Dissertation_Reimer, Anna - Publications at Bielefeld University
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BiokatalytischeSynthesenvon
ɛ–CaprolactonundchiralenAminen
Dissertation
zurErlangungdesDoktorgrades
derNaturwisenschaften
(Dr.rer.nat.)
vorgelegtder
FakultätfürChemiederUniversitätBielefeld
von
AnnaReimer
ausPretorija/Russland
Bielefeld,August2015
Inmemoriam
JAKOBREIMER
AlsDissertationvorgelegtderFakultätfürChemiederUniversitätBielefeld.
Erstberichterstatter:
Zweitberichterstatter: Prof.Dr.HaraldGröger
Prof.Dr.NorbertSewald
Die vorliegende Arbeit wurde in der Organischen Chemie der Fakultät für Chemie der Universität
BielefeldunterderLeitungvonProf.Dr.HaraldGrögerimZeitraumvomApril2011bisAugust2015
erstellt.
AnnaReimer,BiokatalytischeSynthesenvonɛ–CaprolactonundchiralenAminen
©August2015
TeiledieserArbeitsindbereitsveröffentlicht:
Posterpräsentation:
AnnaReimer,SvenjaStaudt,UweBornscheuer,UlfMenyes,HaraldGröger,“EstablishingofGCanalytics
forenzymicallycatalysedBaeyer‐Villigerreaction”,7.CeBiTecSymposium,ZentrumfürInterdisziplinäre
Forschung(ZiF),UniversitätBielefeld,17.–19.Dezember2012.
Publikationen:
AnnaReimer,SeverinWedde,SvenjaStaudt,SandySchmidt,DanielaHöffer,WernerHummel,UdoKragl,
UweBornscheuer,HaraldGröger,ProcessDevelopmentThroughSolventEngineeringintheBiocatalytic
SynthesisoftheHeterocyclicBulkChemicalɛ–Caprolactone, J.Heterocyc.Chem.2015,eingereicht.
FlorianUthoff,AnnaReimer,AndreasLiese,HaraldGröger,EnantioselectiveSynthesisofChiralAmines
ThroughEnzymaticResolutionunderSolvent‐freeConditions,Adv.Synth.Catal.2015,eingereicht.
Danksagung
AndieserStellemöchteichalldenendanken,diedurchihrefachlicheundpersönlicheUnterstützung
zumGelingendieserArbeitbeigetragenhaben.
MeinbesondererDankgiltProf.Dr.HaraldGrögerfürdieBetreungmeinerDissertation.Insbesondere
dankeichfürdieBereitstellungderinteressantenThemenunddieHilfsbereitschaft,diekontinuierliche
FörderungunddiefachlichenGespräche.
IchdankeProf.Dr.NorbertSewaldfürdieÜbernahmedesZweitgutachtens.
Der Deutschen Bundeststiftung Umwelt (DBU) danke ich für die finanzielle Förderung des Projektes
„Nachhaltige,biokatalytischeOxidationsprozesse“.DerFirmaEnzymicalsAGundderArbeitsgruppevon
Prof.Dr.WernerHummelgiltmeinDankfürdiezurVerfügunggestelltenMonooxygenasenbzw.der
Alkohol‐Dehydrogenase.
EingroßerDankgehörtdenbeidengutenSeelenderArbeitsgruppe:ThomasGeislerundArjaGaestel.
BeidehabenmitIhrerunendlichfreundlichenArteineschöneAtmosphäregezaubert.Niemandkann
einen morgens fröhlicher begrüßen, mit einem Schmunzeln besser die Ruhe bewahren und eine
leckerereFeuerzangenbowlebastelnalsThomas.ArjadankeichfürdiezahlreichenPläuschchenund
Urlaubsimpressionenimmermalwiederzwischendurch.
Des Weiteren danke ich der MS‐Abteilung: Dr. Jens Spross, Sandra Heitkamp (Danke für die ESI‐
Messungen)undHeinz‐WernerPatruck,derbeiHilfe‐RufeninComputerfragensofortzurStellewar.
Herrn Peter Mester danke ich für die superschnellen NMR‐Messungen, die teilweise schon auf den
Serverhochgeladenwaren,bevormandenWegzurückinsLaborgeschaffthatte.FrauBrigitteMichel
dankeichfürdieDurchführungderElementaranalysen.
IchdankedemehemaligenAKMattayfürdiefreundlicheAufnahmeindiewunderbareWeltderOCI.
MeinDankgiltdenehemaligenundaktuellenMitgliedernderArbeitsgruppe:Dr.KaiAltenhöner*Daniel
Bakonyi–ischweiß,wodingGrillsteht,mingJung,unischfühlemicheingeladen!*TobiasBetke*Dr.
SebastianBringmann–dankefürdeinehumorvolleArt*Dr.JensEberhard–einwandelndesLehrbuch,
sprudelndvorIdeen*WilkoGreschner–einVirtouseanderKaffeemaschine*Dr.AnkeHummel–danke
fürdasKorrekturlesen!*Dr.FlorianMay*Dr.RichardMetzner–dankefürdasKorrekturlesenundnoch
vielesmehr(Fünnünününü!)*Dr.MichaelPeter*MatthiasPieper*PhilippRommelmann*Katharina
Tenbrink*Dr.OliverTosic*FlorianUthoff–denichumseineGelassenheitbeneide*SeverinWedde*
Dr.SebastianWiegmann–erkönntedieWeltmitStativstangenundAlufolieretten*sowiesämtlichen
KollegendesAKinErlangen.DankefürdienetteAtmosphäreimLabor,dievielenschönenausufernden
DiskussionenindenPausensowiedieMario‐Kart‐Abende,dieprofessionellenBrauerei‐Besichtigungen
und Boßel‐Hochleistungssport‐Ausflüge, PubQuiz‐Abende, Glühweinmarkt‐Besuchen und noch vieles
mehr.EswareineschöneZeit!
Dr.SvenjaStaudtdankeichfürdiefreundlicheHilfestellungenundTippsundTricksfürdenEinstiegin
die Thematik. Ich danke Mathilde Brax und Jan‐Phlipp Broschinski für die synthetischen Arbeiten
während ihrer Forschungspraktika und sämtlichen Azubis (Dank an Evelyn Schulde für die helfende
HandamKolben)undHiWis.DenDoktorandenderOCIIundOCIIIdankeichfürdengemeinsamen
ZeitvertreibwährendderPraktikumsbetreuungimSaal.
Meiner Büro‐Familie, Ramona Bringmann, Dr. Tina Reß und Marc Biermann, danke ich für die
fruchtbarenDiskussionenüberChemie,MSWordsowiedieWeltunddasLeben.„WennausKollegen
Freundewerden“odereinfach:ihrseidmirindiesenJahrensehransHerzgewachsen.Inbesonderem
MaßemöchteichmichbeiTinafürihreFreundschaftbedanken.EsgibtnochvieleschlechteFilmezu
schauen,vielWeinzutrinkenundunendlichvielzubereden–ichfreuemichdarauf!
MeinenFreundenundLiebenaußerhalbderUnidankeichfürihrVerständnis.Ichkonntemichimmer
aufihroffenesOhrundihrenUnterstützungverlassen,auchwennihnennichtimmersoklarwar,was
genauichdainderUnieigentlichsomache.
ZumSchlussdankeichdenfürmichkostbarstenMenschen:ichdankemeinemFreundRobertfürseine
geduldige moralische Unterstützung und seine Liebe. Mein Bruder Viktor danke ich für seine
Ermutigungen und dafür, dass er der beste Bruder ist. Meiner Mutter Erna, die mir diese Chancen
ermöglichthat,dankeichaustiefstemHerzenfürdasinmichgesetzteVertrauen.Ohneeuchhätteich
diesenlangenWegnichtgehenkönnen.DANKE!
Inhalt
Inhalt....................................................................................................................................................................I Abkürzungsverzeichnis..............................................................................................................................IX 1 Einleitung..........................................................................................................................................................1 2 MotivationundZielsetzung.........................................................................................................................3 3 2.1 EnzymkatalysierteOxidationvonCyclohexanol(1).....................................................................3 2.2 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen.............................................................................5 EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen.............................................................................9 3.1 ChemischeBAEYER‐VILLIGER‐Oxidation................................................................................................9 3.1.1 KlassischeBAEYER‐VILLIGER‐Oxidation.................................................................................................9 3.1.2 StandderWissenschaft:klassischeBAEYER‐VILLIGER‐Oxidation...........................................12 3.1.3 StereoselektiveBAEYER‐VILLIGER‐Oxidation....................................................................................14 3.2 EnzymkatalysierteSynthesen..............................................................................................................15 3.2.1 EnzymatischeBAEYER‐VILLIGER‐Oxidation.......................................................................................15 3.2.2 BAEYER‐VILLIGER‐Monooxygenasen.....................................................................................................16 3.2.2.1 Allgemeines...................................................................................................................................................16 3.2.2.2 StrukturundMechanismus...................................................................................................................18 3.2.3 Alkohol‐Dehydrogenasen.......................................................................................................................23 3.2.4 Cofaktor‐Regeneration............................................................................................................................26 3.3 EigeneErgebnisseundDiskussion.....................................................................................................29 3.3.1 Standardreaktion:DoppeloxidationvonCyclohexanol(1)zuɛ‐Caprolacton(3).........29 3.3.2 EtablierunganalytischerMethoden...................................................................................................30 3.3.2.1 UmsatzbestimmungmittelsNMR‐Analytik....................................................................................30 3.3.2.2 UmsatzbestimmungmittelsGaschromatographie......................................................................32 3.3.2.3 ErmittlungderRückgewinnungsrate................................................................................................33 3.3.2.4 VergleichderAnalytik‐MethodenanhandderStandard‐Reaktion.....................................36 3.3.2.5 AktivitätsbestimmungmittelsUV/Vis‐SpektroskopieundBRADFORD‐Test.....................37 3.3.2.6 OptimierungderStandardreaktion...................................................................................................39 3.3.3 UntersuchungenmittelsTitrations‐Apparatur.............................................................................43 3.3.4 VerwendungvonAdsorberharzen.....................................................................................................46 I
3.3.5 4 VariationderSubstrate...........................................................................................................................48 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen...............................................................................53 4.1 Lipasen............................................................................................................................................................53 4.1.1 Allgemeines..................................................................................................................................................53 4.1.2 StrukturundMechanismus...................................................................................................................54 4.1.3 EnantioselektivitätvonLipasen..........................................................................................................57 4.2 StandderWissenschaft:Aminsynthesen........................................................................................58 4.2.1 KlassischchemischeundchemokatalytischeSynthesen.........................................................58 4.2.2 EnzymkatalysierteSynthesen..............................................................................................................64 4.3 EigeneErgebnisseundDiskussion.....................................................................................................73 4.3.1 ReferenzenundAnalytik........................................................................................................................73 4.3.1.1 SynthesederReferenzverbindungen................................................................................................73 4.3.1.2 Analytik..........................................................................................................................................................75 4.3.2 VorversuchemitsubstituiertenBenzylaminenalsSubstrate................................................79 4.3.2.1 SynthesedesBenzylamids133...........................................................................................................79 4.3.3 EnzymatischeAcylierungsubstituierterBenzylamine.............................................................80 4.3.4 EnzymatischeRacematspaltungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)........................................85 4.3.4.1 Prozessoptimierung..................................................................................................................................86 4.3.4.1.1 EinflussderTemperaturundReaktionszeit..................................................................................86 4.3.4.1.2 VergleichmitbestehendenindustriellenProzessen..................................................................88 4.3.5 Enzymrecycling...........................................................................................................................................89 4.3.6 VerwendungvonalternativenLipasen............................................................................................90 4.3.6.1 Lipasen‐Screening.....................................................................................................................................90 4.3.6.2 VerwendungderLipasenvonC‐LECTAalsBiokatalysatoren..................................................93 4.3.7 VariationderAcyldonoren....................................................................................................................96 4.3.7.1 VergleichderAcyldonorenunterStandard‐Reaktionsbedingungen..................................97 4.3.7.2 VergleichderAcyldonorenbeiverringerterTemperatur.......................................................99 4.3.7.3 ParallelablaufendechemischeAcylierungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)................100 4.3.8 ReaktionskinetikenderRacematspaltungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)mit
unterschiedlichenAcyldonoren.......................................................................................................102 II
4.3.9 Substratbreite...........................................................................................................................................107 4.3.9.1 1‐Aminoindan(rac‐130).....................................................................................................................107 4.3.9.2 SekundäreAmine....................................................................................................................................112 4.3.10 ɛ–Caprolacton(3)alsAcyldonor......................................................................................................116 4.3.10.1 ChemischeAcylierungmitɛ–Caprolacton(3)............................................................................116 4.3.10.2 EnzymatischeAcylierungvonBenzylamin(134)mitɛ‐Caprolacton(3)......................118 4.3.10.3 EnzymatischeAcylierungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)mitɛ–Caprolacton
(3)...................................................................................................................................................................119 4.3.10.4 5 6 7 EnzymatischeAcylierungvonsekundärenAminenmitɛ‐Caprolacton(3)..................123 Zusammenfassung.....................................................................................................................................125 5.1 EnzymatischeOxidationvonCyclohexanol(1)mittelsCHMO...........................................125 5.2 EnzymatischeRacematspaltungchiralerAmine.......................................................................127 Summary.......................................................................................................................................................132 6.1 Enzymaticoxidationofcyclohexanol(1)bymeansofCHMO.............................................132 6.2 Enzymaticresolutionofchiralamines..........................................................................................134 ExperimentellerTeil.................................................................................................................................139 7.1 VerwendeteChemikalienundGeräte............................................................................................139 7.2 Synthesen,MethodenundspektroskopischeDaten................................................................142 7.2.1 EnzymatischeOxidationvonCyclohexanol(1)unterEinsatzvonCHMOund
LK‐ADH........................................................................................................................................................142 7.2.1.1 Standardreaktion:AllgemeineArbeitsvorschrift1(AAV1):Enzymatische
OxidationvonCyclohexanol(1)zuε‐Caprolacton(3)...........................................................142 7.2.1.2 Analytik........................................................................................................................................................143 7.2.1.2.1 Umsatzbestimmungmittels1H‐NMR‐Spektroskopie..............................................................143 7.2.1.2.2 StabilitätvonUrotropin(51)alsStandard.................................................................................143 7.2.1.2.3 BestimmungderRückgewinnungsratemittelsNMR..............................................................143 7.2.1.3 UmsatzbestimmungmittelsGC.........................................................................................................144 7.2.1.3.1 ErstellenderEichgerade......................................................................................................................144 7.2.1.3.2 BestimmungderDurchschnittsabweichungen..........................................................................144 7.2.1.3.3 BestimmungdesWiederfindungsratemittelsGC.....................................................................145 7.2.1.3.4 BestimmungderWiederfindungsrateinAnwesenheitvonLk‐ADH...............................146 7.2.1.3.5 EinflussderEnzympellet‐BildungaufdieRückgewinnungsrate......................................146 7.2.1.3.6 VergleichderAnalytikmethoden:GCvs.NMR...........................................................................147 7.2.1.4 Photometertests......................................................................................................................................148 III
7.2.1.4.1 BestimmungderEnzymaktivitätderLk‐ADHgegenüber3,3,5‐Trimethyl‐
cyclohexanol(53)...................................................................................................................................148 7.2.1.4.2 AllgemeineArbeitsvorschrift2(AAV2):BestimmungderEnzymaktivitätder
CHMO............................................................................................................................................................149 7.2.1.4.3 BVMO‐ScreeningundBRADFORD‐TestzurOxidationvonCyclohexanol(2).................149 7.2.1.4.4 AktivitätsbestimmungderCHMOgegenüberIsophoron(52)...........................................150 7.2.1.5 OptimierungderStandard‐Reaktion..............................................................................................150 7.2.1.5.1 AllgemeineArbeitsvorschrift3(AAV3):Doppeloxidationzuɛ‐Caprolacton(3)
mitoptimierterAufarbeitung............................................................................................................150 7.2.1.5.2 VariationdesLösungsmittels............................................................................................................151 7.2.1.5.3 VariationderReaktionsbedingungen............................................................................................152 7.2.1.6 AllgemeineArbeitsvorschrift4(AAV4):UntersuchungderStabilitätderLk‐
ADHmittelsTitrations‐Apparatur..................................................................................................152 7.2.1.7 VariationdesSubstrates......................................................................................................................153 7.2.1.7.1 3,5,5‐Trimethylcyclohexanol(53)alsSubstrat.........................................................................153 7.2.1.7.2 Isophoron(52)alsSubstrat...............................................................................................................154 7.2.1.8 VerwendungvonAdsorberharzen..................................................................................................155 7.2.1.8.1 BestimmungderRückgewinnungsrateinAnwesenheitvonXAD‐7und
XAD‐1180...................................................................................................................................................155 7.2.1.8.2 DoppeloxidationvonCyclohexanol(1)inAnwesenheitvonXAD‐7................................155 7.2.2 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminenmittelsLipasen.....................................157 7.2.2.1 AllgemeineArbeitsvorschrift5(AAV5):SynthesevonReferenzverbindungen........157 7.2.2.1.1 SynthesedesDL‐Ethyl‐3‐oxo‐3‐(1‐phenylethylamino)propanoats(rac‐10)..............157 7.2.2.1.2 Synthesedes2‐Phenoxy‐N‐(1‐phenylethyl)acetamids(rac‐121)....................................158 7.2.2.1.3 Synthesedes2‐Cyano‐N‐(1‐phenylethyl)‐acetamids(rac‐123).......................................158 7.2.2.1.4 SynthesedesN‐(1‐Phenylethyl)acetamids(rac‐7).................................................................159 7.2.2.1.5 Synthesedes2‐Phenyl‐N‐(1‐phenylethyl)acetamids(rac‐126).......................................160 7.2.2.1.6 Synthesedes2‐Methoxy‐N‐(1‐phenylethyl)acetamids(rac‐8).........................................161 7.2.2.1.7 SynthesedesEthyl‐3‐((2,3‐dihydro‐1H‐inden‐1‐yl)amino)‐3‐oxo‐propanoats
(rac‐129)....................................................................................................................................................161 IV
7.2.2.2 Analytik.......................................................................................................................................................162 7.2.2.2.1 ValidierungderAufarbeitungvonAAV5mittelsNMR‐Analytik.......................................162 7.2.2.2.2 BestimmungderEnantiomerenüberschüssedurchchemischeAcylierungdes
resultierendenAmins(S)‐4................................................................................................................163 7.2.2.3 VorversuchezurenzymatischenAcylierungmitBenzylaminenalsSubstrate...........164 7.2.2.3.1 SynthesevonEthyl‐3‐(benzylamino)‐3‐oxopropanoat(133)............................................164 7.2.2.3.2 AnalysedesDiamidsN,N‘‐Dibenzylmalonamid(137)...........................................................165 7.2.2.3.3 AllgemeineArbeitsvorschrift6(AAV6):EnzymatischeAcylierung
substituierterBenzylamine................................................................................................................166 7.2.2.3.4 EnzymatischeSynthesevonEthyl‐3‐(benzylamino)‐3‐oxopropanoat(133).............166 7.2.2.3.5 EnzymatischeSynthesevonN‐(m‐Hydroxybenzyl)‐N‐ethylmalonamid(141)..........166 7.2.2.3.6 EnzymatischeSynthesevonN‐(m‐Bromobenzyl)‐N‐ethylmalonamid(145).............167 7.2.2.3.7 SynthesevonN‐(m‐Methoxybenzyl)‐N‐ethylmalonamid(143)........................................168 7.2.2.3.8 BestimmungdesVerlustsvonBenzylamin(134)undMalonsäurediethylester
(9)...................................................................................................................................................................168 7.2.2.3.9 AllgemeineArbeitsvorschrift7(AAV7):Kontrollederchemischen
ParallelreaktionderAcylierungverschiedenerBenzylamine............................................169 7.2.2.3.10 UntersuchungenzurDiamidbildungausgehendvon3‐Methoxybenzylamin
(139).............................................................................................................................................................170 7.2.2.3.11 LösungsmitteleffektderenzymatischenAcylierungsubstituierterBenzylamine.....170 7.2.2.4 EnzymatischenRacematspaltungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)..................................171 7.2.2.4.1 Standardreaktion:Racematspaltungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)mit
Malonsäurediethylester(9)................................................................................................................171 7.2.2.4.2 ProzessoptimierungderenzymatischenRacematspaltungvonrac‐4............................172 7.2.2.4.3 UntersuchungderParallelreaktionderAcylierungvon1‐Phenylethylamin
(rac‐4)..........................................................................................................................................................173 7.2.2.4.4 EnzymatischeRacematspaltungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)beigeringerer
Enzymbeladung.......................................................................................................................................173 7.2.2.4.5 EnzymatischeRacematspaltungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)beigeringerer
EnzymbeladunginEt2O........................................................................................................................174 7.2.2.5 Enzymrecycling........................................................................................................................................174 7.2.2.6 Lipasen‐ScreeningdurchAcylierungvonAminen...................................................................175 7.2.2.6.1 Lipasen‐ScreeningdurchAcylierungvonBenzylamin(134).............................................175 7.2.2.6.2 Lipasen‐ScreeningdurchAcylierungvon3‐Hydroxybenzylamin(138).......................176 7.2.2.6.3 Lipasen‐ScreeningdurchAcylierungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)...........................177 V
7.2.2.7 EnzymatischeRacematspaltungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)mit
alternativenLipasenCAL‐BvonC‐LECTA......................................................................................178 7.2.2.7.1 AllgemeineArbeitsvorschrift9(AAV9):VergleichderAktivitätvonLipasen
vonC‐LECTAmittelsTitrationmitNaOH.......................................................................................178 7.2.2.7.2 BestimmungderEnzymaktivitätenderLipasenvonC‐LECTAmittels
enzymatischerSpaltungdesEssigesters5bei20°C..............................................................178 7.2.2.7.3 BestimmungderEnzymaktivitätenderLipasenmittelsenzymatischer
SpaltungdesEssigesters5bei60°C..............................................................................................179 7.2.2.7.4 EnzymatischeRacematspaltungvonrac‐4mittelsimmobilisierterCAL‐Bvon
C‐LECTA.........................................................................................................................................................180 7.2.2.7.5 EnzymatischeRacematspaltungvonrac‐4mittelslyophilisierterCAL‐Bvon
C‐LECTA.........................................................................................................................................................180 7.2.2.8 VariationderAcyldonoren.................................................................................................................181 7.2.2.8.1 EnzymatischeRacematspaltungvonrac‐4mitalternativenAcyldonoren...................181 7.2.2.8.2 ParallelablaufendechemischeAcylierungvonrac‐4mitunterschiedlichen
Acyldonoren..............................................................................................................................................182 7.2.2.8.3 KinetikderRacematspaltungvonrac‐4mitMalonsäurediethylester(9)....................183 7.2.2.8.4 KinetikderRacematspaltungvonrac‐4mitPhenoxyessigsäureethylester
(122).............................................................................................................................................................184 7.2.2.8.5 KinetikderRacematspaltungvonrac‐4mitCyanessigsäureethylester(124)...........185 7.2.2.8.6 KinetikderRacematspaltungvonrac‐4mitMethoxyessigsäureethylester
(111).............................................................................................................................................................185 7.2.2.9 1‐Aminoindan(rac‐130)alsSubstrat...........................................................................................186 7.2.2.9.1 AnalysedesDiamidsN1,N3‐bis(2,3‐dihydro‐1H‐inden‐1‐yl)malonamid(129).........186 7.2.2.9.2 BestimmungdesVerlustsvon1‐Aminoindan(rac‐130)währendder
Aufarbeitung.............................................................................................................................................187 7.2.2.9.3 Temperatur‐undZeiteffektderenzymatischenRacematspaltungvon
1‐Aminoindan(rac‐130).....................................................................................................................187 VI
7.2.2.9.4 ParallelablaufendechemischeAcylierungvon1‐Aminoindan(rac‐130)....................188 7.2.2.10 SekundäreAminealsSubstrate........................................................................................................189 7.2.2.10.1 BestimmungdesVerlustsdersekundärenAmine149bzw.150.....................................189 7.2.2.10.2 SynthesevonEthyl‐3‐(2‐methylpiperidin‐1‐yl)‐3‐oxopropanoat(rac‐151)..............189 7.2.2.10.3 SynthesevonEthyl‐3‐(3‐methylpiperidin‐1‐yl)‐3‐oxopropanoat(rac‐152)..............190 7.2.2.10.4 EnzymatischeAcylierungvon3‐Methylpiperidin(rac‐150)..............................................190 7.2.2.10.5 ProzessoptimierungderenzymatischenRacematspaltungvon
3‐Methylpiperidin(rac‐150).............................................................................................................191 7.2.2.10.6 ParallelablaufendechemischeAcylierungvonrac‐150.......................................................191 7.2.2.11 Verwendungvonɛ–Caprolacton(3)alsAcyldonor................................................................192 7.2.2.11.1 BestimmungderStabilitätvonɛ–Caprolacton(3)währendderReaktionund
Aufarbeitung..............................................................................................................................................192 7.2.2.11.2 EnzymatischeAcylierungvonBenzylamin(134)mitɛ‐Caprolacton(3)......................193 7.2.2.11.3 VariationderReaktionsbedingungenderenzymatischenAcylierungvon
Benzylamin(134)mitɛ‐Caprolacton(3).....................................................................................193 7.2.2.11.4 ParallelablaufendechemischeAcylierungvonBenzylamin(134)mit
ɛ‐Caprolacton(3)....................................................................................................................................194 7.2.2.11.5 Synthesevon6‐Hydroxy‐N‐(1‐phenylethyl)hexanamid(157)..........................................195 7.2.2.11.6 EnzymatischeAcylierungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)mit
ɛ‐Caprolacton(3)....................................................................................................................................195 7.2.2.11.7 TemperaturabhängigkeitderenzymatischenAcylierungvon
1‐Phenylethylamin(rac‐4)mitɛ–Caprolacton(3)..................................................................196 7.2.2.11.8 ParallelablaufendechemischeAcylierungvonrac‐4mitɛ‐Caprolacton(3)..............197 7.2.2.11.9 ReaktionskinetikderAcylierungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)mit
ɛ‐Caprolacton(3)....................................................................................................................................197 8 7.2.2.11.10 Synthesevon6‐Hydroxy‐1‐(3‐methylpiperidin‐1‐yl)hexan‐1‐on(155).......................198 7.2.2.11.11 EnzymatischeAcylierungensekundärerAminemitɛ‐Caprolacton(3).........................198 Literaturverzeichnis.................................................................................................................................201 VII
VIII
Abkürzungsverzeichnis
AAV
AllgemeineArbeitsvorschrift
ADH
Alkohol‐Dehydrogenase
AD‐H
HPLC‐Säule,CHIRALPAK®
Amolysetris‐(3,5‐dimethylphenylcarbamat)
Äq.
Äquivalent(e)
atm
Atmosphäre,Druckeinheit
BVMO
Baeyer‐Villiger‐Monooxygenase
br
breit
c
Umsatz(conversion)
CAL‐A
LipaseAausCandidaantarctica
CAL‐B
LipaseBausCandidaantarctica,Novozym435
CH
Cyclohexan
CHMO
Cyclohexan‐Monooxygenase
δ
chemischeVerschiebungin[ppm]
d
Dublett
d
Küvettendickein[cm]
DBU
DeutscheBundesstiftungUmwelt
DBU
1,8‐Diazabicyclo[5.4.0]undec‐7‐en
DC
Dünnschichtchromatographie
DCM
Dichlormethan
dd
dupliziertesDublett
dest.
destilliert
DKR
dynamisch‐kinetischeRacematspaltung
ε
ExtinktionskoeffizientfürNAD(P)Hin[mL.μmol‐1.cm‐1]
E.coli
Escherichiacoli
EA
Elementaranalyse
EC
EinteilungderEnzymeinKlassen(enzymecommission)
EDTA
Ethyldiamintetraacetat
ee
Enantiomerenüberschuss(enantiomericexcess)
EI
Elektronenstoß‐Ionisation
EtOAc
Essigester
ESI
Elektrospray‐Ionisation
Et
Ethyl
etal.
undandere(lat.etalii)
Et2O
Diethylether
f
Probenverdünnungsfaktor
IX
FDA
US‐Arzeimittelbehörde(USFoodandDrugAdministration)
FMN
Flavinmononukleotid
GC
Gaschromatographie
GDH
Glucosedehydrogenase
ges.
gesättigt
h
Stunde(n)
HPLC
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
(HighPerformanceLiquidChromatography)
Hz
Hertz
i‐PrOH
iso‐Propanol
IR
Infrarot
i.Vak.
imVakuum
J
skalareKopplungskonstantein[Hz]
kDa
Kilodalton
KM
MICHAELIS‐Konstantein[mol/l]
KPi
Kaliumphosphatpuffer
Lb‐ADH
Alkohol‐DehydrogenaseausLactobacillusbrevis
Lk‐ADH
Alkohol‐DehydrogenaseausLactobacilluskefir
M
molar,Stoffmengenkonzentrationin[mol/l]
m
Multiplett
m‐CPBA
meta‐Chlorperbenzoesäure(meta‐chloroperoxybenzoicacid)
Me
Methyl
mg
Milligramm
MHz
Megahertz
min
Minute(n)
mL
Milliliter
mm
Millimeter
mM
millimolar,Stoffmengenkonzentrationin[mmol/l]
mmol
Millimol
MTBE
Methyl‐tert‐butylether
MS
Massenspektrometrie
m/z
VerhältnisMassezuLadung
μL
Mikroliter
NADH,NAD+
Nikotinsäureamid‐Adenin‐Dinukleotid
NADPH,NADP+
Nikotinsäureamid‐Adenin‐Dinukleotid‐Phosphat
n.b.
nichtbestimmt
NEt3
Triethylamin
nm
Nanometer
NMR
KernmagnetischeResonanz(Nuclearmagneticresonance)
org.
organisch
X
PAMO
Phenylaceton‐Monooxygenase
PBA
Peroxybenzoesäure(peroxybenzoicacid)
PCL
Poly‐ε‐caprolacton
PMP
para‐Methoxyphenyl‐Schutzgruppe
ppm
TeileproMillion(partspermillion)
prim
primär
q
Quartett
qui
Quintett
R
Substituent
rac
Racemat
rel.
relativ
rpm
UmdrehungenproMinute(roundsperminute)
RT
Raumtemperatur
s
Singulett
Sdp.
Siedepunkt
sec
sekundär
Smp.
Schmelzpunkt
spez.
spezifisch
T
Temperaturin[°C]
t
Triplett
t
Zeit
TBAI
Tetrabutylammoniumiodid
td
TripletteinesDubletts
tert
Tertiär
THF
Tetrahydrofuran
tR
Retentionszeit
TMS
Tetramethylsilan
TRIS
Tris‐(hydroxymethyl)‐aminmethan
U
Unitsin[µmolmin‐1]
U/mg
Aktivität
U/mL
volumetrischeAktivität
UV/Vis
Ultraviolett/sichtbar(ultraviolett/visible)
v
Volumen
Umrechnungsfaktor
Wellenzahlin[cm‐1]
vmax
Maximalgeschwindigkeit
wässr.
wässrig
XI
XII
ˆ
f
v|xÇvx? Åç Ätw? |á Åtwx âÑ Éy Å|áàt~xá?
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JULESVERNE,
AJourneytotheCenteroftheEarth
XIII
XIV
1
1
Einleitung
Einleitung
Die Biotechnologie hat sich zu einer der Schlüssel‐ und Zukunftstechnologien entwickelt. Die
Bezeichnung„weißeBiotechnologie“grenztdieindustrielleBiotechnologievonder„grünen“undder
„roten“Biotechnologieab,diesichmitPflanzenundLebensmittelbefassen,jedochgibtesmitbeiden
BereichenÜberschneidungen.[1]DieweißeBiotechnologiesetztdabeibiotechnologischeMethodenfür
industrielleVerfahrenzurHerstellungvonpharmazeutischenundchemischenProduktenwieAmino‐
säuren,Vitaminen,Antibiotika,Enzymen,MedikamentenundPolymerenein.Bereitsheutebeträgtder
AnteilvonProduktenundVerfahren,dieBiotechnologienutzen,inderchemischenIndustrieetwa5%.
EinAnstiegauf10–20%biszumJahr2025wirderwartet.[2]Etwa80%derWirkstoffeinderProdukt‐
pipeline der Pharmafirmen sind chiral und ein weiterer Anstieg ist sicher. Seit 1992 wird durch
Regularien der US Food and Drug Administration (FDA) und des European Committee for Proprietary
MedicinalProductsvorgeschrieben,dassdiephysiologischeWirkungjedesEnantiomerseinesPharma‐
wirkstoffseinzelnuntersuchtwerdenmuss.[4]
Die hervorragenden katalytischen Fähigkeiten von Enzymen zeigen sich in ihrer Vielfalt und Kom‐
plexität.EinGrundfürdasgroßePotentialvonBiokatalysatorenliegtauchdarin,dassdieunendliche
VielfaltderNaturerstansatzweiseentziffertist.MittedesJahres2015sind6759verschiedeneEnzyme
identifiziert und beschrieben worden, wobei etwa 25000 unterschiedliche Enzyme in der Natur
vermutetwerden.[5,6]DurchchemischeModifizierungen,zufälligeMutationenundProteinEngineering
wirdeinegroßeAnzahlanmodifiziertenEnzymenauchfürdieindustrielleAnwendungzurVerfügung
stehen. Zu den etablierten Anwendungsfeldern von Enzymen im Bereich der weißen Biotechnologie
zählen vor allem die Agro‐, Lebensmittel‐, Waschmittel‐ und Textilchemie sowie die chemische und
pharmazeutischeIndustrie.VondenschonbekanntenEnzymenwerdenderzeitgeradeeinmaletwa130
industriellgenutzt.DieUnterteilungvonEnzymenerfolgtinsechsKlassen(EC,enzymecommission)in
AbhängigkeitvonihrenKatalyse‐EigenschafteninderNatur(Tabelle1).[7]
Tabelle1.
UnterteilungderEnzymeinEC‐Klassen.[7,8]
Enzymklasse
EC
FunktioninMikroorganismen
Oxidoreduktasen
1
Reduktionbzw.Oxidation
Transferasen
2
TransfervonAldehyd‐,Keton‐,Acyl‐,Zucker‐,
Phosphoryl‐oderMethylgruppen
Hydrolasen
3
SpaltungoderBildungvonEstern,Amiden,Lactonen,
Lactamen,Epoxiden,Nitrilen,Anhydriden,Glycosiden
Lyasen
4
Addition/EliminierungvonkleinenMolekülen
Isomerasen
5
Isomerisierung,z.B.Racemisierung,Epimerisierung
Ligasen
6
BildungvonC‐C‐,C‐O‐,C‐S‐,C‐N‐Bindungen
1
1 Einleitung
Enzyme lassen sich allerdings für weit mehr Reaktionen als Katalysator einsetzen als von der Natur
vorgesehenist.BeimVergleichvonchemischenmitenzymatischenReaktionensindvieleVorteileder
Enzymkatalysezuerkennen.TypischerweiseverlaufenenzymkatalysierteReaktionenumeinenFaktor
108 bis 1012 mal schneller verglichen mit den nicht‐katalysierten Reaktionen[8,9] und bis zu 107 mal
schnelleralschemischkatalysierteReaktionenunterphysiologischenBedingungen.[10]
EnzymatischeUmsetzungenkönnenmeistbeimoderatenBedingungendurchgeführtwerden,während
chemischeReaktionenhäufigErhitzenzumRückflussoderaberHerunterkühlenaufniedrigeTempe‐
raturen erfordern. Metallkatalysatoren, die beispielsweise Platin oder Palladium enthalten, sind oft
teuer und aufwendig in der Herstellung. Im Gegensatz dazu sind viele Mikroorganismen im großen
MaßstabkultivierbarundfürzahlreicheEnzymestehenetablierteExpressionssystemezurVerfügung,
sodass Biokatalysatoren leicht und relativ günstig in großem Umfang erhalten werden können. Aus‐
gehendvoneinemprochiralenkanneinchiralesZentrumerzeugtwerden.Auchkanndurchdiehohe
Chemo‐undRegioselektivitätdermeistenEnzymeaufaufwändigesSchützenundEntschützenvonähn‐
lichenfunktionellenGruppeninnerhalbeinesMolekülsverzichtetwerden.[6,11]
ZudenNachteilenderEnzymezählendieoftmäßigeStereoselektivität,dielimitierteSubstratbreiteund
die relativgeringe Stabilität, da sie in ihrer Aktivitätan sehr engeMilieubedingungen gebunden und
schnelldenaturierbarsind,z.B.durchextremepH‐WerteoderTemperaturen.[12]DabeigibtesinHin‐
blickaufdieStabilitätauchUnterschiedeinnerhalbderBiokatalysatoren.SokönnenmancheEnzyme
lyophilisiertoderinGlycerin‐LösungenebensowieimmobilisiertaufTrägermaterialiendurchauslange
Lagerzeiten ohne größeren Aktivitätsverlust überstehen. Des Weiteren besteht die Möglichkeit, das
immobilisierteEnzymnachderReaktionabzutrennenundeseinerweiterenUmsetzungzuzuführen.
Auch wird dadurch die Verwendung von organischen Lösungsmitteln als Reaktionsmedium ermög‐
licht.[13]
AlseinlimitierenderFaktorgaltlangediegeringeVerfügbarkeitvonEnzymeninbenutzerfreundlicher
Form.DurchheterogeneGenexpressionfremderGeneinnicht‐pathogenenundgutcharakterisierten
Organismen wie Escherichia coli (E. coli) oder der Bäckerhefe (Sachharomyces cerevisiae) kann diese
Limitierung überwunden werden. Die Hauptvorteile einer rekombinanten Expression gegenüber der
NutzungeinesWildtyp‐Enzymssind,dasseinhöheresExpressionsniveauerreichtwerdenkannunddie
WahrscheinlichkeitderkatabolenVerstoffwechslungdesgebildetenProduktsehergeringist.
Biotransformationen lassen sich in isolierten Enzymen und in ganzen Zellen durchführen und beide
Biokatalysator‐FormenhabenihreVor‐undNachteile.BeiderVerwendungvonGanzzell‐Katalysatoren
entfallendieIsolationderEnzymesowiedieVerwendungeineszusätzlichenCofaktor‐Regenerations‐
systems.ZudenNachteilenzählendieniedrigeAktivitätundderUmgangmitPathogenen.Außerdem
sinddieseZell‐SystemeaufSubstratebeschränkt,diezumeinendieZellmembrandesMikroorganismus
passierenkönnen,zumanderensolltenimFalleinerFermentationwederSubstratnochProdukttoxisch
für den Organismus sein oder von diesem auf anderem Wege umgesetzt werden.[11,14] Andererseits
treten bei isolierten Enzymen, im Gegensatz zu Ganzzell‐Katalysatoren, keine Massentransfer‐
Limitierungen und keine mögliche Nebenproduktbildung durch Übermetabolisierung des Produktes
auf.[15,16] Weitere Vorteile sind die einfachere Aufarbeitung und es kann mit höheren Substrat‐
konzentrationengearbeitetwerden.
2
2
2
MotivationundZielsetzung
MotivationundZielsetzung
Lactone dienen in der Industrie als wichtige Precursor für die Herstellung von unterschiedlichen
großtechnischenProdukten.[17]AusgehendvonCyclohexanol(1)sollindieserArbeitüberdieZwischen‐
stufe Cyclohexanon (2) die Synthese von ɛ–Caprolacton (3) mittels enzymkatalysierter Oxidation
erfolgen.FürdieDarstellungdesLactons3wirdzumeineneineAlkoholdehydrogenase(ADH)undzum
anderen eine Cyclohexanon‐Monooxygenase (CHMO) als Biokatalysator in einem Eintopf‐Prozess
eingesetzt(Abbildung1).
Die Synthese enantiomerenreiner Amine ist ein wichtiger Bestandteil bei der Entwicklung und
HerstellungneuartigerArzneimittelsowiebeiderOptimierungderSynthesewegebekannterpharma‐
zeutischerWirkstoffe.[18]FürdieDarstellungvon(S)‐AminenmithohenEnantiomerenüberschüssensoll
im Rahmen dieser Arbeit die kinetische Racematspaltung von racemischen Aminen mit Hilfe von
Lipasen als Biokatalysatoren untersucht werden. In Abbildung 1 sind die untersuchten Enzym‐
reaktionenaufgezeigt.
Abbildung1.
BiokatalytischeReaktionen:DoppeloxidationvonCyclohexanol(1)zuε‐Caprolacton
(3)undRacematspaltungvonAminen.
2.1
EnzymkatalysierteOxidationvonCyclohexanol(1)
LactonesindcyclischeEster,vondenenε–Caprolacton(3)dasbekanntesteunddasgrößtekommerziell
erhältlicheist.LactonemitkleinererRinggrößewieβ–Propio‐,γ‐Butyro‐undδ‐Valerolactondienenals
BausteinefürPolyesterfürunterschiedlicheAnwendungen.[19]2003lagdieweltweiteProduktionvon
3
2 MotivationundZielsetzung
ɛ‐Caprolacton(3)bei40.000‐60.000t/a.[20]Etwa50%desproduziertenLactons3wirddurchRing‐
öffnungspolymerisationzuPolycaprolacton(PCL)verarbeitet,einemaliphatischenPolyester,derbio‐
resorbierbar und nicht toxisch für Organismen ist.[17] PCL ist unter physiologischen Bedingungen
biologischleichtabbaubarundfindetgroßeVerwendungalsBiomaterial‐ImplantatoderalsMatrixfür
Drug‐Delivery‐SystemeundinderTherapiefürKnochenregeneration.[17,21]WeitereAnwendungfindet
ɛ‐Caprolacton 3 als Precursor für die Caprolactam‐Synthese, welches für die Nylon‐6‐Produktion
benötigt wird, sowie in der Synthese von Urethan‐Beschichtungen, Elastomeren, Lösungsmittel‐
VerdünnernundFasern.[22]
Industriell wird Caprolacton (3) im sogenannten UCC‐Prozess (Union Carbide Corporation) durch
Oxidation von Cyclohexanon (2) mit Peressigsäure bei 50 °C und Atmosphärendruck hergestellt. Die
üblichen Selektivitäten liegen bei 90% bezogen auf Cyclohexanon (2) und 85‐90% bezüglich Per‐
essigsäure.[23]DieindustrielleSyntheseweisteinigeökonomischeundauchökologischeNachteileauf.
DurchdieVielzahlderbenötigtenSynthese‐undAufreinigungsschritteistdieAbfallproduktionbeiden
industriellenProzessenenormhoch.ZudembenötigtdieReaktionsführunghoheTemperaturensowie
Trägergase. Erst zu Beginn des Jahres 2014 hat BASF die Preise von Caprolactam und Adipinsäure
aufgrundgestiegenerRohstoffpreiseerhöht.[24]
AusgehendvondeneinleitendenArbeitenvonWILLETSundSTAUDTistdasHauptzieldieserArbeitdie
WegbereitungzurVergrößerungdesReaktionsmaßstabesderOxidationvonCyclohexanol(1)überdie
Zwischenstufe Cyclohexanon (2) zum Produkt ε‐Caprolacton (3) mit elementarem Sauerstoff als
alleiniges Oxidationsmittel in einem Eintopf‐Prozess (Abbildung 2).[25,26] Dabei soll das Hauptaugen‐
merkdieserArbeitaufdemSolvenz‐EngineeringzurVermeidungderProduktinhibierungliegen.
Abbildung2.
Enzymatische Doppeloxidation von Cyclohexanol (1) zu ɛ–Caprolacton (3) unter
EinsatzvonLk‐ADHundCHMO.[26]
Die Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir (Lk‐ADH) und die CHMO aus Acinetobacter calcoa‐
ceticus(ECSMo‐1)wurdeninderLiteraturalseffektivsteBiokatalysatorenbeschriebenunddement‐
sprechendindieserArbeiteingesetzt.[25,26]AlseinzigesAbfallproduktdieserOxidationsreaktionwird
Wassererhalten.
An erster Stelle steht in dieser Arbeit die Etablierung einer stabilen Analytik mittels Gaschromato‐
graphie, um für die anschließenden enzymatischen Reaktionen die Umsätze mit möglichst geringer
Schwankungsbreitezubestimmen.DesWeiterensollendieoptimalenBedingungenfürdieBiokatalyse
4
2
MotivationundZielsetzung
entwickeltwerden.ZielistdieEntwicklungeineseffizientenVerfahrensdurchVariationvonReaktions‐
zeit, Temperatur und Wahl des Lösungsmittels. Auch die Verwendung von Adsorberharzen soll zur
insitu‐Produktentfernunguntersuchtwerden.DiezuoptimierendenParameterderStandard‐Reaktion
desCyclohexanols(1)zumLacton3sindinAbbildung3dargestellt.
Abbildung3.
UntersuchungderenzymatischenDoppeloxidation.
2.2
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
Enantiomerenreine Amine sind wichtigeBausteine für eine große Anzahl an Arzneimittel, Agro‐ und
anderen Spezialchemikalien. Untersuchungen zeigten, dass etwa 40 – 50% der pharmazeutischen
Wirkstoffe chirale Amine enthalten.[18] In der Literatur ist die kinetische Racematspaltung von race‐
mischenaliphatischenundaromatischenAminenmittelsLipaseninvielfältigerAusführungbeschrie‐
ben.DieLipaseBausCandidaantarctica(CAL‐B)wurdedabeialseffektivstesEnzymbeschriebenund
indieserArbeitverwendet.[27–29]DasamhäufigstenverwendeteracemischeAminzurRacematspaltung
istdasModelsubstrat1‐Phenylethylamin(rac‐4),welchesmitAcyldonorenwieEssigsäureethylester(5)
oder Methoxyessigsäurepropylester (6) in organischen Lösungsmitteln umgesetzt wurde (Abbildung
4).[30,31]Zwarkönnendieerhaltenen(R)‐Amide,(R)‐7und(R)‐8,unddasresultierende(S)‐Amin(S)‐4
mitsehrhohenEnantiomerenüberschüssenerzieltwerden,jedochliegendieReaktionszeitenbeibiszu
60Stunden.DieReaktionsgeschwindigkeitdieserAcylierungenkannerhöhtwerden,wennAcyldonoren
wie6eingesetztwerden,dieinβ‐PositioneinHeteroatomtragen.DabeiwerdendiebestenErgebnisse
in Bezug auf Reaktionsgeschwindigkeit und Enantioselektivität mit Sauerstoff als Heteroatom
erhalten.[31]
IndustriellfindetdiekinetischeRacematspaltungvonAminenbereitsAnwendung.EinVerfahrenzur
AcylierungvonAminenwurdevonBASFSEpatentiert.[32]Seit2002wirddieenzymatischeRacemat‐
spaltungvonAminenimMaßstabvon>3500t/aproduziert.[4]
5
2 MotivationundZielsetzung
Abbildung4.
EnzymatischeRacematspaltungvonrac‐4mitbekanntenAcyldonorenunterEinsatz
vonCAL‐B.[30,31]
In Vorarbeiten von SIMON hat sich das Malonsäurediethylester (9) als effizientester Acyldonor
dargestellt.[33,34]DabeikonntedasAmid(R)‐10unterdengewähltenStandard‐Reaktionsbedingungen
von80°CReaktionstemperaturnachnur4.5StundenmitvollständigemUmsatznahezuenantiomeren‐
reinerhaltenwerden(Abbildung5).
Abbildung5.
Benchmark‐ExperimentzurenzymatischenRacematspaltungvonrac‐4mit
Malonsäurediethylester(9).[33,34]
EinleitendeVersuchevonUTHOFFzeigten,dassdieRacematspaltungvonrac‐4mitMalonsäurediethyl‐
ester (9) auch unter lösungsmittelfreien Bedingungen sehr gute Umsätze und Enantiomerenüber‐
schüssebeiniedrigerenReaktionstemperaturenliefert.[35]ImRahmendieserArbeitsolldieRacemat‐
spaltungmitMalonsäurediethylester(9)alsAcyldonorunterlösungsmittelfreienBedingungenweiter
etabliert werden. Durch die Variation von wichtigen Parametern, unter anderem von Reaktionszeit,
Temperatur,EnzymbeladungsowieSubstratkonzentration,istdasZieldieserArbeitdieOptimierung
der enzymkatalysierten kinetischen Racematspaltung hinsichtlich hoher Umsätze und Enantioselek‐
tivitäten. Da sich die CAL‐B durch eine Akzeptanz eines breiten Substratspektrums auszeichnet[4],
werdenimRahmendieserArbeitunterschiedlicheAminegetestet.ZusätzlichsollderAcyldonorvariiert
werden. Außerdem sollte der Prozess eine hohe Selektivität und Reaktionsgeschwindigkeit sowie
möglichst quantitative Umsätze aufweisen. Die Verwendung eines lösungsmittelfreien Reaktions‐
systemsisteingroßerSchritthinsichtlichder„grünen“Chemie,dadasorganischeLösungsmitteleinen
6
2
MotivationundZielsetzung
großen Teil der Abfallmenge einer kinetischen enzymatischen Racematspaltung ausmacht.[36] Die
meistenorganischenMedienhabenverschiedeneNachteile,unteranderemdieToxizitätfürdieUmwelt
sowiepotentielleExplosionsgefahraufgrundihrerFlüchtigkeitundEntflammbarkeit.[37]InderLiteratur
wurdevoneinerverringertenReaktionszeitderRacematspaltunginAbwesenheitvonLösungsmittel
berichtet, was aus ökonomischer Hinsicht vorteilhaft ist.[36] Die zu optimierenden Parameter der
kinetischenRacematspaltungwerdeninAbbildung6amBeispielderRacematspaltungdesAminsrac‐4
mitMalonester9alsStandard‐AcyldonorzumentsprechendenAmid(R)‐10dargestellt.
Abbildung6.
UntersuchungderenzymatischenRacematspaltung.
7
8
3
EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
3
EnzymatischeOxidationmittels
Monooxygenasen
3.1
ChemischeBAEYER‐VILLIGER‐Oxidation
3.1.1
KlassischeBAEYER‐VILLIGER‐Oxidation
VON BAEYERundVILLIGERberichtetenimJahre1899mitderRingöffnung„vonKetoneninderTerpen‐
gruppe“.[38]DabeiwurdensieaufBeobachtungenvonCAROaufmerksam,dereinJahrzuvordieOxidation
von Anilin zu Nitrosoamin mit dem stärksten zu der Zeit bekannten Oxidationsmittel, H2SO5, durch‐
führte,welcheserauskonzentrierterSchwefelsäureundKalimpersulfatherstellte(Abbildung7).[39]
Abbildung7.
SynthesedesCARO’schenReagenz(H2SO5).[39]
DiesesOxidationsmittelwandtenVONBAEYERundVILLIGERaufdieTerpen‐Derivateanund„fanden,dass
das CARO’sche Reagenz einebenso spezifisch auf Ketone wirkendes Mittel ist, welches gestattet, eine
ReihevonbisherunausführbarenAufgabenspielendleichtzulösen“.[38]Sokonntensieunteranderem
Menthon, Tetrahydrocarvon und Campher in die entsprechenden ε‐Caprolactone überführen
(Abbildung8).
Abbildung8.
BAEYER‐VILLIGER‐OxidationvonMenthon(A),Tetrahydrocarvon(B)undCampher(C)
mitdemCARO’schenReagenz.[38,40]
9
3 EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
Sie schlussfolgerten, dass das hypothetisch gebildete Oxidationsprodukt „Syperoxid“, ähnlich einer
BECKMANN‐Umlagerung von Oximen, zu den Lactonen umgewandelt wird.[38] In ihrer Studie zur Oxi‐
dation von 13‐ bis 17‐gliedrigen ringförmigen Ketonen mit dem CARO’schen Reagenz untersuchten
RUZICKA und STOLL im Jahre 1928 erstmals den Einfluss von Temperatur und Lösungsmittel.[41] Die
bestenErgebnisseerhieltensiebeiTemperaturenvon50–65°CinEisessig.DieBildungvonOligomeren
alsNebenproduktekonntebeiniedrigenTemperaturenvermiedenwerden.
Die ersten Vorschläge zum Ablauf der Reaktion reichten von dem von VON BAEYER und VILLIGER
vorgeschlagenenDioxiran‐Mechanismus[38]überdieBildungeinesPeroxid‐DimersalsNebenprodukt[42]
biszumWITTIG‐Mechanismus[43]mitderformalenÜbertragungeinesOH+‐TeilchensvoneinerPersäure
11 zum Carbonylsauerstoff des Ketons 12. Einen weiteren Ansatz lieferte CRIEGEE 1948, als er einen
nucleophilen Angriff der Persäure 11 auf die Keto‐Funktion postulierte, wodurch das sogenannte
CRIEGEE‐Intermediat13gebildetwird.[44]ImJahre1953schließlichkonntenDOERINGundDORFMANdurch
IsotopenmarkierungsexperimentedieTheorievonCRIEGEEbestätigen,indemsie18O‐markiertesBenzo‐
phenon (12) einer Oxidation mit Persäure 11 aussetzten und dadurch die Position des markierten
SauerstoffatomsimProdukt14bestimmenkonnten(Abbildung9).[45]
Abbildung9.
Isotopenmarkierungsexperimente zur Aufklärung des Mechanismus der BAEYER‐
VILLIGER‐Oxidation.[40] Dargestellt sind die nach den oben vorgeschlagenen Mecha‐
nismenzuerwartendenReaktionsprodukte.
Im Fall der Dioxiran‐Bildung (15) nach VON BAEYER und VILLIGER wurde eine statistische 50:50‐
Verteilung erwartet.[40] Sollte die Reaktion über das CRIEGEE‐Intermediat (13) laufen, so müsste das
markierteSauerstoffatomTeilderKeto‐Funktionsein.TatsächlichenthieltdieCarbonylfunktionzu93%
18O‐Sauerstoff.DasProduktdersäurekatalysiertenAdditioneinerPersäureaneineCarbonylfunktion
wirdallgemeinalsCRIEGEE‐Intermediatbezeichnet.DieseAdditionkannhierbeisowohlSäuren‐alsauch
10
3
EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
Basen‐katalysiertablaufen.DieSäure‐EinheitfungiertdabeinachdemnucleophilenAngriffalsAbgangs‐
gruppe, während die Carbonylfunktion wieder hergestellt wird und ein Rest (RM) vom Carbonyl‐
KohlenstoffzumpositivpolarisiertenSauerstoffwandert,wodurchderEstererhaltenwird(Abbildung
10). Als klassische organische Persäuren dienen unter anderem m‐Chlorbenzoesäure (m‐CPBA),
TrifluorperessigsäuresowiePeroxybenzoesäure(PBA).
Abbildung10.
ReaktionsmechanismusderBAEYER‐VILLIGER‐OxidationmiteinerPersäure(RM=wan‐
dernderRest,RR=verbleibenderRest,RL=Abgangsgruppe).[46]
ImFallderOxidationeinesasymmetrischenKetonswandertamwahrscheinlichstendiejenigeGruppe,
diediepartiellepositiveLadungambestenstabilisierenkann.[40]SokanndieWanderungstendenzim
allgemeinenwiefolgtdefiniertwerden:tert‐Alkyl>Cyclohexyl>sec‐Alkyl>Benzyl>Phenyl>prim‐
Alkyl>Cyclopentyl,Cyclopropyl>Methyl.[46]SinddiebeidenRestegleichoderähnlich,dannwirdein
Gemisch aus beiden möglichen Estern erhalten. Sterische Ansprüche der Reste sowie sie Art der
verwendeten Persäure spielen ebenfalls eine entscheidende Rolle. Demnach muss im CRIEGEE‐Inter‐
mediat ein nicht‐bindendes freies Elektronenpaar des Sauerstoffatoms sowie die O‐O‐Bindung anti‐
periplanarzumwanderndenRestRMstehen(Abbildung11).[47]
Abbildung11.
Antiperiplanare Anordnung des wandernden Restes im CRIEGEE‐Intermediat (RM=
wandernderRest,RR=verbleibenderRest,RL=Abgangsgruppe).[47]
TURNERbeobachtetebereits1950amBeispielderOxidationvonsowohlcis‐alsauchtrans‐1‐Acetyl‐2‐
Methylcyclohexan (17), dass dabei nur das jeweilige cis‐ bzw. trans‐Produkt (18) gebildet wird
(Abbildung12).[48]
Abbildung12.
ErsterBeweisderErhaltungderKonfigurationdeswanderndenResteswährendder
BAEYER‐VILLIGER‐Oxidation.[48]
11
3 EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
BERSONundSUZUKIschlugen1959vor,dassdieWanderungdesRestesunddieCarboxylatabspaltung
konzertiert ablaufen und nannten dieses als Grund für die Stereoselektivität der Reaktion.[49] Die
BeobachtungenzurStereoselektivitätderBAEYER‐VILLIGER‐OxidationwurdenvonMISLOWundBRENNER
bestätigt,indemsiedasoptischaktive3‐Phenyl‐2‐butanon(20)oxidiertenunddabeieineRetentionvon
98% erhielten (Abbildung 13).[50] Die Retention der Stereoinformation macht die BAEYER‐VILLIGER‐
OxidationzueinemwichtigenWerkzeugfürdieasymmetrischeorganischeSynthese.
Abbildung13.
Reaktionssequenz zur Bestätigung des Erhalts der Retention des wandernden
KohlenstoffatomsdesoptischaktivenKetons20.[50]
3.1.2
StandderWissenschaft:klassischeBAEYER‐VILLIGER‐Oxidation
ObwohlmehralseinJahrhundertseitEntdeckungderBAEYER‐VILLIGER‐Oxidationvergangenist,istein
Ende der Entwicklung der Reaktion noch nicht abzusehen. In der Industrie findet die Synthese von
ɛ‐Caprolacton (3) großtechnische Anwendung. Dabei spielten in den letzten Jahrzehnten neben der
OptimierungderReaktionsbedingungenauchUmweltaspekteeineimmerwichtigereRolle.
