einer Charge unternommen.
II.2.3.2 Isoproterenol, AT II, Endothelin
Isoproterenol, Angiotensin und Endothelin wurden kommerziell bei der Firma Sigma
erworben. Auf ihre Wirkungen wird später genau eingegangen.
II.2.3.3 Substanzen für die Lösungen
NaCl, KCl, MgSO4, KHCO3 , KH2PO4, CaCl2 und Glucose wurden von der Firma
Merck bezogen. Pyruvat, Taurin, NTA und BDM wurden von der Firma Sigma
erworben, HEPES wurde von der Firma Roth, NaHCO3 bei Riedel-de Haën, Insulin
bei der Hoechst-AG erworben. Die Substanzen waren von größtem analytischen
Reinheitsgrad.
Material und Methoden
39
II.3 Transport
II.3.1 Ventrikel- und Vorhofmyokard aus der Universitätsklinik Freiburg
Das Ventrikel- und Vorhofgewebe von Patienten der Chirurgischen Universitätsklinik
Freiburg wurde unmittelbar nach der Entnahme durch den Chirurgen in Carbogendurchperlte, BDM-haltige Tyrode gelegt. Innerhalb 10 Minuten wurden die Proben ins
Labor gebracht.
II.3.2 Biopsie-Material aus Freiburg
Zwei Biopsien wurden direkt nach der Entnahme durch den Herzkatheterspezialisten
in eiskalte Low-Calcium-Lösung gegeben, die vorher mit Carbogengas gesättigt
wurde. Dann erfolgte der sofortige Transport ins Labor, der etwa 10 Minuten
benötigte.
II.3.3 Myokard aus dem Herzzentrum Bad Oeynhausen
Für das Gewebe aus dem Herzzentrum Nordrhein-Westfalen war eine Transportzeit
von etwa sechs Stunden erforderlich. In einem speziellen Transportkoffer wurde das
Myokard in mit Carbogen-gesättigter Tyrode, die ebenfalls BDM enthielt, gekühlt
transportiert. Die Sauerstoffsättigung war die gesamte Reisezeit über ausreichend.
Material und Methoden
40
II.4 Präparation
II.4.1 Linksventrikuläres Gewebe
Aus dem linken Ventrikel wurden in einer speziellen Präparierkammer, die mit
Carbogen-durchperlter BDM-Lösung gefüllt war, mit Hilfe augenchirurgischer
Instrumente Trabekel und intramurale Gewebestücke präpariert, die dann zügig
unter Berücksichtigung der Faserrichtung in maximal 1mm³ kleine Würfel zerkleinert
wurden (Argentax-Klingen der Firma Martor). Diese Würfel wurden dann in ein
Cellstar-Gefäß (Fa. Greiner) gegeben, in dem nun anschließend die Zellisolierung
erfolgte.
II.4.2 Vorhofgewebe
Unter einem Stereomikroskop mit zehnfacher Vergrößerung (Firma Olympus, SZ 40)
wurde in der Präparierkammer aus dem Vorhof mit Hilfe von augenchirurgischen
Instrumenten möglichst atraumatisch alle Trabekel aus dem Auriculum cordis dexter
herauspräpariert und dann mit einer Klinge in kleine Würfel (ca.1mm³) geschnitten.
Das Gewebe wurde nun mit Hilfe einer 20ml Spritze zur weiteren Isolierung in ein
Cellstar-Gefäß überführt.
Material und Methoden
41
II.5 Zellisolierung
Zunächst wurden die Gewebestücke bei 36°C in einem Wärmebad insgesamt 12
Minuten in 25ml Low-Calcium-Lösung inkubiert, um möglichst viel Calcium
auszuwaschen, was beim Präpariervorgang durch Zellverletzung massiv freigesetzt
würde und dem übrigen Gewebe schaden könnte, indem es zu Kontrakturen führt.
Um zusätzlich Calcium zu binden, enthielt die Low-Calcium Lösung NTA. Die Lösung
wurde alle drei Minuten gewechselt. Dann wurde die Low-Calcium-Lösung
abpipettiert. Das Gewebe wurde 45 Minuten lang mit einer Proteaselösung inkubiert
(Ventrikel 4,3 U/ml; Vorhof 3,07 U/ml). Danach wurde die Proteaselösung
abpipettiert und durch eine Collagenaselösung ersetzt (Ventrikel 0,21 U/ml; Vorhof
0,27 U/ml). In dieser Lösung wurde das Gewebe für zweimal 45 Minuten inkubiert.
Bei Vorhofgewebe wurde der ersten Collagenaselösung zusätzlich Hyaluronidase
(160 U/ml) zugegeben. Während der gesamten Inkubation wurde die Lösung mit
Carbogengas durchperlt und dadurch sanft durchmischt.
In den abpipettierten Collagenaselösungen befanden sich die isolierten Zellen. Die
Enzymlösungen wurden auf Eis gelegt, um die Enzymaktivität zu stoppen.
Nun wurde etwa 1ml der Lösung in das Organbad pipettiert. Die isolierten Zellen
setzten sich auf dem Deckglas nieder, wurden mit 1,25 mM calciumhaltiger Tyrode
superfundiert und konnten nun unter dem Mikroskop betrachtet werden.
Der Anteil morphologisch intakter Zellen nach dem Isolationsvorgang war stark
schwankend. Manchmal erreichte er 50-70%, in der Regel lag er bei 10%.
Material und Methoden
42
II.6 Messung der Kontraktilität der isolierten Myozyten
II.6.1 Versuchsaufbau
Die folgende Anlage wurde speziell für Einzelzellmessungen von Professor Güth
(Scientific Instruments, Heidelberg) entwickelt und zusammengestellt. Folgende
Komponenten kamen zum Einsatz:
• Mikroskop mit Küvetteneinsatz (Diaphot 300, Fa. Nikon)
• Temperaturkontrolleinheit (Scientific Instruments, Heidelberg)
• Rollpumpe (Scientific Instruments, Heidelberg)
• Stimulationsanlage (Scientific Instruments, Heidelberg)
• Kameraeinheit (Scientific Instruments, Heidelberg)
• Kathodenstrahloszilloskop (HAMEG, HM 304)
• Monitor (Phillips, 12 Bit s/w slave Monitor)
• Softwarepaket zur Signalanalyse (MUCELL, Scientific Instruments, Heidelberg)
• Personalcomputer (Pentium, Fa. Pyramid)
Material und Methoden
43
In der folgenden Abbildung sind die wichtigsten Bestandteile der Meßapparatur
dargestellt.
Abbildung 4: Meßanlage: Küvettentisch, Oszilloskop, Kameraeinheit und Stimulationsanlage.
Material und Methoden
44
II.6.1.1 Küvettensystem
Abbildung 5 zeigt das Küvettensystem im Detail, welches in das Mikroskop integriert
ist. In das Gehäuse ist eine runde Vertiefung eingelassen, in die ein Deckglas gelegt
wird, das den Boden des Organbades bildet. Die konisch zulaufende Küvette mit
einem runden Durchlaß wird in das Gehäuse eingeschraubt. Durch einen
Dichtungsring wird das Organbad gegen das Deckglas abgedichtet. Hier hinein wird
nun etwa ein Milliliter der Enzymlösung am Ende der Inkubationszeit gegeben, die
auch die isolierten Zellen enthält. Als Deckel des Organbades dient ein
quarzgläserner Deckel, in den sowohl zwei Platinelektroden, die mit der
Stimulationsanlage verbunden sind, als auch die Zu- und Abflußröhrchen
eingelassen sind. Der Zu- und Abfluß der Tyrode wird durch eine Rollpumpe
gewährleistet, deren Flußgeschwindigkeit manuell bestimmt werden kann. Das
Küvettensystem ist mit einer Temperaturkontrolleinheit verbunden. Hiermit kann die
Temperatur, die in dem Organbad herrschen soll, genau eingestellt werden. Bei
unseren
Experimenten
betrug
die
Temperatur
32°C.
Auch
das
Phasenkontrastobjektiv, das sich sehr nah unter dem Deckglas befindet, auf dem die
Myozyten liegen, ist von einem Thermoblock umgeben, um die Temperatur
möglichst konstant zu halten. Die zufließende Tyrode hatte eine Temperatur von
34°C, um die Bildung von Gasblasen im Küvettensystem zu vermeiden.
Abbildung 5: Küvettensystem: Organbad, Platinelektroden, Tyrodenzu- und -ablauf
Material und Methoden
45
II.6.1.2 Mikroskop
Der Strahlengang führt im Mikroskop von der Lichtquelle von oben durch das
Küvettensystem, durch die Objektive über verschiedene Spiegel zu einem
Okularrevolver, in den jeweils ein Okular mit 10- und 40-facher Vergrößerung und ein
Phasenkontrastobjektiv mit 100facher Vergrößerung eingebaut sind. Weiter fällt das
Licht über verschiedene Spiegel gelenkt einerseits zum Binokular, andererseits in
eine Kamera, in die eine Diodenkette eingebaut ist.
II.6.1.3 Zellendendetektion
Die
Diodenkette
nimmt
Helligkeitsunterschiede
war.
Durch
das
Phasenkontrastobjektiv heben sich die Zellenden besonders gut vom Hintergrund
ab. Um das zu erreichen, ist es wichtig, daß die Zelle parallel zur Diodenkette liegt,
was man durch Drehen der Kamera oder des Mikroskoptisches erreichen kann. Um
das Einstellen zu erleichtern, ist an die Kamera ein Bildschirm angeschlossen, über
den man die Zellposition gut beurteilen kann.
Abbildung 6: Zelleinstellung: Mikroskoptisch, Kamera und Monitor
Material und Methoden
46
Das Helligkeitsprofil der Zelle wird von der Diodenkette in der Kamera
aufgenommen, umgewandelt und auf dem Oszilloskop wiedergegeben (Kanal 1).
Zwei Marker sind auf dem Bildschirm des Oszilloskop integriert, die sich über die
Anlage horizontal und vertikal bewegen lassen. Diese Marker sind so eingerichtet,
daß sie Helligkeitsunterschiede erkennen, die für Zellenden typisch sind. Die Marker
werden jeweils links vor die Zellenden positioniert und detektieren die Zellenden
rechts daneben. Über einen zweiten Kanal wird diese Information angezeigt: hat das
Instrument das linke Zellende entdeckt, steigt die Spannung an; an der Stelle, an der
der zweite Marker das rechte Zellende entdeckt, fällt die Spannung wieder ab. Die
Zelle ist somit so lang wie der Abschnitt des zweiten Pulses, der eine erhöhte
Spannung anzeigt. Änderungen der Zellänge, wie sie bei jeder Kontraktion auftreten,
werden somit zuverlässig aufgenommen. Die Gesamtauflösung der Aufnahme
beträgt 50 Hz.
Abbildung 7: Oszillograph: Zellendendetektion
Material und Methoden
47
II.6.1.4 Elektrische Feldstimulation
Die Myozyten, die sich auf dem Deckglas absetzen, werden elektrisch durch die
beiden Platinelektroden im Feld stimuliert. Es handelt sich hierbei um einen
bipolaren Stimulus von 5ms Dauer. Die Spannung beträgt zwischen 23 V und 31 V
und wurde 10% höher als die jeweilige Schwellenspannung gewählt, bei der die
Myozyten zu kontrahieren begannen.
II.6.1.5 Registrierung der Zellkontraktion und Datenverarbeitung
Die Informationen der Photodiodenkette werden mittels einer 12 Bit Analog/DigitalWandlerkarte direkt in einen Personalcomputer gespeist und im Softwareprogramm
„Mucell“ verarbeitet. Jede Kontraktion wird in Form einer Verkürzungskurve
angezeigt. Einzelne Kontraktionen können aufgezeichnet werden; von ihnen werden
dann folgende Parameter berechnet:
• diastolische Zellänge
• maximale Verkürzung
• Verkürzungs-Zeit-Integral
• Dauer bis zur maximalen Kontraktion
• Dauer von 10%iger Verkürzung bis zum Kontraktionsmaximum
• maximale Kontraktionsgeschwindigkeit
• maximale Relaxationsgeschwindigkeit
• Dauer vom Kontraktionsmaximum bis zur 50%igen Relaxation
Es besteht die Möglichkeit, mehrere Kontraktionen hintereinander aufzuzeichnen
und sämtlich Werte zu mitteln. So verfälschen kleinere Störungen der Aufnahme, die
beispielsweise durch geringe Bewegungen der Zelle durch die Pumpenströmung
zustande kommen, nicht zu sehr die Ergebnisse.
Material und Methoden
48
II.7 Versuchsablauf
Nach der Isolation der Myozyten in den Enzymlösungen wurde etwa ein Milliliter der
Lösung mit einer Einwegpipette entnommen und in das Küvettensystem gefüllt. Die
intakten Myozyten setzten sich auf dem Deckglas ab. Nun wurde der Tyrodefluß
angestellt, die Myozyten mit 1,25 mM calciumhaltiger Tyrode, die ständig mit
Carbogen durchperlt wurde, superfundiert. Es kann davon ausgegangen werden,
daß die Zellen ausreichend mit Sauerstoff versorgt wurden. Zelltrümmer wurden
durch den Tyrodefluß weggespült. Die Zellen blieben nun 30 bis 45 Minuten in Ruhe,
bevor dann die Feldstimulation eingestellt wurde. Es wurde mit einer Spannung von
20 V begonnen, diese dann solange hochreguliert, bis die Kardiocyten zu
kontrahieren begannen. So ist die Schwellenspannung definiert. Die Spannung
wurde nun um 10% gesteigert, unter welcher letzlich der Versuch stattfand.
Nach folgenden Kriterien wurde nun ein Myozyt, mit dem der Versuch stattfinden
soll, ausgesucht:
• Zellmorphologie:
eindeutige Querstreifung
keine Vakuolen
keine Zellabschnitte in Hyperkontraktur
• keine Spontanaktivität unter 1,25 mM Calcium
• konstante Kontraktionsamplitude unter der Stimulation von 0,2 Hz über 15
Minuten
• konstante diastolische Länge
Erfüllte eine Zelle alle Kriterien, wurde an ihr ein Experiment gestartet.
Material und Methoden
49
Die untersuchten Substanzen, Calcium, Isoproterenol, Angiotensin II und Endothelin1, wurden in den entsprechenden Konzentrationen in das Tyrodenreservoir gegeben.
