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AUS DER UNIVERSITÄTS-FRAUENKLINIK
DER ALBERT-LUDWIGS-UNIVERSITÄT FREIBURG I. BR.
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Identifikation von
Choriongonadotropin-induzierten
Genexpressionsveränderungen
in humanen Granulosazellen
INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung des MEDIZINISCHEN DOKTORGRADES
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg i. Br.
Vorgelegt 2007
Von Philipp Max Ulrich Saur
Geboren in Nürtingen
Dekan: Prof. Dr. Ch. Peters
1. Gutachter: Prof. Dr. G. Gitsch
2. Gutachter: Prof. Dr. U. Wetterauer
Jahr der Promotion : 2007
In Liebe und Dankbarkeit
Meinen Eltern gewidmet
Inhaltsverzeichnis
INHALTSVERZEICHNIS............................................................................................................I
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS .............................................................................................. IV
1. EINLEITUNG .......................................................................................................................... 1
1.1 REGULATION DES OVARIALZYKLUS UND FOLLIKELREIFUNG .............................................. 1
1.1.1. Gonadotropinfreisetzung............................................................................................ 1
1.1.2. Ablauf der Follikelreifung.......................................................................................... 2
1.1.3. Ovulation.................................................................................................................... 4
1.1.4. Corpus Luteum........................................................................................................... 4
1.1.5. Corpus luteum gravidate ............................................................................................ 5
1.1.6. Luteolyse .................................................................................................................... 6
1.1.7. Humanes Choriongonadotropin (hCG) ...................................................................... 7
1.2. MÖGLICHKEITEN ZUR IDENTIFIZIERUNG DIFFERENTIELL EXPRIMIERTER GENE .................. 8
1.2.1. Differential Display.................................................................................................... 8
1.2.2. SAGE ......................................................................................................................... 8
1.2.3. Mikrochips ................................................................................................................. 9
1.2.4. Suppressive Subtractive Hybridization ...................................................................... 9
1.3. ZIELSETZUNG DER ARBEIT ............................................................................................... 10
2. PATIENTINNEN, MATERIAL UND METHODEN ........................................................... 11
2.1. PATIENTINNEN ................................................................................................................. 11
2.2 ZELLKULTUR ..................................................................................................................... 11
2.2.1. Zellgewinnung.......................................................................................................... 11
2.2.2. Induktion .................................................................................................................. 12
2.3. RNA-ISOLIERUNG MIT TRIZOL ......................................................................................... 13
2.4. SUBTRACTIVE HYBRIDISIERUNG ...................................................................................... 14
2.4.1. Poly A+-RNA-Isolierung ......................................................................................... 17
2.4.2. cDNA-Synthese........................................................................................................ 17
2.4.2.1. Erststrang cDNA-Synthese ............................................................................... 17
2.4.2.2 Zweitstrang cDNA-Synthese.............................................................................. 18
2.4.3. Verdauung mit RsaΙ ................................................................................................. 18
2.4.4. Ligation der Adaptoren ............................................................................................ 19
2.4.5. Erste Hybridisierung ................................................................................................ 19
2.4.6. Zweite Hybridisierung.............................................................................................. 20
2.4.7. PCR-Amplifikation .................................................................................................. 20
2.4.7.1. Erste Amplifikation ........................................................................................... 20
2.4.7.2. Zweite Amplifikation ........................................................................................ 21
2.5. KLONIERUNG.................................................................................................................... 21
2.5.1. Gelextraktion............................................................................................................ 21
2.5.2. Ligation und Transformation ................................................................................... 22
2.5.3. Plasmid-Mini Präparation ........................................................................................ 23
2.5.4. Restriktionsverdau mit EcoR1 ................................................................................. 24
2.6. MEMBRANHYBRIDISIERUNG MIT P32-MARKIERTER CDNA-SONDE ................................... 24
2.6.1. Präparation der Membran......................................................................................... 24
2.6.2. cDNA-Sonde mit P³²-Markierung ............................................................................ 25
2.6.3. Hybridisierung.......................................................................................................... 26
2.6.4. Autoradiographie...................................................................................................... 26
2.6.5. Auswertung .............................................................................................................. 26
2.7. IDENTIFIKATIONEN DER FRAGMENTSEQUENZEN .............................................................. 27
2.7.1. Sequenzierung .......................................................................................................... 27
2.7.2. Analyse der Sequenz ................................................................................................ 27
I
Inhaltsverzeichnis
2.8. VERIFIZIERUNG DES HCG-EINFLUSSES AUF DIE EXPRESSION ........................................... 27
2.8.1. Reverse Transkription .............................................................................................. 27
2.8.2. Polymerase Ketten Reaktion (PCR) ......................................................................... 28
2.8.2.1. PCR-Protokoll ................................................................................................... 28
2.8.2.2. Primersequenz und Zykluszahl ......................................................................... 29
2.8.2.3. Darstellung der PCR-Produkte.......................................................................... 29
2.8.3. Auswertung .............................................................................................................. 30
2.9. MATERIAL ........................................................................................................................ 31
2.9.1. Zellkultur.................................................................................................................. 31
2.9.2 RNA-Isolierung......................................................................................................... 31
2.9.4 Klonierung................................................................................................................. 31
2.9.5 α-P32-Membran-Hybridisierung ................................................................................ 32
2.9.6. RT-PCR.................................................................................................................... 32
2.9.7. Chemikalien ............................................................................................................. 32
2.9.8. Verbrauchsmaterialien ............................................................................................. 33
2.9.9. Sonstige Geräte ........................................................................................................ 33
3. ERGEBNISSE........................................................................................................................ 34
3.1 SUBTRAKTIVE HYBRIDISIERUNG ....................................................................................... 34
3.1.1 RNA-Kontrolle.......................................................................................................... 34
3.1.2 Rsa 1-Verdaukontrolle .............................................................................................. 34
3.1.3 Adaptorligationskontrolle.......................................................................................... 35
3.1.4 Analyse der Subtraktionseffizienz ............................................................................ 36
3.1.5 PCR-Amplifikation ................................................................................................... 37
3.2 KLONIERUNG..................................................................................................................... 37
3.3 Α-P32-MEMBRAN-HYBRIDISIERUNGEN UND AUSWERTUNG ............................................... 38
3.3.1 α-P32-Membran-Hybridisierung ................................................................................ 38
3.3.2 Auswertung ............................................................................................................... 39
3.4 SEQUENZANALYSEN .......................................................................................................... 40
3.4.1 hHR23b ..................................................................................................................... 41
3.4.2 ribosomal protein S6 ................................................................................................. 43
3.4.3 gamma-Aktin 1.......................................................................................................... 44
3.4.4 BNP ........................................................................................................................... 45
3.5 RT-PCR............................................................................................................................ 47
3.5.1 Semiquantitative densitometrische Auswertung mittels Normalisierung durch die
GAPDH-Expression ........................................................................................................... 47
3.5.2 Ermittlung der Zykluszahl......................................................................................... 48
3.5.3 Durchführung und Statistische Auswertung ............................................................. 48
3.5.3.1 Überprüfung des Einflusses von hCG auf die hHR23b-mRNA-Expression in
humanen Granulosazellen.............................................................................................. 48
3.5.3.2 Überprüfung des Einflusses von hCG auf die γ-Actin-mRNA-Expression in
humanen Granulosazellen.............................................................................................. 50
3.5.3.3 Überprüfung des Einflusses von hCG auf die rP S6-mRNA-Expression in
humanen Granulosazellen.............................................................................................. 51
3.5.3.4 Überprüfung des Einflusses von hCG auf die BNP-mRNA-Expression in
humanen Granulosazellen.............................................................................................. 52
3.6 ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE ............................................................................. 54
4. DISKUSSION ........................................................................................................................ 55
4.1. METHODIK ....................................................................................................................... 55
4.1.1. Differential Display.................................................................................................. 55
II
Inhaltsverzeichnis
4.1.2. SAGE ....................................................................................................................... 57
4.1.3. Mikrochips ............................................................................................................... 58
4.1.4. Suppressive Subtractive Hybridization (SSH) ......................................................... 58
4.1.5 Zusammenfassung der Überlegungen zur Wahl der Methodik................................. 60
4.2. DISKUSSION DER ERGEBNISSE .......................................................................................... 61
4.3. DISKUSSION DER GEFUNDENEN GENE .............................................................................. 62
4.3.1. hHR23B................................................................................................................... 62
4.3.1.1. Lokalisation und Funktion des hHR23B........................................................... 64
4.3.1.2. Beeinflußung der hHR23B-mRNA-Expression................................................ 64
4.3.2. γ-Aktin...................................................................................................................... 66
4.3.2.1. Aufbau des γ-Aktins.......................................................................................... 66
4.3.2.2. Aktinbindende Proteine und ihre Funktion ....................................................... 68
4.3.2.3. Beeinflussung der γ-Aktin-mRNA-Expression................................................. 68
4.3.3. Das humane ribosomale Protein S6 ......................................................................... 70
4.3.3.1. Kontrolle des ribosomalen Protein S6............................................................... 72
4.3.3.2. Beeinflussung der rP S6- mRNA-Expression ................................................... 74
4.3.4. BNP ......................................................................................................................... 75
4.3.4.1. Auslöser für Synthese und Sekretion von ANP und BNP ................................ 76
4.3.4.2 Beeinflussung der BNP-mRNA-Expression ...................................................... 77
5. ZUSAMMENFASSUNG....................................................................................................... 80
6. ABBILDUNGSVERZEICHNIS ............................................................................................ 81
7. LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................................... 83
8. DANKSAGUNG.................................................................................................................. 103
9. LEBENSLAUF .................................................................................................................... 104
III
Abkürzungsverzeichnis
AIDA
Advanced Imaging Data Analyzing
ANP
atrial natriuretic peptide
BLAST
Basic Local Alignment Search Tool
BNP
brain natriuretic peptide
cDNA
komplemetäre („complementary“) DNA
CNP
c-type natriuretic peptide
dATP
Desoxy-Adenosin-5´-Triphosphat
DCM
dilatative Kardiomyopathie
dCTP
Desoxy-Cystidin-5´-Triphosphat
dGTP
Desoxy-Guanosin-5´-Triphosphat
DNA
Desoxyribonukleinsäure
dNTP
Desoxynukleosid-5´Triphosphat
ds-DNA
doppelsträngige Desoxyribonucleinsäure
dTTP
Desoxy-Thymidin-5´-Triphosphat
EDTA
Ethylendiamin-N,N,n´-tetraessigsäure
ETS
externe Transkriptionsspacer
FCS
fötales Kälberserum
FSH
Follikelstimulierendes Hormon
GAPDH
Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase
GnRH
Gonadotropin-releasing Hormon
hCG
humanes Choriongonadotropin
hHR23B
human Homolog B of RAD23
ICSI
intrazytoplasmatische Spermineinjection
IST
interne Transkriptionsspacer
IVF
In vitro Fertilisation
Kbp
Kilobasenpaare
LH
Luteinisierendes Hormon
mRNA
messangerRibonukleinsäure
mRNP
Messenger-Ribonucleotidpartikel
NER
Nukleotidexcisionsreparatur
NP
natriuretisches Peptid
OD
optische Dichte
PBS
Phosphat gepuffertes Kochsalzlösung (phosphat buffered saline)
PKC
Proteinkinase C
IV
Abkürzungsverzeichnis
PCR
Polymerase Ketten Reaktion
RAAS
Renin-Angiotensin-Aldosteron-System
RNA
Ribonukleinsäure
RPA
Replikationsprotein A
rpmRNA
mRNA aus ribosomalen Proteinen
RT
Raumtemperatur
RT-PCR
Reverse Trankriptase Polymerase Ketten Reaktion
SAGE
Serial Analysis of Gene Expression
SDS
Natrium- (“sodium”-) dodecylsulfat
snoRNA
small nucleolar RNA
SSH
Suppresive Substractive Hybridization
TBE
Tris-Borat-EDTA
TFIIH
Transkriptionsfaktor IIH
TOP
5´terminale Oligopyrimidinsequenz
X-Gal
5-Bromo-4-Chlor-Indigo-Galaktosid
XP
Xeroderma pigmentosum
V
1. Einleitung
1. Einleitung
1.1 Regulation des Ovarialzyklus und Follikelreifung
Der Follikel durchläuft, angefangen mit dem Primordialfollikel, die Stadien des Primär-,
Sekundär-, Tertiärfollikels bis hin zum sprungreifen Graaf´schen Follikel. Diese Entwicklung
endet mit der Bildung des Corpus luteums nach der Ovulation. Entscheidend für die
Regulation des Ovarialzyklus und die Follikelreifung sind die Gonadotropine FollikelStimulierendes Hormon (FSH) und Lutenisierendes Hormon (LH). FSH stimuliert in der
Follikelphase
das
Follikelwachstum
und
induziert,
zusammen
mit
LH,
die
Östrogenproduktion. LH induziert die Ovulation und die Bildung des Corpus luteums,
welches in der Lutealphase Progesteron produziert. Progesteron wiederum ist essentiell für
den Erhalt der Schwangerschaft, indem es im Uterus eine Abstoßung des Endometriums
verhindert.
1.1.1. Gonadotropinfreisetzung
Die Gonadotropinfreisetzung erfolgt im Hypophysenvorderlappen unter dem Einfluss des im
Hypothalamus sezernierten Gonadotropin-Releasing Hormon (GnRH). Die Regulation erfolgt
über die rhythmische, pulsatile Freisetzung des GnRH. Die Steuerung dieser Freisetzung wird
durch interne und externe Signale moduliert. So führen in der frühen Follikelphase GnRHAusschüttungen alle neunzig Minuten zur Freisetzung von FSH. Über einen positiven
Feedback-Mechanismus durch Östrogen wird der Rhythmus der GnRH-Ausschüttungen auf
sechzig Minuten erhöht, was einen sprunghaften Anstieg der LH-Freisetzung zur Folge hat
(Goodman et al. 1983). In der Lutealphase erfolgt unter dem Einfluss von Progesteron ein
GnRH-Puls alle drei Stunden und damit eine insgesamt verminderte GnRH-Freisetzung
(Filicori et al. 1986).
1.1.2. Ablauf der Follikelreifung
Zum Zeitpunkt der Geburt finden sich im menschlichen Ovar ca. eine Million Follikel, von
denen bis zum Einsetzen der Pubertät noch ca. 400.000 übrig sind. Es handelt sich hierbei um
Primordialfollikel, die aus einer Eizelle (Oozyte), umgeben von einer Schicht flacher
1
1. Einleitung
Follikelepithelzellen (Granulosazellen) nebst einer Basallamina, bestehen. Die Oozyten selbst
haben einen grossen, exzentrisch gelegenen Kern und einen Durchmesser von 30-50 μm. Pro
Zyklus werden bis zu tausend dieser Follikel, eine Follikelkohorte, zu Primärfollikeln. Sie
besitzen mindestens 15 Granulosazellen (Gougeon, 1998) und weisen eine Basalmembran
zwischen den Schichten der Granulosa- und Thekazellen auf.
Diese Schritte erfolgen
gonadotropinunabhängig. Die Entwicklung des Sekundärfollikels zeichnet sich durch eine
langsame Differenzierung der Granulosazellen zu kubischen Zellen und deren Proliferation
aus. Wenn sich sechs Schichten Granulosazellen um die Oozyte gelegt haben, beginnt die für
den Sekundärfollikel charakteristische Schicht aus zirkulär angeordneten Stromazellen, sich
in eine äußere, bestehend aus differenzierten Thekazellen, und einer inneren, epitheloid
erscheinenden, Schicht zu teilen. Sekundärfollikel sind von Arteriolenanastomosen umgeben
und damit empfänglich für im Blut befindliche Faktoren.
Dies ist wichtig für die Entwicklung des Tertiärfollikels, denn diese ist gonadotropinabhängig.
Das Auftauchen der epitheloiden Zellen in der Theka stellt den Beginn des präantralen
Stadiums dar, welches durch das Verschmelzen der jetzt gebildeten flüssigkeitsenthaltenden
Hohlräume zu einer großen Follikelhöhle („Antrum“), ins antrale Stadium übergeht. Oozyten
und Granulosazellen können über das Antrum als Kontaktmedium Stoffwechsel betreiben
(Chabab et al. 1986).
Die Granulosazellen besitzen nun wesentlich mehr FSH-Rezeptoren, deren Expression durch
FSH erhöht wurde (La Polt et al. 1992; Speroff 1999, Tilly et al. 1992), als in früheren
Entwicklungsstadien. Dies ist in mehreren, nun folgenden Punkten für den weiteren Verlauf
der Follikelreifung von Bedeutung.
2
1. Einleitung
Abbildung 1.1: Schematische Darstellung des hormonellen Regelkreises ( aus Stauber und Weyerstahl, 2005)
Denn unter dem Einfluss von FSH beginnen die Granulosazellen das Enzym Aromatase zu
synthetisieren, welches, die in den Thekazellen unter LH-Einfluss produzierten Androgene, in
Östrogene umwandelt. Der Ablauf dieser getrennten Beeinflussung der beiden Zellschichten
durch jeweils eines der Gonadotropine FSH und LH, ist als „zwei-Zell/zwei-Gonadotropin“Theorie bekannt (Bender et al. 2001; Erickson et al. 1985; Mc Natty et al, 1980; Ryan et al.
1966). Der damit einhergehenden stark steigende Östrogenspiegel führt durch positive
Rückkopplung
auf
Ebene
der
Hypophyse
zum
Erreichen
der
maximalen
ovulationsauslösenden LH-Ausschüttung 24-36 Stunden vor der Ovulation (Goodman und
Hadgen 1983; Yong et al. 1992).
Des Weiteren induziert FSH die Bildung von LH-Rezeptoren, was den Follikel erst in die
Lage versetzt auf den sprunghaften, mitzyklischen LH-Anstieg mit der Ovulation zu
3
1. Einleitung
antworten. FSH führt zur Synthese von Inhibin, welches die hypophysäre FSH-Ausschüttung
vermindert (Vale et al. 1988) und die Aromatase-Aktivität hemmt (Burger 1992).
Diese Mechanismen sind entscheidend bei der Selektion des dominanten Follikels. Denn nur
der Follikel, der in der Lage ist am sensibelsten auf FSH zu reagieren und dem dies auch noch
bei den abfallenden FSH-Spiegeln zum Ende der Follikelphase gelingt, wird bis zum Stadium
des sprungreifen Graaf´schen Follikels geführt.
1.1.3. Ovulation
Die Ovulation schließlich erfolgt 10-12 Stunden nach dem, durch Östrogen induzierten,
sprunghaften LH-Anstieg (Pauerstein et al. 1978); der dominante Follikel schafft somit die
Vorraussetzungen für seine eigene Ovulation. Im Follikel kommt es zu einer erneuten Teilung
der Granulosazellen und einer Zunahme der Flüssigkeit im Antrum, verbunden mit einer
Vergrößerung des Follikels. Die Produktion von Gewebe-Plasminogenaktivators (tPa) in den
Granulosa- und Thekazellen führt zur Bildung von Plasmin, welches die Bindegewebsstruktur
der Follikelwand zerstört (Speroff et al. 1999, Espey, 1974). Die Oozyte wird zusammen mit
den sie umgebenden Granulosazellen, dem Cumulus oophorus, der Tube übergeben.
1.1.4. Corpus Luteum
Nach erfolgter Ovulation entwickelt sich aus den verbliebenen Zellen des Follikels eine
endokrin aktive Drüse auf Zeit, das Corpus luteum (Short 1977; Smith et al., 1994; Keck et al.
1999). Die morphologischen und funktionellen Unterschiede kommen durch die Einwirkung
des LHs zustande, der Luteinisierung der Granulosa- und Thekazellen zu Granulosaluteinbeziehungsweise Thekaluteinzellen. Dabei hypertrophieren die Granulosazellen, dies geht mit
einer bis zu achtfachen Volumenzunahme einher (Murphy, 2000). Die Granulosaluteinzellen,
nicht aber die Thekaluteinzellen, reagieren hochsensibel auf LH, beziehungsweise hCG
(Jablonka-Shariff et al. 1993). Eine Rolle dabei spielt der, zeitgleich mit dem LH-Gipfel
auftretende, FSH-Anstieg, unter dessen Einfluss auf den Granulosaluteinzellen zusätzliche
LH-Rezeptoren exprimiert werden (Karck und Keck 2002).
Das wichtigste morphologische Kennzeichen des Corpus luteums ist die ausgeprägte
Vaskularisierung, die bereits unmittelbar nach dem Ende des LH-Gipfels einsetzt (McClure et
4
1. Einleitung
al. 1994). Diese Vaskulisierung wird über angiogene Faktoren vermittelt, die in den
Granulosaluteinzellen exprimiert werden. Einer dieser Faktoren ist Vascular Endothelial
Growth Factor (VEGF) (Neulen et al. 1995; Yan et al. 1998; Yanet et al. 1995). Die
Expression von VEGF und seines spezifischen Rezeptors ist sowohl auf mRNA- (Yan et al.
1993), als auch auf Proteinebene in der aktiven lutealen Phase des Corpus luteum deutlich
höher, als in der Regression (Sugino et al. 2000). Eine deutliche Steigerung der VEGFExpression kann in präovulatorischen Follikeln und isolierten Granulosazellen durch LH,
bzw. hCG, hervorgerufen werden (Garrido et al. 1993; Koos, 1995, Pietrowski, 2004).
Die vorrangige Aufgabe des Corpus luteums besteht in der Progesteronproduktion. Es
produziert bis zu 25mg Progesteron pro Tag (Bender et al. 2001), bis ab der neunten
Schwangerschaftswoche die Plazenta die Progesteronproduktion übernimmt. Dazu kommt es
zur Ausbildung von LDL-Rezeptoren, sodass alle Granulosaluteinzellen ausreichend Zugang
zur Grundsubstanz der Steroidsynthese, dem LDL-Cholesterin, haben und weiter zur
Induktion wichtiger Schlüsselenzyme der Steroidbiosynthese (Niswender et al. 2000).
1.1.5. Corpus luteum gravidate
Im Falle einer Konzeption muss das Corpus luteum seine progesteronbildende Funktion über
die üblichen zwei Wochen hinaus beibehalten. Diese Entwicklung zum Corpus luteum
gravidate wird als „luteal rescue“ bezeichnet und wird durch die Stimulation des Corpus
luteums mit hCG bewirkt (Ottobre et Stouffer, 1984), welches bereits ab dem 22. Zyklustag
im Trophoblasten gebildet wird. LH vermag im Gegensatz zu hCG, diese Wirkung nicht zu
erzielen, obwohl beide ihre Wirkung über den gleichen Rezeptor vermitteln. (Zeleznik, 1998).
Dies könnte an der längeren Halbwertszeit von hCG und der konstanen Ausschüttung durch
die Plazenta liegen (Monfort et al. 1989), sodass der ständige Einfluss von hCG einen
stärkeren stimulatorischen Reiz auf das Corpus luteum ausübt, als die pulsatile LHEinwirkung.