ImAllgemeinenwerdendiebisherverwendetenPersäureninsituausdenentsprechendenSäurenund
Wasserstoffperoxid (H2O2, 90%) hergestellt, welches jedoch wegen der hohen Explosionsgefahr aus
demHandelgenommenwurde.[51,52]Dasheuteerhältliche70%igeH2O2liefertjedochnurPersäurenmit
geringerer Konzentration. Die Verwendung von Persäuren erfordert den Einsatz geeigneter Kataly‐
satoren.KatalytischeVerfahrenhabengegenüberdenbisherangewendetenstöchiometrischenReak‐
tionenmehrereVorteile,wiedieVereinfachungderReaktionsbedingungenunddenEinsatzvonkosten‐
günstigerenReagenziensowieVerringerungderAbfallmenge.AllerdingsfälltalsNebenproduktWasser
an,waszurHydrolysederentstandenenEsterführenkann.VerwendeteKatalysatorenenthaltenunter
anderemKomplexederÜbergangsmetalleMo(VI)[53],Re(V)[54–56],Pt(II)[57],Ni(II)[51,52],Se[58]sowieTi‐
Silicate[59,60].EinBeispielfüreinemetallkatalysierteBAEYER‐VILLIGER‐OxidationistinAbbildung14dar‐
gestellt.
12
3
EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
Abbildung14.
VorgeschlagenerMechanismusderBAEYER‐VILLIGER‐OxidationdurcheinenRe‐Kata‐
lysator(23)amBeispielvonCyclobutanon(25).[56]
Anstelle von Wasserstoffperoxid wird seit 1991 auch elementarer Sauerstoff in Kombination mit
BenzaldehydalsOxidationsmitteleingesetzt,welchesalsMUKAIYAMA‐Systembezeichnetwirdunddas
Keton selbst aktiviert.[61] Die Oxidation kann bei Raumtemperatur durch die Übergangsmetalle
Ni(II)[62,63],Cu(II)[63,64]oderFe2O3[65]katalysiertwerden.AllerdingsistderEinsatzsolcherKatalysatoren
vorwiegendaufdieOxidationvoncyclischenKetonenbeschränktundliefernteilweisenurgeringebis
mäßigeStoffumsätze,waszumTeildurchInaktivierungdesKatalysatorsdurchdenzurentsprechenden
Säure hydrolysierten Ester zurückzuführen ist. 1993 wurde von BOLM und KANEDA gezeigt, dass die
BAEYER‐VILLIGER‐OxidationmitdiesemSystemselbstinAbwesenheiteinesKatalysatorsnochmitguten
Umsätzen verläuft, wobei jedoch ein Überschuss an Aldehyd sowie die Verwendung von chlorierten
Lösungsmittelnnotwendigist.[63,66]
AlternativeAnsätzewiebeispielsweisederEinsatzvonrecyclisierbarenmesoporösenMaterialien,z.B.
Fe‐MCM‐48[67], Fe‐Porphyrin‐Systemen[68] sowie die Oxidation mit Zinn‐ oder Titan‐haltigen β‐Zeo‐
lithen[60,69,70]undzahlreichenweiterenheterogenenZinn(IV)‐Spezies[71],Hydrocalcite[72],Heteropoly‐
oxometalate[73], organische Ionenaustauscherharze[74] sowie organische Acridinium‐Systeme[75],
konnten mit guten bis sehr guten Umsätzen durchgeführt werden. Um die Bildung von Wasser als
NebenproduktundsomitHydrolysedesgebildetenLactonszuvermeiden,wurdenBis(trimethylsilyl)‐
monoperoxidsulfat[76,77]sowiePeroxodisulfat‐Salze(S2O82‐)[78]alsOxidationsmittelanstellevonH2O2
verwendet,wassowohldieAusbeutealsauchdieReinheitdesProdukteserhöhte.2009wurdedieses
System in Kombination mit ionischen Flüssigkeiten noch weiter optimiert.[77] Auch mit anderen
KatalysatorenfandenionischeFlüssigkeitenbereitsAnwendung.[55,70]UmdenEinsatzvonhalogenierten
Lösungsmitteln zu vermeiden konnten erfolgreich auf Silica‐immobilisierten Persäuren in über‐
kritischen Kohlenstoffdioxid eingesetzt werden.[79] Im Jahr 2011 fand auch Oxon, das Triple‐Salz
2KHSO5.KHSO4.K2SO4, erneut Anwendung in Kombination mit einem Phasentransfer‐Katalysator,
welchesineinemZweiphasensystembereitsnach6Stundenbei40°CguteUmsätzelieferte.[80]
Es sind auch Vorschläge veröffentlicht worden, Lactone direkt aus den entsprechenden sekundären
Alkoholenzusynthetisieren.2013verwendetenMENGetal.PerameisensäurealsOxidationsmittelund
konnten beispielsweise ɛ‐Caprolacton (3) nach 65 Minuten Reaktionszeit mit vollständigem Umsatz
erhalten.[81]AllerdingswirddabeidasSubstratineinerKonzentrationvon0.2MunddieSäureineinem
etwa 20fachen Überschuss eingesetzt. Des Weiteren finden bei der Doppeloxidation von sekundären
AlkoholenionischenFlüssigkeitenundMikrowellen[82],Nafion‐H®[83]oderorganischeKatalysatoren[84]
Anwendung.JedochsindauchindiesenFällendieUmsätzebeilangenReaktionszeitennurmäßigund
die Verwendung von Peroxo‐Verbindungen ist vom ökologischen Standpunkt aus nachteilig im Ver‐
13
3 EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
gleich zur Enzymkatalyse, bei der eine Zugabe von weiteren Katalysatoren nicht notwendig ist. Des
Weiteren dient elementarer Sauerstoff bei enzymkatalysierten Oxidationsreaktionen als Oxidations‐
mittel.
3.1.3
StereoselektiveBAEYER‐VILLIGER‐Oxidation
Katalysatoren sollten zusätzlich zu ihren Katalyseeigenschaften auch die Fähigkeit besitzen, enantio‐
selektiveOxidationsreaktionenzukatalysieren.SoberichteteSTRUKULbereits1994voneinerOxidation
mit chiralen Pt(II)‐Komplexen, mit denen unterschiedliche 2‐substituierte cyclische Ketone zu den
entsprechendenLactonenmitee‐Wertenvonbiszu58%umgesetztwerdenkonnten(Abbildung15).[85]
Abbildung15. EnantioselektiveBAEYER‐VILLIGER‐OxidationmitchiralemKatalysator.[85]
Später konnte durch den Einsatz von Pt(II)‐ oder Co(Salen)‐Komplexen und Tensiden in Wasser der
Enantiomerenüberschussauf90%gesteigertwerden.[86,87]InderheutigenZeitwerdenhoheUmsätze
mit mäßigen bis guten ee‐Werten durch Verwendung von chiralen enantiomerenreinen Organo‐
katalysatoren[88]oderchiralenMetallkomplexenderÜbergangsmetalleCo[87],Cu[89],Pd[90],Pt[91],Zr[92],
Hf[93]oderMg[94]undAl[95]erhalten.
AuspräperativerSichtscheintdennochdieVerwendungchiralerÜbergangsmetallkatalysatorenfürdie
enantioselektiveSynthesevonEsterninmittlererbishoheroptischerReinheitdieeinzigeaussichtsreise
Alternative zur Katalyse durch Enzyme zu sein.[51,52] Der Nachteil der meisten der genannten
Katalysator‐SystemeistjedochdiegeringeSubstratbreite,danurcyclischeKetoneumgesetztwerden
können. Des Weiteren müssen sie aufwendig synthetisiert werden, liefern niedrige Umsätze und die
ReaktionenmüsseninorganischenLösungsmittelndurchgeführtwerden.
14
3
EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
3.2
EnzymkatalysierteSynthesen
3.2.1
EnzymatischeBAEYER‐VILLIGER‐Oxidation
DerEinsatzvonEnzymenbietetimVergleichzudenobengenanntenorganischenKatalysatorenviele
VorteileinHinblickaufdieRegio‐,Chemo‐undEnantioselektivität.
1995beschriebROBERTSeinedurchdieLipaseBderCandidaantarctica(CAL‐B)katalysierteBAEYER‐
VILLIGER‐OxidationvoncyclischenKetonen.[96]DieCAL‐BisthierbeijedochnichtdirektanderOxidation
desKetonsbeteiligt,sondernkatalysiertdieBildungeinerPersäure,ausgehendvoneinerlangkettigen
Carbonsäure mit Wasserstoffperoxid. Die eingesetzten 2‐ und 3‐substituierten Cyclopentanone
und‐hexanonewurdensozuracemischenLactonenoxidiert.DiedabeierhaltenenAusbeutenlagenbei
57–73%undwarennurgeringfügigniedrigeralsdieaufklassischemWegerhaltenen.EineAusnahme
stellte jedoch 2‐Oxocyclohexanessigsäure (28) dar, bei der durch intramolekulare BAEYER‐VILLIGER‐
OxidationdasentsprechendeLacton29beieinemUmsatzvon54%einEnantiomerenüberschussvon
21% ee erhalten werden kann (Abbildung 16). Der Grund für die Enantioselektivität der Reaktion
scheintdieetwasschnellereAcylierungdesEnzymsdurcheinsderbeidenEnantiomerezusein,sodass
diePersäureimAnschlussdarandieintramolekulareReaktiondurchläuft.DielangenReaktionszeiten
vonetwaeinerWocheunddasaufwändigeEntfernenderentstandenenSäurebedürfenweitererOpti‐
mierung.
Abbildung16.
EnantioselektiveBAEYER‐VILLIGER‐Oxidationvon2‐Oxocyclohexanessigsäure(28)
katalysiertdurchLipaseBderCandidaAntarctica(CAL‐B).[96]
Ähnlichverläuftdie2007vonOLIVObeschriebeneOxidation,derzusätzlichdenKomplexUreahydrogen‐
peroxidinEssigester5einsetzte.[97]DerVorteilhierbeiwardieVermeidungderHydrolysedesLactons
durchAbwesenheitvonWasseralsNebenprodukt.EskonntensoLactonemitee‐Wertenvon20‐60%
undUmsätzevon20–50%nachetwazweiTagenerhaltenwerden.
EinenalternativenWeggingenGUIBÉ‐JAMPELetal.,aufbauendauffrühereArbeitenvonKIRK[98],mitder
autokatalytischenOxidationvonKetonen(Abbildung17).[99]DabeisollteWasserstoffperoxidmithilfe
15
3 EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
vonCarboxyl‐SeitengruppendesEnzymsdieBAEYER‐VILLIGER‐Oxidationstarten.DasgebildeteLacton3
sollte eine CAL‐B‐katalysierte Perhydrolyse zur Peroxysäure 30 durchlaufen, die wiederum die
Oxidation von weiterem Keton 2 katalysieren kann, wodurch ein autokatalytischer Prozess erhalten
wird. Der niedrige Umsatz von 20% konnte durch Ersatz des klassischen H2O2/H2O‐System durch
Ureaperoxidnach48StundenReaktionszeit65%Umsatzgesteigertwerden.ImFallvonsubstituiertem
CyclohexanonliegendieEnantiomerenüberschüssedererhaltenenLactoneauchhierbeinurzwischen
10und70%ee.
Abbildung17.
Lipasenkatalysierte Perhydrolyse mit anschließender chemischer BAEYER‐VILLIGER‐
Oxidation mittels Autokatalyse am Beispiel von Cyclohexanon (2) nach GUIBÉ‐
JAMPEL.[99]
3.2.2
BAEYER‐VILLIGER‐Monooxygenasen
3.2.2.1
Allgemeines
HöhereAusbeutenundhöhereEnantiomerenreinheitkönnendurchdenEinsatzvonBAEYER‐VILLIGER‐
Monooxygenasen (BVMOs, EC 1.13.14.x) erzielt werden.[100] Dadurch lässt sich im Gegensatz zu
chemischenoderLipasen‐katalysiertenReaktionenauchdieVerwendungvonWasserstoffperoxidoder
PersäurenalsOxidationsmittelundorganischeLösungsmittelvermeiden,dadieMonooxygenasenmit
molekularemSauerstoffinwässrigemMediumaktivsind.DesWeiterensindsieinderLage,nichtnur
cyclische, sondern auch aliphatische und aromatische Ketone in die entsprechenden Ester umzu‐
wandeln.DieEpoxidierungvonC=C‐Doppelbindungen[101]sowieunteranderemdieSulfoxidation[102],
Phosphoxidation[103], Aminoxidation[104], Boronsäurenoxidation[105] und Selenoxidation[106] können
ebenfallsdurchBVMOskatalysiertwerden.
Die BAEYER‐VILLIGER‐Monooxygenasen gehören zu einer Superfamilie, die drei Klassen von flavin‐
abhängigen Monooxygenasen umfassen: die sogenannten Flavin‐enthaltenden Monooxygenasen
(FMOs), die N‐hydroxylierenden Monooxygenasen (NMOs) und die BVMOs.[107] Monooxygenasen
werdenanhanddervonihnenbenötigtenCofaktorenunterteilt.MonooxygenasenvomTypIsindFlavin‐
abhängig und benötigen NADPH als Elektronenquelle, während Enzyme des Typs II FMN und NADH
16
3
EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
brauchen,hauptsächlichHeteroatomeoxidierenundeukaryotischemUrsprungssind.[108]DieTypenIII
und IV von Monooxygenasen sind kupferabhhängige bzw. eisenhaltige Enzyme.[109,110] BVMOs vom
TypOsindeinneuartigerBVMO‐Typ,dieebenfallsFADundNADPHbenötigen.[111]Strukturellunter‐
scheidensiesichjedochvondenBVMOsvomTypI,dasienichtdasfürBVMOscharakteristischekonser‐
vierteSequenzmotiv(vgl.Abschnitt3.2.2.2)besitzenundnur8%ÜbereinstimmungzurPAMOzeigen.
AllebisherkloniertenBVMOsgehörendemTypIan.
Die BVMOs aktivieren reduktiv Sauerstoff (O2) und bauen diesen in ein Substrat ein. Sie werden in
MonooxygenasenundDioxygenaseneingeteilt.[109,110]DabeiführenMonooxygenasen,zudenenauchdie
BVMOs zählen, ein Sauerstoffatom in das Substrat ein; das zweite Sauerstoffatom wird zu Wasser
reduziert(Abbildung18).DioxygenasenhingegeninserierenbeideAtomedeselementarenSauerstoffs
indasSubstrat.
Abbildung18.
BAEYER‐VILLIGER‐OxidationeinesKetonskatalysiertdurchBVMO.[112]
Die ersten Anzeichen für eine enzymatische BAEYER‐VILLIGER‐Oxidation wurden von TURFITT 1948
währendseinenStudienzuSteroid‐SyntheseinPilzenentdeckt.[113]1953konntendieArbeitsgruppen
vonFRIEDundPETERSONinderSynthesevonTestololacton(32),ausgehendvonProgesteron(33),zwei
Reaktionsschrittenachweisen,diedurchdieMonooxygenaseausCyclindrocarponradicolakatalysiert
werden(Abbildung19).[114,115]
Abbildung19.
SchematischerSynthesevonProgeston(33)zuTestololacton(32).[116]Diedurch
BVMOkatalysiertenSchrittesindmitSternchengekennzeichnet.
17
3 EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
DieersteVerknüpfungzwischenderLactonisierungvonSteroiden,derbiochemischenOxidationvon
Campher durch ein Bakterium und der chemischen BAEYER‐VILLIGER‐Oxidation erstellten PRAIRIE und
TALALY 1963.[117] Durch weitere mechanistische Studien wurde NADPH als essenzieller Cofaktor für
dieseArtderOxygenaseidentifiziert.[118]
BAEYER‐VILLIGER‐Monooxygenasen treten vorwiegend in Mikroorganismen auf und sind dort an kata‐
bolischenVorgängenbeteiligt,etwaindenPilzenCylindrocarpon[113–115],Exophiala[119],Xanthobacter[120]
und Aspergillus[121] und in den Bakterien der Gattungen Cormamonas (ehemals Pseudomonas)[122],
Nocardia[100],Rhoddococcus[123],Gordonia[124],Mycobacterium[125]undAcinetobacter[126].Aberauchbei
höherenOrganismensindMonooxygenasenanzutreffen,beispielsweisebeiderSynthesevonSteroiden
undIridoideninPflanzen[127]odervonToxineninSchalentieren[128].InBakterienscheintdienatürliche
RollederMonooxygenaseninderKatalysevoneinemodermehrerenwichtigenSchrittenimoxidativen
Katabolismuszuliegen,währenddieseEnzymeinPilzeneineschwacheRolleimWechselzwischendem
Primär‐unddemSekundärmetabolismusspielen.[129]
3.2.2.2
StrukturundMechanismus
WALSH et al. konnten 1988 anhand der Oxidation von Cyclohexanon (2) zu ɛ–Caprolacton (3) durch
CHMOausAcinetobactercalcoaceticusdenMechanismusderReaktionaufklären(Abbildung20).[109,110]
ImerstenSchrittdesMechanismuswirddasenzymgebundeneFlavin(34)durchdenCofaktorNADPH
reduziertundderEnzym‐Cofaktor‐Komplex35gebildet,welchermolekulareSauerstoffbindet.[130]Das
so entstandene C4a‐Peroxyflavin (36) greift, ähnlich wie die Persäure in der chemischen BAEYER‐
VILLIGER‐Oxidation, nucleophil an die Carbonylfunktion des Ketons 2 an.[12] Die Bildung des CRIEGEE‐
Intermediats37istdergeschwindigkeitsbestimmendeSchritt.[130]BeideranschließendenUmlagerung
müssen die stereoelektronischen Voraussetzungen der antiperiplanaren Anordnung der O‐O‐Einheit
sowiedassynchroneWanderndesRestes,wiebeidemPeroxid‐Mechanismus(Abbildung11,Abschnitt
3.1.1), stimmen. Das C4a‐Hydroxyflavin (38) wird hydrolysiert und das oxidierte Flavin 39 für den
nächstenkatalytischenZyklusregeneriert.NADPH,welcheswährendeinesReaktionszyklusalserstes
amEnzymgebundenwirdundmitdemFlavin34reagiert,wirdbiszumletztenSchrittalsNADP+im
aktivenZentrumgehalten.
18
3
EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
O
R
N
NADP
R
N
O
N
NH
N
H
NADP
N
N
H O
O
O
O2
O
35
2
NH
36
C4a‐
Peroxyflavin
9
9a
7
6
6a
N
5
4a
O
1 2
3
4 NH
H+
O
34
R
N
NADP
R
N
NADP
N
39
R
N
O
NH
N
O
N
O
3
39
O
O
NH
38
H2O
C4a‐
Hydroxyflavin
NH
O
NADP
N
N
H
HO O
NADP
N
O
Abbildung20.
NH
37
CRIEGEE‐
Intermediat
R
N 10a N
10
O
N
N
H O
O
O O
NADPH
8
NADP
R
N
O
O
O
O
3
O
3
MechanismusderenzymatischenBAEYER‐VILLIGER‐OxidationamBeispielvonCyclo‐
hexanon(2)bezogenaufPAMO.[130]
WALSH et al. untersuchten 1982 die Fähigkeit der CHMO zur Oxidation von Heteroatom‐Verbin‐
dungen.[131] Der ambivalente Charakter des C4a‐Peroxyflavins 36 ist demnach der Grund für die
katalytischeAktivitätgegenüberelektronenreichen,z.B.Ketone,alsauchelektronenarmenSubstraten,
wie Sulfide (Abbildung 21).[116,132] So greift die Schwefelverbindung 40 die C4a‐Peroxy‐Spezies 36
nucleophilan,imUnterschiedzuderOxidationeinesKetons,beiderdasPeroxyflavin36alsNucleophil
agiert.
19
3 EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
Abbildung21.
AmbivalenteReaktivitätderC4a‐Peroxyflavins36gezeigtanderSulfid‐(links)und
BAEYER‐VILLIGER‐Oxidation(rechts).[116,132]
BiochemischeStudienanBVMOssindaufgrundderenrelativgeringenAnzahl,dergeringenStabilität
und/oderderschwierigenAufreinigungsehrrar.[133]DieambestenuntersuchteMonooxygenaseistdie
Cyclohexanon‐Monooxygenase(CHMO,EC1.14.13.22)vomStammAcinetobactercalcoaceticusNCIMB
9871aufgrundihrerkatalytischenundkinetischenEigenschaften.[130]DasEnzymhateineMolekülmasse
vonetwa59kDaundbestehtauseinereinzelnenPolypeptidkette,dieeinMolgebundenesFADenthält,
welches auchnachder Aufreinigung nicht abgetrenntwird.[100] ImAcinetobacter‐Bakterium, welches
natürlich in mariner Umgebung vorkommt, ist es im biologischen Abbau von Cyclohexanol (1), zu
Adipinsäure (41) beteiligt, indem es Cyclohexanon (2) zu ε–Caprolacton (3) oxidiert (Abbildung
22).[112,134] Weitere Oxidation der Adipinsäure (41) durch β‐Oxidation liefert Acetyl‐ und Succinyl‐
Coenzym A. Cyclohexanol (1) selbst ist ein Abbauprodukt von Cyclohexan, welches der CHMO sowie
weiterenMonooxygenasenalsKohlenstoffquelledientundzudenüber1000BestandteilenvonErdöl
gehört.[135]DieseCHMOakzeptierthundertevonunterschiedlichenKetonenundweistsomiteinaußer‐
gewöhnlich breites Substratspektrum in Kombination mit einer sehr hohen Regio‐ und Enantio‐
selektivitätauf.[136]
Abbildung22.
KatabolischerAbbauvonCyclohexanol(1)zuAdipinsäure(41)imBakterium
Acinetobactersp.[134]
AufgrundderInstabilitätderCHMOwaresallerdingslangeZeitnichtmöglich,eineKristallstrukturdes
Enzyms zu erhalten, die einen Einblick in die strukturellen Details des Enzyms geben würden. 2002
20
3
EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
verglichenFRAAIJEetal.verschiedenesequenziertebakterielleBVMOsundstießendabeiaufeinkonser‐
viertesSequenzmotiv(FxGxxxHxxxW).[107]MitdiesenDatenkonntensiedieSuperfamiliederBVMOs
enthüllen.ZweiJahrespäterveröffentlichtedieselbeGruppeeineKristallstrukturvonderPhenylaceton‐
Monooxygenase(PAMO,EC1.14.13.92)ausThermobifidafusca,einemungewöhnlichstabilenundhitze‐
beständigenEnzym,dasjedochnureinensehrengenSubstratbereichhat(Abbildung23).[137]
Abbildung23.
KristallstrukturvonPAMOausThermobifidafusca.[138]DieFAD‐Domäneistgrün,die
NADPH‐Domäneistblau,dasArg337istzentriertdargestellt.
PAMOisteinMonomermiteinerMolekülmassevon62kDa,welchesdieOxidationvonPhenylacetonzu
Phenylessigester katalysiert, und weist eine Homologie von 40.3% zur CHMO von Acinetobacter sp.
auf.[116,137]DieKristallstrukturwurdemitgebundenemFAD,jedochinAbwesenheitvonCofaktorund
Substrat, aufgeklärt. Für PAMO wurde eine Multidomänen‐Struktur, bestehend aus einer FAD‐
bindendenundeinerNADPH‐bindendenDomäne,vorgeschlagen.DasaktiveZentrumbefindetsichin
direkterNachbarschaftzudenbeidenDomänen.DasFlavinisttiefinderFAD‐Domäneverborgenund
durch VANDER WAALS‐undWasserstoffbrückenbindungenfixiert.DiesesstimmtmitderBeobachtung
überein,dassFADnichtvomEnzymdissoziiert,währendNADP+zwischenderFAD‐undderNADPH‐
Domäne eingekeilt ist. Bemerkenswert ist, dass sich das Sequenzmotiv der BVMO nicht im aktiven
Zentrum befindet, sondern in einer Schleife, die die beiden Domänen verbindet. Das aktive Zentrum
enthält zudem die Aminosäure Arg337, der die Funktion zugeschrieben wird, das negativ geladene
Flavin‐Peroxid‐Intermediat35durchWasserstoffbrückenbindungenzustabilisieren.
Arg337 ist außerdem nicht in einer einzelnen Konformation fixiert, sondern besitzt eine inhärente
Flexibilität.ImLaufedesKatalysezyklusnimmtArg337zweiKonformationenein:die„IN“‐Position,wie
es in der erhaltenen Kristallstruktur beobachtet wurde, bei der das Flavin stabilisiert wird, und die
„OUT“‐Position, in der der Cofaktor angrenzend zum Flavin positioniert wird. Die Übertragung eines
Hydrid‐IonsvomNicotinamid‐RingzumFADfindetfolglicherstnacheinerKonformationsänderungim
Enzym statt. Mutagenese‐Studien zeigten, dass die Mutation des Arginin‐Restes zu Alanin zu einer
21
3 EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
vollständigenInaktivierungdesEnzymsführt.[137,139]DieMutationbeeinflusstzwarnichtdieWechsel‐
wirkungen des Enzyms mit dem Cofaktor, jedoch schaltet es die Fähigkeit aus, Sauerstoff zu binden.
DieseszeigtdieBedeutungdesArginin‐ResteszurStabilisierungdesnegativgeladenenPeroxid‐Flavins
36.
MIRZAetal.löstenschließlicheineKristallstrukturderCyclohexanon‐MonooxygenaseausRhodococcus
sp.vomStammHI‐31(CHMORhodo.)inzweiverschiedenenZuständen,deroffenenunddergeschlossenen
Form, mit FAD und NADP+ auf (Abbildung 24).[140] Diese CHMO ist ein stabiles, monomeres Enzym,
welches ebenfalls FAD‐ und NADPH‐Domänen besitzt und zu 55% identisch mit der CHMO aus
Acinetobactersp.ist.WerdennunbeideKristallstrukturenderCHMORhodo.übereinandergelegt,soergibt
sichein„äquivalentesAtom‐Vektordiagramm“,dasdieVerschiebungderAtompositionenillustriert.[140]
WährenddieFAD‐Domäneunverändertbleibt,rotiertdieNADPH‐unddieHelix‐Domäneumetwa5°
bzw. 3°, was zu einer Verschiebung um 5Å bzw. 2Å von Resten führt, die weiter entfernt von der
Rotationsachse sind. Durch diese Rotation wird der Cofaktor seitlich näher zum Flavin geschoben,
sodassderbenötigteHydridtransferstattfindenkann.
Abbildung24.
Kristallstruktur der CHMO von Rhodococcus sp. HI‐31 (links); die FAD‐Domäne ist
beige,dieNADPH‐Domäneistblau,dieLinker‐Regionistgrün,dieflexibleSchleifeist
orange,dieHelix‐Domäneistbraun,dasBVMO‐Sequenzmotivistgelbdargestellt.[140]
ÄquivalentesVektordiagrammderselbenCHMO(rechts).
Obwohlschonlangebekanntist,dassdieCHMOvonAcinetobactersp.vieleKetonemitguterRegio‐und
Stereoselektivität umsetzen kann, war wenig über ihre Chemoselektivität bekannt. Die Chemoselek‐
tivität ist „die bevorzugte Reaktion eines chemischen Reagenz‘ mit einem von zwei oder mehreren
unterschiedlichenfunktionellenGruppen“.[141]VoreinigenJahrenwurdebeschrieben,dassdieOxida‐
tionbevorzugtanderCarbonyl‐Funktionstattfindet,wenneineweitereoxidierbareFunktion,beispiels‐
weiseeinAlkenoderThioether,enthaltenist.WALSHschlugvor,dassα,β‐ungesättigteKetonenichtvon
der CHMO umgesetzt werdenkönnen.[109,110] Diese Theorie wurde von OTTOLINA bestätigt,der zeigte,
dassbeiderchemoselektivenOxidationdesracemischenDiketonsrac‐44dasLacton(S)‐45mit35%
UmsatzinenantiomerenreinerFormerhaltenwurde(Abbildung25).[142]
22
3
EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
Abbildung25.
ChemoselektiveOxidationeinesracemischenDiketonsrac‐44mitCHMOnach
OTTOLINA.[142]
ImFalleeineszweifachsubstituiertenCyclohexanon‐RingsnimmtderEnergieunterschiedimmerweiter
ab,jeähnlichersichdiebeidenRestesind.DadurchverschwimmtderEnergieunterschiedderbeiden
möglichenCRIEGEE‐IntermediateundbeideEnantiomerewerdengebildet.[136]
Wieschonbeschriebenwurde,könnenauchheterocyclischeVerbindungenwieThioether(40)durch
Monooxygenasenoxidiertwerden.BefindetsichjedocheineKeto‐FunktioninderselbenVerbindung,so
findeteineOxidationausschließlichdortstatt(Abbildung26).SelbstnachVerlängerungderReaktions‐
zeitkonntekeineOxidationdesHeteroatomsfestgestelltwerden.DiesesErgebnisistbemerkenswert,
danachorganisch‐chemischemProtokollmitm‐CPBAdasHeteroatombevorzugtoxidiertwird.[143]
Abbildung26. CHMO‐katalysierteBAEYER‐VILLIGER‐OxidationvonThioether(40)[109,110](links)und
vonheterocyclischemKeton[143](rechts).
3.2.3
Alkohol‐Dehydrogenasen
Dehydrogenasen gehören allgemein zur Klasse der Oxidoreduktasen und haben in der Natur die
Funktion, stereospezifisch prochirale Cabonylverbindungen zu reduzieren.[144] Zur biokatalytischen
Darstellung von sekundären Alkoholen aus Carbonylverbindungen als wichtige Bausteine für die
pharmazeutische Industrie werden in großem Umfang Alkohol‐Dehydrogenasen (ADH) eingesetzt.
Diese treten in einer Vielzahl von lebenden Organismen auf, in denen sie für die Entgiftung und den
Metabolismus von Ethanol und anderen Alkoholen zuständig sind.[145] Diese ADHs sind NAD(P)‐
abhängigundkatalysierendenirreversiblenTransfervonHydridionenvonNAD(P)HaufdieCarbonyl‐
verbindung.
ZudenbekanntestenAlkohol‐Dehydrogenasengehörenunteranderemdiejenigen,dieausHefe,Pferde‐
leberoderThermoanaerobicumbrockiiisoliertwurden.[144]Dieseweisenjedocheinegeringethermische
StabilitätundEnantioselektivitätsowieeinenteilweiseengenSubstratbereichauf,sodassSubstratemit
größeren Seitenketten, beispielsweise Acetophenon, nicht umgesetzt werden können. Verschiedene
Alkohol‐Dehydrogenasenkönnen,inAnalogiezuPRELOGSRegel,einHydrid‐IonvomNAD(P)Hentweder
23
3 EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
aufdiesi‐oderdiere‐SeiteeinesKetonsübertragen.DarausresultierteinAlkoholmit(R)‐bzw.(S)‐Kon‐
figurationmitindenmeistenFällenhoherEnantioselektivität.[145,146]DerGroßteilderbekanntenADHs
gehört zu den (S)‐selektiven Dehydrogenasen, wie beispielsweise Rhodococcus erythropolis und
Theormoanaerobicumsp.[144,147]DiezuBeginnder1990erJahreentdeckten(R)‐ADHsgehörenzuden
kurzkettigenDehydrogenasen,zudenendieADHausLactobacilluskefir(Lk‐ADH,EC1.1.1.2)zählt.[144]
DieLk‐ADHisteinHomotetramermit251AminosäurenundeinemMolekulargewichtvon26.6kDapro
Untereinheit.[148]AufgrundderstrukturellenÄhnlichkeit(92.1%Identität)zuderADHausLactobacillus
brevis(Lb‐ADH)kanndessenMechanismusaufdieLk‐ADHübertragenwerden.DieAminosäurender
Lk‐ADHwerdenanalogzudenenderLb‐ADHnummeriert.DerkatalytischeMechanismusumfassteine
hochkonservierteTetradebestehendausSer142,Tyr155,Lys159undAsn113.DerTyrosin‐Restnimmt
dabeidiezentralekatalytischeSäurebeiderReduktioneinerCarbonylverbindungein.Erwirdwährend
desReaktionsverlaufsdeprotoniertundmussdurchdaspositivgeladeneLys159stabilisiertwerden.
Ser142hatdieAufgabe,dasSubstratzufixierenundzusätzlichdieLadungdesTyrosin‐Restesauszu‐
gleichen,sodasseinProtonvonzweiBindungspartnerngeteiltwird.DerkonservierteAsn113‐Restsoll
zusammenmitder2‘‐HydroxygruppedesCofaktorsundeinemgleichzeitigamLysin‐undAsparagin‐
RestgebundenemWassermolekül(Wat122)einProtonen‐Übertragungssystembilden.[149]FILLINGetal.
postulierten ein erweitertes Protonen‐Übertragungssystem, welches eine Gruppe von verschiedenen
Wassermolekülen umfasst, die eine hydrophobe Höhle ausfüllen, welche mit Carbonyl‐Sauerstoff‐
atomenbedecktist(Abbildung27).[150]
Abbildung27.
NahaufnahmederwichtigstenRestedeserweitertenProtonen‐Übertragungssystems
der Lb‐ADH.[149] Die katalytische Tetrade ist in magenta und Wasserstoffbrücken‐
bindungensindgestricheltdargestellt.
DieLk‐ADHenthältzweiMg2+‐Ionen,dieeherstrukturellealskatalytischeEigenschaftenbesitzen,dasie
je eine koordinative Bindung zu einem Monomer und elektrostatische Wechselwirkungen ausbilden.
Durch Zugabe des Komplexbildners Ethyldiamintetraacetat (EDTA) wurde die Inaktivierung des
Enzymsgezeigt,dasodiequarternäreStrukturdesEnzymsnichtmehrstabilisiertwerdenkann.Durch
ZugabevonMg+‐IonenkanndessenAktivitätzuetwaeinemDrittelwiederregeneriertwerden.[148]Die
Bedeutung der Anwesenheit von zusätzlichen Mg2+‐Ionen in der Reaktionsmischung macht sich im
24
3
EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
Anstieg der Aktivität der Lk‐ADH bemerkbar, was bedeutet, dass ein Teil der Ionen vom Enzym
dissoziiert.[151]
DavielederSubstratenichtwasserlöslichsind,kanneineZugabevonorganischemLösungsmittelzur
Reaktionsmischungsinnvollsein.LösungsmittelmitlogP‐Werten<3.5könnenjedochsowohldiespezi‐
fischeAktivitätalsauchdieStabilitätdesisoliertenEnzymsverringern.[152]DiehöchsteAktivitätweist
dieLk‐ADHbei50°Cauf,währenddaspH‐OptimumbeipH7fürdieReduktionundbeipH8fürdie
Oxidationliegt.[151]
HUMMELetal.setzten1990erfolgreichdasprochiraleSubstratAcetophenon(46)zu(R)‐Phenylethanol
((R)‐47)mitder(R)‐spezifischenLk‐ADHmiteinerAktivitätvon558U/mLum(Abbildung28).[151]Die
Lk‐ADH akzeptiert ein sehr breites Spektrum an Substraten wie aliphatische, offenkettige Ketone,
2‐oder3‐KetoesterundcyclischeKetonemithoherspezifischerAktivität(100–500U/mg).[153]
Abbildung28.
SchemaderLk‐ADH‐katalysiertenOxidations‐sowieReduktionsreaktionen.[151]
AuchwenndieReduktionprochiralerKetonezuchiralenAlkoholenderwichtigsteAnwendungsbereich
derLk‐ADHist,kanndieOxidationsreaktionebenfallsgenutztwerden.SowirddieLk‐ADHbereitszur
enzymatischenRacematspaltungvonracemischenAlkoholen,beispielsweisevon(R)‐und(S)‐Phenyl‐
ethanol, eingesetzt, bei der nur der (R)‐Alkohol zum entsprechenden Keton oxidiert wird.[153] Im
RahmendieserArbeitsolldieLk‐ADHdieOxidationvonCyclohexanol(1)zuCyclohexanon(2)mitdem
kostengünstigeneCofaktorNADP+katalysieren(Abbildung29).DieLk‐ADHbesitztfürdieOxidationdes
Alkohols1einegeringereAktivitätalsfürdieReduktioneinesKetons2,sodassdieWahrscheinlichkeit
derRückreaktionsehrgroßist.AllerdingskanndasGleichgewichtzugunstenderOxidationverschoben
werden,wenndasgebildeteKeton2durchdieCHMOdirektweiterumgesetztwird(vergl.Abschnitt
2.1).
Abbildung29.
EnzymatischeOxidationdurchLk‐ADHamBeispielvonCyclohexanol(1)zuCyclo‐
hexanon(2).
AufgrundderCofaktor‐AbhängigkeitderLk‐ADHistauchindiesemFalldieAnwesenheiteinesRegene‐
rationssystemsnotwendig.AufverschiedeneSystemewirdinKapitel3.2.4nähereingegangen.
25
3 3.2.4
EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
Cofaktor‐Regeneration
DieAnwendungvonBVMOsimindustriellenMaßstabistnochnichtvollständigentwickelt.Einesder
größten Hindernisse ist die Abhängigkeit der Lk‐ADH sowie der Monooxygenasen von dem Cofaktor
NADP+ bzw. NADPH, welches in stöchiometrischen Mengen zur Reaktionsführung eingesetzt werden
muss. Aus diesem Grund wurden Systeme zur in situ‐Cofaktor‐Regenerationssysteme entwickelt.
GenerellwerdenzweiunterschiedlicheStrategienzurCofaktor‐Regenerationangewandt(Abbildung
30).[14,154] Zum einen die substratgekoppelte Cofaktor‐Regeneration, die auf einen Alkohol als Co‐
substrat, meist iso‐Propanol, basiert, der in der Rückreaktion von derselben Alkohol‐Dehydrogenase
zum Keton oxidiert wird und somit den Cofaktor regeneriert. Durch Zugabe eines Überschusses an
CosubstratkanndasGleichgewichtzurProduktseiteverschobenwerden.
Abbildung30.
Strategienzursubstrat‐undenzymgekoppeltenCofaktor‐Regeneration.[154]
EinanderesKonzeptnutztdasenzymgekoppeltesRegenerationssystem.DabeiwirdderEinsatzeines
zweiten Enzyms notwendig, welches ein Cosubstrat unter Rückbildung des Cofaktors umsetzt. Die
Reaktionistirreversibel,wodurchdasGleichgewichtebenfallszurProduktseiteverschobenwird.Ein
gutesRegenerationssystemsolltepreiswertsein,keineNebenprodukteproduzierenundnichtmitden
katalytischen Eigenschaften des Enzyms wechselwirken. Klassisch werden als Redox‐Enzym Dehy‐
drogenasen, beispielsweise die Glucose‐ (GDH)[155] und Glucose‐6‐phosphat‐Dehydrogenase
(G6PDH)[131,156] sowie die Formiat‐[157] oder Phosphit‐Dehydrogenase[158,159] eingesetzt. Die Dehydro‐
genasenkönnendabeisowohlalsisoliertesEnzym[158,159]alsauchalsFusionsprotein[160]oderGanzzell‐
biokatalysator[14,161] zusammen mit der BVMO zur Reaktionsmischung gegeben werden. Ganzzellbio‐
katalysatoren, die neben dem rekombinanten produzierenden Enzym ein Cofaktor‐regenerierendes
Enzym coexpremiert enthalten, besitzen weitere Vorteile wie die leichte Handhabbarkeit von Bio‐
transformationen durch Verzicht auf Isolierung und Reinigung von Enzymen sowie die zellinterne
Cofaktor‐Regeneration.GleichzeitigschließensiedasVorhandenseinkonkurrierenderEnzyme,wiees
beiWildtypzellenderFallist,aus.ZubeachtenistsowohlbeiisoliertenEnzymenalsauchbeiGanzzell‐
Systemen die Kompatibilität der beiden Enzymreaktionen, da Inhibierungsreaktionen durch unter‐
schiedlicheReaktandenauftretenkönnen.
26
3
EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
DiefürdieCofaktor‐RegenerationhäufiggenutzteGDHoxidiertdasCo‐Substrat D‐Glucose(48‐a)und
regeneriert dadurch den Cofaktor NAD(P)+ (Abbildung 31).[155] Durch die spontane Hydrolyse des
entstandenen Gluconolactons (49‐a) zur Gluconsäure (50‐a) ist die Reaktion irreversibel und ver‐
schiebtdasGleichgewichtzurProduktseite.DieGDHistgünstig,kommerziellerhältlichundstabilerals
diemeistenzurRegenerationverwendetenEnzyme.WeitereVorteilederGDHsinddieAkzeptanzvon
NAD+sowievonNADP+undihrehohespezifischeAktivität.
DieG6PDHistähnlicheffizientundwirdebenfallsvielfachverwendet.[16,131,156]SieoxidiertdenZucker
Glukose‐6‐Phosphat (48‐b, G6P) zu Glukonolacton (49‐b), welches spontan zu Glukonsäure (50‐b)
hydrolysiert.EinengroßenNachteildiesesSystemsstellendiehohenKostenfürdasG6P(48‐b)dar.Die
G6PDH wurde bereits in Ganzzellsystemen zusätzlich zur BVMO überexprimiert.[16] Die erhöhte
Verfügbarkeit von NADPH für die Oxidation führt zu einer Verbesserung der Produktion von
ε‐Caprolacton(3).
Abbildung31.
CofaktorregenerationmitdemD‐Glucose(48‐a)/GDH‐unddemG6P(48‐b)/G6PDH‐
System.[131,155,156]
DieVerwendungderFormiat‐Dehydrogenase(FDH)isteineweiterebekannteMethodeundliefertCO2
alsNebenprodukt.[157]Dadiesesflüchtigist,erfolgtdadurcheineVerschiebungdesGleichgewichtesder
ReaktionzurProduktseite.NachteilediesesSystemssinddiegeringespezifischeAktivitätderFDHsowie
dieAbhängigkeitvonNADHalsCofaktor.
Die Phosphit‐Dehydrogenase (PtxD) katalysiert die Oxidation von Phosphit zu Phosphat mit gleich‐
zeitiger Reduktion von NAD+ zu NADH (Abbildung 32).[158,159] Anstelle von PtxD kann eine Alkohol‐
Dehydrogenase(ADH)zusammenmitiPrOHzugefügtwerden,umNADP+wiederzuregenerieren.[162]
Dabei wird Aceton gebildet, welches flüchtig ist und das Gleichgewicht zu Gunsten des Produktes
verschiebt.
27
3 EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
Abbildung32.
SchematischeDarstellungfürdenEinsatzvonPhosphit‐Dehydrogenase(PtxD)[158,159]
(links)undAlkohol‐Dehydrogenase(ADH)[162](rechts)zurCofaktor‐Regeneration.
EineeleganteLösungfürdieCofaktor‐RegenerationstelltenWILLETSetal.vor,indemsieeineCHMOmit
einerisoliertenADHkoppelten(Abbildung33).[163,164]DieADHoxidiertdenAlkoholalsSubstratzum
entsprechenden Keton und reduziert währenddessen das NADP+ zu NADPH. Anschließend wird das
Keton durch die Monooxygenase zum Lacton umgewandelt und NADPH verbraucht. Diese Art der
Cofaktor‐RegenerationsollauchindieserArbeitAnwendungfinden.EinweitererVorteildieserReak‐
tionsführungistderEinsatzvonnursehrgeringenMengenderCofaktorenNADP+bzw.NADPH(700€
bzw.2700€/g).[165]
Abbildung33.
SchematischeDarstellungdessubstratgekoppeltenRegenerationssystemsausBVMO
undADH.[163,164]
NebendenbishererwähntenMethodenzurCofaktor‐RegenerationwurdeninneuererZeitauchphoto‐
chemische Verfahren beschrieben. Bei dieser Art der Cofaktor‐Regeneration dient Ethyldiamintetra‐
acetat(EDTA)alsElektronendonor,welchesunterLichteinwirkungzerfällt.[166]DiesesSystemistaller‐
dingswenigeffizient.DanebengibtesAnsätzefürelektrochemischeVerfahren,diezurZeitjedochnoch
nichtausgereiftsind.[167]
28
3.3
3
EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
EigeneErgebnisseundDiskussion
DieindiesemTeilderArbeitverwendeteCyclohexanon‐MonooxygenaseausAcinetobactercalcoaceticus
NCIMB9871(CHMO,EC1.14.13.22,HandelsnameECSMO‐1vonENZYMICALSAG)wurdeausschließlich
alsRohextrakteingesetzt.DieverwendetenChargenderAlkohol‐DehydrogenaseausLactobacilluskefir
(Lk‐ADH,EC1.1.1.2,DSM20587)wurdenebenfallsalsRohextrakteingesetztundinGlycerinineiner
1:1‐Mischung(v/v)aufbewahrt.DieBearbeitungdiesesForschungsprojektesfandimRahmendesvon
der„DeutschenBundesstiftungUmwelt“(DBU)gefördertenProjektsstatt.
3.3.1
Standardreaktion:DoppeloxidationvonCyclohexanol(1)zuɛ‐Caprolacton(3)
Bei der in der Arbeitsgruppe bereits etablierte Doppeloxidation wird Cyclohexanol(1) durch den
BiokatalysatorLk‐ADHinsituzuCyclohexanon(2)unddiesesanschließenddurchdieCyclohexanon‐
Monooxygenasesofortweiterzuɛ‐Caprolacton(3)oxidiert(Abbildung34).[26]DieEnzymaktivitätender
der Lk‐ADH werden zuvor auf Acetophenon und die der CHMO auf Cyclohexanon (2) als Standard‐
Reagenzbezogen.
Abbildung34.
Standard‐ReaktionderDoppeloxidationvonCyclohexanol(1).[26]
BeidieserReaktionbenötigtdieCHMOdieoxidierteCofaktorformNADP+,welchedurchdieLk‐ADHals
Cofaktor‐RegenerationssystemwiederzurreduziertenFormNADPHumgewandeltwird.STAUDTerhielt
den höchsten produktbezogenen Umsatz von >97% bei einer Substratkonzentration von 20 mM bei
Raumtemperatur und 24 Stunden Reaktionszeit.[26] Nach aktuellem Kenntnisstand ist diese Doppel‐
oxidationdiebisdatoerstebiokatalytischeSynthesevonɛ‐Caprolacton(3)ausgehendvonCyclohexanol
(1).[26,168]
29
3 3.3.2
EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
EtablierunganalytischerMethoden
Vor Beginn der synthetischen Arbeiten musste zunächst eine schnelle und robuste Analytik für die
enzymatischeBAEYER‐VILLIGER‐OxidationzurqualitativenundquantitativenBestimmungderUmsätze
erarbeitetwerden.HierzuwurdezumeineneineNMR‐AnalytikinKombinationmitUrotropin(51)als
externerStandardetabliert.ZumanderenwurdeeineUmsatzbestimmungmittelsGaschromatographie
mittels Eichgeraden validiert sowie die Wiederfindungsraten unter verschiedenen Bedingungen
bestimmt.
3.3.2.1
UmsatzbestimmungmittelsNMR‐Analytik
Zur Bestimmung der Umsätze wurde im Anschluss an die Reaktion extraktiv in EPPENDORF‐Gefäßen
aufgearbeitet.NachEntfernendesorganischenLösungsmittelsuntervermindertemDruckwurdeder
vollständigeReaktionsansatzinNMR‐Röhrchenüberführt.Urotropin(51)dientedabeiinFormeiner
frisch angesetzten Stammlösung (0.17 M in CDCl3, 0.1 mL) als externer Standard. Mittels 1H‐NMR‐
SpektroskopiewurdedasVerhältnisvonProdukt3zumStandard51anhanddererhaltenenIntegrale
ermittelt (Abbildung 35). Das im Spektrum vorhandene Ethylacetat wurde bei der Versuchsdurch‐
führungimRahmendesSolvenz‐ScreeningszugegebenundistfürdieBestimmungdesUmsatzesnicht
vonBedeutung.
Abbildung35.
30
Umsatzbestimmungmittels1H‐NMR‐SpektroskopiemitUrotropin(51)alsexternem
Standard.
3
EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
ImvorliegendenBeispielwurdederUmsatzwiefolgtanhandderIntegralebestimmt(Gleichung1):
Gleichung1
Des Weiteren kann der produktbezogene Umsatz am selben Beispiel nach folgender Gleichung 2
ermitteltwerden:
Gleichung2
BeidemVergleichderbeidenBestimmungsmethodenfälltjedochauf,dassesgroßeUnterschiedeinden
mithilfe der Gleichungen 1 und 2 ermittelten Umsätzen gibt. Dieses kann mit der Flüchtigkeit der
Komponenten Cyclohexanol (1) und Cyclohexanon (2) während der extraktiven Aufarbeitung mit
anschließendemEntfernendesLösungsmittelsbeivermindertemDruckbegründetwerden,dainAnwe‐
senheiteinesexternenStandardsnurdasVerhältnisderKomponentenuntereinanderbestimmtwerden
kann und nicht der quantitative Umsatz. Es wurde somit, soweit nicht anders angegeben, auf die
BestimmungdesUmsatzesmittelsexternemStandard50zurückgegriffen.
Die Stabilität des Standards wurde anschließend ermittelt. Dafür wurden Urotropin (51) und Cyclo‐
hexanol(1)eingewogenunddasVerhältnisbeiderKomponentensofortunderneutnach24Stunden
LagerzeitbeiRaumtemperaturineinemgeschlossenenGefäßmittels1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmt
(Tabelle 2). Laut Einwaage liegt das Verhältnis bei 1 : 0.80 (51/1), nach 24 Stunden wird dasselbe
Verhältnis beider Komponenten erhalten. Urotropin (51) ist folglich optimal zur Verwendung als
externerStandardgeeignet.
Tabelle2.
VerhältnisvonUrotropin(51)undCyclohexanol(1)nachEinwaageundnach24Stunden
LagerzeitbeiRaumtemperatur.
Eintrag
Verhältnis51 /1
Einwaage
Verhältnis51/1
nach24h
1
1:0.80
1:0.80
31
3 EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
3.3.2.2
UmsatzbestimmungmittelsGaschromatographie
Dain1H‐NMR‐SpektroskopienureineGenauigkeitindenIntegralenvon±5%erzieltwerdenkann,soll
eineUmsatzbestimmungmittelsGaschromatographie(GC)etabliertwerden.Dafürwaresnotwendig,
zunächst für jede der Komponenten Cyclohexanol (1), Cyclohexanon (2) und ɛ‐Caprolacton (3) eine
Eichgeradezugenerieren,wobeibeiderErstellungderMethodendaraufgeachtetwerdensollte,dass
sichdieeinzelnenPeaksnichtüberlagerten.EswurdeeineStammlösungderdreiKomponenten(je1g
Substanz/100mLDCM)hergestellt.DurchVerdünnungderStammlösungauf5mg/mL,2.5mg/mL,
2mg/mL,1.75mg/mL,1.5mg/mL,1.25mg/mLund1mg/mLwurdeeineEichgeradeangefertigt.Ein
BeispielfüreinGC‐ChromatogrammderdreiKomponentenistinAbbildung36dargestellt.ImAnschluss
andieMessungkanndievorhandeneStoffmengesofortbestimmtwerden.
Abbildung36.
BeispieleinesGC‐ChromatogrammsderdreiKomponenten1,2und3.
DieSchwankungsbreitederUmsatzbestimmungmittelsGaschromatographiewurdefürdiedreiKom‐
ponentenCyclohexanol(1),Cyclohexanon(2)undɛ–Caprolacton(3)ermittelt,indemLösungenderdrei
KomponentenunterschiedlicherKonzentrationhergestelltundmittelsGCineinerDreifachbestimmung
vermessenwurden(Tabelle3).DieAbweichungbeträgtdemnachdurchschnittlich0.02–0.07mg/mL
beiunterschiedlichenKonzentrationenvon0.8–2.8mg/mL.SomitkanndieentwickelteMethodezur
UmsatzbestimmungmittelsGCalsetabliertbetrachtetwerden.Allerdingskannauchmitdieservaliden
AnalytikmethodedasProblemdesVerdampfensdereinzelnenKomponentenwährendderAufarbeitung
nicht verhindert werden. Daher wurde in einem separaten Experiment die Rückgewinnungsrate
währendderAufarbeitunguntersucht(Abschnitt3.3.2.3).
Tabelle3.
BestimmungderDurchschnittsabweichungderKomponenten1,2und3.
Eintrag
Komponente
Einwaage[mg]a)
Abweichung[%]a)b)
1
1
0.93–2.49
2‐4
2
2
0.81–1.58
1
3
3
1.25–2.75
2‐5
a)FürexakteMessdatensieheKapitel7.2.1.3.2.b)angegebensinddieminimalenundmaximalenAbweichungenin%.
32
3.3.2.3
3
EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
ErmittlungderRückgewinnungsrate
UmdieRückgewinnungsratenvondenKomponenten2und3zuerhalten,wurdedieAufarbeitungder
ReaktionsimuliertunddieRückgewinnungsrateabhängigvonderjeweiligenMethodeaufzweiWegen
ermittelt(Abbildung37).
Abbildung37.
SchematischeDarstellungderAufarbeitungsmethodenfürA)dieNMR‐Spektroskopie
undB)dieGC.
ZurBestimmungderRückgewinnungsratemittelsNMR‐SpektroskopiewurdenCyclohexanon(2)bzw.
ε‐Caprolacton (3, je 40 mM) in KPi‐Puffer (5 mL) über einen Zeitraum von 24Stunden bei Raum‐
temperatur gerührt. Im Anschluss wurde die jeweilige Lösung extraktiv aufgearbeitet, das Lösungs‐
mittel entfernt und der gesamte Kolbeninhalt in ein NMR‐Röhrchen überführt. Mithilfe des externen
Standards50wurdendieWiederfindungsratenmittelsNMR‐Spektroskopieermittelt,diebeisehrguten
91 – 98% lagen. Dieses entspricht einem Verlust von 9% bei Cyclohexanon (2) und von 2% beim
ɛ‐Caprolacton(3)(Tabelle4).
Tabelle4.
RückgewinnungsratederSubstanzen2und3nachsimulierterAufarbeitungnach24h
RührenbeiRT.
Eintrag
Substanz
Rückgewinnungsrate[%] *
1
2
2
3
91
98
*ermitteltmittelsNMRmitUrotropin(51)alsStandard.
Die Rückgewinnungsrate wurde parallel dazu mit der GC‐Methode bestimmt, wobei das Augenmerk
dabei auf die unterschiedlichen Rückgewinnungsraten bei unterschiedlichen Konzentrationen gelegt
wurde.DafürwurdendieKomponenten1,2und3inverschiedenenKonzentrationen(20–80mM)
eingewogen und für 24 Stunden in KPi‐Puffer (5 mL) gerührt. Im Anschluss an die extraktive Aufar‐
beitungwirddasLösungsmittelentfernt,derKolbeninhaltineinMaßkolbenüberführtunddieserzum
Eichstrichaufgefüllt(Abbildung37,B).DarauswerdendreiProbenentnommenundmittelsFünffach‐
bestimmungmittelsGCvermessen.DieErgebnissesindinAbbildung38aufgezeigt.
33
3 EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
OH
O
O
O
1
Rückgewinnungsrate[%]
Cyclohexanol(1)
(1)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
71
75
80
2
3
Cyclohexanon(2)
(2)
84
20
88
40
88
ɛ‐Caprolacton(3)
(3)
90
95
97
80
c[mM]
Abbildung38.
RückgewinnungsratederKomponenten1,2und3beiunterschiedlichen
Konzentrationen,ermitteltmittelsGC.
MitzunehmenderKonzentrationsteigtdieRückgewinnungsratevon71–80%bei0.1mMaufhervor‐
ragende 90 – 97% bei einer Konzentration von 0.4 mM an. Bemerkenswert ist dabei, dassdie Rück‐
gewinnungsratenbeiallenKonzentrationenfürCyclohexanol(1)amniedrigstenundfürdasLacton3
amhöchstensind.AuchdiesesErgebnisistmitderFlüchtigkeitderSubstanzenzubegründen,dabei
höherenKonzentrationeninsgesamteingeringererAnteildesSubstratesnotwendigist,umdieAtmo‐
sphäre im Reaktionsgefäß zu sättigen, und somit der Verlust geringer ist. Des Weiteren spielt der
VerteilungskoeffizientdereinzelnenSubstanzenwährendAufarbeitungeinewichtigeRolle.DerlogP‐
Wert ist charakteristisch für jede einzelne Verbindung und somit auch die Effizienz des jeweiligen
Extraktions‐VorgangsauseinerwässrigenPhase.
Die zunächst aus vorhergehenden Arbeiten[26] übernommene Extraktionsmethode in EPPENDORF‐
Gefäßenwurdeoptimiert.AnfangswurdedieoberewässrigePhaseinneueEPPENDORF‐Gefäßeüberführt
unddasEnzym‐PelletmitderorganischenPhase(DCM)zurückgelassen,sodassindennächstenExtrak‐
tionsschrittennurdiewässrigePhaseweiterextrahiertwerdenkonnte(Abbildung39).Beiderneuen
ExtraktionsmethodewirddieuntereorganischePhaseausdemEPPENDORF‐GefäßineinSammelgefäß
gegeben und die zurückbleibende wässrige Phase, die noch das Enzym‐Pellet enthält, erneut mit
Lösungsmittelversetzt.DurchdieseÄnderungwirdeinehöhereRückgewinnungsrateerzielt,danoch
weitereSubstanzausdemPelleterhaltenwerdenkann.SomitkonntediegesamteinderBiotransfor‐
mation eingesetzte Stoffmenge quantitativ zurückerhalten werden, während bei der bisherigen Auf‐
arbeitungsmethodenuretwa84%derStoffmengenachgewiesenwerdenkonnten.
34
3
EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
Abbildung39.
Alte(A)undneue(B)AufarbeitungsmethodemittelsEPPENDORF‐Gefäßen.Dabeiistdie
wässrigePhaseinblau,dieorganischePhaseingelbunddasEnzym‐Pelletinorange
dargestellt.