Die Dosis-Wirkungskurven wurden durch kumulative Zugabe der Substanzen erstellt.
Hierzu muß ein geschlossenes System vorliegen. Der Abflußschlauch wurde zu
diesen Versuchen in das Tyrodereservoir zurückgeleitet, so daß eine konstante
Menge Tyrode zirkulierte. Bei positiv-inotropen Effekten wurden die einzelnen
Kontraktionen zu dem Zeitpunkt registriert, an dem die Zelle mindestens 3 Minuten
konstant, ohne weiteren Verkürzungszuwachs kontrahierte. War nach Zugabe der
Substanzen keine inotrope Wirkung zu beobachten, wurden 10 Minuten abgewartet
und dann die Registrierung vorgenommen.
II.7.1 Dosis-Wirkungskurve mit Calciumionen
Der Effekt von unterschiedlichen extrazellulären Calciumkonzentrationen auf das
Kontraktionsverhalten der Myozyten wurde an 14 Zellen von elf terminal
insuffizienten
explantierten
Herzen
untersucht.
Um
das
Ausfällen
von
Calciumphosphat bei höheren Calciumkonzentrationen in der Tyrode zu verhindern,
wurde eine phosphatfreie Tyrode mit einer Calciumkonzentration von 1,25 mM
verwendet. In diese wurde kumulativ jeweils die Menge einer einmolaren CalciumStammlösung hinzu pipettiert, so daß folgende Konzentrationen im Tyrode-Reservoir
vorlagen: 1,25 mM, 2,5 mM, 4,0 mM, 7,2 mM, 12 mM und 15 mM.
II.7.2 Isoproterenol-Dosis-Wirkungskurven
An fünf Myozyten von vier explantierten Herzen wurde die positiv-inotrope Wirkung
von Isoproterenol untersucht. Hierzu mußte die Tyrodelösung mit Ascorbinsäure
versetzt werden, um ein schnelles Oxidieren und Inaktivieren des Isoproterenols zu
verhindern. Isoproterenol wurde dann in den Konzentrationen 10-9M, 3x10-9M, 10-8M,
3x10-8M und 10-7M zugegeben.
Material und Methoden
50
II.7.3 Angiotensin II Dosis-Wirkungskurven
II.7.3.1 Vorhofmyokard
Die inotrope Wirkung von Angiotensin II wurde an elf Myozyten von neun nichtinsuffizienten rechten Vorhöfen gemessen. Es wurden folgende zu untersuchende
Konzentrationen gewählt: 10-10M, 10-9M, 10-8M, 10-7M, 10-6M und 10-5M. Vor Zugabe
der nächsten Konzentration wurden so lange zugewartet, bis die Zelle wieder
konstant kontrahierte, mit einem Minimalintervall von zehn Minuten.
An zehn Myozyten von sieben rechten Vorhöfen wurde zusätzlich die Wirkung von
Angiotensin II nach vorheriger fünfzehnminütiger Inkubation mit dem Angiotensin IIRezeptorantagonisten
Losartan
-9
-7
(10 M)
untersucht.
Es
folgte
eine
Dosis-
-5
Wirkungskurve von 10 M bis 10 M Angiotensin II.
II.7.3.2 Linksventrikuläres Myokard
Die Wirkung von Angiotensin II in der Konzentration von 10-6M wurde an neun
Myozyten von fünf terminal insuffizienten, explantierten Herzen untersucht.
II.7.4 Endothelin-Dosis-Wirkungskurve
II.7.4.1 Vorhofmyokard
Am humanen rechten Vorhof wurde die Wirkung von Endothelin-1 an insgesamt 12
Myozyten von zehn Auricula cordis untersucht. Endothelin wurde kumulativ dem
Tyrode-Reservoir in folgenden Konzentrationen zugegeben: 10-12M, 10-11M, 10-10M,
10-9M und 10-8M. An acht Myozyten von sechs Vorhöfen wurde der Endothelin-1Rezeptor mit dem spezifischen Rezeptorenblocker BQ 123 geblockt, indem die
Myozyten nach der Isolation 20 Minuten lang mit BQ 123 in einer Konzentration von
10-7M inkubiert wurden. Dann folgte die Zugabe von 10-10M bis 10-8M Endothelin.
II.7.4.2 Linksventrikuläres Myokard
An 16 linksventrikulären Myozyten von sieben explantierten Herzen (10 Myozyten),
von zwei Ventrikelproben (vier Myozyten), die bei der Reduktionsplastik eines linken
Ventrikels anfielen, und von einer Biopsie (zwei Myozyten) wurde die Wirkung von
Endothelin-1 bei verschiedenen extrazellulären Calciumkonzentrationen untersucht.
Material und Methoden
51
Dabei wurden zehn Myozyten bei 1,25 mM extrazellulärem Calciumgehalt gemessen
und sieben Myozyten bei 2,5 mM Calciumgehalt. Endothelin-1 wurde bei 1,25 mM
extrazellulärem Calcium in den Konzentrationen 10-12M, 10-11M, 10-10M, 10-9M und
10-8M zugegeben, bei 2,5 mM Calcium in den Konzentrationen 10-10M, 10-9M und
10-8M.
Material und Methoden
52
II.8 Ausw ertung
II.8.1 Normierung der Daten
Folgende Parameter wurden gemessen und berechnet:
• diastolische Zellänge [µm]
• maximale Verkürzung [µm]
• relative Verkürzung [%]
• Verkürzungs-Zeit-Integral [µm/s]
• Dauer bis zur maximalen Kontraktion [ms]
TTP
• Dauer 10%ige Verkürzung bis Kontraktionsmaximum [ms]
T 10% to peak
• maximale Kontraktionsgeschwindigkeit [-µm/s]
slope max down
• maximale Relaxationsgeschwindigkeit [µm/s]
slope max up
• Dauer Kontraktionsmaximum bis 50%ige Relaxation [ms]
RT 50%
Um die Parameter der unterschiedlichen Präparategruppen trotz unterschiedlicher
Ausgangslagen miteinander vergleichen zu können und auch geringe Unterschiede
zu entdecken, wurden sie jeweils in Prozent zum Ausgangswert berechnet. Bei den
Versuchen an Vorhofmyozyten mit Rezeptorenblockern wurden die Werte nach
Zugabe des Blockers als Ausgangswert genommen, und die Werte nach Zugabe der
Substanzen Angiotensin II und Endothelin-1 auf den Kontrollwert bezogen.
Material und Methoden
53
II.8.2 Statistische Auswertung
Alle genannten Ergebnisse im Text dieser Arbeit sind als Mittelwerte +
Standardabweichung angegeben. Um die Grafiken übersichtlich zu gestalten, wurde
zur Veranschaulichung der Streuung der Daten der Standardfehler des Mittelwertes
benutzt. Die statistische Auswertung wurde mittels des Statistikprogrammes SPSS
7.52 für Windows vorgenommen: Innerhalb der Dosis-Wirkungskurven wurden die
Veränderungen der Parameter gegenüber dem jeweiligen Ausgangswert mittels des
Student-t-Test für gepaarte Stichproben auf Signifikanz geprüft. Die dabei
errechneten p-Werte wurden einer Bonferroni-Holmes Transformation unterzogen.
Vergleiche zwischen verschieden Gruppen erfolgte mit Hilfe des Student t-Test für
unabhängige Stichproben. Eine Irrtumswahrscheinlichkeit von p<0,05 wurde als
statistisch signifikant akzeptiert.
54
III Ergebnisse
III.1 Einfluß
der
extrazellulären
Calciumkonzentration
auf
die
Kontraktilitätsparameter linksventrikulärer Myozyten
Die Wirkung von unterschiedlichen extrazellulären Calcium-Konzentrationen wurde
an 14 isolierten linksventrikulären Myozyten in Form einer Dosis-Wirkungsanalyse
untersucht. Die Myozyten stammten von elf Patienten, die aufgrund einer dilatativen
(n= 7) oder ischämischen (n= 4) Kardiomyopathie terminal herzinsuffizient waren.
Sie waren im Mittel zum Zeitpunkt der Operation 52,3 Jahre alt und hatten eine
durchschnittliche linksventrikuläre Ejektionsfraktion von 23,1 %. Die klinischen Daten
der Patienten sind in folgender Tabelle zusammengefaßt.
Initialen
Geschlecht
Alter [a]
Diagnose
EF [%]
CI [l/min/m²]
F.R.
C.E.
m
m
58
26
DCM
DCM
33
10-15
n.b.
2,1
M.H.
m
60
DCM
10
1,9
J.M.
m
40
DCM
14
1,94
W.R.
m
58
DCM
n.b.
2
F.E.
m
67
DCM
n.b.
n.b.
R.G.
m
38
DCM
15-20
n.b.
U.S.
m
62
ICM
35
1,7
W.G.
m
44
ICM
15-20
n.b.
E.O.
w
54
ICM
36
3,66
U.M-P
w
68
ICM
32
2,53
23,1±10
2,26±0,6
x +s
52,3±13
Tabelle 1: Klinische Daten der Patienten. ICM = ischämische Kardiomyopathie; DCM = dilatative
Kardiomyopathie; EF = linksventrikuläre Ejektionsfraktion; CI = Herzindex = Herzminutenvolumen/Körperoberfläche; n.b. = nicht bekannt
Ergebnisse
55
Zu Beginn der Versuche verkürzten sich die Myozyten bei einer extrazellulären
Calciumkonzentration von 1,25mM im Durchschnitt um 3,69 ± 0,38%. Bei steigender
Calciumkonzentration nahm die Verkürzungsfraktion proportional zu bis auf 13,46 ±
1,31% bei 15 mM Calcium. Ab einer Konzentration von 4mM war die Kontraktionszunahme signifikant erhöht.
In der folgenden Abbildung ist die Orginalregistrierung zweier Kontraktionen zu
sehen. Die erste Kontraktion wurde zu Beginn des Versuchs aufgezeichnet, die
zweite unter Einwirkung von 15mM extrazellulärem Calcium.
Abbildung 8: Originalregistrierung zweier Kontraktionen einer linksventrikulären Myozyte unter
1,25mM und 15mM extrazellulärem Calcium.
Ergebnisse
56
Das Kontraktionsverhalten in Abhängigkeit von den extrazellulären Calcium-Konzentrationen ist in Abbildung 9 dargestellt.
Abbildung 9: Mittelwerte ± Standardabweichung der relativen Verkürzung der linksventrikulären
Myozyten bei einer Calcium - Dosis - Wirkungsanalyse. *=p<0,05 vs. 1,25mM Ca
Ergebnisse
57
Auch weitere Kontraktilitätsparameter änderten sich unter erhöhter extrazellulärer
Calciumkonzentration. So nahm die diastolische Länge ab, das Verkürzungs-ZeitIntegral, die TTP, T
10%
to peak, die maximalen Kontraktions- und Relaxationsge-
schwindigkeiten zu. Die RT 50% änderte sich dagegen nicht.
In der Tabelle sind sämtliche Änderungen der Kontraktilitätsparameter in
Absolutwerten zusammengefaßt.
Parameter Ca 1,25mM
Ca 2,5mM
Ca 4mM
Ca 7,2mM
Ca 12mM
Ca 15mM
3,69 ± 0,38
4,98 ± 0,76
7,08* ± 1,09
9,46* ± 0,82
11,0* ± 1,03
13,46* ± 1,31
Ldia
130 ± 85
120 ± 85
120 ± 84
120* ± 73
110* ± 51
100* ± 78
INT
2841 ± 422
4164 ± 882
5811* ± 1120
7688* ± 795
8527* ± 859
9674* ± 1291
TTP
536 ± 59
579* ± 56
568 ± 46
615 ± 45
611* ± 48
580* ± 63
T10%toP
473 ± 53
503 ± 49
488 ± 39
538 ± 37
519 ± 44
474* ± 62
smd
-18 ± 2
-20 ± 3
-27* ± 5
-36* ± 4
-43* ± 5,14
-48* ± 4
smu
16 ± 3
19 ± 3
30* ± 5
46* ± 7
44* ± 6
50* ± 6
891 ± 118
923 ± 107
866 ± 77
930± 64
859 ± 62
716 ± 69
rel.Verk.
RT 50%
Tabelle 2: Mittelwerte ± Standardabweichung der Kontraktilitätsparameter aller 14 mit Calcium
untersuchten Myozyten. Ca = Calcium; rel. Verk. = relative Verkürzung [%]; Ldia = diastolische Länge
[µm]; INT = Verkürzungs-Zeit-Integral [µm/s]; TTP = time to peak [ms]; T10% to P = time 10% to peak
[ms]; smd = slope max down [Ldia/s]; smu = slope max up [Ldia/s]; RT 50% = time peak to 50% [ms]; *
= signifikant verschieden von Ca 1,25mM
Ergebnisse
III.2 Einfluß
58
von
Isoproterenol
auf
die
Kontraktilitätsparameter
linksventrikulärer Myozyten
Die
Wirkung
des
selektiven
β-Agonisten
Isoproterenol
wurde
an
fünf
linksventrikulären Myozyten aus vier terminal insuffizienten explantierten Herzen in
Form einer Dosis-Wirkungskurve untersucht. Zum Zeitpunkt der Operation waren die
Patienten im Mittel 55 Jahre alt und hatten eine linksventrikuläre Ejektionsfraktion
von 10%, 14% und 35%, der Wert eines Patienten ist leider nicht bekannt. Die
klinischen Daten sind in folgender Tabelle zusammengefaßt.
Initialen Geschlecht Alter [a] Diagnose EF [%] CI [l/min/m²]
M.H.
m
60
DCM
10%
1,9
J.M.
m
40
DCM
14%
1,94
W.R.
m
58
DCM
n.b.
2
U.S.
m
62
ICM
35%
1,7
x +s
55±9
20±11 1,89±0,11
Tabelle 3: Klinische Daten der Patienten. ICM = ischämische Kardiomyopathie; DCM = dilatative
Kardiomyopathie; EF = linksventrikuläre Ejektionsfraktion; CI = Herzindex = Herzminutenvolumen/Körperoberfläche; n.b. = nicht bekannt
Ergebnisse
59
Vor Zugabe von Isoproterenol zu Beginn der Versuche verkürzten sich die
Kardiomyozyten durchschnittlich um 3,24±0,29%. Nach Zugabe von Isoproterenol
nahm die Verkürzungsfraktion in Abhängigkeit von der Konzentration stetig zu bis auf
7,9±1,4% bei 10-7 M. Ab einer Konzentration von 10-8M war die Zunahme signifikant
erhöht zum Basalwert. In der folgenden Abbildung sind Originalregistrierungen
-7
dargestellt, die flache Kurve zu Beginn des Versuches, die zweite unter 10 M
Isoproterenol.