Ein Effekt der hCG-Einwirkung ist dabei eine Verminderung der Expression der MatrixMetalloproteinase 9 (Stamouli et al. 1996), und damit eine Stabilisierung der extrazellulären
Matrix. Weiterhin kommt es zu einer zweiten Induktion der Angiogenese, einhergehend mit
einer Erhöhung der VEGF-Expression (Wulff et al. 2001).
5
1. Einleitung
Abbildung 2.1 : Schematische Darstellung der Follikelreifung (aus Stauber und Weyerstahl, 2005)
1.1.6. Luteolyse
Bleibt eine Konzeption aus, kommt es zwei Wochen nach der Ovulation zur Luteolyse. Dabei
verlieren die lutealen Zellen zunächst die Fähigkeit zur Progesteronsynthese, anschließend
kommt es zum Abbau der Zellen und zur lutealen Regression (Denschlag und Keck 2002;
Kamat et al. 1995; Yamamoto et al. 1997). In den meisten Spezies ist die uterine Sekretion
von Prostaglandin F2α ein wesentlicher Faktor zur Initierung der Luteolyse (McCracken et al.
1970; Pate and Keyes et al. 2001). Prostaglandin F2α bewirkt nach Bindung an seinen
Rezeptor über die Phospholipase C eine Aktivierung der Proteinkinase C, welche im
Wesentlichen für die negativen Effekt auf die Steroidbiosynthese verantwortlich ist (McGuire
et al. 1994; Wiltbank et al. 1990). Es kommt zu einer Abnahme der Syntheseleistung für
Progesteron und dessen Sekretion (Pitzel et al. 1993; Yuan et al. 1993). Die Blutversorgung
des Corpus luteums wird von Prostaglandin F2α vermindert, was zu einer geringeren
Versorgung mit Stoffwechselprodukten und luteotropen Faktoren führt (Pharriss et al. 1970).
Dies erfolgt über zwei Mechanismen; der Degeneration von lutealen Endothelzellen (Sawyer
et al. 1990) und der Induktion von Endothelin 1 (Girsh et al. 1996), und dessen
vasokonstriktorischen Effekts (Ohtani et al. 1998). Zusätzlich führt PGF 2α zur zellulären
Apoptose (Rueda et al. 1995; Zheng et al. 1994), dies erfolgt über die DNA-Fragmentation
durch Ca2+-abhängige Endonukleasen (Wyllie et al. 1980).
Auch bei der Luteolyse des Menschen, die noch nicht hinreichend geklärt ist, kommt es zu
apoptotischen Prozessen (Shikone et al. 1996), welche für den Menschen essentiell sind
6
1. Einleitung
(Vaskivuo et al. 2003). Auch einer erhöhten Expression der Metalloproteinase MT1-MMP
könnte eine regulatorische Funktion in der Luteolyse zukommen (Manase et al. 2002)
1.1.7. Humanes Choriongonadotropin (hCG)
Humanes Choriongonadotropin ist ein Glykoproteinhormon mit einem Molekulargewicht von
39 kDa. Zusammen mit FSH, LH und TSH gehört es zu der Familie der Gonadotropine. Es
wird
unter
physiologischen
Bedingungen
hauptsächlich
im
Trophoblast
gebildet,
unphysiologisch auch in verschiedenen genitalen und nichtgenitalen Tumoren (Monteiro et al.
1983).Es hat eine Halbwertszeit von 96 Stunden, diese ist damit länger, als die des LHs,
dessen Halbwertszeit lediglich bei vier Stunden liegt (Keck und Breckwoldt 2002).
In seiner Struktur weist es starke Homologien zu Lutenisierendem Hormon (LH) auf, so ist
die 92 Aminosäuren lange α-Kette bei beiden identisch. Die kovalent an die α-Kette
gebundene β-Kette von hCG, welche die spezifische biologische Funktion bestimmt, ist zwar
mit 142 um 26 Aminosäuren länger als die des LH, dennoch sind sie zu 80% homolog. Dies
erklärt auch, dass beide an den gleichen Rezeptor binden, allerdings ist die Bindung von hCG
wesentlich stärker (Keck et al. 2002).
Bei dem hCG/LH-Rezeptor handelt es sich um einen G-Protein gekoppelten Rezeptor, der
typischerweise neben einem großen extrazellulären und einem intrazellulären C-terminalem
Abschnitt über eine transmembranösen Domäne mit sieben α-helicale Sekundärstrukturen
verfügt. Die Signalkette im Anschluß an die Ligandenbindung ist vielfältig. Zum einen wird
die Phospholipase C aktiviert, dadurch wird über Diacylglycerin die Proteinkinase C aktiviert
(Greenwood et al. 1998) und über Inositoltriphosphatbildung und dem resultierenden
Kalziumanstieg Calmodulin aktiviert. Zum anderen wird die Adenylatcylase aktiviert welche
über den cAMP-Anstieg die Proteinkinase A aktiviert (Dufau 1998), dadurch wiederum wird
die Steroidproduktion induziert (Bender et al. 2001).
Der cAMP-Anstieg spielt auch eine Rolle in der Regulation der hCG/LH-Rezeptorexpression.
Durch eine Erhöhung des cAMP-Spiegels wird die Biosynthese des Rezepors auf mRNAEbene vermindert (Wang et al.1991; Kishi et al. 1997). Somit spielen hCG und LH eine Rolle
in der Regulation ihres eigenen Rezeptors.
7
1. Einleitung
Eine Expression des hCG/LH-Rezeptor findet extragonadal außer in der Plazenta (Minegishi
et al. 1997), auf Nabelschnurgewebe, in den Tuben und im Uterus auch in der Prostata, den
Nebennieren und dem ZNS statt (Licht und Wildt, 1998).
1.2. Möglichkeiten zur Identifizierung differentiell exprimierter Gene
1.2.1. Differential Display
Der Differential Display ist eine etwas ältere Methode, ursprünglich von Liang et al. als
„RNA fingerprinting by arbitrarily primed PCR“ beschrieben (Liang und Pardee, 1992). Der
Ablauf besteht aus einer reversen Transkription unter Verwendung von Oligo-(dT)-Primern
mit ein oder zwei zusätzlichen Nukleotiden (genannt „Anchorprimer“)t, welche die mRNAPopulation in Untereinheiten einteilt, und einer anschließenden PCR, bei der 3`-Anchorprimer
mit verschiedenen 5`-Primern, deren ungefähr zehn Nukleotide willkürlich gewählt sind
(deshalb „arbitrary primers“), kombiniert werden. Auf diese Weise entsteht eine ganze Reihe
unterschiedlich langer amplifizerter Sequenzen, die, getrennt nach Primerkombinationen, auf
einem Polyacrylamid-Gel aufgetrennt werden. Banden, die nur oder wesentlich deutlicher in
einer Population zu sehen sind, aber nicht in der anderen stellen Ausschnitte aus differentiell
exprimierten Genen dar. Diese können ausgeschnitten, subkloniert und weiter analysiert
werden.
Der Vorteil des Differential Display liegt einerseits darin gleichzeitig herauf- und
herabregulierte Gene zu identifizieren, andererseits darin, dass mehr als zwei GenPopulationen auf einmal verglichen werden können. Unter den Nachteilen sticht hervor, dass
Gene mit geringer Abundanz nur schlecht gefunden werden und, dass diese Methode einen
großen Anteil falsch positiver Ergebnisse liefert.
1.2.2. SAGE
Eine weitere Technik stellt SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) dar , erstmalig von
Velculescu et al 1995beschrieben. (Velculescu et al., 1995). Sie macht sich zunutze, dass
kurze, neun bis zehn Nukleotid lange, Bruchstücke („Tags“) ausreichen um ein Transkript zu
identifizieren und viele dieser Bruchstücke in einem einzigen Klon sequenziert werden
können, wenn sie aneinandergehängt werden.
8
1. Einleitung
Praktisch wird mit Oligo-(dT)-Primern cDNA hergestellt, welche an Streptavidin gebunden
wird. Die cDNA wird mit einem 4-bp-Restriktionsenzym überhängend geschnitten, sodass in
getrennten Ansätzen zwei verschiedene „Linker“ angehängt werden können, die ihrerseits
eine Erkennungsstelle für ein 20 bp entfernt schneidendes Restriktionsenzym haben. Die
Linker werden also mit einem kurzen cDNA-Stück vom Streptavidin getrennt. Die cDNASeiten aus beiden Ansätzen werden zu „Di-Tags“ zusammengefügt, die Linker werden
abgeschnitten und viele dieser „Di-Tags“ gemeinsam in einen Vektor kloniert um sequenziert
zu werden.
1.2.3. Mikrochips
Zu den neusten Techniken gehört die Verwendung sogenannter DNA-Mikrochips auf die
Olignukleotide aufgebracht sind und die mit Sonden aus den zu untersuchenden Populationen
hybridisiert und anschließen analysiert werden. Diese Methode ist sehr kostenintensiv und
erfordert in der Durchführung der Analyse viel Erfahrung, doch können damit die
Expressionsmuster tausender Gene an einem Tag untersucht werden und auch Gene sehr
geringer Abundanz isoliert werden.
1.2.4. Suppressive Subtractive Hybridization
Die SSH wurde 1996 ertsmalig von Diatchenko et al. beschrieben und stellt eine neue und
fortgeschrittene Methode dar (Diatchenko et al. 1996).
Die Suppressive Subtractive Hybridization (SSH) ist eine Technik, die es ermöglicht
Transkripte differentiell exprimierter Gene zu isolieren und zu vervielfältigen. Bei dieser
Methode werden Gene mit geringer Abundanz gegenüber häufigen angereichert und können
somit isoliert werden.
Man bedient sich hierzu der mRNA-Populationen der zu vergleichenden Zellkulturen, wobei
die Population, deren differentiell exprimierte Transkripte man isolieren möchte als „Tester“,
die von ihr zu subtrahierende Population als „Driver“ bezeichnet wird. In vorliegender Arbeit
sollen hCG-assoziierte Expressionsveränderungen untersucht werden, deshalb dienten
einerseits hCG-induzierte Zellkulturen als Tester, um Gene zu identifizieren deren
9
1. Einleitung
Expression erhöht wird, und andererseits nicht-induzierte Zellkulturen als Tester, um Gene zu
identifizieren deren Expression erniedrigt wird.
1.3. Zielsetzung der Arbeit
Unmittelbar nach der Ovulation entwickelt sich aus den Granulosazellen des rupturierten
Follikels das Corpus luteum. Die Entstehung des Corpus luteums und seine Umwandlung in
ein funktionsfähiges Corpus luteum graviditatis ist abhängig von der Zufuhr von
Gonadotropinen,
insbesondere
von
humanem
Choriongonadotropin.
Dieser
Umwandlungsprozess geht einher mit massiven strukturellen und physiologischen
Veränderungen. Eine bedeutende Rolle kommt dabei der Angiogenese zu, die durch hCG
über eine Steigerung der VEGF-Expression mitreguliert wird. Durch den Einfluss von hCG
kommt es zum „luteal rescue“, dies wird auch über die Regulation von Apoptose-assoziierten
Genen bewirkt, welche im Ablauf der luteolytischen Prozesse involviert sind.
Dennoch ist zurzeit nur wenig darüber bekannt, welche weiteren Gene während der
Entstehung und des Erhalts des Corpus luteums eine Beeinflussung erfahren. Es gibt jedoch
eine Reihe von Methoden deren Ziel es ist, solche Beeinflussungen der Genexpression zu
detektieren.
Es stellen sich daher folgenden Fragen deren Beantwortung Ziel dieser Arbeit ist:
1. Welche Methode zur Detektion von Expressionsveränderungen erscheint anhand
vorliegender Erfahrungswerte am besten geeignet, differentiell exprimierte Gene in
Granulosazellen zu identifizieren?
2. Lassen sich mit dieser Methode in Granulosazellen durch hCG in ihrer Transkription
beeinflussten Gene nachweisen?
3. In welchem Zusammenhang stehen diese nachgewiesenen Gene mit solchen, von
denen bereits bekannt ist durch hCG in ihrer Transkription beeinflusst zu werden?
4. Gibt es bekannte Regulationsmechanismen, über die hCG einen Einfluss auf die
Transkription dieser Gene ausüben kann?
10
2.Material und Methoden
2. Patientinnen, Material und Methoden
2.1. Patientinnen
Die Granulosazellen, die für die folgenden Versuche verwendet wurden, stammten aus
der
Follikelflüssigkeit
Fertilitätstherapie
in
von
Patientinnen,
Form
einer
deren
Follikel
im
In-vitro-Fertilisation
Rahmen
einer
(IVF)
oder
Intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI) punktiert wurden. Diese Eingriffe
fanden in der Universitätsfrauenklinik Freiburg, sowie in der Praxis Prof. Geisthövel in
Freiburg
statt.
Normalbefund
Die
auf,
Patientinnen
wurden
über
wiesen
allesamt
die Verwendung
einen
der
endokrinologischen
Granulosazellen
zu
Versuchszwecken unterrichtet und gaben hierzu ihr schriftliches Einverständnis.
2.2 Zellkultur
2.2.1. Zellgewinnung
Nach Entnahme der Eizellen wurden dem Follikelpunktat 6 μl Hyaluronidase (3U/μl)
zugegeben. Die Follikelflüssigkeit wurde in 50 ml-Greinerröhrchen überführt und eine
Minute bei 1500 rpm zentrifugiert (Hettich Roto Silenta/K, Hettich, Tuttlingen). Der
Überstand wurde abgenommen und das Pellet, bestehend aus den Granulosazellen nebst
Erythrozyten sowie Leukozyten und Makrophagen, in PBS-Puffer resuspendiert und
erneut zentrifugiert.
Die entstandenen Pellets wurden gepoolt, jeweils ein ml auf 2 ml Percoll:PBS(1:2)Lösung in einem 15ml-Greinerröhrchen geschichtet und 10 Min bei 4000 rpm
zentrifugiert, mit dem Ziel die Zellen nach Größe entlang des Dichtegradienten zu
trennen. Die Granulosazellen bilden dabei aufgrund ihrer Größe die oberste Schicht und
können somit von den übrigen Zellen separiert werden. Die Granulosazellen wurden
von dem Percoll abgetragen und gleichmäßig auf 50 ml-Falcon -Zellkulturflaschen
aufgeteilt. Jeder Zellkulturflasche wurden 3 ml M199-25MM HEPES-Medium mit 10%
FCS und 1% Penicillin/Streptomycin zugegeben. Das Medium wurde alle 48 h
gewechselt.
11
2.Material und Methoden
Die Zellen wurden bei 37°C und 5 % CO2 in einem Brutschrank (Hereaeus, Hanau)
kultiviert.
Abb. 2. 1: Darstellung einer Granulosazellkultur nach 48h Inkubation (10fache Vergrößerung).
2.2.2. Induktion
Die Granulosazellkulturen wurden nach 48h mit 6μl humanem Choriongonadotropin
(10 IE/μl) induziert. Diese Zeitspanne wurde eingehalten um den Einfluss des in vivo
verabreichten hCGs abgeklungen lassen zu haben. Die Induktion dauerte 48h und in
dieser Zeit wurden kein Mediumwechsel durchgeführt. Um den Effekt des hCGs auf
die Genexpression zu untersuchen wurde jeweils nur eine Hälfte der Kulturen, die
Probekulturen (P), induziert, die andere Hälfte, die Kontrollkulturen (K), wurden nicht
induziert. Die Überstände wurden am Ende der Induktion abgenommen und zur
weiteren Verwendung eingefroren.
Da die Granulosazellen unterschiedlichen Patientinnen entnommen wurden, besteht die
Gefahr, dass sich individuelle Veränderungen in den folgenden Versuchen
durchschlagen. Um dies zu verhindern wurde die Follikelflüssigkeit aller Individuen
vor der Zellgewinnung vereinigt. Auf diese Weise enthielten sowohl die Probekulturen,
als auch die Kontrollkulturen gleiche Anteile von Granulosazellen aller Patientinnen.
12
2.Material und Methoden
2.3. RNA-Isolierung mit Trizol
Die RNA-Isolierung erfolgte durch die „one-step“-Methode nach Chomczynski und
Sacchi (1987).
Nach Entnahme des Mediums wurden die Zellen noch einmal mit PBS gewaschen und
anschließend mit einem ml Trizol gelöst und in diesem in ein 2,0ml-Tube überführt. Es
wurden 200μl Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) zugegeben, gevortext und dann bei
14000rpm für 20Min zentrifugiert (Universal 16R, Hettich). Die wässrige obere Phase,
in der die Nukleinsäuren verbleiben, wurde abgenommen, in ein neues 1,5ml-Tube
überführt und mit 500μl Isopropanol vermischt. Dieser Ansatz wurde 15Min bei
Raumtemperatur inkubiert und anschließend erneut bei 14000rpm für 20Min
zentrifugiert. Der Überstand wurde ohne das auf dem Boden verbliebene Pellet zu
zerstören abgenommen. Nach dem Waschen mit zuerst 100%igen, dann75%igen
Ethanol und jeweils 5-minütiger Zentrifugation bei 14000rpm wurde das Pellet
komplett getrocknet und in 45μl RNASecure-Lösung aufgenommen.
Es folgte ein DNA-Verdau mit 3μl DNAse (10U/l) und 5μl DNAse-Puffer für 30Min
bei 37°C und 20Min bei 70°C (GeneAmp 2400 Thermocycler, Applied Biosystems,
USA).
Die Konzentrationsbestimmung erfolgte über die Messung der optischen Dichte von
100μl einer RNA-Verdünnung von 1:20 in einem Spektrophotometer (DU640,
Beckmann, USA).
Anschließend wurden zur Integritätskontrolle 50μl der Verdünnung auf einem
1,5%igen Agarose-Gel aufgetragen. Hierbei sollte sich bei qualitativ hochwertiger
RNA eine doppelt so große Bande bei ca. 4,9 kbp zeigen wie bei ca. 1,9 kbp (distinkte
28s und 18s Banden).
13
2.Material und Methoden
2.4. Subtractive Hybridisierung
Zur Verwendung kam das PCR-Select cDNA Subtraction Kit der Firma Clontech (Palo
Alto, USA).
Die Poly-A+-RNA der beiden Zellkulturen wird in einem ersten Schritt in cDNA
umgeschrieben und dann mit Rsa I, einem Restriktionsenzym welches gerade Enden
erzeugt und an einer spezifischen 4-Basensequenz schneidet, verdaut. Die Tester-cDNA
wird dann in zwei gleiche Mengen geteilt und jeweils mit Adaptor 1 bzw. 2R ligiert.
Die Adaptorenenden haben keine Phosphatgruppe, sodass jeweils nur ein Einzelstrang
eines jeden Adaptors an das 5`-Ende der cDNA gekoppelt wird. Die Sequenz der
Adaptoren enthält identische Abschnitte an die Primer in der PCR binden können,
nachdem die Enden aufgefüllt wurden.
In der ersten Hybridisierung wird den beiden Testergruppen getrennt Driver-cDNA
zugegeben, zusammen denaturiert und anschließend hybridisiert. Die Driver-cDNA
wird im Überschuss zugegeben und Sequenzen die im Driver ebenfalls vorkommen
bilden die Hybride c (Abb. 4). Da die Hybridisierung für testerspezifische Sequenzen
mit hoher Abundanz schneller verläuft bilden diese die Hybride b, somit ist die
Konzentration der einzelsträngigen Moleküle a gleich für alle testerspezifischen
Sequenzen, unabhängig der Abundanz. Diese erste Hybridisierung hat also zum Effekt,
dass einerseits testerunspezifische Sequenzen, die als Tester-Driver-Hybride (c)
vorliegen nur linear amplifiziert werden können, andererseits, dass testerspezifische
Sequenzen geringer Abundanz
ebenso stark wie die hoher Abundanz amplifiziert
werden können. In der zweiten Hybridisierung werden die beiden Ansätze der ersten
Hybridisierung ohne erneute Denaturierung vermischt und zwar zeitgleich mit einem
erneuten Überschuss an denaturierter Driver-cDNA, um die Effektivität
der
Subtraktion zu erhöhen. Zusätzlich zu den Produkten der ersten Hybridisierung
entstehen nun aus den verbliebenen einzelsträngigen testerspezifischen Sequenzen die
neuen Hybride vom Typ e. Diese Hybride haben verschiedene 5`-Enden, entsprechend
Adaptor 1 und 2R, und somit zwei verschiedene Bindungsstellen für die PCR-Primer.
Nach dem Auffüllen der Enden wurden in der folgenden PCR entsprechend nur die
testerspezifische Sequenzen mit unterschiedlichen 5`- und 3`-Enden exponentiell
amplifiziert. Die Hybride b mit zwei gleichen Adaptoren bilden durch intramolekulare
Hybridisierung die „pan-like“-Struktur und werden nicht amplifiziert.
14
2.Material und Methoden
Eine anschließende zweite PCR mit je einem „Nested“ Primer für Adaptor 1 und 2R
vermehrt die unterschiedlichen Sequenzen zusätzlich und erhöht die Spezifität.
Die SSH sollte einerseits nur testerspezifisch exprimierte Sequenzen amplifizieren,
andererseits sollten Sequenzen, die in geringen Mengen vorkommen, gegenüber den
abundanteren
angereichert
werden.
Letzteres
erfolgt
über
die
erste
Hybridisierungsreaktion und die folgende Suppressions-PCR (Siebert et al., 1995).
Gene, die nicht nur differenziell, sondern auch in hoher Rate exprimiert werden, führen
zu Hybriden vom Typ b. Da beide Stränge am 5'-Ende den gleichen Adaptor besitzen,
kommt es nach der Auffüllreaktion zur Bildung sogenannter inverted repeats. Nach
einem Denaturierungsschritt binden diese kurzen Sequenzen an den Enden derselben
Sequenz bevorzugt aneinander und bilden eine hantelartige (Pan-like) Struktur aus,
wodurch die Amplifikation dieses Fragments unterdrückt wird. Diese Normalisierung
stellt das Herzstück der SSH dar und ermöglicht die Identifikation von Zielgenen mit
geringer Abundanz.
15
2.Material und Methoden
Aufteilen der
cDNA
Abb. 2. 2: Schematische Darstellung zur Veranschaulichung der Subtraktiven Hybridisierung und dem
daraus resultierenden Amplifikationsverhalten der einzelnen Hybride (nach dem Benutzerhandbuch
CLONTECH PCR-SELECTTM cDNA Subtraction Kit, Clontech).
16
2.Material und Methoden
2.4.1. Poly A+-RNA-Isolierung
Dieser Schritt wurde vorgenommen, um die nur in kleinen Konzentrationen von ca.
einem Prozent pro Zelle vorkommende mRNA abzutrennen und zu konzentrieren, da
dies für die weiteren Versuche entscheidend ist.