WährendderAufarbeitungwirddieinderReaktionsmischungenthalteneLk‐ADHdurchdasorganische
Lösungsmittel denaturiert und bildet ein Enzym‐Pellet, welches außer Lösungsmittelmolekülen auch
Substrat einschließen kann. Es wurde folglich die Rückgewinnungsrate in Anwesenheit der Lk‐ADH
erneutbestimmtundmitderRückgewinnunginAbwesenheitdesEnzymsverglichen(Abbildung40).
OH
O
O
O
1
2
3
mitLk‐ADH
Rückgewinnungsrate[%]
100
88
90
ohneLk‐ADH
93
90
73
80
94
76
70
60
50
40
30
20
10
0
1
2
3
Komponente
Abbildung40.
BestimmungderRückgewinnungsratevonCyclohexanol(1),Cyclohexanon(2)und
Lacton3inAnwesenheitundinAbwesenheitvonLk‐ADH.DieZentrifugierzeitbetrug
inallenFällen3x30Minuten.
35
3 EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
DabeiwurdediefürdieStandardreaktiontypischeMengeanEnzymeingesetzt.DieAnwesenheitder
Lk‐ADHwährendderReaktionmitanschließenderBildungdesEnzym‐PelletshathierbeinureineVer‐
ringerungder Wiederfindung von 1– 3% zur Folge.Die Rückgewinnungsrate von ɛ–Caprolacton (3)
wurdeauchmitgrößerenEnzymmengenuntersucht.GleichzeitigwurdedieZentrifugierzeitwährend
der Aufarbeitung von 3 x 30min auf 3 x 5 Minuten verkürzt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 41
aufgezeigt.
Rückgewinnungsrate[%]
3x30min
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
3x5min
93
73
68
69
61
20
0
150
500
Enzymmenge[µL]
Abbildung41.
Bestimmung der Rückgewinnungsrate von ɛ–Caprolacton (3) bei verschiedenen
EnzymmengenundbeiunterschiedlichenZentrifugierzeiten.
DieRückgewinnungsratesinktmitsteigendemEnzymgehaltderMischung,wasaufeinenEinschlussvon
Substrat im Enzym‐Pellet hindeutet. Dieses Pellet wird wahrscheinlich mit zunehmender Dauer des
Zentrifugierens fester und stärker komprimiert, sodass das darin enthaltene Substrat auch durch
mehrfachesWaschennichtherausgespültwerdenkann.Auchkonntefestgestelltwerden,dasssichbei
lang andauernder Zentrifugierzeit Rillen in den EPPENDORF‐Gefäßen bildeten, durch die Teile der
LösungenindieZentrifugeauslaufenkonnten.DieEnzymmengensolltenfolglichmöglichstgeringund
dieZentrifugierzeitkurzgehaltenwerden.
3.3.2.4
VergleichderAnalytik‐MethodenanhandderStandard‐Reaktion
Im Anschluss wurden die beiden etablierten Methoden, die 1H‐NMR‐Spektroskopie mittels externem
Standard sowie die Gaschromatographie, mithilfe der erstellten Eichgerade anhand einer Standard‐
Reaktionmiteinanderverglichen(Abbildung42).
36
3
EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
Lk‐ADH(40U,210µL),CHMO(3.82U,20.1µL)
NADP + (1mol‐%,1.57mg),MgCl2 (1mg)
OH
O
O
KPi‐Puffer (pH7,50mM,5mL)
O
1
40mM,
21µL
3
2
insitu
Konzentration[mM]
GC
40
35
30
25
20
15
10
5
0
NMR
29,6
23,6
2,4
1
0
2,0
1,2
2
3
Komponente
Abbildung42.
VergleichderAnalytik‐MethodennachextraktiverAufarbeitungimAnschlussaneine
Reaktion:GCvs.1H‐NMR.
Dabeiistersichtlich,dassbeidendreiKomponentenCyclohexanol(1),Cyclohexanon(2)sowieɛ‐Capro‐
lacton(3)mittelsGCinallenFälleneinhöhererUmsatzbestimmtwerdenkonnte.Dieseskannmitden
in den Methoden selbst vorhandenen Fehlern erklärt werden. Auch reagiert das GC vor allem bei
niedrigerenKonzentrationen,wieesindiesemBeispielbeimEdukt1derFallist,sensibler,daimNMR‐
Spektrum Komponenten niedriger Konzentration im Signalrauschen untergehen können. Der Unter‐
schiedinderProduktkonzentrationvon6mMbeiɛ‐Caprolacton(3)jedochmussaufandereUrsachen
zurückgeführtwerden.DabeikönnenWägefehleretc.ausgeschlossenwerden,dabeideAnalysenmit
demselbenReaktionsansatzdurchgeführtwordensind.ZudementfälltbeiderGC‐AnalytikderSchritt
desEntfernensdesLösungsmittels,sodassdasteilweiseVerdampfenderSubstratevermiedenwerden
kann.AusdiesemGrundistdieAnalytikmittelsGCdieMethodederWahlfürdieseArbeit.
3.3.2.5
AktivitätsbestimmungmittelsUV/Vis‐SpektroskopieundBRADFORD‐Test
Bei der Bestimmung der Aktivität eines Enzyms mittels UV/Vis‐Spektroskopie wird der von NADPH
durch Oxidation zu NADP+ bzw. die Bildung von NADP+, welches bei einer anderen Wellenlänge
adsorbiert, in Gegenwart des Substrats bei einer Wellenlänge von 340nm zeitlich verfolgt. Aus der
AnfangssteigungdererhaltenenAbsorptionskurvewirddieaufdieKatalysatormenge(inmL)berech‐
37
3 EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
neteAktivitätbestimmtundmittelsGleichung4(Kapitel7.2.1.4.1)berechnet.DadieReagenziennach
demZusammengebengutgeschütteltwerdenmüssen,startetdieMessungmiteinigenSekundenVerzö‐
gerung.AusdiesemGrundistzuerwarten,dassdieermittelteAktivitätetwasgeringeralsdietatsäch‐
licheausfällt.InsolchenFällenisteswichtig,dieEnzymlösungentsprechendzuverdünnen,umeine
LinearitätderMessgeradenderAnfangssteigungzugewährleisten.
Tabelle5.
BVMO‐ScreeningzurOxidationvonCyclohexanon(2).
Eintrag
BVMO
Aktivität
[U/mLRohextrakt]
Aktivität
[U/mgProtein]
RelativeAktivität[%]
1
2
3
ECSMo‐01
ECSMo‐03
ECSMo‐05
7.38
0.50
0.14
3.00
0.20
0.05
100
7
2
DieAktivitätderCHMOwurdeinGegenwartvonCyclohexanon(2,1mM)alsSubstratbestimmt,indem
derVerbrauchdesCofaktorsNADPHzuNADP+beobachtetwird.Diesebeträgtdemnach0.082U/mL.
MithilfeeinesEnzymscreeningsmitdenvonENZYMICALSAGzurVerfügunggestelltenMonooxygenasen
ECS Mo‐03, einer Phenylaceton‐Monooxygenase (PAMO), sowie ECS Mo‐05, einer p‐Hydroxyaceto‐
phenon‐Monooxygenase(HAPMO),mitCyclohexanon(2)alsStandardsubstratsolltendieAktivitäten
mit der von CHMO (ECS Mo‐01) verglichen werden. Da alle drei BVMOs in flüssiger Form erhalten
wurden,kannkeindirekterVergleichdermittelsUV/Vis‐SpektroskopieerhaltenenAktivitäten(U/mL)
erfolgen. Durch einen BRADFORD‐Test wurde im Anschluss der Proteingehalt der einzelnen BVMOs
bestimmtunddarausdieAktivitätpromgProtein(U/mg)ermittelt.DieerhalteneAktivitätderCHMO
(ECSMo‐01)beträgt3.00U/mgundwurdegleich100%gesetzt.ImVergleichdazubeträgtdierelative
AktivitätderECSMo‐03undderECSMo‐05nur7%bzw.2%(Tabelle5).
DadasSubstratspektrumderenzymatischenDoppeloxidationdurchdieCHMOerweitertwerdensoll,
wurdedieEnzymaktivitätgegenüberIsophoron(52,1mM)alsmöglichesweiteresSubstratbestimmt.
DieerhalteneAktivitätwerdenaufdiedesCyclohexanons(2)alsReferenzsubstanzbezogen,welches
gleich100%gesetztwird,umeinerelativeAussageüberdieEnzymaktivitättreffenzukönnen(Tabelle
6).DabeikonnteeineAktivitätderCHMOgegenüberIsophoron(52)vonnur0.003U/mgimVergleich
zurAktivitätgegenüberCyclohexanon(2)von0.101U/mLnachgewiesenwerden.DierelativeAktivität
derCHMOgegenüberIsophoron(52)beträgtdemnachnur3%,wasunterdengegebenenReaktions‐
bedingungeneineschwierigeReaktionsführungist.
38
Tabelle6.
3
EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
BestimmungderAktivitätvonCHMOgegenüberIsophoron(52).
Eintrag
Substrat
Aktivität[U/mg]
RelativeAktivität[%]
1
2
2
51
0.101
0.003
100
3
Die Aktivität der Lk‐ADH wurde gegenüber dem Standard‐Substrat 1‐Phenylethanol (47, 10 mM)
bestimmtundgleich100%relativeAktivitätgesetzt(Tabelle8).AnschließendwurdensowohlCyclo‐
hexanol(1,10mM)alsauch3,3,5‐Trimethylcyclohexanol(52,10mM)aufgleicheWeisevermessen.
Cyclohexanol(1)besitztdabeieinerelativeAktivitätvon153%(33.0U/mL),wirdalsodemnachvon
derLk‐ADHsehrgutalsSubstratakzeptiert.DieLk‐ADHweistgegenüberdemAlkohol53jedochkeine
Aktivitätauf.EventuellistdieReaktionszeitvon3MinutenindiesemFallnichtausreichend,sodassbei
einerverlängertenReaktionsdauervonbeispielsweise24StundentrotzdemProduktgebildetwerden
kann.
Tabelle7.
BestimmungderAktivitätderLk‐ADHgegenüber3,3,5‐Trimethylcyclohexanol(53)im
Vergleichzu1‐Phenylethanol(47)undCyclohexanol(1).
Eintrag
Substrat
Aktivität[U/mL]
RelativeAktivität[%]
1
2
3
47
1
53
21.5
33.0
0
100
153
0
3.3.2.6
OptimierungderStandardreaktion
EsistinderLiteraturbereitsbekannt,dassbeieinerKonzentrationdesLactons3höherals60mMeine
Inhibierung der CHMO auftritt.[26] Um Produktinhibierungen zu vermeiden, wurden in den letzten
Jahren verschiedene Methoden zur in situ‐Produktentfernung entwickelt, darunter der Einsatz von
Adsorberharzen[169,170], worauf im Kapitel 3.3.4 eingegangen wird, sowie die Verwendung von Zwei‐
phasen‐Systemen.[171–173]HydrophobeLösungsmittel,alsosolchemithohenlogP‐Werten,besitzenim
GegensatzzuhydrophilenSolventiennichtdieFähigkeit,dasamEnzymgebundeneessentielleWasser,
welchesalsSubstrathüllefungiert,zuentfernen,waszueinerVerringerungderEnzymaktivitätführen
39
3 EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
würde.[174]IneinemzweiphasigenSystembefindensichdasEnzymunddiehydrophilenKomponenten
inderwässrigenPhase,währenddiehydrophobenAnteileinderorganischenPhasevorhandensind.In
der Literatur wurde beschrieben, dass für die BAEYER‐VILLIGER‐Oxidation von benzolgebundenen
Ketonen durch Katalyse durch die Monooxygenasen PAMO und HAPMO höhere Umsätze durch
VerwendungvonverschiedenenorganischenLösungsmittelnineiner5%(v/v)Konzentrationerzielt
werden können.[112] Der Einsatz eines zweiphasigen Reaktionsmediums kann auch dazu dienen, die
CHMOzustabilisieren,wennmithohenSubstratkonzentrationengearbeitetwerdensoll.Zudemistauch
bekannt, dass die getesteten Monooxygenasen unterschiedliche organische Lösungsmittel tolerie‐
ren.[172,173]
AusgehendvomStandard‐VersuchausKapitel3.3.2.4wurdezunächstderLösungsmitteleffektunter‐
sucht. Dafür sollte sowohl das organische Lösungsmittel als auch die Konzentration variiert werden
(Abbildung 43). Die Bestimmung der Stoffmenge ist bei den gezeigten Reaktionen auf zwei Wegen
durchgeführt worden. In den meisten Fällen ist die Stoffmenge mittels 1H‐NMR‐Spektroskopie mit
Urotropin (51) als externer Standard bestimmt worden. Bei den Reaktionen mit 10% organischem
Lösungsmittel sowie mit Methylcyclohexan‐gesättigtem Puffer wurden die Stoffmengen mittels GC‐
Methodeermittelt.DerUmsatzdesBenchmark‐VersuchsinPuffer(vgl.Kapitel3.3.2.4)wurdeebenfalls
mtitelsGCbestimmtunddientzumVergleich.DabeiistderinKapitel3.3.2.3bestimmteVerlustder
Substanzenmitbiszu10%proKomponentebeidenhierverwendetengeringenKonzentrationenzu
berücksichtigen.
Zunächst ist ein großer Unterschied der Reaktionen in Puffer und dest. Wasser zu erkennen. Der
geringere Umsatz in Wasser ist mit einer möglichen Veränderung des pH‐Wertes des ungepufferten
Systemszuerklären,diedurchhydrolytischeSpaltungdesgebildetenLactons3auftretenkann.
Allgemeinkonntegezeigtwerden,dassdieenzymatischeBAEYER‐VILLIGER‐OxidationauchinAnwesen‐
heit eines organischen Lösungsmittels stattfindet. Zwar liefert die Oxidation in einem zweiphasigen
SystemallgemeingeringereUmsätzealsinreinemPuffer,jedochwirddiesernegativeEffektteilweise
durch eine bessere Löslichkeit des Lactons 3 in dem Lösungsmittel‐Gemisch aufgehoben. Ähnliche
Ergebnisse beschrieben DE GONZALO et al. bei der BVMO‐katalysierten Oxidation von orga‐nischen
SulfideninZweiphasen‐Systemen.[173]BiokatalytischeReaktionenlaufenimAllgemeinenlang‐samabin
LösungsmittelnmitlogP‐Werten<2,mäßigbeilogP‐Wertenzwischen2und4undschnellmithohen
logP‐Wertenvon>4,wasmitdenjeweiligenFähigkeitendesLösungsmittelszusammenhängt,dasdas
EnzymumgebendeessentielleWasserzuentfernen.[175]DerhöchsteUmsatzvon87%konntemit10%
Isooctan (v/v) erzielt werden. Dieses ist nicht weiter überraschend, da Isooctan von den hier ver‐
wendetenLösungsmittelndenhöchstenlogP‐Wertvon4.54besitzt.[176]
DieUmsätzemitjeweils10%(v/v)Methylcyclohexan(logP=3.88)[177]undToluol(logP=2.73)[177]sind
geringer und folgen dem Trend.[177] n‐Heptan hätte mit einem logP‐Wert von 4.40[176] jedoch einen
höhererUmsatzähnlichdemvonIsooctanliefernsollen.MäßigeUmsätzevon35–49%wurdenmit
Lösungsmittel‐gesättigtemKPi‐Puffer(pH7,50mM)erhalten.
40
3
EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
Lk‐ADH(40U,210µL),CHMO(3.82U,20.1µL)
NADP+ (1mol‐%,1.57mg),MgCl 2 (1mg)
OH
O
O
Lösungsmittel‐Gemisch, 5mL
1
40mM,
21µL
3
O
2
insitu
ɛ‐Caprolacton(3)
Stoffmenge3
Cyclohexanon(2)
Stoffmenge2
Stoffmenge1
Cyclohexanol(1)
KPii
dest.Wasser
MTBE‐ges.dest.Wasser
Lösungsmittel‐Gemisch
Methylcyclohexan‐ges.KPii
n‐Hexan‐ges.KPii
n
nn‐Heptan‐ges.KPii
EtOAc‐ges.KPii
MTBE‐ges.KPii
KPi/n‐Heptan9:1
i n
KPi/Isooctan9:1
i
KPi/Methylcyclohexan9:1
i
KPi/Toluol9:1
i
KPi/EtOAc6:4
i
KPi/MTBE6:4
i
KPi/MTBE8:2
i
0
5
10
15
20
Stoffmenge[mmol]
Abbildung43.
25
30
35
40
VariationdesLösungsmittelgemischesbeiderDoppeloxidationvonCyclohexanol(1).
Angegeben ist der Umsatz der Komponenten 2 und 3 sowie die nicht umgesetzte
Stoffmenge von 1. Die Reaktion in PKi‐Puffer ist in Kapitel 3.3.2.4 im Detail
beschriebenunddienthierzumVergleichalsStandard‐Reaktion.
Gemischemit20bzw.40%(v/v)organischemLösungsmittelliefertenpraktischkeinLacton3.Inder
Literaturwurdebereitsbeschrieben,dassmitanderenMonooxygenasenkeineUmsätzeinAnwesenheit
41
3 EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
desEssigesters5(logP=0.68)erhaltenwerdenkonnten.[173,175]DiesesistauchhierderFall.FürdieLk‐
ADHscheintdieVerwendungdesEssigesters5alsLösungsmitteljedochkeinHinderniszusein,dennes
konntenbiszu6%desCylcohexanons(2)alsZwischenstufenachgewiesenwerden.Wahrscheinlichlief
dieOxidationvonCyclohexanol(1)zumKeton2soweitab,bisderhinzugegebeneCofaktorvollständig
zuNADPHreduziertwordenistunddieReaktionstagnierte.Esistauchbekannt,dassdieLk‐ADHihre
spezifische Aktivität und Stabilität in Anwesenheit von organischen Lösungsmitteln mit logP‐Werten
<3.5einbüßt.[153]
Zusammenfassend kann geschlussfolgert werden, dass die Zugabe von 10% Isooctan (v/v), einem
LösungsmittelmithohemlogP‐Wert,zurReaktionsmischungimmernochzuhervorragendenUmsätzen
biszu87%führt.DadieAnsätzestetsnach24Stundenbeendetwordensind,könntehiereineVerlän‐
gerung der Reaktionszeit zu einer quantitativen Reaktion führen. Des Weiteren sollte untersucht
werden, inwiefern unter diesen Bedingungen eine Produktinhibierung auftritt, wenn bei Konzentra‐
tionenvonüber80mMgearbeitetwird.
AnschließendwurdederStandard‐VersuchbeiunterschiedlichenBedingungendurchgeführt.Sowurde
dieMengedesCofaktors,dieMengederLk‐ADHsowiedieReaktionstemperaturvariiert(Tabelle8).
Tabelle8.
VariationderReaktionsbedingungenderOxidationvonCyclohexanol(1).
Eintrag
NADP+
[mol‐%]
Lk‐ADH
[U]
T
[°C]
Umsatz3
[%]b)
Umsatz2
[%]b)
1a)
2
3
4
2
1
2
10
1
1
40
40
40
40
13
RT
RT
RT
30
RT
97
97
61
48
55
3
0
11
5
3
a)Standard‐Reaktion;b)Umsatzbestimmtmittels1H‐NMR‐Spektroskopie,angegebenistderproduktbezogeneUmsatz.
EinevermehrteZugabevonNADP+zurReaktionsmischunghatdemnachkeinenpositivenEinflussauf
denUmsatz.BeieinerErhöhungderCofaktormengeauf2mol‐%wurdenebenfalls97%desLactons3
erhalten.DieZugabevon10mol‐%vonNADP+lieferteimVergleichzurStandard‐Reaktion(Eintrag1)
nurnochetwa2/3desUmsatzes(Eintrag2);dazupassendkonnten11%anCyclohexanon(2)ermittelt
werden.DieseTatsachesprichtdafür,dassdieOxidationvonCyclohexanol(1)zumKeton2durchdie
Lk‐ADH sehr viel schneller abläuft als die Oxidation von 2 zum Lacton 3 durch die Monooxygenase.
Diesesdeutetdaraufhin,dassbeiderverwendetenCofaktor‐KonzentrationderMICHAELIS‐Konstante,
42
3
EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
der KM‐Wert, überschritten worden ist. Der KM‐Wert gibt diejenige Konzentration an, bei der die
ReaktionsgeschwindigkeitderhalbenMaximalgeschwindigkeitvmaxentspricht.BeiweitererErhöhung
derKonzentrationwirdschließlichvmaxangestrebtundeineSättigungtrittein,daalleaktivenZentren
derEnzymebesetztsind.Esistbekannt,dassNADP+festimEnzyminseinerreduziertenFormgebunden
ist und das sonst labile C4a‐Hydroperoxyflavin (36) der CHMO solange stabilisiert, bis ein Substrat
verfügbar ist.[178] Liegt nun in der Reaktionsmischung ein Überschuss an NADP+ im Vergleich zum
Substrat vor ([S] > KM), so kommt es in solchen Fällen zu einer kompetitiven Inhibierung bezüglich
NADPH.DieseArtderHemmungdesEnzymskannjedochdurchErhöhungderSubstratkonzentration
wiederrückgängiggemachtwerden.
Die Erhöhung der Temperatur von 20 °C auf 30 °C führte lediglich zu 48% Umsatz (Eintrag 4). Die
HalbwertszeitderisoliertenCHMObeträgtlautLiteraturbei25°CundpH8.5,demOptimumseiner
katalytischeAktivität,etwaeinenTag[179],sodassdavonausgegangenwerdenkann,dassdiekatalytische
Aktivität der CHMO bei einer Reaktionstemperatur von 30 °C bereits rapide gesunken ist. Die
MonooxygenasewirdalsdaskritischereEnzymindiesemSystemangesehen,dadieLk‐ADHfürihre
StabilitätinAnwesenheitvonhydrophobenMoleküleningroßenMolekülenbekanntist.[26]EinWeg,die
CHMOzustabilisieren,istdieImmobilisationaufeinemTräger.
DerEinflussderVerringerungderEnzymmengevonLk‐ADHaufdenReaktionsverlaufwurdeebenfalls
untersucht(Eintrag5),dafürdieReaktiondiezehnfacheMengeanUnitsderAlkoholdehydrogenase
verwendetimVergleichzurCHMOwird.EskonntendemnachauchmitnureinemDrittelderbisher
verwendeten Menge an Lk‐ADH ein immer noch guter Umsatz von 55% Lacton 3 erhalten werden.
EventuellkönntehiereineVerlängerungderReaktionszeitzueinemvollständigenUmsatzführen,was
zuKosteneinsparungeninHinblickaufdenPreisderAlkohol‐Dehydrogenaseführenkann.
3.3.3
UntersuchungenmittelsTitrations‐Apparatur
Mithilfe der Titrino‐Apparatur kann der Umsatz einer Reaktion bestimmt werden, indem D‐Glucose
(47‐a)/Glucose‐Dehydrogenase(GDH)beiderReaktion,indiesemFalldieReduktionvonAcetophenon
(46)durchdieLk‐ADH,alsCofaktor‐Regenerationssystemeingesetztwird(Abbildung44).Dabeiwird
D‐Glucose(48‐a)überdieZwischenstufeGluconolacton(49‐a)zuGluconsäure(50‐a)umgewandelt.In
derApparaturwirddieseSäuremitNatronlaugebekannterKonzentrationgegentitriert.NachBeenden
derReaktionkanndirektdieMengeanverbrauchterNaOHabgelesenunddarausderUmsatzermittelt
werden.
43
3 EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
O
O
+
46
O
3
+
(R)‐47
NADPH NADP+
D‐Glucose
GDH
O
3
Glucono‐
lacton
Glucon‐
säure
49‐a
50‐a
48‐a
Abbildung44.
O
OH
ADH
NaOH
Na‐Gluconat
Oxidation von Acetophenon (46) durch Lk‐ADH in Anwesenheit von ɛ‐Caprolacton
(3)mitD‐Glucose(48‐a)/GDHalsCofaktor‐Regenerationssystem.
ZunächstsolltedieInhibierungderLk‐ADHdurchɛ–Caprolacton(3)inunterschiedlichenKonzentra‐
tionenübereinenZeitraumvon24Stundenuntersuchtwerden(Abbildung45).DafürwurdeAcetophe‐
non(4),welchesalsStandardsubstratfürdieLk‐ADHfungiert,zuPhenylethanol((R)‐47)reduziert.
Produktkonzentration[mM]
Titrino
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
NMR
50
49
42
30
25
24
19
0
16
0.01
16
0.04
16
15
0.1
0.25
14
1
ɛ‐Caprolacton(3)[M]
Abbildung45.
UntersuchungderInhibierungderLk‐ADHdurchɛ–Caprolacton(3).DieReaktionen
bei0.25und1MLacton‐Konzentrationwurdenautomatischnach3.5hReaktionszeit
beendet.
DieProduktkonzentrationenwurdenimAnschlusszumeinenausgehendvonderverbrauchtenMenge
anNatronlaugewährendderReaktionermittelt.ZumanderenwurdendieProduktkonzentrationendes
gebildetenPhenylethanols(R)‐47imAnschlussandieextraktiveAufarbeitungmittels1H‐NMR‐Spektro‐
skopiemitUrotropin(51)alsexternemStandardbestimmt.Dabeiistzuerkennen,dassdieerhaltenen
KonzentrationendesAlkohols(R)‐47beietwa16mMkonstantbleiben.FolglichtrittkeineInhibierung
derLk‐ADHdurchdasLacton3auf.DiemittelsTitrino‐ApparaturberechnetenProduktkonzentrationen
desAlkohols(R)‐47sindbeigeringenKonzentrationendesɛ‐Caprolactons(3,0–10mM)zunächstzwar
erhöht,bleibenjedochkonstant.MitsteigenderKonzentrationdesLactons3jedochnimmtauchdievia
TitrinoermittelteProduktkonzentrationzu.DiesesliegtzumTeilanKonzentrationsschwankungender
verwendeten Natronlauge. Außerdem kann die Neutralisation von Enzymbestandteilen durch die
44
3
EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
Natronlauge erfolgen. Zudem kann davon ausgegangen werden, dass hierbei eine hydrolytische
SpaltungdeszugegebenenLactons3zurentsprechendenSäure53stattfindet,dieebenfallsmitNaOH
neutralisiertwird(Abbildung46).DiemittelsTitrino‐ApparaturbestimmtenProduktkonzentrationen
könnensomitnichtalsqualitativeWerteangesehenwerden.
O
hydrolytische Spaltung
O
3
Abbildung46.
O
HO
OH
54
HydrolytischeSpaltungvonɛ–Caprolacton(3)zu6‐Hydroxyhexansäure(54).
DieReaktionwurdeinD2OmitanschließenderNMR‐spektroskopischerUntersuchungderwässrigen
Phasedurchgeführt.Mittels1H‐NMR‐SpektroskopiekonntedienahezuvollständigeRückgewinnungdes
eingesetzten Lactons 3 durch Verwendung des externen Standards Urotropin (51) nachgewiesen
werden.IndenSpektrenkonntenzwardiegebildetenwasserlöslichenSalzenichtbelegtwerden,jedoch
konntedieBildungvon6‐Hydroxyhexansäure(54)nachgewiesenwerden,welchedurchhydrolytische
SpaltungdesLactons3entstandenist.Abbildung47zeigteinNMR‐SpektrumeinerBiotransformation,
inderdieHydrolysedesLactons3zurSäure54stattgefundenhat.SosindcharakteristischeSignaleim
aliphatischenBereichdesSpektrums,beispielsweisebei2.16und1.53ppm,vorhanden.DasVerhältnis
desgebildetenLactons3zurentsprechendenSäure54beträgtindiesemFall1.0:2.2.
Abbildung47.
NRM‐Spektrumvonɛ‐Caprolacton(3,links)undBeispieleinesNMR‐Spektrumsder
HydrolysedesLactons3zurSäure54(rechts).
DadieReaktionsgefäßederTitrino‐ApparaturennurmitParafilmverschlossenwerdenkonnten,istes
nichtunwahrscheinlich,dassüberdenReaktionszeitraumvon24StundeneinTeilderSubstrateauf‐
grundderhohenFlüchtigkeitverdampftist.DiemittelsNMR‐SpektroskopieerhaltenenProduktkonzen‐
trationen des Alkohols (R)‐47 bleiben konstant bei etwa 16 mM. Da vor allem bei den Ansätzen mit
hohen Konzentrationen des Lactons3 das Gesamtvolumen an Substrat zunimmt, können sich Fehler
45
3 EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
durchInhomogenitätderProduktmischungenergeben.Insgesamtlässtsichsagen,dassauchbeihohen
Konzentrationenanɛ–Caprolacton(3)keineProduktinhibierungderLk‐ADHstattfindet.DiesesEnzym
istdemnachfürdieDoppeloxidationvonCyclohexanol(1)übereinenZeitraumvon24Stundensehrgut
geeignet.
3.3.4
VerwendungvonAdsorberharzen
Die ersten Versuche, eine Produktinhibierung während der Reaktion durch Verwendung von Adsor‐
berharzenzuvermeiden,wurdenbereits1997vonELI LILLYAND COMPANYveröffentlicht.[169]DasHarz
wirdzurReaktionsmischungzugegebenundkanndabeialsfestesorganischesLösungsmittelangesehen
werden. Die treibende Kraft hinter der Adsorption ist die Wechselwirkung zwischen den unpolaren
Regionen des zu adsorbierenden Moleküls und der polaren Oberfläche des Harzes. So können viel
höhere Substrat‐ und Produktkonzentrationen erreicht werden, während das Enzym nur geringen
Konzentrationenausgesetztist.
DieindieserArbeitgetestetenHarzeXAD‐7undXAD‐1180sindeinfacheporöse,nicht‐funktionalisierte
Kunststoff‐KügelchenmitgroßenOberflächen,dieausunterschiedlichenPolymerenhergestelltwurden
und somit verschiedene Partikel‐ und Porengrößen besitzen. XAD‐7 ist ein Polyacrylat‐Harz und nur
mäßigpolarundsolltesomitsowohldasSubstratCyclohexanol(1)alsauchdasProdukt3gutbinden.
XAD‐1180isteinunpolares,porösesmakrovernetztesaromatischesPolystyren‐Divinylbenzol‐Polymer.
DieHarzebesitzeneinedurchschnittlichePorengrößevon400bzw.450Å.
ZunächstsolltedieRückgewinnungsratederSubstanzenbeibeidenHarzenXAD‐7undXAD‐1180durch
Simulation der Aufarbeitung untersucht werden, indem das Substrat 1 bzw. das Lacton 3 über
20Stunden bei Raumtemperatur in Puffer zusammen mit dem jeweiligen Adsorberharz gerührt.
Anschließend wird zum einen das Harz abfiltriert und mehrmals mit organischen Lösungsmitteln
gewaschen,zumanderendieorganischePhaseextraktivaufgearbeitet(Tabelle9).DieAufnahmefähig‐
keitderbeidenHarzeXAD‐7undXAD‐1180fürdieSubstrateCyclohexanol(1)undɛ–Caprolacton(3)
liegen abhängig von Substrat, Lösungsmittel und Harz nur bei 2 –20%.Nach der extraktiven
Aufarbeitungkönnennur46bzw.74%vonCyclohexanol(1)bzw.ɛ‐Caprolacton(3)inAnwesenheitvon
XAD‐7 zurückgewonnen werden. Die Verwendung von MTBE anstelle von Dichlormethan als
Extraktionsmittel jedoch führt zu einer drastischen Abnahme der Rückgewinnungs‐rate auf 30%.
EventuellkanndieserUnterschiedmitdenlogP‐Werten(DCM:1.25,MTBE:0.94)begründetwerden,da
dasProdukt3(logP=1.25)[180]alsauchderAlkohol1(logP=1.23)[177]inDCMbesserlöslichist.Die
höchsteRückgewinnungsratevomSubstrat1von89%wurdeinAnwesenheitvon100mgXAD‐1180
mitDCMalsExtraktionsmittelerhalten.
46
Tabelle9.
3
EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
RückgewinnungsratederSubstanzen1bzw.3inAnwesenheitderAdsorberharzeXAD‐7
bzw.XAD‐1180.
Eintrag
Substanz
Harz/[mg]
Solvenz
1
1
XAD‐7/100
2
3
3
Rückgewinnungsrate[%]
Harz
insgesamt
DCM
2
46
XAD‐7/100
DCM
8
68
3
XAD‐7/200
DCM
8
74
4
3
XAD‐7/100
MTBE
4
30
5
1
XAD‐1180/100
DCM
20
89
6
1
XAD‐1180/200
DCM
10
41
Da der Fokus bei der Doppeloxidation von Cyclohexanol (1) vor allem bei der Vermeidung der
ProduktinhibierungdurchdasLacton3liegt,wurdendieinAnsatz3verwendetenBedingungenfürdie
imAnschlussdurchgeführteReaktionaus‐gewählt(Abbildung48).
Abbildung48. DoppeloxidationvonCyclohexanol(1)inAnwesenheitvonXAD‐7.
DasHarzXAD‐7wurdezusammenmitdemCyclohexanol(1)sowiedenrestlichenKomponentenfür
24Stunden gerührt. Der dadurch erhaltene Umsatz beträgt 24% bezüglich des Urotropins (51) als
externerStandard(produktbezogenerUmsatz:48%).DieinsgesamtzurückgewonneneStoffmengealler
dreiKomponentenlagnachderAufarbeitungbeinur50%.DadieReaktionnurzurHälfteablief,istes
wahrscheinlich, dass ein Teil des Cyclohexanols (1) gleich zu Beginn im Harz durch Wasserstoff‐
brückenbindungenundVANDERWAALS‐KräftegebundenwurdeundfürdieReaktiondadurchnichtmehr
zurVerfügungstand.
Es wurde in dieser Arbeit erstmalsgezeigt, dassdieVerwendung vonHarzen bei der enzymatischen
DoppeloxidationvonCyclohexanol(1)zumLacton3istmöglichistundmit48%bereitseinenguten
produktbezogenenUmsatzliefert,derjedochnochweitererOptimierungbedarf.DesWeiterenkönnten
weitere Adsorberharze getestet werden, deren Porengröße sowie Polarität noch besser auf das hier
47
3 EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
erhaltene Produkt 3 zugeschnitten ist. Die Verwendung von Lösungsmittel mit höheren logP‐Werten
(>1.25)könntezueinererhöhtenAusbeutewährendderAufarbeitungführen.
3.3.5
VariationderSubstrate
Alkylsubstituierte Caprolactone sind von großem Interesse für die Synthese von entsprechenden
Polymeren. Die Copolymerisation von ɛ‐Caprolacton (3) mit Trimethylcaprolactonen wurde von der
FirmaDAICELpatentiert.[22]DurchUmsetzungderdarausentstandenenPolyolemitDiisocyanatewerden
Polyurethane erhalten, die sich durch exzellente Hydrolysebeständigkeit sowie durch hohe mecha‐
nischeStärkeundStabilitätgegenüberhohenTemperaturenundFeuchtigkeitauszeichnen.
Bei der BAEYER‐VILLIGER‐Oxidation von 3,5,5‐Trimethylcyclohexanon (55) entsteht auf chemischem
WegeeineracemischeMischungausdenRegioisomeren3,3,5‐und3,5,5,‐Trimethyl‐ɛ‐caprolacton(56
bzw. 57) (Abbildung 49). In diesem Fall werden vier Produkte gebildet, da es nur einen geringen
energetischen Unterschied der beiden wandernden Kohlenstoffatome gibt.[181] Die Anwesenheit von
Alkylsubstituenten macht sich auch in der längeren Reaktionszeit im Vergleich zur Oxidation von
Cyclohexanon(2)bemerkbar;sosinktdieReaktionsgeschwindigkeitmitsteigenderAnzahlanSubsti‐
tuenten ebenfalls. Auch die Länge des Alkylrestes in 3‐Position hat einen Einfluss auf die Geschwin‐
digkeit.
Abbildung49.
ProduktederchemischenundenzymatischenBAEYER‐VILLIGER‐OxidationdesKetons
rac‐55.
IndieserArbeitsollteaußerdemdieMöglichkeitderbiokatalytischenDarstellungdesentsprechenden
Lactonsausgehend von 3,5,5‐Trimethylcyclohexanol (53) mithilfeder Lk‐ADH und der CHMO unter‐
suchtwerden(Abbildung50).
48
3
EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
OH
Lk‐ADH
O
53
40mM
O
NADP +
NADPH
O
O
O
+
55
CHMO
rac‐57
rac‐56
GC
NMR
38,8
40
Konzentration[mM]
35
30
23,6
25
20
15
10
5
0
0
0
0
53
55
Komponente
Abbildung50.
1,2
56+57
EnzymatischeDoppeloxidationvon3,5,5‐Trimethylcyclohexanol(53).
BeidieserReaktionkonntemittelsNMR‐SpektroskopiejedochkeinUmsatzzudenLactonen56oder57
festgestellt werden. Das 13C‐NMR‐Spektrum zeigt keine für Carbonylfunktionen charakteristischen
SignaleimBereichzwischen170und220ppm,sodassdavonausgegangenwerdenkann,dassweder
dasKeton55nocheinsdermöglichenLactone56bzw.57inderReaktionsmischunganwesendsind.
Dass kein Keton 54 als Zwischenprodukt zu erkennen ist, stimmt mit den Ergebnissen aus den
vorherigenAktivitätsmessungenüberein.ZusätzlichsindallerdingsFremdsignaleindenNMR‐Spektren
zubeobachten,dienichtweiteridentifiziertwerdenkönnen.MöglicherweisewurdegebildetesLacton
zurjeweiligenSäurehydrolysiert.ImGC‐ChromatogrammkannjedocheinneuesSignalmit3%Fläche
gefunden werden, was einer Konzentration von 1.2 mM entspricht, wobei der Alkohol 53 sowie das
Keton 55 aufgrund unterschiedlicher Retentionszeiten ausgeschlossen werden können. Die in
Abbildung50gezeigtenKonzentrationsunterschiedekönnenmitdenUnterschiedenderMessverfahren
begründetwerden.DermittelsNMR‐SpektroskopieerhalteneWertwurdeaufeinenexternenStandard
bezogen,welchernachderAufarbeitunginsNMR‐Röhrchengegebenwurde.IndiesemFallwurdedabei
aufPyridazin(58) als Standard zurückgegriffen, um eventuelle Überlagerungender Signale mit Uro‐
tropin(51)imaliphatischenBereichdesSpektrumszuvermeiden.DieviaGCerhaltenenWertewurden
ausdemVerhältniszwischenEdukt53unddenmöglichenProdukten56und57ermittelt.DerVerlust
derSubstanzendurchVerdampfenoderderextraktivenAufarbeitungkanndabeinichtberücksichtigt
werden.
49
3 EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
So scheint bereits der erste Schritt, die Oxidation durch die Lk‐ADH, nicht stattzufinden. Die
MonooxygenaseausAcinetobactersp.istbekanntfürihrbreitesSubstratspektrumundwurdebereits
zurasymmetrischenOxidationvonsubstituiertenCyclohexanoneneingesetzt,umenantiomerenreine
Caprolactonezuerhalten.[182]Sowirdbei2‐oder4‐alkyliertemCyclohexanondas(R)‐Enantiomermit
hoherSelektivitätgebildet,wobeibeilängerenAlkylrestendieStereoselektivitätzunimmt.Racemische
3‐alkylierte Cyclohexanone liefern jedoch, besonders bei kleinen Alkylresten, ebenfalls beide Regio‐
isomerealsRacemate,dafürdieMonooxygenasekeineelektronischePräferenzexistiert(Abbildung49).
Parallel zu der Untersuchung der Oxidation von Trimethylcyclohexanol 53 sollte die enzymatische
BAEYER‐VILLIGER‐Oxidation von Isophoron (52) untersucht werden. Isophoron (52) wird aufgrund
seinerhervorragendenLösefähigkeitenalsLösungsmittelfürHarze,BindemittelundChemieprodukte
in der Lack‐, Druckfarben‐ und Klebstoffindustrie eingesetzt.[183] In der Literatur ist nur ein Fall der
OxidationvonIsophoron(52)beschrieben.RUIZetal.erhielten70%UmsatzzumentsprechendenLac‐
ton59,indemsieHydrocalcitealsOxidationsmittelverwendeten.[184]DabeifindetdieEpoxidierungder
DoppelbindungalsKonkurrenzreaktionstatt.EssindkeineenzymkatalysiertenAnsätzezurOxidation
vonIsophoron(52)bekannt.IndieserArbeitsolltediedirektebiokatalytischeDoppeloxidationvonIso‐
phoron(52)zumLacton59untersuchtwerden,wobeidieLk‐ADHzusammenmitiPrOHalsCofaktor‐
Regenerationssystemdienensollte(Abbildung51).
O
O
O
CHMO
52
NADP +
59
NADPH
OH
O
Lk‐ADH
GC
NMR
Konzentration[mM]
39,9
40,0
35,0
30,0
25,0
20,0
15,0
10,0
5,0
0,0
23,6
0,1
52
Komponente
0
59
Abbildung51. EnzymatischeOxidationvonIsophoron(51)mittelsGCundNMR‐Spektroskopie.
IndenNMR‐Spektrenkonntennur59%Edukt52inBezugaufdenexternenStandardPyridazin(58)
wiedergefundenwerden,was23.6mMentspricht.ImGegensatzdazukonnteimGC‐Chromatogramm
50
3
EnzymatischeOxidationmittelsMonooxygenasen
der Reaktionsmischung ein neues Signal beobachtet werden, was etwa 0.3% Fläche und 0.12 mM
entspricht. Auch in diesem Fall ist der Unterschied zwischen den erhaltenen Konzentrationen des
Ketons52sehrgroßundaufunterschiedlicheMessver‐fahrenzurückzuführen.EbensowieinAbbildung
50 wurden die via GC erhaltenen Werte durch das Verhältnis zwischen Edukt 52 und Produkt 59
bestimmt.AuchindiesemFallwerdenVerlustederSubstanzenwährendderReaktionsführungsowie
Aufarbeitungnichtnäherbetrachtet.
Zwarscheintes,alskönnedieBVMOnahezualleSubstrateumsetzen,diedasaktiveZentrumerreichen,
jedochsind2‐Cyclohexenon‐DerivateAusnahmen,dienichtodernursehrlangsamvonderCHMOunter
denhiergewähltenReaktionsbedingungenumgesetztwerdenkönnen.[109,110]
51
52
4
4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
EnantioselektiveRacematspaltungvon
Aminen
4.1
Lipasen
4.1.1
Allgemeines
Lipasen (Triacylglycerol‐Hydrolasen, EC 3.1.1.3) sind in der Natur allgegenwärtig und werden in
verschiedenenPflanzen,TierenundMikroorganismenexprimiert.[185]LipasenmikrobiellenUrsprungs,
hauptsächlichausBakterienundPilzen,repräsentierendieamhäufigstenverwendeteKlasseanEnzy‐
meninbiotechnologischenAnwendungenundinderorganischenChemie.SiefindenEinsatzineinem
breiten Spektrum industrieller Anwendungen, wie beispielsweise in der Lebensmittel‐Technologie,
Waschmittel und chemischen Industrie sowie in der biomedizinischen Forschung.[185,186] Die meisten
Lipasen werden von Bakterien produziert, wodurch sich deren großtechnische Herstellung viel ein‐
facher gestaltet und diese dadurch von besonderem kommerziellem Interesse sind. Ihre Entdeckung
wurdebereits1901vonEIJKMANbeschrieben.[187]
ObwohlbereitseinebeträchtlicheAnzahlanStämmenzurProduktionvonLipasenverwendetwurden,
sind Candida sp., Pseudomonas sp. und Rhizopus sp. die wichtigsten Quellen.[186] Die natürlichen
SubstratederLipasensindlangkettigeTriacylglycerolevomTyp60,dieeinesehrgeringeLöslichkeitin
Wasserbesitzen(Abbildung52).[185]DurchHydrolysewerdenGlycerol(61)sowiedreiÄquivalenteder
entsprechendenFettsäure62erhalten.
Abbildung52.
LipasenkatalysierteHydrolyseundSyntheseeinesTriacylglycerols60.[185]
Neben den lipolytischen, d.h. fettspaltenden Eigenschaften, besitzen die Lipasen noch eine ester‐
spaltende Aktivität.[185] Sie katalysieren neben der Hydrolyse und Umesterung außerdem die Alko‐
holyse, Acidolyse, Veresterung und Aminolyse.[186] Die Vorteile der Verwendung von Lipasen sind
vielfältig.DurchbereitsaufgelösteKristallstrukturenkanndaskatalytischePotentialvonLipasendurch
53
4 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen molekularbiologische Ansätze wie Protein engineering oder gerichtete Evolution weiter verbessert
werden.[188]LipasenbenötigenkeineteurenCofaktorenundsindchemoselektiv.Siebesitzeneinehohe
Substratbreite und sind hochspezifische Katalysatoren in Hinblick auf Regio‐ und Enantioselekti‐
vität.[189]AufgrunddieserEigenschaftensindLipasendieambreitestenangewendeteGruppevonBio‐
katalysatoren,wasauchdurchdiejährlichdurchschnittlich>1000VeröffentlichungenzudemEnzym
deutlichwird.[190]
Lipasen besitzen zudem die Fähigkeit, zwischen den Enantiomeren eines racemischen Gemisches zu
unterscheiden, was zu einem Einsatz von Lipasen zur kinetischen Racemattrennung führte. Solche
enantiomerenreinen oder –angereicherten Komponenten gewinnen in der Synthese von pharmazeu‐
tischen,synthetischorganischenundnatürlichenProduktensowieAgrarerzeugnissenimmermehran
Bedeutung.[185]
4.1.2
StrukturundMechanismus
BRADY et al. publizierten 1990 die erste Kristallstruktur einer Lipase aus dem Pilz Mucor miehei.[191]
Gleichzeitig wurde die Struktur der Lipase aus humaner Pankreas von WINKLER veröffentlicht.[192]
SeitdemwurdennocheinigeweitereLipasenbakteriellenUrsprungsmittelsRöntgenstrukturaufgelöst.
AlledieseLipasenvariierenzwarstarkinderGröße(20–60kDa),habenjedochtrotzrelativgeringer
sequenzieller Übereinstimmungen alle eine ähnliche dreidimensionale Gesamtstruktur mit der soge‐
nannten α/β‐Hydrolase‐Falte, die als allgemeines Faltmuster identifiziert werden konnte und haupt‐
sächlichausβ‐Faltblätternbestehtundvonα–Helicesflankiertwerden.[187]Solcheineα/β‐Hydrolase‐
FalteisttypischfürEnzyme,diekeineoffensichtlicheSequenzähnlichkeitaufweisen,jedochvoneinem
gemeinsamenVorfahrenabstammen.[187]
Die Bestimmung der dreidimensionalen Struktur von unterschiedlichen Lipasen bestätigt deren
KlassifikationalsSerin‐Hydrolasen.[186]DasaktiveZentrumderLipasenenthälteinekatalytischeTriade
bestehend aus Ser‐His‐Asp‐Resten, wobei sich der Serin‐Rest in einem β‐εSer‐α‐Motiv im aktiven
Zentrumbefindet.DiesesMotivbestehtauseinemβ‐Faltblatt,einerSchleifemitSerininderε‐Position
undeinerα–Helix.DerunveränderlicheersteundletzteGlycin‐RestinderConsensus‐Sequenz(Gly‐x‐
Ser‐x‐Gly)diesesMotivsliegeninhelicalerKonformationvor,dieaufgrunddersterischenAnsprüche
diesesMotivskonserviertsind.[187]
Ein unübliches und interessantes Merkmal der Struktur der Lipasen ist, dass das aktive Zentrum
vollständig unter einer deckelartigen Struktur, bestehend aus ein oder zwei α–Helices, verdeckt ist.
DurcheineBewegungdesDeckelswirddasaktiveZentrumfürdasSubstratzugänglich.Diesestruk‐
turelle Änderung des Proteins wird begleitet von einer weiteren Bewegung in einer nahe gelegenen
Schleife,wodurchdiesogenannteOxyanion‐Höhlefreigelegtwird.EineweitereFolgedieserKonforma‐
tionsänderungenistdieerheblicheVergrößerungderhydrophobenOberflächedesEnzyms,wasinder
Lipid‐Oberflächen‐ErkennungeineRollespielt.[187]
DasaktiveZentrumbestehtausdreiResten:einemSerin‐undeinemCarboxylat‐Rest,diebeidewasser‐
stoffverbrücktzueinemHistidin‐Restsind(Abbildung53).BeidemCarboxylat‐Restkannessichum
54
4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
einen Aspartat‐ oder Glutamat‐Rest handeln. Während der Hydrolyse einer Ester‐Bindung findet
zunächst einnucleophilerAngriffdes SauerstoffsdesSerin‐Restesauf das Carbonyl‐Kohlenstoffatom
desEstersstatt,waszuderBildungdestetraedrischenIntermediatesführt(Schritt1).Dieseswirddurch
Wasserstoffbrückenbindungen zu Resten in der Oxyanion‐Höhle stabilisiert. Der Imidazol‐Ring des
Histidins wird protoniert und dadurch positiv geladen und erhöht somit die Nucleophilie der Serin‐
Hydroxygruppe. Diese positive Ladung wird durch die negative Ladung des Säure‐Restes stabilisiert
(Schritt 2). Das tetraedrische Intermediat wird durch zwei Wasserstoffbrückenbindungen zu Amin‐
Funktionen von Resten, die sich in der Oxyanion‐Höhle befinden, stabilisiert. Abschließend wird der
Alkohol freigesetzt, welcher dann den Acyl‐Enzym‐Komplex verlässt (Schritt 3). Durch einen nucleo‐
philenAngriffeinesHydroxy‐IonswirddieFettsäurefreigesetztunddasEnzymregeneriert(Schritt4).
Abbildung53.
DetaillierterMechanismusderHydrolyseeinerEster‐BindungdurcheineLipase.[187]
Wasserstoffbrückenbindungenwerdengestricheltdargestellt.
LipasenbesitzendieFähigkeit,anderWasser/Öl‐Grenzflächezuagieren;diesesunterscheidetsievon
denEsterasen.[186]DasKonzeptderPhasengrenzen‐Aktivierung(‘interfacialactivation‘)ergibtsichaus
derAbhängigkeitderkatalytischenAktivitätderLipasenvondemAggregatzustanddesSubstrates,da
lipolytischeSubstrateineinemGleichgewichtzwischenMonomeren,MicellenundemulgiertemZustand
vorliegenkönnen.DieAktivitätderLipasenwirddurchunlöslicheSubstrate,dieeineEmulsionbilden,
erhöht.[193] Diese Erhöhung der Aktivierung wird ausgelöst durch strukturelle Veränderungen am
aktiven Zentrum. Während der Abwesenheit einer Wasser/Öl‐Grenzfläche wird das aktive Zentrum
55
4 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen durcheinenDeckel„geschlossen“.InAnwesenheitvonhydrophobenSubstanzenjedochöffnensichder
DeckelunddasaktiveZentrumundeswirdeinegroßehydrophobeOberflächeexponiert.
AusderHefeCandidaantarcticakonntenzweiLipasen,AundBgenannt,isoliertwerden.[194,195]Wievom
Namenersichtlichist,wurdederStammursprünglichinderAntarktismitdemZielisoliert,Enzymemit
extremen Eigenschaften zu finden.[195] Beide Lipasen unterscheiden sich stark. Die Lipase A ist ein
unspezifisches,thermostabilesundcalciumabhängigesEnzym.DieindieserArbeitverwendeteLipaseB
(CAL‐B)istetwaswenigerthermostabilundnichtcalciumabhängig.ObwohlderoptimalepH‐Bereich
beipH7liegt,istesimwässrigenMediumimBereichvonpH3.5–9nochstabil.DieCAL‐Bhatein
Molekulargewicht von 33.3kDa und besteht aus 317 Aminosäuren (Abbildung 54). Die Consensus‐
sequenz (Gly‐x‐Ser‐x‐Gly) ist in der CAL‐B nicht vorhanden, da das erste Glycin durch Threonin
ausgetauscht wurde (Thr‐x‐Ser‐x‐Gly). Dadurch ergibt sich eine leicht veränderte Konformation des
Faltblattesundderα–HeliximVergleichzuanderenLipasen.AuchindieserLipaseisteinekurzeα‐Helix
desEnzymsdafürzuständig,alsDeckelzurKontrolledesaktivenZentrumszufungieren.Andersalsdie
meistenLipasenzeigtdieCAL‐BkeineGrenzflächen‐Aktivierung.DieCAL‐Bistnichtsoeffektivbeider
HydrolysevonTriacylglycolenwieandereLipasen,reagiertjedochsehrstereospezifischbeiHydrolysen
oderchemischenSynthesen.[98]
Abbildung54.
KristallstruktureinerCAL‐B‐Mutante(links).DiestrukturellenWassermolekülesind
alsrotePunktedargestellt(rechts).[11]
DieCAL‐B(Novozym435)istaufeinemmacroporösenPolymer‐Trägerimmobilisiert,deraufMethyl‐
undButylmethacrylesterbasiertunddurchDivinylbenzolquervernetztist.[36]DasImmobilisatbesitzt
einenProteingehaltvonetwa5%(w/w)deslyophilisiertenPulvers,wovonnurca.40%denGehaltder
Lipasedarstellen.[196]
56
4.1.3
4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
EnantioselektivitätvonLipasen
ObwohldiegrobeStrukturunddiekatalytischeTriadederLipasensehrähnlichsindgibtesunterihnen
einengroßenUnterschiedinderSubstratspezifitätundderenAusmaß.[197]EineallgemeineRegelfürdie
Vorhersage der Enantioselektivität wurde von KAZLAUSKAS aufgestellt.[198] Die Regel basiert auf der
GrößederSubstituentenamStereozentrum.MittelsKristallstrukturdesEnzymkomplexesderLipase
aus Candida rugosa wurde mit dem schnell reagierenden (R)‐Ester eines sekundären Alkohols eine
WasserstoffbrückenbindungvomkatalytischenHistidin‐RestzumSauerstoffatomdesEstersgefunden.
DieseWasserstoffbrückenbindungfehltimKomplexdesEnzymszumlangsamreagierenden(S)‐Enan‐
tiomer. Generell gilt zudem, dass die Stereoselektivität bei unterschiedlich großen Substituenten am
chiralenKohlenstoffatomhöheristalsbeiSubstituentengleicherGröße.[11,199]
Abbildung55.
Schnellreagierendes(a)undlangsamreagierendes(b)EnantiomerindemModelldes
aktivenZentrums,abgeleitetvonderKAZLAUSKAS‐Regel.[199]
TriacylglyceridekönnenanallendreiEsterfunktionenoderspezifischnuraneineroderzweiPositionen
gespaltenwerden.LipasenzeigenauchverschiedeneSelektivitätenabhängigvonderKettenlängeder
Ester.[11,199]
57
4 4.2
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen StandderWissenschaft:Aminsynthesen
Für die pharmazeutische, agrochemische und feinchemische Industrie ist die Synthese von enantio‐
merenreinen Aminen ein wichtiger Bereich der organischen Chemie. Schätzungen zufolge enthalten
40‐50% aller optisch aktiver Wirkstoffe chirale Amine.[18] Zu den klassischen Synthesewegen von
chiralen Aminen gehörendie asymmetrische Hydrierung[200,201], Aminierung[18], Alkylierung[202] oder
Hydrosilylierung[203]vonIminen,oderdieHydrierungvonEnamiden.[204,205]Außerdemfindenbiokata‐
lytische Ansätze wie der Einsatz vonTransaminasen[206,207] oder diekinetischeRacematspaltung von
racemischen Ausgangsverbindungen[31,208] zunehmend Anwendung. Einige Beispiele sind in den
folgendenAbschnittennäherbeschrieben.
4.2.1
KlassischchemischeundchemokatalytischeSynthesen
Die katalytische asymmetrische Addition von Organometall‐Reagenzien an Imine ist ein wichtiger
Syntheseweg zu optisch aktiven Aminen.[202] Die asymmetrische Addition an C=N‐Bindungen wird
generelldurchVerwendungvonchiralenAuxiliarenoderchiralenLigandenerreicht.Diesesbringtden
Vorteil einer einfachen Trennung der diastereomeren Produkte vor der Abspaltung des chiralen
Auxiliars mit sich. In den letzten Jahrzehnten fand die Addition von Organometall‐Reagenzien in
AnwesenheiteineschiralenLigandenvermehrtAnwendung.DieersteSynthesedieserArtberichtete
TOMIOKA.[202,209]DabeiwirddasgeschützteAmin63mitdemchiralenAminoether‐Liganden(S)‐64um‐
gesetzt(Abbildung56).
Abbildung56.
AsymmetrischeAlkylierungdesgeschütztenImins63.[202,209]
Das entstehende Amin (R)‐65 kann mit einen nahezu vollständigen Umsatz von 98% und guten
ee‐Werten von 75% erhalten werden, wobei der Einsatz von 2.6 Äquivalenten an (S)‐64 notwendig
waren.Selbstmit5mol‐%desLiganden(S)‐64wirdimmernochenantiomerenangereichertesAmin
(R)‐65 mit 40%ee beobachtet. Der ee‐Wert kann bei ähnlichen Aminen durch Verwendung des
Bidentat‐LigandenBisoxazalinauf91%gesteigertwerden.[210]AuchDialkylzink‐Verbindungenkönnen
in Anwesenheit von chiralen Liganden zu sehr guten Enantiomerenüberschüssen führen.[202,211] In
neuerer Zeit zeigten auch Allylstannane und Allylsilane gute Ergebnisse.[212] Aufgrund der extremen
58
4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
Reaktionsbedingungen (‐100°C) sind diese Organometall‐katalysierten Reaktionen aus industrieller
Sichtschwierigzurealisieren.
EinederinteressantestenReaktionenderorganischenChemieistlautdemGreenChemistryInstituteof
AmericanChemicalSocietydieasymmetrischereduktiveAminierungvonprochiralenCarbonylverbin‐
dungen.[18]DabeigibteszweiMöglichkeitenderAminsynthese:diedirekteunddieindirektereduktive
Aminierung(Abbildung57).BeiderindirektenAminierungwirddieCarbonylverbindung66miteinem
AminzueinemImin66oderEnaminalsZwischenproduktumgesetzt,welchesisoliertundanschließend
enantioselektivweiterzumchiralenAmin68reduziertwird.EineLimitierungbestehtallerdingsinder
StabilitätdeszuisolierendenZwischenproduktes67.DiedirekteAminierungumgehtdieIsolationdes
Zwischenproduktes,indemdieCarbonyl‐Komponente66direktzumchiralenAmin68reduziertwird.