Abbildung 10: Originalregistrierung zweier Kontraktionen einer linksventrikulären Myozyte vor und
-7
nach Zugabe von 10 M Isoproterenol.
Ergebnisse
60
Der Verlauf der Verkürzungszunahme ist in folgender Abbildung zu sehen.
Abbildung 11: Mittelwerte ± Standardabweichung der relativen Verkürzung der ventrikulären Myozyten
bei einer Isoproterenol- Dosis - Wirkungsanalyse. *=p<0,05 vs. Basal
Ergebnisse
61
Außer der Verkürzungsfraktion änderten sich mehrere Parameter. Das VerkürzungsZeit-Integral nahm zu, allerdings nicht signifikant, die TTP nahm bei 10-7M
Isoproterenol
signifikant
ab,
ebenso
die
T10%to
P.
Die
maximale
Kontraktionsgeschwindigkeit nahm schon bei 10-9M Isoproterenol signifikant zu; auch
die Relaxationsgeschwindigkeit verdreifachte sich, doch war die Veränderung
statistisch nicht signifikant. Die RT 50% nahm um 25% ab, auch das war statistisch
gesehen nicht signifikant. Die diastolische Länge blieb den Versuch über konstant. In
der folgenden Tabelle sind die Meßergebnisse zusammengefaßt.
Parameter
-9
-9
-8
Iso 3x10 M
3,23 ± 0,28
4,00± 0,34
3,96 ± 0,25
141 ± 14
135 ± 4
137 ± 18
140 ± 13
137 ± 12
136 ± 12
3,05± 0,47
3,65 ± 1,02
4,26 ± 0,75
4,85 ± 0,77
5,98 ± 1,03
6,50 ± 1,28
TTP
593 ± 71
627 ± 84
604 ± 78
509 ± 47
466 ± 51
428* ± 49
t10%toP
513 ± 65
551 ± 74
519 ± 76
431 ± 31
397 ± 37
357* ± 31
smd
13,0 ± 3,0
16,5 ± 2,3
15,8 ± 2,3
22,6* ± 2,6
34,2* ± 7,8
43,3* ± 11,0
smu
13,6 ± 4,2
13,2 ± 2,4
15,1 ± 7,0
19,0 ± 3,6
32,9 ± 8,1
35,4 ± 11,5
RT 50%
914 ± 128
963 ± 159
970 ± 163
788 ± 71
715 ± 70
665 ± 62
Ldia
INT [x10-3]
Iso 3x10 M
-7
Iso 10 M
rel. Verk.
Iso 10 M
-8
Basal
Iso 10 M
5,11*± 0,50 7,13* ± 1,17 7,90* ± 1,39
Tabelle 4: Mittelwerte ± Standardabweichungen der Kontraktilitätsparameter der mit Isoproterenol
untersuchten ventrikulären Myozyten. Iso = Isoproterenol, rel. Verk. = relative Verkürzung [%]; Ldia =
diastolische Länge [µm]; INT = Verkürzungs-Zeit-Integral [µm/s]; TTP = time to peak [ms]; T10% to P =
time 10% to peak [ms]; smd = slope max down [-Ldia/s]; smu = slope max up [Ldia/s]; RT 50% = time
peak to 50% [ms]; * = signifikant verschieden vom Basalwert
Ergebnisse
62
III.3 Untersuchungen zur Angiotensin II - Wirkung auf den rechten
Vorhof
Die Wirkung von Angiotensin II auf Myokard des rechten Vorhofes wurde an elf
Myozyten von neun Auricula cordis dextra untersucht. Die Patienten waren zum
Operationszeitpunkt im Mittel 67,3 Jahre alt, die durchschnittliche linksventrikuläre
Ejektionsfraktion lag bei 49,4%. In Tabelle 5 sind die klinischen Daten der Patienten
zusammengefaßt.
Initialen Geschlecht Alter [a] Diagnose NYHA EF [%]
M.Z.
w
68
KHK
II
55
W.S.
m
59
KHK
III
50
P.B.
m
56
KHK
III
30
W.M.
m
77
KHK
III
30
J.E.
m
71
KHK
n.b.
55
G.H.
m
71
KHK
n.b.
66
G.H-B.
w
n.b.
KHK
III
n.b.
A.H.
m
69
KHK
n.b.
60
E.H.
m
65
KHK
n.b.
55
x +s
67,3±7
49,4±13
Tabelle 5: Klinische Daten der Patienten zum Operationszeitpunkt. KHK = koronare Herzkrankheit; EF
= linksventrikuläre Ejektionsfraktion; n.b. = nicht bekannt
Ergebnisse
63
III.3.1 Einfluß von Angiotensin II auf die Kontraktilitätsparameter atrialer
Myozyten
Die mittlere absolute Verkürzung der zehn Myozyten lag zu Versuchsbeginn bei 4,57
± 0,55%. Bei steigender Angiotensin II - Konzentration nahm die Verkürzungsfraktion
deutlich zu, bei 10-5M lag sie bei 7,26 ± 0,69%. Das entspricht einer Zunahme auf
188,28%. Die Verkürzungsfraktion war ab einer Konzentration von 10-7M signifikant
erhöht.
Die folgende Abbildung zeigt eine Originalregistrierung zweier Kontraktionen, eine zu
-7
Versuchsbeginn und eine unter der Einwirkung von 10 M Angiotensin II.
Abbildung 12: Orginalregistrierung aus einem Angiotensin-Dosis-Wirkungsanalysen-Versuch an
rechts atrialen Kardiomyozyten.
Ergebnisse
64
Abbildung 13 zeigt den Effekt von Angiotensin II auf die atrialen Myozyten in Abhängigkeit von der Konzentration.
Abbildung 13: Mittelwerte ± Standardabweichung der relativen Verkürzung der atrialen Myozyten bei
einer Angiotensin II- Dosis - Wirkungsanalyse. *=p<0,05 vs. Basal
Ergebnisse
65
Außer der Verkürzungszunahme waren auch eine signifikante Zunahme des
Integrals ab 10-8M, eine Verlängerung der TTP ab 10-7M, eine Zunahme der
maximalen Relaxationsgeschwindigkeit bei 10-5M und eine verlängerte RT 50% ab
10-7M zu beobachten. In Tabelle 6 sind die Ergebnisse in absoluten Werten
dargestellt.
-10
-9
-8
-7
-6
-5
Parameter
Basal
A II 10 M
A II 10 M
A II 10 M
A II 10 M
A II 10 M
A II 10 M
rel. Verk.
4,56 ±0,55
4,67 ±0,57
5,219 ±0,69
6,54 ± 0,98
7,32* ±1,16
7,29* ±1,31
7,26* ±0,69
INT
1204 ± 87
1310 ±161
1386 ± 112
1641* ±175
2072* ±199
1987+ ±271
1836* ±237
TTP
157 ± 18
160 ± 17
152 ± 14
161 ± 16
185 ± 23
183 ± 22
171 ± 17
T 10% to P
137 ± 15
142 ± 14
132 ± 13
143 ± 16
160 ± 19
161 ± 18
156 ± 17
smd
-81 ± 17
-83 ± 17
-83 ± 16
-92 ± 16
-94 ± 19
-100 ± 22
-103 ± 17
smu
41 ± 7
41 ± 6
46 ± 7
53 ± 11
55 ± 14
58 ± 13
57* ± 10
267 ± 29
273 ± 30
257 ± 26
276 ± 25
308 ± 29
316* ± 31
311 ± 28
RT 50%
Tabelle 6: Mittelwerte ± Standardabweichung der Kontraktilitätsparameter aller zehn mit Angiotensin II
untersuchten Myozyten. Basal = Ausgangslage vor Angiotensin II; A II = Angiotensin II; rel. Verk. =
relative Verkürzung [%]; Ldia = diastolische Länge [µm]; INT = Verkürzungs-Zeit-Integral [µm/s]; TTP =
time to peak [ms]; T10% to P = time 10% to peak [ms]; smd = slope max down [Ldia/s]; smu = slope
max up [Ldia/s]; RT 50% = time peak to 50% [ms]; * = signifikant verschieden vom Basalwert
Ergebnisse
66
III.3.2 Einfluß des Angiotensin II - Rezeptorantagonisten Losartan auf die
Angiotensin II -Wirkung
Zehn Myozyten aus sieben Auricula dextra wurden mit Losartan, einem spezifischen
Angiotensin II - Subtyp 1-Rezeptorenblocker in einer Konzentration von 10-6M
inkubiert, bevor eine Dosis-Wirkungskurve mit Angiotensin II durchgeführt wurde. Die
Patientendaten sind in Tabelle 7 wiedergegeben. Das durchschnittliche Alter lag bei
66,3 Jahren, die mittlere linksventrikuläre Ejektionsfraktion bei 56,4%.
Initialen Geschlecht Alter [a] Diagnose NYHA EF [%]
O.M.
m
68
KHK
n.b.
60
L.M.
w
65
KHK
III
30
G.M.
m
56
KHK
II
45
H.Z.
m
51
KHK
II
70
C.P.
w
67
KHK
III
75
O.P.
m
73
KHK
III
60
A.C.
m
84
KHK
III
55
x +s
66,3±10
56,4±14
Tabelle 7: Klinische Daten der Patienten zum Operationszeitpunkt. KHK = koronare Herzkrankheit; EF
= linksventrikuläre Ejektionsfraktion
Ergebnisse
67
Losartan blockierte die Angiotensin II - Effekte am Vorhofmyokard vollständig.
Abbildung 14: Mittelwerte ± Standardabweichung der relativen Verkürzung (auf Ausgangswert
bezogen) der rechtsatrialen Myozyten bei Angiotensin II - Dosis - Wirkungsanalysen ohne und mit
-6
Inkubation mit 10 M Losartan. Basal = Ausgangslage vor Dosis-Wirkungskurve; A II = Angiotensin II;
*=p<0,05 A II vs. A II + Losartan
Ergebnisse
68
III.4 Einfluß von Angiotensin II auf die Kontraktilitätsparameter
linksventrikulärer Myozyten
Die Wirkung von Angiotensin II am humanen Ventrikelmyokard wurde an neun Myocyten aus fünf terminal insuffizienten Herzen untersucht. Dabei waren vier Herzen
wegen einer dilatativen Kardiomyopathie insuffizient,
eines
aufgrund
einer
ischämischen Kardiomyopathie. Die Patienten waren zum Zeitpunkt der Operation
im Mittel 55,6 Jahre alt, die mittlere Ejektionsfraktion lag bei 23,7%.
Initialen
Geschlecht
Alter [a]
Diagnose
EF [%]
CI [l/min/m²]
G.R.
m
67
ICM
n.b.
n.b.
U.J.
m
43
DCM
29
1,71
H.S.
m
63
DCM
24
1,76
F.E.
m
67
DCM
n.b.
n.b.
R.G.
m
38
DCM
18
n.b.
23,7±5
1,74±0,03
x +s
55,6±13
Tabelle 8: Klinische Daten der Patienten. ICM = ischämische Kardiomyopathie; DCM = dilatative
Kardiomyopathie; EF = linksventrikuläre Ejektionsfraktion; CI = Herzindex, Herzminutenvolumen/
Körperoberfläche
Ergebnisse
69
Die mittlere absolute Verkürzung lag zu Versuchsbeginn bei 3,22±0,62%. Bei einer
-6
Angiotensin II - Konzentration von 10 M nahm die Verkürzung um 12,14% auf
2,79±0,59% ab. Die Abnahme der relativen Verkürzung war nicht signifikant
(p=0,073). Die Abbildung zeigt den Effekt von Angiotensin II auf die
linksventrikulären Myozyten.
Abbildung15: Mittelwerte ± Standardfehler der relativen Verkürzung der linksventrikulären Myozyten
bei einer Angiotensin II - Einzeldosis - Wirkungsanalyse.
Ergebnisse
70
Sämtliche anderen Kontraktilitätsparameter veränderten sich unter der Einwirkung
von Angiotensin II nicht signifikant. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 dargestellt.
Parameter
rel. Verk.
ITN
absolute Werte
Basal
A II 10-6 M
3,22 ± 0,62
2,79 ± 0,59
3378,07 ± 455,11 3178,6 ± 961,33
TTP
501,54 ± 49,83
518,05 ± 44,91
T 10% to P
455,55± 44,53
471,86 ± 39,26
smd
-15,64 ± 2,09
-12,94 ± 2,03
smu
9,73 ± 1,25
9,15 ± 1,64
837,9 ± 68,47
855,92 ± 71,69
RT 50%
Tabelle 9: Mittelwerte ± Standardabweichung der Kontraktionsparameter aller neun mit Angiotensin II
untersuchten Myozyten. Basal = Ausgangslage vor Angiotensin II; A II = Angiotensin II; rel. Verk. =
relative Verkürzung [%]; INT = Verkürzungs-Zeit-Integral [µm/s]; TTP = time to peak [ms]; T10% to P =
time 10% to peak [ms]; smd = slope max down [Ldia/s]; smu = slope max up [Ldia/s]; RT 50% = time
peak to 50% [ms]
Ergebnisse
71
III.5 Untersuchungen zur Endothelin-1-Wirkung am rechten Vorhof
Die Wirkung von Endothelin-1 auf das Myokard des rechten Vorhofes wurde an zwölf
Myozyten aus zehn Auricula cordis dextra untersucht. Das durchschnittliche Alter
der Patienten zum Operationszeitpunkt lag bei 60,1 Jahren, die mittlere
linksventrikuläre Ejektionsfraktion betrug 55,4%. In der folgenden Tabelle sind die
klinischen Daten der Patienten zusammengestellt.
Initialen
Geschlecht
Alter [a]
Diagnose
NYHA
EF [%]
W.H.
m
33
KHK
II
70
H.S.
m
30
AKE
III
68
H.S.
m
65
KHK
n.b.
60
K.S.
m
62
KHK
II
55
C.G.
m
40
DCM
n.b.
n.b.