Zur Verwendung kam der Oligotex mRNA-Kit von Qiagen (Hilden, Germany). Im
Prinzip macht sich dieser Kit die Poly A+-Schwänze, die im Kern im Anschluß an die
Transkription der RNA angehängt werden, zu Nutzen. Diese Schwänze werden bei
hohen Salzkonzentrationen an Poly T-Oligonucleotide gebunden, während die restliche
RNA abzentrifugiert wird, um dann bei niederen Salzkonzentrationen selbst abgelöst zu
werden.
Die Reaktion wurde jeweils mit 2µg induzierter und nicht induzierter mRNA
durchgeführt.
2.4.2. cDNA-Synthese
Die cDNA-Synthese wurde durchgeführt um ein späteres Vorgehen mittels PCR zu
ermöglichen.
2.4.2.1. Erststrang cDNA-Synthese
Es wurden jeweils 2µg mRNA in einem Volumen von 4µl mit einem µl cDNA
Synthesis Primer vermischt, für 2Min bei 70°C inkubiert und anschließend für 2Min
gekühlt. Nach kurzer Zentifugation wurde jedem Ansatz folgender Master Mix
zugegeben:
5x First Strand Buffer
2µl
dNTP Mix (10mM )
1µl
H2O
1µl
AMV Reverse Transcriptase
1µl
Dieser Ansatz wurde für 1.5 h in einem Brutschrank bei 42°C inkubiert und danach zur
Termination der Erststrang-Synthese auf Eis gestellt.
17
2.Material und Methoden
2.4.2.2 Zweitstrang cDNA-Synthese
H2O
48,4µl
5x Second Strand Buffer
16,0µl
dNTP Mix ( 10mM )
1,6µl
20x Second Strand Enzyme Cocktail
4,0µl
Obiger Master Mix wurde jedem Ansatz zugegeben und für 2 h bei 16°C inkubiert.
Dann wurden 2µl (6U) T4 DNA-Polymerase zugegeben und erneut bei 16°C für 30Min
inkubiert. Zur Termination der Zweitstrang-Synthese wurde jedem Ansatz 4µl 20x
EDTA/Glykogen-Gemisch zugegeben.
Die Reinigung erfolgte durch Zugabe von 100μl Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol
(25:24:1) und Zentrifugation bei 14.000 U/Min für 10Min. Die obere wässrige Phase
wurde abgenommen, 100μl Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) zugegeben und erneut
zentrifugiert. Wieder wurde die obere Phase abgenommen und mit 40μl NH4OAc und
300μl 95%-igem Ethanol vermischt, es folgte eine 20minütige Zentrifugation.
Anschließend wurde der Überstand abgenommen und das Pellet erst mit 80%-igem
Ethanol für 10Min zentrifugiert, dann vollständig getrocknet und in 50μl Wasser
aufgenommen.
Von diesem Ansatz wurden 6μl entnommen und für die Kontrolle der
Verdauungseffizienz aufbewahrt.
2.4.3. Verdauung mit RsaΙ
In diesem Schritt wird die DNA gekürzt und es werden gerade Enden erzeugt, womit
spätere Reaktionsschritte vereinfacht werden.
cDNA
43,5μl
10x RsaΙ Restriktionspuffer
5μl
Rsa Ι (10 U/μl)
1,5μl
18
2.Material und Methoden
Dieser Ansatz wurde 1,5h bei 37°C inkubiert, dann wurden 5μl zur Kontrolle
entnommen. Durch Zugabe von 2,5 μl eines 20x EDTA/Glykogen-Gemisches wurde
die Reaktion gestoppt. Die Reinigung erfolgte entsprechend Kap. 2.4.2.
Nach vollständiger Trocknung wurde die Proben in 5,5μl Wasser aufgenommen.
2.4.4. Ligation der Adaptoren
Die Adaptoren dienen den Primer in der PCR als Anlagerungsstelle.
Komponente
Tester 1-1
Tester 1-2
Tester cDNA (aus 2.4.4)
2μl
2μl
Adaptor 1
2μl
-
Adaptor 2R
-
2μl
Master Mix*
6μl
6μl
* bestehend aus: Wasser
3μl
5x Ligationspuffer
2μl
T4 DNA Ligase(400U/μl)
1μl
Diese Ansätze wurden über Nacht bei 16°C inkubiert und die Ligation dann durch
Zugabe von einem μl EDTA/Glykogen gestoppt. Die Ligase wurde durch
fünfminütiges Erhitzen bei 72°C inaktiviert.
2.4.5. Erste Hybridisierung
Komponente
Hybridisierungsprobe 1
Hybridisierungsprobe 2
Driver cDNA (aus 2.4.2)
1,5μl
1,5μl
Tester 1-1 (aus 2.4.4)
1,5μl
-
Tester 1-2 (aus 2.4.4)
-
1,5μl
4x Hybridisierungspuffer
1μl
1μl
Die Proben wurden bei 98°C für 1,5Min denaturiert und dann bei 68°C für 8h inkubiert.
19
2.Material und Methoden
2.4.6. Zweite Hybridisierung
Ansatz frisch denaturierter Driver cDNA:
Driver cDNA (aus 2.4.4)
1μl
4x Hybridisierungspuffer
1μl
Wasser
2μl
Dieser Ansatz wurde bei 98°C für 1,5Min denaturiert und dann gleichzeitig mit
Hybridisierungsprobe 1 und 2 vermischt, ohne diese erneut zu denaturieren.
Anschließend erfolgte eine Inkubation bei 68°C über Nacht. Die Proben wurden in
200μl Dilutionspuffer aufgenommen, in einem Thermocycler für 7Min auf 68°C erhitzt
und danach eingefroren.
2.4.7. PCR-Amplifikation
Durch die PCR-Amplifikation werden die testerspezifischen Sequenzen vervielfältigt
und können als Banden im Agarosegel sichtbar gemacht werden.
2.4.7.1. Erste Amplifikation
Von beiden Subtraktionsproben und den zugehörigen nicht-subtrahierten Kontrollen
wurde jeweils ein μl in ein PCR-Tube gegeben und mit aufgeführtem Master Mix
vermischt.
H2O
19,5μl
10x Reaktionspuffer
2,5μl
dNTPs (10μM)
0,5μl
PCR Primer 1
1,0μl
50x Advantage cDNA Polymerase Mix
0,5μl
Gesamt
24,0μl
Die Ansätze wurden für 5Min bei 72°C inkubiert um die Adaptoren anzuhängen, im
Anschluß folgten 27 Zyklen dieses Amplifikationsprogramms:
20
2.Material und Methoden
•
94°C
30Sec
•
66°C
30Sec
•
72°C
90Sec
2.4.7.2. Zweite Amplifikation
Ein μl von dem 1:10 verdünnten Amlifikationsprodukt der ersten PCR wurde mit
folgendem Master Mix vermischt.
H2O
18,5μl
10x Reaktionspuffer
2,5μl
Nested PCR Primer 1
1,0μl
Nested PCR Primer 2R
1,0μl
dNTPs
0,5μl
50x Advantage PCR Polymerase Mix
0,5μl
Gesamt
24,0μl
Es folgten 12 Zyklen des Amplifikatiosprogrammes unter 2.4.7.1.
Es wurden 8μl jeder Probe aus beiden Amplifikationen auf einem 2%-igen Agarosgel
analysiert.
2.5. Klonierung
2.5.1. Gelextraktion
Zur Anwendung kam der QIAquick PCR Purification Kit der Firma Qiagen (Hilden).
Das Prinzip basiert auf dem unterschiedlichen Bindungsverhalten der DNA an den
Silizium-Membranen in den QIAquick-Säulchen unter hohen Salzkonzentrationen, und
damit
guten
Bindungsbedingungen,
und
Bindungsbedingungen.
21
niederen,
und
damit
schlechten
2.Material und Methoden
Das ausgeschnittene Gelfragment wurde bei 50°C für 10Min in der dreifachen
Volumen des Puffers QG gelöst und anschließend mit dem einfachen Volumen
Isopropanol vermischt. Die Probe wurde auf ein QIAquick-Säulchen aufgetragen und
eine Min zentrifugiert. Nach einem Waschdurchgang mit 750μl PE-Puffer wurde die
DNA mit 50μl EB-Puffer gelöst.
2.5.2. Ligation und Transformation
Für die Ligation und Transformation wurden der Vektor pCR 2.1-Topo und One Shot
Chemically Competent E.coli-Bakterien der Firma Invitrogen verwendet. Für die
Ligation wurden 4μl der eluierten DNA mit einem μl Puffer für 10Min bei RT
inkubiert und anschließend auf Eis gestellt. Für die Transformation wurde dieser
Ansatz zu den E.coli-Bakterien gegeben und für 10Min auf Eis gestellt. Die E.coliBakterien wurden bei 42°C für 30sec hitzegeschockt und danach wurden auf Eis 100μl
SOC-Medium zugegeben. Es folgte eine einstündige Inkubation bei 37°C.
Schließlich wurden die Bakterien auf einer LB-Platte ausgesät und über Nacht bei 37°C
in einen Inkubator (BK 3023, Ehret) gegeben. Von einer Platte wurden fünf Klone
selektiert und erneut über Nacht in einem 15ml-Greinerrörchen in 5ml LB-Medium mit
Ampicillin (0,1mg/ml) kultiviert.
SOC-Medium: 2% Bacto-Trypton, 10mM NaCl, 10mM MgCl, 2,5mM KCl,
10mM MgSO4, 20mM Glukose
Prinzip der Selektion:
Da das LB-Agar-Medium Ampicillin enthielt (0,01mg/ml), der Resistenzfaktor βLactamase jedoch auf dem Vektor kodiert war konnten nur E.coli-Kulturen wachsen,
die erfolgreich transformiert wurden. Zusätzlich wurden die Platten mit X-Gal (5Bromo-4-Chlor-Indigo-Galaktosid) beimpft, die Insertionsstelle auf dem Vektor liegt
allerdings innerhalb des lacZ-Gens, welches für β-Galaktosidase kodiert und bei
erfolgreicher Ligation nicht mehr vollständig transkribiert werden kann. Transformierte
Kulturen, die zudem erfolgreich ligiert wurden, waren somit nicht mehr in der Lage βGalaktosidase zu bilden und verloren die Fähigkeit Galaktose abzuspalten. Dadurch
22
2.Material und Methoden
wurde die Entstehung des blauen Farbstoffes 5-Bromo-4-Chlor-Indigo verhindert. Zur
weiteren Verwendung kamen daher nur Klone die weiße Kulturen bildeten.
Abb. 2.3: Schematische Darstellung des Vektors pCR 2.1-Topo mit den Insertionsstellen für die
isolierten Fragmente (http://www.invitrogen.com/catalog_project/cat_topota.html)
2.5.3. Plasmid-Mini Präparation
Lösung1:
0,1 M EDTA
20% Glukose in H2O
1 M Tris pH 8,0
Wasser
Lösung2:
Lösung3:
10ml
5ml 10 N NaOH
2,5ml 10% SDS
82,5ml Wasser
2ml 5M Kaliumacetat
60ml
10ml Eisessig
11,5ml
88ml Wasser
28,5ml
1,4 ml der Übernacht-Kultur wurden in ein 1,5 ml-Tube überführt und bei 12000rpm
1min zentrifugiert (Sigma 112, Bioblock Scientific, Osterode im Harz). Der Überstand
wurde abgenommen und das Pellet in 100μl Lösung 1 resuspendiert und 5Min bei RT
inkubiert. Anschließend wurden 200μl frisch angesetzte Lösung 2 zugegeben, der
Ansatz vorsichtig durchmischt und für weitere 5Min auf Eis gestellt. Schließlich
wurden 150μl Lösung 3 beigemischt und wiederum für 5Min auf Eis gestellt. Die
Proben wurden dann 20Min bei 12000rpm zentrifugiert, der Überstand danach
23
2.Material und Methoden
abgenommen und mit dem gleichen Volumen Phenol:Chloroform (1:1) vermischt und
erneut für 2Min bei 12000rpm zentrifugiert. Die obere Phase wurde in ein neues Tube
überführt und die DNA mit dem doppelten Volumen 100%-igem Ethanol ausgefällt.
Das entstandene Pellet wurde mit 75%-igem Ethanol gewaschen, getrocknet und
anschließend in 40μl Wasser und 2μl RNAse (1mg/ml) aufgenommen.
2.5.4. Restriktionsverdau mit EcoR1
Der Vektor hat zwei Bindungsstellen für EcoR1, kurz vor und kurz hinter den
Insertionsstellen, sodass durch den Verdau die Vektor-DNA (3,9 kbp) von dem
eingefügten Fragment getrennt wird.
Vektor
1μg
Restriktionspuffer
2,0μl
EcoR1 (12U/μl)
0,5μl
Wasser
auf 20μl
Dieser Ansatz wurde für eine Stunde bei 37°C inkubiert.
Nach Auftrennung des Verdaus auf einem Agarosegel können die Fragmente auf ihre
Länge untersucht werden.
2.6. Membranhybridisierung mit P32-markierter cDNA-Sonde
Da voraussichtlich eine Reihe von Klonen von nicht unterschiedlich exprimierten
Genen
stammen,
wurde
mittels
Membranhybridisierung
im
Sinne
eines
Screeningverfahrens eine Vorauswahl an Klonen getroffen welche weiteren Analysen
zugeführt werden.
2.6.1. Präparation der Membran
Zum Einsatz kam eine positiv geladene Nylon Hybond-N+-Membran (Amersham
Pharmacia , Freiburg), die vor dem Auftragen der DNA-Fragmente in MiliQ-Wasser
equilibriert wurde. Nach Plasmid-Mini-Präparation und Konzentrationsbestimmung
24
2.Material und Methoden
wurden jeweils 4,5μg der Vektoren getrocknet und in 4,5μl 0,4M NaOH/10mM EDTA
aufgenommen. Die DNA wurde anschließend 2Min bei 95°C denaturiert und sofort auf
Eis gestellt. Es wurden jeweils zwei Dots bestehend aus einem μg Vektor auf die
Membran aufgetragen.
Die Membran wurde vollständig getrocknet und dann für 45sec UV-Bestrahlung
ausgesetzt, um DNA und Membran zu verbinden (cross-linking).
2.6.2. cDNA-Sonde mit P³²-Markierung
Zur Verwendung kam das (α-P³²)-dCTP (1mg/ml) Omniscript Kit der Firma Qiagen
Hilden, mit welchem eine reverse Transkription unter Einbau von radioaktiv markierten
Cytosin-Nukleotiden durchgeführt werden kann.
Herstellung des Master Mix auf Eis:
10x Puffer RT
2,0μl
dNTP Mix P*
2,0μl
(α-P³²)-dCTP(10μCi/ml)
5,0μl
Oligo-dT Primer(100μM)
2,0μl
Omniscript Reverse Transcriptase
2,0μl
bis 20 μl
Wasser
RNA
1μg
*dNTP-Mix P-Konzentrationen:dATP,dGTP,dTTP(jeweils100mM); dCTP (40mM).
Dieser Ansatz wurde für eine Stunde bei 37°C inkubiert, anschließend wurden 2,0μl
RNAse zugegeben um die übriggebliebene RNA bei 37°C für 15Min zu zerstören.
Da freies α-P³²-dCTP die Messung verfälschen würde, wurde die Sonde mittels
Zentrifugation für 2Min bei 3000U/Min durch Probe Quant G50 Micro Columns
gereinigt.
25
2.Material und Methoden
Um in der Hybridisation gleiche Mengen der Sonde einzusetzen wurde die Aktivität
über die Cerenkow-Strahlung in einem Counterscintilator (Wallac 1410 Liquid
Scintillation Counter, Perkin-Elmer-Wallwac, Freiburg) bestimmt.
2.6.3. Hybridisierung
Die Hybridisierung wurde in 50ml-Greinerröhrchen in einem Rollinkubator (Bachofer
Laboratoriumsgeräte, Reutlingen) bei 65°C durchgeführt. Zunächst wurden die
Membranen für 20Min mit 30ml Rapid Hyp Buffer prähybridisiert. Die Menge der
Sonde wurde so gewählt, dass die Aktivität in dem Proben- und Kontrollansatz gleich
war. Die Dauer der Hybridisierung betrug 2,5 Stunden. Der Waschvorgang erfolgte mit
5x-, 1x-, 0,1x-SSC/0,1%SDS-Lösungen, die in absteigender Konzentration und jeweils
10-15Min appliziert wurden.
Ansatz der SSC-Lösung 20x: 3 M NaCl, 0,3 M Trisodium Citrat, Einstellung der pHWerte auf 7,0 mit konz. Salzsäure.
2.6.4. Autoradiographie
Nach dem letzten Waschvorgang wurde die Membran vollständig getrocknet. Die
Belichtung erfolgte auf einem Röntgenfilm bei minus 80°C für 24h bis 4 Tage, je nach
Intensität der Signale.
2.6.5. Auswertung
Die semi-quantitative Auswertung wurde mit den Programmen AIDA (Advanced
Imaging Data Analyzing) 2.0 und Microsoft Excel 2000 durchgeführt.
Zur Normalisierung der Ergebnisse wurde ein Quotient aus den Werten der
Signalintensitäten der verschiedenen Klone und der von GAPDH gebildet (siehe dazu
Kap. 3.2.1). Auf diese Weise wurden Unterschiede in der Hybridisierungsstärke von
Probe und Kontrolle ausgeglichen.
26
2.Material und Methoden
2.7. Identifikationen der Fragmentsequenzen
Da bisher die Identität der Fragmente nicht bekannt war, wurden die klonierten
Fragmente sequenziert.
2.7.1. Sequenzierung
Die Sequenzierung durch die Firma MWG Biotech, der die Proben zugesandt wurden
(http://www.mwg-biotech.com/html/all/shop.php).
2.7.2. Analyse der Sequenz
Die Analyse der Sequenz erfolgte mittels im world wide web (WWW) freizugänglicher
und unentgeltlicher Sequenzanalyse-Programme. Folgende Internet-Seite wurde hierzu
aufgesucht:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi (BLAST)
Dieses Programm bestimmt den Übereinstimmungsgrad einer Sequenz mit allen in
Datenbanken gespeicherten Sequenzen.
2.8. Verifizierung des hCG-Einflusses auf die Expression
Um zu überprüfen, ob die Expression der Faktoren durch hCG beeinflusst wird,
erfolgte die Kontrolle unter Durchführung einer RT-PCR. Hierzu wurden verschiedene
RNAs von Probe- und Kontrollkulturen verwendet. Diese wurden durch Reverse
Transkription in cDNA umgeschrieben und dann durch PCR vervielfältigt.
2.8.1. Reverse Transkription
Zur Verwendung kam das RevertAid H-Minus-First Strand cDNA Synthesis Kit (MBI
Fermentas, St. Leon-Rot).
Für die Reverse Transkription wurde in einem ersten Schritt 1μg RNA zusammen mit
Random Hexamer Primern, die an unterschiedlichen Positionen der RNA binden, in
27
2.Material und Methoden
einem Volumen von 12 μl bei 70°C für 5 Min inkubiert und danach auf Eis gestellt. In
einem zweiten Schritt wurden der denaturierten RNA Oligonukleotide, Puffer und die
M-MLV-Reverse Transkriptase zugegeben; die Umschreibung erfolgte bei 42°C für 60
Min. Die cDNA wurde 1:10 verdünnt und in der PCR als Template eingesetzt.
2.8.2. Polymerase Ketten Reaktion (PCR)
2.8.2.1. PCR-Protokoll
dNTP-Mix
2.5μl
10x PCR-Puffer
2,5μl
Primer 1&2 (forward & reverse)
jeweils 2,5μl
Template
2,0μl
Taq-Polymerase
0,2μl
Wasser
auf 25μl
Zusammensetzung einer Standard-PCR-Reaktion
Amplifikationsprogramm (Mastercycler Gradient, Eppendorf, Hamburg) :
Denaturierung:
94°C
5Min
Denaturierung:
94°C
30 Sec
Annealing
:
60°C
30 Sec
repetitive Phase der PCR,
Elongation
:
72°C
45 Sec
Zykluszahl variabel
Elongation
:
72°C
5Min
Die Anzahl der Zyklen wurde so gewählt, dass die Reaktion in der exponentiellen
Wachstumsphase für die jeweilige Amplifikation liegt. Dazu wurde für jedes
Primerpaar in absteigenden Zykluszahlen die DNA-Bandenintensität ermittelt.
28
2.Material und Methoden
2.8.2.2. Primersequenz und Zykluszahl
Die Primersequenzen wurden mittels der Programme Virtual Genome Center
(http://alces.med.umn.edu/VGC.html) und Web Primer: DNA and Purpose Entry
(http://genome-www2.stanford.edu/cgi-bin/SGD/web-primer), unter zu Hilfenahme der
beim National Center for Biotechnology Information (NCBI, USA) erhältlichen
Sequenzdaten, erstellt.
Im Einzelnen kamen dabei folgende Primersequenzen und Zykluszahlen zur
Anwendung:
Name
GAPDH
Sequenz
vorwärts: 5`-ATG TCT CAG AGC AAC CGG-3`
rückwärts: 5´-TGT CTG GTC ATT TCC GAC T-3´
hhR23b
gamma-
vorwärts: 5`- TTG TCC TTG AAG CTT GTA TCT -3`
Actin
rückwärts: 5´- GTA CAG GGT ATT AAA CAA AT -3´
rP S6
vorwärts: 5`- ACA CGT GGA GTA ACA AGA CG -3`
rückwärts: 5´- GGG TTA TGT GGT CCG AAT -3´
30
20
25
vorwärts: 5`- CAA GCG TTC ATA GCG ACG -3`
rückwärts: 5´- ACC TGT CTC ACG GTC -3´
M 13
27
vorwärts: 5`-AGC AGC AGA CCT TCA AGA-3`
rückwärts: 5´-GGC CCT CTA GAT GCA TGC TCG-3´
BNP 1
Zykluszahl
20
vorwärts: 5`-GTA AAA CGA CGG CCA G-3`
rückwärts: 5´-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3´
25
2.8.2.3. Darstellung der PCR-Produkte
Nach Abschluss des jeweiligen Programms wurden die Produkte der PCR, nach Zugabe
von 2μl Bromphenolblau, auf einem einprozentigen Agarosegel aufgetragen und bei
120V getrennt.
29
2.Material und Methoden
Anschließend wurden die Gele 30 Min in einem Ethidiumbromidbad (0,07%) gefärbt.
Das Ethidiumbromid wurde in einer UV-Kammer (raytest, Straubenhardt) zur
Fluoreszenz angeregt, womit die DNA-Banden sichtbar werden. Zur Auswertung
wurden die Gele mit Hilfe des DIANA Chemiluminescence Detection Systems 2.0
photographiert.
2.8.3. Auswertung
Die semi-quantitative densitometrische Auswertung wurde mit dem Programm AIDA
2.0 (Advanced Imaging Data Analyzing), die statistische mit Microsoft Excel 2000
durchgeführt. Zur Verwendung kam der „students t-test“. Das Sinifikanzniveau wurde
bei p=0,05 festgelegt.