AlshomogeneKatalysatorendienenPt,Pd,NioderRhmitchiralenP‐Liganden.Veränderungeninder
StrukturderDiphosphin‐LigandensowiedersterischenundelektronischenFaktorenmachensichin
drastischen Abweichungen in Reaktivität und Stereokontrolle bemerkbar. Die Aminierung mit Am‐
moniakalsStickstoff‐DonoristimmernocheinungelöstesProblem.AufdiebiokatalytischeAminierung
wirdinKapitel4.2.2eingegangen.
Abbildung57.
IndirekteunddirektereduktiveAminierungvonCarbonylverbindungen66.[18]
Die direkte asymmetrische Aminierung findet in der industriellen Herstellung von (S)‐Metolachlor
((S)‐69)derFirmaSYNGENTA(ehemalsNOVARTIS)Anwendung(Abbildung58).[213,214](S)‐69istderaktive
BestandteilinDUAL®,einemderwichtigstenHerbizide.DurchdiechiraleAchse(Atropisomerie)sowie
das stereogene Zentrum ergeben sich für (S)‐69 vier Stereoisomere. Diese Mischung wird seit 1976
durch Pt‐Katalyse in Anwesenheit von Schwefelsäure mit >20000 t/a produziert. Nachdem 1982
erkanntwurde,dass95%derAktivitätvondenbeiden(1‘S)‐Diastereomerenausgeht,konnte1997eine
enantiomerenangereicherte Form (Handelsname DUAL MAGNUM®) der beiden (1‘S)‐Diastereomere
(90% ee) mit >10000 t/a in den Handel gebracht werden. Dieses führte zu einer Reduzierung der
Umweltbelastungumetwa40%imVergleichzurracemischenMischung.FürdieSynthesedes(S)‐69
wird das sterisch gehinderte Anilin 70 mit Methoxyaceton (71) umgesetzt. Der Schlüsselschritt der
SynthesevonMetolachlor((S)‐69)istdieIridium‐katalysierteenantioselektiveHydrierungdesImins
72.DeroptimierteProzessverläuftbei50°Cund80barWasserstoff‐Druck.DerKatalysatorwirdinsitu
aus [Ir(COD)Cl]2 und dem Ferrocenyl‐Diphosphin‐Liganden XyliPhos (73) generiert. In Anwesenheit
59
4 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen von TBAI (Tetrabutylammoniumiodid) und Säure kann innerhalb von drei Stunden ein vollständiger
Umsatzmitbiszu78%eeerreichtwerden.AnschließendwirddasAmin(R)‐74mitChloracetylchlorid
((R,S)‐75)zum(S)‐69umgesetzt.DiesesisteinsehrschnellerundeffizienterkatalysierterProzessim
gleichzeitiggrößtenMaßstab,derzurzeitinderIndustrieAnwendungfindet.
Abbildung58.
EnantioselektiveasymmetrischereduktiveAminierungzurSynthesevon(S)‐Metola‐
chlor((S)‐69).[213]
DiekatalytischeasymmetrischeHydrierungvonIminenstellteineweitereMöglichkeitzurSynthesevon
chiralenAminendar,wobeisichzweizähnigePhosphor‐Ligandenamerfolgreichstenbewährthaben.
Viele Methoden der asymmetrischen Hydrierung liefern oftmals nur eine geringe Enantioselektivität
undbenötigendenEinsatzvonSchutzgruppen.ZHANGetal.zeigtendieasymmetrischeHydrierungvon
ungeschützten Iminen 76, die durch Addition von Organometallen an Nitrile 77 isoliert werden
(Abbildung59).[200,201]
Abbildung59.
Iridium‐katalysierteasymmetrischeHydrierungdesImins76.[201]
Die Iridium‐katalysierte Hydrierung des Imins 76 durch den starren und elektronenreichen chiralen
Ferrocen‐Phosphan‐Liganden(S,S)‐78liefertdasAmin(R)‐79insehrgutenUmsätzenvonbiszu99%
und93%ee.DieSperrigkeitdesRestesR2imIminhateinengroßenEinflussaufdieEnantioselektivität
60
4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
derHydrierung.Miteinertert‐Butyl‐GruppeanstelleeinerMethyl‐Gruppesinktderee‐Wertvon99%
auf80%.TrotzdersehrgutenErgebnisseergibtsicheinNachteilinderVerwendungvonKetoiminen
76 als Substrate, da diese oftmals nur in Mischungen von E/Z‐Isomeren und Keto‐Enol‐Tautomeren
erhaltenwerdenkönnen.
Die reduktive Aminierungvon Carbonylverbindungen zu Aminen durch Ameisensäure unterHydrid‐
Übertragung ist als LEUCKART‐WALLACH‐Reaktion bekannt.[215] KADYROV et al. beschrieben 2003 die
asymmetrische reduktive Aminierung von Acetophenon (46) mittels Ruthenium‐Katalyse (80) und
AmmoniumformatalsHydrid‐Donor(Abbildung60).[216]SäurenbeschleunigendieReduktion,jedoch
habensieeinennegativenEinflussaufdieasymmetrischeInduktion.DerEinsatzvonAmmoniakführt
zu einer Erhöhung der Selektivität,aber auch zu einer Verringerung der Reaktivität. Bei 5 ‐10Äqui‐
valentenHCOONH4inNH3/Methanol(15–25%)undTemperaturenvon60–85°Cwurdendiebesten
Enantioselektivitätenerhalten.DasProduktwurdealsfreiesAmin(rac‐4)undinN‐formulierterForm
(81)alsHauptproduktdieserReduktionerhalten.NachHydrolysevon81wirddasAmin(rac‐4)mit
hoher Enantioselektivität (86 – 98% ee) erzielt, wenn ein aromatisches Keton als Edukt verwendet
worden ist. Mit aliphatischen Ketonen konnten unter den gegebenen Bedingungen nur Spuren des
entsprechendenAminsbeobachtetwerden.
Abbildung60. Asymmetrische Aminierung von Acetophenon (46) mittels Ruthenium‐Katalyse
(80).[216]
EbenfallsinteressantistdiedreistufigeSyntheseoptischaktiverAmidevonBURKetal.durchenantio‐
selektive katalytische Hydrierung von Enamiden mit RhI/DuPhos (S,S)‐82 (Abbildung 61).[204,205] Die
EnamidewiederumsinddurchReduktionderOximemitEisenzugänglich.AusgehendvomPinakolon‐
Oxim83wirddasnahezuenantiomerenreineAmid(R)‐85überdenZwischenschrittdesEnamins84
erhalten,wobeinur0.1mol‐%desKatalysatorsbenötigtwird.DasAmid(R)‐85kannanschließendzum
primärenAmin(R)‐86hydrolysiertwerden.NachteilediesesProzessessinddieaufwändigeSynthese
der Enamin‐Vorstufe 83, da diese durch Addition von Alkyl‐Grignard an Nitrile hergestellt werden,
sowiediegeringeAusbeutevon20‐40%desEnamids84.
61
4 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen Abbildung61.
EnantioselektivekatalytischeHydrierungvonEnamin84mitRhI/(S,S)‐82.[204,205]
Rhodium‐katalysierteasymmetrischeHydrierungsreaktionenvonEnamidenwerdenerfolgreichauch
mit anderen Liganden durchgeführt. In allen Fällen wird der eigentliche Katalysator aus der Metall‐
Spezies[Rh(COD)2]BF4unddemjeweiligenLigandeninsituhergestellt.DerPhosphin‐Aminophosphin‐
Ligand (S)‐87 liefert einen quantitativen Umsatz und ee‐Werte bis zu 94% (Abbildung 62).[217] Die
einfacheZugänglichkeitaus(S)‐Phenylethylamin((S)‐4),dieModularität,diesehrguteLuft‐undFeuch‐
tigkeitsstabilität und der niedrige Preis machen diesen Liganden extrem attraktiv. Der PhthalaPhos‐
Ligand(S)‐88enthälteinePhthalsäurediamid‐Einheit,dieguteDonor‐undAkzeptor‐Eigenschaftenzur
AusbildungvonWasserstoffbrückenbindungen,waszusupramolekularenWechselwirkungenzwischen
zwei Liganden, die einem supramolekularen Bidentat‐Liganden bilden, und dem Substrat führt.[218]
DurchVariationverschiedenerEinheitendesLiganden,wiebeispielsweisedemLinker,könnendiese
Eigenschaften weiter angepasst werden. Die Reaktionen laufen ebenfalls mit guten Umsätzen und
ee‐Wertenvon>97%ab.
Abbildung62.
ChiralerPhosphin‐Aminophosphin‐Ligand(S)‐87undPhthalaPhos‐Ligand(S)‐88zur
asymmetrischenHydrierungvonEnamiden.[217,218]
DerLigand(S)‐89isteinhocheffizienterpolymergebundenesMonophosphit‐LigandvomBINOL‐Typ,
dereinePEG‐StrukturalsAlkoxyeinheitgebundenhat(Abbildung63).[219]DieProduktederRhodium‐
katalysierten asymmetrischen Hydrierung von Enamiden werden bei Raumtemperatur und 60 bar
WasserstoffdruckmitquantitativemUmsatzmitbereitssehrgutenee‐Wertenvon>96%erhalten.Bei
einer Erhöhung der Katalysatormenge von 0.2% auf 1.0 mol% und einer Verringerung des Wasser‐
stoffdruckesaufnur10barkonntedieEnantioselektivitätnochweiterauf>98%gesteigertwerden.Als
Substrate eignen sich außerdem β‐Aminoacrylate, wobei sowohl (E)‐ als auch (Z)‐90 zur entspre‐
62
4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
chendenAminosäure91umgesetztwerdenkönnen.Hierbeiweist(E)‐90einehöhereAktivitätalsdas
(Z)‐Isomer(94%bzw.73%Umsatz)auf,jedochbleibendieEnantiomerenüberschüssemit96%bzw.
97% bei einer Katalysatorbeladung von 0.1 mol% etwa gleich. Sperrigere Substituenten wie die iso‐
Propyl‐GruppeführenzuoptimiertenErgebnissen,allerdingswirddabeieineUmkehrderSelektivität
von(S)zu(R)beobachtet.WeitereVorteilevon(S)‐89sinddieleichteZugänglichkeit,Luftstabilität,ein‐
facheAbtrennungsowiedieRecyclisierbarkeitdesKatalysator‐Systems.
Abbildung63.
AsymmetrischeRh‐katalysierteHydrierungvonEnamiden90(links)mitdemMono‐
phosphit‐Liganden(S)‐89(rechts).[219]
Die Möglichkeiten zur chemischen asymmetrischen Synthese chiraler Amine sind sehr vielfältig und
liefern in den meisten Fällen sehr gute Umsätze sowie hohe Enantiomerenreinheiten. Die Synthesen
verlaufenjedochoftmehrstufigunderfordernOrganometall‐KatalysatorenundLiganden,diekosten‐
intensivsindundaufwendighergestelltwerdenmüssen.AuchkönnendieReaktionsbedingungennicht
direktaufandereSubstrateübertragenwerden,sodassjederSchrittindividuelloptimiertwerdenmuss.
63
4 4.2.2
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen EnzymkatalysierteSynthesen
Zur biokatalytischen Synthese von chiralen Aminen gibt es unterschiedliche Ansätze ausgehend von
prochiralen Carbonylverbindungen oder von racemischen Aminen bzw. Amiden wie die Transami‐
nierung, die Deracemerisierung und die kinetische sowie dynamisch kinetische Racematspaltung
(Abbildung64).
Abbildung64.
MethodenzurbiokatalytischenSynthesevonchiralenAminen.[220]
SeitBRAUNSTEIN1939erstmalsvondemTransfereinerAminofunktionzwischeneinerDonor‐Amino‐
säure und einer α–Ketosäure als Akzeptor durch lebendes Gewebe tierischen Ursprungs berichtete,
zähltdieEnzymklassederTransaminasezudenambestenuntersuchtePyridoxalphosphat‐abhängigen
Enzymen.[221]EinvonCELGENEentwickeltesindustriellesVerfahrenzurbiokatalytischenSynthesevon
chiralen Aminen nutzt die Transaminierung. Dabei katalysieren Transaminasen die asymmetrische
ÜbertragungeinerAminofunktionaufeineCarbonylverbindungwieKeton46odereineα‐Ketosäure,
wobei Pyridoxalphosphat 92 als Cofaktor dient, in dem die Aminofunktion sowie das Reduktions‐
äquivalentgespeichertwerden(Abbildung65,A).[207,222]Dasowohl(S)‐alsauch(R)‐selektiveTrans‐
aminasenentwickeltwurden,sindbeideEnantiomerederAminezugänglich.[208]EinprochiralesKeton
46 übernimmt dabei vom Amin‐Donor (S)‐93 eine Aminofunktion. Enantiomerenreines (S)‐4 und
AcetonentstehenmiteinerAusbeutevon>90%.DesWeiterenkanndieReaktionauchimSinneeiner
Racematspaltung geführt werden (Abbildung 65, B). Dabei wird das (S)‐4 in das entsprechende
Acetophenon(46)umgewandelt.AlsAminogruppenakzeptorwerdenAldehydewie94verwendet,aus
demdasAmin95entsteht.DasAmin(R)‐4wirdenantiomerenreinmitmaximal50%Umsatzerhalten.
AllerdingserweistsichdieTrennungderProduktmischungenausderRacematspaltungalsaufwendig.
64
4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
TransaminasenakzeptiereneinbreitesSubstratspektrumanaliphatischenundaromatischenKetonen
undAminen.[208]EinNachteilbestehtallerdingsinderAbhängigkeitdesEnzymsvonwässrigenMedien.
DaherwerdenmithydrophobenReagenzienmeistnurgeringeProduktkonzentrationenerzielt.
Abbildung65.
Enantioselektive Transaminierung von Keton rac‐4 mit dem Cofaktor Pyridoxal‐
phosphat92(A)undRacematspaltung(B).[208]
Die mehrstufige Synthese von Sitagliptin ((R)‐96), einem Wirkstoff zur Behandlung von Diabetes
mellitusTyp2,umfasstunteranderemeineRhodium‐katalysierteasymmetrischeReduktioneinesEn‐
amins.[206,207] Das in Kapitel 4.2.1 beschriebene chomokatalytische Verfahren enthält ein toxisches
SchwermetallalsKatalysator,welchesaufwendigwiederentferntwerdenmuss.AlsAlternativewurde
vonMERCK&Co.undCODEXIS,INC.einbiokatalytischerProzessentwickelt(Abbildung66),der2010mit
dem Green Chemistry Award für eine verbesserte grüne Synthese ausgezeichnet worden ist.[223] Die
ω‐TransaminasekatalysiertdieÜbertragungderAmin‐FunktionsowiedesReduktionsäquivalentesvon
einergünstigenStickstoffquellewie2–Propylamin(rac‐93)aufdasDiketon97.DurchdieFlüchtigkeit
des gebildeten Acetons wird das Gleichgewicht zur Produktseite verschoben. Die Reaktion wird mit
einerhohenSubstratkonzentrationvonbiszu500mMund>40°CReaktionstemperaturdurchgeführt.
Sitagliptin((R)‐96)wirdinnerhalbvon24StundenmiteinemUmsatzvon90–95%undeinemEnantio‐
merenüberschussvon99.5%gewonnen.
Abbildung66.
BiokatalytischeSynthesevonSitagliptin((R)‐96)mittelsω‐Transaminase.[206,207]
65
4 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen Die Deracemerisierung von racemischen Aminen, wie α–Aminosäuren, wurde kürzlich durch die
KupplungeinerenantioselektivenOxidationmittelseinerD‐spezifischenAminoxidaseundeinerche‐
mischen,nicht‐selektivenReduktiondurchgeführt(Abbildung67).[224]DieserProzessführtsomitzur
Bildung von L‐98 ausgehend vom prochiralen Imin 99. Da chirale Amine jedoch nicht von Amino‐
säureoxidasenoxidiertwerdenkönnen,wurdeninneuererZeiteineAminoxidaseausAspergillusniger
als aktiver Biokatalysator identifiziert.[225] Somit kann nun ein breites Substratspektrum an chiralen
Aminen mit guter Enantioselektivität umgesetzt werden. In allen bekannten Fällen ist dieses Enzym
(S)‐selektiv.AllerdingssindfürAnwendungeningroßemMaßstabnochOptimierungeninHinblickauf
Selektivität,AktivitätundStabilitätnotwendig.
Abbildung67.
DeracemerisierungeinerD‐α‐AminosäureD‐98mittelseinerAminoxidase.[224]
ImgroßenMaßstabwerdenLipasenzurbiokatalytischenSynthesevonchiralenAminenherangezogen.
Nach einer Empfehlung von IUPAC ist eine kinetische Racematspaltung wie folgt definiert: „Das
ErreichenvoneinerteilweisenodervollständigenTrennungaufgrundvonunterschiedlichenReaktions‐
geschwindigkeitenderEnantiomereeinesRacematesmiteinemchiralenAgens(Reagenz,Katalysator,
Lösungsmittel, etc).“[226] Im einfachsten Fall einer Racematspaltung regieren die Enantiomere des
SubstratsmiteinemchiralenAgensoderKatalysatorüberzweidiastereomereÜbergangszustände.Die
EnergiendieserÜbergangszuständebestimmendieGeschwindigkeitskonstantenfürdieUmsetzungdes
langsamunddesschnellerreagierendenEnantiomersunddamitdieProduktverteilung.[37]Zwarwurden
vermehrtchemischeKatalysatorenzurRacematspaltunggetestet,allerdingskonntendieErgebnisse,die
mitvielenBiokatalysatorenerzieltwurden,nichtübertroffenwerden.[208]
Anfangder90erJahrenwurdenbeiSHELLersteArbeitenzurenantioselektivenHydrolyseracemischer
AmidemittelsArthrobactersp.durchgeführt,wobeisichdieVerwendungvonganzenZellensowiedie
sehrlangenReaktionszeitenalsnachteiligerwiesen.[227]Mitteder90erJahrewurdenvonderBAYERAG
Methoden zur selektiven Hydrolyse von racemischen Acetamiden wie 100 mit Lipase B aus Candida
antarctica (CAL‐B) als Biokatalysator ausgearbeitet (Abbildung 68).[228] Die CAL‐B hat sich, in Form
eines Immobilisats auf einem Acrylamid‐Träger (Novozym 435), in einer Reihe von Arbeiten als die
geeignetsteLipaseerwiesen.[27–29]AufgrundunbefriedigenderRaum‐Zeit‐Ausbeuten,43%Umsatznach
sieben Tagen Reaktionszeit, wurde dieser Prozess trotz sehr guter Enantiomerenüberschüssen von
>99.5%technischnichtangewendet.[208]
66
4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
Abbildung68.
SelektiveHydrolysedesracemischenAcetamidsrac‐100nachBAYERAG.[228]
Nach einem von BASF SE patentierten Verfahren der enantioselektiven Acylierung, der sogenannten
kinetischen Racematspaltung, von Amin rac‐4 wird in der ersten Stufe nahezu enantiomerenreines
Amin(S)‐4unddasentsprechendeAmid(R)‐102mit>99%eeerhalten.[208]EineBesonderheitstelltder
induktiveEffektderMethoxygruppedar,diedieReaktivitätanderCarbonylfunktionaktiviert.Durch
MolecularModellingeinesÜbergangszustandeskonnteeineWasserstoffbrückenbindungzwischendem
β‐Sauerstoffatom des Esters 103 und der Aminofunktion von rac‐4 ermittelt werden.[229,230] Wahr‐
scheinlichstabilisierendieseWechselwirkungsowieinduktiveEffekteundsterischeGründedenÜber‐
gangszustandunderhöhendadurchdieReaktionsgeschwindigkeit.
NachAbtrennungvon(R)‐102durchDestillationoderExtraktionwirddasebenfallsenantiomerenreine
(R)‐4 durch basische Hydrolyse freigesetzt. Die Substratbreite ermöglicht die Racematspaltung von
vielenstrukturellsehrunterschiedlichenAminen.WeitereVorteilediesesProzessessinddieMöglich‐
keit zur Rückführung der unerwünschten Enantiomere durch Racemisierung[231–233] und die Rück‐
gewinnung des Acylierungsmittels[234]. Seit Anfang 2002 produziert BASF SE mit diesem Verfahren
optischaktiveAminemit>3500t/aundistsomitderweltweitführendeAnbieterchiralerAmine.[208]
Abbildung69.
Enantioselektive Amidbildung ausgehend von rac‐4 nach BASF SE.[208] Basische
Hydrolysevon(R)‐102ergibt(R)‐4.
Bei der Umsetzung von cyclischen Aminoalkoholen[235] und Diaminen (wie (±)‐104)[236,237] wird
ebenfalls CAL‐B als Biokatalysator verwendet. Im Fall des Diamins (±)‐104 können mit Dimethyl‐
Malonester (105) als Acyldonor zwei sequenzielle Acylierungsreaktionen durchgeführt werden
(Abbildung70).[236,237]DabeiwirdzunächstdurchMonoacylierungdasoptischangereicherteMonoamid
67
4 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen (R,R)‐106 mit 66% Enantiomerenüberschuss und das nicht umgesetzte Amin (S,S)‐104 mit 83% ee
erhalten.DerzweiteAcylierungsschrittistenantioselektiv,wodurchdasDiamid(R,R)‐107mit>99%ee
erzieltwerden.DieCAL‐BzeigtfolglichinbeidenSchrittendiegleichePräferenzinBezugaufdas(R,R)‐
Enantiomer.DiesesErgebnisstehtinEinklangmitderRegelvonKAZLAUSKAS,dadasmonoacylierteAmid
(R,R)‐106 einen größeren sterischen Unterschied in den Substituenten aufweist als das freie Diamin
(±)‐104.[28]
Abbildung70.
Lipasen‐katalysierte doppelte Acylierung des Diamins (±)‐104 mit Malonsäure‐
dimethylester(105)alsAcyldonor.[236,237]
Die Optimierung der katalytischen Aktivität und Selektivität der CAL‐B kann durch Variation des
LösungsmittelssowiedesAcyldonorserreichtwerden.DaAminesehrguteNucleophilesind,können
hochreaktiveAcyldonorenbereitsdurchspontanenicht‐enzymatischenucleophileSubstitutionzurace‐
mischenAmidenführen.[31]GILetal.zeigtendieAkzeptanzeinesbreitenSubstratspektrumsderCAL‐B
amBeispielderAcylierungvonrac‐108(Abbildung71).[31]Sowohlkurz‐alsauchlangkettigeCarbon‐
säurenundEster,wieLaurinsäure(109)unddessenEster110,wurdendabeialsAcyldonorengetestet,
wobeidieEnantioselektivitätsowiedieReaktionsgeschwindigkeitmitsteigenderKettenlängezunimmt.
AllerdingskanndieserEinflussnichtalsallgemeinerTrendfürLipasenangesehenwerden.Währendmit
simplen Estern, das bekannteste davon ist Essigester 5, nur bis zu 91% ee erhalten werden können,
liefertMethoxyessigsäureethylester(111)innur1.5Stunden>99.5%ee,dasAmid(R)‐8allerdingsnur
mit77.4%ee.
68
4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
Abbildung71.
EnzymatischeAcylierungvonrac‐108mitunterschiedlichenAcyldonoren.[31]
Ein großer Nachteil der kinetischen Racematspaltung ist die Limitierung des Umsatzes auf maximal
50%. Aus diesem Grund ist die Racemisierung ein wichtiges Hilfsmittel, das in Kombination mit der
biokatalytischenkinetischenRacematspaltungzueinemUmsatzvontheoretisch100%undeinemeffi‐
zienteren Gebrauch des gesamten Racemates führen kann. Ein möglicher Mechanismus der Racemi‐
sierungbestehtauseinerKombinationvonDehydrierungdeschiralenAminsundeinerRe‐Additionvon
WasserstoffandasImin.[231]DesWeiterenistdiebasenkatalysierteRacemisierungdesresultierenden
chiralenAminsmöglich.[238]EinSchlüsselproblemderdynamisch‐kinetischenRacematspaltung(DKR)
istes,Bedingungenzufinden,unterdenenderBio‐undderChemokatalysatoreffizientarbeitenkönnen.
WenndaserwünschteEnantiomerdas(R)‐Produktist,dannistbeidenReaktionsgeschwindigkeitender
einzelnenSchrittefolgendeReihenfolgevorausgesetzt:krac>kR>kS(Abbildung72).[239]
Abbildung72.
Schemaderdynamisch‐kinetischenRacematspaltung(DKR).[239]
REETZundSCHIMOSSEKbeschrieben1996dieerstedynamisch‐kinetischeRacematspaltungmitPalladium
aufAktivkohlealsKatalysator,wobeinachfünfTageReaktionszeiteinUmsatzvon64%zumAmidund
ein Enantiomerenüberschuss von 99% erreicht werden konnte.[240] Weitere Ansätze verwendeten
Pd‐Partikel immobilisiert auf Trägern wie BaSO4[241] oder einen Palladium‐Nanokatalysator einge‐
schlosseninAluminiumhydroxid.[242]BÄCKVALLetal.kombiniertendieCAL‐BschließlichineinerZwei‐
stufen‐SynthesemitdemRuthenium‐Katalysator116,derinähnlicherFormbereitserfolgreichbeider
RacemisierungvonAlkoholenVerwendungfindet(Abbildung73).[231]AusgehendvondenAminenrac‐4
und rac‐117 werden die Amide (R)‐7 und (R)‐118 nahezu enantiomerenrein mit >98% ee und mit
Umsätzenvon69%bzw.66%erhalten.DieAnwesenheitvonelektronenschiebendenGruppenerhöht
69
4 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen dieGeschwindigkeitderRacemisierung.AllerdingserfordertdieseMethodeeineextraktiveTrennung
des(S)‐AminsvomProduktfürdieanschließendeRacemisierung.IndenletztenJahrenwurdenweitere
Katalysatorenentwickelt,beispielsweisedurchModifizierungenvon116[232,233]oderdurchEinsatzvon
MetallenwieIridium[239]oderdemThiyl‐Radikal[243],diehöhereReaktionsgeschwindigkeitenundSelek‐
tivitätenaufweisen.
Abbildung73.
DKRausgehendvonrac‐4undrac‐117mitdemRuthenium‐Katalysator116.[231]
InneuererZeitgibtesauchVersuche,dieRacemisiserungbiokatalytischdurchEinsatzvonRacemasen
anstellevonChemokatalysatorendurchzuführen.InderNaturgibteswegenderMehrzahlanstereo‐
spezifischen Prozessen nur eine kleine Anzahl an Racemasen. Die am besten untersuchte Mandelat‐
RacemaseausPseudomonasputidaATCC12633istaufgrundderStabilität,demrelativbreitenSubstrat‐
spektrumsowiederCofaktor‐UnabhängigkeiteinattraktiverBiokatalysatorfürRacemisierungenvon
Hydroxy‐Carbonsäuren.[244] Die geringe Aktivität gegenüber nicht‐natürlichen Substraten konnte in
diesem Fall bereits durch Mutationen optimiert werden. Die Anwendung der meisten Racemasen ist
jedochaufAminosäurenundderenDerivatebeschränkt.[238]DafürjedeSubstratklassediegeeignete
Racemase gefunden und verbessert werden muss steckt die generelle Anwendung von Racemasen
jedochnochindenAnfängen.[11]
Trotz seines Vorteils als nicht‐toxisches und natürliches Lösungsmittel ist Wasser für viele unpolare
organische Substrate ein schlechtes Lösungsmittel. Oft finden Nebenreaktionen statt und die Rück‐
gewinnungderProduktegestaltetsichschwierig.SogehörtdieimVergleichzuWassererhöhteLöslich‐
keitvonunpolarenSubstraten,sowiedieVermeidungderHydrolysedesgebildetenProdukteszuden
Vorteilen der Verwendung von Enzymen in organischen Lösungsmitteln.[245] Dennoch ist die kata‐
lytische Aktivität der Enzyme in organischen Lösungsmitteln häufig um einige Größenordnungen
geringeralsinwässrigenSystemen.DieseslässtsichteilweiseaufdieLimitierungderDiffusionsowie
ÄnderungenderFlexibilitätundDestabilisierungdesEnzymszurückführen.AuchbeiEnzymen,diein
organischenMedienaktivsind,isteinegeringeMengeanWassernotwendig.GenerellsindzweiArten
von Wassermolekülen im Enzym vorhanden. Die Wassermoleküle in der „inneren Klasse“ sind im
InnerendesEnzymsgebundenundspieleneinewichtigeRolleindessenTertiär‐Struktur.DieWasser‐
moleküleder„Kontakt‐Klasse“sindnurschwachanderOberflächedesEnzymsgebundenundkönnen
beigetrocknetenEnzymendreiGew.%odermehrausmachen.[246]Diesekönnenschnelldurchandere
Moleküleausgetauschtwerden,waseinegroßeFlexibilitätdesEnzymszurFolgehat.UnpolareLösungs‐
mitteltauschennureinenTeildieserWassermoleküleausundführensomitzuverringerterFlexibilität,
während polare Lösungsmittel stärker an der Oberfläche binden. Die Verwendung von organischen
70
4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
LösungsmittelnistausmehrerenGründennachteiligfürdenEinsatzinderIndustrie.[247]Siesindmeist
starkflüchtigundderenVerwendungbedarfkostenintensivenNachbehandlungenwieAbdampfenund
Recycling.DesWeiterenführtderEinsatzvonLösungsmitteldurchdiehoheVerdünnungzurVerringe‐
rungderRaum‐Zeit‐Ausbeute.DemnachwäreeinlösungsmittelfreierProzesssowohlausökologischer
undökonomischerPerspektivevongroßemVorteil.
Lösungsmittelfreie Systeme sind hauptsächlich bei der biokatalytischen Acylierung von Alkoholen
bekannt.[248,249]Fürdielipasenkatalysierte,lösungsmittelfreieRacematspaltungvonAminen,indenen
derAcyldonornichtalsLösungsmitteldient,sindstrengeReaktionsbedingungensowieerhöhteTempe‐
raturen und verminderter Druck notwendig. So beschrieben KATO et al., aufbauend auf den früheren
Arbeiten von HULT, eine der ersten enantioselektiven lipasenkatalysierte Acylierung von Amin rac‐4
durch Reaktion mit Carbonsäuren 119 und 109 in einem lösungsmittelfreien System (Abbildung
74).[250,251]DasGleichgewichtderReaktionwirdzugunstenderBildungderAmide(R)‐120verlagert,
indem das als Nebenprodukt gebildete Wasser kontinuierlich unter niedrigem Druck entfernt wird.
AufgrundderViskositätderReaktionsmischungmusstebei55°Cgearbeitetwerden,umeineeffiziente
Durchmischung des Systems zu ermöglichen. Die Acylierung liefert Enantiomerenüberschüsse von
>97%fürdasAmid(R)‐120‐abzw.>99%für(R)‐120‐bbeimäßigenUmsätzenvon32bzw.45%.Kurze
ZeitspäterberichteteGUPTA,dasseinvollständigerUmsatzdurchzusätzlichesErhitzenderReaktions‐
mischungauf90°Cerreichtwerdenkann.[252]AllerdingswerdenhierbeikeineAngabenzurStabilität
desEnzymsgemacht.
Abbildung74.
LösungsmittelfreiebiokatalytischeAcylierungvonrac‐4.[250]
KANERVAetal.schließlichführtendielösungsmittelfreieRacematspaltungunterschiedlicherAminemit
äquimolarer Menge an aktivierten Methoxyestern mittels CAL‐B bei Raumtemperatur durch.[36] Alle
(S)‐Amine und (R)‐Amide konnten mit hoher Enantiomerenreinheit von ≥95% erhalten werden. Die
größtenUnterschiedezwischenReaktioneninGegenwartoderAbwesenheitvonorganischenLösungs‐
mittelnliegeninderbenötigtenZeit,um50%Umsatzzuerreichen,sowieinderEnzymeffizienz,dastatt
100mgEnzymprommolSubstratindiesemFallnurnoch25mgEnzymbenötigtwurden.Außerdem
konnte die Reaktionstemperatur auf 23 °C gesenkt werden ohne Verluste in den Umsätzen oder
ee‐Wertenzubeobachten.
In der Arbeitsgruppe von GRÖGER wurde Malonsäurediethylester (9) als effizienter Acyldonor in
n‐HeptanalsorganischesLösungsmitteleingesetzt.[33,34]DabeiwurdedasAmid(R)‐10bei80°CReak‐
tionstemperaturnach4.5StundenmitvollständigemUmsatznahezuenantiomerenreinerhalten.[33,34]
71
4 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen InderselbenArbeitsgruppewurdeanschließendderMalonester9erfolgreichunterlösungsmittelfreien
Bedingungeneingesetzt.SokonnteineinemgrößeremMaßstabvon50mmoldasAmid(R)‐10beinur
60°Cmit50%Umsatzund99%eeerzieltwerden(Abbildung75).[35]
Abbildung75.
EnzymatischeRacematspaltungvonrac‐4mitMalonsäurediethylester(9).[35]
DieVerwendungeineslösungsmittelfreienReaktionssystemsisteingroßerSchrittinHinblickaufGreen
Chemistry,dadasLösungsmitteleinengroßenTeildesAbfallsderenzymatischenkinetischenRacemat‐
spaltungausmacht.LimitierungenderlösungsmittelfreienRacematspaltungsindEnzymtoleranzenund
Selektivitäten sowie langsame Reaktionsraten in äquimolaren Reaktionsmischungen. Zudem muss
gewährleistetsein,dassdieSubstrateunterdenReaktionsbedingungenflüssigoderineinanderlöslich
sind.[4]
72
4.3
4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
EigeneErgebnisseundDiskussion
DieindieserArbeitverwendeteLipaseBausCandidaantarctica(CAL‐B)wurde,sofernnichtanders
erwähnt,ausschließlichinimmobilisierterForm(Novozym435)eingesetzt.DiesewirdimFolgenden
nuralsCAL‐Bbezeichnet.
4.3.1
ReferenzenundAnalytik
Im Folgenden wurde die enantioselektive Racematspaltung an racemischen Aminen durch die
(R)‐spezifischeCAL‐Buntersucht.UmdieEnantiomerenüberschüssederdarausresultierendenAmide
mittels HPLC bestimmen zu können wurden zunächst die entsprechenden Racemate chemisch syn‐
thetisiert. Diese dienten als Referenz zur Identifikation der Signale der Enantiomere im Chromato‐
grammsowiealsVergleichfürdie1H‐und13C‐NMR‐Spektren.
4.3.1.1
SynthesederReferenzverbindungen
DiechemischeAcylierungerfolgteimFallderAmiderac‐10undrac‐121ausgehendvonPhenylethyl‐
aminrac‐4mitdenAcyldonorenMalonsäurediethylester(9)undPhenoxyessigsäureethylester(122)
unterErhitzenzumRückflussfür4bzw.5Stunden(Abbildung76).[253]
Abbildung76.
SynthesederReferenzverbindungenrac‐10,rac‐121undrac‐123.[253,254]
73
4 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen DieAmiderac‐10undrac‐121wurdemitUmsätzenvon≥81%erhalten,imFallvonrac‐121allerdings
nachchromatographischerAufreinigungnurmiteinerAusbeutevon37%.
ZwarkonntedasCyano‐Amidrac‐123mitdieserVorgehensweisemiteinemUmsatzvon39%erhalten
werden, jedoch gelang die Produkttrennung ausgehend von der braunen Reaktionsmischung nicht.
Stattdessen wurde das Amin rac‐4 mit Cyanessigsäureethylester (124) für 24 Stunden bei Raum‐
temperaturgerührt(Abbildung76).[254]DasAmidrac‐123konntemiteinerAusbeutevon36%isoliert
werden.TrotzdesgeringenUmsatzeswurdekeineweitereOptimierungzurSynthesevorgenommen.
FürdieSynthesedesAcetamidsrac‐7ausgehendvonrac‐4unddemAcyldonorEssigsäurevinylester
(125) war jedoch eine Erhöhung der Temperatur auf 60 °C notwendig (Abbildung 77). Bei der Acy‐
lierung wurde ein Umsatz von 95% erzielt, weswegen auf weitere Aufreinigungsschritte verzichtet
wordenist,dadieerhalteneReinheitausreichendwar,umeineMethodefürdieHPLCzuetablieren.
Abbildung77. SynthesedesRacematesrac‐7alsReferenzverbindung.
EineweitereSynthesewurdefürdieDarstellungderAmiderac‐126undrac‐8herangezogen,dieaus‐
gehend von rac‐4 mit einem Acyldonor, 2‐Phenylacetylchlorid (127) bzw. 2‐Methoxyacetylchlorid
(128),undeinerHilfsbase,wieTriethylaminoderPiperidin,bei0–20°Cerhaltenwurden(Abbildung
78).[255,256] Die Synthese der Amide rac‐126 und rac‐8 gelang mit quantitativen Umsätzen und Aus‐
beutenvon80%(rac‐126)bzw.95%(rac‐8)nachextraktiverAufarbeitung.
Abbildung78.
74
SynthesederRacematerac‐126undrac‐8alsReferenzverbindungen.[255,256]
4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
Die Synthese des Aminoindan‐Amids rac‐129 benötigte weit längere Reaktionszeiten als die bisher
beschriebenen Synthesen. Das Aminoindan rac‐130 wurde zusammen mit dem Malonester 9 und
1,8‐Diazabicyclo[5.4.0]undec‐7‐en(DBU)inDCMfürdreiTagebei40°Cgerührt(Abbildung79).[257]Das
Amid rac‐129 konnte mit einer Ausbeute von 17% isoliert werden. Zusätzlich zum Produkt rac‐129
konntedurchsäulenchromatographischeAufreinigungdasentsprechendeDiamid131alsNebenpro‐
duktmit9%Ausbeuteisoliertwerden.
Abbildung79.
SynthesedesAminoindan‐Amidsrac‐129.[257]
4.3.1.2
Analytik
Um eine genaue Umsatzbestimmung mittels 1H‐NMR‐Spektroskopie etablieren zu können, wurde
zunächstdieAufarbeitungvalidiert.Dafürwurdeeine1:1‐MischungausMalonsäurediethylester(9)und
rac‐4 eingewogen und das genaue Verhältnis mittels 1H‐NMR‐Spektroskopie bestimmt. Nach an‐
schließender Aufarbeitung analog der Allgemeinen Arbeitsvorschrift 5 (AAV 6, Abschnitt 7.2.2.3.3)
erfolgteerneuteineBestimmungdesVerhältnissesmittels1H‐NMR‐Spektroskopie.Diedabeierhaltenen
AbweichungenlagennachdreifacherBestimmungzwischen1–4%undsomitmitdurchschnittlich2%
im akzeptablen Bereich. Im Rahmen von Messunsicherheit kann dieser Wert toleriert werden. Es
konntenauchkeineProdukteeinerHydrolyse‐Reaktionbeobachtetwerden.
Die produktbezogene Bestimmung des Umsatzes mithilfe der 1H‐NMR‐Spektroskopie erfolge nach
Gleichung 2. In Abbildung 80 ist beispielhaft ein Spektrum einer Acylierung bei 60°C Reaktions‐
temperaturund4.5StundenReaktionszeitgezeigt.AnhandderambestenisoliertenIntegraledesAmids
(R)‐10 bei 5.15 ppm und des Malonats 9 bei 3.36 ppm konnte in diesem Fall ein produktbezogener
Umsatzvon42%ermitteltwerden.DadurchVariationderSignaleSchwankungenderUmsätzemitbis
zu2%auftretenkönnen,wurdenfürdieUmsatzbestimmungimmeraufdiegenanntenSignalezurück‐
gegriffen.
75
4 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen Abbildung80.
Beispiel der Umsatzbestimmung der Acylierung von rac‐4 mit Diethylmalonat (9)
mittels1H‐NMR‐Spektroskopie.
Zur Bestimmung der Enantiomerenreinheit des bei der Racematspaltung des Amins rac‐4 mit dem
Malonester 9 erhaltenen Amids (R)‐10 wurde mithilfe des zuvor synthetisierte Racemat rac‐10 eine
geeigneteHPLC‐Methodeentwickeltundetabliert(Abbildung81).
Abbildung81.
HPLC‐ChromatogrammdesAmidsrac‐10(gemessenanAD‐H‐Säulemit
n‐Heptan/i‐PrOH(95/5(v/v)),flow:0.8mL/min,Retentionszeiten:tR=16.63min
(R),26.70min(S),ee‐Wert:0%.
Der ee‐Wert des bei einer Racematspaltung nicht umgesetzten Amins (S)‐4 kann mittels HPLC nicht
ermitteltwerden.AusdiesemGrundwurdeimAnschlussaneineenzymatischeRacematspaltungvon
76
4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
rac‐4diegesamteReaktionsmischungohnevorherigeAufarbeitungmitAcetanhydrid(132)umgesetzt,
sodasseineAcylierungdesnicht‐umgesetztenAmins(S)‐4erfolgenkann(Abbildung82).DasAcetamid
(S)‐7 wurde dabei quantitativ erhalten. Mithilfe des zuvor dargestellten Racemates rac‐7 konnte
ebenfallseineHPLC‐Analytiketabliertwerdenundderee‐WertdesAmins(S)‐7somitermitteltwerden.
Dieserbeträgt<0.2%ee.
Abbildung82.
ChemischeAcylierungdesresultierendenAmins(S)‐4.DieBerechnungdesee‐Wertes
von(S)‐4erfolgtemithilfedesProgramms„Enantioselectivity“durchAngabedesUm‐
satzeszumAmid(R)‐10unddessendetektiertenee‐Wertes.[258]
Der ermittelte ee‐Wert des Amins (S)‐4 von 88% stimmte mit dem ee‐Wert, der mittels Umsatz der
enzymatischenAcylierungunddenee‐WertendeserhaltenenAmids(R)‐4berechnetwurden,bisauf
2%Differenzsehrgutüberein,sodassdieEnantiomerenüberschüssederSubstrateimFolgendennur
berechnet worden sind. Die Berechnung der Selektivität sowie der E‐Werte kann mithilfe des Pro‐
gramms„Enantioselectivity“derUniversitätGrazerfolgen(Abbildung83).[258]
77
4 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen Selektivität
eeP[%]x
eeS[%]o
Umsatz[%]
eep:97%
eeS:86%
E‐Wert:183
Umsatz:47%
Abbildung83. SelektivitätsbestimmungderRacematspaltungvonrac‐4mitMalonester9,bestimmt
mitdemProgramm„Enantioselectivity“.[258]
DerE‐WertdientalsMaßfürdieEnantioselektivitäteinesSystems,derdieSelektivitätderkinetischen
Racematspaltung mit dem Umsatz und dem Enantiomerenüberschuss in Verbindung setzt. Die
BerechnungerfolgtnachfolgenderGleichung3:[11]
E=
ln[1‐C (1+eep)]
ln[1‐C (1‐eep )]
=
ln[1‐C (1‐ee s)]
ln[1‐C (1+ees)]
Gleichung3
InderLiteraturfindensichverschiedeneRichtwerte,abwanneineRacematspaltungeffizientistundin
großem Maßstab durchgeführt werden könnte.[11] Als Faustregel gilt, dass Racematspaltungen mit
E‐Werten <15 inakzeptabel sind für praktische Anwendungen. E‐Werte zwischen 15 – 30 werde als
moderatbisgutundbeiWerten>30alsexzellentangesehen.E‐Wertevon>200jedochkönnennicht
genaubestimmtwerdenaufgrundvonUngenauigkeiten,diedurchBestimmungenderee‐Werten,z.B.
durchdieHPLC,entstehen,daindiesemBereichselbsteinesehrkleineAbweichungderee‐Werteeine
signifikante Änderung des E‐Wertes zu Folge hat. Aufgrund dieser Schwankungen wird im Rahmen
dieserArbeitdieGenauigkeits‐GrenzederE‐Werteals100definiertundgrößereE‐WertealsE>100
angegeben.
78
4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
4.3.2
VorversuchemitsubstituiertenBenzylaminenalsSubstrate
4.3.2.1
SynthesedesBenzylamids133
Zur detaillierten Etablierung von Methoden der Analytik und Umsatzbestimmungsollte zunächst ein
Modelsubstrat zum Einsatz kommen, das keine Stereoinformation trägt. Dafür wurde sowohl das
einfachstearomatischeAmin,Benzylamin(134),alsauchsubstituierteDerivateausgewählt.Inmeta‐
PositionsubstituiertearomatischeAminedienenalsAusgangsstoffefürdieSynthesepharmazeutischer
Wirkstoffe. Beispiele dafür sind Rivastigmin (135)[259,260] oder das Calcimimeticim 136[261], die zur
Behandlung der Alzheimerschen Krankheit bzw. zur Therapie von Hyperparathyroidismus, einer
RegulationsstörungderNebenschilddrüse,eingesetztwerden(Abbildung84).
Abbildung84.
Beispiele für pharmazeutische Wirkstoffe mit meta‐substituierten aromatischen
Aminen:Rivastigmin(135)[259,260]unddasCalcimimeticum136[261].
FüreinevollständigeAnalytikwurdedieseAcylierungsreaktionzunächstchemisch,d.h.beimErhitzen
zumRückflussfür3Stunden,durchgeführt(Abbildung85).[253]DabeikonntenebendemBenzylamid
133,dasmit48%Ausbeuteisoliertwurde,dieBildungdesentsprechendenDiamids137beobachtet
werden. Nach säulenchromatographischer Aufreinigung wurde das Diamid 137 mit 20% Ausbeute
isoliert.DieBildungdiesesNebenproduktes137kanndurchschrittweiseZugabedesAcyldonorszur
Reaktionsmischungunterdrücktwerden.
Abbildung85.
ChemischeAcylierungvonBenzylamin(134)mitMalonsäurediethylester(9).[253]
ImAnschlusswurdederVerlustderSubstanzen134und9währendderAufarbeitungbestimmt,indem
diese eingewogen und bei unterschiedlichen Drücken bei einer Badtemperatur von 40 °C gerührt
wurden.DiejeweiligenVerlustewurdenimAnschlussmittelsAuswaageermittelt(Abbildung86).Ein
großerVerlustanbeidenSubstanzen134und9währendderAufarbeitungmachtdiegenaueBestim‐
mungeinesproduktbezogenenUmsatzesunmöglich.DerVerlustderbeidenKomponenten134und9
79
4 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen istabhängigvondenDampfdrücken(0.6bzw.1.3hPa)derKomponenten.[262]SomitkannderVerlust
desAmins134beimErhöhendesDruckesvon230auf550mbarbeieinerRührdauervon120Minuten
von69%aufnurnoch12%gesenktwerden.DainderRegelaberRührzeitenvonunter30Minutenfür
dieAufarbeitungausreichenkanndermittelsAuswaageermittelteVerlustvon<3%fürbeideKompo‐
nentenvernachlässigtwerden.DerproduktbezogeneUmsatzwird,sofernnichtandersangegeben,in
dieserArbeitaufdenAcyldonorMalonsäurediethylester(9)bezogen.
Verlust[%]
134,230mbar
112,230mbar
134,550mbar
112,550mbar
9,230mbar
9,550mbar
9,550mbar
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
0,5
1
Zeit[h]
1,5
2
Abbildung86.
VerlustderSubstanzen134und9währendderAufarbeitung.
4.3.3
EnzymatischeAcylierungsubstituierterBenzylamine
ZurUntersuchungdesEinflusseseinesSubstituenteninmeta‐Positionwurdenunterschiedlichsubsti‐
tuierteBenzylamine134und138–140mitMalonsäurediethylester(9)undCAL‐BalsBiokatalysator
lösungsmittelfrei umgesetzt (Abbildung 87). Bei allen Acylierungsreaktionen wurden, mit Ausnahme
desm‐Hydroxybenzylamins(138),nahezuvollständigeUmsätzeerzielt.DasAmin138istimGegensatz
zudenMethoxy‐undBromo‐substituiertenBenzylaminen139und140einkristallinerFeststoff,der
sich nur zu einem gewissen Anteil im Malonester9 löst. Eine Verlängerung derReaktionszeitwürde
hierbeizueinemhöherenUmsatzführen.AllerdingskonntebeiderAcylierungdesHydroxyamins138,
welche nicht in lösungsmittelfreier Umgebung durchgeführt werden kann, neben der Bildung des
Produktes 141 auch die Bildung des entsprechenden Diamids 142 mit einem Umsatz von 17%
beobachtetwerden.DajeweilsnureinTeildesm‐Hydroxybenzylamins(138)gelöstinderReaktions‐
mischungvorliegtunddasentstandeneAmid141mitdemMalonester9gutmischbarist,istdieWahr‐
scheinlichkeiteinerzweitenAcylierungsehrgroß.
DieBildungdesentsprechendenDiamidskonntebeidenAcylierungsreaktionenderAmine134bzw.
139und140mit9bzw.5%nachgewiesenwerden.DieAnwesenheiteineselektronenziehendenSubsti‐
tuenteninmeta‐PositionscheintdemnacheinenpositivenEinflussaufdenUmsatzzuhaben.Alleindie
schlechteLöslichkeitdesHydroxyamins138istfürdessensehrniedrigenUmsatzverantwortlich.Durch
80
4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
dieInhomogenitätderMischungwirddieBildungeinesEnzym‐Substrat‐Komplexesverhindert,wasder
geschwindigkeitsbestimmendeSchrittderAcylierungist.
9,1Äq.
R
NH2
CAL‐B
O
R
N
H
80°C
4.5h
134 (R=H)
138 (R=OH)
139 (R=OMe)
140 (R=Br)
Umsatz[%]/Ausbeute[%]
O
O
R
+
N
H
133 (R=H)
141 (R=OH)
143 (R=OMe)
145 (R=Br)
UmsatzAmid
100
O
R
N
H
137 (R=H)
142 (R=OH)
144 (R=OMe)
146 (R=Br)
UmsatzDiamid
AusbeuteAmid
95
91
O
95
84
90
81
80
70
60
50
38
40
30
20
35
17
9
10
5
5
139
140
0
134
138
Amin
Abbildung87. EnzymatischeAcylierungsubstituierterBenzylamine.
Durch Acylierungen des Benzylamins (134) sowie der substituierten Amine 139 und 140 unter den
bisherverwendetenReaktionsbedingungen,jedochinAbwesenheitderLipaseCAL‐B,wurdeaufeine
möglicheparallelablaufendechemischeReaktiongetestet(Abbildung88).Dabeizeigtesich,dassmit
den substituierten Aminen 139 und 140 auch in Abwesenheit der Lipase Acylierungsreaktionen
stattfinden,da7%bzw.8%desentsprechendenAmids143und145nachgewiesenwerdenkönnen.Die
BildungdesDiamidsläuftnurmitdemMethoxy‐substituiertenAmin139miteinemUmsatzvon2%ab.
81
4 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen O
R
N
H
ohneCAL‐B
NH2
O
133 (R=H)
143 (R=OMe)
145 (R=Br)
+
9,1Äq.
R
O
60°C
4.5h
O
R
134 (R=H)
139 (R=OMe)
140 (R=Br)
O
N
H
R
N
H
137 (R=H)
144 (R=OMe)
146 (R=Br)
Umsatz[%]
Amid[%]
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Amid,enzymkatalysiert[%]
Diamid,enzymkatalysiert[%]
Diamid[%]
95
91
9
0
0
134
130
133
7
0
137
133
139
95
5
8
2
5
134
138
Amin
Abbildung88.
Vergleichzwischenenzym‐undunkatalysierterAcylierungvonBenzylaminen.
Im Anschluss sollten die Bedingungen zur Diamidbildung ermittelt werden. Aufgrund der Inhomo‐
genitätderReaktionsmischung wurdeanstelle von 3‐Hydroxybenzylamin (138)das Methoxy‐substi‐
tuierte Amin 139 sowie Malonsäurediethylester (9) in verschiedenen Äquivalenten eingesetzt
(Abbildung89).Dabeiistersichtlich,dassmitnur0.6ÄquivalentenMalonester9,alsoeinemdeutlichen
ÜberschussanAmin143,biszu32%desDiamids144gebildetwerden.BeieinemleichtenÜberschuss
an Acyldonor 9 jedoch entstehen bei der Acylierung nur noch etwa 3% des Diamids. Die Neben‐
reaktionen zum Diamid können somit durch einen leichten Überschuss an Acyldonor 9 unterdrückt
werden.
82
4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
O
O
N
H
9 (0.6‐1.2Äq.)
O
O
143
CAL‐B(40mg/mmol)
NH2
+
60°C,4.5h
O
139
O
O
O
N
H
O
N
H
144
Umsatz[%]
Amid121[%]
143
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Diamid122[%]
144
91
84
79
53
32
9
0.6
1.0
3
1.2
1
1.5
Acyldonor9 (Äq.)
Abbildung89.
UntersuchungderDiamidbildungamBeispielvonAmin139.
EswurdenVersuchezurProzessoptimierungderenzymatischenAcylierungsubstituierterAmine138,
139und140durchgeführt.DabeiwurdezumeinennacheinempassendenorganischenLösungsmittel
fürdieAcylierungdesHydroxyamins138gesuchtundzumanderendieMöglichkeitderReduktionder
Reaktionstemperaturgetestet(Tabelle10).InderLiteraturfinden1,4‐Dioxan[236]sowien‐Heptan[33,34]
als Lösungsmittel Anwendung. Bei der enzymatischen Acylierung von Bromamin 140 werden dabei
75%bzw.76%Umsatzbei60°CReaktionstemperaturerzielt(Einträge1und2).Inlösungsmittelfreier
Umgebungjedochkonntensehrgute91%UmsatzzumAmid145erreichtwerden.Einenähnlichsehr
guten Umsatz von 93%konnte bei derAcylierung von Amin 140 erhalten werden. Dabei konnte die
Reaktionstemperaturvon80°Cauf60°Cherabgesetztwerden,wasausökonomischerSichtvonVorteil
ist.
Aufgrund der geringen Löslichkeit des Hydroxyamins 138 im Malonester 9 ist es notwendig, die
AcylierunginorganischemLösungsmitteldurchzuführen,umeinhomogenesSystemzugewährleisten.
Es wurden Lösungsmittel unterschiedlicher Polarität mit logP‐Werten zwischen ‐0.34 und 4.50 ver‐
wendet. Der produktbezogene Umsatz wird aus dem Verhältnis des Integrals des Produktes zu der
Summe der Integrale von Edukt, Produkt sowie eventuellen Zwischenprodukten ermittelt (vgl.
Gleichung2,Kapitel3.2.2.1).DabeiwurdemitdempolarenTHF(logP=0.46)[177]dasbesteErgebnismit
75%produktbezogenemUmsatzerhalten.EbenfallsguteErgebnissevon51%bzw.50%liefertenMTBE
(logP=0.94)[177]bzw.derAcyldonor9(logP=0.90)[263]selbst,wobeiletztererbeieinerReaktionstem‐
83
4 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen peraturvonnur60°Ceingesetztwordenist.BeideVariantenbietenVorteile,denndasMTBEistauf‐
grundseineshohenDampfdruckeseinfachausdemReaktionsgemischzuentfernen,währendMalon‐
säurediethylester(9)nachDestillationeinerweiterenAcylierungsreaktionzugeführtwerdenkönnte.
EineweitereBesonderheitzeigtsichbeiderVerwendungvonDiethylether(logP=0.89)[177]alsLösungs‐
mittel,dadasHerabsenkenderTemperaturvon60°CaufRaumtemperaturmitgleichzeitigerVerlän‐
gerungderReaktionsdauerauf24StundendengleichenUmsatzvon30%liefert.DiesesstehtinEinklang
mitBeobachtungenvonDITRICH,dermitMethoxyacetat6alsAcyldonormitCAL‐BinDiethyletherbei
Raumtemperaturüber24StundenReaktionszeitdasentsprechendeAmidenantiomerenreinmitvoll‐
ständigem Umsatz erzielen konnte.[30] Dieses zeigt deutlich die hohe Aktivität der CAL‐B in einem
breitenTemperaturbereich.
Tabelle10.
Versuche zur Prozessoptimierung der enzymatischen Acylierung meta‐substituierter
Benzylamine.
Eintrag
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14d)
15
Amin
140
140
140
139
138
138
138
138
138
138
138
138
138
138
138
T[°C]
60
60
60
60
80
80
80
80
80
60
60
60
60
RT
RT
t[h]
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
24
24
Solvens
logP
Umsatz[%]
1,4‐Dioxan n‐Heptan
‐
‐
MTBE
THF
2‐Me‐THF
MeCN
i‐PrOH
n‐Heptan
EtOAc
Malonester 9(100Äq.)
Et2O
Et2O
EtOH
‐1.10a)
75
76
91
93
51
75
70
43
22
45
41
50
30
30
5
4.50 b)
‐
‐
0.94b)
0.46b)
1.00c)
‐0.34b)
0.28b)
4.50b)
0.73b)
0.90 c)
0.89b)
0.89b)
‐0.24a)
Datenentnommenaus:a)LAANEetal.[175];b)SANGSTERetal.[177];c)BestimmtdurchAdvancedChemistryDevelopment
(ACD/Labs)SoftwareV11.02[263];d)Zugabevon1.5ÄquivalenteMalonsäurediethylester(9).
84
4.3.4
4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
EnzymatischeRacematspaltungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)
In der Literatur ist die enzymatische Racematspaltung von aliphatischen und aromatischen Aminen
durchunterschiedlicheAcyldonoreninAnwesenheitvonorganischenLösungsmittelnbereitsvielfach
beschrieben worden. Häufig finden dabei Acyldonoren wie langkettige Säuren sowie deren Ester
Anwendung,dieallerdingssehrlangeReaktionszeitenfüreinenvollständigenUmsatzbenötigen(vgl.