A.L.
m
84
KHK
I
50
L.B.
m
74
KHK
III
35
M.G.
w
65
KHK
II
45
E.E.
m
74
KHK
III
40-50
S.G.
m
74
KHK
I
60
x +s
60,1±18
54,2±11
Tabelle 10: Klinische Daten der Patienten zum Operationszeitpunkt. KHK = koronare Herzkrankheit;
AKE = Aortenklappenersatz; DCM = dilatative Kardiomyopathie; EF = linksventrikuläre
Ejektionsfraktion
Ergebnisse
72
III.5.1 Einfluß von Endothelin-1 auf die Kontraktilitätsparameter atrialer
Myozyten
Die mittlere relative Verkürzung der Myozyten lag zu Versuchsbeginn bei
3,66±0,68%. Unter Endothelineinwirkung nahm die Verkürzungsfraktion stetig zu bis
auf 7,27±1,20% bei 10-8M.
Zwei typische Kontraktionen sind als Originalregistrierung in der folgenden Abbildung
zu sehen.
100
relative Verkürzung [%]
Basal
98
96
-8
ET-1 10 M
92
0
100
200
300
400
500
600
t [ms]
Abbildung 16: Orginalregistrierung aus einem Endothelin-1-Dosis-Wirkungsanalysen-Versuch an
atrialen Kardiomyozyten.
Ergebnisse
73
Ab 10-10M Endothelin-1 war die Kontraktionszunahme signifikant zum Basalwert
erhöht.
In
der
folgenden
Abbildung
sind
die
Kontraktilitätsänderungen
konzentrationsabhängig wiedergegeben.
*
relative Verkürzung [%]
8
*
*
7
6
5
4
3
Basal
-12
-11
-10
-9
-8
log M Endothelin-1
Abbildung 17: Mittelwerte ± Standardabweichung der relativen Verkürzung der atrialen Myozyten bei
einer Endothelin-1-DosisWirkungsanalyse. *=p<0,05 vs. Basal
Ergebnisse
74
Die diastolische Länge nahm ab 10-9M Endothelin-1 signifikant ab, das VerkürzungsZeit-Integral bei 10-8M signifikant zu. Während sich an den Kontraktionszeiten TTP,
T10% to peak und RT 50% nichts änderte, nahmen die Kontraktions- und
Relaxationsgeschwindigkeiten
ab
einer
Endothelinkonzentration
von
10-10M
signifikant zu. Die veränderten Kontraktilitätsparameter unter Endothelineinwirkung
sind in der Tabelle wiedergegeben.
Parameter
rel. Verk.
Basal
ET 10-12M
ET 10-11M
ET 10-10M
ET 10-9M
ET 10-8M
3,66 ± 0,68 3,58 ± 0,72 4,49 ± 0,87 5,54* ±1,06 7,14* ±1,31 7,27* ±1,20
109 ± 6
109± 7
108 ± 7
107 ± 6
106* ± 7
106* ± 6
1,54 ± 0,28
1,38 ± 0,3
1,50 ± 0,3
1,81 ± 0,4
2,37 ± 0,5
2,41* ± 0,5
TTP
168 ± 12
173 ± 13
161 ± 14
161 ± 14
163 ± 12
192 ± 26
T10% to P
152 ± 11
157 ± 13
145 ± 13
141 ± 14
147 ± 10
176 ± 26
smd
55,0 ± 7,4
52,0 ± 7,7
61,5 - 8,3
74,0* ±11,3 97,2* ±15,8 91,4* ±12,4
smu
30,0 ± 5,0
28,0 ± 5,1
36,5 ± 5,6
44,9* ±804 56,1* ±10-7 46,0* ±6,4
RT 50%
311 ± 20
316 ± 22
298 ± 20
Ldia
INT [x10-3]
283 ± 21
285 ± 18
332 ± 30
Tabelle 11: Mittelwerte ± Standardabweichungen der Kontraktilitätsparameter der mit Endothelin
untersuchten atrialen Myozyten. Rel. Verk. = relative Verkürzung [%]; Ldia = diastolische Länge [µm];
INT = Verkürzungs-Zeit-Integral [µm/s]; TTP = time to peak [ms]; T10% to P = time 10% to peak [ms];
smd = slope max down [-Ldia/s]; smu = slope max up [Ldia/s]; RT 50% = time peak to 50% [ms]; * =
signifikant verschieden vom Basalwert
Ergebnisse
III.5.2 Einfluß
75
des
Endothelin-1-Rezeptorantagonisten
BQ
123
auf
die
Endothelinwirkung
Acht Myozyten aus sechs rechten Vorhöfen wurden vor Beginn einer EndothelinDosis-Wirkungskurve mit dem spezifischen ETA-Rezeptorenblocker BQ 123
inkubiert. Im Mittel waren die Patienten 62,6 Jahre alt und hatten eine
linksventrikuläre Ejektionsfraktion von 61,2%. Die Daten der Patienten sind in
folgender Tabelle zusammengestellt.
Initialen Geschlecht Alter [a] Diagnose NYHA EF [%]
R.F.
m
83
KHK
III
60
M.K.
m
38
KHK
I
70
J.M.
m
44
KHK
n.b.
45
J.R.
m
69
KHK
III
45
H.G.
m
74
KHK
n.b.
87
O.M.
m
68
KHK
n.b.
60
x +s
60,6±16
56,7±17
Tabelle 12: Klinische Daten der Patienten zum Operationszeitpunkt. KHK = koronare Herzkrankheit;
EF = linksventrikuläre Ejektionsfraktion; n.b. = nicht bekannt
Ergebnisse
76
Durch BQ 123 ließen sich sämtliche Effekte des Endothelin-1 am atrialen Myozyten
blockieren. Kein Parameter änderte sich zum Ausgangswert signifikant. Trägt man
die
Veränderungen
der
relativen
Verkürzung
auf
100%
bezogen
beider
Vorhofversuche in einen Graphen auf, erhält man folgendes Bild:
*
250
*
relative Verkürzung [%]
ET-1
200
*
150
ET-1 + BQ 123
100
50
0
Basal
-10
-9
-8
log M Endothelin-1
Abbildung 18: Mittelwerte ± Standardabweichung der relativen Verkürzung der atrialen Myozyten bei
Endothelin-1-Dosis-Wirkungsanalysen, mit und ohne BQ 123. ET-1 = Endothelin-1; *=signifikant
verschieden vs. ET-1 + BQ 123
Ergebnisse
77
III.6 Untersuchungen zur Endothelin-1- Wirkung am Ventrikel
Die Wirkung von Endothelin-1 am Ventrikel wurde bei zwei verschiedenen
extrazellulären Calciumkonzentrationen durchgeführt. Bei 1,25 mM extrazellulärem
Calcium wurden neun Myozyten aus fünf terminal insuffizienten Herzen untersucht,
bei 2,5 mM Calciumkonzentration waren es sieben Myozyten aus vier insuffizienten
Herzen. Im Mittel waren die Patienten 54,6 Jahre alt, die durchschnittliche
linksventrikuläre Ejektionsfraktion lag bei 22,7%. Die klinischen Daten der Patienten
sind in Tabelle 13 wiedergegeben.
Ca-Konz. [mM] Initialen Geschlecht Alter [a] Diagnose EF [%] CI [l/min/m²]
1,25
2,5
x +s
U.J.
m
43
DCM
29
1,71
H.S.
m
63
DCM
24
1,76
F.E.
m
67
DCM
n.b.
n.b.
M.B.
w
61
DCM
15
n.b.
D.B.
m
57
DCM
29
1,17
W.G.
m
44
ICM
15-20
n.b.
M.N.
w
60
ICM
21
2,56
C.K.
m
49
ICM
15
2,1
C.C-M.
w
48
DCM
31
n.b.
54,6±8
22,7±6 1,86±0,5
Tabelle 13: Klinische Daten der Patienten. Ca-Konz. = extrazelluläre Calciumkonzentration; DCM =
dilatative Kardiomyopathie; ICM = ischämische Kardiomyopathie; EF = linksventrikuläre Ejektionsfraktion; CI = Herzindex
Ergebnisse
78
Zu Versuchsbeginn lag bei 1,25 mM extrazellulärem Calcium die mittlere
Verkürzungsfraktion bei 4,27 ± 0,86%, bei 2,5 mM Calcium war die anfängliche
Verkürzungsfraktion etwas niedriger mit 3,03 ± 0,42%.
Unter 1,25 mM extrazellulärem Calcium betrug die relative Verkürzung bei einer
Endothelinkonzentration von 10-8M 3,81 ± 0,92%, was einer Abnahme von 4,92% im
-6
Vergleich zum Basalwert entspricht. Nach Zugabe von Isoproterenol (10 M,
Einzeldosis) steigerte sich die Verkürzung auf 7,59 ± 2,05% (n=3).
Bei 2,5 mM extrazellulärem Calcium betrug die Verkürzungsfraktion unter 10-8M
Endothelin-1 2,38 ± 0,32%, was eine Abnahme vom Ausgangswert um 17,3%
bedeutet. Nach Isoproterenol-Zugabe steigerte sich die Verkürzungsfraktion
signifikant auf 10,10% (n=2). In der folgenden Abbildung sind die Ergebnisse
graphisch dargestellt.
450
400
relative Verkürzung [%]
350
300
250
200
150
100
50
Basal
-10
-9
-8
Iso sd
log M Endothelin-1
Abbildung 19: Mittelwerte ± Standardfehler der relativen Verkürzung der linksventrikulären Myozyten
bei
einer
Endothelin-1
Dosis-Wirkungsanalyse
bei
unterschiedlichen
extrazellulären
Calciumkonzentrationen. Schraffiert = 1,25 mM Ca, kariert = 2,5 mM Ca . Ca = Calcium, Iso sd =
Isoproterenol-Einzeldosis; * = p<0,05 zum Basalwert
Ergebnisse
79
Während bei den Myozyten, die unter 1,25 mM extrazellulärem Calcium auf ihren
Endothelineffekt hin untersucht wurden, lediglich die diastolische Länge ab einer
Endothelin-Konzentration von 10-11M signifikant abnahm, änderten sich bei 2,5 mM
extrazellulärem Calcium mehrere Parameter. Das Verkürzungs-Zeit-Integral, die
TTP, T10% to P und RT 50% nahmen ab 10-9M Endothelin-1 signifikant ab.
Vergleicht man allerdings die beiden Gruppen untereinander, ergibt sich für keinen
Parameter ein signifikanter Unterschied. In der folgenden Tabelle sind die Meßdaten
nochmals zusammengefaßt.
Parameter
rel. Verk.
Basal
4,27 ± 0,9
ET 10-12M ET 10-11M ET 10-10M ET 10-9M ET 10-8M
4,45 ± 0,9
4,57 ± 0,9
3,03 ± 0,4
150 ± 10
Ldia
151 ± 10
144* ± 11
129 ± 15
-3
INT [x10 ]
5,47 ± 1,3
6,61 ± 1,7
6,38 ± 1,1
5,65 - 1,3
TTP
648 ± 61
703 ± 80
697 ± 79
720 ± 163
T10% to P
578 ± 56
632 ± 71
632 ± 73
653 ± 146
smd
13,4 ± 1,8
15,9 ± 3,6
17,0 ± 3,4
15,1 ± 3,6
smu
10,7 ± 2,5
12,1 ± 4,4
11,7 ± 3,7
9,7 ± 2,8
RT 50%
1038 ± 110
1337 - 319
1192 ± 156
1212* ±158
Iso sd
4,25 ± 0,9
3,44 ± 0,8
3,81 ± 0,9
7,59 ± 2,1
3,06 ± 0,4
2,53 ± 0,3
2,38 ± 0,3
10,1 ± 1,6
144* ± 12
144* ± 11
142* ± 11
139 ± 21
127 ± 15
128 ± 15
127 ± 15
146 ± 17
6,19 ± 1,2
4,22 ± 0,9
4,45 ± 1,1
14,5 ± 7,7
4,12 ± 0,9
2,71*±0,6
2,41*±0,4
6,51 ± 2,0
654 ± 65
582 ± 51
622 ± 115
697 ± 200
582 ± 97
513* ± 94
495* ± 99
298* ± 75
568 ± 49
519 ± 45
518 ± 78
648 ± 205
526 ± 82
463* ± 85
450* ± 69
267* ± 60
15,3 ± 3,0
14,4 ± 2,4
15,3 ± 2,5
36,8 ± 9,2
14,3 ± 3,5
13,8 ± 2,8
13,0 ± 3,6
87,8 ± 33
10,7 ± 3,9
13,2 ± 3,9
14,8 ± 3,8
18,7
7,6 ± 2,9
7,9 ± 2,0
7,4 ± 2,6
77,6 ± 22
1236 ± 144
1017 ± 140
1038 ± 152
1586 ± 476
1077 ± 239
890* ± 187
946 ± 223
451* ± 108
Tabelle 14: Mittelwerte ± Standardabweichungen der Kontraktilitätsparameter unter Endothelin-1 und
1,25mM, bzw. 2,5mM (grau unterlegt) extrazellulärer Calciumkonzentration. Rel. Verk. = relative
Verkürzung [%]; Ldia = diastolische Länge [µm]; INT = Verkürzungs-Zeit-Integral [µm/s]; TTP = time to
peak [ms]; T10% to P = time 10% to peak [ms]; smd = slope max down [-Ldia/s]; smu = slope max up
[Ldia/s]; RT 50% = time peak to 50% [ms]; * = signifikant verschieden vom Basalwert
80
IV Diskussion
IV.1 Methode zur Gew innung von isolierten Kardiomyozyten
Versuche zur Untersuchung verschiedenster Substanzen auf die myokardiale
Kontraktilität finden schon sehr lange statt. Doch stellt sich immer wieder die Frage,
welche Methode dazu am sinnvollsten ist, welche Vor- und Nachteile die einzelnen
Methoden haben und inwieweit die Versuchsergebnisse tatsächlich auf den
Gesamtorganismus eines Menschen zu übertragen sind.
So ist es möglich, inotrope Effekte am Menschen in vivo zu untersuchen. Unter
klinischen
Bedingungen
Ejektionsfraktion
und
können
die
zwar
maximale
Herzminutenvolumen,
linksventrikuläre
Druckanstiegsgeschwindigkeit
gemessen
werden, die als Parameter für den kontraktilen Zustand angesehen werden können,
doch sind sämtliche Parameter von der Vor- und Nachlast des Herzens abhängig,
die wiederum sekundär durch die Inotropie und direkt durch eine Änderung des
Gefäßtonus beeinflußt werden [179].