Zur Normalisierung der Ergebnisse wurde ein Quotient aus den Werten der
Bandenintensitäten der verschiedenen Fragmente und der von simultan amplifizerten
GAPDH gebildet. Auf diese Weise wurden Unterschiede zwischen den Templates von
Probe und Kontrolle ausgeglichen (siehe dazu Kap. 3.5.1).
Es wurden für jedes zu untersuchende Transkript mindestens vier PCR-Läufe
durchgeführt.
30
2.Material und Methoden
2.9. Material
2.9.1. Zellkultur
PBS
PAA Laboratories, Linz,
Hyaluronidase
Sigma, Deisenhofen
FCS
Gibco , USA
Penicillin/Streptomycin
PAA Laboratories, Linz,
hCG
SERONO, Unterschleißheim
HEPES 199 Medium
Gibco BRL, Scotland
Sterilbank
Lamin Air HB 2448, Heraeus,
2.9.2 RNA-Isolierung
Trizol
Invitrogen, USA
RNA-Secure Solution
Ambion
DNAse
Roche, Mannheim
2.9.4 Klonierung
Vektor pCR 2.1 Topo
Invitrogen, USA
One shoot Chemically
Invitrogen, USA
competent E.coli
LB-Medium
Bio 101, USA
Ampicillin
Gibco, USA
X-Gal
Sigma, Taufkirchen
Eco RI
Promega, USA
31
2.Material und Methoden
2.9.5 α-P32-Membran-Hybridisierung
( -P³²)-dCTP
Amersham Pharmacia, Freiburg
dNTP
MBI Fermentas, St. Leon-Rot
G50 Micro Columns
Amersham Pharmacia, Freiburg
Rapid Hyp Buffer
Amersham Pharmacia, Freiburg
Röntgenfilm
Kodak
2.9.6. RT-PCR
Taq-Polymerase
Qiagen, Hilden
dNTPs
Qiagen, Hilden
10x-Puffer
Qiagen, Hilden
TBE-Puffer
Merck, Darmstadt
Ethidium-Bromid
Sigma, Steinheim
Elektrophoresekammer
OWL,
Agarose
Qbiogene, USA
Kamera
Pabst, St. Georgen
2.9.7. Chemikalien
Phenol
Applichem, Darmstadt
Ethanol
Merck, Darmstadt
Isopropanol
Merck, Darmstadt
Chloroform
Merck, Darmstadt
Glukose
Merck, Darmstadt
SDS
Applichem, Darmstadt
32
2.Material und Methoden
2.9.8. Verbrauchsmaterialien
Galspipetten
Brand, Wertheim
Einmalpipetten
Falcon, USA
Pipettierakku
Pipetus-Akku, Hirschmann, Eberstadt
Greinerrörchen
Falcon, USA
Pipettenspitzen
Falcon, USA
Tubes
Biozym, Oldenburg
Zellkulturflaschen
Falcon, USA
2.9.9. Sonstige Geräte
Präzisionswaage
BP 2110, Sartorius, Göttingen
Mikrowelle
LG, England
33
3. Ergebnisse
3. Ergebnisse
3.1 Subtraktive Hybridisierung
3.1.1 RNA-Kontrolle
Mittels der gut etablierten und vielfach eingesetzten Methode von Chromzynski und
Sacchi erfolgte die RNA-Isolation. Da die RNA sehr anfällig für Abbau ist, die
Intaktheit jedoch von entscheidender Bedeutung für alle nachfolgenden Schritte ist,
wurde die Integrität jeder einzelnen RNA-Isolation vor der cDNA-Umschreibung
mittels Gelelektrophorese überprüft. In der folgenden Abbildung ist diese Intaktheit
anhand einiger RNA-Proben dokumentiert.
28S
18S
Abb 3.1: RNA-Proben von Isolationen aus verschiedenen Granulosazellpräparationen,
aufgetragen auf einem 1%-igen Agarosegel nach Ethidiumbromid-Färbung.
Man erkennt gut die distinkten Banden bei 4,5 und 1,9 kbp, die der 28S- und 18SFraktion der RNA entsprechen.
3.1.2 Rsa 1-Verdaukontrolle
Die Kontrolle dient zur Überprüfung des erfolgreichen Rsa 1-Verdaus, welcher kurze
ds-cDNA-Fragmente erzeugen soll. Die unverdaute cDNA erschien als breit gefächerte
Bande zwischen 0,5 und 10 kbp, die verdaute zwischen 0,1 und 2 kbp. Der Verdau war
somit erfolgreich.
34
3. Ergebnisse
3.1.3 Adaptorligationskontrolle
Diese Kontrolle wurde durchgeführt um zu überprüfen, ob ein ausreichender Anteil der
cDNA mit den Adaptoren ligiert wurde. Die Überprüfung erfolgt durch PCR unter
Verwendung des G3PDH-Primers. Es wird untersucht, ob sich bei Verwendung zweier
genspezifischen Primer (G3PDH-3` und 5`) nicht wesentlich schwächere Banden
zeigen, als bei Verwendung eines genspezifischen (G3PDH-3`) und eines PCRspezifischen Primers (PCR-Primer1).
Abb 3.2: dargestellt sind: 1:Tester 1-1 (Adaptor1-ligiert), G3PDH-3`-Primer und PCR-Primer 1;
2: Tester 1-1, G3PDH-3` und 5`-Primer; 3: Tester 1-2 (Adaptor2R-ligiert), G3PDH-3`-Primer und
PCR-Primer 2R; 4: Tester 1-2, G3PDH-3` und 5`-Primer. Wobei Tester der hCG-induzierten
cDNA entspricht.
Abb 3.3: dargestellt sind:1:Tester 1-1 (Adaptor1-ligiert), G3PDH-3`-Primer und PCR-Primer 1; 2:
Tester 1-1, G3PDH-3` und 5`-Primer; 3: Tester 1-2 (Adaptor2R-ligiert), G3PDH-3`-Primer und
PCR-Primer 2R; 4: Tester 1-2, G3PDH-3` und 5`-Primer. Wobei Tester der nicht hCG-induzierte
cDNA entspricht.
Damit die Effizienz der Subtraktion als nicht signifikant vermindert gilt, darf die
Intensität der Bande des PCR-Amplifikats der genspezifischen Primer nicht mehr als
um den Faktor 4 größer sein, als die Intensität der Bande unter Verwendung eines PCRund eines genspezifischen Primers. In diesem Fall ist diese Vorraussetzung mit
folgenden Verhältnissen erfüllt:
35
3. Ergebnisse
Abb 3.2:
Abb 3.3:
OD von Tester 1-1 mit genspezifischem Primer/mit PCR-Primer 1
3,3
OD von Tester 1-2 mit genspezifischem Primer/mit PCR- Primer 2R
3,4
OD von Tester 2-1 mit genspezifischem Primer/mit PCR- Primer 1
2,3
OD von Tester 2-2 mit genspezifischem Primer/mit PCR- Primer 2R
2,4
3.1.4 Analyse der Subtraktionseffizienz
Diese Kontrolle wurde durchgeführt um vor der weiteren Untersuchung der PCRAmplifikate zu überprüfen, ob auch tatsächlich in Tester und Driver gemeinsam
exprimierte Sequenzen subtrahiert worden sind.
Dazu wurde G3PDH verwendet, welches in Tester und Driver vorkommt und welches,
da es keine Schnittstelle für Rsa 1 aufweist, auch nach dem Verdau in amplifizierbarer
Form vorliegt. Es wurde eine PCR mit G3PDH-Primern durchgeführt, und subtrahierte
und unsubtrahierte cDNA als Template eingesetzt. Dabei wurden mehrere Ansätze
hergestellt, die bei unterschiedlichen Zykluszahlen gefahren wurden.
Abb 3.4: Darstellung der PCR-Amplifikation von G3PDH in der Subtraktion (oberes Bild) und
unsubtrahierten Kontrolle (unteres Bild). Die Proben wurden jeweils bei 18 (Bahn 1), 23 (Bahn 2),
28 (Bahn 3) und 33 (Bahn 4) Zyklen entnommen.
Es ist zu erkennen, dass sich in der subtrahierten Probe nur noch kaum nachweisbare
Mengen an Amplifikat befinden. Dies bedeutet, dass die Durchführung der SSH in
diesem Fall zur erfolgreichen Subtraktion von in Probe und Kontrolle (Tester und
Driver) vorkommender mRNA geführt hat.
36
3. Ergebnisse
3.1.5 PCR-Amplifikation
Zum Abschluß des PCR-Select-Verfahrens erfolgte die Amplifizierung der potentiell
differentiell exprimierten Gene. Die Amplifikate wurden nach Durchführung der
zweiten PCR auf ein 2%iges Agarosegel aufgetragen. Dabei zeigen sich in den
Amplifikaten der subtrahierten cDNA unterschiedliche Bandenmuster, als in den
Amplifikaten der unsubtrahierten cDNA. Diese Banden sollten unterschiedlich
exprimierten Genen entsprechen.
Abb. 3.5: Darstellung der PCR-Amplifikation nach Durchführung der Subtraktion. . Bahn 1
entspricht der subtrahierten Probe unter Einsatz induzierter Tester-cDNA,Bahn 2 der zugehörigen
Kontrolle. Bahn 3 entspricht der subtrahierten Probe unter Einsatz nicht-induzierter TestercDNA,Bahn, 4 der zugehörigen Kontrolle.
3.2 Klonierung
Die verschiedenen Fragmente wurden aus den Gelen eluiert, in Vektoren kloniert und
in kompetente E. coli transfiziert. Insgesamt wurden schließlich 23 unterschiedliche
Klone ausgewählt. Vor dem Aufbringen dieser auf der Membran zur Hybridisierung,
wurde nochmals untersucht, ob es sich bei den inserierten Fragmente tatsächlich um 23
verschiedene handelt. Dazu wurden mit einer PCR mit M13-Primern, für die der Vektor
kurz vor und nach der Insertionsstelle eine Bindungsstelle hat, die enthaltenen
Fragmente amplifiziert und auf einem Agarosegel begutachtet. Dies ist in Abb. 3.6 und
3.7 dargestellt.
37
3. Ergebnisse
Abb. 3.6: Darstellung der PCR-Amplifikate der Plasmid-Inserts nach Auftrennung in einem 1%igen Agarosegel und Anfärbung in Ethidiumbromid.
Abb. 3.7: Darstellung der PCR-Amplifikate der Plasmid-Inserts nach Auftrennung in einem 1%igen Agarosegel und Anfärbung in Ethidiumbromid.
Man erkennt, dass die amplifizierten Fragmente jeweils unterschiedliche Größen
aufweisen. Somit kann davon ausgegangen werden, dass keines doppelt kloniert
worden ist.
3.3 α-P32-Membran-Hybridisierungen und Auswertung
3.3.1 α-P32-Membran-Hybridisierung
In Abb. 3.8 sind zwei Membranen mit aufgetragener Vektor-DNA nach der
Hybridisierung mit radioaktiv markierten cDNA-Sonden dargestellt. Die Sonden
wurden dabei mit RNA aus induzierten (obere Membran) und nicht-induzierten
Granulosazellkulturen hergestellt. Die Vektor-DNA aller Klone wurde dabei in drei
absteigenden Konzentrationen (1μg/μl; 0,5μg/μl; 0,2 μg/μl) aufgetragen um
Sättigungseffekte zu vermeiden. Zusätzlich wurden alle Verdünnungen jeweils doppelt
aufgetragen.
38
3. Ergebnisse
Abb. 3.8: Dargestellt sind Dot Blot-Membranen nach Hybridisierung mit einer induzierten (oben)
und einer nicht induzierten (unten) radioaktiv markierten cDNA-Sonde. In dem gekennzeichneten
Bereich entsprechen dabei drei nebeneinander liegende Punkte von rechts nach links den
absteigenden Konzentrationen.
3.3.2 Auswertung
In Abb. 3.9 sind die Ergebnisse der semiquantitativen densitometrischen Auswertung
der α-P32-Membran-Hybridisierungen dargestellt. Die gezeigten Werte sind Mittelwerte
der Hybridisierungen mit mind. drei verschiedenen Sonden. Die statistische
Auswertung ergab für vier klonierte Vektoren einen signifikanten Unterschied in der
Intensität der Hybridisierung zwischen Probe und Kontrolle.
Dies bedeutet, dass die in diesen Vektoren enthaltenen Fragmente wahrscheinlich
Transkripte differentiell exprimierter Gene darstellen. Die Sequenzen dieser Fragmente
wurden daher analysiert.
39
3. Ergebnisse
Abb. 3.9: Darstellung der Intensitätsunterschiede in den Hybridisierungen. Dargestellt als
Mittelwerte ±Standardfehler (M±SEM). Für die gezeigten Werte liegen mind. drei
Hybridisierungen mit verschiedenen Sonden vor. * Signifikante Unterschiede im t-test (p<0,05).
3.4 Sequenzanalysen
In dem folgenden Kapitel sind die gefundenen Sequenzen und die Ergebnisse der
BLAST-Sequenzvergleiche dargestellt.
Bei den Sequenzdarstellungen sind die GAATTC-Sequenz des Vektors, welche
unmittelbar vor der Ligationsstelle liegt, sowie die Sequenzen der Adaptoren 1 bzw. 2R
markiert. Wie üblich entsprechen dabei die Großbuchstaben A und G den Nukleotiden
der Purinbasen Adenosin und Guanin, C und T stehen für die Pyrimidinbasen Cytosin
und Thymin.
Bei den BLAST-Sequenzvergleichen ist zuerst der Name der Sequenz zusammen mit
einer Identifikationsnummer der Datenbank angegeben. Darunter erfolgen Angaben
zum Auswertungsergebnis. Im Einzelnen bedeuten diese:
Identities: Gibt die Anzahl der Übereinstimmungen aus der Suchanfrage, bzw. des
verglichenen Bereiches daraus, mit der hinterlegten Sequenz wieder.
Gaps: Gibt an wie viele Nukleotide im Vergleich zum komplementären Strang fehlen.
Expect: Dieser Wert ist der wichtigste, denn er gibt an, mit welcher Wahrscheinlichkeit
40
3. Ergebnisse
die Suchanfrage tatsächlich mit der gefundenen Sequenz übereinstimmt. Der Wert stellt
im Prinzip die Wahrscheinlichkeit dar mit der die gefundenen Übereinstimmungen
zufällig sind und ist daher umso signifikanter je kleiner.
Schließlich erfolgt eine Darstellung der Sequenz der Suchanfrage zusammen mit der
hinterlegten komplementären direkt darunter. Übereinstimmungen zwischen den
Sequenzen werden durch Verbindungslinien zwischen den jeweiligen Nukleotiden
deutlich gemacht.
3.4.1 hHR23b
Das Insert in Klon 4B1 weist in seiner gesamten Länge eine sehr hohe
Übereinstimmung (99%) mit der mRNA von hHR23b auf. Der Ewartungswert
charakterisiert eine zufällige Übereinstimmung als unmöglich. Das zugehörige Gen
liegt auf Chromosom 9(9q31.2) und kodiert für ein 43,2 kDa großes Protein. hHR23b
ist ein Protein welches Teil des DNA-Reparaturmechnismus ist.
Adaptor 1
Primer 1 + 2
CCATTATACGTCTTCTTTATACCCCCTAAAACCCACTGGTACGAGCTCGGAT
CCCCATTAAGAAAAACAGTGTGCTGGAATTCTCCCTTTCGAGCGGCCGCCC
GGGCAGGTCACCCTGAAGACCCTCCAGCAGCAGACCTTCAAGATAGACATT
GACCCCGAGGAGACGGTGAAAGCACTGAAAGAGAAGATTGAATCTGAAAA
GGGGAAAGATGCCTTTCCAGTAGCAGGTCAAAAATTAATTTATGCAGGCAA
AATCCTCAATGATGATACTGCTCTCCAAGAATATAAAATTGATGAGAAAAA
CTTTGTGGTGGTTATGGTGACCAAACCCAAAGCAGTGTCCACACCAGCACC
AGCTACAACTCAGCAGTCAGCTCCTGCCAGCACTACAGCAGTTACTTCCTCC
ACCACCACAACTGTGGCTCAGGCTCCAACCCCTGTCCCTGCCTTGGCCCCCA
CTTCCACACCTGCATCCATCACTCCAGCATCAGCGACAGCATCTTCTGAACC
TGCACCTGCTAGTGCAGCTAAACAAGAGCAAGCCTGCAGAAAAGCCAGCA
GAGACACCAAGTGGGTACTAGCCCAACAGCAACTGGACAATACCTCGGCC
GCGACTAAGCTAAGGGCGAATTCTGCAGATATCCCATCCACTGGCGGGTCG
CTCGAGCATGCATCTAGAGGGCCCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTA
CAATTTACTGGGCCGTCCGTTTTACAACGACGAGACTGGGAAAACCCTGGC
GGTTTCCCAACTTAATCGCCTTGCAAGAAAATCCGCCCTTTCGTCAACTGGC
GTAATAAAGAAGAAGCCGTACCGATCGTCCTCCCTA
>gi|51173731|ref|NM_002874.3| Homo sapiens RAD23 homolog B (RAD23B), mRNA
Length = 4130
Score = 930 bits (469), Expect = 0.0
Identities = 489/493 (99%), Gaps = 2/493 (0%)
Strand = Plus / Plus
41
3. Ergebnisse
Query: 106 gcaggtcaccctgaagaccctccagcagcagaccttcaagatagacattgaccccgagga
165
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 370 gcaggtcaccctgaagaccctccagcagcagaccttcaagatagacattgaccccgagga
429
Query: 166 gacggtgaaagcactgaaagagaagattgaatctgaaaaggggaaagatgcctttccagt
225
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 430 gacggtgaaagcactgaaagagaagattgaatctgaaaaggggaaagatgcctttccagt
489
Query: 226 agcaggtcaaaaattaatttatgcaggcaaaatcctcaatgatgatactgctctccaaga
285
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||
Sbjct: 490 agcaggtcaaaaattaatttatgcaggcaaaatcctcaatgatgatactgctctcaaaga
549
Query: 286 atataaaattgatgagaaaaactttgtggtggttatggtgaccaaacccaaagcagtgtc
345
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 550 atataaaattgatgagaaaaactttgtggtggttatggtgaccaaacccaaagcagtgtc
609
Query: 346 cacaccagcaccagctacaactcagcagtcagctcctgccagcactacagcagttacttc
405
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 610 cacaccagcaccagctacaactcagcagtcagctcctgccagcactacagcagttacttc
669
Query: 406 ctccaccaccacaactgtggctcaggctccaacccctgtccctgccttggcccccacttc
465
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 670 ctccaccaccacaactgtggctcaggctccaacccctgtccctgccttggcccccacttc
729
Query: 466 cacacctgcatccatcactccagcatcagcgacagcatcttctgaacctgcacctgctag
525
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 730 cacacctgcatccatcactccagcatcagcgacagcatcttctgaacctgcacctgctag
789
Query: 526 tgcagctaaacaagagcaagcctgcagaaaagccagcagagacaccaagtgggtactagc
585
|||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||| ||||| |||||||
Sbjct: 790 tgcagctaaacaagag-aagcctgcagaaaagccagcagagacacc-agtggctactagc
847
Query: 586 ccaacagcaactg 598
|||||||||||||
Sbjct: 848 ccaacagcaactg 860
3.4.2 ribosomal protein S6
42
3. Ergebnisse
Das Insert in Klon 4B1 weist in seiner gesamten Länge eine sehr hohe
Übereinstimmung (98%) mit der mRNA von ribosomal protein S6 auf. Der
Ewartungswert charakterisiert eine zufällige Übereinstimmung als unmöglich. Das
zugehörige Gen liegt auf Chromosom 9(9p21) und kodiert für ein 28,7 kDa großes
Protein. ribosomal protein S6 ist ein Protein welches Teil der Proteinsynthese ist.
Adaptor 1
Primer 1 + 2
GAANTCTNNGGGCGAATTGGGCCCTCTAGATGCATGCTCGAGCGGCCGCCA
GTGTGATGGATATCTGCAGAATTCGCCCTTAGCGGCCGCCCGGGCAGGTAC
GCTGCTTCTTCAGAGCAATACGCCGCCGTTTGTGCTGCAGGACACGTGGAG
TAACAAGACGCTGAATCTTGGGTGCTTTGGTCCTAGGTTTCTTACCTTCTTT
ATTTAAGGGCTTTCTTACAACATACTGGCGGACATCATCTTCTTTAGAGAGA
TTGAAAAGTTTGCGGATTCTGCTAGCTCTTTTGGGGCCCAGGCGGCGAGGC
ACTGTAGTATCAGTCAGTCCAGGAATATCCTTCTCTCCTTTTTTTACAATAA
CCAAGTTGAGAACGCTCAGATTTGCATCCACAATGCAACCACGAACTGATT
TTCTCTTTCTTTCTCCAGTTCTCCTTGGTCTGTAACAGGAATGCCCCTTACTC
AGTAGCAGGCGGACACGGCCATGGGTCAAGACACCCTGCTTCATGGGGAA
ACCTTGTTTGTCGTTCCCACCACTGATTCGGACCACATAACCCTTCCATTCTT
CACCCAGAGCGTCAGCAGCAACTTCTGTGGCCATACGCTTCTCATAGAAGG
TACCTCGGCCGCGACCACGCTAAGGGCGAATTCCAGCACACTGGCGGCCGT
TACTAGTGGATCCGAGCTCGGTACCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGC
TGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCA
>gi|34785047|gb|BC009427.2| Homo sapiens ribosomal protein S6, mRNA (cDNA
clone IMAGE:3545844),
partial cds
Length = 808
Score = 989 bits (499), Expect = 0.0
Identities = 516/524 (98%)
Strand = Plus / Plus
Query: 74
133
Sbjct: 69
128
gtaccttctatgagaagcgtatggccacagaagttgctgctgacgctctgggtgaagaat
|||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
gtactttctatgagaagcgtatggccacagaagttgctgctgacgctctgggtgaagaat
Query: 134 ggaagggttatgtggtccgaatcagtggtgggaacgacaaacaaggtttccccatgaagc
193
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 129 ggaagggttatgtggtccgaatcagtggtgggaacgacaaacaaggtttccccatgaagc
188
Query: 194 agggtgtcttgacccatggccgtgtccgcctgctactgagtaaggggcattcctgttaca
253
43
3. Ergebnisse
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 189 agggtgtcttgacccatggccgtgtccgcctgctactgagtaaggggcattcctgttaca
248
Query: 254 gaccaaggagaactggagaaagaaagagaaaatcagttcgtggttgcattgtggatgcaa
313
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 249 gaccaaggagaactggagaaagaaagagaaaatcagttcgtggttgcattgtggatgcaa
308
Query: 314 atctgagcgttctcaacttggttattgtnnnnnnnggagagaaggatattcctggactga
373
||||||||||||||||||||||||||||
|||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 309 atctgagcgttctcaacttggttattgtaaaaaaaggagagaaggatattcctggactga
368
Query: 374 ctgatactacagtgcctcgccgcctgggccccaaaagagctagcagaatccgcaaacttt
433
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 369 ctgatactacagtgcctcgccgcctgggccccaaaagagctagcagaatccgcaaacttt
428
Query: 434 tcaatctctctaaagaagatgatgtccgccagtatgttgtaagaaagcccttaaataaag
493
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 429 tcaatctctctaaagaagatgatgtccgccagtatgttgtaagaaagcccttaaataaag
488
Query: 494 aaggtaagaaacctaggaccaaagcacccaagattcagcgtcttgttactccacgtgtcc
553
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 489 aaggtaagaaacctaggaccaaagcacccaagattcagcgtcttgttactccacgtgtcc
548
Query: 554 tgcagcacaaacggcggcgtattgctctgaagaagcagcgtacc 597
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 549 tgcagcacaaacggcggcgtattgctctgaagaagcagcgtacc 592
3.4.3 gamma-Aktin 1
Das Insert in Klon F4 weist eine sehr hohe Übereinstimmung (99%) mit der mRNA
von gamma-Aktin 1 auf. Der Ewartungswert ist der höchste aller durchgeführten
Sequenzvergleiche, was am ehesten auf die relative Kürze des Fragments
zurückzuführen ist. Unmittelbar zwischen Adaptor 2R und der übereinstimmenden
Sequenz findet sich in diesem Insert ein Poly-A-Schwanz.