Kapitel4.2.2).[31]WeiterehäufigverwendeteAcyldonorensindEssigester5oderMethoxyesterwie6
bzw.111(Abbildung90).[30,31]Zwarwerdendiedabeierhaltenen(R)‐AmidemitsehrhohenEnantio‐
merenüberschüssenerhalten,allerdingsliegendieReaktionszeitenauchhierbeinochbei15bzw.60
Stunden.DurchEinsatzeinesHeteroatomsinβ‐PositiondesAcyldonorskanndieReaktionsgeschwin‐
digkeiterhöhtwerden,wobeidiebestenErgebnissemitO‐Substituentenerhaltenwerden.[31]
DieRacematspaltungracemischerAmineunterlösungsmittelfreienBedingungenfindeterstseitBeginn
diesesJahrhundertsBeachtung.[36,250–252]ZudenerstenenantioselektivenlipasenkatalysiertenAcylie‐
rungendesPhenylethylaminsrac‐4inAbwesenheitvonorganischenLösungsmittelnzählendieReak‐
tionenmitCarbonsäuren(119oder109)[250,252]oderMethoxyestern(6oder111)[36]alsAcyldonoren.
ImFallderCarbonsäurenistzurGleichgewichtseinstellungeinverringerterDrucknotwendig,während
mitMethoxyesternbereitsbeiRaumtemperaturgearbeitetwerdenkann.Methoxyestersinddurchdas
Heteroatominβ–PositionaktivierteAcyldonoren.
(111)
Abbildung90.
EnzymatischeRacematspaltungvonrac‐4mitunterschiedlichenAcyldonorenin
AbwesenheitvonorganischenLösungsmitteln.[36,250]
Der in dieser Arbeitsgruppe bereits erfolgreich etablierte Acyldonor Malonsäurediethylester (9) soll
unterlösungsmittelfreienBedingungenalsStandard‐Acyldonordienen.[33–35]Ausgehendvondenvoran‐
gegangenArbeitensolltesielösungsmittelfreiAcylierungvonrac‐4weiteroptimiertundinHinblickauf
weiteremöglicheAcyldonorenuntersuchtwerden,DerWeiterensollenweiteremöglicheLipasenauf
ihre Fähigkeit zur solvenzfreien Acylierung von rac‐4 getestet und die Kinetiken dieser Reaktionen
geprüftwerden.
85
4 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen 4.3.4.1
Prozessoptimierung
4.3.4.1.1
EinflussderTemperaturundReaktionszeit
ZunächstsolltederEinflussderTemperaturbeieinerReaktionsdauervon4.5StundeninHinblickauf
UmsatzundEnantioselektivitätuntersuchtwerden(Abbildung91).ZuBeginnwurdediezuvorinder
Arbeitsgruppe[33] etablierte Syntheseroute zur Racematspaltung des 1‐Phenylethylamins (rac‐4) mit
Malonester 9 in MTBE als organisches Lösungsmittel zum Vergleich mit späteren Reaktionen durch‐
geführt.Dabeiwurdebei80°CReaktionstemperaturdasAmid(R)‐10miteinemUmsatzvon42%und
92%eeerhalten,waseinerEnantioselektivitätvon48entsprichtundmitdemLiteraturwert[33]über‐
einstimmt. Dieselbe Reaktion wurde im Anschluss in Abwesenheit von organischen Lösungsmittel
durchgeführt,wobei46%UmsatzzumAmid(R)‐10mit96%ee(E>100)erzieltwerdenkonnten.Auch
dieseWertepassenzudeninderArbeitsgruppeerhaltenenErgebnissen.[35]SelbsteineVerringerung
der Reaktionstemperatur auf 0°C lieferte das Amid (R)‐10 enantiomerenrein mit 24% Umsatz, was
einersehrgutenEnantioselektivitätvon>100entspricht..DieCAL‐Barbeitetfolglichineinembreiten
Temperaturbereichhochselektiv.
O
NH2
O
+
O
rac‐4
+
(R)‐10
9,1Äq.
42
46
42
(S)‐4
ee(R)‐10[%]
ee(R)‐10
99
97
96
92
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
NH2
O
0‐80°C,4.5h
O
Umsatz[%]
Umsatz[%]/ee(R)‐10 [%]
HN
CAL‐B
(40mg/mmol)
O
O
99
90
45
41
24
80°C,MTBE,
125mM
80°C
60°C
40°C
20°C
0°C
Reaktionsbedingungen
Abbildung91.
EinflussderReaktionstemperaturbeiderRacematspaltungvonrac‐4.
InfolgedieserErgebnisseausAbbildung91wurdedieReaktionenbei60°Cund40°C,alsKompromiss
zwischenhohenUmsatzundhohemEnantiomerenüberschuss,inHinblickaufVerlängerungderReak‐
tionsdaueruntersucht.DabeisinddiebereitsdurchgeführtenRacematspaltungenbei4.5Stundenzum
Vergleich im Diagramm aufgetragen (Abbildung 92). Eine Verlängerung der Reaktionszeit auf acht
86
4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
Stunden bei 60 °C Temperatur lieferte eine leichte Erhöhung des Umsatzes, jedoch wurde ein etwas
verringerter ee‐Wert von 89% (E = 39) beobachtet. Bei 24 Stunden Reaktionszeit konnte das Amid
(R)‐10nahezuenantiomerenreinmit50%Umsatzerhaltenwerden.Diesesentsprichteinersehrguten
Enantioselektivität von >100. Ähnliche Ergebnisse wurden im Fall der Racematspaltungen bei 40°C
erzielt.WährenddasAmid(R)‐10nach4.5StundenReaktionszeitmit45%Umsatzund95%eeerhalten
wurden,konntebeisechsStundenReaktionsdauerkeineUmsatzsteigerungundeinetwasgeringerer
ee‐WertdesAmids(R)‐10von85%(E=27)erreichtwerden.DieserrelativniedrigeEnantiomeren‐
überschussistungewöhnlich,dainderLiteraturbereitsdieenantiomerenreineSyntheseunterschied‐
licher Amide bei Raumtemperatur und 24Stunden Reaktionszeit beschrieben worden ist.[30] Fehler
währendderReaktionsführungsowiebeiderAuswertungderHPLC‐Chromatogrammekönnenausge‐
schlossenwerden.
Racematspaltung40°C
Racematspaltung60°C
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
97
42
4.5
Umsatz[%]
ee(R)‐10
ee[%]
94
89
46
8
50
24
Umsatz[%]/ee(R)‐10 [%]
Umsatz[%]/ee(R)‐10 [%]
Umsatz[%]
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Reaktionszeit[h]
Abbildung92.
ee[%]
ee(R)‐10
95
85
45
4.5
46
6
Reaktionszeit[h]
Reaktionszeit[h]
EinflussderReaktionszeitbeiderRacematspaltungvonrac‐4bei60°C(links)und
40°C(rechts).
Um parallel ablaufende chemische Acylierungsreaktionen von rac‐4 mit Malonsäurediethylester (9)
ausschließenzukönnenwurdenAcylierungeninAbwesenheitvonCAL‐BalsBiokatalysatorbeiunter‐
schiedlichen Temperaturen durchgeführt. Dabei wurde in allen Fällen eine chemische Acylierung
ausgeschlossen, da mittels 1H‐NMR‐Spektroskopie hierbei keine Produktbildung beobachtet werden
konnte.DiemitfortschreitenderReaktionszeitsinkenderee‐Wertbei40°Ckanndemzufolgenichtmit
chemischablaufendenParallelreaktionenbegründetwerden.
DieenzymatischeRacematspaltungvonrac‐4mitdemMalonester9kannineinemsehrbreitenTempe‐
raturbereich von 0 – 80 °C mit sehr guten Enantiomerenüberschüssen und folglich auch sehr guten
Selektivitätendurchgeführtwerden.DabeiwirdderUmsatzinAbwesenheiteinesorganischenLösungs‐
mittels leicht gesteigert. Da milde Reaktionsbedingungen sowohl aus ökonomischer Sicht als auch in
HinblickaufEnzymstabilitätvorteilhaftsind,wurden60°CReaktionstemperaturund4.5Stundenals
Standard‐Bedingungen gewählt. Alle weiteren lösungsmittelfreien Racematspaltungen von rac‐4
wurdenimFolgendenunterdiesenReaktionsbedingungendurchgeführt.
87
4 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen 4.3.4.1.2
VergleichmitbestehendenindustriellenProzessen
NachdemdieoptimaleReaktionstemperaturauf60°CunddieReaktionsdauerauf4.5Stundenfestgelegt
wordensind,wurdedielösungsmittelfreieenzymatischeRacematspaltungdesAminsrac‐4mitMalon‐
ester9alsAcyldonormitbestehendenindustriellenProzessenverglichen(Tabelle11,Eintrag1).Nach
einerPatentanmeldungvonBASFSEwirdeinaromatischesracemischesAminmitMethoxyester111
(1.5 Äq.) und 2 mg/mmol CAL‐B bei 20 °C umgesetzt und das entsprechende Amid (R)‐8 mit hoher
Enantiomerenreinheit erhalten.[264] Die Übertragung dieser Vorschrift auf die Racematspaltung mit
Malonsäurediethylester(9)alsAcyldonorliefertejedochnur25%Umsatzmit95%ee(Eintrag2).Der
bestimmteguteE‐Wertvon53liegtjedochdeutlichunterdenunterStandard‐Bedingungenerhaltenen
Wert. Der Unterschied in den Enantioselektivitäten von >100 und 53 kann mit der geringeren ver‐
wendeten Enzymmenge sowie niedrigeren Reaktionstemperatur und die dadurch etwas geringere
AktivitätderLipasebegründetwerden.DesWeiterenistderMethoxyester104alsAcyldonorstärker
aktiviertalsdasMalonat9.DurchVerlängerungderReaktionszeitkönnteauchindiesemFalleinvoll‐
ständigerUmsatzunddadurcheinehöhereEnantioselektivitäterreichtwerden.
Tabelle11.
VergleichmitbestehendenindustriellenProzessen.
Eintrag
Ester
(Äq.)
CAL‐B
[mg/mmol]
Solvens
Temperatur
[°C]
Umsatz
[%]
eeP
[%]
eeS
[%]a)
E
1b)c)
2d)
3d)
4d)
9(1)
9(1)
9(1.5)
111(1.5)
40
2
10
10
‐
‐
Et2O
Et2O
60
20
20
20
42
25
48
52
96
95
95
95
70
n.b.
88
99
>100
53
>100
>100
a)Bestimmtmittels„Enantioselectivity“ [258];b)DarstellungdiesesVersucheserfolgtebereitsinAbbildung91undisthierzum
Vergleichaufgeführt;c)Reaktionszeit:4.5h;d)Reaktionszeit:24h;n.b.=nichtbestimmt.
DITRICHetal.setztenrac‐4mitMethoxyessigsäurepropylester(6)beiRaumtemperaturinDiethylether
um, wobei 10mg/mmol CAL‐B verwendet wurden.[30] Dabei wird das entsprechende Amid nach
24StundenReaktionszeitmit46%Umsatzenantiomerenrein(E>100)erhalten.BeiderReproduktion
dieserReaktionmitdemAcyldonor104konnten52%UmsatzzumAmid(R)‐8sowiesehrgute95%ee
(E>100)erreichtwerden(Eintrag4).DurchErsatzdesAcyldonors111durchdenMalonester9wurde
unter den gleichen Bedingungen ebenfalls ein sehr guter Umsatz von 48% erzielt (Eintrag 3). Der
EnantiomerenüberschusswurdefürdasAmid(R)‐10auf95%eebestimmt,wasebenfallseinerEnan‐
tioselektivitätvon>100entspricht.ZwarwirdnachdieserVorschriftnureinViertelderindieserArbeit
eingesetztenEnzymmengevon40mg/mmolbeiRaumtemperaturverwendet,allerdingsistderEinsatz
88
4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
vonDiethyletheralsLösungsmittelnotwendig.DesWeiterenwirdfüreinenvollständigenUmsatzzum
(R)‐AmideineReaktionszeitvon24Stundenbenötigt,wasausökonomischerSichtunvorteilhaftist.
BeiderRacematspaltungvonrac‐4unterdenindieserArbeitgewähltenlösungsmittelfreienReaktions‐
bedingungenmitdemMalonester9alsAcyldonorkonnteeinesehrguteEnantioselektivitätvon>100
erreichtwerden,dieinderselbenGrößenordnungderbestehendenindustriellenProzesseliegt.Durch
Up‐ScalingzugrößerenMaßstäbenkönntedieAufarbeitungdannmittelsDestillationerfolgen,sodass
kein organisches Lösungsmittel für extraktive Aufarbeitung mehr benötigt würde. Der im Rahmen
dieser Arbeit gewählte Syntheseweg stellt folglich eine sehr gute Alternative zu den bestehenden
industriellenProzessendar.
4.3.5
Enzymrecycling
Im Rahmen eines Enzymrecyclings wurde die Aktivität und die Stabilität der CAL‐B aus Candida
antarcticagetestetwerden.DurchFiltration,WaschenundTrocknenwardieRückgewinnungderLipase
imAnschlussaneineReaktionsehreinfachinderHandhabung.DerVerlustderCAL‐BbeiderReinigung
sowiedurchmechanischeBelastungwährenddesReaktionsablaufswurdedurcheinenentsprechend
größeren Reaktionsaufbau gering gehalten. In vorhergehenden Versuchen von SIMON konnte bei
starkem mechanischen Rühren ein starker Enzymabrieb beobachtet werden, der durch Rühren mit
<200rpmverringertwerdenkonnte.[33]DasEnzymrecyclingwurdeunterStandardbedingungendurch‐
geführt,indemdasracemischeAminrac‐4zusammenmitdemMalonester9unddieCAL‐Bbei60°C
gerührtwird(Abbildung93).
DieAuswertungderErgebnissedeutetaufeinestarkeAbnahmederAktivitätundauchderStabilitätder
CAL‐BwährendderZyklisierungsversuchedurchInaktivierunghin.SokonnteschonimzweitenZyklus
des Recyclings nur noch 30% Umsatz anstelle der 43% des ersten Zyklus erreicht werden. In den
folgendenZyklen(Zyklus3und4)sankderUmsatzweiterauf25%bzw.20%Umsatz.ImfünftenZyklus
konnten24%UmsatznurdurchVerlängerungderReaktionszeitaufübersechsStundenerzieltwerden.
AuchwenneinstetigerAbfallinderAktivitätderCAL‐Bzuerkennenist,bleibtdieStereoselektivität
konstanthoch.InallenFällen,mitAusnahmedeszweitenZyklus(81%ee),konntenguteEnantiomeren‐
überschüssevon>88%undsomitE‐Wertevon>13erreichtwerden.
InderLiteratursowieineinerDoktorarbeitdiesesArbeitskreisessinderfolgreicheRecyclingprozesse
derCAL‐BbeiderRacematspaltungvonAmineninAnwesenheitvonLösungsmittelnsowieinlösungs‐
mittelfreierUmgebungbeschriebenworden.[33,36]DabeiwurdengleichbleibendhoheUmsätzemitsehr
gutenee‐WertenfürdieerstenZyklenerhalten,bevoreinleichterRückgangderUmsätzezubeobachten
war.DierapidesinkendenUmsätzeinderRecycling‐VersuchsreiheimRahmendieserArbeitinlösungs‐
mittelfreiem Milieu deuten auf eine verringerte Aktivität der CAL‐B hin. In der Tat wurde dieses
PhänomenauchvonderArbeitsgruppeumKANERVAbeiderlösungsmittelfreienRacematspaltungvon
rac‐4 mit Methoxyester 6 beobachtet.[36] Des Weiteren wurde beobachtet, dass die Lipase bei mehr‐
facherAnwendungbeihöherenTemperaturenteilweisevonTrägermaterialabgelöstwird.[33]
89
4 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen O
NH2
O
+
Umsatz[%]/ee[%]
rac‐4
O
HN
CAL‐B
(40mg/mmol)
O
NH2
O
+
60°C,4.5h
O
(R)‐10
9,1Äq.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
O
92
Umsatz[%]
ee[%]
(R)‐10
89
87
(S)‐4
94
90
43
30
1
25
2
3
20
4
24
5
Zyklus
Abbildung93. EnzymrecyclingamBeispielderRacematspaltungvonrac‐4mitMalonester9.
Die CAL‐B kann somit zwar durch Immobilisierung stabilisiert werden, allerdings eignet sich diese
LipasenichtfürRecyclingreaktionenunterdenindieserArbeitgewähltenlösungsmittelfreienStandard‐
bedingungen,damitjedemZykluseinbeträchtlicherVerlustanUmsatzeinhergeht.Allerdingskonnte
gezeigtwerden,dassnurderVerlustderAktivitätdieMöglichkeitdesRecyclingsbeeinträchtigt,dadie
Enantiomerenüberschüssestets>81%betrugen.
4.3.6
VerwendungvonalternativenLipasen
4.3.6.1
Lipasen‐Screening
ObwohldieCAL‐BdieamhäufigstenverwendeteLipaseistundauchbereitsgroßtechnischAnwendung
findet,[27–29]sindauchandereProzessebekannt,diealternativeLipasenbenutzen.AlsBeispielseihier
dieRacematspaltungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)mitMethoxyessigsäureseternwie111vonBASF
SEgenannt,inderdieLipaseausBurkholderiaplantariierfolgreicheingesetztwird.[229]IndieserArbeit
solltensomitalleinderArbeitsgruppevorhandenenLipasenaufihreFähigkeituntersuchtwerden,die
entsprechenden Acylierungsreaktionen zu katalysieren. Als einfachstes Substrat wurde zunächst
Benzylamin(134)eingesetzt,daskeinStereozentrumbesitztundsomitzueinemvollständigenUmsatz
zumAmid133führensollte(Abbildung94).InallenScreening‐AnsätzenwurdeMTBEalsLösungsmittel
verwendet, da das Hydoxy‐Amin 138 als feste Komponente zu einer inhomogenen Mischung führen
würde.NebenderimmobilisiertenCAL‐BausCandidaantarctica(Novozym435)liefertendieimmo‐
90
4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
bilisierteundlyophilisierteLipasenCAL‐B(beidevonC‐LECTA)einennahezuvollständigenUmsatzzum
Amid133(89%bzw.94%).WeitereLipasenführtenzuniedrigenUmsätzenimBereichvon15‐22%.
Beachtlichisthierbei,dassdieLipasenL5,GC4,R10,AY30sowieCE5undD20(allevonAMANO)alle
ungewöhnlich hohe Umsätze zum Diamid 137 zeigten. Dieses kann als Indiz für eine sehr langsame
Acylierungsreaktion gesehen werden, in der die zweite Acylierung mit größerer Wahrscheinlichkeit
abläuft als die gewünschte einfache Reaktion zum Amid 133. Eventuell spielt die durch den ersten
AcylierungsschrittschonentstandeneNähedesAmids133zuraktivenSeitederLipaseeinewichtige
Rolledabei.
NH2
134
+
O
Lipase
(40mg/mmol)
O
O
60°C,3h
O
O
N
H
O
O
133
9
1Äq.
UmsatzAmid113[%]
133
UmsatzDimer114[%]
137
CAL‐B(Novozym435)
Toyobo
Hogpancreas(F
LUKA)
Hogpancreas(Fluka)
L„A
MANO
“5
L„Amano“5
Lipase
Rhizopusniveus(F
LUKA)
Rhizopusniveus(Fluka)
L.P.L.„A
MANO“100S
L.P.L.„Amano“100S
GC„A
MANO“4
GC„Amano“4
R„A
MANO“10
R„Amano“10
AY„A
MANO“30
AY„Amano“30
NConc(A
MANO)
NConc(Amano)
AP6(A
MANO)
AP6(Amano)
PSimmob.aufToyonite‐200‐P(AMANO)
PSimmobilisiertaufToyonite‐200‐P(Amano)
PSimmobilisiertaufDiatomite(Amano)
PSimmob.Diatomite(AMANO)
M‐AP10(A
MANO)
M‐AP10(Amano)
F‐AP15(A
MANO)
F‐AP15(Amano)
R10(A
MANO)
R10(Amano)
CE„A
MANO“5
CE„Amano“5
D„A
MANO
“20
D„Amano“20
AK„A
MANO“
AK„Amano“
AYS„A
MANO“
AYS„Amano“
PS„A
MANO“SD
PS„Amano“SD
CAL‐Bimmobilisiert(
C‐LECTA)
CAL‐Bimmobilisiert(c‐LEcta)
CAL‐Blyophilisiert(
C‐LECTA)
CAL‐Blyophilisiert(c‐LEcta)
0
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Umsatz[%]
Abbildung94. Lipasen‐ScreeningmitBenzylamin(134)alsSubstrat.
91
4 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen DieobengenanntenLipasenwurdenimAnschlussinderAcylierungdesHydroxy‐Amins138eingesetzt
(Abbildung95).UnterdenhierverwendetenReaktionsbedingungenkonntenmitderCAL‐B(Novozym
435) nur maximal 52% Umsatz erreicht werden. Weiterhin lieferten die immobilisierten Lipasen PS
(AMANO)unddieCAL‐B(C‐LECTA)moderateUmsätzevon47%bzw.44%.MitderlyophilisiertenLipase
von C‐LECTAkonntennoch18%UmsatzzumHydroxy‐Amid141erzieltwerden.Auffälligist,dassbei
derVerwendungderLipasePS,dieaufdemkeramischenTrägerToyonite‐200‐Pimmobilisiertist,kein
Diamid142alsNebenproduktgebildetwordenist.
HO
NH2
138
0.2M
O
+
Lipase
(40mg/mmol)
O
O
O
HO
60°C,3h
MTBE
O
9
1Äq.
UmsatzAmid118[%]
141
N
H
O
O
141
UmsatzDimer119(%)
142
CAL‐B(Novozym435)
CAL‐B(Novozym435)
L„A
MANO“5
L„Amano“5
GC„A
MANO“4
GC„Amano“4
Lipase
CE„A
MANO“5
CE„Amano“5
R„A
MANO“10
R„Amano“10
D„A
MANO“20
D„Amano“20
AY„A
MANO“30
AY„Amano“30
PSimmobilisiertaufToyonite‐200‐P(Amano)
PSimmob.aufToyonite‐200‐P(AMANO)
CAL‐Bimmobilisiert(
C‐LECTA)
CAL‐Bimmobilisiert(c‐LEcta)
CAL‐Blyophilisiert(
C‐LECTA)
CAL‐Blyophilisiert(c‐LEcta)
0
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Umsatz[%]
Abbildung95. Lipasen‐ScreeningmitHydroxy‐Amin138alsSubstrat.
DieselbenLipasenwurdenschließlichfürdieAcylierungdesracemischen1‐Phenylethylamins(rac‐4)
verwendet(Abbildung96).NurdieCAL‐B(Novozym435)sowiedieimmobilisierteLipasevonC‐LECTA
(46%bzw.45%)zeigteneinensehrgutenUmsatz.MitderlyophilisiertenLipasevon C‐LECTAkonnte
nocheinUmsatzvon12%erzieltwerden.AlleweiterenLipasenzeigtenkeineAktivitätinHinblickauf
die Acylierung des racemischen Amins rac‐4. Die Bildung des entsprechenden Diamids wurde nicht
beobachtet.
92
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
O
NH2
O
+
rac‐4
0.2M
4
Lipase
(40mg/mmol)
O
O
HN
O
O
60°C,3h
MTBE
O
9
1Äq.
(R)‐10
(R)‐10
Umsatz[%]
CAL‐BCandidaantarctica(Novozym435)
CAL‐B(Novozym435)
L„Amano“5
L„AMANO“5
GC„Amano“4
GC„AMANO“4
Lipase
CE„Amano“5
CE„AMANO“5
R„Amano“10
R„AMANO“10
D„Amano“20
D„AMANO“20
AY„Amano“30
AY„AMANO“30
PSimmob.aufToyonite‐200‐P(Amano)
PSimmob.AufToyonite‐200‐P(AMANO)
CAL‐Bimmob.(c‐LEcta)
CAL‐Bimmobilisiert(
C‐LECTA)
CAL‐Blyo.(c‐LEcta)
CAL‐Blyophilisiert(
C‐LECTA)
0
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Umsatz[%]
Abbildung96. Lipasen‐Screeningmit1‐Phenylethylamin(rac‐4)alsSubstrat.
In einem breit angelegten Lipasen‐Screening wurden alle vorrätigen Enzyme an der gewünschten
Acylierungsreaktion getestet. Die Lipase B aus Candida antarctica erwies sich als das einzige aktive
Enzym bei der Racematspaltung des Amins rac‐4. Dabei wurden die besten Ergebnisse mit den auf
unterschiedlicheTrägerimmobilisierteLipasenerhalten.DieEnzymaktivitätenderbeidenLipasenvon
C‐LECTAwurdenimFolgendendirektmitdervonCAL‐B(Novozym435)verglichen.
4.3.6.2
VerwendungderLipasenvonC‐LECTAalsBiokatalysatoren
Mit den beiden Lipasen aus Candida antarctica der Firma C‐LECTA, insbesondere die auf einen
Metacrylat‐TrägerimmobilisierteLipase,konntensehrgutebzw.mäßigeUmsätzeerzieltwerden(vergl.
Abschnitt4.3.6.1).ZunächstwurdendieEnzymaktivitätendieserbeidenLipasenmitdenenderCAL‐B
(Novozym 435) verglichen. Dabei wurde mit Essigester 5 gesättigter KPi‐Puffer zusammen mit der
jeweiligen Lipase bei Raumtemperatur an einer Titrationsapparatur umgesetzt. Die bei der Spaltung
entstandene Essigsäure wurde mit NaOH gegentitriert und das erhaltene Volumen der Lauge zur
BerechnungderrelativenAktivitätderLipaseeingesetzt.DieAktivitätderCAL‐B(0.855U/mg)wurde
dabeigleich100%gesetzt(Tabelle12).ImVergleichdazukonntebeiderimmobilisiertenLipasevon
C‐LECTA, mitder imRahmen desLipasen‐Screenings(Abschnitt 4.3.6.1)ein Umsatz von 45%bei der
93
4 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen Acylierungvonrac‐4erhaltenwurde,nureinerelativeAktivitätvonnur68%nachgewiesenwerden.
Von der lyophilisierte Lipase von C‐LECTA wurde nur 1/20 der Enzymmenge eingesetzt. Die dabei
ermittelterelativeAktivitätdieserLipasebetrug2000%.AufgrunddesniedrigenUmsatzesimRahmen
desLipasen‐ScreeningsistdiesesErgebnisüberraschend.
Tabelle12.
EnzymkatalysierteSpaltungdesEssigesters5mitunterschiedlichenLipasenbei20°C.
Eintrag
Lipase
Enzym
[mg/mmol]
Steigung
[mL/sec]
Aktivität
[U/mg]
Rel.Aktivität
[%]
1
Novozym435
20
0.0057
0.855
100
2
C‐LECTAimmobilisiert
20
0.0039
0.585
68
3
C‐LECTAlyophilisiert
1
0.0057
17.100
2000
DieenzymatischeSpaltungdesEssigesters5durchdieCAL‐B(Novozym435)sowiedieimmobilisierte
und lyophilisierte Lipasen von C‐LECTA wurden im Anschluss bei 60 °C an der Titrationsapparatur
durchgeführt (Tabelle 13). Dabei wurde erneut die Aktivität der CAL‐B (Novozym 435) gleich 100%
gesetzt.DiemittelsimmobilisierterLipase(C‐LECTA)erhaltenerelativeAktivitätgleichtmit69%den
WerteninTabelle12(Eintrag2).
Tabelle13.
EnzymkatalysierteSpaltungdesEssigesters5mitunterschiedlichenLipasenbei60°C.
Eintrag
Lipase
Enzym
[mg/mmol]
Aktivität
[U/mg]
Rel.Aktivität
[%]
1
Novozym435
20
3.180
100
2
C‐LECTAimmobilisiert
20
2.190
69
3
C‐LECTAlyophilisiert
1
31.800
1000
Bei der lyophilisierten CAL‐B von C‐LECTA konnte eine relative Aktivität von 1000% nachgewiesen
werden. Dieses entspricht der Hälfte des Wertes bei einer Temperatur von 20 °C und lässt darauf
schließen, dass die nicht‐immobilisierte CAL‐B bei höheren Temperaturen an Stabilität einbüßt. Die
erhöhteStabilitätvielerEnzymedurchImmobilisierungistinderLiteraturoftmalsbeschrieben.[13]Auch
in den Produktinformationsblättern der Firma C‐LECTA wird der immobilisierten CAL‐B eine höhere
Thermostabilitätzugewiesen.[265]
94
4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
DadiebeidenLipasenvon C‐LECTAhohebzw.sehrhoheAktivitäteninHinblickaufdieenzymatische
Esterspaltung aufweisen, sollte im Folgenden die enzymatische Racematspaltung von rac‐4 unter
Standardbedingungenuntersuchtwerden.DiejeweiligeEnzymmengewurdedafürentsprechendandie
ermittelterelativeAktivitätangepasst.
DieAcylierungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)mitderimmobilisiertenCAL‐Bvon C‐LECTAwurdezum
einen lösungsmittelfrei und zum anderen in Anwesenheit von MTBE als Lösungsmittel durchgeführt
(Tabelle 14). Zwar führten dabei beide Acylierungsreaktionen zu einem vollständigen Umsatz, aller‐
dingskonntenurinAbwesenheitvonLösungsmitteln(Eintrag1)sehrguteee‐Wertevon96%(E=194)
erreichtwerden.ImGegensatzdazuwurdeninAnwesenheitvonMTBEnur84%eeundeinguterE‐Wert
von 29 erzielt (Eintrag 2). Die immobilisierte Lipase von C‐LECTA stellt somit ein weiteres wichtiges
WerkzeugzurDarstellungenantiomerenreinerAmineinlösungsmittelfreierUmgebungdar.
Tabelle14.
EnzymatischRacematspaltungvonrac‐4mittelsimmobilisierterCAL‐BvonC‐LECTA.
Eintrag
MTBE[mL]
Umsatz[%]
eeP [%]
eeS[%]a)
E
1
2
0
0.5
52
49
96
84
96
81
194
29
a)berechnetmit„Enantioselectivity“[258].
ParallelzuderenzymatischenRacematspaltungvonrac‐4mittelsimmobilisierterCAL‐Bvon C‐LECTA
wurdedieTrennungderEnantiomeremithilfederlyophilisiertenCAL‐B,ebenfallsvon C‐LECTA,unter‐
sucht.AuchindiesemFallwurdedieEnzymmengeandieermittelterelativeAktivitätangepasst.
Die Racematspaltung von rac‐4 durch die lyophilisierte CAL‐B wurde zunächst unter Standard‐
bedingungeninAbwesenheitvonLösungsmittelndurchgeführt(Tabelle15,Eintrag1).Dabeiwurdenur
eingeringerUmsatzvon9%erzielt,jedochmiteinemgutenEnantiomerenüberschussvon81%(E=1).
Mit der fünffachen Enzymmenge konnte sowohl der Umsatz auf 26% als auch der ee‐Wert auf 91%
gesteigert werden. Dieses entspricht einer exzellentenEnantioselektivität von 29.Eine Verlängerung
derReaktionszeitauf24Stundenmit4mg/mmolCAL‐BliefertenureinenetwashöherenUmsatzvon
19%, jedoch war hierbei der Enantiomerenüberschuss mit 74% (E = 8) nicht zufriedenstellend
(Eintrag3). Eventuell hat in diesem Fall bei der langen Reaktionsdauer eine parallel chemische
Acylierungstattgefunden,sodassderee‐Wertdadurchsinkt.InteressanterweisewurdebeieinerReak‐
tionstemperaturvon20°Cbei24StundenReaktionsdauernahezudasidentischeErgebnisderReaktion
unterStandardbedingungenerhalten.AuchdieDurchführungderRacematspaltunginAnwesenheitvon
MTBEalsLösungsmittelliefertenur7%Umsatzmit87%ee(Eintrag5).DieZugabevonWasserzuder
ansonstenlösungsmittelfreienSyntheseführtenurzueinemUmsatzvon6%.AufeineBestimmungdes
EnantiomerenüberschussesistindiesemFallaufgrunddesniedrigenUmsatzesverzichtetworden.
95
4 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen Tabelle15. EnzymkatalysierteRacematspaltungvonrac‐4mittelslyophilisierterCAL‐BvonC‐LECTA.
Eintrag
CAL‐B
[mg/mmol]
T[°C]
t[h]
Umsatz[%]
ee[%]
E
1
2
3
4
5a)
6b)
4
20
4
4
4
4
60
60
60
20
60
60
4.5
4.5
24
24
4.5
4.5
9
26
19
6
7
6
81
91
74
80
87
n.b.
10
29
8
10
2
n.b.
a)Zugabevon0.5mLMTBE;b)Zugabevon10µLdest.Wasser;n.b.=nichtbestimmt.
Insgesamt ist festzustellen, dass die enzymatische Racematspaltung des Amins rac‐4 unter lösungs‐
mittelfreienBedingungentrotzdersehrhohenrelativenAktivitätderlyophilisiertenCAL‐BimVergleich
zudenbeidenimmobilisiertenLipasen(Novozym435unddieCAL‐Bvon C‐LECTA)nichtzuzufrieden‐
stellenden Ergebnissenführt. Allein dieErhöhungder Enzymmenge um das Fünffache (20mg/mmol
anstellevon4mg/mmolunterStandardbedingungen)lieferteeinenmäßigenUmsatzmithoherEnan‐
tiomerenreinheitundEnantioselektivitätvon29(Eintrag2).DieVerwendungeinerhohenEnzymmenge
istdemnachsinnvoll,umNebenreaktionenzumDiamidzuunterdrücken.AusökonomischerSichtist
dieseArtderReaktionsführungjedochnichtratsam.
4.3.7
VariationderAcyldonoren
BeiderRacematspaltungvonAminenistdieWahldesAcyldonorsvongroßerBedeutung.Hochreaktive
Acyldonoren, wie beispielsweise Enolester, können Carbonyl‐Verbindungen freisetzen, die dann
wiederummitderAminfunktionzueinemIminreagierenkönnten.[31]AufgrundderhohenNucleophilie
desAminsführendiesespontanen,nicht‐enzymatischenAcylierungsreaktionensomitzueinerverrin‐
gertenEnantioselektivität.SehrguteErgebnissewurdeninderLiteraturmitAcyldonorenerhalten,die
inβ–PositioneinHeteroatom,meistensSauerstoff,tragen,wieMethoxyessigsäureethyl‐oder–propyl‐
ester (111 bzw. 6, Abbildung 4). Die Anwesenheit eines Heteroatoms hat eine erhöhte Aktivität des
Carbonyl‐KohlenstoffszurFolge.[229]InderArbeitvonSIMONwurdeschließlichMalonsäurediethylester
(9) als sehr effizienter Acyldonor gefunden.[33,34] Aufgrund des sehr breiten Substratspektrums der
CAL‐BkanneineVielzahlanAcyldonorenverwendetwerden.EineAuswahlanAcyldonorenwurdebei
derenzymatischenRacematspaltungvonAminrac‐4unterlösungsmittelfreienBedingungeneingesetzt
unddieErgebnissederAcylierungmiteinanderundmitMalonsäurediethylester(9)alsStandard‐Acyl‐
donorverglichen.BeidenuntersuchtenAcyldonorenhandeltessichumPhenoxyessigsäureethylester
96
4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
(122), Phenylessigsäureethylester (147), Methoxyessigsäureethylester (111), Cyanessigsäureethyl‐
ester(124)undEssigsäurevinylester(125).DieausgewähltenAcyldonorensindinAbbildung97dar‐
gestellt.
Abbildung97. AlternativeAcyldonoren.
4.3.7.1
VergleichderAcyldonorenunterStandard‐Reaktionsbedingungen
Bei der enzymatischen Racematspaltung von 1‐Phenylethylamin (rac‐4) unter Standard‐Reaktions‐
bedingungenbei60°CReaktionstemperatursolltendieAktivitätenderAcyldonorenausAbschnitt4.3.5
untereinander verglichen werden. Die Ergebnisse sind in Abbildung 98 graphisch dargestellt. Es ist
ersichtlich,dassbeiderAcylierungdesAminsrac‐4bereitsnach4.5StundenReaktionszeitmitdem
Standard‐AcyldonorMalonsäurediethylester(9)46%Umsatzsowiesehrgute98%eeerhaltenwurden.
DiesesentsprichteinemexzellentenE‐Wertvon>200.
DerAcyldonorPhenoxyessigester122lieferte51%Umsatzmit65%ee(E=9).EineVerringerungder
Reaktionstemperatur von 60 °C auf 40 °C lieferte ein ähnliches Ergebnis, da 49% Umsatz zum Amid
(R)‐121sowie67%ee(E=10)erreichtwordensind.TrotzdergutenUmsätzesinddieseWertefüreine
effizienteRacematspaltungnichtausreichend.
Der Cyanoester 124 wurde in der Literatur bereits als Acyldonor für die Synthese von Zytostatica
beschrieben,jedochnurmittelsChemokatalyse.[266]BeiderenzymatischkatalysiertenAcylierungliefert
der Acyldonor 124 einen guten Umsatz von 45%. Allerdings können dabei nur 10% ee beobachtet
werden,demnachisteineRacematspaltungauchmitdiesemDonornichterfolgreich.MitMethoxyessig‐
ester111konntennach4.5StundenReaktionszeitzwarnurmäßige25%UmsatzzumAmid(R)‐8erzielt
werden, jedoch lag der Enantiomerenüberschuss erfreulicherweise bei 92%. Dieses entspricht einer
sehrgutenEnantioselektivitätvon33.AllgemeinwerdenmitMethoxyessigesternbeiderAcylierungvon
AmineninderLiteraturvollständigeUmsätzeerhalten.[30]SosetztenDITRICHetal.dasAminrac‐4mit
97
4 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen Methoxyessigsäurepropylester(6)mit46%UmsatzzumAmid(R)‐8enantiomerenrein(E>100)um.
DieseEnantioselektivitätenkönnenimRahmendieserArbeitundauchbeivorherigenAcetylierungs‐
reaktioneninorganischemLösungsmittelinnerhalbderArbeitsgruppe[33,34]nichtmehrerreichtwerden.
DerGrunddafürkannunterandereminderViskositätdeslösungsmittelfreienSystemsunddesdadurch
verminderten Transportprozesses innerhalb der Reaktionsmischung liegen. Es sollte im Anschluss
überprüft werden, inwiefern eine Verlängerung der Reaktionszeit eine Steigerung des Umsatzes zur
Folgehat.
O
NH2
CAL‐B
(40 mg/mmol)
O
+
rac‐4
R
O
R'
NH
+
60 °C, 4.5 h
Acyldonor, 1 Äq.
(R)‐Amid
9 (R = CH2 COOEt, R' = Et)
122 (R = CH2 COPh, R ' = Et)
147 (R = CH2 Ph, R' = Et)
111 (R = CH2 OMe. R' = Et)
124 (R = CH2 CN, R' = Et)
125 (R = CH3 , R' = CHCH2 )
(S)‐4
(R)‐10 (R = CH 2COOEt)
(R)‐121 (R = CH2COPh)
(R)‐126 (R = CH2Ph)
(R)‐8 (R = CH 2OMe)
(R)‐123 (R = CH2CN)
(R)‐7 (R = CH 3)
Umsatz[%]
ee[%]
96
100
NH2
R
92
Umsatz[%]/ee[%]
90
80
65
70
50
53
51
60
45
43
40
25
30
15
20
10
16
10
10
0
9
122
147
111
121
125
Acyldonor
Abbildung98.
VergleichderalternativenAcyldonorenunterStandard‐Reaktionsbedingungen.
EnttäuschendeErgebnisseliefertendieRacematspaltungenvonrac‐4mitPhenylessigester147sowie
Vinylester 125. Mit dem Acyldonor 147 konnten nur 15% Umsatz zum Amid (R)‐126 beobachtet
werden.DieseskannmitdemfehlendenHeteroatominβ‐Positionunddiedadurchbedingtegeringere
AktivitätdesEsters147begründetwerden.[31]VermutlichwirktsichdieKettenlängedesDonors147
negativ auf die Selektivität des Enzyms aus. Der ee‐Wert dieser Acylierungsreaktion beträgt für das
Amid(R)‐12653%miteinerinakzeptablenEnantioselektivitätvon4.DerAcyldonor147imdemnach
ungeeignetfüreineenzymatischeAcylierungdesAminsrac‐4.DieAcylierungmitdemVinylester125
liefertbeiebenfallsnur16%UmsatzzumAmid(R)‐7jedochnur10%ee.
98
4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
UnterdengewähltenStandard‐ReaktionsbedingungenkonntefolglichmitMalonsäurediethylester(9)
als Acyldonor der beste Umsatz und die höchste Enantiomerenreinheit von 96% erzielt werden. Im
AnschlussandieseVersuchsreihewurdendieAcylierungsreaktionenmitPhenoxy‐oderVinylessigester
(122bzw.125)beiverringerterTemperaturdurchgeführtunddieErgebnissemiteinanderverglichen.
4.3.7.2
VergleichderAcyldonorenbeiverringerterTemperatur
DiealternativenAcyldonorenwurdenauchbeiverringerterTemperaturvon40°CmitdemAminrac‐4
umgesetztunddieErgebnissemiteinanderverglichen.DasHerabsetzenderReaktionstemperaturkann
sich, besonders bei stark aktivierten Acyldonoren wie 122 und 124, als vorteilhaft erweisen, da die
Reaktionendannlangsamerundsomitselektiverablaufenkönnten.AlsStandard‐Acyldonordientehier‐
beiwiederMalonsäurediethylester(9).DieErgebnissesindinAbbildung99graphischdargestellt.
O
NH2
O
+
rac‐4
R
O
R'
CAL‐B
(40 mg/mmol)
NH
+
40 °C, 4.5 h
(R)‐Amid
Acyldonor, 1 Äq.
9 (R = CH2 COOEt, R' = Et)
122 (R = CH2 COPh, R ' = Et)
147 (R = CH2 Ph, R' = Et)
111 (R = CH2 OMe. R' = Et)
124 (R = CH2 CN, R' = Et)
125 (R = CH3 , R' = CHCH2 )
ee[%]
82
90
Umsatz[%]/ee[%]
95
100
80
67
70
60
40
(S)‐4
(R)‐10 (R = CH 2COOEt)
(R)‐121 (R = CH2COPh)
(R)‐126 (R = CH2Ph)
(R)‐8 (R = CH 2OMe)
(R)‐123 (R = CH2CN)
(R)‐7 (R = CH 3)
Umsatz[%]
50
NH2
R
49
40
34
31
30
20
11
4
10
17
22
0
9
122
147
111
124
125
Acyldonor
Abbildung99. VergleichderalternativenAcyldonorenbeiverringerterReaktionstemperatur.
99
4 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen Der Malonester 9 liefert bei 40 °C Reaktionstemperatur mit 34% Umsatz und sehr hoher Enantio‐
merenreinheitvon96%einensehrgutenE‐Wertvon80.DiesesistfüreineeffizienteRacematspaltung
einhervorragendesErgebnis.MitPhenoxyessigester122alsAcyldonorwurdenzwarsehrgute49%
Umsatz erzielt, jedoch konnten nur mäßige 67% ee beobachtet werden. Dieses entspricht einer
Enantioselektivitätvon10undist,ebensowiebei60°C,nichtzufriedenstellend.
Der Methoxyessigester 111 lieferte zwar einen leicht erhöhten Umsatz von 31% im Vergleich zur
Acylierungbei60°C,allerdingskonnteeinleichtesAbsinkendesee‐Wertesvon92%auf82%bei40°C
(E=14)detektiertwerden.AucheineweitereVerringerungderTemperaturauf20°Cführtenochzu
guten31%Umsatz,allerdingsnurmitmäßigen71%ee(E=8).DieniedrigenEnantiomerenüberschüsse
desAmids(R)‐8beiVerringerungderReaktionstemperaturaufnurnoch71%eeweichendeutlichvon
deninderLiteraturbeiRaumtemperaturerhaltenenWertenmitAcyldonor6ab(>99%ee,E>100).[30]
Eine Verringerung der Selektivität der CAL‐B bei niedrigeren Temperaturen kann demnach ausge‐
schlossenwerden.
Unveränderte Ergebnisse (40% Umsatz mit 11% ee zum Amid (R)‐123) im Vergleich zu den Acylie‐
rungsreaktionenbei60°CwurdenmitCyanoessigester124erhalten.UnterdenhierverwendetenReak‐
tionsbedingungenisteineRacematspaltungmitdiesemDonornichtmöglich.MitVinylessigester125
konnten auch bei 40 °C Reaktionstemperatur nur 17% Umsatz erzielt werden. Für eine gute Durch‐
mischungderdickflüssigenReaktionsmischungwarindiesemFalldieZugabevonMTBEalsLösungs‐
mittelnotwendig.Deree‐Wertbeträgthierbei22%.DiesesentsprichteinemE‐Wertvon2undistnicht
ausreichendfürdieRacematspaltung.EbenfallsnegativeErgebnissemit4%Umsatzwerdenmitdem
Phenylessigester 147 als Acyldonor erhalten. Auf eine Bestimmung des Enantiomerenüberschusses
wurdeindiesemFallverzichtet.
EshatsichfolglichauchbeiverringerterReaktionstemperaturvon40°CMalonsäurediethylester(9)als
dergeeignetsteAcyldonorerwiesen,sowohlinHinblickaufdenUmsatzalsauchaufdieEnantiomeren‐
reinheitderRacematspaltung.MitdenAcyldonorenMalonester9,Phenoxyessigester122,Cyanessig‐
ester124sowiedemMethoxyessigester111wurdenimFolgendenKinetikenderRacematspaltungdes
Aminsrac‐4unterlösungsmittelfreienStandard‐Bedingungenuntersucht.
4.3.7.3
ParallelablaufendechemischeAcylierungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)
In den beiden vorangegangenen Abschnitten sind teilweise ungewöhnlich niedrige Enantiomeren‐
überschüsse erhalten worden. Dieses sollte daraufhin näher untersucht werden, indem die entspre‐
chenden Acylierungsreaktionen von rac‐4 zwar unter Standard‐Bedingungen, jedoch in Abwesenheit
derLipaseCAL‐Bdurchgeführtwurden(Abbildung100).
SowohlmitdemCyanessigester124,alsauchinnochstärkeremMaßemitdemVinylessigester125,
findenunkatalysierteAcylierungsreaktionenstatt.DieseserklärtdiesehrniedrigenEnantiomerenüber‐
schüsse,dieindenAbschnitten4.3.7.1und4.3.7.2beschriebenwordensind.SokonnteninAbwesenheit
der CAL‐B bei 60 °C und 4.5Stunden Reaktionszeit bereits 33% Umsatz zum entsprechenden race‐
mischen Amid rac‐123mit 3% ee (E = 1) erhalten werden. Durch Verringerung der Temperatur auf
100
4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
40°CkanndiechemischeReaktionzueinemGroßteilunterdrücktwerden,danurnoch12%Umsatz
ermitteltwerden.
O
NH2
O
+
rac‐4
R
HN
O
R'
R
20 ‐ 60 °C
4.5 h
Acyldonor, 1 Äq.
rac‐10 (R = CH2 COOEt)
rac‐123 (R = CH2 COPh)
rac‐126 (R = CH2 Ph)
rac‐8 (R = CH2 OMe)
rac‐123 (R = CH2 CN)
rac‐7 (R = CH3 )
9 (R = CH2COOEt, R' = Et)
122 (R = CH2COPh, R ' = Et)
147 (R = CH2Ph, R' = Et)
111 (R = CH2OMe. R' = Et)
124 (R = CH2CN, R' = Et)
125 (R = CH3, R' = CHCH2)
40°C
60°C
Umsatz[%]
93
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
81
33
0
0
9
0
2
0
0
0
0
122
147
111
12
122
60°C
40°C
125
Acyldonor
Abbildung100. ParallelablaufendechemischeAcylierungvonrac‐4.
ImFalledesVinylessigesters125könnenbei60°CReaktionstemperaturbiszu93%desAmidsrac‐8
erreichtwerden.DieGeschwindigkeitderchemischenAcylierungkannwährendderReaktionsführung
mit und ohne Lipase beobachtet werden, da bereits nach wenigen Minuten eine Braunfärbung zu
erkennenist.DiesesistmiteinererhöhtenReaktivitätdesEsters125zubegründenunderklärtden
relativniedrigenUmsatzvon16%inAbschnitt4.3.7.1,derdurchenzymatischeAcylierungdesAmins
rac‐4 erhalten wurde. Obwohl der Vinylester 125 bereits erfolgreich zur Acylierung von Alkoholen
unter lösungsmittelfreien Bedingungen[248] eingesetzt worden ist, eignet er sich nicht zur Racemat‐
spaltungvonrac‐4.
Wird mit stark aktivierten Acyldonoren gearbeitet, so lässt sich die chemische Acylierung durch
VerringerungderReaktionstemperaturzueinemgewissenTeilvermeiden.Allerdingsmussinsolchen
Fällen die vorhandene Aktivität der CAL‐B bei entsprechenden Temperaturen bestimmt werden, da
dieseihrTemperaturoptimumbei60–80°Chat.[195]
101
4 4.3.8
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen ReaktionskinetikenderRacematspaltungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)mit
unterschiedlichenAcyldonoren
Um die Effizient der unterschiedlichen Acyldonoren effektiv miteinander vergleichen zu können,
wurdendieAnfangsgeschwindigkeitenkinetischerRacematspaltungendieserAcyldonorenmiteinander
undmitMalonsäurediethylester(9)alsStandard‐Acyldonorverglichen.
DieReaktionskinetikenderAcylierungsreaktionendesAminsrac‐4wurdenunterdenStandard‐Reak‐
tionsbedingungen durchgeführt. Dabei wurden die Reaktionen nach der entsprechenden Zeit abge‐
brochenundaufgearbeitet,wasgenerellzukleinerenAbweichungendurchWägefehlernführenkann.
WeitereFehlerquellensinddieSchwankungsbreitenbeiderAuswertungder 1H‐NMR‐Spektrensowie
derHPLC‐Chromatogramme.DerUmsatzwirdbeidiesenAcylierungsreaktioneninBezugaufdasAmin
rac‐4bestimmt,dadieFlüchtigkeitderAcyldonorennichtuntersuchtwordenist.
AlsVergleichfürdiealternativenAcyldonorendientedieReaktionskinetikderAcylierungvonrac‐4mit
Malonsäurediethylester(9)alsAcyldonorunterlösungsmittelfreienBedingungen(Abbildung101).Es
ist ein steter Anstieg des Umsatzes mit der Zeit zu erkennen bis nach 24 Stunden ein vollständiger
Umsatzerreichtwird.DieEnantiomerenüberschüssefürdasAmid(R)‐10liegenbeidiesenAcylierungs‐
reaktionenimmer>94%ee.EineAusnahmestelltdabeiderReaktionmitachtStundenReaktionszeitan,
beidernur89%eebeobachtetwerdenkönnen.DieseAbweichungkannnichtaufFehlerwährendder
Reaktionsführungbegründetwerden.
Die Kinetik der Racematspaltung von rac‐4 mit Malonsäurediethylester (9) wurde in vorherigen
ArbeitenimArbeitskreis[33]bereitsuntersucht,allerdingsbeieinerReaktionstemperaturvon80°Cund
in Anwesenheit von n‐Heptan als Lösungsmittel. Dabei konnte ebenfalls eine schnelle Reaktionsrate
festgestelltwerden,wobeidervollständigeUmsatzbereitsnachdreiStundenerreichtwurde.Allerdings
warderEinsatzvon200mg/mmolCAL‐B,alsoderfünffachenMengedesimRahmendieserKinetik‐
studieverwendetenEnzyms,fürdieVersuchsreihenotwendig.
102
4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
Umsatz[%]
ee(R)‐10
ee(R)‐10[%]
Umsatz[%]/ee(R)‐10 [%]
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
5
10
15
20
25
Resktionszeit[h]
Abbildung101. KinetikderRacematspaltungvonrac‐4mitMalonsäurediethylester(9).
Bei der Verwendung von Phenoxyessigsäureethylester (122) als Acyldonor bei der enzymatischen
Racematspaltung des Amins rac‐4 in Abwesenheit von Lösungsmitteln wurden moderate Ergebnisse
erzielt(Abbildung102).SowerdenhierbeizwarbereitsnacheinerMinuteReaktionszeit30%Umsatz
zumAmid(R)‐121undeinEnantiomerenüberschussvon79%eeerreicht,waseinemE‐Wertvon12
entspricht. Nach zehn Minuten liegt der Umsatz schon bei 41%, allerdings sinkt hierbei der Enan‐
tiomerenüberschuss auf 72% (E = 10). Im Verlauf der Reaktion jedoch steigt der Umsatz weiter an,
sodassbei24StundenReaktionsdauer58%Umsatzerhaltenwerden.Deree‐WertliegtindiesemFall
bei61%,waseinerEnantioselektivitätvon9entspricht.DiesesistfüreineeffizienteRacematspaltung
nichtausreichend.DerbeilängererReaktionsdaueransteigenderUmsatzundsinkendeEnantiomeren‐
reinheit ist ein Indiz dafür, dass eine parallel ablaufende chemische Acylierung stattfindet. Sollte
Phenoxyessigester122alsAcyldonorEinsatzfinden,sowürdedasbesteErgebnismitderimRahmen
dieserArbeitverwendeteEnzymmengebereitsnachzehnMinutenReaktionszeiterzieltwerden.
103
4 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen 122,1Äq.
(R)‐121
Umsatz[%]
ee(R)‐117[%]
ee(R)‐121
100
Umsatz[%]/ee(R)‐121 [%]
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
5
10
15
20
Reaktionszeit[h]
25
Abbildung102. KinetikderRacematspaltungvonrac‐4mitPhenoxyessigester122.
DieKinetikderRacematspaltungdesAminsrac‐4mitCyanessigester124alsAcyldonorunterlösungs‐
mittelfreien Bedingungen ist in Abbildung 103 dargestellt. Zwar werden hierbei bereits nach einer
Minute20%Umsatzerreicht,allerdingssteigtdieserimVerlaufderReaktionnursehrlangsamweiter
an. Nach 4.5 Stunden Reaktionszeit können dennoch 42% Umsatz erzielt werden. Bei einer Verlän‐
gerung der Reaktionsdauer auf 24 Stunden liegt der Umsatz bei 65%, was für eine theoretische
Racematspaltungmitmaximal50%UmsatzzumAmid(R)‐123nachteiligist.DieEnantiomerenüber‐
schüssedieserAcylierungenliegenbeihöchstens12%ee,waseinerEnantioselektivitätvon1entspricht.
Diesessprichtdafür,dassdieenzymatischeAcylierungnichtenantioselektivverläuft.Vielmehrstimmt
es mit den in Abschnitt 4.3.7.3 erhaltenen Ergebnissen überein. Demnach wird in Abwesenheit von
CAL‐B 33% Umsatz zum Amid 123 mit 3% ee erzielt. Die Lipase selbst hat folglich in dieser
Versuchsreihe mit Cyanessigester 124 als Acyldonor keinen Einfluss auf die Racematspaltung. Der
DonoristsomitfürdiekinetischeRacematspaltungnichtgeeignet.
104
4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
Umsatz[%]
ee[%]
ee(R)‐123
100
Umsatz[%]/ee(R)‐123 [%]
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
5
10
15
20
Reaktionszeit[h]
25
Abbildung103. KinetikderRacematspaltungvonrac‐4mitCyanessigester124.
DieVersuchsreihezurBestimmungderKinetikderRacematspaltungvonrac‐4mitMethoxyessigester
111alsAcyldonorzumentsprechendenAmid(R)‐8wurdeebenfallsunterlösungsmittelfreienBedin‐
gungen durchgeführt (Abbildung 104). Hierbei ist zu erkennen, dass die Reaktion mit nur geringer
Geschwindigkeitverläuft,daderUmsatzsehrlangsamvon16%nacheinerMinuteReaktionszeitauf
33%nach24Stundenansteigt.DerEnantiomerenüberschussbeträgtnacheinerMinuteReaktionsdauer
72%,waseinerEnantioselektivitätvon7entspricht.ImLaufederReaktionüber24Stundenbleibtder
ee‐Wert konstant bei etwa 76 – 83% ee. Auch hierbei findet wahrscheinlich eine konkurrierende,
parallelablaufendeunkatalysierteAcylierungdesAminsrac‐4statt,dadasMethoxyessigester111in
β–Positionstarkaktiviertist.EinAbfalldesEnantiomerenüberschussesbeierhöhtenTemperaturenmit
demEster111wurdeauchvonKANERVAbeobachtet.[36]DerhöchsteE‐Wertvon16wirdsomitnach
24StundenReaktionsdauererreichtwird,wobeiderUmsatzallerdingsjedochnurbei33%liegt.
105
4 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen Umsatz[%]
ee(R)‐8
ee[%]
10
15
100
Umsatz[%]/ee(R)‐8 [%]
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
5
20
Reaktionszeit[h]
25
Abbildung104. KinetikderRacematspaltungvonrac‐4mitMethoxyessigester111.
BeidemdirektenVergleichderhiergewähltenAcyldonorenwirddeutlich,dassMalonsäurediethylester
(9) eine Sonderstellung einnimmt (Abbildung 105). Dabei wurde das Amid (R)‐10 nach 4.5 Stunden
Reaktionszeitmit42%Umsatzund95%ee(E>100).ZwarkonntenmitdemPhenoxyessigester122
bereits nach zehn Minuten Reaktionszeit43% Umsatzerhalten werden, allerdings steigtdieser nach
4.5Stundenauf57%an.DiesesliegtdeutlichüberdemmaximalenUmsatzeinerkinetischenRacemat‐
spaltungvon50%undhateineverringerteEnantiomerenreinheitundsomitauchEnantioselektivität
(E=18)zurFolge.DerinderLiteraturhäufigverwendeteMethoxyessigester111weistzuBeginnder
Reaktion eine hohe Reaktionsrateauf, allerdings stagniertdiese bereits nach etwa30 Minuten.Nach
4.5StundenkanndasAmid(R)‐8mit22%Umsatzund92%ee(E=31)beobachtetwerden.Eventuell
ist die Carbonylfunktion des Esters 111 durch die aktivierte Methoxy‐Funktion zu reaktiv für
Acylierungsreaktion in lösungsmittelfreien Systemen. Daher wäre ein Einsatz des Esters 111 in
größerenMaßstäbennichtbefriedigend.