Der inotrope Effekt einer Substanz läßt sich somit einfacher direkt an einem
Muskelpräparat messen. Hierzu stehen wiederum verschiedene Methoden zur
Verfügung, doch auch diese unterliegen mehreren Beschränkungen:
Myokard von nicht insuffizienten Herzen steht nur dann zur Verfügung, wenn ein
potentielles Spenderherz aus technischen Gründen zur Transplantation abgelehnt
wird. Das ist äußerst selten der Fall, da ein enormer Bedarf an Spenderorganen
besteht, der nicht abgedeckt werden kann. Wird ein Spenderherz abgelehnt, dann
meistens deshalb, weil eine kardiale Erkrankung nicht völlig auszuschließen ist,
womit die Einstufung als „gesund“ fragwürdig erscheint. Für diese Arbeit stand kein
sogenanntes Normalherz zur Verfügung, womit die Kontrolle gegenüber terminalinsuffizienten Herzen fehlt.
Terminal insuffizientes Myokard wird hauptsächlich aus explantierten Herzen
gewonnen. Auch dieses steht nur in wenigen Zentren Deutschlands ausreichend zur
Verfügung, so daß neben den explantierten Herzen aus der Universitätsklinik
Freiburg
Diskussion
81
auch Herzen aus dem Herzzentrum in Bad Oeynhausen untersucht wurden. Der
Transportweg dieser Herzen benötigte ca. sechs Stunden. Durch die Verwendung
der speziellen kardioplegischen Substanz 2,3-Butanedione Monoxime [144] konnten
diese logistischen Probleme erheblich vermindert werden.
Es besteht die Möglichkeit, an intakten Muskelstreifenpräparaten, die isometrisch
schlagen, die Veränderung der Spitzenkraft zu messen. Das sollte dann unter
möglichst physiologischen Bedingungen geschehen, bei einer Temperatur von 37°C
und einer Stimulationsfrequenz von 1 Hertz. Doch muß hier sichergestellt sein, daß
der Sauerstoffbedarf auch im Inneren des Streifenpräparates ausreichend ist. Dazu
darf das Präparat nur eine kleine Querschnittsfläche haben (unter 0,6 mm²). Bei
atrialem Myokard ist das ein kleineres Problem, weil im Auriculum cordis dexter
genügend dünne Trabekel vorhanden sind, die in toto exzidiert und zum Versuch
verwendet werden können. Im linksventrikulären Myokard allerdings müssen die
Präparate in passender Größe herausgeschnitten werden, was mit einer Verletzung
des Myokards einhergeht. Die größte Gefahr stellt die massive Calciumfreisetzung
dar, die zu Kontrakturen und Superkontrakturen des umliegenden Gewebes führt.
Mit Hilfe von BDM versucht man dieses Problem in den Griff zu bekommen. Nicht
berücksichtigt
wurde
bisher,
daß
in
Muskelstreifenpräparaten
nicht
nur
Kardiomyozyten enthalten sind, sondern auch Endothelzellen und Fibroblasten. Wie
kann unter solchen Versuchsbedingungen also eindeutig ausgesagt werden, daß die
beobachteten Effekte ausschließlich auf die Kardiomyozyten zurückzuführen sind?
1981 gelang es Powell et al. [166] zum ersten Mal, humane Kardiomyozyten aus
rechten Ventrikeln von Kindern und Erwachsenen enzymatisch zu isolieren. Ein Jahr
später waren auch Bustamente et al. [28] in der Lage, isolierte Herzmuskelzellen aus
menschlichem Ventrikel und Vorhof zu gewinnen, die sich unter physiologischen
extrazellulärem Calcium elektrisch stimulieren ließen. In den nächsten Jahren wurde
viel experimentiert, um die Isolationsmethode zu verbessern: Verschiedenste
Enzyme kamen beim Isolationsvorgang zum Einsatz, beispielsweise Collagenasen
[3, 27, 47, 165, 135], Hyaluronidasen [90], und unspezifische Proteasen [28]. Unsere
Arbeitsgruppe etablierte nun die Einzelzellisolierung in Anlehnung an das Protokoll
von Harding et al. [74] (s.Kapitel II). Die Ausbeute morphologisch gut erhaltener
Zellen war recht verschieden, lag meistens bei 10%, erreichte selten aber auch 5070%. Die Zellen ließen sich mit einer Frequenz von 0,2 Hz bei 23-31 V stimulieren.
Unter
physiologischen
Bedingungen
von
37°C
und
einer
andauernden
Diskussion
82
Stimulationsfrequenz von 1 Hz wurden die Myozyten zum Großteil sehr schnell
instabil und gingen in Kontraktur, Versuche ließen sich unter diesen Bedingungen
nicht durchführen. Die Temperatur im Organbad betrug deshalb 32°C, die
extrazelluläre Calciumkonzentration je nach Versuchsprotokoll 1,25 oder 2,5mM.
Die ventrikulären Myozyten verkürzten sich im Mittel um 3,46%, die Kardiomyozyten
aus Vorhofgewebe um 4,62%. Das entspricht den Werten, die Davies et al. an
Ventrikelmyozyten beobachteten [43]. Sie notierten auch die TTP als Maß für das
Kontraktionsverhalten der Kardiomyozyten (0,2 Hz, 32°C, Ca2+ 2mM, NYHA III-IV).
Hier kann man verschiedene Ergebnisse notieren. Während die Myozyten unserer
Arbeitsgruppe eine TTP von 599 ± 79 ms benötigten, kontrahierten Davies Zellen in
300 ms. Die Diskrepanz dieser Ergebnisse läßt sich schwer erklären; das
untersuchte Myokard beider Arbeitsgruppen war ähnlich insuffizient.
Diskussion
83
IV.2 Überprüfung der isolierten Kardiomyozyten auf
kontraktile
Reserven und intakte Rezeptoren
Konzentrations-Wirkungsanalysen mit Calciumionen und Isoproterenol zeigten, daß
die Myozyten nach dem Isolationsvorgang intakte Membranen und Rezeptoren
haben.
IV.2.1 Calcium-Wirkungsanalyse
Bei
ansteigenden
extrazellulären
Calciumkonzentrationen
nahm
die
Verkürzungsfraktion auf 369% zu. Das entspricht einer größeren Zunahme, als es
bei NYHA IV-Ventrikelproben bei Harding et al. [75] der Fall war, wobei diese
Arbeitsgruppe keine genauen Angaben zur Calciumkonzentration macht, sondern
lediglich von einem maximalen Effekt unter Calcium spricht. Die anderen
Kontraktilitätsparameter bleiben bei Harding et al. unerwähnt, während unsere
Arbeitsgruppe signifikante Veränderungen nahezu aller Parameter beobachten
konnte.
Erwartungsgemäß
Verkürzungsfraktion
zu,
nimmt
das
Verkürzungs-Zeit-Integral
ebenfalls
die
analog
Kontraktions-
zur
und
Relaxationsgeschwindigkeiten. Die maximale Kontraktionsamplitude wird signifikant
später erreicht. Calciumpumpen und Calcium-ATPasen benötigen diese Zeit, um das
erhöhte Calciumangebot zu verarbeiten. Die gesamte Kontraktionszyklusdauer
nimmt zu. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Myozyten nach dem Isolationsvorgang
gute kontraktile Reserven besitzen, intakte Membranen haben und auch die
intrazellulären
Calciumspeicher und
Funktionsproteine
unbeschädigt
blieben.
Vergleicht man Ergebnisse von Muskelstreifenpräparaten mit denen an isolierten
Myozyten, nimmt die isometrische Kraft am Streifenpräparat bei einer Änderung der
extrazellulären Calciumkonzentration von 1,25 mM auf 4,0 mM Ca2+ um 117% zu,
die Verkürzungsfraktion der Kardiomyozyten um 100%. Auch die weiteren
Kontraktilitätsparameter verändern sich ähnlich. Es ist fraglich, inwieweit man diese
verschiedenen Methoden - isometrische Kraftentwicklung eines Muskelstreifenpräparates und widerstandsfreie Kontraktionen isolierter Kardiomyozyten - miteinander
vergleichen darf, doch an isolierten humanen Kardiomyozyten wurden die Wirkungen
von Isoproterenol und Calciumionen bisher nicht systematisch in Form von DosisWirkungsanalysen untersucht.
Diskussion
84
IV.2.2 Isoproterenol-Wirkungsanalyse
Isoproterenol
wurde
als
spezifischer
β-Rezeptor-Agonist
an
isolierten
Kardiomyozyten untersucht, um festzustellen, ob nach dem enzymatischen
Isolationsvorgang die Rezeptoren und nachgeschalteten second messengerSysteme intakt sind. Bei Isopro-terenol handelt es sich um einen reinen βAdrenozeptor-Agonisten mit gleich starker β1- und β2-Wirkung, der chemisch dem
Adrenalin verwandt ist. Die Bindung von Isoproterenol am Rezeptor an der
Außenseite der Zellmembran führt über die Spaltung von GTP zu einer
Konformationsänderung des stimulierenden Guanylnukleotid bindenden Proteins
(Gs-Protein).
Die
α-Einheit
des
Gs-Proteins
steigert
die
Leitfähigkeit
der
2+
sarkolemmalen Ca -Kanäle. Zugleich wird über eine Aktivitätssteigerung der
Adenylatcyclase, durch das G-Protein vermittelt, ATP-abhängig cyclisches 3´,5´Adenosinmonophosphat (cAMP) gebildet, das über Aktivierung von Proteinkinasen
zur Phosphorylierung intrazellulärer Proteine führt (u.a. Calciumkanäle, Ca-ATPase,
Troponin I). Die Phosphorylierung von Membranproteinen des Calciumkanals hat zur
Folge, daß die Kanal-Öffnungswahrscheinlichkeit steigt und entsprechend mehr
Calcium ins Zellinnere gelangt. Dieses ist der Grund für die positiv-inotrope,
chronotrope und dromotrope Wirkung von β-Adrenozeptor-Agonisten. Auch das
Troponin I wird phosphoryliert, dadurch die Affinität von Troponin C für Calcium
gesenkt.
Kombiniert
Sarkoplasmatische
mit
der
Retikulum
gesteigerten
wird
so
die
Ca2+-Wiederaufnahme
in
das
Relaxationsgeschwindigkeit
des
Kardiomyozyten gesteigert (positiv lusitroper Effekt) [24].
Die Ergebnisse unserer Dosiswirkungsanalyse für die Isoproterenol-Wirkung an
isolierten Herzmuskelzellen bestätigen diese Theorie. Die Verkürzungsfraktion nahm
auf 239% zu, die Zellen verkürzten sich unter 10-7 M Isoproterenol um 7,9%. Auch
Harding et al. untersuchten die Isoproterenolwirkung an isolierten menschlichen
Kardiomyozyten,
allerdings
unsystematisch;
sie
erstellten
keine
Dosis-
Wirkungskurve. Unter „maximalem Isoproterenol“ verkürzten ihre Myozyten um
10,4% [76]. Auch andere Kontraktilitätsparameter änderten sich, teils statistisch
signifikant,
teils
nicht,
was
auf
eine
mangelnde
Anzahl
von
Versuchen
zurückzuführen ist. Sieht man sich allerdings die Werte an, erkennt man die
Isoproterenol-typischen Veränderungen. So nimmt das Verkürzungs-Zeit-Integral
analog zur Verkürzungsfraktion zu, ebenfalls nehmen die Kontraktions- und
Relaxationsgeschwindigkeiten zu. Entsprechend ist eine Abnahme der T10% to P,
Diskussion
85
TTP und RT50% zu verzeichnen. In dieselbe Richtung weisen, mit den oben
genannten Einschränkungen, Hardings Ergebnisse.
Die Wirkung, die Isoproterenol auf die isolierten Kardiomyozyten hat, zeigt, daß die
Rezeptoren und die nachgeschalteten second messenger-Systeme nach dem
Isolationsvorgang intakt sind.
Um den Unterschied zwischen einer Calcium- und einer cAMP-abhängigen
Veränderung der Kontraktilität zu verdeutlichen, sind im folgenden Schaubild zwei
Originalregistrierungen gezeigt. Eine zeigt die Wirkung von 15 mM Calciumionen auf
die Funktion eines Kardiomyozyten, die andere die von 10-7 M Isoproterenol.
Abbildung 20: Originalregistrierung aus Dosis-Wirkungsanalysen für Calciumionen und Isoproterenol
an linksventrikulären Kardiomyozyten.
Diskussion
86
IV.3 Einfluß von Angiotensin II auf die Kontraktilität humaner
Kardiomyozyten
In
einigen
Studien
wurde
der
Einfluß
von
Angiotensin
II
auf
humane
Herzmuskelstreifenpräparate untersucht, u.a. von Moravec et al. [138] und
Holubarsch et al. [84]. Holubarsch et al. konnten einen positiv-inotropen Effekt von
Angiotensin I und II auf Vorhoftrabekel nachweisen, allerdings keinen Einfluß auf
Ventrikelmyokard. Moravec et al. fanden dagegen unter unphysiologischen
Versuchsbedingungen in einigen Ventrikelpräparaten einen positiv-inotropen Effekt.
Um höhere Peptidkonzentrationen an den Angiotensinrezeptoren zu erreichen und
um den Einfluß von Endothel und Bindegewebe auszuschließen, untersuchten wir
die Angiotensinwirkung an isolierten humanen Kardiomyozyten. Eine Studie zur
Angiotensinwirkung
gibt
es
für
isolierte
atriale
und
ventrikuläre
humane
Kardiomyozyten. Lefroy et al. [111] konnten weder an ventrikulären, noch an atrialen
Myozyten einen Einfluß von Angiotensin II auf die Kontraktilität feststellen, während
Calciumionen und Isoproterenol einen deutlichen positiv-inotropen Effekt hatten. In
Hinblick auf die Angiotensinwirkung widersprechen sich die Ergebnisse.
IV.3.1 Angiotensinwirkung an humanen atrialen Kardiomyozyten
Wir konnten einen signifikanten positiv-inotropen Effekt von Angiotensin an humanen
-5
isolierten atrialen Kardiomyozyten nachweisen. Unter 10 M Angiotensin II nahm die
relative Verkürzung auf 188% zu, signifikant ab 10
-7
M. Entsprechend nahm auch
signifikant das Verkürzungs-Zeit-Integral, die TTP und die RT50% zu. T10% to P ,
Kontraktions- und Relaxationsgeschwindigkeiten nahmen leicht zu.