44
3. Ergebnisse
Das zugehörige Gen liegt auf Chromosom 17(17q25) und kodiert für ein 41,7 kDa
großes Protein. Gamma-Aktin ist ein Protein welches Teil des Cytoskeletts ist.
Adaptor 2R
Primer 1 + 2
CTTNGTNCGNGCTGGATCCACCTAGNTAACGGCCGCCAGCTGATGCTGGAA
TTCGCCCTTAGCGTGGTCGCGGCCGAGGTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAANAAAAAAAGAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAGCTTGTACCTGCCCGGGCGGCCGCTCGAAACTGGA
ATAAGCCTTCNAAAANAAATTGTCCTTGAAGCTTGTATCTGATATCANCACT
GGATTGTAAAACTTGTTGCTGATTTTGACCTTGTATTGAAGTTAACTGTTCC
CCTTGGNATTTGTTTAATACCCTGTACCTCGGCCGCACCACGCTAAGG
>gi|34782781|gb|BC018861.2|
IMAGE:3141563)
Length = 1378
Homo sapiens actin, gamma 1, mRNA (cDNA clone
Score = 196 bits (99), Expect = 3e-47
Identities = 131/136 (96%)
Strand = Plus / Plus
Query: 190 cgaaactggaataagccttcnaaaanaaattgtccttgaagcttgtatctgatatcanca
249
|||||||||||||||||||| |||| ||||||||||||||||||||||||||||||| ||
Sbjct: 720 cgaaactggaataagccttcgaaaagaaattgtccttgaagcttgtatctgatatcagca
779
Query: 250 ctggattgtaaaacttgttgctgattttgaccttgtattgaagttaactgttccccttgg
309
|||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 780 ctggattgtagaacttgttgctgattttgaccttgtattgaagttaactgttccccttgg
839
Query: 310 natttgtttaataccc 325
|||||||||||||||
Sbjct: 840 tatttgtttaataccc 855
3.4.4 BNP
Das Insert in Klon G4 weist eine sehr hohe Übereinstimmung (99%) mit der mRNA
von BNP auf. Der Ewartungswert charakterisiert eine zufällige Übereinstimmung als
sehr unwahrscheinlich. Das zugehörige Gen liegt auf Chromosom 1(1p36.2) und
45
3. Ergebnisse
kodiert für ein 14,7 kDa großes Protein. BNP ist ein Peptidhormon welchem eine
regulatorische Funktion im Wasser- und Elekrolyhaushalt zukommt.
Adaptor 2R
Primer 1 + 2
GGGCGAATTGGGCCCTCTAGATGCATGCTCGAGCGGCCGCCAGTGTGATGG
ATATCTGCAGAATTCGCCCTTAGCGTGGTCGCGGCCGAGGTACGAATACAG
ACCGTGAAAGCGGGGCCTCACGATCCTTCTGACCTTTTGGGTTTTAAGCAG
GAGGTGTCAGAAAAGTTACCACAGGGATAACTGGCTTGTGGCGGCCAAGC
GTTCATAGCGACGTCGCTTTTTGATCCTTCGATGTAGGCTCTTCCTATCATTG
TGAAGCAGAATTCACCAAGCGTTGGATTGTTCACCCACTAATAGGGAACGT
GAGCTGGGTTTAGACCGTCGTGAGACAGGTTAGTTTTACCCTACT
>gi|16553850|dbj|AK057879.1| Homo sapiens cDNA FLJ25150 fis, clone CBR07695,
highly similar to
Homo sapiens BNPI mRNA for brain-specific Na-dependent
inorganic phosphate cotransporter
Length = 1887
Score = 557 bits (281), Expect = e-155
Identities = 291/295 (98%)
Strand = Plus / Plus
Query: 99
gtacgaatacagaccgtgaaagcggggcctcacgatccttctgaccttttgggttttaag 158
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 1181 gtacgaatacagaccgtgaaagcggggcctcacgatccttctgaccttttgggttttaag
1240
Query: 159
caggaggtgtcagaaaagttaccacagggataactggcttgtggcggccaagcgttcata 218
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 1241 caggaggtgtcagaaaagttaccacagggataactggcttgtggcggccaagcgttcata
1300
Query: 219
gcgacgtcgctttttgatccttcgatgtaggctcttcctatcattgtgaagcagaattca 278
|||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 1301 gcgacgtcgctttttgatccttcgatgtcggctcttcctatcattgtgaagcagaattca
1360
Query: 279
ccaagcgttggattgttcacccactaatagggaacgtgagctgggtttagaccgtcgtga 338
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct: 1361 ccaagcgttggattgttcacccactaatagggaacgtgagctgggtttagaccgtcgtga
1420
Query: 339
gacaggttagttttaccctactgatgatgtgttgttgccatgnnaatccttctca 393
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||| ||||
Sbjct: 1421 gacaggttagttttaccctactgatgatgtgttgttgccatggtaatcctgctca 1475
46
3. Ergebnisse
Die Informationen zu den einzelnen Genen stammen aus der Human Protein Reference
Database (www.hprd.org).
3.5 RT-PCR
3.5.1 Semiquantitative densitometrische Auswertung mittels Normalisierung durch die
GAPDH-Expression
Da unterschiedlich eingesetzte cDNA-Konzentrationen das Ergebnis der RT-PCR
verfälschen könnten, wurden die Werte der Proben durch Abgleich mit den Werten des
Ansatzes
von
simultan
amplifiziertem
GAPDH
(Glycerinaldehyd-3-Phosphat-
Dehydrogenase) kontrolliert.
Bei GAPDH handelt es sich um ein sog. „house-keeping-gene“, welche konstitutiv
exprimierte Gene darstellen. Sie werden in allen Zellen gleichmäßig exprimiert, da die
kodierten Proteine grundlegenden Eigenschaften des Zellhaushaltes dienen. Sie bleiben
daher auch durch die hCG-Exposition in ihrer Transkriptionsrate unbeeinflusst. Diese
Aussagen sind auf der folgenden Abbildung verdeutlicht. Dargestellt sind GAPDHBanden unterschiedlicher Proben und Kontrollen, die sich in ihrer Intensität nicht
wesentlich unterscheiden.
P
K
P
K
P
K
P
K
P
K
P
K
Abb. 3.10: Nachweis der spezifischen GAPDH-Expression der untersuchten humanen
Granulosazellen
durch RT-PCR. Es wurden 6 verschiedene Granulosazellpräparationen
eingesetzt, jeweils mit (P) und ohne (K) hCG-Stimulation. Darstellung der Banden bei 657bp nach
Anfärbung in Ethidiumbromid.
47
3. Ergebnisse
3.5.2 Ermittlung der Zykluszahl
Für die korrekte Interpretation der Ergebnisse ist entscheidend, dass der Vergleich von
Probe und Kontrolle zu einem Zeitpunkt stattfindet an dem die Amplifikationsrate
beider Ansätze noch im exponentiellen Bereich liegt. Nach Erreichen des
Sättigungsbereiches würden Unterschiede zwischen den Proben und Kontrollen
ausgeglichen werden. Dieser Zeitpunkt wird jedoch bei individuellen Zykluszahlen
erreicht, abhängig von der Effektivität der PCR und der Ausgangsmenge an cDNA im
jeweiligen Template.
Deshalb wurde für jedes Template die optimale Zykluszahl ermittelt, indem zu
unterschiedlichen Zeitpunkten der PCR Amplifikate entnommen wurden. Dies wird mit
nachfolgender Abbildung am Beispiel von GAPDH verdeutlicht.
Abb. 3.11: Darstellung der spezifischen GAPDH-Expression der untersuchten humanen
Granulosazellen bei unterschiedlichen Zykluszahlen (20, 25, 27, 30, 33 Zyklen) durch RT-PCR.
Darstellung der Banden bei 657bp nach Anfärbung in Ethidiumbromid.
In diesem Fall befindet sich die Amplifikationsrate bei 27 Zyklen noch im
exponentiellen Bereich, sodass diese Zykluszahl für die PCR mit GAPDH verwendet
wurde.
3.5.3 Durchführung und Statistische Auswertung
3.5.3.1 Überprüfung des Einflusses von hCG auf die hHR23b-mRNA-Expression in
humanen Granulosazellen
Zum Nachweis der hCG-abhängigen Regulation der hHR23b-mRNA-Expression in
induzierten und nicht induzierten Granulosazellkuturen wurde eine RT-PCR
durchgeführt. Die Primer wurden anhand der analysierten Sequenz so gewählt, dass ein
bp großes Fragment amplifizert werden kann. In Abb. 3.12 ist zu erkennen, dass die
48
3. Ergebnisse
Banden der induzierten Proben (P) stärker gefärbt sind, als die der nicht induzierten
Kontrolle (K).
Die statistische Überprüfung der densitometrischen Auswertung des Bildes ergab einen
signifikanten Unterschied der Intensität der Bandenfärbung von Probe und Kontrolle
(p=0,049). Dies ist in Abb. 3.13 dargestellt.
Abb. 3.12: Nachweis der spezifischen Transkriptionsprodukte von hHR23b in humanen
Granulosazellen
durch RT-PCR. Darunter sind die zur Normalisierung eingesetzten
korrespondierenden GAPDH-Banden abgebildet. Darstellung der Banden nach Anfärbung in
Ethidiumbromid.
Abb. 3.13: Densitometrische Auswertung der hHR23b-mRNA-Expression in humanen
Granulosazellen. Die Daten sind als Mittelwert von fünf Proben und den zugehörigen Kontrollen
±Standardfehler (M±SEM) dargestellt. Die Unterschiede sind im t-Test signifikant (p=0,049)
49
3. Ergebnisse
3.5.3.2 Überprüfung des Einflusses von hCG auf die γ-Actin-mRNA-Expression in
humanen Granulosazellen
Die Überprüfung des hCG-Einflusses auf die γ-Actin-mRNA-Expression in humanen
Granulosazellen erfolgte mittels RT-PCR. Dazu wurden aus den Sequenzdaten Primer
gewählt unter deren Verwendung ein 112bp großes Fragment amplifiziert werden kann.
Die Banden dieser Amplifikation, aufgetrennt auf einem Agarosegel und nach Färbung
in Ethidiumbromid sind in Abb. 3.14 dargestellt. Dabei ist zu erkennen, dass zwischen
den Intensitäten der induzierten Proben (P) und nicht induzierten Kontrollen (K) kein
wesentlicher Unterschied besteht.
Die statistische Auswertung der densitometrisch ermittelten Werte dieser Intensitäten
bestätigt diesen Eindruck. Dies ist in Abb. 3.15 verdeutlicht.
P
K
P
K
P
K
P
K
Abb. 3.14: Nachweis der spezifischen Transkriptionsprodukte von γ-Actin in humanen
Granulosazellen
durch RT-PCR. Darunter sind die zur Normalisierung eingesetzten
korrespondierenden GAPDH-Banden abgebildet. Darstellung der Banden nach Anfärbung in
Ethidiumbromid.
50
3. Ergebnisse
Abb. 3.15: Densitometrische Auswertung der γ-Actin-mRNA-Expression in humanen
Granulosazellen. Die Daten sind als Mittelwert von fünf Proben und den zugehörigen Kontrollen
±Standardfehler (M±SEM) dargestellt. Die Unterschiede sind im t-Test nicht signifikant (p=0,62)
3.5.3.3 Überprüfung des Einflusses von hCG auf die rP S6-mRNA-Expression in
humanen Granulosazellen
Zur Überprüfung der Abhängigkeit der rP S6-mRNA-Expression von hCG in humanen
Granulosazellen wurde eine RT-PCR durchgeführt. Die Banden des 414bp grossen
Transkriptionsprodukts, welches unter Verwendung von spezifischen Primern
amplifiziert werden konnte sind in Abb. 3.16 dargestellt. Zwar weisen die Banden im
Gegensatz zu den Banden von simultan amplifizierten GAPDH (unteres Bild in Abb
3.16), unterschiedliche Intensitäten von Probe und Kontrolle auf, doch sind diese
Unterschiede nicht signifikant.
Das Ergebnis dieser statistischen Auswertung der densitometrisch ermittelten
Intensitäten wird in Abb. 3.17 dargestellt.
51
3. Ergebnisse
Abb. 3.16: Nachweis der spezifischen Transkriptionsprodukte von rP S6 in humanen
Granulosazellen
durch RT-PCR. Darunter sind die zur Normalisierung eingesetzten
korrespondierenden GAPDH-Banden abgebildet. Darstellung der Banden nach Anfärbung in
Ethidiumbromid.
Abb. 3.17: Densitometrische Auswertung der rP S6 -mRNA-Expression in humanen
Granulosazellen. Die Daten sind als Mittelwert von fünf Proben und den zugehörigen Kontrollen
±Standardfehler (M±SEM) dargestellt. Die Unterschiede sind im t-Test nicht signifikant (p=0,383)
3.5.3.4 Überprüfung des Einflusses von hCG auf die BNP-mRNA-Expression in
humanen Granulosazellen
Inwieweit
hCG
die
Regulation
der
BNP-mRNA-Expression
in
humanen
Granulosazellen beeinflusst wurde mittels RT-PCR überprüft. Dazu wurden Primer
ausgewählt deren Einsatz in der RT-PCR ein 136bp großes Fragment erzeugt. Die dabei
entstandenen Amplifikate sind in Abb. 3.18 dargestellt. Es ist zu erkennen, dass sich die
52
3. Ergebnisse
Banden der hCG-induzierten Proben und der nicht induzierten Kontrollen, ähnlich wie
bei dem darunter dargestellten simultan amplifizierten GAPDH, in ihrer Intensität nicht
wesentlich unterscheiden.
P
K
P
K
P
K
P
K
P
K
Abb. 3.18: Nachweis der spezifischen Transkriptionsprodukte von BNP in humanen
Granulosazellen
durch RT-PCR. Darunter sind die zur Normalisierung eingesetzten
korrespondierenden GAPDH-Banden abgebildet. Darstellung der Banden nach Anfärbung in
Ethidiumbromid.
Die statistische Überprüfung der Werte in der densitometrischen Auswertung,
dargestellt in Abb. 3.19, ergab dementsprechend auch keinen statistisch signifikanten
Unterschied.
Abb.
3.19:
Densitometrische
Auswertung
der
BNP-mRNA-Expression
in
humanen
Granulosazellen. Die Daten sind als Mittelwert von fünf Proben und den zugehörigen Kontrollen
±Standardfehler (M±SEM) dargestellt. Die Unterschiede sind im t-Test nicht signifikant (p=0,434)
53
3. Ergebnisse
3.6 Zusammenfassung der Ergebnisse
Zum Nachweis von durch hCG induzierten Genexpressionsveränderungen in humanen
Granulosazellen wurde in der vorliegenden Arbeit die SSH verwendet. Während der
Durchführung dieser Methode wurden Kontrollen der Adaptorligation und der
Subtraktionseffizienz durchgeführt, diese waren in beiden Fällen erfolgreich.
Nach Durchführung der SSH wurden insgesamt 23 Transkripte in Vektoren kloniert.
Von diesen wiederum erschienen vier in der radioaktiven Membranhybridisierung als
potentiell differentiell exprimiert und wurden sequenziert.
Bei den sequenzierten Transkripten handelt es sich um hHR23B, γ-Aktin, rP S6 und
BNP. Im Fall von hHR23b konnte mittels PCR bewiesen werden, dass dieses durch den
Einfluß von hCG auf humane Granulosazellkulturen in vitro signifikant erhöht
exprimiert wird. Diese Verhältnisse sind in nachfolgender Tabelle noch einmal
verdeutlicht.
Anzahl der untersuchten Transkripte
23
Anzahl der im Dot-Blot differentiell erscheinenden Transkripte
4
Anzahl der mittels RT-PCR als differentiell exprimiert verifizierten Gene
1
54
4. Diskussion
4. Diskussion
4.1. Methodik
Der differentiellen Expression von Genen kommt die entscheidende Bedeutung in einer Reihe
von biologischen Prozessen zu. In verschiedenen Entwicklungsstadien, in unterschiedlichen
Geweben und in pathologischen Erscheinungen können diese Veränderungen beobachtet
werden. Zusätzlich können stimulatorische oder inhibitorische Effekte Einfluss auf die
Expressionsrate von Genen in einer Zellpopulation nehmen, und die Zellfunktion so an
veränderte Umstände anpassen.
Die Identifikation von expressionsveränderten Genen ermöglicht ein besseres Verständnis
dieser Prozesse. Daher wurden eine Reihe unterschiedlicher Methoden entwickelt um diese
Veränderungen nachzuweisen.
Die Auswahl der geeigneten Methode stellte den ersten Schritt zum Gelingen dieser Arbeit
dar. Daher wurden die Vor- und Nachteile dieser Methoden und ihre Anwendungsgebiete vor
Beginn der Arbeit anhand der Literatur und publizierter Experimente evaluiert. Die daraus
resultierenden Ergebnisse dieser Literaturrecherche sollen im Folgenden erörtert werden und
führten letztlich zur Auswahl der Supressive Subtractive Hybridization.
4.1.1. Differential Display
Der Differential Display wurde ursprünglich von Liang et al. als „RNA fingerprinting by
arbitrarily primed PCR“ beschrieben (Liang und Pardee, 1992), und findet seitdem breite
Anwendung. Die Methode wurde genutzt, um Unterschiede in der Genexpression zweier oder
mehrerer Zellpopulationen zu untersuchen. Dabei wird die gesamte mRNA isoliert, in cDNA
umgeschrieben und auf einem Gel separiert, um die Sequenzen zu isolieren, die
unterschiedlich repräsentiert werden.
Differential Display eignet sich gut für wenig komplexe mRNA-Populationen. Bei höher
komplexen mRNA-Gemischen ist der optische Vergleich der cDNA Bandenmuster erheblich
erschwert, da die Auflösung der Banden auf Grund deren hohen Anzahl niedrig wird.
55
4. Diskussion
Komplette Repräsentationen einer komplexen mRNA Population mit angemessener
Auflösung der Banden sind daher mit einem extrem hohen Arbeitsaufwand verbunden.
Die Durchführung des Differential Displays gelingt in wenigen Tagen und erlaubt es, in
einem Ansatz herauf- und herabregulierte Transkripte zu isolieren. Die Methode wird
allerdings von einigen Nachteilen begleitet:
•
Es muss ein hoher Aufwand betrieben werden, um alle Sequenzen zu vergleichen
(Vedoy et al. 1999);
•
Erhöhte Häufigkeit von falsch positiven Ergebnissen (von bis zu 70 %). Ursachen
dafür
können
beispielweise
die
PCR-Bedingungen
oder
eine
mangelnde
elektrophoretische Auftrennung unterschiedlicher cDNAs einer Bande sein (Callard et
al. 1994, Mou et al. 1994, Sun et al. 1994)
•
In vielen Fällen entsprechen die Fragmente den 3´-Enden des zugrunde liegenden
RNA-Strangs (oftmals nicht transkribierte Regionen), sodass die Transkripte nicht
ihren Genen zugeordnet werden können;
•
Zusätzlich weist der Differential Display eine Bevorzugung der stark amplifizierten
mRNAs auf, somit können Gene mit geringer Abundanz nur schwer isoliert werden
(Bertoli et al. 1995).
Vorteile des Differential Display sind die rasche Durchführbarkeit der Methode, die geringe
Menge an mRNA, die benötigt wird und die Möglichkeit, gleichzeitig auf einem Gel
induzierte und reprimierte mRNAs mehrerer Zellpopulationen zu identifizieren, im Gegensatz
zur subtraktiven Hybridisierung, bei der nur zwei Zellpopulationen gleichzeitig ins Auge
gefasst werden können. Es gibt heutzutage Weiterentwicklungen dieser Methode, die die
Vorteile der subtraktiven Hybridisierung mit denen des „differential display“ kombinieren,
um so die Nachteile der einzelnen Methoden zu kompensieren.
Die Methode wurde unter anderem dazu eingesetzt, bekannte und neue krebsassoziierte
(Miller et al. 1999; Xin et al. 2000) und infektionsassoziierte (Domachowske et al. 2000)
56
4. Diskussion
Transkripte zu identifizieren, und solche in normaler (Furusawa et al. 2000) und gestörter
(Copie-Bergman et al. 2000) Hämatopoese.
4.1.2. SAGE
SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) wurde 1995 von Velculescu et al. beschrieben.
Die Methode ermöglicht es viele Transkripte in einem einzelnen Klon zu sequenzieren und
erlaubt quantitative Aussagen durch mathematische Auswertung der Häufigkeit des
Auftretens eines einzelnen Transkripts (Velculescu et al. 1995).
Durch ein kompliziertes Verfahren werden die cDNAs durch die Summe ihrer SAGE-Tags
repräsentiert. Jeder Repräsentant wird dann sequenziert. Das Ergebniss des darauffolgenden,
vom Computer unterstützten Vergleichs der beiden Pools von SAGE-Tags, weist auf eine
mögliche differentielle Genexpression hin. Die mRNAs werden dabei zuerst mit biotinylierten
Oligo-dT-Primern in cDNAs umgeschrieben. Die cDNAs werden dann mit einer 4-Basen
Endonuklease geschnitten und die Fragmente, an die Biotin gebunden ist, mit Streptavidin
isoliert. Die biotinylierten cDNAs werden dann in zwei Pools verteilt und anschließend mit
zwei Adaptoren versehen, die die Erkennungssequenz eines Typ-2 Enzyms tragen. Die Typ-2
Enzyme schneiden DNA-Sequenzen an den Stellen, die in einer bestimmten Distanz (8-15
Basen) zu ihrer Erkennungssequenz liegen (Szybalski, 1985). Nach der Restriktion mit dem
Typ-2 Enzym ergeben sich dann Fragmente, die die Adaptorsequenz und einen kurzen Teil
einer cDNA (5-10 Basen) enthalten. Dieser mit Adaptor verbundene cDNA-Teil ist für jede
cDNA spezifisch und wird als deren SAGE-Tag bezeichnet. Die SAGE-Tags aus beiden
Pools werden dann zusammenligiert und die dabei entstandenen Ditags durch PCR
amplifiziert. Als Primer dafür dienen die Sequenzen der beiden Adaptoren. Die amplifizierten
Ditags werden dann mit der gleichen Endonuklease geschnitten, danach gereinigt und
kloniert.