Ein Vergleich der Racematspaltungen mit den Acyldonoren 9 und 124 zeigt zunächst ein ähnliches
Verhalten,allerdingswirdnurmitMalonsäurediethylester(9)einvollständigerUmsatzmitsehrguten
EnatiomerenüberschüssenundexzellentenE‐Wertenvon>100erreicht.DieCyano‐FunktionimEster
124hatdemnacheinenzustarkaktivierendenEinflussaufdieCarbonylfunktionundsomitauchaufdie
Reaktionsrate,dahierbeinach4.5Stundenzwar48%UmsatzzumAmid(R)‐123erzieltwerden,jedoch
beträgtderEnantiomerenüberschussbei10%ee(E=1).FürRacematspaltungeninlösungsmittelfreien
106
4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
SystemenistMalonsäurediethylester(9)folglichderAcyldonorderWahlundwirdalsStandard‐Acyl‐
donoreingesetzt.
O
NH2
CAL‐B
(40 mg/mmol)
O
+
rac‐4
R
O
(R)‐10 (R' = CH2 COOEt)
(R)‐121 (R' = CH2 OPh)
(R)‐123 (R' = CH2 CN)
(R)‐8 (R' = CH2 OMe)
ee[%]
Umsatz[%]
96
R'
60 °C, 4.5 h
R'
9 (R = Et, R' = CH2COOEt)
122 (R =Et, R' = CH2 OPh)
124 (R = Et, R' = CH2 CN)
111 (R = Et, R' = CH2 OMe)
100
HN
E‐Wert
107
92
Umsatz[%]/ee[%]/
E‐Wert
90
80
68
70
57
60
50
48
43
31
40
30
22
16
20
10
1
10
0
(R)‐10
(R)‐10
(R)‐121
(R)‐121
(R)‐123
(R)‐123
(R)‐8
(R)‐8
Amid
Abbildung105. VergleichderAcyldonorennach4.5StundenReaktionszeit.
4.3.9
Substratbreite
4.3.9.1
1‐Aminoindan(rac‐130)
1‐(R)‐Aminoindan ((R)‐130) ist ein wichtiger Metabolit des Antiparkinson‐Medikaments Rasagilin
(148)undkanngleichzeitigalsBausteinfürdieSynthesediesesWirkstoffesdienen(Abbildung106).
(R)‐130selbstbesitztzusätzlichneuroprotektiveEigenschaften.
HN
149
Rasagilin
NH2
(R)‐148
(R)‐130
NH2
rac‐148
rac‐130
Abbildung106. RetrosynthesevonRasagilin(148),ausgehendvon(R)‐130.
107
4 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen Ein möglicher Syntheseweg ausgehend von (R)‐130 beginnt mit der Racematspaltung der Vorstufe
rac‐130,die in derLiteratur bereits mehrfachsowohlauf chemischem als auch enzymatischem Weg
beschriebenwurde.[30,31,68,242,267]Dabeikonnten,insbesonderebeiderRacematspaltungmittelsCAL‐B,
bereitssehrguteErgebnisseinHinblickaufUmsatzundEnantioselektivitäterzieltwerden.Sokonnten
DITRICH et al. das entsprechende Amid mit 1.5 Äquivalenten Methoxyacetat 6 als Acyldonor nach
24StundenbeiRaumtemperaturmit92%Umsatz(bezogenauf50%maximalenUmsatz)und>98%ee
erhalten.[30]AuchdieAcylierungmitCarbonsäurenliefertdasjeweiligeAmidmit>99%ee.[31]Durcheine
dynamisch‐kinetischeRacematspaltungmithilfederCAL‐BundeinesPd‐KatalysatorsmitEthylacetat5
alsAcyldonorkonntePARKdasentsprechendeAmidenantiomerenreinmit88%Umsatzerhalten.[242]
ZuBeginnderArbeitenmitAminoindan(rac‐130)wurdeauchdieseRacematspaltunginHinblickauf
parallelablaufende,spontanechemischeAcylierungsreaktionenuntersucht.DafürwurdedieAcylierung
vonrac‐130mitMalonsäurediethylester(9)beiunterschiedlichenTemperaturenundReaktionszeiten
löungsmittelfrei zum entsprechenden Amid rac‐129 umgesetzt (Abbildung 107). Bei 60 °C und
24Stunden Reaktionsdauer wurde der höchste Umsatz von 9% erzielt. Eine Erhöhung auf 80 °C bei
4.5StundenReaktionsdauerliefertenoch8%Umsatz,währendbei20°Cnurnoch2%erhaltenwurden.
Unter den im Rahmen dieser Arbeit gewählten Standard‐Reaktionsbedingungen von 60 °C und
4.5StundenReaktionsdauerwurdennur4%UmsatzzumAmidrac‐129erzielt.ImRahmenderenzy‐
matischenAcylierungsinddieAuswirkungendiesesErgebnissesvernachlässigbar.
O
+
O
O
O
O
N
H
T, t
NH2
rac‐130
9, 1 Äq.
O
O
rac‐129
Umsatz[%]
9
10
8
Umsatz[%]
8
6
4
4
3
1
2
0
80°C,4.5h 80°C,24h 60°C,4.5h 60°C,24h 20°C,24h
Reaktionsbedingungen
Abbildung107. ParallelablaufendechemischeAcylierungvonrac‐129.
Im Anschluss an die Bestimmungen der durch unkatalysierte Parallelreaktionen erhaltenen Umsätze
solltedieenzymatischeRacematspaltungvonrac‐130mitMalonsäurediethylester(9)unterStandard‐
Bedingungen durchgeführt und in Hinblick auf optimale Reaktionsbedingungen untersucht werden.
Dafür wurde die Racematspaltung von rac‐130 zunächst in Abhängigkeit von der Temperatur bei
108
4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
4.5Stunden Reaktionsdauer untersucht. Die Ergebnisse sind in Abbildung 108 graphisch dargestellt.
Dabeiistersichtlich,dassbeiderRacematspaltungkeinTrendderAbhängigkeitvonderTemperatur
hinsichtlich des Umsatzes vorliegt. So werden bei 80 °C Reaktionstemperatur 39% Umsatz erzielt,
währendbei20°Cnoch43%Umsatzerhaltenwerden.DieEnantiomerenüberschüsseliegendabeifür
dasAmidrac‐129imBereichvonnur73‐79%ee.DieRacematspaltungvonrac‐130mitdemMethoxy‐
ester6wurdevonBASFSEmithoherEnantiomerenreinheitsowohldesAmids(R)‐129alsauchdes
Amins(S)‐130durchgeführt.[30]KANERVAetal.führtendieAcylierung,ebenfallsmitdemMethoxyester
6,unterlösungsmittelfreienBedingungenbei23°CmithoherEnantioselektivitätdurch,wobeibereits
nacheinerStunde39%Umsatzerzieltwordensind.[36]BeidenindieserArbeitgewähltenReaktions‐
bedingungen spielt die Wahl des Acyldonors sowie die Abwesenheit von Lösungsmitteln eine ent‐
scheidendeRolle.
O
+
CAL‐B
(40 mg/mmol)
O
O
O
O
N
H
T, 4.5 h
NH2
rac‐130
Umsatz[%]
Umsatz[%]/ee(R)‐129 [%]
O
(R)‐129
9, 1 Äq.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
O
ee(R)‐129
ee[%]
79
73
66
73
49
39
80
60
20
Reaktionstemperatur[°C]
Abbildung108. Racematspaltungvonrac‐130inAbhängigkeitderTemperaturbei4.5h.
DieReaktionsdauerwurdeunterdensonstgleichbleibendenBedingungenauf24Stundenverlängert,
um den Einfluss der Reaktionszeit zu überprüfen (Abbildung 109). Dabei wird bei 80 °C Reaktions‐
temperatureinUmsatzvon42%erreicht,wasnureineleichteSteigerungzudemWertvon39%bei
4.5Stunden Reaktionszeit ist. Der Enantiomerenüberschuss für das Amid (R)‐129 ist mit 97% ee
(E>100)sehrgut.Allerdingswurdebereitsbeschrieben,dassbiszu8%desAmids(R)‐129bei80°C
und 24 Stunden Reaktionsdauer auf chemischem Wege gebildet wird. Die Enantiomerenüberschüsse
der Acylierungen nehmen jedoch mit weiter sinkender Temperaturab, sodass das Amid (R)‐129 bei
40°Czwarnochmit50%Umsatzund90%ee,bei20°Cjedochnurnocheinee‐Wertvon54%detektiert
werden kann. Diese niedrige Enantioselektivität ist überraschend, da die Arbeitsgruppe um KANERVA
sehrguteErgebnissemitderCAL‐BinHinblickaufEnantioselektivitätbei23°CReaktionstemperatur
erhaltenhat.[36]
109
4 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen DasbesteResultatwurdebei24StundenReaktionsdauersomitbei60°CReaktionstemperaturerzielt
(E>100).DasAmid(R)‐129wurdehierbeinahezuenantiomerenreinerhalten.Diesesistungewöhnlich,
danach4.5StundenReaktionszeitbereitseinee‐Wertvon79%beobachtetwerdenkonnte(Abbildung
108). Obwohl es sich bei den beiden Acylierungen um eigenständige Reaktionen handelt können
technischeFehlerausgeschlossenwerden.WährendderLagerungdesAminsrac‐130isteineÄnderung
dereigentlichfarblosenVerbindungzueinergelbensichtbargewesen.Mithilfeder 1H‐NMR‐Spektro‐
skopiekonntegezeigtwerden,dassneueFremdsignalesowohlimaromatischenalsauchaliphatischen
Bereich des Spektrums vorhanden sind, die jedoch nicht weiter zugeordnet werden können. Diese
beobachteten Verunreinigungen sollten jedoch keine Auswirkung auf die Enantiomerenüberschüsse
haben.
O
+
CAL‐B
(40 mg/mmol)
O
O
O
O
N
H
T, 24 h
NH2
rac‐130
Umsatz[%]/ee(R)‐129 [%]
Umsatz[%]
80
44
60
ee(R)‐129
ee[%]
98
97
42
O
(R)‐129
9, 1 Äq.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
O
90
50
40
45
54
20
Reaktionstemperatur[°C]
Abbildung109. Racematspaltungvonrac‐130inAbhängigkeitderTemperaturbei24h.
NachdemdieStandardreaktions‐Bedingungenvon60°Cund4.5StundenfürdieenzymatischeRacemat‐
spaltungvonrac‐130zwarzueinemgutenUmsatzvon39%,jedochnurzueinemmäßigenEnantio‐
merenüberschussvon79%eeführten,solltenimAnschlussdaranweitereVariablen,wiedieAnzahlan
Äquivalenten des Acyldonors 9 oder die Zugabe von MTBE zum Reaktionsgemisch zur besseren
DurchmischungderKomponenten,getestetwerden(Abbildung110).Dieunterdenlösungsmittelfreien
StandardreaktionsbedingungenerhaltenenErgebnissedienendabeialsVergleichsreaktion.
DurchZugabevon1.5ÄquivalentendesMalonesters9kanneinnahezuvollständigerUmsatzmitsehr
hoherEnantiomerenreinheiterzieltwerden,waseinersehrgutenEnantioselektivitätvon61entspricht.
AlsVergleichwurdedieRacematspaltunginMTBEalsLösungsmitteldurchgeführt,die41%Umsatzmit
mäßigen70%ee(E=9)lieferte.EineVerlängerungderReaktionszeitauf24Stundenliefertebessere
Ergebnisse mit 52% Umsatz und 85% ee (E = 40). Eine Erhöhung der Menge an Acyldonor 9 auf
110
4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
5Äquivalente, ebenfalls in MTBE, führte zu 63% Umsatz zum Amid (R)‐129 und 76% ee. Dieses
entspricht einer Enantioselektivität von 14 und ist für eine effiziente Racematspaltung ungenügend.
Allerdings spielt bei 24Stunden Reaktionszeit die spontane chemische Acylierung von rac‐130 eine
tragendeRolle.
AuchbeidiesenAcylierungsreaktionensinddiegroßenSchwankungenderEnantioselektivitätennicht
aufFehlerwährendderDurchführungsowiederMessungenmittelsHPLCzuerklären.
O
+
O
CAL‐B
(40 mg/mmol)
O
O
Umsatz[%]
Umsatz[%]/ee(R)‐129 [%]
ee(R)‐129
ee[%]
79
80
70
46
49
83
76
63
70
50
91
90
60
O
(R)‐129
9, 1 ‐ 5 Äq.
100
O
N
H
60 °C, 4.5 ‐ 24 h
MTBE
NH2
rac‐130
O
52
46
40
30
20
10
0
1Äq.9
1.5Äq.9
1Äq.9,MTBE
9,
9,
5Äq.9,MTBE,
1Äq.9,MTBE,
9,
24h
24h
Reaktionsbedingungen
Abbildung110. VariationvonReaktionsbedingungenderAcylierungvonrac‐130.
ZusätzlichwurdederVerlustdesAminoindans(rac‐130)währendderAufarbeitungermittelt.Dabei
wurdenach15MinutenRührenbei550mbarund40°CnureinVerlustvon3%ermittelt,wasnochim
akzeptablenBereichliegt.
DiegezeigtenAcylierungsreaktionensindübereinenlängerenZeitraummitunterschiedlichenChargen
desAminsrac‐130durchgeführtworden.ZwarwareinFarbunterschiedvonfarblosbisgelbsowohl
zwischen den Chargen als auch während der Lagerung zu erkennen, jedoch sind in allen aufgenom‐
menen1H‐NMR‐SpektrendiegleichenPeaksvonVerunreinigungenmit<1–3%vorhanden.Somitkann
eineZersetzungdesEduktesrac‐130ausgeschlossenwerden.
Insgesamtlässtsichfolgern,dassbeiderenzymatischenRacematspaltungdesAminoindans(rac‐130)
dieVerwendungeinesleichtenÜberschussesdesAcyldonors9zueinemvollständigenUmsatzundsehr
guten91%ee(E=61)führt.Diesesscheintzunächstnachteiligzusein,allerdingskannderMalonester
9 bei größeren Reaktionsansätzen destillativ vom Rohprodukt abgetrennt und in weiteren Racemat‐
spaltungeneingesetztwerden.
111
4 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen 4.3.9.2
SekundäreAmine
Enantiomerenreine Amine sind wichtige Bausteine für pharmazeutische Wirkstoffe und Agro‐
chemikalien.EssindjedochnurwenigeMethodenzurRacematspaltungsekundärerAminebekannt.Der
StandderWissenschaftistdabeiaufChromatographiemitchiralenstationärenPhasenoderklassische
Racematspaltung durch Bildung von Diastereomerenpaaren beschränkt. Sekundäre Amine reagieren
aufgrundihrerstarkenNucleophilliemitdenAcyldonorenunterStandard‐Reaktionsbedingungen,wie
niedrige Temperaturen und Konzentrationen, meist nicht. Die Schwierigkeit bei der Acylierung
cyclischer sekundärer Amine liegt wahrscheinlich in der großen Anzahl an potentiellen Übergangs‐
zuständen sowie an den möglichen Konformationen, die energetische sehr ähnlich sind.[268] Bei der
RacematspaltungfindendabeiklassischLipasenausCandidarugosa[239]sowiedieCAL‐AausCandida
antarctica[28,269]Anwendung.
In dieser Arbeit sollten zunächst die Referenzverbindungen der ausgehend von 2‐ bzw. 3‐Methyl‐
piperidin(149bzw.150)synthetisiertwerden,umeineMethodefürdieHPLCzufinden.ImAnschluss
daransolltedieenzymatischeAcylierungmitMalonsäurediethylester(9)untersuchtwerden.
Die chemische Acylierung erfolgt im Fall der sekundären Amine 149 und 150 mit dem Acyldonor
Malonsäurediethylester(9)unterErhitzenzumRückflussfür3Stunden(Abbildung111).[253]DieAmide
rac‐151 und rac‐152 wurde mit Umsätzen von 56% bzw. 63% erhalten. Die isolierten Ausbeuten
betrugendabei41%fürrac‐151und42%fürrac‐152,wasfürdieAnalytikjedochausreichendwar.
Abbildung111.
SynthesederRacematerac‐151undrac‐152alsReferenzverbindungen.[253]
AnschließendkonntefürdieAmideeinegeeigneteMethodefürdieHPLCetabliertwerden.InAbbildung
112isteincharakteristischesHPLC‐ChromatogrammamBeispielvonrac‐152dargestellt.Deree‐Wert
desRacematesrac‐144beträgt<0.2%.
112
4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
(S)‐152
Flächenintegral:
49.9%
(R)‐152
Flächenintegral:
50.1%
Abbildung112. HPLC‐ChromatogrammdesracemischenAmidsrac‐152(gemessenanAD‐H‐Säule
mitn‐Heptan/i‐PrOH(95/5(v/v)),flow:0.8mL/min,Retentionszeiten:
tR=18.29min(R),19.68min(S),ee‐Wert:0%).
Durch Rühren bei vermindertem Druck konnte der Verlust der sekundären Amine 149 und 150
ermitteltwerden(Abbildung113).
NH
NH
149
150
Verlust150
Verlust138[%]
Verlust142[%]
Verlust149
100
Verlust[%]
80
64
60
43
40
27
21
20
15
6
0
5
10
15
Rührdauer[min]
Abbildung113. VerlustdersekundärenAmine149und150.
So wird mit kontinuierlicher Rührdauer ein größerer Verlust der Komponenten beobachtet. Nach
15MinutenwirdbeidemAmin149einVerlustvon64%undbei150von27%bestimmt.Infolgedessen
sollte während der Reaktionsführung besonders bei höheren Temperaturen auf ein dicht ver‐
113
4 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen schlossenes Reaktionssystem geachtet werden. Die Bestimmung des Umsatzes sollte aufgrund der
FlüchtigkeitderAmine149und150inBezugaufdenjeweiligenAcyldonorgeschehen.
Im Anschluss an die chemische Acylierung der sekundären Amine 149 und 150 wurden die enzy‐
matischeRacematspaltungmitMalonsäurediethylester(9)alsAcyldonorunterStandardbedingungen,
abweichend davon jedoch mit 24 Stunden Reaktionsdauer, durchgeführt. Die Ergebnisse sind in
Abbildung114graphischdargestellt.
O
NH
R2
O
+
O
O
R1
CAL‐B
(40 mg/mmol)
O
N
O
O
R2
60 °C, 24 h
R1
9, 1 Äq.
149: R1 = H, R 2 = Me
150: R1 = Me, R2 = H
151: R1 = H, R 2 = Me
152: R1 = Me, R2 = H
Umsatz[%]/ee[%]
Umsatz[%]
20
ee[%]
15
15
10
10
5
0
0
149
Amin
150
Abbildung114. EnzymatischeAcylierungungdersekundärenAmine149und150.
Die Acylierung des Amins rac‐149 mit Malonsäurediethylester (9) gelang unter den hier gewählten
Bedingungen nicht. Sterische Gründe könnten in diesem Fall eine wichtige Rolle spielen, da das in
2‐PositionmethylierteAmin149einenschlechtenZugangzuderAmino‐Funktionbietet.MitdemAmin
rac‐150konnten15%UmsatzzumAmid152erreichtwerden.Derermittelteee‐Wertbetrugnur10%,
waseinerEnantioselektivitätvon1entspricht.
ImAnschlussandieAcylierungsreaktionenunterStandard‐ReaktionsbedingungensolltenVersuchezur
Optimierung der enzymatischen Acylierung von 3‐Methylpiperidin (rac‐150) in Hinblick auf Umsatz
bzw. Enantioselektivität durchgeführt werden. Dabei wurden die Reaktionstemperatur sowie die
EnzymmengeunddieZugabevonMTBEalsLösungsmittelvariiert(Tabelle16).Sokonntemitsinkender
Temperatur ein Anstieg des Umsatzes von 5% bei 80 °C auf 19% bei 40 °C festgestellt werden. Die
VerlängerungderReaktionsdauerauf48StundenführtenurzueinemleichtenAnstiegdesUmsatzesauf
22% (Eintrag 6). Die Enantiomerenüberschüsse liegen dabei in allen Fällen bei 10%, was einer
Enantioselektivität von <2 entspricht. Die Zugabe von MTBE zur Reaktionsmischung bei 60 °C
(Eintrag3) führte zu einerVerdopplungdes Umsatzes auf 34%, jedochkaumzueiner Erhöhungdes
ee‐Wertes.DiezusätzlicheErhöhungderEnzymmengeauf80mg/mmolliefertedasAmid152in75%
Umsatz,aberauchindiesemFalllagderee‐Wertnurbei18%.ZwargelingeineRacematspaltungvon
rac‐150mitderLipaseCAL‐Bnicht,jedochkannauchindiesemFalldieLipasealsBiokatalysatorfür
114
4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
die Darstellung des racemischen Amids rac‐152 dienen, da hierbei auf das Erhitzen zum Rückfluss
verzichtetwerdenkann.
Tabelle16.
ProzessoptimierungderenzymatischenRacematspaltungvonrac‐150.
Eintrag
MTBE[mL]
T[°C]
Umsatz[%]
ee[%]
E
1
2
3
4a)
5
6b)
‐
‐
0.1
0.1
‐
‐
80
60
60
60
40
40
5
15
34
75
19
22
10
10
13
18
11
10
<2
1
<2
2
<2
<2
a)CAL‐B:80mg/mmol,b)Reaktionsdauer:48h.
ZusätzlichzumVersuchderProzessoptimierungwurdedieparallelablaufendechemischeAcylierung
des sekundären Amins 150 bei unterschiedlichen Reaktionstemperaturen untersucht (Tabelle 17).
DabeikonntebeiallenTemperaturendieBildungdesAmidsrac‐152mitbiszu9%Umsatzbei60°C
und 24 Stunden Reaktionszeit beobachtet werden. Die ee‐Werte betrugen erwartungsgemäß <1%.
DiesesErgebnisweichtvonderchemischenAcylierungmitrac‐4alsAminab(vergl.Abschnitt4.3.4.1.1),
beiderkeinUmsatzzumentsprechendenAmiderhaltenwurde.DieseswirdmitderstärkerenNucleo‐
philiedessekundärenAminsrac‐150begründet.
Tabelle17.
ParallelablaufendechemischeAcylierungvonrac‐150.
Eintrag
T[°C]
t[h]
Umsatz[%]
ee[%]
E
1
2
3
80
60
40
24
24
48
5
9
6
n.b.
0
<1
n.b.
0
1
n.b.=nichtbestimmt.
115
4 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen 4.3.10
ɛ–Caprolacton(3)alsAcyldonor
4.3.10.1
ChemischeAcylierungmitɛ–Caprolacton(3)
In dem ersten Teil dieser Arbeit (vergl. Abschnitt 3.3) wurde die enzymatische Herstellung von
ɛ‐Caprolacton (3) beschrieben. Im Folgenden wurde nun die Fähigkeit des Lactons 3 zur Racemat‐
spaltung von Aminen wie 1‐Phenylethylamin (rac‐4) näher untersucht. Dafür wurden die Referenz‐
verbindungenchemischhergestelltsowiedieStabilitätdesLactons3ermittelt.ImAnschlusswurdedie
enzymatischeAcylierungderAminedurchgeführtundderTemperatureffektuntersucht.
Als Vorbereitung der Acylierungsreaktionen wurde zunächst die Stabilität von ɛ–Caprolacton (3)
untersucht. Dazu wurde das Lacton 3 in An‐ und Abwesenheit der CAL‐B bei 60 °C für 24 Stunden
gerührt(Tabelle18).ImFallderCAL‐BerfolgtzusätzlicheineAufarbeitungnachAAV6.DieAnsätze
wurdenmittels1H‐NMR‐Spektroskopieuntersucht.
Tabelle18.
BestimmungderStabilitätvonɛ–Caprolacton(3).
Eintrag
Bedingungen
Verhältnis3/146
1
RührenohneCAL‐B
RührenmitCAL‐Bund
AufarbeitungnachAAV6
100:0
2
1:77
So wird nach 24 Stunden Rühren in Abwesenheit der Lipase nur das reine Lacton 3 im 1H‐NMR‐
Spektrumerhalten.InAnwesenheitderCAL‐BmitanschließenderAufarbeitungmittelsFiltrationund
SpülenmitorganischenLösungsmittelnwerdenjedochnurnochSpurendesLactons3gefunden.Den
größtenAnteilderMischungmachtdieentsprechendeHydroxysäure54aus,diedurchdieSpaltungdes
Lactons3gebildetwird.FürdieSpaltungdesLactons3kanndiebereitsinSpurenvorhandeneSäure54
undzumanderendieLipaseselbstverantwortlichsein..FürdieReaktionsführungistdiesesjedochnicht
vonNachteil,dainderLiteraturCarbonsäurenbereitsmehrfacherfolgreichalsAcyldonoreneingesetzt
wordensind.[250,251]
DiechemischeAcylierungdesAminsrac‐4mitdemAcyldonorɛ‐Caprolacton(3)erfolgtunterErhitzen
zumRückflussfür4Stunden(Tabelle19,Eintrag1).[253]DasAmidrac‐147wurdedabeimit62%Umsatz
erhalten, was für die Analytik jedoch ausreichend war. Zusätzlich wurden auf gleichem Wege
AcylierungsreaktionendersekundärenAmine142und143durchgeführt(Eintrag2und3).Dieent‐
sprechendenAmidekonntendabeinurmitgeringenUmsätzenvon7bzw.17%erhaltenwerden.
116
Tabelle19.
4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
ChemischeAcylierungsreaktionenmitɛ–Caprolacton(3).[253]
O
NH2
HN
O
rac‐4
oder
+
NH
OH
4
153
O
oder
180 °C, 4 h
O
3, 1 Äq.
N
R2
4
OH
R2
R1
R1
149 (R1 = H, R 2 = Me)
150 (R1 = Me, R 2 = H)
154 (R1 = H, R 2 = Me)
155 (R1 = Me, R2 = H)
Eintrag
Amin
Umsatz[%]
1
2
3
rac‐4
149
150
62
7
17
Anschließend konnte für das Amid rac‐153 eine geeignete Methode für die HPLC gefunden werden
(Abbildung115).DasAmid153wurdealsRacematmit0%eeerhalten.DieEtablierungeinerHPLC‐
MethodefürdieAmide154und155gelangnichtaufgrunddergeringenSubstanzmengenicht.
O
HN
(R)‐153
Flächenintegral:
49.9%
4
OH
(S)‐153
(S)‐147
Flächenintegral:
Flächenintegral:
50.1%
50.1%
Abbildung115. HPLC‐Chromatogrammvonrac‐153(gemessenanAD‐H‐Säulemitn‐Heptan/i‐PrOH
(95/5(v/v)),flow:0.8mL/min,Retentionszeiten:tR=32.21min(R),39.69min(S),
ee‐Wert:0%).
117
4 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen 4.3.10.2
EnzymatischeAcylierungvonBenzylamin(134)mitɛ‐Caprolacton(3)
ImAnschlussandieBestimmungderStabilitätdesLactons3solltezunächstdessenAktivitätuntersucht
werden,bevorVersuchezurSelektivitätdurchgeführtwerden.DafürwurdedieseszunächstmitBenzyl‐
amin(134)alsModel‐SubstratunterStandardbedingungenenzymatischumgesetzt(Abbildung116).
Da es sich bei dem Amin 134 nicht umeine racemische Verbindung handelt isthier von einem voll‐
ständigen Umsatz auszugehen. Im 1H‐NMR‐Spektrum konnte allerdings nur ein Umsatz von 46%
bezogenaufdasAmin130nachgewiesenwerden.AuchindiesemFallistetwaeinDritteldesLactons3
zur Säure 54 gespalten worden. Wird der Umsatz zum Amid 156 auf die Summe der Integrale des
Lactons 3 und der Säure 54 bezogen, so ergibt sich ein Umsatz von 44%. Während der Reaktions‐
führungundderAufarbeitungtrittdemnachkeinVerlustderKomponentenauf.
Abbildung116. EnzymatischeAcylierungvonBenzylamin(130)mitɛ‐Caprolacton(3).
Durch Variation der Temperatur sollte die enzymatische Acylierung in Hinblick auf eine mögliche
Umsatzsteigerung untersucht werden (Tabelle 20). So wurden bei 80 °C Reaktionstemperatur 51%
UmsatzzumAmid156erreicht.DurchZugabevonMTBEalsorganischesLösungsmittelbei80°Ckonnte
eineUmsatzsteigerungauf65%erzieltwerden.Erfreulicherweisekonntenbereitsbei20°CReaktions‐
temperatur nach 4.5 Stunden 57% Umsatz erhalten werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine
Erhöhung der Temperatur auf 80 °C keinen positiven Einfluss auf die enzymatische Acylierung des
Benzylamins134hat.
Tabelle20.
Prozessoptimierung der enzymatischen Racematspaltung von Benzylamin (134) mit
ɛ‐Caprolacton(3).
Eintrag
MTBE[mL]
T[°C]
t[h]
Umsatz[%]
1
2
3
‐
0.5
‐
80
80
RT
4.5
4.5
4.5
51
65
57
Die parallel ablaufende chemische Acylierung des Amins 134 mit dem Lacton 3 wurde bei unter‐
schiedlichen Temperaturen untersucht (Tabelle 21). Bei 80 °C Reaktionstemperatur können in Ab‐
wesenheitderLipasenoch30%UmsatzzumAmiderzieltwerden.MitsinkenderTemperatursinktder
118
4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
Umsatz, bis schließlich bei 0 °C nur noch 3% Amid 156 gebildet werden. Durch Verlängerung der
Reaktionszeitauf24Stundenbei20°C(Eintrag4)werdennoch53%Umsatzerhalten.
Tabelle21.
ParallelablaufendechemischeAcylierungvonBenzylamin(134)mitɛ–Caprolacton(3).
Eintrag
T[°C]
t[h]
Umsatz[%]
1
2a)
3
4
5
80
60
RT
RT
0
4.5
4.5
4.5
24
4.5
30
69
12
53
3
a)VerwendungeineraltenChargeanɛ–Caprolacton(3).
DurchVerwendungeinerälterenChargedesLactons3(Eintrag2),inderlaut 1H‐NMR‐Spektroskopie
bereits17%desLactons3währendderLagerungzurentsprechendenSäure54gespaltenwordensind,
konnten bei 60 °C und 4.5 Stunden Reaktionszeit 69% Umsatz zum Amid 156 erhalten werden.
CarbonsäurenwerdenseltenalsAcyldonorenverwendet,daeinereversibleSalzbildungmitdemAmin
stattfindet.[250] Dieses unreaktive Salz ist nicht mehr für die Bildung des Acyl‐Enzym‐Komplexes
vorhanden.SomitstehtnureinTeilderSäurealsAcyldonorzurVerfügung,waszueinerverringerten
Reaktionsgeschwindigkeitführt.UnaktiviterteCarbonsäurenbenötigenfolglicheinKupplungsreagenz
zurAktivierungundhäufigdrastischeReaktionsbedingungen,ummiteinemAmineineAmid‐Bindung
zubildenunddieBildungdesentsprechendenSalzeszuvermeiden.[270]DieWahrscheinlihckeiteiner
Acylierungsreaktions durch die Säure 54 als Acyldonor ist unter den verwendeten Reaktionsbedin‐
gungen demnach sehr gering. Durch die Wahl einer möglichst kurzen Reaktionsdauer und niedriger
TemperaturkanndieunkatalysierteAcylierungdesAmins134somitunterdrücktwerden.Dascyclische
Lacton3ist,eventuelldurchdieRingspannung,sehrstarkaktiviert,sodassbeidenfolgendenAcylie‐
rungendesracemischenAminsrac‐4aufeineVermeidungderchemischenAcylierunggeachtetwurde.
4.3.10.3
EnzymatischeAcylierungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)mitɛ–Caprolacton(3)
ZunächstwurdedieMöglichkeiteinerparallelzuderenzymatischenablaufendechemischeAcylierung
des Amins rac‐4 mit dem Lacton 3 untersucht. Dazu wurden die beiden Komponenten bei unter‐
schiedlichenTemperaturenfür4.5StundeninAbwesenheitderLipasegerührt.DieErgebnissesindin
Abbildung117graphischdargestellt.Sokannbei80°CnocheinUmsatzzumAmid157von10%erzielt
werden. Mit sinkender Temperatur nimmtauchder Umsatz ab, bisbei 0 °C keinAmid157 mehr im
1H‐NMR‐Spektrumdetektiertwerdenkann.
119
4 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen O
O
NH2
+
rac‐4
HN
O
4
0 ‐ 80 °C, 4.5 h
OH
rac‐157
3, 1 Äq.
Umsatz[%]
Umsatz[%]
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
10
80
4
2
1
60
40
20
0
0
Temperatur[°C]
Abbildung117. ParallelablaufendechemischeAcylierungvonrac‐4mitɛ–Caprolacton(3).
DieenzymatischeAcylierungvonrac‐4mitɛ–Caprolacton(3)alsAcyldonorwurdeimAnschlussbei
unterschiedlichen Temperaturen und Reaktionszeiten untersucht (Abbildung 118). Mit sinkender
TemperaturnimmtderUmsatzbei4.5StundenReaktionsdauerab.Sowirdbei80°CeinUmsatzvon
49%erzielt,währendbei20°Cnoch26%UmsatzzumAmid157erhaltenwird.Zusätzlichwurdeder
Effekt der Verlängerung der Reaktionsdauer bei 60 °C untersucht. Dabei wurde mit andauernder
ReaktionszeiteineleichteSteigerungdesUmsatzesvon41%bei4.5Stundenauf45%beiachtStunden
beobachtet. Die ee‐Werte aller Acylierungsreaktionen zum Amid rac‐157 betrugen hierbei 0%. Des
WeiterenkönnenbeieinemenzymatischenAnsatzbiszu10%desentstandenenAmids157bei80°C
Reaktionstemperaturundbiszu4%bei60°CparallelaufchemischemWegemit0%eegebildetwerden.
Diesesbedeutet,dassdieLipasedasLacton3nichtspezifischumsetzenkannundeineRacematspaltung
desAminsrac‐4durchdasLacton3demnachnichtmöglichist.DieDarstellungdesAmidsrac‐157sollte
hierbeijedochmitvollständigemUmsatzablaufen,dadiefürdieRacematspaltungtypischeGrenzevon
maximal50%UmsatzimFalldesLactons3alsAcyldonornichtrelevantist.DasLacton3eignetsich
allerdings sehr gut zur Synthese von Amiden. Diese Art der Acylierung kann eventuell als Starter‐
ReaktionfürdiePolymerisationdesLactons3zuPolycaprolacton(PCL)dienen.[271]
120
4
O
NH2
O
+
rac‐4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
O
CAL‐B
(40 mg/mmol)
HN
4
T, t
3, 1 Äq.
rac‐157
Umsatz[%]
OH
ee[%]
eerac‐157
Umsatz[%]/eerac‐157 [%]
100
90
80
70
60
49
50
45
43
41
40
26
25
30
20
10
0
0
0
0
0
0
0
80°C,4.5h,
MTBE
60°C,4.5h
60°C,6h
60°C,8h
40°C,4.5h
20°C,4.5h,
MTBE
Reaktionsbedingungen
Abbildung118. TemperaturabhängigkeitderenzymatischenRacematspaltungvonrac‐4mit
ɛ‐Caprolacton3.
ImAnschlusswurdedieReaktionskinetikderenzymatischenAcylierungvonrac‐4mitɛ–Caprolacton
(3) untersucht. Dafür wurden die Acylierungen unter Standard‐Reaktionsbedingungen durchgeführt.
DieErgebnissesindinAbbildung119graphischdargestellt.Esistzuerkennen,dassdieReaktionzu
Beginn mit einer relativ niedrigen Geschwindigkeit startet, da nach zwei Stunden erst 20% Umsatz
erreichtwordensind.DanachverläuftdieAcylierungnahezulinear,bisnach24Stunden65%Umsatz
zumAmid157erhaltenwerden.Dieee‐WertedieserAcylierungsreaktionenbetrageninallenFällen0%,
was in Analogie zu den Ergebnissen in den Abschnitten 4.3.10.3 steht. Da die Reaktion nur zum
racemischenProdukt157führt,solltehierbeimitlängererReaktionsdauerallerdingseinvollständiger
Umsatzerzieltwerden.
121
4 EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen Umsatz[%]
ee[%]
eerac‐157
100
Umsatz[%]/eerac‐157 [%]
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
5
10
15
Reaktionszeit[h]
20
25
Abbildung119. ReaktionskinetikderenzymatischenAcylierungvonrac‐4mitdemLacton3.
Zwar gelingt mit ɛ–Caprolacton (3) als Acyldonor keine Racematspaltung des Amins rac‐4, jedoch
beschleunigtdieAnwesenheitderCAL‐BdieAcylierungsreaktionbei60°Cund4.5StundenReaktions‐
dauerumdaszehnfache.SowerdenohneCAL‐B4%UmsatzzumRacemat157erhalten(vgl.Abbildung
118), während in Anwesenheit des Biokatalysators 41% Umsatz erzielt werden können. Da keine
Nebenprodukte gebildet werden, erfolgt die Aufreinigung durch Abtrennen der nicht‐umgesetzten
Edukte.DieSynthesevonracemischenAmidenkannsomitmittelsEnzymkatalysebereitsbeiniedrigen
TemperaturenohneweitereZugabevonZusätzenerfolgen.WirdbeispielsweiseeineCarbonsäureals
Acyldonoreingesetzt,soistdieZugabevonDicyclohexylcarbodiimid(DCC)alsKondensationsprodukt
beihohenTemperaturennotwendig(Abbildung120).BeiderVerwendungvonEsternalsAcyldonoren
ist,wieimAbschnitt7.2.2.1beschrieben,dasErhitzenzumRückflusserforderlich.
Abbildung120. ChemischeAmidbildungmitDCC.
Die Bildung eines Amids mit ɛ–Caprolacton (3) als Acyldonor mittels Lipasen‐Katalyse kann als
Initiationsreaktion für die Polymerisation zum Polycaprolacton (PCL) dienen, was in der Literatur
bereits mit anderen Lipasen beschrieben wurde. Im Anschluss an den Kettenstart findet dann das
122
4
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminen
Kettenwachstum durch ringöffnende Polymerisation statt, was ebenfalls durch die Lipase katalysiert
werdenkann.[271]
4.3.10.4
EnzymatischeAcylierungvonsekundärenAminenmitɛ‐Caprolacton(3)
Im Anschluss an die chemische Darstellung der Amide 154 bzw. 155 wurden die entsprechenden
sekundären Amine 149 und 150 enzymatisch unter Standard‐Reaktionsbedingungen umgesetzt
(Tabelle 22). So konnte mit beiden Aminen nur 9% Umsatz zu den jeweiligen Amiden 154 und 155
erzieltwerden.DieAcylierungsreaktionendersekundärenAmine149und150liefernunterlösungs‐
mittelfreienBedingungensomitungenügendeUmsätzevon7bzw.9%.DurchZugabevonMTBEzudem
Reaktionsgemisch(Eintrag3)zurbesserenDurchmischungderKomponentenkonnteeineSteigerung
desUmsatzesauf18%erreichtwerden.DieenzymatischeAcylierungderin2‐Positionsubstituierter
sekundärerAminegelingtdemnachnicht.
Tabelle22.
EnzymatischeAcylierungdersekundärenAmine149und150mitɛ‐Caprolacton(3).
Eintrag
Amin
MTBE[mL]
Umsatz[%]
1
2
3
149
150
150
‐
‐
0.1
7
9
18
123
124
5
Zusammenfassung
5
Zusammenfassung
ZielderArbeitwares,effizienteundnachhaltigeSyntheseroutenvonɛ–Caprolacton(3)undchiralen
Aminenzuetablieren.InnerhalbdieserArbeitkonntezumeinendieenzymatischeDoppeloxidationvon
Cyclohexanol(1)zumLacton3unterVerwendungderCHMOausAcinetobactercalcoaceticussowiedie
Lk‐ADHausLactobacilluskefirerfolgreichdurchgeführtwerden.DieSynthesewurdeinBezugaufihre
Effizienz optimiert. Zum anderen stand besonders die enzymatische Racematspaltung von chiralen
AminendurchdieVerwendungvonLipaseBausCandidaantarctica(CAL‐B)ineinemlösungsmittel‐
freienSystemimFokusderUntersuchungen.
5.1
EnzymatischeOxidationvonCyclohexanol(1)mittels
CHMO
DiezweistufigebiokatalytischeOxidationvonCyclohexanol(1)zuε–Caprolacton(3)mittelsADHaus
LactobacilluskefirsowieeinerCyclohexanon‐MonooxygenaseausAcinetobactercalcoaceticusüberdas
insitu‐gebildeteCyclohexanon(2)alsZwischenstufewurdeeingehenduntersucht.
EinleitendwurdenzweiMethodenzurzuverlässigenUmsatzbestimmungetabliert,dieVerwendungvon
Urotropin(51)alsexternerStandardfür 1H‐NMR‐SpektroskopiesowiedieAnalytikmittelserstellter
EichgeradedurchGaschromatographie.BeimVergleichderbeidenMethodenhatsichgezeigt,dassdie
GC‐MethodehöhereUmsätzeundgeringereSchwankungsbreitenliefert,dadieseMethodebesonders
bei geringen Konzentrationen sensibler reagiert und der Schritt des Entfernens des Lösungsmittels
entfällt.AusdiesemGründenwardieAnalytikmittelsGCdieMethodederWahl.
AnschließendwurdendieRückgewinnungsratendereinzelnenSubstanzenbestimmt.Diesesindsowohl
von der eingesetzten Enzymmenge als auch von der Zentrifugierzeit während der Aufarbeitung
abhängig. Bei steigender Konzentration des Substrats Cyclohexanol (1) wurde ein Anstieg der Rück‐
gewinnungsratevon71–80%auf90–97%beobachtet.ZusätzlichkonntediezuvorimArbeitskreis
verwendete Extraktionsmethode mittels EPPENDORF‐Gefäßen optimiert und dadurch der Verlust der
Substanzenverringertwerden.
ZunächstwurdediespezifischeAktivitätderhierverwendetenCHMObezüglichCyclohexanon(2)als
SubstratbestimmtundmitweiterenBVMOs,ECSMo‐03undECSMo‐05vonENZYMICALSAG,verglichen.
Dazu wurden zum einen die volumetrischen Aktivitäten mittels Photometertest bestimmt und zum
anderen BRADFORD‐Tests durchgeführt, um den jeweiligen Proteingehalt der Enzyme zu ermitteln.
Dadurch konnten die spezifischen Aktivitäten der drei Monooxygenasen berechnet werden. Die
spezifische Aktivität derCHMO wurde gleich 100% relative Aktivität gesetzt. Die beiden BVMOs ECS
Mo‐03 und ECS Mo‐05 wiesen spezifische Aktivitäten von 0.2 U/mg bzw. 0.05 U/mg auf. Dieses
125
5 Zusammenfassung
entsprichtrelativenAktivitätenvon7%bzw.2%.FolglichsinddiebeidenMonooxygenasennichtfähig,
Cyclohexanon(2)effektivzuoxidieren.
DesWeiterenwurdedieAktivitätderEnzymegegenüberdenReferenz‐Substanzensowiegegenüber
weiterenSubstratenphotometrischbestimmt.DieCHMOwiesbezüglichCyclohexanon(2)eineAktivität
von0.082U/mL,wasgleich100%relativerAktivitätgesetztwurde.GegenüberdemSubstratIsophoron
(52)besitztdieCHMOeinerelativeAktivitätvonnur3%.SokonntebeiderbiokatalytischenOxidation
von Isophoron(52) mit dem D‐Glucose (48‐a)/GDH‐Regenerationssystem kein Umsatz festgestellt
werden. Unter den in dieser Arbeit gewählten Reaktionsbedingungen ist diese Aktivität nicht aus‐
reichendfüreineökonomischsinnvolleOxidation.
DieAktivitätderLk‐ADHwurdegegenüberdemStandard‐Substrat1‐Phenylethanol(47)bestimmtund
gleich 100% relative Aktivität gesetzt. Im Vergleich dazu wurde gegenüber Cyclohexanol (1) und
3,3,5‐Trimethylcyclohexanol(53)einerelativeAktivitätvon153%bzw.0%bestimmt.Währendsich
Cyclohexanol(1)demnachhervorragendalsSubstratfürdieOxidationdurchdieLk‐ADHeignet,liefert
die enzymatische Doppeloxidation des dreifach methylierten Alkohols 53 unter den Standard‐Reak‐
tionsbedingungenkeinLacton56oder57.
Im Anschluss wurde die Standard‐Reaktion in Hinblick auf Produktinhibierung der CHMO optimiert,
indemunterschiedlicheorganischeLösungsmittelineinemZweiphasensystemgetestetwurden.Dabei
zeigtesicheinGemischausKPi‐Pufferund10%Isooctan(v/v)alsbestesLösungsmittel.Dieseslieferte
einensehrgutenUmsatzvon87%(Abbildung121).AllgemeinkönnenmitLösungsmittelnmithöheren
logP‐WertenauchhöhereUmsätzeerzieltwerden.
Abbildung121. EnzymatischeDoppeloxidationvonCyclohexanol(1)mit10%(v/v)Isooctan.
AußerdemwurdensowohlderEinflussderMengenderLk‐ADHunddesCofaktorssowiederReaktions‐
temperatur untersucht. Bei der Erhöhung der Cofaktormenge von 1 auf 10mol‐% sinkt der Umsatz
dabei um ein Drittel. Einen noch stärkeren negativen Einfluss haben die Verringerung der Lk‐ADH‐
Mengevon40auf13UsowiedieErhöhungderReaktionstemperaturvonRTauf30°C.
Es konnte nachgewiesen werden, dass selbst bei sehr hohen Produktkonzentrationen von 1 M keine
ProduktinhibierungderLk‐ADHauftritt.AllerdingswurdemittelsTitrino‐Apparaturdiehydrolytische
SpaltungdesLactons3zurentsprechendenSäure54beobachtet.
Dieinsitu‐ProduktentfernungmittelsAdsorberharzengelangmitdenfürdieseArbeitgewähltenHarzen
nicht.AuchdieRückgewinnungsratederSubstanzenausdenHarzendurchextraktiveAufarbeitungist
126
5
Zusammenfassung
mitmaximal74%nurmäßig.EventuellkanndurcheinScreeningweitererHarzeeinfürdiesesSystem
effizienteresgefundenwerden.
5.2
EnzymatischeRacematspaltungchiralerAmine
Als einleitende Versuche zur Racematspaltung wurden enzymatische Acylierungsreaktionen substi‐
tuierter Benzylamine mit Malonsäurediethylester (9) als Standard‐Acyldonor in Abwesenheit von
organischen Lösungsmitteln durchgeführt (bildung 122). Als Biokatalysator fand die immobilisierte
Lipase B aus Candida antarctica (CAL‐B, Handelsname: Novozym 435) Anwendung, die sich in der
Literatur als hochselektives Enzym erwiesen hat.[27–29] Die zuvor in der Literatur[33–35] verwendeten
Benchmark‐Bedingungen konnten dabei optimiert werden. So wurde die Reaktionstemperatur von
80°Cauf60°Cbei4.5StundenReaktionszeitinlösungsmittelfreierUmgebunggesenkt,ohneVerluste
beimUmsatzzubeobachten(Abbildung122).
9,1Äq.
R
NH2
CAL‐B
O
R
N
H
80°C
4.5h
UmsatzAmid[%]
Umsatz[%]/Ausbeute[%]
O
O
+
R
N
H
UmsatzDiamid[%]
9
134
R
95
84
38
N
H
AusbeuteAmid[%]
95
91
O
137 (R=H)
142 (R=OH)
144 (R=OMe)
146 (R=Br)
133 (R=H)
141 (R=OH)
143 (R=OMe)
145 (R=Br)
134 (R=H)
138 (R=OH)
139 (R=OMe)
140 (R=Br)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
O
81
35
17
138
5
5
139
140
Amin
Abbildung122. EnzymatischenAcylierungsubstituierterBenzylamine.
Diese Reaktionsbedingungen wurden als Standard‐Reaktionsbedingungen definiert. Es zeigte sich
zudem,dassdieAnwesenheiteineselektronenziehendenSubstituenteninmeta‐Positioneinenleichten
positivenEinflussaufdenUmsatzhat.AllerdingskonnteeineparallelablaufendechemischeAcylierung
zumentsprechendenAmidmitbiszu8%nachgewiesenwerden.DieBildungderDiamide,bestehend
127
5 Zusammenfassung
ausMalonsäurediethylester(9)undzweiÄquivalentensubstituiertenBenzylamins,wurdeinnahezu
allenFällennachgewiesen.DurchEinsatzeinesleichtenÜberschusses(1.2Äquivalente)anMalonester
9konntedieBildungausgehendvonMethoxy‐Amin139nahezuunterdrücktwerden.Dabeiistaller‐
dings ein leichter Abfall des Umsatzes von 91% auf 82% zu beobachten. Bei der Verwendung des
Hydroxy‐substituiertenBenzylamins134warjedochaufgrunddeshohenSchmelzpunktesderEinsatz
vonLösungsmitteln notwendig, umdieHomogenitätder Mischung zu gewährleisten.Von den unter‐
suchtenunterschiedlichenLösungsmittelnliefertenTHF(75%Umsatzbei80°CReaktionstemperatur)
und2‐Methyl‐THF(70%Umsatzbei80°C)diebestenErgebnisse.
Die enzymatische Racematspaltung von racemischen Aminen unter lösungsmittelfreien Bedingungen
konnteanschließendanhanddesSystemsaus1‐Phenylethylamin(rac‐4)undMalonsäurediethylester
(9) zum enantiomerenreinen Amid rac‐10 untersucht werden (Abbildung 123). Dabei wurde der
EinflussvonTemperaturundReaktionsdauersowiederEnzymbeladunguntersuchtunddieReaktions‐
kinetik unter den optimierten Bedingungen dokumentiert. Das Amid rac‐10 konnte dabei mit 42%
Umsatzundmit97%Enantiomerenreinheiterhaltenwerden,waseinerexzellentenEnantioselektivität
von>100entspricht.EineVerlängerungderReaktionszeitauf24Stundenbei60°CReaktionstempe‐
ratur führte zu einem vollständigen Umsatz zum Amid (R)‐10 mit 98% ee. Eine parallel ablaufende
chemischeAcylierungwurdebeirac‐4mitdemMalonester9alsAcyldonornichtbeobachtet.
Abbildung123. EnzymatischeRacematspaltung(Benchmark‐Reaktion).
EinVergleichdiesesVerfahrensmitbestehendenindustriellenProzessen[30,264]zeigte,dassdieRacemat‐
spaltung des chiralen Amins rac‐4 unter den in dieser Arbeit gewählten lösungsmittelfreien Bedin‐
gungenEnantioselektivitätendergleichenGrößenordnungliefert.WährenddasinderLiteratur[30]ver‐
wendeteMethoxyessigester11152%Umsatzund95%ee(E>100)lieferte,gelangdieRacematspal‐
tung unter den gleichen in der Industrie verwendeten Bedingungen mit Malonester 9 als Donor das
Amid (R)‐10 mit 48% Umsatz und ebenfalls 95% ee (E>100). Die Racematspaltung unter den im
Rahmen dieser Arbeit gewählten Bedingungen lieferte eine Enantioselektivität von >100. Die
verwendete größere Enzymmenge und höhere Temperatur wird folglich durch Vermeidung von
Lösungsmittel und viel kürzerer Reaktionszeit ausgeglichen. Der in dieser Arbeit etablierte lösungs‐
mittelfreieProzessstelltsomiteinesehrguteAlternativezubestehendenVerfahrendar.
Bei den anschließend durchgeführten Recyclingversuchen der Racematspaltung von rac‐4 mit
Malonester9 durch die immobilisierten CAL‐B (Novozym 435) konnte ein deutlicher Abfall des Um‐
satzesimVerlaufderRecyclingschrittebeobachtetwerden(Abbildung124).NachdemzweitenRecyc‐
lingschritt wurden nur noch 30% und im dritten bis fünften Durchgang nur 20‐24% Umsatz zum
128
5
Zusammenfassung
entsprechenden Amid (R)‐10 gefunden. Die ee‐Werte der einzelnen Durchgänge blieben allerdings
konstant hoch. Dieses Verhalten ist auf die Instabilität des Biokatalysators in lösungsmittelfreier
UmgebungzurückzuführenundstehtinAnalogiezurLiteratur.[36]
ee(R)‐10
ee[%]
Umsatz[%]/ee[%]
Umsatz[%]
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
92
89
94
90
87
43
30
1
2
25
3
Zyklus
20
4
24
5
Abbildung124. Enzymrecycling.
In einem breiten Enzym‐Screening aus 23 Lipasen konnte sowohl die CAL‐B aus Candida antarctica
(Novozym 435) als auch zwei Formen der CAL‐B der Firma C‐LECTA, in immobilisierter und lyophi‐
lisierterForm,alsdieeffektivstenLipasenbeiderAcylierungderBenzylamine134und138sowieder
Racematspaltung vonrac‐4 nachgewiesen werden. Bei Titrationsuntersuchungenwiesen die Lipasen
von C‐LECTA68%bzw.1000%relativeAktivitätinBezugaufNovozym435auf.BeipräparativenVer‐
suchenjedochzeigtenurdieimmobilisierteLipasevonC‐LECTAsehrguteErgebnisse(52%Umsatz,96%
ee). Die lyophilisierte CAL‐B lieferte unter optimierten Bedingungen (5fache Enzymmenge) nur 26%
Umsatz.DieimmobilisierteCAL‐Bvon C‐LECTAstelltsomiteinweiteresWerkzeugzurenzymatischen
RacematspaltungvonAminendar.
DieUntersuchungzurVerwendungalternativerAcyldonorenerfolgteinHinblickaufeineVerbesserung
derRacematspaltungmitderimmobilisiertenCAL‐B(Novozym435).DieunterStandard‐Bedingungen
enzymatisch dargestellten Amide wiesen sehr unterschiedliche Enantiomerenüberschüsse auf. So
konntenurmitdemliteraturbekannten[229]Methoxyessigester11192%eeerzieltwerden.Racemat‐
spaltungenmitweiterengetestetenAcyldonorenführtenzuee‐Wertevon10–65%,sodassdieseunter
den gewählten Standard‐Bedingungen eine effiziente Racematspaltung nicht stattfindet. Bei den teil‐
weisesehrreaktivenAcyldonorenkonnteeineparallelablaufendechemischeAcylierungnachgewiesen
werden.SowurdemitVinylessigester125inAbwesenheitderLipasebereitsbei40°C81%Umsatzzum
entsprechenden racemischen Amid erzielt. Durch diese Hintergrundreaktionen werden die ee‐Werte
derRacematspaltungenverringert.DasbereitsinderArbeitsgruppeetablierte[33,34]undindieserArbeit
alsStandard‐AcyldonorverwendeteMalonsäurediethylester(9)stelltesichauchinlösungsmittelfreier
UmgebungalsdereffektivsteDonordar.
ZumdirektenVergleichderAcyldonorenuntereinanderwurdenReaktionskinetikenderenzymatischen
Acylierungvonrac‐4unterlösungsmittelfreienStandard‐Bedingungenaufgenommen(Abbildung125).
129
5 Zusammenfassung
Phenoxyessigester122zeigtzwareinenschnellenReaktionsverlauf,jedochwerdennach24Stunden
68% Umsatz erhalten. Dieses übersteigt den theoretischen Umsatz einer Racematspaltung von 50%.
Methoxyessigester111weistzuBeginnderReaktioneinehoheReaktionsrateauf,allerdingsstagniert
diese bereits nach etwa 0.5 Stunden. Die Acyldonoren 9 und 124 zeigen zunächst ein ähnliches
Verhalten,allerdingswirdnurmitMalonsäurediethylester(9)einvollständigerUmsatzmitsehrguten
EnatiomerenüberschüssenundE‐Wertenvon>100erreicht.FürRacematspaltungeninlösungsmittel‐
freienSystemenistMalonsäurediethylester(9)folglichderAcyldonorderWahl.
O
NH2
CAL‐B
(40 mg/mmol)
O
+
rac‐4
R
O
Umsatz[%]
100
R'
60 °C, 4.5 h
R'
9 (R = Et, R' = CH2COOEt)
122 (R =Et, R' = CH2 OPh)
124 (R = Et, R' = CH2 CN)
111 (R = Et, R' = CH2 OMe)
96
HN
(R)‐10 (R' = CH2 COOEt)
(R)‐121 (R' = CH2 OPh)
(R)‐123 (R' = CH2 CN)
(R)‐8 (R' = CH2 OMe)
ee[%]
E‐Wert
107
92
Umsatz[%]/ee[%]/
E‐Wert
90
80
68
70
57
60
50
48
43
31
40
30
16
20
22
10
1
10
0
(R)‐10
(R)‐10
(R)‐121
(R)‐121
(R)‐123
(R)‐123
(R)‐8
(R)‐8
Amid
Abbildung125. VergleichderAcyldonorennach4.5StundenReaktionszeit.
ZurUntersuchungdesSubstratspektrumswurden1‐Aminoindan(rac‐130)undsekundäreAminemit
Malonsäurediethylester(9)enzymatischumgesetzt.DieRacematspaltungvon1‐Aminoindan(rac‐130)
führte unter lösungsmittelfreien Bedingungen zu 49% Umsatz und 79% ee. Eine Verlängerung der
Reaktionszeit lieferte das Amid (R)‐129 bei Temperaturen von 80 °C bzw. 60 °C nahezu enantio‐
merenrein.DurchEinsatzvon1.5ÄquivalentendesMalonesters9konnten91%eeerhaltenwerden,
waseinemgutenE‐Wertvon61entspricht.DieenzymatischeAcylierungdersekundärenAminegelang
nur mit Amin 150, wobei unter Standard‐Bedingungen ein Umsatz von 15% mit nur 18% ee erzielt
130
5
Zusammenfassung
werden konnte. Unter den gewählten Bedingungen konnte eine effiziente Racematspaltung nicht
erreichtwerden.