Vergleicht man diese Ergebnisse mit denen, die Holubarsch et al. [84] an
Streifenpräparaten
erhielten,
stellt
man
Übereinstimmungen
fest.
Die
Kraftentwicklung der Trabekel nahm, so wie bei uns die Verkürzungsfraktion und das
Verkürzungs-Zeit-Integral,
signifikant
um
40%
zu,
die
Kontraktions-
und
Relaxationsgeschwindigkeiten und die RT50% nahmen zu, aber nicht signifikant.
Holubarsch et al. wiesen mit der Äquorinmethode nach, daß die positiv-inotrope
Wirkung
von
Angiotensin
II
auf
die
Zunahme
des
Calciumstransienten
zurückzuführen ist.
Daß die positive Inotropie an isolierten Kardiomyozyten wesentlich stärker
ausgeprägt ist als an einem Muskelstreifenpräparat, zeigt, daß die Einzelzellmethode
Diskussion
87
quantitativ sensitiver ist und auch kleine Veränderungen in der Kontraktilität gut
feststellen kann.
Die beobachteten Effekte an den isolierten Kardiomyozyten ließen sich komplett
durch
Präinkubation
mit
dem
spezifischen
AT1-Rezeptorenblocker
Losartan
hemmen. Das bedeutet, daß die Angiotensinwirkung auf die Kontraktilität der
Myozyten an den AT1-Rezeptor gekoppelt ist.
IV.3.2 Angiotensinwirkung an humanen Ventrikelkardiomyozyten
An isolierten Kardiomyozyten aus herzinsuffizienten linken Ventrikeln ließ sich kein
-6
positiv-inotroper Effekt von Angiotensin II in einer Dosis von 10 M feststellen. Das
entspricht den Ergebnissen von Holubarsch et al. [84] und Lefroy et al. [111].
Warum wirkt Angiotensin II nicht positiv-inotrop wie am Vorhofmyokard?
Die Ergebnisse am Vorhof zeigen, daß die Einzelzell-Methode sehr sensitiv ist und
auch geringe positive Wirkungen dedektieren kann.
Eine weitere Möglichkeit für das Fehlen der positiv-inotropen Wirkung für
Angiotensin II sind die unphysiologischen Bedingungen, denen die Zellen ausgesetzt
sind (32°C, Stimulation bei 0,2 Hz). Doch die atrialen Myozyten zeigten unter
denselben Bedingungen sehr wohl einen eindeutigen Effekt auf Angiotensin II.
Nach dem Isolationsvorgang besitzen die Ventrikelmyozyten sowohl kontraktile
Reserven, als auch intakte Rezeptoren. Das zeigen die Ergebnisse aus der
Calciumionen- und Isoproterenol-Dosis-Wirkungsanalyse. Auch die AngiotensinRezeptoren und nachgeschalteten second messenger-Systeme bleiben intakt, am
Vorhof wirkt dieses Peptid positiv-inotrop.
Diskussion
88
Im folgendem Schaubild sind die Wirkungen von Angiotensin II und Isoproterenol auf
isolierte ventrikuläre Kardiomyozyten dargestellt.
Abbildung 21: Mittelwerte ± Standardabweichung der relativen Verkürzung linksventrikulärer
Kardiomyozyten zu Beginn eines Versuches, unter Angiotensin- und Isoproterenoleinwirkung. * =
signifikant verschieden vom Basalwert.
Daß Angiotensin II-Rezeptoren am insuffizinten humanen
Ventrikelmyokard
vorhanden sind, wurde vielfach publiziert [130, 87, 111]. Asano et al. und RegitzZagrosek et al. [9, 173] berichteten über eine insgesamte Abnahme der ATRezeptoren und eine Überzahl von AT2-Rezeptoren in dilatierten und ischämischen
Ventrikeln;
die
mRNA
wiesen
sie
in
verringerter
Konzentration
in
den
Kardiomyozyten nach. Insofern hat Angiotensin II an isolierten ventrikulären
Kardiomyozyten die Möglichkeit, an Rezeptoren zu binden.
Diskussion
89
Möglicherweise ist die Wirkung von Angiotensin II an das Vorhandensein von
Endothel gebunden. Dagegen spricht, daß an intakten Muskelstreifenpräparaten mit
Endothel auch keine Wirkung auf die Inotropie stattfindet.
Es könnte sein, daß nicht alle Myozyten gleich auf Angiotensin II reagieren, daß es
sogenannte Responder und Non-Responder gibt. Darüber berichteten Moravec et al.
bei den Untersuchungen an Streifenpräparaten [138]. Diese Theorie ist insofern
unwahrscheinlich, als daß Holubarsch et al. an 42 Ventrikelstreifenpräparaten und
wir an neun linksventrikulären Myozyten nicht einen einzigen „Responder“ fanden.
Am ehesten ist die fehlende inotrope Wirkung von Angiotensin II auf eine
Entkopplung der Rezeptoren von nachgeschalteten second messenger-Systemen,
die eine positiv-inotrope Wirkung vermitteln können, zurückzuführen. Es ist denkbar,
daß Angiotensin II an den Rezeptor bindet, daß auch die PLC aktiviert wird und IP3
entsteht, dieses aber keine Bindungsstelle am Sarkoplasmatischen Retikulum hat
und somit nicht zu einer intrazellulären Calciumfreisetzung führt.
Weitere Untersuchungen zur Klärung der Signaltransduktion sind notwendig, um
diesen Sachverhalt zu verstehen, daß Angiotensin II zwar am Vorhofmyozyt einen
positiv-inotropen Effekt ausübt, nicht aber am linksventrikulären Kardiomyozyt,
obwohl Rezeptoren vorhanden sind.
Diskussion
IV.4 Einfluß
90
von
Endothelin-1
auf
die
Kontraktilität
humaner
Kardiomyozyten
Studien zur Endothelin-1-Wirkung an humanen isolierten Kardiomyozyten gibt es zur
Zeit nicht. Vorhanden sind die Ergebnisse einiger Studien an menschlichen Herzmuskelstreifenpräparaten. Meyer et al. [132] konnten einen Kraftzuwachs von 32%
an rechtsatrialen Streifenpräparaten nachweisen, Pieske et al. wiesen an terminal
insuffizienten linksventrikulären Myokardstreifen eine Kraftzunahme von 36% nach
[159]. Meyer und Pieske führten ihre Versuche unter physiologischen Bedingungen
durch, wahrscheinlich deshalb die geringeren Effekte im Vergleich zu Moravec [137].
IV.4.1 Endothelinwirkung an humanen rechtsatrialen Kardiomyozyten
Wir konnten einen signifikant positiv-inotropen Effekt von Endothelin-1 an atrialen
isolierten humanen Kardiomyozyten nachweisen. Unter 10-8M Endothelin-1 nahm die
relative Verkürzung auf 244% zu; das ist ein wesentlich stärkerer Effekt als der von
Angiotensin II (188%). Das Verkürzungs-Zeit-Integral und die Kontraktions- und
Relaxationsgeschwindigkeiten nahmen signifikant zu, unverändert dagegen blieben
die TTP, T10% to P und RT50%. Das bedeutet, daß die Kontraktionsdauer unverändert
blieb. Vergleicht man diese Ergebnisse mit denen, die von Meyer et al. [132] an
Streifenpräparaten gefunden wurden, zeigen sich Unterschiede. Am Streifen nahm
die Kraft, verglichen mit unserer Verkürzungsfraktion, nur um 32% zu. Zudem
änderten sich die Kontraktions- und Relaxationsgeschwindigkeiten nicht, die RT50%
nahm signifikant zu. Sie konnten nachweisen, daß der positiv-inotrope Effekt mit
einem erhöhten Calciumgehalt im Streifenpräparat korrelierte und daß sowohl die
PKC und der Na+/H+-Austauscher am Endothelin-Effekt beteiligt sind. Moravec et al.
[137 ] zeigten 1989 einen positiv-inotropen Effekt von Endothelin-1 an Vorhofpräparaten, die Kraft nahm um 75% zu.
Während sich sämtliche Effekte an den isolierten Vorhofmyozyten vollständig durch
Präinkubation mit dem spezifischen ETA-Rezeptorenblocker BQ 123 verhindern
ließen, blieben bei Meyer et al. trotz ETA-Rezeptorenblockade die RT50% verlängert,
ebenso unter Blockade der PKC oder des Na+/H+-Austauschers. Sie vermuten für
diese Veränderungen einen anderen intrazellulären Mechanismus.
Die Ergebnisse an isolierten humanen atrialen Kardiomyozyten lassen vermuten,
daß der positiv-inotrope Effekt nicht ausschließlich auf eine erhöhte intrazelluläre
Diskussion
91
Calciumfreisetzung zurückzuführen ist, da die Kontraktionsdauer unverändert bleibt.
Anzunehmen ist ein Zusammenspiel mehrerer Mechanismen, die netto zu einer
unveränderten Kontraktionsdauer führen. So ist es möglich, daß der Calcium-sensitivierende Effekt durch die intrazelluläre Alkalinisierung über die Aktivierung des
Na+/H+-Austauschers eine Verlängerung der Kontraktionsdauer bewirkt, aber durch
die Phosphorylierung weiterer Funktionsproteine second messenger aktiviert
werden, die eine Verkürzung der Kontraktionsdauer zur Folge haben. Um diesen
Sachverhalt
zu
klären,
sind
weitere
Untersuchungen
zur
intrazellulären
Signaltransduktion nötig. So könnte mittels eines Calciumindikators geprüft werden,
ob an dem isolierten Kardiomyozyt ähnliche Verhältnisse des intrazellulären
Calciumstoffwechsels vorliegen wie am Syncytium.
IV.4.2 Endothelin-1-Wirkung an humanen linksventrikulären Kardiomyozyten
An isolierten linksventrikulären Kardiomyocten ließ sich kein positiv-inotroper Effekt
von Endothelin-1 feststellen. Da Herzmuskelstreifenpräparate unter 2,5 mM und
Einzelzellpräparate in der Regel unter 1,25 mM extrazellulärem Calcium untersucht
wurden, wurde die Endothelin-Wirkung unter zwei verschiedenen Calciumkonzentrationen
gemessen,
um
einen
Einfluß
der
extrazellulären
Calciumkonzentration auszuschließen. Bei 2,5 mM extrazellulärem Calcium nahmen
das Verkürzungs-Zeit-Integral ab, die TTP und T10% to P im Zeitverlauf zu, was dem
„run down“, der Verschlechterung der isolierten Myozyten im Laufe der Zeit,
entspricht. Dieser Effekt tritt merklich bei der höheren Calciumkonzentration ein, weil
die Kardiomyozyten, durch das Calcium positiv-inotrop beeinflußt, eine bessere
Ausgangslage hatten. Eine Einzeldosis Isoproterenol 10-7M führte zu einer
deutlichen Zunahme der Kontraktilität auf 234%.
Zur Endothelin-1-Wirkung an menschlichen ventrikulären Kardiomyozyten liegen
derzeit keine weiteren Studien vor. Somit werden die Ergebnisse mit solchen
verglichen, die aus Untersuchungen an Muskelstreifenpräparaten vorliegen. Unsere
Ergebnisse gleichen nicht denen von Moravec et al. [137] und Pieske et al. [159,
160]. Sie konnten an Streifenpräparaten aus ventrikulärem Myokard positiv-inotrope
Effekte von Endothelin-1 beobachteten (+9% bei Moravec und +36% bei Pieske).
Pieske et al. wiesen mit der Äquorinmethode nach, daß der Effekt Calcium-
Diskussion
92
unabhängig ist; sie gehen davon aus, daß der Effekt am ehesten über eine erhöhte
Calciumsensitivität durch intrazelluläre Alkalinisierung zustande kommt.
Es liegt eine Studie zur Endothelinwirkung an isolierten ventrikulären Myozyten aus
Rattenherzen vor [199]. Während Myozyten aus gesunden Herzen auf Endothelin-1
mit einer Calcium-unabhängigen Zunahme der Verkürzungsfraktion und der
Kontraktions- und Relaxationsgeschwindigkeit reagierten, war das bei Myozyten aus
insuffizienten Rattenherzen nicht der Fall. Die Herzinsuffizienz wurde experimentell
durch Isoproterenolinjektionen induziert. Die Myozyten aus diesen Herzen reagierten
negativ-inotrop auf Endothelin-1, die Verkürzungsfraktion nahm ab, die Kontraktionsund
Relaxationsgeschwindigkeiten
zu.
Zudem
ließ
sich
ein
geringerer
Calciumtransient in den insuffizienten Myozyten im Vergleich zu den gesunden
feststellen. Da sich diese negativen Auswirkungen durch BQ 123 und Staurosporin
(PKC-Inhibitor) verhindern ließen, gehen die Autoren davon aus, daß die Wirkungen
über den ETA-Rezeptor und über eine PKC-abhängige Transduktion vermittelt
werden.
Nun stellt sich die Frage, warum an isolierten humanen ventrikulären Kadiomyozyten
kein Effekt vorhanden ist, wenn er am Streifen zu beobachten ist.
Liegt ein methodischer Fehler vor? Wie die vorherigen Ergebnisse zeigen, scheint
die Einzelzellmethode sensitiver zu sein, als es beispielsweise bei Untersuchungen
an
intakten
Muskelstreifenpräparaten
der
Fall
ist.
Änderungen
der
Kontraktilitätsparameter sind quantitativ wesentlich größer. Es ist möglich, daß die
Muskelstreifenpräparate trotz hoher Sauerstoffsättigung der umgebenden Tyrode im
Inneren hypoxisch und azidotisch sind, weil eine optimale Sauerstoffversorgung im
Faserinneren nicht möglich ist. Da Endothelin unter anderem über eine Alkanisierung
des Zellinnern zu einer Sensitivitätssteigerung der Myofilamente gegenüber Calcium
führt, wird ein positiv-inotroper Effekt unter azidotischen Bedingungen potenziert
[219]. Bei der Einzelzellmethode kann im Gegensatz zur Muskelstreifenmethode
eine Sauerstoffminderversorgung ausgeschlossen werden.
Endothelin-1 ist die vorherrschende Isoform der Endotheline im menschlichen
Herzen [162]. Die Plasmaspiegel von Endothelin-1 bei herzinsuffizienten Patienten
sind erhöht [128, 114]. Das Endothelin-1, das bei dieser Studie zum Einsatz kam, ist
ein aktives Peptid, wie es die Ergebnisse bei den Vorhofuntersuchungen zeigten.