Es dauert durchschnittlich 2-3 Monate, um mit SAGE das Expressionsprofil eines
eukaryotischen Organismus herzustellen.
Die Nachteile von SAGE liegen in der Schwierigkeit der technischen Durchführung, da unter
anderem das sehr exakte Sequenzieren einer großen Anzahl kleiner Bruchstücke eine
wesentliche Rolle spielt. Auch die Kosten der Laborausstattung sind hoch.
57
4. Diskussion
4.1.3. Mikrochips
Die Hybridisierung von DNA-Chips mit RNA- oder cDNA-Proben, ist eine neue Methode,
die es erlaubt sehr schnell, sehr viele Gene auf ihr Expressionsmuster hin zu untersuchen
(Lennon et al. 1996). Die Industrialisierung molekularbiologischer Methoden wie der
Sequenzierung oder der Oligonukleotidsynthese ermöglicht dieses Vorgehen. Durch die
computergestützte Auswertung können zwar Gene sehr geringer Abundanz aufgefunden
werden (Lockhart et al. 1996), allerdings erfordert dies einen sehr hohen technischen und
finanziellen Aufwand.
Der Nachteil von Mikrochips besteht im Wesentlichen darin, dass es sich um ein
geschlossenes Vorgehen handelt; es können nur Gene untersucht werden, die zuvor
aufgebracht wurden. Daraus ergibt sich, dass diese Methode keine unbekannten oder
unerwarteten Gene zum Vorschein bringen kann (Carulli et al. 1998), und sich vor allen
Dingen eignet, klar umschriebene Gruppen von Genen und Genfamilien auf ihre Expression
zu untersuchen.
4.1.4. Suppressive Subtractive Hybridization (SSH)
Die SSH wurde 1996 von Diatchenko beschrieben und stellt eine neue und fortgeschrittene
Methode dar (Diatchenko et al. 1996).
Die Anwendung der SSH bietet wesentliche Vorteile gegenüber anderen Methoden der
differentiellen Expressionsanalyse:
•
Sie ermöglicht die exponentielle Amplifikation aller differentiell exprimierten
Sequenzen, unabhängig davon ob sie von stark oder schwach exprimierten Genen
abstammen, da durch einen Normalisierungsschritt die Abundanz aller Transkripte
angeglichen wird.
•
Die hohe Amplifikationsrate erlaubt eine Identifizierung seltener Transkripte, dies
hebt die SSH besonders von den anderen Methoden ab. Seltene Transkripte kann
jedoch entscheidende Bedeutung in der Regulation von Zellprozessen zukommen.
Gurskaya et al. schlug daher eine Normalisierung vor, d.h. die cDNA-Konzentration
58
4. Diskussion
anzugleichen. Dies hat ihm zufolge während der Subtraktion zu geschehen. Da somit
gewährleistet ist, dass weder differentielle Transkripte verloren gehen, noch seltene
Transkripte überproportioniert werden. (Gurskaya et al. 1996)
•
Mit der SSH lassen sich geringe Änderungen der Transkriptionsrate aufzeigen.
Groenik et al. berichten von sehr geringen Unterschieden mit nur 1,5-fachen
Veränderungen, obwohl Unterschiede im über 5-fachen Bereich wahrscheinlicher sind
entdeckt zu werden (Wan et al. 2002).
•
In einem von Bertram et al. durchgeführten Vergleich mit dem Differential Display
erwies sich die SSH als zuverlässigere und schnellere Alternative (Bertram et al.
1998).
•
Es handelt sich um ein offenes System, das heißt es können sowohl bekannte als auch
unbekannte und unerwartete Sequenzen isoliert werden. Durch die SSH können somit
auch Sequenzen gefunden werden, deren Funktion auch nach der Entschlüsselung des
Genoms nicht bekannt ist und deren Auffinden ein erster Hinweis auf ihre Funktion
sein könnte.
Ein Nachteil der subtraktiven Hybridisierung ist die Notwendigkeit, in „beide Richtungen“
subtrahieren zu müssen, damit in beiden Zellpopulationen erhöhte Mengen an mRNAs
ausfindig gemacht werden können. In „beide Richtungen“ subtrahieren bedeutet, daß beide
Zellpopulationen sowohl einmal Tester als auch einmal Driver sein müssen. Dies ist ein
deutlicher zeitlicher und materieller Mehraufwand im Gegensatz zum Differential Display,
bei dem gleichzeitig auf einem Gel reprimierte und induzierte mRNAs zu erfassen sind. Ein
weiterer Nachteil ist in der Unvollständigkeit der Subtraktion zu sehen. Zu viele
Subtraktionsrunden wären erforderlich, um sämtliche Unterschiede komplexer Gewebe zu
erfassen (Sagerström et al. 1997).
Im Bereich der Gynäkologie wurde die SSH bereits mehrfach eingesetzt. Fujimoto et al.
beschrieben 1996 die Notwendigkeit von Transglutaminase für progesteroninduzierte
Dezidualisierung
in
humanen
Endometriumsstromazellen
(Fujimoto
et
al.
1996).
Untersuchungen der Plazentabildung brachten neue (Dakour et al. 1997) und bekannte
Morrish et al. 1996) Gene zum Vorschein. Unter den bekannten waren unter anderem
59
4. Diskussion
humanes α-Choriongonadotrophin, 3-β-hydroxysteroid Dehydrogenase und Plasminogen
Aktivator Inhibitor Typ 1, denen bereits früher eine Rolle in der Plazentabildung
zugeschrieben wurde. Robert et al. nutzten die SSH für Untersuchungen von Granulosazellen
von bovinen Follikeln in verschiedenen Entwicklungsstadien (Robert et al. 2001), in ihren
Ergebnissen fand sich unter anderem MMP (Matrix-Metalloproteinase), ein Gen von dem
bekannt ist den Follikel zu modulieren (Einspanier et al. 1999). Die Methode wurde des
Öfteren zu Untersuchungen der Transkription in Mammakarzinomen eingesetzt (Burger et al.
1998, Leygue et al. 1999, Miller et al. 1999).
Im Bereich der Endokrinologie wurde mit der SSH nach Östrogen-stimulierten Genen im
vorderen Hypophysenlappen gesucht, dabei wurde ein bisher unbekanntes Gen isoliert (Duan
et al. 2002).
Zu den Einsatzgebieten gehörten auch Untersuchungen der Hämatopoese (Gingras &
Margolin, 2000, Li et al. 1999, Orlic et al. 1999) und der Angiogenese (Cockerill et al. 1998;
Girrard et al. 1999).
Wlaschek et al. isolierten in humanen dermalen Fibroblasten mittels SSH mehrere bekannte
UVA-induzierte Gene und ein neues Gen (Wlaschek et al. 2000).
4.1.5 Zusammenfassung der Überlegungen zur Wahl der Methodik
Die Genauigkeit, die schnelle Durchführung und der im Vergleich mit anderen Methoden
geringe finanzielle und technische Aufwand haben die SSH zu einem beliebten und oft
angewendeten Verfahren gemacht und waren auch in dieser Arbeit unter den entscheidenden
Faktoren für die Wahl dieser Methode.
Weitere entscheidende Kriterien die von der SSH erfüllt werden sind die Möglichkeit zur
Detektion von Genen geringer Abundanz, sowie von Genen, deren Expression nur in
moderaten Maßen verändert wird. Zusätzlich sollte es sich um ein offenes System handeln,
denn speziell bisher unbekannte Expressionsveränderungen waren Augenmerk dieser Arbeit.
Beachtung in den Überlegungen fanden auch die in Kapitel 4.1.4 erwähnten
Veröffentlichungen, in denen die SSH bereits erfolgreich im Bereich der Gynäkologie
eingesetzt wurde, dabei speziell zur Untersuchung von bovinen Granulosazellen in
verschiedenen Entwicklungsstadien.
60
4. Diskussion
4.2. Diskussion der Ergebnisse
In der vorliegenden Arbeit wurden die Effekte von hCG auf humane Granulosazellkulturen
untersucht. Es zeigte sich, dass hCG einen Einfluss auf die mRNA-Expression von hHR23B
hat. Die Zellen wurden nach 48 Stunden mit humanem Choriongonadotropin für weitere 48
Stunden
inkubiert.
Um
individuelle
Veränderungen
zu
vermeiden,
wurde
die
Follikelflüssigkeit aller Probanden vor der Zellgewinnung vereinigt. Dadurch enthielten
sowohl die Probekulturen als auch die Kontrollkulturen gleiche Anteile von Granulosazellen
aller Patientinnen.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Suppressive Subtraktive Hybridisierung (SSH) zur
Identifizierung differentiel exprimierter Gene angewandt, die nicht nur die Identifikation einer
großen Anzahl, sondern vor allem schwach abundanter Gene ermöglicht.
Die SSH förderte eine Reihe von Transkripten, deren Expression differentiell reguliert sein
sollte. Um zunächst falsch positive Transkripten auszuschließen, wurden sie zunächst in
Vektoren kloniert und anschließend durch radioaktiv markierte Membranhybridisierung
weitergehend analysiert. Dieses Vorgehen ergab schließlich vier klonierte Transkripte, deren
differentielle Expression nun sehr wahrscheinlich war.
Um zu überprüfen, ob die Expression der zu analysierenden Gene durch hCG beeinflusst
wird, erfolgte die Kontrolle mittels einer RT-PCR. Die RNAs von Probe- und
Kontrollkulturen wurden durch Reverse Transkription in cDNA umgeschrieben und
anschließend durch PCR amplifiziert.
Für weitere Untersuchungen war es notwendig diese bislang unbekannten Transkripte zu
identifizieren,
dazu
wurde
eine
DNA-Sequenzanalyse
durchgeführt.
Eine
DNA-
Sequenzanalyse ist die automatisierte, PC-gestützte Bestimmung von charakteristischen
Abschnitten in einem DNA-Strang. Dabei werden die bei der DNA-Sequenzierung
gewonnenen Informationen über die Abfolge und Position der Basenpaare unterstützt. Eine
der häufigsten Problemstellungen ist die Suche nach bestimmten Teilsequenzen in einer
Datenbank. Man kann entweder nach exakten Übereinstimmungen (String-MatchingAlgorythmen) suchen oder nach allen ungefähren Entsprechungen innerhalb einer bestimmten
edit distance vom „Suchstring“. Diese „Anpassungen“ zweier Strings werden sequence
alignments genannt. Die weitaus bekannteste Realisierung von Alignment ist der BLAST-
61
4. Diskussion
Algorithmus.
Dieses
Werkzeug
ist
auf
der
Webseite
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi abrufbar. Es erlaubt den Zugang zu über
580 Bakterien- und über 120 Eukaryotengenomen (Cummings et al. 2002).
Die Resultate der Sequenzanalyse und der anschließenden BLAST(Basic Local Alignment
Search Tool)-Suche zeigten Homologien nicht unter 98% und zeigten, dass es sich bei den
klonierten Transkripten um hHR23B, γ-Aktin, rP S6 und BNP handelt.
Um letztlich den Beweis der hCG-abhängigen differentiellen Expression zu führen wurde eine
RT-PCR durchgeführt. Die Anzahl der PCR-Zyklen muss dabei so gewählt werden, dass die
entstehenden Amplifikate detektierbar sind und die PCR sich noch in der exponentiellen
Phase der Amplifikation befindet (Freeman et al. 1999).
Die semiquantitative densitometrische Auswertung erfolgte durch Abgleich der Werte der
Proben und Kontrollen mit den Werten des Ansatzes von simultan amplifizierter GAPDHcDNA, welches konstituiv exprimiert wird.
Es zeigte sich, dass hCG die mRNA-Expression von hHR23B in humanen Granulosazellen in
vitro heraufreguliert.
4.3. Diskussion der gefundenen Gene
4.3.1. hHR23B
Bei der Nucleotidexcisionsreparatur (NER), durch die aufgrund von UV-Licht, mutagenen
Substanzen und Chemotherapeutika geschädigte Olignucleotide entfernt werden (Sancar et al.
1996), kommt hHR23b eine entscheidende Rolle zu. Zusammen mit XPC stellt es den
initialen Erkennungsfaktor dar, nach dessen Bindung an der geschädigten DNA-Stelle alle
anderen Faktoren rekrutiert werden (Sugasawa et al. 1998; Evans et al. 1997) (Abb. 4.1). In
der folgenden Kaskade wird zunächst TIFIIH
gebunden, ein aus neun Untereinheiten
aufgebauter Faktor, dessen Helicase-Untereinheiten XPD und XPB für eine Entwindung der
DNA im Bereich der Läsion sorgen. Die darauf folgende Rekrutierung von RPA, XPA und
XPG bewirkt eine weitere Entwindung der Helix bis zur vollständigen Öffnung (Evans et al.
1997). Zum Zeitpunkt der Bindung von XPG und während der weiteren Formierung des
NER-Komplexes scheint XPC-hHR23b nicht mehr gebunden zu sein, dafür anscheinend XPA
62
4. Diskussion
(Missura et al. 2001; Wagasuki et al. 1998). Die NER-Maschinerie wird schließlich durch
XPF-ERCC1 ergänzt (Saijo et al. 1996; Park et al. 1994), welches wie XPG eine
Endonuclease darstellt, die die Inzision auf 3´- und 5´- Seite des DNA-Schadens durchführt
(Sijbers et al. 1996). Es wird ein 30 Basen umfassendes Oligonukleotid freigesetzt, welches
die Schädigung enthält. Nun folgt die Polymerisation des fehlenden DNA-Abschnitts durch
die DNA Polymerasen δ und ε in einem PCNA (proliferating cell nuclear antigen)abhängigen Schritt. Als letztes erfolgt die Ligation des synthetisierten Abschnitts durch die
DNA-Ligase I.
Abb. 4.1: Modell für den Aufbau des menschlichen NER-Komplexes (aus You et al. 2002).
63
4. Diskussion
4.3.1.1. Lokalisation und Funktion des hHR23B
hHR23A- und hHR23B-Untereinheiten sind während der Interphase vorwiegend im Zellkern
und während der Mitose im Zytoplasma lokalisiert (Katiyar und Lennarz 2005). Die
nukleären hHR23B-Levels nehmen in der S-Phase ab. Beim Eintritt der Zelle in die Mitose ist
das hHR23B-Protein wieder im Zytoplasma zu finden. Diese Befunde deuten auf eine
zellzyklusabhängige intrazelluläre Verteilung des hHR23B-Proteins hin (Katiyar und Lennarz
2005).
hHR23A- und hHR23B-Proteine weisen eine 57%ige Sequenzidentität untereinander auf.
HHR23B bildet einen Komplex mit XPC. HHR23A kann hHR23B bei der in vitro Bindung
und Stimulation substituieren, was auf eine gewisse funktionelle Redundanz hinweist
(Sugasawa et al. 1997). HHR23B kommt in Säugerzellen viel häufiger als XPC vor, meistens
in freier Form (Masutani et al. 1994). Die hHR23B-Untereinheit des Heterodimers kann beim
Ab- oder Umbau des Nukleosoms involviert sein. Dies macht die DNA für die XPCUntereinheit und andere Faktoren des Exzisionsnukleasesystems zugänglich. hHR23B
stimuliert die Aktivität des XPC-Proteins, möglicherweise indem es seine Stabilität und/oder
seine Bindung an geschädigte DNA moduliert (Reardon et al. 1996).
4.3.1.2. Beeinflußung der hHR23B-mRNA-Expression
Es ist letztlich nicht genau bekannt wie die Regulation der vielen Proteine der
Nukleotidexzisionsreparatur erfolgt. Diesbezüglich konnten Louat et al. (2004) in HeLaZellen jedoch zeigen, dass die Zellresistenz gegen genotoxische Stoffe, welche DNA-Schäden
verursachen, mit atypischer Expression der Proteinkinase C (PKC) einhergeht und der
Expressionsgrad von hHR23B und XPC dabei mit der PKC-Expression korreliert. Diese
Ergebnisse weisen darauf hin, dass PKC als Modulator der NER-Aktivität wirken kann, und
zwar durch die Heraufregulation der Expression von hHR23B und XPC (Louat et al. 2004).
Maizels et al. (1996) konnten in diesem Zusammenhang eine durch hCG ausgelöste Erhöhung
der PKC-mRNA-Expression sowie der PKC-Proteine in Granulosazellen des Hasen
feststellen. Zu einem gleichen Ergebnis kamen Cutler et al. (1993) bei ihren Untersuchungen
an Granulosazellen der Ratte (Cutler et al., 1993; Maizels et al., 1996). Dagegen konnten
64
4. Diskussion
Salvador et al. (2002) keine über den LH/hCG-Rezeptor ausgelöste PKC-Aktivierung in
Granulosazellen der Ratte nachweisen. (Salvador et al., 2002)
Die
Expression
des
hHR23B-Gens
und
anderer
NER-Gene
ist
im
humanen
Leberzellkarzinom erhöht. Die Überexpression zweier Schlüsselenzyme, ERCC1 und XPC,
die in der Frühphase des NER-Prozesses involviert sind, weist darauf hin, dass diese mit der
bekannten chemotherapeutischen Resistenz des Leberzellkarzinoms im Zusammenhang
stehen könnten (Fautrel et al. 2005).
Die Anhäufung genetischer Veränderungen in Tumorzellen kann teilweise auf Defekte der
DNA-Reparatur-Mechanismen zurückgeführt werden. So berichten Peng et al. (2005) über
epigenetische Hypermethylierung des hHR23B-Gens in der IL6-responsiven MyelomZelllinie KAS-6/1. Diese wurde durch die Zugabe von Zebularin signifikant verringert. Die
Folge war eine Erhöhung des hHR23B-mRNA-Levels innerhalb von 48 Stunden. Die
Entfernung dieses Stoffes und die Resupplementierung des Kulturmediums mit Il-6 stellte die
DNA-Hypermethylierung des hHR23B-Gens wieder ein und verringerte die hHR23BGenexpression. Die reversible Methylierung nach Entfernung des Zebularins spiegelt die
Hypermethylierungstendenz des hHR23B-Gens aufgrund des tumorgenen Status der KAS6/1-Myelomzellen wider (Peng et al. 2005). Dies könnte die klonale Expansion der
Myelomzellen unterstützen. Darüber hinaus konnten Brockstedt et. al (1998) hHR23b als
eines der apoptoseassoziierten Proteine in einer humanen Burkitt-Lymphom-Zelllinie
Nachweisen (Brockstedt et. al, 1998). Die Ergebnisse von Heeny et al. (2003) deuten auf
einen möglichen Zusammenhang von der Überexpression von hHR23b und anderen Proteinen
in Granulozyten und mononukleären Zellen von Patienten mit paroxysmaler nächtlicher
Hämoglobinurie mit der bekannten Apotose-Resistenz dieser Zellen.
In einer Studie von Vinson und Hales (2001) wurde die Expression der NER-Gene während
der Organentwicklung bei der Ratte unter der Einwirkung des genotoxischen Teratogens, 4Hydroperoxycyclophosphamid, untersucht. Die meisten NER-Gene im Dottersack und
Embryo waren am 10. Trächtigkeitstag leicht exprimiert, mit Ausnahme von XPD, XPE und
CPNA. Zwischen dem 10. und 11. Trächtigkeitstag traten keine wesentlichen Veränderungen
der Genexpression auf. Die Expression von hHR23B, XPP, ERCC1 und DNA-Polymerase
war erst am 12. Tag erhöht.
65
4. Diskussion
Zwischen dem 10. und 12. Trächtigkeitstag blieb die Konzentration des XPA-Proteins im
Dottersack minimal, im Embryo dagegen erhöhte sie sich allmählich. Es wird
geschlussfolgert, dass die Genexpression während der Organogenese stadien- und
gewebespezifisch reguliert wird. Die Exposition des Fötus auf einen teratogenen Stoff führt
zu Malformationen, ohne die Transkriptlevels der NER-Gene zu beeinflussen (Vinson und
Hales 2001).
In der vorliegenden Arbeit wurde eine signifikant erhöhte hHR23B-mRNA-Expression in
induzierten Granulosazellkulturen im Vergleich zu Kontrollkulturen festgestellt.
Diese Ergebnisse lassen die Vermutung zu, dass hCG als ein Regulator der in vitro
Expression von hHR23B-mRNA in humanen Granulosazellen wirken könnte.
4.3.2. γ-Aktin
Aktin ist ein Strukturprotein, das in allen eukaryotischen Zellen vorkommt. Es ist Bestandteil
des Zytoskeletts. In Muskelzellen ist jedes zehnte Proteinmolekül ein Aktinmolekül, in
anderen Zellen beträgt der Anteil 1-5%. In der Zelle bildet Aktin dynamische Filamente, die
als Bestandteil des Zytoskeletts der Stabilisierung der äußeren Zellform, sowie intrazellulären
Transporten dienen.
4.3.2.1. Aufbau des γ-Aktins
Das Protein hat eine globuläre Form und ist 42 kDA groß. Das Aktinmonomer, auch G-Aktin
(globulär) genannt, gliedert sich in vier Domänen (Abb. 4.2). In der Regel bindet Aktin ein
Nukleotid, ATP, das während der physiologischen Aktivität zu ADP hydrolysiert wird
(Otterbein et al. 2001, Winder 2003). Aktin polymerisiert zu langen Filamenten, dem F-Aktin
(Craig 1994, Pollard 1999). Das Filament besteht aus zwei Ketten aus polymerisierten GAktin-Monomeren, die sich helixartig umeinanderwinden (Pollard 1999).
Es existieren in warmblütigen Vertebraten sechs Aktin-Isoformen, die von eigenen Genen
kodiert und entweder gewebespezifisch oder ubiquitär exprimiert werden. Hierzu gehören die
beiden Skelettmuskel- und Herzmuskel-α-Aktine, die beiden α-Aktine der vaskulären und
visceralen Glattmuskelzellen sowie die zytoplasmatischen Aktinisoformen, β-Aktin und γ-
66
4. Diskussion
Aktin, die in allen Zellen vorhanden sind. Die Unterscheidung der Aktinisoformen in α, β und
γ bezieht sich auf die verschiedenen isoelektrischen Punkte. Die Aktinisoformen
unterscheiden sich nur geringfügig in ihrer Primärsequenz. Die Unterschiede sind in NTermini zu finden, in denen eine Reihe von posttranslationalen Modifikationen stattfinden
(Ampe und Vandekerckhove 1999).