Als weiterer Acyldonor sollte das zuvor enzymatisch synthetisierte ɛ–Caprolacton (3) dienen. Dabei
konnte in allen Fällen nur geringe Umsätze und auch nur racemische Gemische des entsprechenden
Amids erhalten werden. Somit ist das Lacton3kein geeigneter Acyldonor. Allerdingskanndie enzy‐
matische Amidbildung als Startreaktion für die Polymerisation zum Polycaprolacton (PCL) genutzt
werden.
Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die lösungsmittelfreie Racematspaltung vergleichbar ist mit
Reaktionen in organischen Medien. Der Unterschied zwischen lösungsmittelfreien Acylierungen und
ReaktioneninLösungsmittelnliegeninderbenötigtenZeit,um50%Umsatzzuerreichen,sowieinder
benötigtenEnzymmenge.BesondersmitMalonsäurediethylester(9)alsAcyldonorundderLipaseBaus
Candidaantarctica(CAL‐B,Novozym435)konntenbeiderRacematspaltungchiralerAminewierac‐4
undrac‐130inAbwesenheitvonorganischenLösungsmittelnsehrguteErgebnissebei60°CReaktions‐
temperaturinnur4.5Stundenbzw.24StundenReaktionszeitimFallvonrac‐130erzieltwerden.
131
6 6
Summary
Summary
Theaimofthisworkwastoestablishefficientandsustainablesynthesisroutesofɛ‐caprolactone(3)
andchiralamines.Inthisthesistheenzymaticdoubleoxidationofcyclohexanol(1)tolactone3byusage
of CHMO from Acinetobacter calcoaceticus as well as Lk‐ADH from Lactobacillus kefir has been
successfully carried out. The synthesis was optimized in regard of its efficiency. In particular the
enzymaticresolutionofchiralaminesbyusageoflipaseBfromCandidaantarctica(CAL‐B)inasolvent‐
freesystemwasinthefocusofresearch.
6.1
Enzymaticoxidationofcyclohexanol(1)bymeansof
CHMO
Thetwo‐stepbiocatalyticoxidationofcyclohexanol(1)toɛ–caprolactone(3)performedbymeansof
ADHfromLactobacilluskefirandcyclohexanone‐monooxygenasefromAcinetobactercalcoaceticusvia
theintermediatestateoftheinsitu‐formedcyclohexanone(2)hasbeenexaminedindetail.
For a reliable determination of the conversion two methods have been developed first, the use of
urotropine(51)asanexternalstandardfor1H‐NMRspectroscopyandamethodofanalysisbyuseofa
createdstandardcurveviagaschromatography.Ithastobetakenintoaccountwhencomparingboth
methodsthattheGCmethodprovideshigherconversionsandlowerrangeoffluctuationbecausethis
method is sensitive at higher concentrations and the measure of removing the solvent is eliminated.
ThereforeanalysisviaGCisthemethodofchoice.
Afterwardstherecoveryratesoftheindividualsubstanceshadtobedeterminedwhicharedependent
ontheusedamountofenzymeaswellasthetimeofcentrifugationduringthework‐upprocedure.At
growingconcentrationofthesubstratecyclohexanol(1)anincreasedrecoveryratefrom71–80%to
90–97%isobserved.InadditionthebeforehandusedmethodofextractionviaEPPENDORFvialshas
beenimprovedandthusreductionofthelossfactorofthesubstanceswasachieved.
ThespecificactivityofthehereinusedCHMOwithregardtocyclohexanone(2)assubstratehasbeen
determinedandcomparedwithotherBVMOs,ECSMo‐03andECSMo‐05fromENZYMICALSAG.Therefore
firstlythevolumetricactivityhasbeendeterminedviaphotometertestsandsecondlyaBRADFORDtest
hasbeenperformedtoidentifytheproteincontentoftheenzymes.Inthiswaythespecificactivityof
thesemonooxygenasescouldbecalculated.ThespecificactivityoftheCHMOisrepresentedas100%.
TheothertwoBVMOs,ECSMo‐03andECSMo‐05,showed0.2U/mgand0.05U/mgspecificactivity,
whichcorrespondsto7%and2%relativeactivity,respectively.Thusbothothermonooxygenasesare
notcapableofoxidizingcyclohexanone(2)effectively.
132
6
Summary
Inadditiontheactivityoftheenzymeshavebeenassayedphotometricallywithregardtothebenchmark
substanceaswellasfurthersubstrates.TheCHMOshowedanactivityof0.082U/mLregardingcyclo‐
hexanone(2),whichisrepresentedas100%.Towardsthesubstrateisophorone(52)theCHMOshowed
anactivityofjust3%.Sonoconversioncouldbedetectedbythebiocatalyticoxidationofisophorone
(52) with the D‐glucose (48‐a)/GDH‐regeneration system. Under the terms used in this work this
activityisnotsufficientforaneconomicallyreasonableoxidation.
The activity of the Lk‐ADH has been determined with regard of the benchmark substrate 1‐phenyl‐
ethylethanol(47)andrepresentedas100%relativeactivity.Comparedtothistherelativeactivitywith
regard to cyclohexanol (1) and 3,3,5‐trimethylcyclohexanol (53) has been set at 153% and 0%,
respectively.Cyclohexanol(1)isanextremelywell‐suitedsubstrateforoxidationbyLk‐ADH.However,
theenzymaticdoubleoxidationofthethreefoldmethylatedalcohol53providesnolactone56or57
underthebenchmarkreactionconditions.
Thisresultsarefollowedbytheoptimizationofthebenchmarkreactioninviewofproductinhibitionof
theCHMObytestingdifferentorganicsolventsinatwo‐phasesystem.Itwasfoundthatthebestsolvent
isamixtureofKPi‐bufferand10%isooctane(v/v),whichledtoaconversionof87%(Scheme1).With
organicsolventswithhigherlogP‐values,ingeneral,higherconversionscanbeachieved.Besidesboth
the influence of the amount of the Lk‐ADH and of the cofactor as well as the temperature has been
investigated. The conversion has fallen by one third by increasing the amount of cofactor from 1 to
10mol‐%.ThereductionoftheamountofLk‐ADHfrom40to13Uandtheriseofthetemperaturefrom
RTto30°Chadanevenstrongernegativeimpact.
Scheme1.
Enzymaticdoubleoxidationofcyclohexanol(1)with10%(v/v)isooctane.
Itwasdemonstratedthatevenwithveryhighproductconcentrationof1Mnoproductinhibitionofthe
Lk‐ADH appeared. However, by use of the Titrino titration apparatus the hydrolytic cleavage of the
lactone3tothecorrespondingacid53couldbeobserved.
Theinsitu‐productremovalviaadsorberresinsdidnotsucceedunderthechosenconditions.Alsothe
recovery rates from the resins by means of extractive recycling is modest with a maximum of 74%.
Eventuallyamoreefficientsystemcanbefoundbyscreeningoffurtherresins.
133
6 Summary
6.2
Enzymaticresolutionofchiralamines
As initiating tests for the resolution of amines, enzymatic acylation reactions of substituted
benzylamines with diethyl malonate (9) as standard acyl donor have been performed in absence of
organic solvents (Scheme2). The immobilized lipaseB from Candida Antarctica(CAL‐B, trade name:
Novozym435)isusedasbiocatalyst,whichhasprovedtobeahighlyselectiveenzyme.[27–29]Theformer
usedbenchmarkconditions[33–35]couldbeoptimized.Thereactiontemperaturecouldbereducedfrom
80°Cto60°Cat4.5hoursofreactiontimeinasolvent‐freeenvironmentwithoutanylossofconversion.
Theseconditionsweredefinedasstandardreactionconditions(Scheme2).
O
9,1eq.
R
NH2
R
CAL‐B
N
H
80°C
4.5h
O
O
+
R
conversionamide
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
yieldamide
95
95
84
38
9
134
81
35
17
138
5
5
139
140
amine
Scheme2.
R
N
H
137 (R=H)
142 (R=OH)
144 (R=OMe)
146 (R=Br)
conversiondiamide
91
O
N
H
133 (R=H)
141 (R=OH)
143 (R=OMe)
145 (R=Br)
134 (R=H)
138 (R=OH)
139 (R=OMe)
140 (R=Br)
conversion[%]/yield[%]
O
Enzymaticacylationofsubstitutedbenzylamines.
It has been shown furthermore, that there is a positive effect on the conversion by the presence of
electron withdrawing substituents in meta position. However, parallel chemical acylation reactions
towards the accordingly amide up to 8% has been proven. By using the hydroxy‐substituted
benzylamine134theusageofsolventsisnecessarytoensurehomogeneityofthemixtureduetothe
high meltingpoint oftheamine. Ofthesolvents investigatedTHF(75%conversion at 80°C reaction
temperature) and 2‐methyl‐THF (70% at 80 °C) showed the best results. The formation of diamids
consistingofdiethylmalonate(9)andtwoequivalentsofsubstitutedbenzylaminecouldbeprovenin
nearlyallcases.Byusageofaslightexcessofmalonate9theformationofthediamidecouldbealmost
suppressed.However,aslightdecreaseoftheconversionfrom91%to82%hasbeendetected.
134
6
Summary
Theenzymaticresolutionofracemicaminesinasolvent‐freeenvironmentwasinvestigatedbymeans
ofthesystemof1‐phenylethylamine(rac‐4)anddiethylmalonate(9)towardsamiderac‐10(Scheme
3).Therebytheinfluenceoftemperatureundreactiontimeaswellasenzymeloadingwasexaminedand
thereactionkineticsatoptimizedconditionsweredocumented.Theamiderac‐10wasobtainedwith
42%conversionand97%enantiomericpurity,meaninganexcellentenantioselectivityof>100.Exten‐
sionofthereactiontimeto24hoursat60°Cgavecompleteconversionwith98%ee.Aparallelchemical
acylationreactionofrac‐4andmalonate9asacyldonorhasnotbeendetected.
40mg/mmol
NH2
+
O
O
O
CAL‐B
9
O
(R)‐10
1.0eq.
Scheme3.
HN
O
T,t
solvent‐free
O
rac‐4
O
60°C,4.5h
42%conversion
97%ee
Enzymaticresolution(benchmark‐reaction).
Acomparisonofthisprocedurewithexistingindustrialprocesses[30,264]showed,thattheresolutionof
thechiralaminerac‐4undersolvent‐freeconditionschosenforthisworkprovidesvaluesofenantio‐
selectivity in the same range of magnitude. Methoxy acetate 111 used in literature[30] led to 52%
conversionand95%ee(E>100)whereastheresolutionwithmalonate9asdonorsucceededwith48%
conversionandalso95%ee(E>100)underthesameconditions.Theresolutionunderconditionsused
in this thesis led to enantioselectivity of >100. The used increased amount of enzyme and higher
temperaturearebeingcompensatedbyavoidanceoforganicsolventsandshorterreactiontimes.The
techniqueestablishedhereconstitutesaverygoodalternativetoexistingindustrialprocesses.
Enzyme recycling experiments by means of resolution of rac‐4 with malonate 9 by the immobilized
CAL‐Bshowedasignificantdropofconversionduringtherecyclingsteps(Scheme4).
conversion[%]/ee(R)‐10 [%]
conversion
Umsatz[%]
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
92
89
ee(R)‐10
ee[%]
43
30
1
2
25
3
cycle
Scheme4.
94
90
87
20
4
24
5
Enzymerecycling.
135
6 Summary
After the second recycling step, only 30% conversion and in the following recycling steps, merely
20‐ 24% conversion towards the amide (R)‐10 could be detected. The ee‐values of the resolution
reactionsremainedconstantlyhighthough.Thisbehaviorisduetotheinstabilityofthebiocatalystina
solvent‐freeenviron‐mentandisanalogoustoliterature.[36]
Inabroadlipasescreeningfrom23lipasesCAL‐BfromCandidaantarctica(Novozym435)aswellas
two forms of CAL‐B, received from C‐LECTA in immobilized and lyophilized form, have been
demonstratedasthemosteffectivelipasesbytheacylationofbenzylamines130and132aswellasthe
resolutionofrac‐4.TitrationinvestigationsofthelipasesfromC‐LECTAshowed68%and1000%relative
activityregardingNovozym435,respectively.Inpreparativeexperimentsonlytheimmobilizedlipase
from C‐LECTA offered very good results (52% conversion, 96% ee). The lyophilized CAL‐B delivered
merely26%conversionunderoptimizedconditions(fivefoldamountofenzyme).Thustheimmobilized
CAL‐BfromC‐LECTApresentsanimportanttoolforenzymaticresolutionofchiralamines.
Theexaminationoftheusageofalternativeacyldonorsoccurredwithregardtotheimprovementofthe
resolution by the immobilized CAL‐B. The amides, which were enzymatically synthesized under
standardconditions,presentedverydifferentenantiomericratios.Soonlywithmethoxyacetate111
knownfromliterature[229]92%eecouldbeachieved.Resolutionwiththeothertestedacyldonorsledto
ee‐valuesof10–65%.Thusthesedonorsdonotleadtoefficientresolutionundertheconditionschosen
inthisthesis.Incaseofveryreactiveacyldonors,parallelrunningchemicalacylationreactionswere
proven.Sowithvinylacetate125at40°Calready81%conversiontotherespectiveracemicamidewas
receivedinabsenceoflipase.Duetothisbackgroundreactiontheee‐valuesoftheenzymaticresolution
arebeingdecreased.Diethylmalonate(9),alreadyestablishedinthisworkinggroup[33–35]andusedas
standard acyl donor in this thesis, represented itself as the most effective acyl donor in solvent‐free
environmentalso.
Forthedirectcomparisonoftheacyldonorsamongthemselvesreactionkineticsoftheresolutionof
rac‐4undersolvent‐freeconditionsweremeasured(Scheme5).Phenoxyacetate118presentedafast
reaction process but after 24 hours 68% conversion were achieved, which surpasses the theoretic
conversion of a resolution of 50%. Methoxy acetate 111 exhibited a very high reaction rate at the
beginningwhichstagnatedalreadyafter0.5hours.Theacyldonors9and124showedsimilarbehavior,
butjustdiethylmalonate(9)ledtocompleteconversionandveryhighenantiomericratio(E>100).For
resolutionreactionsinsolvent‐freesystemdiethylmalonate(9)istheacyldonorofchoice.
136
6
Summary
O
NH2
CAL‐B
(40 mg/mmol)
O
+
rac‐4
R
O
conversion
Umsatz[%]
96
conversion[%]/ee[%]/
E‐value
R'
60 °C, 4.5 h
R'
(R)‐10 (R' = CH2 COOEt)
(R)‐121 (R' = CH2 OPh)
(R)‐123 (R' = CH2 CN)
(R)‐8 (R' = CH2 OMe)
9 (R = Et, R' = CH2COOEt)
122 (R =Et, R' = CH2 OPh)
124 (R = Et, R' = CH2 CN)
111 (R = Et, R' = CH2 OMe)
100
HN
E‐Wert
E‐value
ee[%]
107
92
90
80
68
70
57
60
50
48
43
31
40
30
16
20
22
10
1
10
0
(R)‐10
(R)‐10
(R)‐121
(R)‐121
(R)‐123
(R)‐123
(R)‐8
(R)‐8
amide
Scheme5.
Comparisonofacyldonorsafter4.5hreactiontime.
Fortheexaminationofthesubstratespectrum1‐aminoindane(rac‐130)andsecondaryamineswere
reactedwithmalonate9.Theresolutionofrac‐130ledto49%conversionand79%eeundersolvent‐
free conditions after 4.5 hours reactions time. By enhancing the reaction time to 24 hours nearly
enantiomericpureamide(R)‐129couldbeobtained.Theenantiomericpuritycouldalsobeincreased
to91%throughusageof1.5equivalentsofmalonate9,representingagoodenantioselectivityof61.The
enzymatic acylation of secondary amines partly succeeded with amine 150, whereby just 15%
conversionand18%eecouldbeachievedunderstandard‐conditions.Underthesechosenconditions
resolutionofsecondaryaminesfailed.
ɛ‐Caprolactone(3),previouslyenzymaticallysynthesized,shouldbeemployedaspossibleacyldonor.It
isnotsuitedasacyldonorduetolowconversionsandracemicmixturesoftherespectiveamidereceived
in all cases. However, the enzymatic formation of amide can be used as starting reaction for
polymerizationtopolycaprolactone(PCL).
Theresultsobtainedshowedthecomparabilityofthesolvent‐freeresolutionwithreactionsinorganic
media.Thedifferencesbetweensolvent‐freeacylationreactionsandreactionsinorganicsolventsresult
fromthetimeneededtoachieve50%conversionaswellfromtheamountofenzymeneeded.Especially
withdiethylmalonate(9)asacyldonorandlipaseBfromCandidaantarctica(CAL‐B,Novozym435)
resolutionofchiralamineslikerac‐4andrac‐130verygoodresultsat60°Creactiontemperaturein
137
6 Summary
just4.5hoursreactiontimeand24hoursfortheaminerac‐130,respectively,havebeenachievedin
absenceoforganicsolvents.
138
7 ExperimentellerTeil
7
ExperimentellerTeil
7.1
VerwendeteChemikalienundGeräte
AutomatischesTitrationssystem:
Titrationen wurden auf einem TitroLinealpha Plus der Firma DI ANALYTICS durchgeführt. Als Titrier‐
lösungdienteverdünnteNaOH‐Lösung(0.1M).DieSpektrenwerdenmitderTitriSoft2.73Softwarevon
SCHOTTINSTRUMENTSaufgenommenundbearbeitet.
Chemikalien:
DieverwendetenkäuflichenChemikalienwurden,wennnichtandersvermerkt,vonACROS ORGANICS®,
ALFA AESAR®, FLUKA®, FLUOROCHEM LTD. UNIT.®, MERCK®, ROTH®, SIGMA‐ALDRICH® bezogen und ohne
weitereReinigungeingesetzt.DasLösungsmittelMTBEwurdealsHochschulspendevonEVONIKDEGUSSA
GMBHzurVerfügunggestellt.AlleweiterenverwendetenLösungsmittelwurdenvonVWRCHEMICALS®,
FISHER CHEMICAL®,ROTH®undAPPLICHEM®bezogenundwarenfürReaktionenundAnalytikvonp.a.
Qualität.DeuterierteLösungsmittelstammenvonDEUTERO.
Dünnschichtchromatographie(DC):
Dünnschichtchromatogramme werden mit MERCK DC‐Folien, Kieselgel 60 auf Aluminiumfolie (F245),
durchgeführt.DieDC‐FolienwerdennachdemEntwickelnmitIoddampfangefärbt.DieDetektionerfolgt
mittelsUV‐Licht.
DC‐MS‐Spektrometrie:
DC‐MS‐KopplungenwurdenamZQ2000(Normalphase;Eluens:iPrOH)miteinerESI‐Ionenquelleder
Firma WATERS durchgeführt. Die Daten wurden mit der Software MestReNova (MESTRELAB RESEARCH,
Version7.0.2‐8636)ausgewertet.
Elementaranalyse(EA):
ElementaranalysenwurdenaneinemEuroEAElementaranalysatordurchgeführt.
EnzymeundCofaktoren:
DieBAEYER‐VILLIGER‐Monooxygenasen(BVMO)ECS‐MO01sowieECS‐MO03undECS‐MO05wurden
freundlicherweise von der ENZYMICALS AG zur Verfügung gestellt. Die Alkohol‐Dehydrogenase aus
Lactobacillus kefir (Lk‐ADH, DSM 20587) wurden im Arbeitskreis von Herrn Prof. Dr. W.HUMMEL
(FORSCHUNGSZENTRUM JÜLICH) entwickelt und zur Verfügung gestellt. Die Cofaktoren NAD(P)H und
NAD(P)+wurdenvonORIENTALYEASTerworben.CandidaantarcticaLipaseB(CAL‐B)inimmobilisierter
139
7 ExperimentellerTeil
Form(Novozym435)wurdevonSIGMAALDRICH®käuflicherworben.CAL‐BinlyophilisierterFormund
immobilisiertaufeinemMethacrylat‐TrägerwurdevonC‐LECTAGMBHzurVerfügunggestellt.
ESI‐MS:
ESI‐MassenspektrenwerdenmitdemEsquire3000derFirmaBRUKERDALTONIKmitIonenfalleundESI‐
Quelleaufgenommen.DieProbenwerdendirektmiteinerautomatischenSpritzeeingeführt.Stickstoff
dient als Zerstäuber‐ und Trockengas und wird durch den Stickstoffgenerator NGM 11 von BRUKER
generiert. Zur Kühlung der Ionenfalle dient Helium. Die Spektren werden mit der BRUKER Daltonik
esquireNT4.0esquireControlSoftware(V6.04)aufgenommenundmitderDataAnalysisSoftware2.0
bearbeitet.
Gaschromatographie(GC):
UmsatzbestimmungenerfolgtenaneinemGC‐2010vonSHIMADZUmiteinemAutoinjektorAOC‐20ivon
SHIMADZUundeinerRt‐βDEXm‐SäulevonRESTEK.AlsTrägergasdienteStickstoff(100kPa).DieSäule
weisteineLängevon30mundeinenInnendurchmesservon0.25mmauf.DieSpektrenwerdenmitder
Software GCsolution Analysis (Version 2.41.00) von SHIMADZU aufgenommen und mit der Software
GCsolutionPostrun(Version2.41.00)bearbeitet.
Methode:Startbei70°C,mit7.5°C/minauf110°C,mit25°C/minauf220°C.
HPLC:
DieChromatogrammewerdenmiteinemGerät,bestehendausfolgendenBausteinenderFirmaJASCO,
aufgenommen:PumpenPU‐2080Plus,automatischerRückdruckreglerBP‐2080Plus,Säulenthermostat
CO‐2060Plus,Multiwellenlängen‐DetektorMD‐2010PlusundAutosamplerAS‐2059Plus.DieTrennung
derProbenerfolgtemitSäulenvonDAICELChiralpak®(AD‐H).DieChromatogrammewurdenmitder
GalaxyChromatographyDataSystemSoftwareaufgenommenundausgewertet.
IR‐Spektroskopie:
IR‐spektroskopischeMessungenwurdenaneinemNicolet308FT‐IR‐SpektrometerderFirmaTHERMO
ELECTRON CORPORATION durchgeführt und mit der Software Omnic (Version 2.11) aufgenommen. Die
AbsorptionwirdinWellenzahl in[cm‐1]angegeben.
NMR‐Spektroskopie:
Die 1H‐ und 13C‐NMR‐Spektren wurden an einem BRUKER DRX‐500 oder BRUKER Advance500 NMR‐
Spektrometer bei Raumtemperatur aufgenommen. Die chemischeVerschiebungδ[ppm] der 1H‐ und
13C‐Spektren
werden, sofern nicht anders angegeben, in Relation zur normierten chemischen Ver‐
schiebungdesverwendetenpartiellundeuteriertenLösungsmittelsangegeben(CDCl3δ=7.26ppm).
DieSpin‐Multiplizitätenwerdenalsbr(broad),s(Singulett),d(Dublett),dd(dupliziertesDublett),t
(Triplett), td (Triplett eines Dubletts), q(Quartett), qui (Quintett) und m (Multiplett) angegeben. Die
erhaltenen Daten wurden mit der Software MestReNova (Mestrelab Research, Version 8.1.0‐11315)
ausgewertet.
140
7 ExperimentellerTeil
UV/Vis‐Spektroskopie:
UV/Vis‐spektroskopische Messungen wurden an einem V‐630 von JASCO und an einem UV‐2450 der
FirmaSHIMADZUdurchgeführt.DieerhaltenenDatenwurdenmitderSoftwareSpectraManager(Version
2.008.04)ausgewertet.
141
7 ExperimentellerTeil
7.2
Synthesen,MethodenundspektroskopischeDaten
7.2.1
EnzymatischeOxidationvonCyclohexanol(1)unterEinsatzvonCHMOund
LK‐ADH
7.2.1.1
Standardreaktion:AllgemeineArbeitsvorschrift1(AAV1):Enzymatische
OxidationvonCyclohexanol(1)zuε‐Caprolacton(3)
Abbildung126. DoppeloxidationvonCyclohexanol(1)zuε‐Caprolacton(3).[26]
In einem 10 mL‐Rundkolben wird Rohextrakt der CHMO aus Acinetobacter calcoaceticus (3.82U,
bezogenaufCyclohexanon(2))inKPi‐Puffer(pH7.0,50mM,5mL)aufgenommenundgutgeschüttelt.
Cyclohexanol(1,0.2mmol,20.0mg),MgCl2 (1mM),undLk‐ADH(40U,Rohextrakt/Glycerin1:1(v/v),
bezogen auf Acetophenon) werden zugegeben. Das Gemisch wird für 20 min bei Raumtemperatur
gerührt.DurchZugabevonNADP+(1mol‐%,1.57mg)wirddieReaktiongestartetunddieMischungfür
einebestimmteZeitbeiRaumtemperaturgerührt.Anschließendwerdendie5mLzuje0.7mLaufsieben
1.5mL‐EPPENDORF‐Gefäße verteilt und jeweils mit 0.7 mL DCM versetzt. Durch 30min Schütteln im
Thermomixer wird das Zweiphasensystem extrahiert. Die Phasentrennung wird durch 30 min
Zentrifugieren bei 13000 rpm erreicht. Die überstehende wässrige Phase wird abgenommen und in
siebenneueEPPENDORF‐Gefäßegegeben.DieExtraktionmitanschließenderPhasentrennungwirdnoch
zweimalwiederholt.DieorganischenPhasenwerdenineinem25mL‐Rundkolbenüberführtunddas
Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 900mbar und 40 °C Badtemperatur entfernt. Der
produktbezogeneUmsatzwirdmithilfeder1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmt.
ProduktbezogenerUmsatz:>97%.
1H‐NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm):1.75(m,4H,H‐4,H‐5),1.84(2H,H‐3),2.62
(t,3J=6.5Hz,2H,H‐2),4.21(t,3J=4.5Hz,2H,H‐6).
13C‐NMR(500MHz,CDCl3):23.22(C‐3),29.25(C‐5),29.57(C‐4),34.85(C‐2),
69.60(C‐6),176.52(C‐1).
DiespektroskopischenDatenstimmenmitdeninderLiteraturangegebenen
Wertenüberein.[272]
142
7 7.2.1.2
Analytik
7.2.1.2.1
Umsatzbestimmungmittels1H‐NMR‐Spektroskopie
ExperimentellerTeil
FürdieUmsatzbestimmungmittels 1H‐NMR‐SpektroskopiewirdUrotropin(51)alsexternerStandard
verwendet. Dazu wird der gesamte Reaktionsansatz im Anschluss an die Aufarbeitung in ein NMR‐
RöhrchengegebenundfrischangesetzteUrotropin‐Stammlösung(51,0.17MinCDCl3,0.1mL)sowie
CDCl3(0.7mL)zugegeben.DerUmsatzwirdinBezugaufdasSingulettsignaldesStandards50bestimmt.
7.2.1.2.2
StabilitätvonUrotropin(51)alsStandard
Zur Bestimmung der Stabilität des externen Standards Urotropin (51) werden Cyclohexanol (1,
0.2mmol,21µL)sowieUrotropin(51,0.1mLder0.17M‐StammlösunginCDCl3)zusammenmitCDCl3
in ein NMR‐Röhrchen gegeben und sofort vermessen. Das Verhältnis beider Komponenten wird
bestimmt.Nach24hbeiRTwirddieselbeProbeerneutvermessenunddasVerhältnisbeiderKompo‐
nentenmittels1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmt.DieErgebnissesindinTabelle23aufgelistet.
Tabelle23.
BestimmungderStabilitätvonUrotropin(51)über24h.
Eintrag
Verhältnis51 /1
eingewogen
Verhältnis51/1
nach24
1
1:0.80
1:0.80
7.2.1.2.3
BestimmungderRückgewinnungsratemittelsNMR
Zur Bestimmung der Rückgewinnungsrate der Substanzen wird die Aufarbeitung simuliert. Dazu
werdenCyclohexanon(2,0.2mmol,20.7µL)bzw.ɛ–Caprolacton(3,0.2mmol,21.1µL)inKPi‐Puffer
(pH7,50mM,5mL)gelöstundfür24hbeiRTgerührt.DieAufarbeitungdurchExtraktionerfolgtanalog
der AAV 1. Zur Bestimmung der Substanzmenge mittels 1H‐NMR‐Analytik wird Urotropin (51) als
Standard (0.1 mL der 0.17 M‐Stammlösung in CDCl3) verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 24
aufgelistet.
143
7 ExperimentellerTeil
Tabelle24. RückgewinnungsratederSubstanzennachsimulierterAufarbeitung.
Eintrag
Substanz
Rückgewinnungsrate[%]
1
2
2
3
91
98
7.2.1.3
UmsatzbestimmungmittelsGC
7.2.1.3.1
ErstellenderEichgerade
VordemErstelleneinerEichgeradenwurdezunächsteineMethodeamGaschromatographenerstellt,
dieeineguteTrennungderSubstanzenerlaubt.ImAnschlusswurdeeineStammlösung(10g/l)von
Cyclohexanol (1), Cyclohexanon (2) und ɛ–Caprolacton (3) hergestellt. Dafür wurden je 1 g der drei
Substanzeninein100mL‐fassendenMaßkolbeneingewogen,mitDCMbiszumEichstrichaufgefülltund
sehrgutgeschüttelt.AusgehendvondieserStammlösungwurdeeineVerdünnungsreihedurchgeführt,
sodass Lösungen der Konzentrationen von 5 g/l, 2.5 g/l, 2.0 g/l, 1.75 g/l, 1.5 g/l, 1.25 g/l, 1.0 g/l
hergestelltwerdenkonnten.VonderStammlösungsowievondenweiterenLösungenwurdenjeweils3
Probenfläschchen abgefüllt und doppelt am Gaschromatographen vermessen. Aus den erhaltenen
WertenwurdemithilfedesProgrammsderMittelwertgebildetunddieEichgeradeerstellt.
7.2.1.3.2
BestimmungderDurchschnittsabweichungen
Zur Bestimmung der durchschnittlichen Abweichungen der zuvor erstellten Eichgerade werden
unterschiedlicheMengenderSubstanzen1,2und3ineinen100mL‐Maßkolbeneingewogenundmit
DCM aufgefüllt. Davon werden jeweils drei Proben abgefüllt und mittels Gaschromatographie ver‐
messen.DieErgebnissesindinTabelle25aufgelistet.
144
7 Tabelle25.
ExperimentellerTeil
BestimmungderDurchschnittsabweichungenbeiGC‐Messungen.
Eintrag
Substanz
Einwaage
[mg/mL]
Stoffmenge
erhalten[mg/mL]
Abweichung
[mg/mL]/[%]
1
2
3
1
2
3
2.39
0.81
1.78
2.49
0.82
1.85
0.10/4
0.01/1
0.07/4
4
5
6
1
2
3
1.25
1.40
1.25
1.28
1.42
1.28
0.03/2
0.02/1
0.07/2
7
8
9
1
2
3
0.93
1.58
2.75
0.96
1.60
2.89
0.03/3
0.02/1
0.14/5
10
3
2.45
2.45
0/0
7.2.1.3.3
BestimmungdesWiederfindungsratemittelsGC
DieKomponenten1,2und3werdeninverschiedenenKonzentrationen(0.1–0.4mmol)eingewogen
undinKPi‐Puffer(pH7,50mM,5mL)für24hbeiRTgerührt.DieAufarbeitungerfolgtanalogderAAV1.
Der Rückstand wird nach Entfernen des Lösungsmittels in einen Maßkolben gegeben und auf den
Eichstrich aufgefüllt. Davon wird eine Probe abgefüllt und die Substanzmenge mittels Gaschromato‐
graphie bestimmt. Jede Messung wird fünfmal durchgeführt und daraus der Durchschnittswert
ermittelt.DieErgebnissesindinTabelle26aufgelistet.
Tabelle26.
BestimmungderWiederfindungsratewährendderAufarbeitung.
Eintrag
Substanz
Stoffmenge[mmol]
Wiederfindung [%]
1
2
3
1
2
3
0.1
0.1
0.1
71
75
80
4
5
6
7
1
2
3
1
0.2
0.2
0.2
0.4
84
88
88
90
145
7 ExperimentellerTeil
Eintrag
Substanz
Stoffmenge[mmol]
Wiederfindung[%]
8
9
2
3
0.4
0.4
95
97
7.2.1.3.4
BestimmungderWiederfindungsrateinAnwesenheitvonLk‐ADH
DieKomponenten1,2und3(0.2mmol)werdeneingewogenundinKPi‐Puffer(pH7,50mM,5mL)
zusammenmitLk‐ADH(0‐40U,0‐141µL)für1hbeiRTgerührt.DieAufarbeitungerfolgtanalogder
AAV1.DerRückstandnachEntfernendesLösungsmittelswirdineinen25mL‐Maßkolbengegebenund
davon drei Proben abgefüllt. Die Substanzmenge wird mittels Gaschromatographie bestimmt. Jede
MessungwirddreimaldurchgeführtunddarausderDurchschnittswertermittelt.DieErgebnissesindin
Tabelle27aufgelistet.
Tabelle27.
BestimmungderWiederfindungsrateinAnwesenheitvonLk‐ADH.
Eintrag
Substanz
Lk‐ADH
Wiederfindung[%]
1
2
3
4
5
9
1
1
2
2
3
3
‐
+
‐
+
‐
+
88
90
76
73
94
93
7.2.1.3.5
EinflussderEnzympellet‐BildungaufdieRückgewinnungsrate
ZurUntersuchungderEinflussesderPellet‐BildungaufdieRückgewinnungsratewerdenɛ‐Caprolacton
(3,0.2mmol,22.8mg)undLk‐ADH(0–500µL)inKPi‐Puffer(pH7,50mM,5mL)für10minbeiRT
gerührt.DieAufarbeitungerfolgtanalogderAAV1,mitderAbweichungderZentrifugierzeittzwischen
5–30Minuten.DieSubstanzmengevon3wirdanschließendmittelsGaschromatographiebestimmt.Die
ErgebnissesindinTabelle28aufgelistet.
146
7 Tabelle28.
ExperimentellerTeil
EinflussderPellet‐BildunginAnwesenheitvonLk‐ADH.
Eintrag
Lk‐ADH[µ]
t[min]
Rückgewinnungsrate[%]
1
2
3
4
5
6
0
150
500
0
150
500
3x30
3x30
3x30
3x5
3x5
3x5
68
61
20
93
73
69
7.2.1.3.6
VergleichderAnalytikmethoden:GCvs.NMR
DieSyntheseerfolgtanalogderAAV1.DazuwirdCHMO(3.82U,20.1mg),Cyclohexanol(1,0.2mmol),
MgCl2(1mM)sowieLk‐ADH(40U,210.5µL)undNADP+(1mol%,1.57mg)eingesetztundinKPi‐Puffer
(pH7,50mM,5mL)für24hgerührt.DieAufarbeitungerfolgtanalogderAAV1.DerRückstandwird
nach Entfernen des Lösungsmittels in einen Maßkolben gegeben und auf den Eichstrich aufgefüllt.
DavonwerdendreiProbenabgefülltundperGCvermessen.DerrestlicheInhaltderGC‐Gläschenwird
mit der restlichen Lösung zusammengegeben und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei
900mbarund40°CBadtemperaturentfernt.DergesamteReaktionsansatzwirdimAnschlussandie
AufarbeitungineinNMR‐RöhrchengegebenundfrischangesetzteUrotropin‐Stammlösung(51,0.17M
inCDCl3,0.1mL)sowieCDCl3(0.7mL)zugegeben.DerUmsatzwirdinBezugaufdasSingulettsignaldes
Standards50bestimmt.DieErgebnissesindinTabelle29aufgezeigt.
Tabelle29.
VergleichderAnalytikmethoden:GCvs.NMR
Eintrag
Substanz
Umsatzvia GC[%]
UmsatzviaNMR[%]
1
2
3
1
2
3
6
5
74
0
3
59
147
7 ExperimentellerTeil
7.2.1.4
Photometertests
7.2.1.4.1
BestimmungderEnzymaktivitätderLk‐ADHgegenüber3,3,5‐Trimethyl‐
cyclohexanol(53)
DieEnzymaktivitätderLk‐ADHwirdspektroskopischanalogeinerarbeitsgruppeninternerVorschrift
spektroskopischbeieinerWellenlängevon340nmdurchMessungdesVerbrauchsvonNADPHdurch
Oxidation zu NADP+ in Gegenwart eines Substrates bestimmt. Dafür werden in eine 3 mL fassende
Küvette 2880 µL der Substratlösung (10 mM bis 2M in KPi‐Puffer (pH 7, 50mM)) und 60 µL einer
NADPH‐Lösung (12.5 mM in KPi‐Puffer (pH 7, 50mM)) gegeben und gut geschüttelt. Abschließend
werden60µLderentsprechendverdünntenLk‐ADH‐Lösung(Rohextrakt)zugegeben.DieLösungwird
nocheinmalgutgeschütteltunddieMessungsofortgestartet.Eswurdeüber3MinutenjedeSekunde
einMesspunktaufgenommen.ZurBerechnungdervolumetrischenEnzymaktivitätwirddieAnfangs‐
steigung derAbsorptionskurve in folgende Gleichung4 eingesetzt.Die Ergebnisse sind in Tabelle 30
aufgezeigt.
Gleichung4
U/mL:
volumetrischeEnzymaktivität
∆E340nm
Anfangssteigung/‐abnahmederAbsorptionskurve[min‐1]
t
:
Vg:
GesamtvolumenderProbe[mL]
f:
VerdünnungsfaktordesRohextraktes
Vp:
Enzymvolumen[mL]
ɛ:
molarerExtinktionskoeffizient
d:
SchichtdickederKüvette[cm]
IndieserArbeitsindd=1cmundɛ=6.3
mL
mL
mM∙cm
.
mM∙cm
Tabelle30.
BestimmungderAktivitätderLk‐ADHgegenüber3,3,5‐Trimethylcyclohexanol(53)im
Vergleichzu1‐Phenylethanol(47)undCyclohexanol(1).
148
Eintrag
Substrat
Aktivität[U/mL]
RelativeAktivität[%]
1
2
3
47
1
53
21.5
33.0
0
100
153
0
7 7.2.1.4.2
ExperimentellerTeil
AllgemeineArbeitsvorschrift2(AAV2):BestimmungderEnzymaktivitätder
CHMO
Die Enzymaktivität der CHMO (ECS Mo‐01) wird nach einer Vorschrift der ENZYMICALS AG bei einer
Wellenlänge von 340 nm durch Messung des Verbrauchs an NADPH durch Oxidation zu NADP+ in
GegenwartvonCyclohexanon(2)alsSubstratbestimmt.DazuwerdenStammlösungendesSubstrats
Cyclohexanon(2,100mMinDMF)undeineNADPH‐Lösung(125mMindest.Wasser)hergestellt.Es
werden2670µLdesTRIS‐HCl‐Puffers(pH8.5,50mM)zusammenmit30µLderSubstratlösungund
3µL der NADPH‐Lösung in eine Küvette pipettiert und durch Schütteln gut vermischt. Anschließend
werden300µLderjeweiligenEnzymlösung(RohextraktinPuffer)zugegebenunddieLösungnochein
weiteres Mal gut durchmischt und die Messung gestartet. Es wird über 3 Minuten jede Sekunde ein
Messpunkt aufgenommen. Zur Berechnung der volumetrischen Enzymaktivität wird die Anfangs‐
steigungderAbsorptionskurvenachGleichung5berechnet.
Gleichung5
U/mL:
volumetrischeEnzymaktivität
∆E340nm
Anfangssteigung/‐abnahmederAbsorptionskurve[min‐1]
t
:
f:
VerdünnungsfaktordesRohextraktes
ɛ:
molarerExtinktionskoeffizient
d:
SchichtdickederKüvette[cm]
IndieserArbeitsindd=1cmundɛ=6.3
mL
mL
mM∙cm
.
mM∙cm
Aktivität:0.082U/mg.
7.2.1.4.3
BVMO‐ScreeningundBRADFORD‐TestzurOxidationvonCyclohexanol(2)
Die Enzymaktivitäten der BVMOs ECS Mo‐03 und ECS Mo‐05 (ENZYMICALS AG) sollen photometrisch
analog zur AAV 2 bestimmt werden. Dazu werden Stammlösungen des Substrats Cyclohexanon (2,
100mMinDMF)undeineNADPH‐Lösung(125mMindest.Wasser)hergestellt.Eswerden2670µLdes
TRIS‐HCl‐Puffers(pH8.5,50mM)zusammenmit30µLderentsprechendenSubstratlösungund3µL
derNADPH‐LösungineineKüvettepipettiertunddurchSchüttelngutvermischt.Anschließendwerden
300µLderjeweiligenEnzymlösung(RohextraktinPuffer)zugegebenunddieLösungnocheinweiteres
MalgutdurchmischtunddieMessunggestartet.Eswirdüber3MinutenjedeSekundeeinMesspunkt
aufgenommen. Zur Berechnung der Enzymaktivität wird die Anfangssteigung der Absorptionskurve
nachGleichung5berechnet.DieErgebnissesindinTabelle31aufgezeigt.
149
7 ExperimentellerTeil
Tabelle31.
BVMO‐ScreeningzurOxidationvonCyclohexanon(2).
Eintrag
BVMO
Aktivität[U/mL]
Aktivität[U/mg]
RelativeAktivität[%]
1
2
3
ECSMo‐01
ECSMo‐03
ECSMo‐05
7.38
0.50
0.14
3.00
0.20
0.05
100
7
2
7.2.1.4.4
AktivitätsbestimmungderCHMOgegenüberIsophoron(52)
Die Enzymaktivität der CHMO soll photometrisch gegenüber Isophoron (52) als Substrat bestimmt
werden.AbweichendvonderAAV1wirddieAktivitätnacheinerVorschriftderFirmaENZYMICALS AG
dargestellt.DazuwerdenStammlösungenderSubstrateCyclohexanon(2)undIsophoron(52,100mM
in DMF) und eine NADPH‐Lösung (125 mM in dest. Wasser) hergestellt. Es werden 2670 µL des
TRIS‐HCl‐Puffers(pH8.5,50mM)zusammenmit30µLderentsprechendenSubstratlösungund3µL
derNADPH‐LösungineineKüvettepipettiertunddurchSchüttelngutvermischt.Anschließendwerden
300µLderjeweiligenEnzymlösung(RohextraktinPuffer)zugegebenunddieLösungnocheinweiteres
MalgutdurchmischtunddieMessunggestartet.Eswirdüber3MinutenjedeSekundeeinMesspunkt
aufgenommen. Zur Berechnung der Enzymaktivität wird die Anfangssteigung der Absorptionskurve
nachGleichung5berechnet.DieErgebnissesindinTabelle32aufgezeigt.
Tabelle32.
Bestimmung der Aktivität von CHMO gegenüber Isophoron (52) im Vergleich zu
Cyclohexanon(2).
Eintrag
Substrat
Aktivität[U/mg]
Aktivität[%]
1
2
2
52
0.101
0.003
100
3
7.2.1.5
OptimierungderStandard‐Reaktion
7.2.1.5.1
AllgemeineArbeitsvorschrift3(AAV3):Doppeloxidationzuɛ‐Caprolacton(3)mit
optimierterAufarbeitung
Zur Optimierung der Aufarbeitung wird die Synthese analog der AAV 1 (siehe Abbildung 126)
durchgeführt.DazuwerdenCHMO(3.82U,68.2mg)inKPi‐Puffer(pH7,50mM,5mL),Cyclohexanol(1,
0.2 mmol, 22.0 mg), MgCl2 (1mM) sowie Lk‐ADH (40 U, 210.5 µL) und NADP+ (1mol‐%, 1.57 mg)
eingesetztundfür24hbeiRTgerührt.Anschließendwerdendie5mLzuje1mLauffünf2mL‐EPPEN‐
DORF‐Gefäßeverteiltundjeweilsmit1mLDCMversetzt.Durch30minSchüttelnimThermomixerwird
150
7 ExperimentellerTeil
dasZweiphasensystemextrahiert.DiePhasentrennungwirddurch5minZentrifugierenbei13000rpm
erreicht.DieuntereorganischePhasewirdabgenommenunddiezurückbleibendewässrigePhasesowie
dasdenaturierteEnzymwerdenerneutmitje1mLDCMversetzt.DieExtraktionmitanschließender
Phasentrennung wird noch zweimal wiederholt. Die organischen Phasen werden in einem 50mL‐
MaßkolbenüberführtundderKolbenbiszurEichmarkemitDCMaufgefüllt.EswerdendreiProben‐
fläschchenabgefülltundderUmsatzmittelsGaschromatographiebestimmt.
Umsatz:74%ɛ‐Caprolacton(3),20%Cyclohexanon(2),10%Cyclohexanol(1).
7.2.1.5.2
VariationdesLösungsmittels
DieSynthesenerfolgenanalogderAAV1.DazuwerdenjeweilsCHMO(3.82U,20.1mg),Cyclohexanol
(1,0.2mmol),MgCl2(1mM)sowieLk‐ADH(40U,210.5µL)undNADP+(1mol‐%,1.57mg)eingesetzt
und für 24 h bei RT gerührt. Als Lösungsmittel dient zum einen mit organischem Co‐Solventien
versetzterKPi‐Puffer(pH7,50mM)bzw.dest.Wasser.ZumanderenwirdKPi‐Puffer(pH7,50mL)bzw.
dest.WassermitdemCo‐Solvenz(je10mL)für24hbeiRTund1200rpmgerührtumeinegesättigte
wässrigePhasezuerhalten.DieAufarbeitungerfolgtanalogderAAV1.DieUmsätzezu2und3sowie
die Stoffmenge des nicht umgesetzten Edukts 1 werden entweder mittels 1H‐NMR‐Spektroskopie
bestimmtundaufdenStandardUrotropin(51)bezogenoderviaGCermittelt.DieErgebnissesindin
Tabelle33aufgelistet.
Tabelle33.
VariationdesLösungsmittelgemischesbeiderDoppeloxidationvonCyclohexanol(1).
Eintrag
Lösungsmittel‐Gemisch
Stoffmenge3
[mmol]
Stoffmenge2
[mmol]
Stoffmenge1
[mmol]
1a)
2a)
3a)
4b)
5b)
6b)
7b)
8a)
KPi/MTBE8:2
KPi/MTBE6:4
KPi/EtOAc6:4
KPi/Toluol9:1
KPi/Methylcyclohexan9:1
KPi/Isooctan9:1
KPi/n‐Heptan9:1
MTBE‐ges.KPi
1.6
0.4
0
23.6
25.6
34.8
26.0
13.2
1.2
0.8
2.4
3.2
2.0
2.0
2.0
1.2
18.4
28.0
27.6
8.4
2.4
2.0
4.4
3.6
151
7 ExperimentellerTeil
Eintrag
Lösungsmittel‐Gemisch
Stoffmenge3
[mmol]
Stoffmenge 2
[mmol]
Stoffmenge1
[mmol]
9a)
10a)
11a)
12a)
13a)
14a)
EtOAc‐ges.KPi
n‐Heptan‐ges.KPi
n‐Hexan‐ges.KPi
Methylcyclohexan‐ges.KPi
MTBE‐ges.dest.Wasser
dest.Wasser
0
14.0
19.6
28.0
0.8
14.0
2.8
1.2
0.8
1.2
2.0
1.2
24.4
3.2
0
0
32.0
6.8
a)UmsatzbestimmtmittelsNMR‐SpektroskopiemitUrotropin(51)alsStandard;b)UmsatzbestimmtmittelsGC.
7.2.1.5.3
VariationderReaktionsbedingungen
DieSynthesenerfolgenanalogderAAV1.DazuwerdenCHMO(3.82U,20.1mg)inKPi‐Puffer(pH7,
50mM,5mL),Cyclohexanol(1,0.2mmol),MgCl2(1mM)sowieLk‐ADH(13–40U,70.2‐210.5µL)und
NADP+(2‐10mol‐%)eingesetztundfür24hbeiRT–30°Cgerührt.DieAufarbeitungerfolgtanalogder
AAV 1. Die produktbezogenen Umsätze werden mittels 1H‐NMR‐Spektroskopie bestimmt. Die Ergeb‐
nissesindinTabelle34aufgelistet.
Tabelle34.
VariationderReaktionsbedingungenderOxidationvonCyclohexanol(1).
Eintrag
NADP+
[mol‐%]
Lk‐ADH
[U]
T
[°C]
Umsatz3
[%]
Umsatz2
[%]
1
2
3
4
2
10
1
1
40
40
40
13
RT
RT
30
RT
97
61
48
55
3
11
5
3
7.2.1.6
AllgemeineArbeitsvorschrift4(AAV4):UntersuchungderStabilitätderLk‐ADH
mittelsTitrations‐Apparatur
Abbildung127. UntersuchungderStabilitätderLk‐ADHinAnwesenheitvonLacton3.
IneinerTitrino‐ApparaturwerdenAcetophenon(46,20mM,21μL),ε‐Caprolacton(3,10mM–1M)
sowieD‐Glucose(48‐a,100mM,180.1mg)in10mLdest.Wassergegeben.Anschließendwerden1mg
152
7 ExperimentellerTeil
MgCl2,40U/mmolLk‐ADHund40U/mmolGlucosedehydrogenase(GDH)„AMANO2“zugegebenunddie
ReaktionmitZugabevonNADP+(1mol%,1.57mg)alsCofaktorfür24hgestartet.
D‐Glucose(48‐a)dienthierbeialsRegenerationsmediumfürdeneingesetztenCofaktor,derdurchdie
VerwendungvonGDHzumbenötigtenNADPHreduziertwird.D‐Glucose(48‐a)selbstwirdzunächstin
Gluconolacton(49‐a)umgewandelt,welchesirreversibelzurGluconsäure(50‐a)gespaltenwird.Durch
Zugabe von Natronlauge (0.2 M) wird die gebildete Säure zum Natriumgluconat neutralisiert. Die
verbrauchteMengeanNatronlaugegibtAuskunftüberdenUmsatzderReaktion.
DurchZugabevon15mLDCMwirddieReaktionbeendet.EswirdimScheidetrichterausgeschütteltund
dieorganischePhaseabgetrennt.Anschließendwirdnochzweimalmitje15mLDCMextrahiert.Das
organische Lösungsmittel wird bei 900 mbar und 40°C Badtemperatur am Rotationsverdampfer
entfernt. Der Umsatz wird ebenfalls mittels 1H‐NMR‐Spektroskopie bestimmt und auf den Standard
Urotropin(51)bezogen.DieErgebnissesindinTabelle35aufgezeigt.
Tabelle35.
UntersuchungderStabilitätvonLk‐ADHinAnwesenheitvonLacton3.
Eintrag
Keton46
[M]
Lacton3
[M]
Produktkonzentration
viaTitrino[%]
Produktkonzentration
viaNMRa)[%]
1
2
3
4
5b)
6b)
7b)
0.02
0.02
0.02
0.02
0.02
0.02
0
0
0.01
0.04
0.10
0.25
1.00
0.25
25
24
30
42
49
50
0
19
16
16
15
16
14
0
a)UmsatzbestimmtmittelsUrotropin(51)alsexternerStandard;b)automatischerAbbruchderReaktionnach3.5h.
7.2.1.7
VariationdesSubstrates
7.2.1.7.1
3,5,5‐Trimethylcyclohexanol(53)alsSubstrat
Abbildung128. Doppeloxidationvon3,5,5‐Trimethylcyclohexanol(53).
153
7 ExperimentellerTeil
DieSynthesenerfolgenanalogderAAV1.DazuwerdenjeweilsCHMO(3.82U,20.1mg),3,5,5‐Trimethyl‐
cyclohexanol (53, 0.2 mmol), MgCl2 (1 mM) sowie Lk‐ADH (40 U, 210.5 µL) und NADP+ (1mol‐%)
eingesetztundfür24hbeiRTgerührt.DieAufarbeitungerfolgtanalogderAAV1.DieKonzentrationen
der Komponenten wird sowohl mittels 1H‐NMR‐Spektroskopie, bezogen auf den Standard Urotropin
(51),sowiemittelsGaschromatographiebestimmt.DieErgebnissesindinTabelle36aufgelistet.
Tabelle36.
3,5,5‐Trimethylcyclohexanol(53)alsSubstrat.
Eintrag
Analytik
1
2
1H‐NMR
Konzentration53
[mM]
Konzntration 55
[mM]
Konzentration56/57
[mM]
28.4
38.8
0
0
0
1.2
GC
7.2.1.7.2
Isophoron(52)alsSubstrat
Abbildung129. OxidationvonIsophoron(52)mitLk‐ADHalsRegenerationssystem.
Ineinem10mL‐RundkolbenwirdRohextraktderCHMO(3.82U,20.1mg)inKPi‐Puffer(pH7.0,50mM,
5 mL) aufgenommen und gut geschüttelt. Isophoron (52, 0.2 mmol, 27.6mg), MgCl2 (1mM), Lk‐ADH
(40U,Rohextrakt/Glycerin1:1(v/v))sowiei‐PrOH(1.25ml)werdenzugegeben.DasGemischwirdfür
20minbeiRaumtemperaturgerührt.DurchZugabevonNADP+(1mol‐%,1.57mg)wirddieReaktion
gestartet und die Mischung für eine bestimmte Zeit bei Raumtemperatur gerührt. Die Aufarbeitung
erfolgtanalogderAAV1.DieKonzentrationwirdmittels1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmtundaufden
StandardUrotropin(51)bezogen.DieErgebnissesindinTabelle37aufgelistet.
Tabelle37.
154
Isophoron(52)alsSubstrat.
Eintrag
Analytik
Konzentration52[mM]
Konzentration59[%]
1
2
1H‐NMR
23.6
39.9
0
1
GC
7 ExperimentellerTeil
7.2.1.8
VerwendungvonAdsorberharzen
7.2.1.8.1
BestimmungderRückgewinnungsrateinAnwesenheitvonXAD‐7undXAD‐1180
ZurBestimmungderRückgewinnungsratewerdenCyclohexanol(1)bzw.dasLacton3(0.2mmol)in
KPi‐Puffer (pH 7, 50 mM) mit XAD‐7 bzw. XAD‐1180 (100 – 200 mg) für 20 h bei RT gerührt. Die
Harzkügelchenwerdenabfiltriertundzunächstmitdest.Wasser(3x20mL)undanschließendmitDCM
bzw.MTBE(3x20mL)gewaschenunddiePhasengetrennt.DiewässrigePhasewirdmitDCMbzw.
MTBE (3 x 20 mL) extrahiert. Die organischen Phasen werden vereint und das Lösungsmittel bei
900mbarund40°Centfernt.DerUmsatzwirdmittels 1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmtundaufden
StandardUrotropin(51)bezogen.DieErgebnissesindinTabelle38aufgelistet.
Tabelle38. Bestimmung der Rückgewinnungsrate in Anwesenheit der Adsorberharze XAD‐7 bzw.
XAD‐1180.
Eintrag
Substanz
Harz/[mg]
Solvenz
Rückgewinnung [%]
1
2
3
4
5
6
1
3
3
3
1
1
XAD‐7/100
XAD‐7/100
XAD‐7/200
XAD‐7/100
XAD‐1180/100
XAD‐1180/200
DCM
DCM
DCM
MTBE
DCM
DCM
46
68
74
30
89
41
7.2.1.8.2
DoppeloxidationvonCyclohexanol(1)inAnwesenheitvonXAD‐7
Abbildung130. DoppeloxidationvonCyclohexanol(1)inAnwesenheitvonXAD‐7.
Die Synthese erfolgt analog der AAV 1. Dazu werden CHMO (3.82 U, 20.1mg), Cyclohexanol (1,
0.2mmol), XAD‐7 (100 mg), MgCl2 (1 mM) sowie Lk‐ADH (40 U, 210.5 µL) und NADP+ (1mol‐%) in
KPi‐Puffer(pH7,50mM,5mL)eingesetztundfür24hbeiRTgerührt.DieAufarbeitungerfolgtanalog
155
7 ExperimentellerTeil
derAAV1.DerUmsatzwirdmittels 1H‐NMR‐SpektroskopiebestimmtundaufdenStandardUrotropin
(51)bezogen.DieErgebnissesindinTabelle39aufgelistet.
Tabelle39.
156
DoppeloxidationvonCyclohexanol(1)inAnwesenheitvonXAD‐7.
Umsatz3[%]
Umsatz2[%]
ZurückgewonneneStoffmenge
1+2+3[%]
24
3
50
7 ExperimentellerTeil
7.2.2
EnantioselektiveRacematspaltungvonAminenmittelsLipasen
7.2.2.1
AllgemeineArbeitsvorschrift5(AAV5):SynthesevonReferenzverbindungen
Zumjeweiligenrac‐AminwirdderentsprechendeAcyldonor(1Äq.)gegebenundfürdieangegebene
Reaktionszeit zum Rückfluss (Ölbad auf 180 °C) erhitzt (Abbildung 131).[253] Der produktbezogene
Umsatzwirdmittels 1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmt.DasRohproduktwirdmittelsSäulenchromato‐
graphieaufgereinigt,umdasisolierterac‐Amidzuerhalten.
Abbildung131. SynthesederReferenzverbindungen.[253]
7.2.2.1.1
SynthesedesDL‐Ethyl‐3‐oxo‐3‐(1‐phenylethylamino)propanoats(rac‐10)
Die Synthese erfolgt analog der AAV 5.[253] Zu 1‐Phenylethylamin (rac‐4, 2.7 mmol, 327.3mg) wird
Malonsäurediethylester (9, 15.1 mmol, 2.4g) gegeben und für 4h zum Rückfluss erhitzt. Die Aufrei‐
nigung erfolgt mittels Säulenchromatographie (Laufmittel: CH/EtOAc 2:1). Das Amid rac‐10 wird als
farbloserFeststofferhalten.