Diskussion
93
Kontraktile Reserven besitzen die Kardiomyozyten nach dem Isolationsvorgang. Das
zeigen die Ergebnisse aus der Calcium-Dosis-Wirkungsanalyse. Auch daß die
Rezeptoren durch die enzymatische Isolierung nicht beschädigt werden, wurde
gezeigt.
Isoproterenol
hat
einen
positiv-inotropen
Effekt
auf
ventrikuläre
Kardiomyozyten, Endothelin-1 wirkt positiv-inotrop auf Myozyten vom rechten
Vorhofmyokard.
Auch sind Rezeptoren im menschlichen Ventrikelmyokard vorhanden [136]. Pieske
et al. [160] zeigten kürzlich, daß in aufgrund einer dilatativen Kardiomyopathie
insuffizienten Herzen die ETA-Rezeptoren-Dichte höher ist als in gesunden Herzen.
Generell kann gesagt werden, daß das Vorhandensein von intakten Rezeptoren
nicht an eine inotrope Wirkung gekoppelt sein muß. Das zeigen die Ergebnisse aus
den Untersuchungen zur Angiotensinwirkung am Ventrikelmyokard. Zudem wurde
gezeigt, daß Endothelin bei verschiedenen Spezies unterschiedliche Wirkungen hat,
beispielsweise positiv-inotrop an Rattenherzen [204] und Kaninchenherzen [61],
negativ an Hundeherzen [228]. Und selbst innerhalb eines Organs sind
unterschiedliche Wirkungen möglich, wie es die Untersuchungen von Angiotensin
am menschlichen Herzen zeigten.
Da in dieser Studie isolierte ventrikuläre Kardiomyozyten untersucht wurden, ist der
Einfluß anderer Zellen ausgeschlossen. Parakrine Wirkungen, wie sie für Endothelin
typisch sind, sind somit nicht mehr möglich. Eventuell sind Endothel, Bindegewebe
und Fibroblasten nötig, damit Endothelin Einfluß auf die Kontraktilität nehmen kann.
Harada et al. [73] zeigten an kultivierten Rattenkardiomyozyten, daß nur in CoKulturen von Kardiomyozyten und kardialen Fibroblasten eine BNP- und ANFPoduktion stattfand und die Kardiomyozyten hypertrophierten.
Die fehlende Wirkung läßt sich durch eine Entkopplung des Rezeptors von einer
positiv-inotropen Wirkung erklären. So könnte beispielsweise die Kopplung der PKC
an den Na+/H+-Austauscher in insuffizienten Kardiomyozyten gestört sein [94].
PKC-abhängig findet auch die Phosphorylierung der inhibitorischen Untereinheit
Troponin I (TnI) und der Tropomyosin-bindenden Untereinheit Troponin T(TnT) statt
[216, 45]. Die Phosphorylierung von TnI vermindert die Calciumsensitivität der
Myofilamente und spielt eine wichtige Rolle in der pH-Regulation. So besteht die
Möglichkeit, daß bei der Herzinsuffizienz die Phosphorylierung des TnI den
alkalinisierenden Effekt durch Endothelin-1 ausgleicht. Insgesamt resultiert dann
Diskussion
94
eine verminderte Calciumsensitivität der Myofilamente in insuffizienten Myozyten und
somit wirkt Endothelin-1 nicht positiv-inotrop [199].
Möglicherweise liegt auch eine verminderte PKC-Aktivität im herzinsuffizienten
Myokard vor. So wurden verminderte Kinase-Aktivitäten in ischämischen und
druckbelasteten Herzen nachgewiesen [168, 107]. Das hätte Auswirkungen auf den
Calciumhaushalt in den Kardiomyozyten. Eine Endothelin-induzierte Aktivierung der
PKC könnte somit zur verminderten Phosphorylierung von Calciumkanälen und
folglich zur verminderten Calciummobilisation und -wiederaufnahme führen. Daraus
resultiert eine geringere Inotropie.
Insgesamt liegen derzeit zu wenige Studien vor, die den Wirkmechanismus von
Endothelin-1 am menschlichen Myokard untersucht haben. Diese sind aber nötig,
um zu verstehen, wie Endothelin-1 am Herzen wirkt und welche Konsequenzen
pharmakologische Eingriffe in dieses System haben.
Diskussion
95
IV.5 Physiologische Bedeutung von Angiotensin II und Endothelin-1
Folgende Abbildung zeigt nochmals die Verhältnisse bezüglich der Inotropie von
Calciumionen,
Isoproterenol,
Angiotensin
II
und
Endothelin-1
auf
isolierte
Kardiomyozyten aus humanem Ventrikel- und Vorhofmyokard.
Abbildung 22: Mittelwerte ± Standardabweichung der relativen Verkürzung isolierter Kardiomyozyten aus humanem Vorhof- und Ventrikelgewebe unter dem Einfluß verschiedener Sub2+
stanzen. Ca = Calciumionen, Iso = Isoproterenol; AT II = Angiotensin II; ET-1 = Endothelin-1;
* = signifikant verschieden vom Basalwert
Diskussion
96
Wir konnten zeigen, daß Angiotensin II und Endothelin-1 am humanen
Vorhofmyokard eine positiv-inotrope Wirkung haben, am Ventrikelmyokard keinen
Einfluß auf die Kontraktilität besitzen, obwohl Rezeptoren vorhanden sind. Somit
haben Angiotensin II und Endothelin-1 keinen direkten Einfluß auf die ventrikuläre
Funktion. Substanzen, die den Aktivierungsgrad des Renin-Angiotensin-Systems
oder des Endothelin-Systems beeinflussen, können keine direkte Wirkung auf die
Ventrikelfunktion haben. Beim Einsatz von Angiotensin-KonversionsenzymHemmstoffen (ACE-Hemmstoffe), Angiotensin-Rezeptoren-Blockern (AT IIRezeptorenblocker) und Endothelin-Rezeptorenblockern (ET-Rezeptorenblocker)
kann es zu keinem negativ-inotropen Effekt kommen, wie es beispielsweise für den
Einsatz von β-Rezeptorenblockern bekannt ist.
Für die Therapie mit ACE-Hemmstoffen liegen Studien vor, die einen lebensverlängernden Effekt zeigen [103, 37]. Diese geringere Mortalität ist aber von den
eingesetzten Konzentrationen abhängig. In der ATLAS-Studie (Assessment of
Treatment with Linsinopril and Survival) wurde gezeigt, daß hohe Dosen von ACEHemmstoffen, die keinen weiteren toxischen Effekt haben, günstigere Effekte auf die
Mortalität haben [156]. In den MEGA-Trails zeigten sich neben den positiven
Effekten wie Vasodilatation, neurohumorale Inhibition, verminderte Hypertrophie,
gesteigerte
linksventriuläre
Ejektionsfraktion
und
verminderte
ventrikuläre
Fibroisierung auch proarrhythmische Effekte [38].
Da ACE-Hemmer am Herzen die Angiotensinwirkung möglicherweise nicht komplett
blockieren können, weil Angiotensin I über Chymasen, die sich nicht durch ACEBlocker hemmen lassen, zu Angiotensin II konvertiert werden kann [213, 214],
wurden AT II-Rezeptorenblocker entwickelt. In der LIFE-Studie (The Losartan
Intervention For Endpoint Reduction) werden erstmals die Wirkungen des AT IIRezeptorenblockers Losartan mit denen von β-Rezeptorenblockern in Hinblick auf
den Krankheitsverlauf und die Mortalität an über 8000 Patienten verglichen [42].
Ergebnisse liegen noch nicht vor.
In weiteren Studien wurden AT II-Rezeptorenblocker mit ACE-Hemmstoffen
verglichen (ELITE-Studie, RESOLVD-Studie). In der RESOLVD-Sudie [208] konnte
gezeigt werden, daß die Kombination von einem ACE-Hemmstoff mit einem AT IIRezeptorenblocker den günstigsten Effekt
hat.
Aldosteron
wird
vermindert
ausgeschüttet, die BNP-Produktion und das ventrikuläre Remodeling werden
Diskussion
97
reduziert. Ein Vergleich zwischen ACE-Hemmstoffen und AT II-Rezeptorenblockern
zeigte keinen Unterschied hinsichtlich der Blutdrucksenkung, der Mortalität und
Morbidität, auch die Aldosteronausschüttung war ähnlich [127]. In der ELITE-Studie
zeigte sich bisher, daß ältere Patienten mit Herzinsuffizienz, die mit Losartan, einem
AT II-Rezeptorenblocker, behandelt wurden, eine geringere Mortalität aufwiesen als
die Patienten, die einen ACE-Hemmstoff erhielten [161]. Brooksby [25] führt dieses
überraschende Ergebnis auf ein vermindertes Risiko für maligne Arrythmien zurück.
Zusammenfassend kann für die Therapie, die in das Renin-Angiotensin-System
eingreift, gesagt werden, daß es keinen Hinweis darauf gibt, daß die Therapie mit
ACE-Hemmstoffen
oder
AT
II-Rezeptorenblockern
negativ-inotrop
auf
die
Ventrikelfunktion wirkt. Die Patienten profitieren von der Therapie. Ob nun dem
Einsatz
von
AT
II-Rezeptorenblockern
oder
ACE-Hemmstoffen
oder
einer
Kombination beider Medikamente der Vorzug zu geben ist, muß in größer
angelegten Studien gezeigt werden.
Medikamente, die das Endothelin-System hemmen, werden derzeit erst entwickelt.
Der erste orale Endothelin-Rezeptorenblocker (ET-Rezeptorenblocker) wurde von
Clozel et al. [33] entwickelt und heißt Ro 46-2005. Eine Studie an einem kleinen
Patientenkollektiv führten Kiowski et al. [102] mit dem nicht-spezifischen ETRezeptorenblocker Bosentan durch. Sie beobachteten unter der Therapie höhere
Endothelin- und unveränderte Big-Endothelin-Plasmaspiegel, korreliert damit eine
Abnahme der pulmonalen Hypertension und der ventrikulären Füllungsdrücke. Der
Herzzeit-Index nahm um 14% zu, die Herzfrequenz blieb unverändert. Aus dieser
Studie geht hervor, daß eine längerfristige Behandlung mit ET-Rezeptorenblockern
sinnvoll sein könnte. Es müssen jedoch Studien durchgeführt werden, die zeigen, ob
es sinnvoll ist, einen unspezifischen ET-Rezeptorenblocker einzusetzen. Es gibt
Hinweise, daß der ETB-Rezeptor eine Clearance-Funktion für Endothelin besitzt [39].
Eine Studie an Ratten zeigte, daß die selektive Blockade von ETA-Rezeptoren nicht
nur
den
Blutdruck
und
die
Herzfrequenz
senkte,
sondern
auch
die
Gewebeumbauprozesse im Herzmuskel beeinflußte. So wurde zwar nicht die
Hypertrophie verhindert, doch nahm der Anteil an Collagen ab [143]. Am Menschen
hat sich gezeigt, daß eine Endothelin-Rezeptorblockade nur bei den Patienten einen
moderaten Einfluß auf den Bluthochdruck hat, bei denen keine vaskuläre
Überexpression von Endothelin vorhanden war. So wird es in den nächsten Jahren
von Interesse sein, dieses Patientenkollektiv zu identifizieren [141].
Diskussion
98
Insgesamt sind die Erfahrungen mit ET-Rezeptorenblockern noch sehr gering. Es
müssen weitere Studien durchgeführt werden, um herauszufinden, ob es den
Patienten Vorteile bringt, mit Hemmstoffen des Endothelin-Systems behandelt zu
werden. Zur Zeit kann noch nicht gesagt werden, ob eine Behandlung mit ETRezeptorenblockern einen negativen Einfluß auf die Ventrikelfunktion ausübt oder
nicht.
Sowohl AT- und ET-1-Rezeptorenblocker, als auch in einem geringen Maße die
ACE-Hemmstoffe
wirken
negativ
inotrop
auf
das
Vorhofmyokard.
Beim
herzinsuffizienten Patienten ist das sogar von Vorteil. Die ventrikuläre Füllung
geschieht im Rahmen der vaskulär erhöhten Vorlast im wesentlichen passiv.
Zusätzlich zur vaskulär bedingten hämodynamischen Belastung könnte eine durch
Vorhofaktionen
bedingte
vermehrte
Ventrikelfüllung
zur
Erhöhung
des
linksventrikulären enddiastolischen Volumen führen. Das hätte eine weitere
Verschlechterung der Ventrikelgeometrie zur Folge und könnte zur Progredienz der
Erkrankung beitragen. Eine so erhöhte Vorlast führt dann zu einem gesteigerten
enddiastolischen linksventrikulären Druck; das vermindert die Ventrikelfunktion
weiter. Insofern ist es kein Nachteil, wenn die positiv-inotrope Wirkung von
Angiotensin II und Endothelin-1 auf das Vorhofmyokard medikamentös unterdrückt
wird.
Abbildung 23: Einfluß von Angiotensin II und Endothelin-1 auf das LVEDV und den LVEDP.
Während Katecholamine über ihre positiv-inotrope und -chronotrope Wirkung der
akuten Anpassung der Kreislauffunktion an veränderte Bedingungen dienen, sind
das Renin-Angiotensin- und das Endothelin-System für die mittel- bis langfristige
Diskussion
99
Adaptation zuständig. Diese beiden Systeme führen zur Vasokonstriktion und
kardialen Hypertrophie. In diesem Zusammenhang ist eine positive Inotropie
teleoskopisch
nicht
sinnvoll.
Eine
isolierte
positiv-inotrope
Wirkung
am
Vorhofmyokard akzentuiert die Vorlaststeigerung mittels Vasokonstriktion durch die
endogenen Peptide Angiotensin II und Endothelin-1.
Eine therapeutische Blockade von Angiotensin- und Endothelin-Rezeptoren ist somit
auch bei Patienten mit terminaler Herzinsuffizienz sicher. Die durch Vasodilatation
und
direkte
Rezeptorenblockade
reduzierte
Myokardhypertrophie
und
Phänotypänderung wird möglicherweise durch einen isolierten negativ-inotropen
Effekt am Vorhofmyokard von den Peptiden noch unterstützt. Die Progredienz der
Herzinsuffizienz könnte durch eine Therapie mit Hemmstoffen des ReninAngiotensin-Systems und des Endothelin-Systems aufgehalten werden.