Die zytoplasmatischen Aktine, β-Aktin und γ-Aktin, sind in vielen Zellen submembranös
lokalisiert und am Aufbau verschiedener Aktinzytoskelettstrukturen beteiligt (Alberts et al.
2002).
An bestimmten, spezifischen Punkten der Zelle treten diese Aktinzytoskelettstrukturen
verstärkt auf, z.B. in Membranausbuchtungen (Mikrovilli, Synapsen) sowie in bestimmten,
Zelljunktionen (Adhärens-Kontakt, Tight junctions) und tragen so zur Form und Stabilität von
Zellen und Geweben bei.
Abb. 4.2: Übersicht zu G- und F-Aktin (nach Alberts et al. 2002).
A: G-Aktin mit angegebenen Domänen, gebundenem ATP und Schwanz (Plus-Ende) sowie Kopf (MinusEnde).
B: Hypothetisches Modell des F-Aktins. Die Pfeile deuten die Hauptrichtung von Polymerisation und
Depolymerisation an.
C: Das helikal gewundene, zweisträngige Aktinfilament zeigt die reelle Struktur des F-Aktins.
67
4. Diskussion
4.3.2.2. Aktinbindende Proteine und ihre Funktion
Neben der gewebe- und zellspezifischen Expression der Aktinisoformen spielt eine Vielzahl
an aktinbindenden Proteinen eine wichtige Rolle für die Funktionserhaltung und -veränderung
des Aktinzytoskeletts. Aktinbindende Proteine sorgen für eine räumliche und zeitliche
Kontrolle der Polymerisations- und Depolymerisationsprozesse, der Anheftung des F-Aktins
an die Plasmamembran und andere Zellkompartimente, sowie für Kontraktion und
Relaxation. Die Diversität der Strukturen in Organisation, Stabilität und Dynamik wird durch
die Assoziation des G- und F-Aktins mit verschiedenen synergistisch und antagonistisch
agierenden, aktinbindenden Proteinen gewährleistet (Ayscough, 1998).
Aktinfilamente strahlen in zwei Zellkontakte ein, die Adhärens-Kontakte und die
Fokalkontakte. Dabei werden sie über Adaptorproteine an den Proteinstrukturen der Kontakte
verankert. Verantwortlich dafür sind u.a. das α-Aktinin, das Vinculin und Talin. α-Aktinin
bildet Bündel, die typischerweise mit Myosin verspannt werden. Vinculin spielt vor allem
eine Rolle bei der Zell-Zell-Adhäsion, die bei Vinculinverlust erheblich gestört ist. Vimentinarme Zellen weisen eine verminderte Motilität und chemotaktische Wanderung auf (Eckes et
al. 1998). Scherkräfte werden über Vimentinfilamente zum Zellkern und zu benachbarten
Zellen geleitet. Außerdem dient Vimentin als Dehnungsrezeptor der Zelle. α- und β-Tubuline
sind Proteindimere, die die Hauptbestandteile der Mikrotubuli repräsentieren. Sie sind
involviert in Vorgänge wie Zellteilung, Stofftransport in der Zelle und Kommunikation des
Zellinneren mit der Zelloberfläche (www.cytochemistry.net/cellbiology). Tubuline sind Teil
des Spindelapparats (Verrills et al. 2005).
4.3.2.3. Beeinflussung der γ-Aktin-mRNA-Expression
In der vorliegenden Arbeit erfolgte die Überprüfung des hCG-Einflusses in humanen
Granulosazellen mittels RT-PCR. Es bestand im Bezug auf die γ-Aktin-mRNA-Expression
kein wesentlicher Unterschied zwischen den hCG-behandelten Granulosazellen und den
Kontrollkulturen. Die Proteinsynthese wurde zwar nicht analysiert, Untersuchungen zeigten
jedoch, dass die Aktin-Synthese den Aktin-mRNA-Level widerspiegelt (Ben-Ze'ev und
Amsterdam 1986).
68
4. Diskussion
Veränderungen der γ-Aktin-mRNA-Expression wurden in verschiedenen Mauszellen
(Tokunage et al. 1988), während der ZNS-Entwicklung (Chiba et al. 1990), in verschiedenen
Zellzyklusphasen (Masibay et al. 1988), nach Behandlung mit Serum und Wachstumsfaktoren
(Masibay et al. 1988) sowie nach Insulinbehandlung (Messina 1994) festgestellt. Obwohl βund γ-Aktin zur gleichen Genfamilie gehören, ist das Expressionsmuster dieser Gene
unterschiedlich (Masibay et al. 1988, Tokunaga et al. 1988).
In einer Studie von Ben-Ze'ev und Amsterdam (1989) wurde die Expression der
Zytoskelettproteine in menschlichen Granulosazellen aus präovulatorischen Follikel mit Hilfe
der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert. Die Zugabe von hCG zu den
kultivierten Granulosazellen führte zu einer signifikanten Abnahme der Synthese von
Vinculin, α-Aktinin und Aktin, ohne eine vergleichbare Veränderung der Syntheserate von αund β-Tubulin.
Kranen et al (1993) konnten dagegen in Granulosazellen der Ratte durch hCG-Zugabe eine
Erhöhung des Aktins im löslichen Zustand beobachten, jedoch nur nach Vorbehandlung mit
FSH und Insulin. Die alleinige Zugabe von FSH und Insulin bewirkte eine beträchtliche
Senkung der Aktinkonzentration (Kranen et al. 1993).
Eine weitere Studie von Ben-Ze'ev und Amsterdam (1986) zeigte, dass die Differenzierung
der Granulosazellen bei der Ratte mit Veränderungen der Organisation und Expression der
Zytoskelettproteine verbunden ist, die an der Bildung der Zellkontakte sowie an der
Bestimmung der Zellform beteiligt sind (Ben-Ze'ev und Amsterdam 1986).
Die hormonabhängige Differenzierung von Oozyten beinhaltet funktionelle Veränderungen in
Aktin-Zytoskelett dieser Zellen, auch wenn dabei die Expression der Zytoskelettproteine nicht
beeinflusst wird. Es ist bekannt, dass die in der Prophase 1 arretierten Oozyten, nach ihrer
Freisetzung aus den Follikeln und Platzierung in die Kultur, eine spontane und
hormonunabhängige Reifung durchlaufen können (Albertini et al., 2001). Dennoch weisen
diese Oozyten Veränderungen auf, die ihre Fähigkeit zur Befruchtung und vollständigen
Embryonalentwicklung beeinträchtigen (Morgan et al. 1991). Mehrere Studien haben gezeigt,
dass der Zusatz von Gonadotropin die Befruchtungsrate sowie die Embryonalentwiclung der
in vitro gereiften Oozyten verbessert (Morgan et al., 1991). Andere Forscher konnten keine
Wirkung der Supplementierung mit Gonadotropin nachweisen (Yang et al. 1993). Der
69
4. Diskussion
Mechanismus zur Gonadotropin-Wirkung auf den Reifungsprozess erfordert offensichtlich
die Stimulation der Granulosazellen, die die Signale zur Oozyte übertragen (Albertini et al.,
2001, Eppig 1991). Gonadotropine haben während der in vitro Eizellreifung spezifische
Effekte auf die Meiose, die Ausstoßung des ersten Polkörperchens, die KumuluszellverbandOozyte-Wechselwirkungen sowie auf den Aufbau des Zytoskeletts. Dies bedeutet, dass die
hormonelle Kontrolle der Meiose auch zytoskelettale Veränderungen beinhaltet (Plancha et al.
1994).
So erreichen in Anwesenheit von LH oder hCG in vitro lediglich 28-41% von HamsterOozyten die zweite Reifeteilung. Bei der Zugabe von FSH erreichen jedoch 83% der Oozyten
die Proliferationsphase (M2) (Plancha et al., 1994). In dieser Studie von Plancha et al. (1994)
mit Hamster-Oozyten
wiesen die meisten aktivierten Oozyten in den hCG-stimulierten
Kulturen kein Polkörperchen und keine Pronuclei auf, während die Oozyten in den hCG- und
FSH-Kulturen ein Polkörperchen und einen Pronucleus bilden. Die Effizienz der Zytokinase
und Polkörperchen-Ausstoßung ist hormonabhängig: sie ist relativ hoch in FSH-behandelten
Oozyten, intermediär in LH-Ooozyten und niedrig in hCG-behandelten Oozyten. Die meisten
Kumulus-Oozyte-Komplexe zeigen in Anwesenheit von FSH oder FSH + hCG eine
intensivere Rhodamin-Phytoidin-Färbung im Vergleich zu Oozyten, die mit hCG behandelt
wurden. Diese Veränderungen deuten auf eine Aktinpolymerisierung im Kortex der Oozyten
während der in vitro Reifung hin (Plancha et al. 1994).
4.3.3. Das humane ribosomale Protein S6
Die Regulation der Proteinbiosynthese, die an Ribosomen stattfindet, erfolgt über
Phosphorylierung/Dephosphorylierung von spezifischen Proteinfaktoren. Das S6 Protein ist
eines diser ribosomalen Phosphorproteine, dessen Phosphorylierungsgrad von den
Wachstumsbedingungen abhängt (Ferrari und Thomas 1994).
Die Isolierung und Sequenzierung eines S6-spezifischen cDNA-Klons führte zur Aufklärung
der Primärstruktur des humanen ribosomalen Proteins S6 (Pata et al. 1992). Das Protein
besteht aus 249 Aminosäuren und besitzt ein Molekulargewicht von ca. 28,7 kDa. Das
funktionelle humane S6-Gen setzt sich aus 6 Exons und 5 Introns zusammen und ist auf
Chromosom 9 lokalisiert (Antoine und Fried, 1992). Das 5´Ende des S6-Gens weist die
70
4. Diskussion
typischen Merkmale ribosomaler Proteingene von Säugern auf, wie das Fehlen einer TATABox und das Vorhandensein einer CpG-reichen Region (Pata et al. 1992).
Das in der 40S-Untereinheit integrierte ribosomale Protein S6 ist das einzige basische
Phosphoprotein in Säuger-Ribosomen (Wool et al. 1996). Als Phosphorylierungsstellen
dienen die Aminosäuren Ser236, Ser235, Ser240, Ser244 und Ser 247 (Jeffries und Thomas
1996). Eine Reihe verschiedener Faktoren, z.B. Hormone, Wachstumsfaktoren, Serum,
Virusinfektionen und Phorbolester stimulieren die S6-Phosphorylierung (Traugh und
Pendergast, 1986). Hypertoner Schock (Kruppa und Clemens, 1984) oder Hitzeschock
(Kennedy et al. 1984) führen zur Dephosphorylierung von S6.
Die biologische Bedeutung der S6-Phosphorylierung ist bisher nicht aufgeklärt. Die
mitogenstimulierte Phosphorylierung von S6 geht mit der Bildung von Polysomen und einem
Anstieg der Proteinbiosynthese einher (Duncan et al. 1982). Der Phospholylierungsgrad des
S6-Proteins korreliert weder mit dem Ausmaß der Polysomen-Aggregation noch mit der
Proteinsyntheserate (Kruppa und Clemens 1984).
Das S6-Protein bildet einen Bestandteil der mRNA-Bindungsstelle innerhalb der ribosomalen
40S-Untereinheit (Wool et al. 1996). Es wird vermutet, dass die S6-Phosphorylierung die
Bindungsaffinität der Ribosomen für 5´ TOP-haltige mRNA erhöht und dadurch die Initiation
der Translation erleichtert (Brown und Schreiber 1996, Jeffries und Thomas 1996). So können
als Folge einer Insulinbehandlung ruhender Zellen sowohl die Phosphorylierung von S6 als
auch eine gesteigerte Translation der mRNA ribosomaler Proteine beobachtet werden
(Meyuhas et al. 1996). Rapamycin, ein hochselektiver Inhibitor der 70-kDa S6-Kinase und
der S6-Proteinphosphorylierung, unterdrückt die Translation von 5´TOP-haltigen mRNAs,
was für eine regulatorische Funktion der S6-Phosphorylierung spricht (Price et al. 1992,
Jeffries et al. 1994).
Das ribosomale Protein S6 wird im Nucleolus bereits an den 45S-rRNA-Vorläufer angelagert
(Todorov et al. 1983). Das humane S6 Protein enthält drei Kernsignale, mit deren Hilfe das
Protein nach seiner cytosolischen Synthese in den Zellkern gelangt (Schmidt 1992, Schmidt et
al. 1996). Für die nachfolgende Akkumulation im Nucleolus konnten bisher zwei
nucleolusbindende Domänen identifiziert werden (Kundu-Michalik 1997, Lipsius 1998).
71
4. Diskussion
Das ribosomale Protein S6 kann direkt an mRNA, tRNA und Initiationsfaktoren
kreuzgebunden werden, was seine Lokalisierung im Bereich der Initiation der Translation
bestätigt (Williams et al. 2003).
4.3.3.1. Kontrolle des ribosomalen Protein S6
Über die Regulation der Ribosomen-Biosynthese werden viele komplexe Prozesse, die sich
während des normalen Wachstums, der Differenzierung, der Entwicklung oder malignen
Transformation in Eukaryonten ereignen, beeinflusst. Ribosomen sind essentiel für das
Wachstum der Zellen, da sie die Synthese von Proteinen katalysieren (Albert et al. 1995). Die
Werte für Ribosomen aus Säugertieren sind in der Tabelle angegeben.
Untereinheit RNA
Nukleotide Proteine
60S
4718
28S rRNA
47
5,8S rRNA 160
40S
5S rRNA
120
18S rRNA
1874
33
Tabelle 1: Ribosomen in Eukaryonten-Zellen (aus Knippers 1995).
Eukaryontische Ribosomen mit einem nominalen Sedimentationskoeffizienten von 80S
besitzen ein Molekulargewicht von etwa 4,22 MDa und setzen sich aus zwei Untereinheiten
zusammen. Die große ribosomale 60S-Untereinheiten mit einer Masse von 2,82 MDa enthält
einen RNA-Anteil von ungefähr 65%. Die kleine ribosomale 40S-Untereinheit mit einem
Molekulargewicht von 1,40 MDa enthält einen RNA-Anteil von etwa 50% (Wool et al. 1996).
Bei der eukaryontischen Ribosomenbiogenese werden neben den ribosomalen Proteinen und
RNAs, auch weitere Faktoren für den Aufbau der Untereinheiten, z.B. snoRNAs (Tollervey
und Kiss 1997) benötigt.
72
4. Diskussion
Die Biogenese der ribosomalen Untereinheiten im Nukleolus wird durch die Bereitstellung
äquimolarer Mengen von ribosomalen Proteinen und rRNA gewährleistet. Dies wiederum
setzt die koordinierte Regulation auf verschiedenen Ebenen der Translation bzw.
Transkription und des nuklearen Transports der einzelnen ribosomalen Komponenten voraus
(Mager 1988, Warner 1989).
Der vorherrschende Regulationsmechanismus ist die Kontrolle der ribosomalen Protein-GenExpression auf der Translationsebene. Die Translationseffizienz der rPmRNA wird durch die
mRNA-Akkumulation reguliert (Meyuhas et al. 1996).
Bei Vertebraten wird die Translation der rPmRNA hauptsächlich in Abhängigkeit vom
Wachstum reguliert. Beim Wachstumsstillstand kommt es zu einer Abnahme der rPmRNA
aus Polysomen in den proliferierenden Zellen und einer Zunahme der MessengerRibonucleotid-Partikel (mRNP) in den Ruhezellen. Diese spezifische Fluktuation wurde nach
verschiedenen physiologischen Stimuli (Avni et al. 1994, Shame et al. 1995), sowie beim
Übergang von schnell wachsender fötaler Leber zur adulten Leber (Aloni et al. 1992)
beobachtet.
Im Allgemeinen sind etwa 66% der rPmRNA und etwa 90% der anderen housekeepingmRNA in der Polysomenfraktion. Diese selektive Translokationsrepression der rPmRNA
wird in wachstumssarretierten Zellen größer. Hier sind nur etwa 26% der rPmRNA im
Vergleich zu 84% anderer housekeeping-mRNA in Polysomen anzutreffen.
Die Analyse der rPmRNA aus Teilungs- und Ruhezellen zeigt zwei diskrete mRNAPopulationen: translationsaktive rPmRNA (Polysom-assoziiert) und translationsinaktive
rPmRNA (maskiert in RNP-Partikel) (Meyuhas et al. 1990). Die translationsaktive rPmRNA
wird im aktiven Zustand mit maximaler Effizienz translatiert.
Wird der Initiationschritt der Translation blockiert, kommt es zur Repression und einem
Anstieg der mRNA-Fraktion (Meyuhas et al. 1996). Ob die Umverteilung der rPmRNA in den
RNP-Partikeln mit einer Modifikation verbunden ist, die ihre Translation unmöglich macht,
bleibt noch ungeklärt. Die Selektivität der Translationskontrolle der rPmRNA lässt vermuten,
dass diese eine spezifische Eigenschaft besitzen, die von der Translationsmaschinerie
und/oder von den Proteinen der RNP-Partikeln erkannt wird.
73
4. Diskussion
Eine Phosphorylierung kann durch Stimuli, wie Serum (Thomas et al. 1982),
Wachstumsfaktoren (Blenis et al. 1984), Insulin (Rosen et al. 1981) und tumorgene Faktoren
(Blenis und Erikson 1984) induziert werden. Transformierende Viren erhöhen ebenfalls den
Phosphorylierungsgrad (Decker 1981). Im Nukleolus findet die Phosphorylierung des rPS6Proteins während der aktiven Biogenese der Ribosomen statt (Jefferies et al 1997).
Ribosomen mit dem höchsten Phosphorylierungsgrad haben einen Selektionsvorteil bei der
Bildung von Polysomen (Jefferies und Thomas 1996).
Die rPS6-Phosphorylierung in Säugerzellen wird durch Proteinkinasen und Phosphatasen
moduliert, die ihrerseits als Antwort auf externe Stimuli, durch intrazelluläre Signale aktiviert
werden. Diese lösen eine Signaltransduktionskaskade aus, die die Kinasen aktiviert (Williams
et al. 2003). Die S6-Kinase-Aktivität wird durch die intrazelluläre ATP-Konzentration über
die Regulation der TOR-Aktivität kontrolliert (Dennis et al. 2001).
4.3.3.2. Beeinflussung der rP S6- mRNA-Expression
Die Charakterisierung der S6-spezifischen mRNA in proliferierenden Lymphozyten nach
Stimulation mit ConA zeigte keine signifikanten Veränderungen, während die Transkription
der mRNA nach Stimulation mit Lymphokinen, wie γ-Interferon und Interleukin-2 stark
induziert wird. Die Southernblot-Analyse der menschlichen Genom-DNA weist auf das
Vorkommen mehrerer Kopien des S6-Gens hin (Heinze et al. 1988). Dieser Befund steht im
Einklang mit den Ergebnissen anderer Studien (Monk et al. 1984).
Die mRNA-Spiegel für die ribosomalen Proteine S6, S11 und S14 in ruhenden und
proliferierenden Fibroblasten bzw. mononukleären Zellen im steady-state-Zustand sind nach
Stimulation mit Serum oder Mitogen nicht erhöht. Die mRNA-Menge für diese ribosomalen
Proteine bleibt auf etwa gleichem Niveau (Ferrari et al. 1990). Die konstitutive Expression
dieser Gene scheint demzufolge koordiniert zu erfolgen, da sie auch nach Inhibition der
Proteinsynthese durch Cycloheximid unverändert bleibt.
Die Untersuchung der rPmRNA aus 15 verschiedenen Populationen leukämischer Blasten
zeigte jedoch, dass sich die Konzentrationen der einzelnen rPmRNA-Arten signifikant
voneinander unterscheiden (Ferrari et al. 1990). Die Ergebnisse dieser Versuche weisen
74
4. Diskussion
darauf hin, dass die Expression der rP-Gene bei der großen Mehrheit der leukämischen Zellen
unabhängige, aufeinander nicht abgestimmte Veränderungen durchlaufen (Ferrari et al. 1990).
In der vorliegenden Arbeit änderte sich die rP S6-mRNA-expression in humanen
Granulosazellen nicht signifikant unter Einfluss von hCG.
4.3.4. BNP
Das Herz als endokrines Organ synthetisiert und sezerniert 3 natriuretische Peptide, atrial
natriuretic peptide (ANP), brain natriuretic peptide (BNP) und das c-type natriuretic peptide
(CNP) (Riegger et al. 1996). Allen natriurretrischen Peptiden ist ein Aminosäurering aus 17
Aminosäuren (AS) gemeinsam, wobei 11 dieser 17 AS bei allen drei Polypeptiden homolog
sind (Abb. 4.3). Aufgrund ihrer natriuretischen, diuretischen und vasodilatatorischen Effekte
und durch die Hemmung des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems (RAAS) spielen sie eine
wichtige Rolle bei der Regulation des Wasser- und Elektolythaushaltes (Riegger et al. 1996,
Tanaka et al. 1998, Zellner 1999). Plasma-BNP (p-BNP) gilt zudem als nichtinvasiver,
hochsensitiver und hochspezifischer Marker bei der Erkennung linksventrikulärer
Dysfunktion (LV-Dysfunktion) und ist proportional zur Schwere der Funktionseinschränkung
erhöht ( Riegger et al. 1996, Mair et al. 1997, McDonagh et al. 1997). Darüber hinaus wurde
ein 4. natriuretisches Peptid beschrieben, Urodilatin (URO) (Maack 1992).
ANP, URO and BNP haben einen gemeinsamen Rezeptor, den natriuretischen PeptidrezeptorTyp A (NPR-A), was auf ähnliche pharmakologische Profile hinweist (Rosenzweig und
Seidman 1991; Koller und Goddel 1992). CNP bindet an den Rezeptor-Typ B, NPR-B
(Chang et al. 1989). Die natriuretischen Peptidrezeptoren NPR-A und NPR-B weisen eine
Guanylylcyclase- und eine Kinase-like-Domäne auf (Suga et al. 1992). Die Aktivierung durch
natriuretische Peptide führt zur cGMP-Synthese (Hamet et al. 1991). Ein dritter Rezeptortyp
(NPR-C oder Clearance-Rezeptor) dient zur Entfernung der natriuretischen Peptide aus dem
Plasma (Maack et al. 1987). Er hat eine kurze cytoplasmatische Domäne und ist nicht an die
Guanylatcyclase gekoppelt (Gutkowska et al. 1999). Sämtliche bislang bekannten
natriuretischen Peptide binden mit gleicher Affinität an diesen Rezeptor (Nouabi et al. 2000).
75
4. Diskussion
Abb. 4.3: Strukturen der natriuretischen Peptide (nach Riegger et al 1996)
ANP und BNP werden von Myozyten des Herzmuskels gebildet. Die höchste ANPGenexpression wird im Vorhof gemessen (Tanaka et al. 1998, Mair et al. 1997). ANP- mRNA
findet
sich
auch
im
Vorhofkonzentrationen.