100
V Zusammenfassung
Die günstigen Ergebnisse in der Langzeitbehandlung der Herzinsuffizienz mit
Hemmstoffen des Angiotensin-Konversionsenzyms und die positiven Erfahrungen,
die bisher mit spezifischen Angiotensin II-Rezeptorenblockern gemacht wurden,
lassen sich wahrscheinlich durch ein organspezifisches Renin-Angiotensin-System
erklären. Neue Therapieversuche mit Endothelin-Rezeptorenblockern sollen
nachteilige Effekte dieses Peptids auf das insuffiziente Herz verringern. Die Wirkung
von Angiotensin II und Endothelin auf das menschliche Herz ist noch weitgehend
ungeklärt. Die vorliegende Arbeit untersucht daher den Einfluß der endogenen
Peptide Angiotensin II und Endothelin-1 auf die Kontraktilität isolierter humaner
Kardiomyozyten aus Vorhof- und Ventrikelgewebe.
Aus humanem Vorhof- und insuffizientem Ventrikelmyokard wurden Kardiomyozyten
enzymatisch isoliert. Bei einer Temperatur von 32°C und unter einer elektrischen,
biphasischen Feldstimulation kontrahierten die isolierten Myozyten konstant.
An zehn Vorhofkardiomyozyten zeigte sich konzentrationsabhängig eine
Kontraktionszunahme unter Angiotensin II, der sich durch den AT1Rezeptorenblocker Losartan vollständig blockieren ließ. Auch Endothelin-1 bewirkte
an zwölf Myozyten aus dem Auriculum cordis dexter konzentrationsabhängig eine
positive Inotropie, die sich durch den spezifischen ETA-Rezeptorenblocker BQ 123
verhindern ließ. Der positiv-inotrope Effekt am Vorhof hat eine vermehrte
linksventrikuläre enddiastolische Füllung zur Folge, die beim herzinsuffizienten
Patienten die ventrikuläre Funktion verschlechtert.
Dagegen konnte an keiner der 19 Myozyten aus insuffizientem Ventrikelmyokard mit
Angiotensin II oder Endothelin-1 ein positiv-inotroper Effekt ausgelöst werden. Eine
Verletzung der Zellmembranen oder der Rezeptoren durch den Isolationsvorgang
scheiden als Begründung für den fehlenden Effekt aus, da eine Zunahme der
Kontraktilität unter erhöhten extrazellulären Calciumkonzentrationen und
Isoproterenol beobachtet wurde.
Hemmstoffe des Renin-Angiotensin- und des Endothelin-Systems sind als sicher in
ihrer klinischen Anwendung anzusehen, da sie die Kontraktilität des menschlichen
Herzens nicht negativ beeinflussen. Die durch Vasodilatation und direkte
Rezeptorenblockade reduzierte Myokardhypertrophie und Phänotypänderung wird
möglicherweise durch einen isolierten negativ-inotropen Effekt am Vorhofmyokard
noch unterstützt. Die Hemmung beider neurohumoraler Systeme könnte ein
Therapieansatz sein, der die Progredienz der Herzinsuffizienz aufhält und von dem
die Patienten profitieren.
101
VI Abbildungsverzeichnis
ABBILDUNG 1: CIRCULUS VITIOSUS: SYNOPSIS DER PATHOGENESE UND THERAPIE DER CHRONISCHEN
HERZINSUFFIZIENZ. ........................................................................................................................ 16
ABBILDUNG 2: INTRAZELLULÄRE TRANSDUKTION VON ANGIOTENSIN II ...................................................... 21
ABBILDUNG 3: INTRAZELLULÄRE TRANSDUKTION VON ENDOTHELIN-1 ....................................................... 28
ABBILDUNG 4: MESSANLAGE ................................................................................................................... 43
ABBILDUNG 5: KÜVETTENSYSTEM ............................................................................................................ 44
ABBILDUNG 6: ZELLEINSTELLUNG ............................................................................................................ 45
ABBILDUNG 7: ZELLENDENDETEKTION ..................................................................................................... 46
ABBILDUNG 8: ORIGINALREGISTRIERUNG AUS EINER CALCIUMIONEN-DOSIS-W IRKUNGSANALYSE. ............ 55
ABBILDUNG 9: CALCIUM - DOSIS - W IRKUNGSANALYSE ............................................................................ 56
ABBILDUNG 10: ORIGINALREGISTRIERUNG AUS EINER ISOPROTERENOL-DOSIS-W IRKUNGSANALYSE. ........ 59
ABBILDUNG 11: ISOPROTERENOL- DOSIS - W IRKUNGSANALYSE ............................................................... 60
ABBILDUNG 12: ORGINALREGISTRIERUNG AUS EINER ANGIOTENSIN-DOSIS-W IRKUNGSANALYSE AN
RECHTSATRIALEN KARDIOMYOZYTEN............................................................................................... 63
ABBILDUNG 13: ANGIOTENSIN II- DOSIS - W IRKUNGSANALYSE AN RECHTSATRIALEN KARDIOMYOZYTEN.... 64
ABBILDUNG 14: ANGIOTENSIN II - DOSIS - W IRKUNGSANALYSEN UNTER REZEPTORBLOCKADE ................. 67
ABBILDUNG15: ANGIOTENSIN II - W IRKUNGSANALYSE AN LINKSVENTRIKULÄREN KARDIOMYOZYTEN ......... 69
ABBILDUNG 16: ORGINALREGISTRIERUNG AUS EINER ENDOTHELIN-1-DOSIS-W IRKUNGSANALYSEN AN
RECHTSATRIALEN KARDIOMYOZYTEN............................................................................................... 72
ABBILDUNG 17: ENDOTHELIN-1-DOSISW IRKUNGSANALYSE AN RECHTSATRIALEN KARDIOMYOZYTEN......... 73
ABBILDUNG 18: ENDOTHELIN-1-DOSISW IRKUNGSANALYSE UNTER REZEPTORBLOCKADE ......................... 76
ABBILDUNG 19: ENDOTHELIN-1 DOSIS-W IRKUNGSANALYSE AN LINKSVENTRIKULÄREN KARDIOMYOZYTEN . 78
ABBILDUNG 20: ORIGINALREGISTRIERUNG AUS DOSIS-W IRKUNGSANALYSEN FÜR CALCIUMIONEN UND
ISOPROTERENOL AN LINKSVENTRIKULÄREN KARDIOMYOZYTEN......................................................... 85
ABBILDUNG 21: RELATIVE VERKÜRZUNG LINKSVENTRIKULÄRER KARDIOMYOZYTEN UNTER ANGIOTENSINUND ISOPROTERENOLEINWIRKUNG. ................................................................................................. 88
ABBILDUNG 22: SYNOPSIS DER RELATIVEN VERKÜRZUNG ISOLIERTER KARDIOMYOZYTEN AUS HUMANEM
VORHOF- UND VENTRIKELGEWEBE UNTER DEM EINFLUSS VERSCHIEDENER SUBSTANZEN ................ 95
ABBILDUNG 23: EINFLUSS VON ANGIOTENSIN II UND ENDOTHELIN-1 AUF DAS LVEDV UND DEN LVEDP. . 98
102
VII Tabellenverzeichnis
TABELLE 1: KLINISCHE DATEN DER PATIENTEN - CALCIUMIONEN-DOSIS-WIRKUNGSANALYSE.........................54
TABELLE 2: KONTRAKTILITÄTSPARAMETER BEI EINER CALCIUMIONEN-DOSIS-WIRKUNGSANALYSE .................57
TABELLE 3: KLINISCHE DATEN DER PATIENTEN - ISOPROTERENOL-DOSIS-WIRKUNGSANALYSE........................58
TABELLE 4: KONTRAKTILITÄTSPARAMETER BEI EINER ISOPROTERENOL-DOSIS-WIRKUNGSANALYSE ................61
TABELLE 5: KLINISCHE DATEN DER PATIENTEN - ANGIOTENSIN- DOSIS-WIRKUNGSANALYSE AN
RECHTSATRIALEN KARDIOMYOZYTEN.........................................................................................................62
TABELLE 6: KONTRAKTILITÄTSPARAMETER BEI EINER ANGIOTENSIN- DOSIS-WIRKUNGSANALYSE AN
RECHTSATRIALEN KARDIOMYOZYTEN.........................................................................................................65
TABELLE 7: KLINISCHE DATEN DER PATIENTEN - ANGIOTENSIN- DOSIS-WIRKUNGSANALYSE AN
RECHTSATRIALEN KARDIOMYOZYTEN UNTER REZEPTORBLOCKADE ..........................................................66
TABELLE 8: KLINISCHE DATEN DER PATIENTEN - ANGIOTENSIN- DOSIS-WIRKUNGSANALYSE AN
LINKSVENTRIKULÄREN KARDIOMYOZYTEN ................................................................................................68
TABELLE 9: KONTRAKTILITÄTSPARAMETER BEI EINER ANGIOTENSIN- DOSIS-WIRKUNGSANALYSE AN
LINKSVENTRIKULÄREN KARDIOMYOZYTEN ................................................................................................70
TABELLE 10: KLINISCHE DATEN DER PATIENTEN - ENDOTHELIN-1 -DOSIS-WIRKUNGSANALYSE AN
RECHTSATRIALEN KARDIOMYOZYTEN.........................................................................................................71
TABELLE 11: KONTRAKTILITÄTSPARAMETER BEI EINER ENDOTHELIN-1 -DOSIS-WIRKUNGSANALYSE AN
RECHTSATRIALEN KARDIOMYOZYTEN.........................................................................................................74
TABELLE 12: KLINISCHE DATEN DER PATIENTEN - ENDOTHELIN-1 -DOSIS-WIRKUNGSANALYSE AN
RECHTSATRIALEN KARDIOMYOZYTEN UNTER REZEPTORBLOCKADE ..........................................................75
TABELLE 13: KLINISCHE DATEN DER PATIENTEN - ENDOTHELIN-1 -DOSIS-WIRKUNGSANALYSE AN
LINKSVENTRIKULÄREN KARDIOMYOZYTEN ................................................................................................77
TABELLE 14: KONTRAKTILITÄTSPARAMETER BEI EINER ENDOTHELIN-1 -DOSIS-WIRKUNGSANALYSE AN
LINKSVENTRIKULÄREN KARDIOMYOZYTEN ................................................................................................79
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Literatur
127
Teile der Ergebnisse dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht, weitere Arbeiten
sind in Vorbereitung:
Schmidt-Schweda, S; Kamenzin, S; Wollner, S; Rummer, C; Holubarsch, Ch:
Inotropic effect of Angiotensin II in isolated myocytes from human atrial and
ventricular myocardium. Eur Heart J, No. 19. 1998, S. 269
Schmidt-Schweda, S; Rummer, C; Kamenzin, S; Wollner, S; Holubarsch, Ch:
Endothelin exerts positive effects in isolated human atrial but not in ventricular
cardiomyocytes. American Heart Association, Abstract no. 3990; 71st Scientific
Sessions 1998
128
IX Lebenslauf
Caroline Martina Rummer
geboren am :
01.03.1974 in Bonn
Eltern:
Prof. Dr. iur. Hans Rummer, Beamter i.R.
Jutta Rummer, geb. Gilbert, Hausfrau
Geschwister:
Andreas Rummer
Hans Guido Rummer
Anne Friderike Rummer
Schulbildung:
1980-1984
Friedrich-Ebert Schule in Bad Homburg
1984-1993 Humanistisches Gymnasium
Schule in Bad Homburg, 1993 Abitur
Kaiserin-Friedrich-
seit WS 1993 Studium der Humanmedizin an der AlbertLudwigs-Universität in Freiburg/Breisgau
Famulaturen:
Innere Medizin, Diakonie-Krankenhaus in Freiburg
Pädiatrie, Universitäs-Kinderklinik in Freiburg
Anästhesie, chirurgische Ambulanzpraxis in Freiburg
Thorax- und Kardiovaskularchirurgie, Herz- und Diabeteszentrum NRW in Bad Oeynhausen
Gynäkologie und Geburtshilfe, Kantonsspital Nidwalden in
Stans/CH
Kinderkardiologie, Herz- und Diabeteszentrum NRW in Bad
Oeynhausen
Pädiatrie, St. Hedwigshaus in Freiburg
Doktorarbeit:
seit Oktober 1996 Mitarbeit in der kardiologischen Forschungsgruppe von Prof. Dr. Ch. Holubarsch an der Medizinischen
Klinik III der Albert-Ludwigs- Universität Freiburg/Breisgau
Abteilung Kardiologie und Angiologie (Direktor Prof. Dr. H. Just)
August 1998 Vorstellung eines Teil der Ergebnisse auf dem
th
XX Congress of the European Society of Cardiology in Wien
129
X Danksagungen
Herrn Dr. med. Stephan Schmidt-Schweda danke ich für die Überlassung des
Dissertationsthemas und die wissenschaftliche Betreuung dieser Arbeit. Besonders
half mir seine stete Diskussionsbereitschaft beim Verfassn dieser Arbeit.
“You do one experiment in medicine to convince yourself, then 99 more to convince
others.” — Alphonse Raymond Dochez
Mit diesem Zitat möchte ich Herrn Prof. Dr. med. Christian Holubarsch für die
Aufnahme in seine Arbeitsgruppe danken. Seine erfrischende Motivationsfähigkeit,
Begeisterung und Überzeugung von unseren Ergebnissen ließen die langen Stunden
des nächtlichen Experimentierens schnell vergehen.
Herrn Prof. Dr. D. Kececioglu danke ich für die Übernahme des Zweitgutachtens.
Frau Susanne Kamenzin und Herrn Stefan Wollner danke ich für die gute und
effektive Zusammenarbeit.
Den Mitarbeitern der Chirurgischen Universitätsklinik Freiburg und des Herzzentrums
NRW in Bad Oeynhausen danke ich für die Bereitstellung des Myokards. Ohne ihre
Mithilfe wäre die vorliegenden Arbeit nicht möglich gewesen.
Meinem Freund Erik Parkner danke ich für die Geduld, die moralische Unterstützung
und sein Dasein.
Besonders freut es mich, an dieser Stelle meinen lieben Eltern für das danken zu
können, was ich durch ihre immerwährende Unterstützung erreichen konnte. Ich bin
glücklich, einen solchen Rückhalt zu haben.