Ventrikel,
jedoch
Außerhalb
des
nur
Herzens
in
Konzentrationen
wird
ANP
im
von
1%
Gehirn,
der
dem
Hypophysenvorderlappen, der Lunge und der Niere gebildet (Stein et al. 1998). Der
Hauptanteil der Synthese von BNP findet im linken Ventrikel statt. Geringe Anteile werden in
Gehirn, Niere und Lunge gebildet (Stein et al. 1998, Tanaka et al. 1998). Die höchste
Konzentration der CNP-Transkription wurde im vaskulären Endothel gefunden, außerdem in
Gehirn und Niere (Stein et al. 1998).
4.3.4.1. Auslöser für Synthese und Sekretion von ANP und BNP
ANP und BNP werden kontinuierlich vom Herzen freigesetzt (Yoshibayashi et al. 1996).
Unter physiologischen Bedingungen werden höhere ANP- als BNP-Spiegel im Plasma
76
4. Diskussion
gemessen (Tanaka et al. 1998). Die BNP-Plasmakonzentrationen beim Gesunden werden
zwischen 4,5 ± 0,69 pg/ml und 3,12 ± 0,24 pg/ml (mittels RIA gemessen) angegeben (Lang et
al. 1991).
Bei Gesunden führt eine Natriumbelastung zu erhöhten BNP-Werten (Haug et al. 1993).
Mechanische und neuroendokrine Stimuli erhöhen ebenfalls die Freisetzungsrate. Die meisten
Untersuchungen weisen darauf hin, dass eine erhöhte Dehnung des Myokards mit einem
Anstieg der BNP-Synthese und -Freisetzung einhergeht (Tanaka et al. 1998). Bei LVDysfunktion findet zusätzlich eine ventrikuläre Sezernierung von ANP statt. So kommt es
entsprechend der Hauptsyntheseorte der NPs nach Vorhofdehnung zu vermehrter ANPSekretion, während eine erhöhte Wandspannung im Ventrikel mit einem BNP-Anstieg
beantwortet wird (Tanaka et al. 1998). Die BNP-Expression wird durch ventrikuläre
Überbelastung und Hypertrophie des Myokards induziert (Yoshibayashi et al. 1996).
Linksventrikuläre Dysfunktion führt zu einem stärkeren BNP- als ANP-Anstieg (Haug et al.
1993, Tanaka et al. 1998). Bei hypertropher obstruktiver Kardiomyopathie (HOCM) ist BNP
deutlich erhöht, wohingegen die ANP-Konzentrationen nur einen milden Anstieg zeigen
(Yoshibayashi et al. 1996). Bei Patienten mit Herzinsuffizienz steigen anfangs ANP- und
BNP-Konzentrationen proportional zur Schwere der Erkrankung an. In schweren Fällen ist
der BNP-Anstieg wesentlich drastischer (100-1000fach) als die Erhöhung des ANP-Spiegels
(10-100fach). Die BNP-Konzentration übersteigt dann die ANP-Konzentration (Yoshibayashi
et al. 1996, Mukoyama et al. 1991). Bei Ischämie und Untergang von Herzmuskelgewebe
kommt es ebenfalls zu einer Erhöhung der NPs. Beim akuten Myokardinfarkt (AMI) ist BNP
deutlich stärker erhöht als ANP (Stein et al. 1998, Haug et al. 1993, Tanaka et al. 1998).
4.3.4.2 Beeinflussung der BNP-mRNA-Expression
In Northern Blot Analysen der Patienten mit terminaler Herzinsuffizienz findet sich eine
deutlich erhöhte BNP-mRNA Expression. Die BNP-mRNA Expression ist gegenüber der
Kontrollgruppe durchschnittlich um Faktor 10 erhöht. (Takahashi et al. 1992). Während einer
hypertrophen Stimulation des Myokards wird ANP in den Ventrikeln reexprimiert und die
ventrikuläre Expression von BNP steigt stark an. Die BNP-mRNA-Expression steigt
innerhalb 30 Minuten nach Einsetzen verschiedener hypertropher Stimuli, wie mechanische
Belastung durch stärkere Dehnung des Myokards, Stimulation durch Katecholamine oder
77
4. Diskussion
Angiotensin II um ein mehrfaches des Ausgangswertes an (Radicke et al. 1997, Wiese et al.
1997). BNP wird in geringen Mengen auch in nicht-insuffizientem, nicht-belasteten
Ventrikeln exprimiert. In nichtinsuffizienten Vorhöfen ist die Expression ebenfalls nur sehr
gering. BNP kann als Marker der myokardialen Belastung angesehen werden (Bruneau und de
Bold 1994, Ogawa et al. 1995, Takahashi et al. 1992).
Natriuretische Peptide wurden auch in anderen Gewebearten nachgewiesen. So wurden
mRNA-Transkripte im Nierengewebe, Glandula suprarenalis sowie im Reproduktionstrakt
nachgewiesen (Gutkowska et al. 1993, Komatsu et al. 1991, Suga et al. 1992). BNP-mRNA
wird in allen Knochenmarkzellen exprimiert, während das Protein lediglich in den
endothelialen Stromazellen sezerniert wird (Bordenave et al. 2002). Weiterhin wurde BNPmRNA in malignen Zellen, z.B. beim kleinzelligen Lungenkarzinom nachgewiesen (Ohsaki et
al. 1999).
Um zu überprüfen, ob die Expression von BNP im Ovar unter dem Einfluss von hCG steht,
wurde die Wirkung der hCG-Behandlung auf die BNP-mRNA in isolierten Granulosazellen
analysiert. Die Expression der mRNA-Transkripte für BNP wurde durch die RT-PCRTechnik evaluiert. Die Ergebnisse zeigen, dass hCG keine signifikante Wirkung auf die
Expression der BNP-mRNA in Granulosazellen hat.
Es wurde gezeigt, dass das ANP-System in Ovarien der Ratte exprimiert wird (Gutkowska et
al. 1993). Autoradiographische Untersuchungen haben gezeigt, dass ANP und CNP an die
Granulosazellen in Follikeln binden (Jankowski et al. 1997). Noubani et al. (2000) konnten
CNP- und NPR-B-mRNA in Ovarien der Ratte nachweisen. In Granulosazellen wurden zwar
auch NPR-A-mRNA-Transkripte, jedoch keine spezifische ANP-Bindung nachgewiesen
(Noubani et al. 2000). Dieser Befund lässt vermuten, dass die Expression des NPR-A-Gens zu
keinen nachweisbaren Mengen funktioneller Rezeptoren führt.
Die ANP-Expression im Ovar konnte bereits mehrfach dokumentiert werden (Gutkowska et
al. 1993, Gutkowska et al. 1999, Kim 1992, Pandey et al. 1987, Tornell et al. 1990). CNPRezeptoren (NPR-B) wurden in isolierten humanen Zellen aus dem proximalen Eileiter
nachgewiesen. Im distalen Abschnitt des Eileiters wurden mRNA-Transkripte der ANP- und
BNP-Rezeptoren (NPB-A bzw. NPR-B) festgestellt (Mistry et al. 2001). Während der
Schwangerschaft wurden im Decidua parietalis, Chorion laeve, Myometrium sowie in der
Plazenta mittels Northern Blot Analyse sowohl NPR-A- als auch NPR-B-mRNA
78
4. Diskussion
nachgewiesen (Itoh et al. 1994). In Amnionzellen kommen hohe Mengen an natriuretischen
Peptiden Typ B vor, die in der Schwangerschaft eine parakrine Wirkung auf das benachbarte
Gewebe haben. Dieses Mechanismus könnte eine Rolle bei der Aufrechterhaltung der
Schwangerschaft spielen (Itoh et al. 1994).
Es liegen keine Berichte über die möglichen Wirkungen des BNP auf das Ovar vor. Es muss
aber bemerkt werden, dass manche Organe, die NP-Rezeptoren aufweisen, auch die
spezifischen NP-Liganden exprimieren (Terada et al. 1994, Vollmar et al. 1993).
Beispielweise weist das Herz, der Hauptort der ANP- und BNP-Synthese, spezifische
Rezeptoren für natriuretische Peptide auf (Vollmar et al. 1993). Neuere Untersuchungen
zeigen, dass CNP und sein Rezeptor, NPR-B, in verschiedenen Gewebearten koexprimiert
werden (Niere, Herz, Chondrozyten) (Vollmar et al. 1993, Hagiwara et al. 1994).
Es wird angenommen, dass die endogenen natriuretischen Peptide in diesen Organen
parakrine oder autokrine Effekte hervorrufen. So wurde in Chondrozyten der Ratte, z.B., eine
autokrine Regulation der Zellproliferation durch CNP und seinen Rezeptor, NPR-B,
nachgewiesen (Hagiwara et al. 1994).
Die Rolle der natriuretischen Peptide im Ovar ist unklar. Sandberg et al. (1993) zeigten, dass
ANP die Progesteron-induzierte Eireifung bei Xenopus verstärkt. Tornell et al. (1990) zeigten,
dass ANP die spontane Eireifung im Cumulus oophorus der Ratte inhibiert. Diese Befunde
sprechen für eine beschränkte Wirkung der natriuretischen Peptide auf eine Subgruppe der
Granulosazellen, z.B. Cumuluszellen (Noubani et al. 2000).
79
5. Zusammenfassung
5. Zusammenfassung
Die Entwicklung des Corpus luteums aus den Granulosazellen des rupturierten Follikels nach
der Ovulation ist abhängig von der Zufuhr von Gonadotropinen, insbesondere von humanem
Choriongonadotropin. Dieser Umwandlungsprozess geht einher mit massiven strukturellen
und physiologischen Veränderungen. Eine bedeutende Rolle kommt dabei der Angiogenese
zu, die durch hCG über eine Steigerung der VEGF-Expression mitreguliert wird. Durch den
Einfluss von hCG kommt es zum „luteal rescue“, dies wird auch über die Regulation von
Apoptose-assoziierten Genen bewirkt, welche im Ablauf der luteolytischen Prozesse
involviert sind.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, weitere Gene zu identifizieren welche sich in
Granulosazellen durch hCG in ihrer Transkription beeinflussen lassen sowie zugehörige
Regulationsmechanismen aufzuzeigen, über die hCG einen Einfluss auf die Transkription
dieser Gene ausüben kann. Ferner sollte geprüft werden, ob die Suppressive Subtractive
Hybridization eine geeignete Methode ist, differentiell exprimierte Gene in Granulosazellen
zu identifizieren.
Nach Durchführung der SSH erschienen die in vier Vektoren enthaltenen Fragmente
wahrscheinlich Transkripte differentiell exprimierter Gene zu sein. Zum Nachweis der hCGabhängigen Regulation in induzierten und nicht induzierten Granulosazellen wurde die RTPCR durchgeführt.
Die densitometrische Auswertung der hHR23B-mRNA-Expression ergab einen signifikanten
Unterschied der Intensität der Bandenfärbung zwischen Probe und Kontrolle. Dies bedeutet,
dass hHR23b unter dem Einfluss von hCG in vitro in Granulosazellen signifikant vermehrt
exprimiert wird, dies könnte über den Signalweg der Proteinkinase C erfolgen.
Der Einfluss von hCG auf die rP-S6-mRNA-Expression, die BNP-mRNA-Expression und die
γ-Aktin-mRNA-Expression in den Granulosazellen konnte mittels RT-PCR nicht als
signifikant verifiziert werden.
Mit Hilfe der SSH war es also möglich durch hCG differentiell exprimierte Gene in humanen
Granulosazellen zu identifizieren. Weiterführende Analysen, auch auf Protein-Ebene, sollten
daher Inhalt weiterer experimenteller Arbeiten sein.
80
6. Abbildungsverzeichnis
6. Abbildungsvereichnis
Abb.1.1: Schematische Darstellung des hormonellen Regelkreises ( aus Stauber und
Weyerstahl, 2005) ............................................................................................................... 3
Abb.1.2: Schematische Darstellung der Follikelreifung (aus...................................................... 6
Abb.2.1: Darstellung einer Granulosazellkultur nach 48h Inkubation (10fache
Vergrößerung). .................................................................................................................. 12
Abb.2.2: Schematische Darstellung zur Veranschaulichung der Subtraktiven Hybridisierung
und dem daraus resultierenden Amplifikationsverhalten der einzelnen Hybride (nach
cDNA Subtraction Kit,
dem Benutzerhandbuch CLONTECH PCR-SELECTTM
Clontech). .......................................................................................................................... 16
Abb.3.1: RNA-Proben von Isolationen aus verschiedenen Granulosazellpräparationen,
aufgetragen auf einem 1%-igen Agarosegel nach Ethidiumbromid-Färbung................... 34
Abb.3.2: dargestellt sind: 1:Tester 1-1 (Adaptor1-ligiert), G3PDH-3`-Primer und PCRPrimer 1; 2: Tester 1-1, G3PDH-3` und 5`-Primer; 3: Tester 1-2 (Adaptor2R-ligiert),
G3PDH-3`-Primer und PCR-Primer 2R; 4: Tester 1-2, G3PDH-3` und 5`-Primer.
Wobei Tester der hCG-induzierten cDNA entspricht. ...................................................... 35
Abb.3.3: dargestellt sind:1:Tester 1-1 (Adaptor1-ligiert), G3PDH-3`-Primer und PCR-Primer
1; 2: Tester 1-1, G3PDH-3` und 5`-Primer; 3: Tester 1-2 (Adaptor2R-ligiert), G3PDH3`-Primer und PCR-Primer 2R; 4: Tester 1-2, G3PDH-3` und 5`-Primer. Wobei Tester
der nicht hCG-induzierte cDNA entspricht....................................................................... 35
Abb.3.4: Darstellung der PCR-Amplifikation von G3PDH in der Subtraktion (oberes Bild)
und unsubtrahierten Kontrolle (unteres Bild). Die Proben wurden jeweils bei 18 (Bahn
1), 23 (Bahn 2), 28 (Bahn 3) und 33 (Bahn 4) Zyklen entnommen. ................................. 36
Abb.3.5: Darstellung der PCR-Amplifikation nach Durchführung der Subtraktion. . Bahn 1
entspricht der subtrahierten Probe unter Einsatz induzierter Tester-cDNA,Bahn 2 der
zugehörigen Kontrolle. Bahn 3 entspricht der subtrahierten Probe unter Einsatz nichtinduzierter Tester-cDNA,Bahn, 4 der zugehörigen Kontrolle. ......................................... 37
Abb.3.6: Darstellung der PCR-Amplifikate der Plasmid-Inserts nach Auftrennung in einem
1%-igen Agarosegel und Anfärbung in Ethidiumbromid. ................................................ 38
Abb.3.7: Darstellung der PCR-Amplifikate der Plasmid-Inserts nach Auftrennung in einem
1%-igen Agarosegel und Anfärbung in Ethidiumbromid. ................................................ 38
Abb.3.8: Dargestellt sind Dot Blot-Membranen nach Hybridisierung mit einer induzierten
(oben) und einer nicht induzierten (unten) radioaktiv markierten cDNA-Sonde. In dem
gekennzeichneten Bereich entsprechen dabei drei nebeneinander liegende Punkte von
rechts nach links den absteigenden Konzentrationen........................................................ 39
Abb.3.9: Darstellung der Intensitätsunterschiede in den Hybridisierungen. Dargestellt als
Mittelwerte ±Standardfehler (M±SEM). Für die gezeigten Werte liegen mind. drei
Hybridisierungen mit verschiedenen Sonden vor. * Signifikante Unterschiede im t-test
(p<0,05). ............................................................................................................................ 40
Abb.3.10: Nachweis der spezifischen GAPDH-Expression der untersuchten humanen
Granulosazellen
durch
RT-PCR.
Es
wurden
6
verschiedene
Granulosazellpräparationen eingesetzt, jeweils mit (P) und ohne (K) hCG-Stimulation.
Darstellung der Banden bei 657bp nach Anfärbung in Ethidiumbromid.......................... 47
Abb.3.11: Darstellung der spezifischen GAPDH-Expression der untersuchten humanen
Granulosazellen bei unterschiedlichen Zykluszahlen (20, 25, 27, 30, 33 Zyklen) durch
RT-PCR. Darstellung der Banden bei 657bp nach Anfärbung in Ethidiumbromid.......... 48
81
6. Abbildungsverzeichnis
Abb.3.12: Nachweis der spezifischen Transkriptionsprodukte von hHR23b in humanen
Granulosazellen durch RT-PCR. Darunter sind die zur Normalisierung eingesetzten
korrespondierenden GAPDH-Banden abgebildet. Darstellung der Banden nach
Anfärbung in Ethidiumbromid. ......................................................................................... 49
Abb.3.13: Densitometrische Auswertung der hHR23b-mRNA-Expression in humanen
Granulosazellen. Die Daten sind als Mittelwert von fünf Proben und den zugehörigen
Kontrollen ±Standardfehler (M±SEM) dargestellt. Die Unterschiede sind im t-Test
signifikant (p=0,049)......................................................................................................... 49
Abb.3.14: Nachweis der spezifischen Transkriptionsprodukte von γ-Actin in humanen
Granulosazellen durch RT-PCR. Darunter sind die zur Normalisierung eingesetzten
korrespondierenden GAPDH-Banden abgebildet. Darstellung der Banden nach
Anfärbung in Ethidiumbromid. ......................................................................................... 50
Abb.3.15: Densitometrische Auswertung der γ-Actin-mRNA-Expression in humanen
Granulosazellen. Die Daten sind als Mittelwert von fünf Proben und den zugehörigen
Kontrollen ±Standardfehler (M±SEM) dargestellt. Die Unterschiede sind im t-Test
nicht signifikant (p=0,62).................................................................................................. 50
Abb.3.16: Nachweis der spezifischen Transkriptionsprodukte von rP S6 in humanen
Granulosazellen durch RT-PCR. Darunter sind die zur Normalisierung eingesetzten
korrespondierenden GAPDH-Banden abgebildet. Darstellung der Banden nach
Anfärbung in Ethidiumbromid. ......................................................................................... 51
Abb.3.17: Densitometrische Auswertung der rP S6 -mRNA-Expression in humanen
Granulosazellen. Die Daten sind als Mittelwert von fünf Proben und den zugehörigen
Kontrollen ±Standardfehler (M±SEM) dargestellt. Die Unterschiede sind im t-Test
nicht signifikant (p=0,383)................................................................................................ 52
Abb.3.18: Nachweis der spezifischen Transkriptionsprodukte von BNP in humanen
Granulosazellen durch RT-PCR. Darunter sind die zur Normalisierung eingesetzten
korrespondierenden GAPDH-Banden abgebildet. Darstellung der Banden nach
Anfärbung in Ethidiumbromid. ......................................................................................... 52
Abb.3.19: Densitometrische Auswertung der BNP-mRNA-Expression in humanen
Granulosazellen. Die Daten sind als Mittelwert von fünf Proben und den zugehörigen
Kontrollen ±Standardfehler (M±SEM) dargestellt. Die Unterschiede sind im t-Test
nicht signifikant (p=0,434)................................................................................................ 53
Abb.4.1: Modell für den Aufbau des menschlichen NER-Komplexes (aus You et al. 2002)... 63
Abb.4.2: Übersicht zu G- und F-Aktin (nach Alberts et al. 2000). ........................................... 67
Tab.4.1: Ribosomen in Eukaryonten-Zellen (aus Knippers 1995)........................................... 72
Abb.4.3: Strukturen der natriuretischen Peptide (nach Riegger et al 1996).............................. 76
82
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102
8. Danksagung
8. Danksagung
Ich bedanke mich ganz herzlich bei Prof. Dr. G. Gitsch für die Überlassung des Themas,
sowie für die Möglichkeit die vorliegende Arbeit an der Universitätsfrauenklinik Freiburg
fertig zu stellen.
Herrn PD Dr. Keck danke ich herzlich für die Aufnahme als Doktorand in die Arbeitsgruppe
und die Unterstützung während der Anfertigung dieser Arbeit.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. D. Pietrowski für dessen tatkräftige Unterstützung und
ausführliche Hilfe, die ich von ihm jederzeit in Form anregender Diskussionen, sowie
Ratschlägen zur Durchführung der diversen Methoden erhalten habe. Seine anhaltende
Motivation hat entscheidend zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen.
Bei Frau H. Bettendorf und Herrn M. Jäger möchte ich mich herzlich für die vielfach
gewährte praktische Hilfe während der Durchführung der Versuche bedanken.
Den weiteren Doktoranden der Gruppe danke ich für die kollegiale Zusammenarbeit und die
gute Atmosphäre innerhalb des Labors.
Für die Überlassung der Granulosazellen bedanke ich mich bei der gynäkologischen Praxis
Prof. Dr. Geisthövel sowie der IVF-Ambulanz der Universitätsfrauenklinik Freiburg.
Meiner Familie und meinen Freunden danke ich für die von Ihnen erfahrene Unterstützung
und Geduld während der Entstehung dieser Arbeit.
103
9. Lebenslauf
Name:
Philipp Max Ulrich Saur
Staatsangehörigkeit:
Geburtsdatum:
Geburtsort:
Adresse:
Eltern:
deutsch
15.08.1976
Nürtingen
Amalienstr. A 59, 86633 Neuburg a. d. Donau
Vater: Dr. Hans Saur (Diplom-Kaufmann)
Mutter: Eva Saur, geb. Holder
SCHULBILDUNG
1987-1993
1993-1994
1994-1997
17. Juni.1997
Dietrich-Bonhoeffer-Gymnasium in Metzingen
Millbrook School, Millbrook, USA
Theodor-Heuss-Schule in Reutlingen
Abitur
HOCHSCHULBILDUNG
Oktober
1997
17. September
29. August
04. September
22.November
1999
2000
2003
2004
Beginn des Studium der Humanmedizin an der AlbertLudwigs-Universität in Freiburg i. Br.
Ärztliche Vorprüfung
Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
Dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung
PRAKTISCHE AUSBILDUNG
•
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•
•
4-wöchige Famulatur in der Winghoffer-Klinik in Rottenburg
(Unfallchirurgie und Sporttraumatologie) im März/April 2000
4-wöchige Famulatur im Kantonsspital Chur, Schweiz im
Februar/April 2001 (Radiologie)
4-wöchige Famulatur im Victoria Hospital Mahe, Seychellen im
August 2001 (Gynäkologie)
PJ-Tertial Chirurgie im Tygerberg Hospital, University of
Stellenbosch, Südafrika, Oktober 2003-Januar 2004
PJ-Tertial Wahlfach in der Abteilung Urologie des
Universitätsklinikums Freiburg, Februar -Mai 2004
PJ-Tertial Innere im Klinikum Konstanz, Mai-August 2004
BERUFLICHER WERDEGANG
Seit April 2005 Assistenzarzt in der Urologischen Klinik des Klinikum
Ingolstatdts, Direktor Prof. Dr. A. Manseck
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