Umsatz:85%;Ausbeute:71%(448.6mg,1.9mmol).
1H‐NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm):1.28(t, 3J=7.1Hz,3H,H‐14),
1.51(d,3J=6.9Hz,3H,H‐9),3.32(d,3J=4.9Hz,2H,H‐11),4.19(q,
3J=7.2Hz,2H,H‐13),5.15(q, 3J=7.2Hz,1H,H‐7),7.24–7.36(m,
5H,Har),7.50(m,1H,H‐8).
13C‐NMR(500MHz,CDCl3):14.16(C‐14),22.22(C‐9),41.21(C‐11),
49.04 (C‐7), 61.69 (C‐13), 126.19 (C‐1, C‐5), 127.46 (C‐3), 128.80
(C‐2,C‐4),143.16(C‐6),164.12(C‐10),169.83(C‐12).
HPLC: AD‐H‐Säule, 95:5 (n‐Hexan/i‐PrOH, v/v), 210nm, flow:
0.8mL/min,tR=16.9min(R),26.7min(S),ee‐Wert:0%.
IR (ATR): (cm‐1) = 3276.0, 3064.4, 2977.5, 2930.4, 2359.4, 1735.8, 1642.7, 1541.0, 1448.4, 1367.9,
1152.8,1031.6,943.8,761.0,698.3,613.8,537.9.
MS(ESI):m/z(%)=258.1(100)[M+Na]+,356.3(3),437.3(5),493.2(31)[2M+Na]+.
EA(C13H17NO3):berechnet:C:61.95%,H:8.98%,N:6.57%,O:22.50%;gefunden:C:61.08%,H:8.99%,
N:6.47%,O:23.46%.
DiespektroskopischenDatenstimmenmitdeninderLiteraturangegebenenWertenüberein.[273]
157
7 ExperimentellerTeil
7.2.2.1.2
Synthesedes2‐Phenoxy‐N‐(1‐phenylethyl)acetamids(rac‐121)
DieSyntheseerfolgtanalogderAAV5.[253]Zurac‐1‐Phenylethylamin(rac‐4,0.5mmol,61.0mg)wird
Phenoxyessigsäureethylester(122,0.5mmol,90.6mg)gegebenundfür5hzumRückflusserhitzt.Die
AufreinigungerfolgtmittelsSäulenchromatographie(Laufmittel:CH/EtOAc3:2).DasProduktwirdals
farbloserFeststofferhalten.
Umsatz:81%,Ausbeute:37%(47.2mg,0.18mmol).
1H‐NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm):1.56(d,3J=7.0Hz,3H,H‐9),
O
8
1
2
HN
10
7
6
3
9
O
12
4.51(d,3J=6.0Hz,2H,H‐11),5.24(qui,3J=7.5Hz,1H,H‐7),6.79
13
11
17
16
5
4
rac‐117
C16H17NO2
M=255.31g/mol
14
(br,1H,H‐8),6.92(d,3J=8.5Hz,2H,Har),7.03(t,3J=7.5Hz,1H,
15
Har),7.27–7.36(m,5H,Har),7.50(m,1H,H‐8).
13C‐NMR
(500 MHz, CDCl3): 21.96 (C‐9), 48.43 (C‐7), 67.51
(C‐11), 114.86 (Car), 122.30 (Car), 126.24 (Car), 127.61 (Car),
128.85 (Car), 129.92 (Car), 142.80 (C‐5), 157.26 (C‐12), 167.44
(C‐10).
HPLC: AD‐H‐Säule, 95:5 (n‐Hexan/i‐PrOH, v/v), 210 nm, flow:
0.8mL/min,tR=15.11min(R),16.18min(S),ee‐Wert:0%.
IR(ATR):(cm‐1)=3269.9,3062.6,3970.0,2929.9,
MS(ESI):m/z(%)=278.1(80)[M+Na]+,410.7(12),533.1(100)[2M+Na]+.
DiespektroskopischenDatensindnichtliteraturbekannt.
7.2.2.1.3
Synthesedes2‐Cyano‐N‐(1‐phenylethyl)‐acetamids(rac‐123)
Abbildung132. SynthesedesCyano‐Amidsrac‐123.[254]
Zurac‐1‐Phenylethylamin(rac‐4,0.5mmol,59.8mg)wirdCyanessigsäureethylester(124,0.5mmol,
57.7 mg) zugegeben und für 24h bei RT gerührt (Abbildung 132).[254] Das Rohprodukt wird mittels
Säulenchromatographie(Laufmittel:CH/EtOAc2:3)aufgereinigt.DasProduktwirdalsfarbloserFest‐
stofferhalten.
Umsatz:40%,Ausbeute:36%(33.9mg,0.18mmol).
158
7 ExperimentellerTeil
1H‐NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm):1.56(d, 3J=7.0Hz,3H,H‐9),3.35
(d, 3J=2.5Hz,2H,H‐11),5.12(qui, 3J=7Hz,1H,H‐7),6.29(br,1H,H‐
8),7.29–7.38(m,5H,Har).
13C‐NMR
(500 MHz, CDCl3): 21.60 (C‐8), 26.04 (C‐11), 50.12 (C‐7),
114.85 (C‐13), 126.27 (Car), 128.01 (Car), 129.02 (Car), 141.99 (C‐5),
160.09(C‐10).
HPLC: AD‐H‐Säule, 95:5 (n‐Hexan/i‐PrOH, v/v), 210 nm, flow: 0.8
mL/min,tR=17.14min(R),21.38min(S),ee‐Wert:0%.
IR (ATR): (cm‐1) = 3275.3, 3064.8, 2966.1, 2919.9, 2357.5, 2341.2, 2256.4, 1644.8, 1550.2, 1445.2,
1355.0,1241.6,1195.0,1106.6,934.9,748.5,684.3,597.8,587.6,528.2.
MS (ESI): m/z (%) = 211.0 (100) [M+Na]+, 316.2 (4), 353.3 (13), 399.1 (52) [2M+Na]+, 437.2 (6),
569.2(3).
EA (C11H12N2O): berechnet C: 70.19%,H: 6.43%, N: 14.88%, O: 8.50; gefunden:C:70.53%, H: 6.66%,
N:3.93%,O:6.69%.
DiespektroskopischenDatenstimmenmitdeninderLiteraturangegebenenWertenüberein.[254]
7.2.2.1.4
SynthesedesN‐(1‐Phenylethyl)acetamids(rac‐7)
Abbildung133. Acylierungvonrac‐4mitEssigsäurevinylester(125).
Zu1‐Phenylethylamin(rac‐4,0.5mmol,59.8mg)wirdEssigsäurevinylester(125,0.5mmol,57.7mg)
zugegeben undfür 4.5 Stunden bei 60 °C gerührt. DasRohproduktwird indest.H2O(0.5mL)aufge‐
nommenundmitDCMextrahiert.DasProduktwirdalsgelbesÖlerhalten.
Umsatz:95%.
1H‐NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm):1.49(d,3J=6.9Hz,3H,H‐9),1.98(s,3H,
H‐11),5.13(qui, 3J=7.2Hz,1H,H‐7),5.71(br,1H,H‐8),7.25–7.36(m,5H,
Har).
13C‐NMR (500 MHz, CDCl3): 21.82 (C‐9), 23.56 (C‐11), 48.91 (C‐7), 114.85
(C‐13), 126.32 (C‐6, C‐5), 127.49 (C‐2), 128.78 (CC‐1, C‐3), 143.28 (C‐5),
169.25(C‐10).
HPLC:AD‐H‐Säule,95:5(n‐Hexan/i‐PrOH,v/v),210nm,flow:0.8mL/min,
tR=27.39min(R),37.85min(S),ee‐Wert:0%.
IR(ATR):(cm‐1)=3733.9,3278.5,2974.9,2358.8,2340.8,1646.2,1541.3,
1473.4,1447.8,1370.5,1296.7,1274.5,1209.7,1138.5,1028.3,728.9,638.2,519.8.499.2.
159
7 ExperimentellerTeil
MS(ESI):m/z(%)=186.0(100)[M+Na]+,393.3(15),556.3(5).
DiespektroskopischenDatenstimmenmitdeninderLiteraturangegebenenWertenüberein.[274]
7.2.2.1.5
Synthesedes2‐Phenyl‐N‐(1‐phenylethyl)acetamids(rac‐126)
Abbildung134. Acylierungvonrac‐4mit2‐Phenylacetylchlorid(127).[255]
Zu1‐Phenylethylamin(rac‐4,2mmol,0.24g),gelöstinDCM(2.5mL),wirdNEt3(4mmol,0.57mL)
gegebenundfür10Minutenauf0°Cgekühlt(Abbildung134).[255]2‐Phenylacetylchlorid(127,2mmol,
0.27mL)wirdzugetropftundfür21hbeiRaumtemperaturgerührt.Ammoniumchlorid‐Lösungwird
zugegeben und die Phasen werden getrennt. Die wässrige Phase wird mit ges. Natriumhydrogen‐
carbonat‐Lösung(3x)gewaschen,dievereintenorganischenPhasenwerdenmitDCM(3x)extrahiert
und über MgSO4 getrocknet. Das Lösungsmittel wird i.Vak. entfernt. Das Produkt wird als farbloser
Feststofferhalten.
Umsatz:>99%,Ausbeute:80%(0.38g,1.61mmol).
1H‐NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm):1.40(d, 3J=7.0Hz,3H,H‐9),
3.58(s,2H,H‐11),5.12(qui,3J=7.0Hz,1H,H‐7),5.61(br,1H,H‐8),
7.18–7.37(m,12H,Har).
13C‐NMR(500MHz,CDCl3):21.92(C‐9),44.04(C‐11),48.86(C‐7),
126.07(C‐1,C‐5),127.42(C‐3),127.49(C‐15),128.75(C‐2,C‐4),
129.16 (C‐16, C‐14), 129.51 (C‐17, C‐13), 135.01 (C‐13), 143.17
(C‐6),170.13(C‐10).
HPLC: AD‐H‐Säule, 95:5 (n‐Hexan/i‐PrOH, v/v), 210 nm, flow:
0.8mL/min,tR=24.14min(R),3.51min(S),ee‐Wert:<1%.
IR(ATR):(cm‐1)=3317.6,3057.3,3014.9,2973.3,2910.0,2359.1,
1716.3,1646.0,1525.6,1493.8,1450.1,1341.8,1243.2,1209.1,1130.6,1072.0,1027.5,952.6,905.7,
756.4,692.8,532.2.
MS (ESI): m/z (%) = 262.1 (81) [M+Na]+, 303.2 (13), 379.4 (100), 437.3 (57), 502.2 (7) [2M+Na]+,
559.4(7).
EA (C16H17NO): berechnet C: 80.30%, H: 7.16%, N: 5.85%, O: 6.69; gefunden: C:68.55%, H: 6.23%,
N:3.93%,O:8.43%.
DiespektroskopischenDatenstimmenmitdeninderLiteraturangegebenenWertenüberein.[275]
160
7 7.2.2.1.6
ExperimentellerTeil
Synthesedes2‐Methoxy‐N‐(1‐phenylethyl)acetamids(rac‐8)
Abbildung135. Acylierungvonrac‐4mit2‐Methoxyacetylchlorid(128).[256]
Zu 1‐Phenylethylamin (rac‐4, 1.25 mmol, 161.8µL) wird bei 0°C Piperidin (1.05 Äq., 103.8µL)
zugegeben(Abbildung135).[256]Eswirdmit2‐Methoxyacetylchlorid(128,1.1Äq.,131.5µL)versetzt
undfür1hunterEisbadkühlunggerührt.DaserhaltenefarbloseÖlwirdinDCMaufgenommenunddie
Phasenwerdengetrennt.DieorganischePhasewirdmitHCl(1M,2x),mitges.Natriumchlorid‐Lösung
(2x)sowiemitges.Natriumhydrogencarbonat‐Lösung(2x)gewaschenundüberMgSO4getrocknet.Das
Lösungsmittelwirdi.Vak.entfernt.DasProduktwirdalsfarbloserFeststofferhalten.
Umsatz:>99%,Ausbeute:95%(227.8mg,1.18mmol).
1H‐NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm):1.52(d,3J=7.0Hz,3H,H‐12),3.40
(s,3H,H‐12),3.90(d, 3J=10.5Hz,2H,H‐11),5.18(qui, 3J=7.0Hz,1H,
H‐7),6.75(br,1H,H‐8),7.25–7.28(m,1H,Har),7.31–7.37(m,4H,Har).
13C‐NMR(500MHz,CDCl3):21.97(C‐9),48.14(C‐7),59.21(C‐12),72.03
(C‐11), 126.24 (Car), 127.49 (Car), 127.78 (Car), 143.01 (C‐5), 167.71
(C‐10).
HPLC: AD‐H‐Säule, 95:5 (n‐Hexan/i‐PrOH, v/v), 210 nm, flow:
0.8mL/min,tR=13.09min(R),17.47min(S),ee‐Wert:<1%.
IR (ATR): (cm‐1) = 3342.7, 2971.0, 2931.3, 2828.6, 1650.5, 1521.7,
1454.9,1208.0,1112,0,1018.2,977.9,766.0,701.1,663.4,614.5,571.8,537.5,501.7.
MS(ESI):m/z(%)=216.0(100)[M+Na]+,217.0(13),409.2(8)[2M+Na]+.
DiespektroskopischenDatenstimmenmitdeninderLiteraturangegebenenWertenüberein.[276]
7.2.2.1.7
SynthesedesEthyl‐3‐((2,3‐dihydro‐1H‐inden‐1‐yl)amino)‐3‐oxo‐propanoats
(rac‐129)
Abbildung136. SynthesedesAminoindan‐Amidsrac‐129.[257]
161
7 ExperimentellerTeil
Zu1‐Aminoindan(130,1.0mmol,132.5mg)werdenMalonsäurediethylester(9,1.0mmol,159.0mg)
und DBU (0.5 mmol, 78.0 mg) in DCM (0.2 mL) gegeben und bei 40 °C für 3 d gerührt (Abbildung
136).[257] Der Umsatz wird mittels 1H‐NMR‐Spektroskopie bestimmt. Das Rohprodukt wird mittels
Säulenchromatographie(LaufmittelCH/EtOAc1:4)aufgereinigtumdasisolierteProduktzuerhalten.
Umsatz:43%,Ausbeute:17%(40.6mg,0.17mmol).
1H‐NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm):1.28(t, 3J=7.1Hz,3H,
H‐15),1.84(m,1H,H‐2),2.62(m,1H,H‐1),2.88(m,1H,H‐2),
3.00 (m, 1H, H‐2), 3.37 (d, 3J = 2.2 Hz, 2H, H‐12), 4.19 (q,
3J=7.2Hz,2H,H‐14),5.51(q,3J=7.8Hz,1H,H‐9),7.20–7.30
(m,4H,Har).
13C‐NMR(500MHz,CDCl3):14.19(C‐15),30.39(C‐1),34.08
(C‐2), 41.42 (C‐12), 54.89 (C‐9), 61.71 (C‐14), 124.12 (C‐4),
124.92(C‐7),126.92(C‐5),128.11(C‐6),143.00(C‐8),143.48
(C‐3),164.96(C‐11),169.58(C‐13).
HPLC: AD‐H‐Säule, 95:5 (n‐Hexan/i‐PrOH, v/v), 210 nm, flow: 0.8 mL/min, tR=21.89 min (R),
28.47min(S),ee‐Wert:0%.
IR (ATR): (cm‐1) = 3269.9, 3069.2, 2990.9, 2961.8, 2847.6, 2358.0, 1732.4, 1640.2, 1548.9, 1457.6,
1409.5,1363.8,1228.4,1148.2,1023.2,749.1,587.1,539.3.
MS(ESI):m/z(%)=270.1(100)[M+Na]+,315.2(3),437.2(3),517.1(5)[2M+Na]+.
EA(C14H17NO3):berechnetC:68.00%,H:6.93%,N:5.66%;gefunden:C:68.58%,H:6.96%,N:5.77%.
DiespektroskopischenDatensindnichtliteraturbekannt.
7.2.2.2
Analytik
7.2.2.2.1
ValidierungderAufarbeitungvonAAV5mittelsNMR‐Analytik
ZurValidierungderAnalytikwerdenMalonsäurediethylester(9)undrac‐10imVerhältnis1:1einge‐
wogen. Mittels 1H‐NMR‐Spektroskopie wird das Verhältnis beider Komponenten bestimmt. An‐
schließend erfolgt eine Aufarbeitung analog der AAV6, indem filtriert und mit DCM und MTBE (je
10mL) gespült wird. Das Verhältnis der beiden Komponenten wird erneut mittels 1H‐NMR‐Spektro‐
skopieermittelt.DieErgebnissesindinTabelle40dargestellt.
162
7 Tabelle40.
ExperimentellerTeil
ValidierungderAufarbeitungvonAAV6mittels1H‐NMR‐Analytik.
Eintrag
Verhältnis9/rac‐10
vorAufarbeitung
Verhältnis9/rac‐10
nachAufarbeitung
Abweichung
[%]
1
2
3
1:0.98
1:1.02
1:1.04
1:0.99
1:1.06
1:1.05
1
4
1
7.2.2.2.2
BestimmungderEnantiomerenüberschüssedurchchemischeAcylierungdes
resultierendenAmins(S)‐4
DieSyntheseerfolgtanalogderAAV5.Zurac‐1‐Phenylethylamin(rac‐4,0.5mmol,60.1mg)werden
Malonsäurediethylester (9, 0.5mmol, 80.1mg) und CAL‐B (40mg/mmol) gegeben und für 24h bei
60°Cgerührt.DieAufarbeitungerfolgtanalogderAAV5.ImAnschlusswirddergesamteReaktions‐
ansatzzusammenmitAcetanhydrid(132,0.5mmol,47.7µL)für6hbeiRTinChloroformgerührt.Das
Lösungsmittelwirdi.Vak.entfernt.MittelsHPLCwerdendieee‐WertedesAmids(R)‐10bestimmt.Der
ee‐WertdesAmids(S)‐7wurdeebenfallsmittelsHPLCdetektiertundmitdemberechnetenWertfür
(S)‐4verglichen.DieErgebnissesindinTabelle41aufgelistet.
Tabelle41.
BestimmungdesEnantiomerenüberschussesdesresultierendenAmins(S)‐4.
ee‐Wert(S)‐10detektiert
ee‐Wert(S)‐4 berechnet
ee‐Wert(R)‐7detektiert
97%
90%
88%
163
7 ExperimentellerTeil
7.2.2.3
VorversuchezurenzymatischenAcylierungmitBenzylaminenalsSubstrate
7.2.2.3.1
SynthesevonEthyl‐3‐(benzylamino)‐3‐oxopropanoat(133)
Abbildung137. ChemischeAcylierungvonBenzylamin(134)mitMalonsäurediethylester(9).[253]
DieSyntheseerfolgtanalogderAAV5.[253]ZuBenzylamin(134,10.0mmol,1.07g)wirdMalonsäure‐
diethylester(9,10.0mmol,1.60g)gegebenundfür3hzumRückflusserhitzt.DieAufreinigungerfolgt
mittels Säulenchromatographie (Laufmittel: CHCl3/Aceton 85:15). Das Amid 133 wird als farbloser
kristallinerFeststofferhalten.
Umsatz:49%,Ausbeute:48%(1.22g,4.82mmol).
1H‐NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm): 1.28 (t, 3J = 7.0 Hz, 3H,
H‐13),3.36(s,2H,H‐10),4.20(q,3J=7.0Hz,2H,H‐12),4.49(d,
3J=5.5Hz,2H,H‐7),7.28–7.35(m,5H,Har),7.45(br,1H,H‐8).
13C‐NMR (500 MHz, CDCl3): 14.17 (C‐13), 41.21 (C‐10), 43.69
(C‐7),61.74(C‐12),127.63(C‐3),127.82(C‐2,C‐4),128.83(C‐1,
(113)C‐5),138.00(C‐6),156.02(C‐9),169.68(C‐11).
IR (ATR): (cm‐1) = 3280.4, 2977.4, 1732.2, 1638.7, 1551.2,
1499.2,1453.8,1364.9,1284.0,1214.7,1149.2,1027.7,749.5,
670.4,580.4.
DC‐MS(ESI):m/z(%)=244.9(93)[M+Na]+,260.0(19)[M+K]+,465.0(100)[2M+Na]+,466.0(19),906.2
(13).
MS(ESI):m/z(%)=222.0(10)[M]+,244.0(100)[M+Na]+,260.0(34)[M+K]+,465.0(78)[2M+Na]+,
466.1(15),906.3(12).
EA(C17H18N2O2):berechnetC:65.14%,H:6.83%,N:6.33%;gefunden:C:65.37%,H:7.20%,N:6.52%.
DiespektroskopischenDatenstimmenmitdeninderLiteraturangegebenenWertenüberein.[273,277]
164
7 7.2.2.3.2
ExperimentellerTeil
AnalysedesDiamidsN,N‘‐Dibenzylmalonamid(137)
Abbildung138. BildungdesDiamids137alsNebenprodukt.
BeiderchemischenAcylierungdesBenzylamins(134)mitMalonsäurediethylester(9)analogderAAV
5(Abschnitt7.2.2.3.1)entstehtdasgewünschteBenzylamid133(Abbildung138).[253]AlsNebenprodukt
wirddabeidasentsprechendeDiamid137erhalten,welchesdurchSäulenchromatographie(Laufmittel
CHCl3/Aceton85:15)isoliertundalsfarbloserFeststofferhaltenwird.
Umsatz:27%,Ausbeute:20%(0.56g,1.98mmol).
1H‐NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm):3.23(s,2H,H‐10),
4.44(d, 3J=6.0Hz,2H,H‐7+H‐13),7.18(br,2H,H‐8+
H‐12),7.25–7.34(m,10H,Har).
13C‐NMR
(500 MHz, CDCl3): 43.17 (C‐10), 43.76 (C‐7,
C‐13), 127.68 (C3, C‐17), 127.81 (C‐2, C‐4, C‐18, C‐16),
128.85(C‐1,C‐5,C‐19,C‐15),137.80(C‐6,C‐14),167.25
(C‐9,C‐11).
IR (ATR): (cm‐1) = 3279.4, 3062.5, 2359.1, 1654.6, 1623.7, 1541.3, 1452.2, 1354.0, 1243.0, 1225.9,
1026.3,716.8,691,9,604.3.
DC‐MS (ESI): m/z (%) = 305.0 (100) [M+Na]+, 306.0 (15), 320.0 (27) [M+K]+, 587.0 (73) [2M+Na]+,
588.1(20),967.3(24).
MS (ESI): m/z (%) = 102.1 (100), 116.1 (68), 118.1 (30), 305.0 (35) [M+Na]+, 321.0 (10) [M+K]+,
587.0(15)[2M+Na]+,685(17),764.3(31).
EA(C17H18N2O2):berechnetC:72.32%,H:6.43%,N:9.92%;gefunden:C:72.10%,H:6.75%,N:10.00%.
DiespektroskopischenDatenstimmenmitdeninderLiteraturangegebenenWertenüberein.[278]
165
7 ExperimentellerTeil
7.2.2.3.3
AllgemeineArbeitsvorschrift6(AAV6):EnzymatischeAcylierungsubstituierter
Benzylamine
Abbildung139. EnzymatischeAcylierungsubstituierterBenzylamine.
Zu substituiertem Benzylamin (134, 138 ‐ 140, 0.5 – 2.5 mmol) werden Malonsäurediethylester (9,
1Äq.)undCAL‐B(40mg/mmol)gegebenundbei80°Cfür4.5hbei200rpmgerührtoderimThermo‐
Schüttlerbei300rpmgeschüttelt(Abbildung139).DieLipasewirdabfiltriert,mitDCMundMTBE(je
10–40mL)gewaschenunddieLösungsmitteli.Vak.entfernt.DerUmsatzwirdmithilfevon 1H‐NMR‐
Spektroskopiebestimmt.DasProduktwirdmittelsSäulenchromatographieisoliert.
7.2.2.3.4
EnzymatischeSynthesevonEthyl‐3‐(benzylamino)‐3‐oxopropanoat(133)
DieSyntheseerfolgtanalogderAAV6.ZuBenzylamin(134,0.5mmol,53.6mg)werdenMalonsäure‐
diethylester(9,0.5mmol,81.3mg)undCAL‐B(40mg/mmol,20mg)gegebenundbei80°Cfür4.5h
erhitzt.DieAufarbeitungerfolgtanalogderAAV2.DasProdukt133wirdineinerMischungmitdem
Diamid137erhalten.
Umsatz:91%133+9%137.
1H‐NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm):1.28(t, 3J=7.0Hz,3H,H‐
13), 3.36 (s, 2H, H‐10), 4.20 (q, 3J=7.0Hz, 2H, H‐12), 4.48 (d,
3J=5.5Hz,2H,H‐7),7.28–7.35(m,5H,Har),7.45(br,1H,H‐8).
Die analytischen Daten stimmen mit den Vergleichsdaten aus
Abschnitt7.2.1.1undderLiteraturüberein.[277]
7.2.2.3.5
EnzymatischeSynthesevonN‐(m‐Hydroxybenzyl)‐N‐ethylmalonamid(141)
Die Synthese erfolgt analog der AAV 6. Zu 3‐Hydroxybenzylamin (138, 1.0 mmol, 123.8mg) werden
Malonsäurediethylester (9, 1.0mmol, 162.5mg) und CAL‐B (40mg/mmol, 40 mg) gegeben und bei
80°C für 4.5h gerührt. Die Aufreinigung erfolgt mittels Säulenchromatographie (Laufmittel: CHCl3/
Aceton3:2).DasProduktwirdalsfarbloserFeststofferhalten.
166
7 ExperimentellerTeil
Umsatz:38%,Ausbeute:35%+17%(136).
7
HO
1
O
8
2
6
3
5
N
H
10
9
1H‐NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm):1.26(t,3J=7.5Hz,3H,
O
H‐14),3.36(s,2H,H‐11),3.80(s,3H,H‐7),4.18(q,3J=7.0
13
O
1
11 2
14
Hz,2H,H‐13),4.46(d,3J=5.5Hz,2H,H‐8),6.75–6.81(m,
3H,Har),7.18(t,3J=7.5Hz,1H,Har),7.61(br,1H,H‐7).
4
141
C12H15NO4
M = 251.28 g/mol
13C‐NMR (500 MHz, CDCl3): 14.07 (C‐14), 41.12 (C‐11),
43.66 (C‐8), 61.89 (C‐13), 114.80 (C‐3), 114.96 (C‐1),
119.31 (C‐4), 129.94 (C‐4), 139.18 (C‐6), 156.91 (C‐2),
166.03(C‐10),169.42(C‐12).
IR (ATR): (cm‐1) = 3291.6, 2980.8, 2358.9, 1720.8, 1646.4, 1588.9, 1541.5, 1455.3, 1368.9, 1330.2,
1194.0,1154.6,1020.6,946.9,866.2,780.6,731.5,694.3.
MS(ESI):m/z(%)=260.0(100)[M+Na]+,497.1(52).
EA(C13H16NO3):berechnetC:60.75%,H:6.37%,N:5.90%;gefunden;C:59.24%,H6.86%,N:5.83%.
DiespektroskopischenDatensindnichtliteraturbekannt.
7.2.2.3.6
EnzymatischeSynthesevonN‐(m‐Bromobenzyl)‐N‐ethylmalonamid(145)
Die Synthese erfolgt analog der AAV 6. Zu 3‐Brombenzylamin (140, 2.5 mmol, 468.5mg) werden
Malonsäurediethylester (9, 2.5 mmol, 404.1mg) und CAL‐B (40mg/mmol, 200mg) gegeben und bei
80°C für 4.5 h gerührt. Die Aufreinigung erfolgt mittels Säulenchromatographie (Laufmittel:
CHCl3/Aceton85/15).DasProdukt137wirdinFormvonkristallinenNadelnerhalten.
Umsatz:95%,Ausbeute:81%.
1H‐NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm):1.29(t,3J=7.1Hz,3H,
Br
1
2
6
3
5
4
O
7
N
H
9
O
10
11
8
145
C13H16BrNO3
M = 314.18 g/mol
H‐13),3.37(s,2H,H‐10),4.20(q,3J=7.0Hz,2H,H‐12),4.46
12
O
13
(d,3J=6.0Hz,2H,H‐7),7.18–7.23(m,2H,Har),7.39–7.44
(m,2H,Har),7.55(br,1H,H‐8).
13C‐NMR
(500 MHz, CDCl3): 14.19 (C‐13), 41.07 (C‐10),
42.97 (C‐7), 61.86 (C‐12), 122.85 (C‐2), 126.39 (C‐5),
130.37(C‐3+C‐4),130.76(C‐1),140.43(C‐6),165.17(C‐9),
169.72(C‐11).
IR (ATR): (cm‐1) = 3234.5, 3059.8, 2973.5, 2360.5, 2341.5, 1745.7, 1635.4, 1551.8, 1416.9, 1329.3,
1275.8,1234.8,1143.8,1071.7,1030.9,994.6,786.5,683.5.
MS(ESI):m/z(%)=322.0(95),324.0(100)[M+Na]+,393.3(4),437.2(6).
EA(C13H16NO3):berechnetC:48.02%,H:4.70%,N:4.67%;gefunden:C:47.71%,H4.79%,N:4.67%.
DiespektroskopischenDatensindnichtliteraturbekannt.
167
7 ExperimentellerTeil
7.2.2.3.7
SynthesevonN‐(m‐Methoxybenzyl)‐N‐ethylmalonamid(143)
Die Synthese erfolgt analog der AAV 6. Zu 3‐Methoxybenzylamin (139, 2.5 mmol, 345.5mg) werden
Malonsäurediethylester (9, 2.5mmol, 403.4mg) und CAL‐B (40mg/mmol, 200mg) gegeben und bei
80°C für 4.5h gerührt. Die Aufreinigung erfolgt mittels Säulenchromatographie (Laufmittel:
CHCl3/Aceton85/15).DasProdukt138wirdinFormvonkristallinenNadelnerhalten.
Umsatz:95%,Ausbeute:84%.
O
7
1
2
6
3
O
8
5
N
H
10
1H‐NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm):1.29(t,3J=7.0Hz,3H,
O
11
12
H‐14),3.36(s,2H,H‐11),3.80(s,3H,H‐7),4.20(q,3J=7.0
13
O
9
14
4
143
C13H17NO4
M = 251.28 g/mol
Hz,2H,H‐13),4.46(d,3J=5.5Hz,2H,H‐8),6.81–6.84(m,
2H,Har),6.87–6.88(d,3J=7.5Hz,1H,Har),7.25(t,3J=8.0
Hz,2H,Har),7.55(br,1H,H‐7).
13C‐NMR (500 MHz, CDCl3): 14.18 (C‐14), 41.20 (C‐11),
43.65 (C‐8), 55.37 (C‐7), 61.76 (C‐13), 113.08 (C‐1),
113.43 (C‐3), 120.03 (C‐5), 129.88 (C‐4), 139.58 (C‐6),
160.00(C‐2),165.01(C‐10),169.70(C‐12).
IR (ATR): (cm‐1) = 3229.5, 3056.8, 2978.2, 2361.0, 2341.5, 1748.1, 1635.5, 1597.8, 1553.4, 1453.1,
1325.2,1276.3,1134.6,1037.7,879.5,792.2,737.6,669.9,570.0.
MS(ESI):m/z(%)=322.0(95),324.0(100)[M+Na]+,393.3(4),437.2(6).
EA(C13H17NO4):berechnetC:62.14%,H:6.82%,N:5.57%;gefunden;C:61.96%,H7.04%,N:5.63%.
DiespektroskopischenDatensindnichtliteraturbekannt.
7.2.2.3.8
BestimmungdesVerlustsvonBenzylamin(134)undMalonsäurediethylester(9)
ZurBestimmungdesVerlustsvonBenzylamin(134)undMalonsäurediethylester(9)währendderAuf‐
arbeitungwirdeinebekannteMengederSubstanzenübereinenbestimmtenZeitraumbei230bzw.
550mbarund40°Cgerührt.DurchAuswaagewirdderVerlustderSubstanzenbestimmt.DieErgeb‐
nissesindinTabelle42aufgelistet.
168
7 Tabelle42.
ExperimentellerTeil
Bestimmung des Verlusts von Benzylamin (134) und Malonsäurediethylester (9)
währendderAufarbeitung.
Eintrag
Substanz
Zeit
[min]
Verlust[mg]
Verlust[%]
Verlust[mg]
1
2
3
4
5
134
134
134
134
134
0
15
30
60
120
0
1.1
1.8
2.9
7.2
0
10
17
28
69
0
0
0.5
1.2
2.1
0
0
3
7
12
6
7
8
9
10
9
9
9
9
9
0
15
30
60
120
0
0.4
0.7
1.3
4.0
0
1
2
3
9
0
0.1
0.1
0.5
0.9
0
0
0
1
2
230mbar
Verlust[%]
550mbar
7.2.2.3.9
AllgemeineArbeitsvorschrift7(AAV7):Kontrollederchemischen
ParallelreaktionderAcylierungverschiedenerBenzylamine
ZusubstituiertemBenzylamin(134,139bzw.140,0.25‐0.5mmol)wirdMalonsäurediethylester(9,
1Äq.)gegebenundbei80°Cfür4.5hgerührt.EswirdanalogderAAV6filtriert,mitDCMundMTBE(je
10–40mL)gewaschenunddieLösungsmitteli.Vak.entfernt.DerUmsatzwirdmittels1H‐NMR‐Spektro‐
skopiebestimmt.DieErgebnissesindinTabelle43aufgelistet.
Tabelle43.
ParallelablaufendechemischeAcylierungsubstituierterBenzylamine.
Eintrag
Amin
UmsatzAmid[%]
UmsatzDiamid[%]
1
2
3
134
140
139
0
7
8
0
0
2
169
7 ExperimentellerTeil
7.2.2.3.10
UntersuchungenzurDiamidbildungausgehendvon3‐Methoxybenzylamin(139)
Zu3‐Methoxybenzylamin(139,0.1mmol)werdenanalogderAAV2Malonsäurediethylester(9,0.6–
1.5mmol)undCAL‐B(40mg/mmol)zugegebenundfür4.5hbei80°Cgerührt.DieAufarbeitungerfolgt
analogderAAV6.DieUmsätzewerdenmittels1HNMR‐Spektroskopieermittelt.DieErgebnissewerden
inTabelle44aufgelistet.
Tabelle44.
Untersuchungen zur Bildung des Diamids 144 bei der enzymatischen Acylierung von
3‐Methoxybenzylamin(139).
Eintrag
Malonsäurediethylester(9)
[mmol]
UmsatzAmid143
[%]
UmsatzDiamid144
[%]
1
2
3
4
0.6
1.0
1.2
1.5
53
91
84
79
32
9
3
1
7.2.2.3.11
LösungsmitteleffektderenzymatischenAcylierungsubstituierterBenzylamine
Die enzymatische Acylierung substituierter Benzylamine (0.5 mmol) mit Malonsäurediethylester (9,
1Äq.)undLipaseCAL‐B(40mg/mmol)wurdebeiunterschiedlichenReaktionsbedingungenuntersucht.
DieSynthesemitanschließenderAufarbeitungerfolgteanalogderAAV6.DieErgebnissesindinTabelle
45aufgelistet.
170
7 Tabelle45.
ExperimentellerTeil
EinleitendeVersuchezurProzessoptimierungderenzymatischenAcylierung
substituierterBenzylamine.
Eintrag
Amin
T[°C]
t[h]
Solvens
1
140
60
4.5
1,4‐Dioxan
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14d)
15
140
140
139
138
138
138
138
138
138
138
138
138
138
138
60
60
60
80
80
80
80
80
60
60
60
60
RT
RT
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
4.5
24
24
n‐Heptan
‐
‐
MTBE
THF
2‐Me‐THF
MeCN
i‐PrOH
n‐Heptan
EtOAc
Malonester 9(100Äq.)
Et2O
Et2O
EtOH
logP
Umsatz[%]
‐1.10a)/
‐0.30
4.50b)
‐
‐
0.94b)
0.46b)
1.00c)
‐0.34b)
0.28b)
4.50b)
0.73b)
0.90c)
0.89b)
0.89b)
‐0.24a)
75
76
91
93
51
75
70
43
22
45
41
50
30
30
5
Datenentnommenaus:a)LAANEetal.[175];b)SANGSTERetal.[177];c)BestimmtdurchAdvancedChemistryDevelopment
(ACD/Labs)SoftwareV11.02[263];d)Zugabevon1.5ÄquivalentenMalonsäurediethylester(9).
7.2.2.4
EnzymatischenRacematspaltungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)
7.2.2.4.1
Standardreaktion:Racematspaltungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)mit
Malonsäurediethylester(9)
Abbildung140.
Racematspaltungvonrac‐4mitMalonester9.
DieSyntheseerfolgtanalogderAAV6.Zurac‐1‐Phenylethylamin(rac‐4,5.0mmol,604.1mg)werden
Malonsäurediethylester(9,5.1mmol,810.6mg)undCAL‐B(40mg/mmol)gegebenundfür4.5hbei
171
7 ExperimentellerTeil
80°C und 200 rpm gerührt (Abbildung 140). Die Aufarbeitung erfolgt analog der AAV6. Durch
AufreinigungmittelsSäulenchromatographie(Laufmittel:CH/EtOAc2:1)wirddasProduktrac‐10als
farbloserFeststofferhalten.
Umsatz:44%,Ausbeute:26%(312.0mg,1.3mmol).
1H‐NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm): 1.28 (t, 3J = 7.0 Hz, 3H,
H‐14),1.51(d,3J=7.0Hz,3H,H‐9),3.31(d,3J=5.0Hz,2H,H‐11),
4.19(q,3J=7.5Hz,2H,H‐13),5.15(qui,3J=7.0Hz,1H,H‐7),7.24
–7.28(m,1H,Har),7.31‐7.36(m,5H,Har),7.47(m,1H,H‐8).
HPLC: AD‐H‐Säule, 95:5 (n‐Hexan/i‐PrOH, v/v), 210 nm, flow:
0.8mL/min,tR=17.0min(R),27.1min(S),ee‐Wert:96%.
DiespektroskopischenDatenstimmenmitdeninderLiteratur
undinAbschnitt7.2.2.1.1angegebenenWertenüberein.[279]
7.2.2.4.2
ProzessoptimierungderenzymatischenRacematspaltungvonrac‐4
Die enzymatische Racematspaltung von 1‐Phenylethylamin (rac‐4) mit Malonsäurediethylester (9,
1Äq.) und Lipase CAL‐B (40 mg/mmol) wurde in Analogie zu AAV 6 mit unterschiedlichen
Reaktionsbedingungen untersucht. Die Synthese erfolgte analog der AAV 6. Die Ergebnisse sind in
Tabelle46aufgelistet.
Tabelle46.
ProzessoptimierungderenzymatischenRacematspaltungvonrac‐4.
Eintrag
T[°C]
t[h]
Umsatz[%]
eeP [%]
eeS [%] a)
E
1b)
80
80
60
60
60
40
40
20
0
4.5
4.5
4.5
8
24
4.5
6
4.5
4.5
42
46
42
46
50
45
46
41
24
92
96
97
89
94
99
85
90
99
67
82
70
76
94
81
72
63
n.b.
48
>100
>100
39
>100
>100
27
36
>100
2
3
4
5
6c)
7
8
9c)
a)berechnetmit„Enantioselectivity“[258];b)Zugabevon0.4mLMTBE;c)präperativeDurchführungderVersuchedurchT.Geisler.
172
7 7.2.2.4.3
ExperimentellerTeil
UntersuchungderParallelreaktionderAcylierungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)
DieSynthesenwerdenanalogderAAV7durchgeführt.Zu1‐Phenylethylamin(rac‐4,0.5mmol)wird
Malonsäurediethylester(9,1Äq.)gegebenundbeiRT–60°Cfür4.5hgerührt.Eswird,analogderAAV
6,filtriert,mitDCMundMTBE(je10mL)gewaschenunddieLösungsmitteli.Vak.entfernt.DerUmsatz
wirdmittels1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmt.DieErgebnissesindinTabelle47aufgelistet.
Tabelle47.
NegativkontrollederRacematspaltungvonrac‐4mitMalonsäurediethylester(9).
Eintrag
T[°C]
Umsatzrac‐10[%]
1
2
3
60
40
RT
0
0
0
7.2.2.4.4
EnzymatischeRacematspaltungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)beigeringerer
Enzymbeladung
Abbildung141. Enzymatische Racematspaltung von rac‐4 mit Malonsäurediethylester (9) bei
geringererEnzymbeladung.[264]
Zu 1‐Phenylethylamin (rac‐4, 0.49 mmol, 59.8 mg) werden Malonsäurediethylester (9, 0.49 mmol,
79.1mg) undCAL‐B (2mg/mmol, 1 mg)gegeben undfür 24 h beiRT und 200 rpmgerührt.[264] Das
EnzymwirdabfiltriertundanalogderAAV6mitDCMundMTBE(je10mL)gespült.DieLösungsmittel
werdeni.Vak.entfernt.DerUmsatzwirdmittels1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmt.
Umsatz:25%.
HPLC:AD‐H‐Säule,95:5(CO2/i‐PrOH,v/v),210nm,flow:0.8mL/min,tR=21.38min(R),34.97min(S),
ee‐Wert:>95%.
173
7 ExperimentellerTeil
7.2.2.4.5
EnzymatischeRacematspaltungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)beigeringerer
EnzymbeladunginEt2O
Abbildung142. EnzymatischeRacematspaltungvonrac‐4beigeringererEnzymbeladunginEt2O.[30]
Zu1‐Phenylethylamin(rac‐4,1.25–2.5mmol)werdenderentsprechendeEster9oder111(1.5Äq.)
undCAL‐B(10mg/mmol)gegebenundinEt2O(5–10mL)für24hbeiRTgerührt(Abbildung142).[30]
Das Enzym wird abfiltriert und analog der AAV 6 mit DCM und MTBE (je 10 mL) gespült. Die
Lösungsmittelwerdeni.Vak.entfernt.DerUmsatzwirdmittels 1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmt.Die
ErgebnissesindinTabelle48aufgelistet.
Tabelle48.
EnzymatischeRacematspaltungvonrac‐4mitgeringererEnzymbeladunginEt2O.[30]
Eintrag
Ester
Umsatz[%]
ee[%]
E
1
2
9
111
48
52
95
95
>100
>100
7.2.2.5
Enzymrecycling
Das Enzymrecycling wird analog der AAV 6 durchgeführt. Dazu werden 1‐Phenylethylamin (rac‐4,
5mmol)undMalonsäurediethylester(9,5mmol)zusammenmitderCAL‐B(40mg/mmol)für4.5hbei
60°Cgerührt.DieAufarbeitungerfolgtanalogderAAV6.DiezurückerhalteneCAL‐Bwirdgetrocknet
undimnächstenZykluseingesetzt.DieErgebnissesindinTabelle49aufgelistet.
174
7 Tabelle49.
ExperimentellerTeil
Enzymrecycling.
Eintrag
Zyklus
Umsatz[%]
eeP [%]
eeS[%]a)
E
68
35
n.b.
n.b.
n.b.
39
13
19
26
45
1
1
43
90
2
2
30
81
3
3
25
87
4
4
20
90
b)
5
24
94
5 a)berechnetmit„Enantioselectivity“[258];b)Reaktionsdauer:6,5h;n.b.=nichtbestimmt.
7.2.2.6
Lipasen‐ScreeningdurchAcylierungvonAminen
7.2.2.6.1
Lipasen‐ScreeningdurchAcylierungvonBenzylamin(134)
Das Screening wird analog der AAV 6 durchgeführt. Dazu werden Benzylamin (134, 0.5mmol) und
Malonsäurediethylester(9,0.5mmol)zusammenmitderjeweiligenLipase(20mg)inMTBE(0.3mL)
für3hbei60°CineinemThermomix‐Schüttlerbei300rpmgeschüttelt.DieAufarbeitungerfolgtanalog
derAAV6.DieErgebnissesindinTabelle50aufgelistet.
Tabelle50.
Lipasen‐ScreeningmittelsAcylierungvonBenzylamin(134).
Eintrag
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Lipase
Umsatz
Amid133
[%]
Umsatz
Diamid137
[%]
Gesamtumsatz
[%]
CAL‐B(Novozym435)
Toyobo
Hogpancreas(FLUKA)
L„AMANO“5
Rhizopusniveus(FLUKA)
L.P.L.„AMANO“100S
GC„AMANO“4
R„AMANO“10
AY„AMANO“30
NConc(AMANO)
89
11
12
17
6
6
22
19
17
6
10
3
3
6
1
1
10
9
6
4
>99
14
15
20
7
7
32
28
23
10
175
7 ExperimentellerTeil
Eintrag
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
Lipase
AP6(AMANO)
PSimmob.aufToyonite‐200‐P
(AMANO)
PSimmob.aufDiatomite(AMANO)
M‐AP10(AMANO)
F‐AP15(AMANO)
R10(AMANO)
CE„AMANO“5
D„AMANO“20
AK„AMANO“
AYS„AMANO“
PS„AMANO“SD
CAL‐Bimmob.(C‐LECTA)
CAL‐Blyo.(C‐LECTA)
Umsatz
Amid133
[%]
Umsatz
Diamid137
[%]
Gesamtumsatz
[%]
6
1
7
15
3
18
4
5
6
12
18
22
13
8
11
89
94
<1
<1
<1
1
7
11
3
1
3
11
6
5
5
6
13
25
33
16
9
15
>99
>99
7.2.2.6.2
Lipasen‐ScreeningdurchAcylierungvon3‐Hydroxybenzylamin(138)
Das Screening wird analog der AAV 6 durchgeführt. Dazu werden 3‐Hydroxybenzylamin (138,
0.1mmol) und Malonsäurediethylester (9, 0.1mmol) zusammen mit der jeweiligen Lipase
(40mg/mmol,4mg)inMTBE(0.3mL)für3hbei60°CineinemThermomix‐Schüttlerbei300rpm
geschüttelt.DieAufarbeitungerfolgtanalogderAAV6.DieErgebnissesindinTabelle51aufgelistet.
Tabelle51.
Lipasen‐ScreeningmittelsAcylierungvon3‐Hydroxybenzylamin(138).
Eintrag
Lipase
1
2
3
4
5
6
7
CAL‐B(Novozym435)
L„AMANO“5
GC„AMANO“4
CE„AMANO“5
R„AMANO“10
D„AMANO“20
AY„AMANO“30
PSimmob.aufToyonite‐200‐P
(AMANO)
8
176
Umsatz
Amid141
[%]
Umsatz
Diamid142
[%]
Gesamtumsatz
[%]
52
0
0
0
0
0
0
12
0
0
0
0
0
0
60
0
0
0
0
0
0
47
0
47
7 ExperimentellerTeil
Eintrag
Lipase
Umsatz
Amid141
[%]
9
10
11
BSA
CAL‐Bimmob.(C‐LECTA)
CAL‐Blyo.(C‐LECTA)
0
44
18
Umsatz
Diamid142
[%]
Gesamtumsatz
[%]
0
3
<1
0
47
18
7.2.2.6.3
Lipasen‐ScreeningdurchAcylierungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)
DieSynthesenwerdennachAAV6durchgeführt.Dafürwerden1‐Phenylethylamin(rac‐4,0.1mmol)
und Malonsäurediethylester (9, 0.1mmol) zusammen mit der jeweiligen Lipase (4 mg) in MTBE
(0.3mL) für 3 h bei 60 °C in einem Thermomix‐Schüttler bei 300 rpm geschüttelt. Die Aufarbeitung
erfolgtanalogderAAV6.DieErgebnissesindinTabelle16aufgelistet.DieErgebnissesindinTabelle52
aufgelistet.
Tabelle52.
Lipasen‐ScreeningmittelsAcylierungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4).
Eintrag
Lipase
Umsatz[%]
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
CAL‐B(Novozym435)
L„AMANO“5
GC„AMANO“4
CE„AMANO“5
R„AMANO“10
D„AMANO“20
AY„AMANO“30
PSimmob.aufToyonite‐200‐P(AMANO)
CAL‐Bimmob.(C‐LECTA)
CAL‐Blyo.(C‐LECTA)
46
0
0
0
0
0
0
<1
45
13
177
7 ExperimentellerTeil
7.2.2.7
EnzymatischeRacematspaltungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)mitalternativen
LipasenCAL‐BvonC‐LECTA
7.2.2.7.1
AllgemeineArbeitsvorschrift9(AAV9):VergleichderAktivitätvonLipasenvon
C‐LECTAmittelsTitrationmitNaOH
ZurBestimmungderEnzymaktivitätwirdPuffer(KPi,pH7,10mM)mitEssigester5gesättigt,indem
PufferundEsterfür1hbeiRTgerührtundanschließenddiePhasengetrenntwerden.Zunächstwird
alsReferenzdieAktivitätderCAL‐B(Novozym435)bestimmt.AnschließendwerdendiebeidenLipasen
von C‐LECTA,immobilisiertaufeinemMethacrylat‐Trägersowielyophilisiert,vermessen.Dazuwerden
20mgEnzymin5mLPuffervorgelegtundgegebenenfallsaufdieentsprechendeTemperaturerwärmt.
Vor Beginn der Messung ist der pH‐Wert des Enzym‐enthaltenen Puffers zu prüfen und mithilfe der
wässr.NaOH‐Lösung(0.05M)neueinzustellen.DurchZugabevon5mLdesEtOAc‐ges.Pufferswirddie
Titrationgestartet.Gemessenwird1MinutejedeSekunde,wobeiderVerbrauchanwässr.NaOH‐Lösung
beobachtetunddieAnfangssteigungbestimmtwird.Diesekannamgenauestenbestimmtwerden,wenn
derKurvenverlaufzuBeginnderMessungübermehrereSekundenkonstantist.Gegebenenfallsmuss
dieMengedesimmobilisiertenEnzymsreduziertbzw.dieLösungderlyophilisiertenCAL‐Bverdünnt
und die Messung entsprechend wiederholt werden.Für die Berechnung der Enzymaktivität wird die
AnfangssteigungderTitrationmitwässr.NaOH‐Lösung(0.1M)verwendet.DieBerechnungderEnzym‐
aktivitäterfolgtnachfolgenderGleichung6:
Gleichung6
U/mg: Enzymaktivität
M:
MolaritätderNaOH[µmol/mL]
:
AnfangssteigungdesKurvenverlaufs[mL/sec]
f:
Umrechnungsfaktor[sec/min]
m:
MengederLipasein5mLPuffer[mg]
IndieserArbeitsindM=50µmol/mLundf=60sec/min.
7.2.2.7.2
BestimmungderEnzymaktivitätenderLipasenvonC‐LECTAmittels
enzymatischerSpaltungdesEssigesters5bei20°C
Die Spaltung des Essigesters 5 zu Essigsäure und Ethanol mit der immobilisierten sowie der
lyophilisiertenCAL‐BvonC‐LECTAwirdanalogderAAV7bei20°Cdurchgeführt.AlsReferenzdientdie
CAL‐BvonSIGMAALDRICH(Novozym435).DiefürNovozym435erhalteneAktivitätvon855U/gwirdals
178
7 ExperimentellerTeil
100%definiertunddiejeweilsgemessenenAktivitätenderLipasenwerdenaufdiesenWertbezogen.
DieErgebnissesindinTabelle53aufgelistet.
Tabelle53.
EnzymkatalysierteSpaltungdesEssigesters5mitunterschiedlichenLipasenbei20°C.
Eintrag
Lipase
Enzym
[mg/mmol]
Steigung
[mL/sec]
Aktivität
[U/mg]
Rel.Aktivität
[%]
1
Novozym435
20
0.0057
0.855
100
2
C‐LECTAimmobilisiert
20
0.0039
0.585
68
3
C‐LECTAlyophilisiert
1
0.0057
17.100
2000
7.2.2.7.3
BestimmungderEnzymaktivitätenderLipasenmittelsenzymatischerSpaltung
desEssigesters5bei60°C
Die Spaltung des Essigesters 5 zu Essigsäure und Ethanol mit der immobilisierten sowie der lyo‐
philisiertenCAL‐Bvon C‐LECTAwirdanalogderAAV5bei60°Cdurchgeführt.AlsReferenzdientdie
CAL‐B von SIGMA ALDRICH (Novozym435). Die für CAL‐B Novozym 435 bestimmte Aktivität von
3.180U/mgwirdals100%definiertunddiejeweilsgemessenenAktivitätenderLipasenwerdenauf
diesenWertbezogen.DieErgebnissesindinTabelle54aufgelistet.
Tabelle54.
EnzymkatalysierteSpaltungdesEssigesters5mitunterschiedlichenLipasenbei60°C.
Eintrag
Lipase
Enzym
[mg/mmol]
Aktivität
[U/mg]
Rel.Aktivität
[%]
1
Novozym435
20
3.180
100
2
C‐LECTAimmobilisiert
20
2.190
69
3
C‐LECTAlyophilisiert
1
31.800
1000
179
7 ExperimentellerTeil
7.2.2.7.4
EnzymatischeRacematspaltungvonrac‐4mittelsimmobilisierterCAL‐Bvon
C‐LECTA
NachderAAV6werden1‐Phenylethylamin(rac‐4,0.5mmol)undMalonsäurediethylester(9,0.5mmol)
zusammenmitimmobilisierterCAL‐Bvon C‐LECTA(2.190U/mg,29.0mg)undMTBE(0‐0.5mL)für
4.5hbei60°Cgerührt.DieAufarbeitungerfolgtanalogderAAV1.DieErgebnissesindinTabelle55
aufgelistet.
Tabelle55.
Enzymkatalysierte Racematspaltung von rac‐4 mittels immobilisierter CAL‐B von
C‐LECTA.
Eintrag
MTBE[mL]
Umsatz[%]
eeP [%]
eeS [%]a)
E
1
2
0
0.5
52
49
96
84
96
81
194
28
a)berechnetmit„Enantioselectivity“[258].
7.2.2.7.5
EnzymatischeRacematspaltungvonrac‐4mittelslyophilisierterCAL‐Bvon
C‐LECTA
NachderAAV6werden1‐Phenylethylamin(rac‐4,0.5mmol)undMalonsäurediethylester(9,0.5mmol)
zusammenmitlyophilisierterCAL‐Bvon C‐LECTA(31.8U/mg,2‐10mg)für4.5‐24hbei20‐60°C
gerührt.GegebenenfallserfolgtnocheineZugabevonMTBE(0–0.5mL)unddest.Wasser(10µL).Es
erfolgtkeineweitereAufarbeitung.DerUmsatzwirdmittels1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmt.Vorder
Bestimmungdesee‐WertesmittelsHPLCwirddielyophilisierteCAL‐BmittelsSpritzenfilterabfiltriert.
DieErgebnissesindinTabelle56aufgelistet.
180
7 Tabelle56.
ExperimentellerTeil
EnzymkatalysierteRacematspaltungvonrac‐4mittelslyophilisierterCAL‐BvonC‐LECTA.
Eintrag
CAL‐B[mg]
T[°C]
t[h]
Umsatz [%]
ee[%]
E
1
2
3
4
5a)
6b)
2
10
2
2
2
2
60
60
60
20
60
60
4.5
4.5
24
24
4.5
4.5
9
26
19
6
7
6
81
91
74
80
87
n.b.
10
29
8
10
2
n.b.
a)Zugabevon0.5mLMTBE;cb)Zugabevon10µLdest.Wasser;n.b.=nichtbestimmt.
7.2.2.8
VariationderAcyldonoren
7.2.2.8.1
EnzymatischeRacematspaltungvonrac‐4mitalternativenAcyldonoren
Abbildung143. Vergleich von alternativen Acyldonoren durch enzymatische Racematspaltung von
rac‐4.
Der Vergleich der alternativen Acyldonoren erfolgt analog der AAV 6. Zu 1‐Phenylethylamin (rac‐4,
0.5mmol) wird der entsprechende Acyldonor (1Äq.) gegeben und bei RT – 60 °C für 4.5 h gerührt
(Abbildung 143). Die Aufarbeitung erfolgt nach der AAV 6. Der Umsatz wird mittels 1H‐NMR‐
Spektroskopiebestimmt.DieErgebnissesindinTabelle57aufgelistet.
181
7 ExperimentellerTeil
Tabelle57. VergleichderalternativenAcyldonorenmittelsRacematspaltungvonrac‐4.
Eintrag
Acyldonor
T[°C]
Umsatz[%]
eeP [%]
eeS [%]a)
E
1
2
3
4
5
6
7
8b)
9
10
11c)
12c)
122
122
147
147
111
111
111
111
124
124
125
125
60
40
60
40
60
40
RT
RT
60
40
60
40
51
49
15
4
25
31
29
51
45
40
16
17
65
67
53
n.b.
92
82
71
87
10
11
10
22
68
64
n.b.
n.b.
n.b.
37
30
91
8
7
n.b.
n.b.
9
10
4
n.b.
33
14
8
45
1
1
1
2
a)bestimmtmittels„Enantioselectivity“ [258];b)Reaktionszeitt=24h,nachAAV4:CAL‐B=10mg/mmol,Et2O=4mL/mmol;
c)Zugabevon0.5mLMTBE;n.b.=nichtbestimmt.
7.2.2.8.2
ParallelablaufendechemischeAcylierungvonrac‐4mitunterschiedlichen
Acyldonoren
Abbildung144. ParallelablaufendechemischeAcylierungvonrac‐4mitalternativenAcyldonoren.
DieReaktionenwerdenanalogderAAV7durchgeführt.Zu1‐Phenylethylamin(rac‐4,0.5mmol)wird
derentsprechendeAcyldonor(1Äq.)gegebenundbeiRT‐60°Cfür4.5hgerührt(Abbildung144).Der
Umsatz wird, ohne vorherige Aufarbeitung, mittels 1H‐NMR‐Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse
sindinTabelle58aufgelistet.
182
7 Tabelle58.
ExperimentellerTeil
ParallelablaufendeAcylierungvonrac‐4mitalternativenAcyldonoren.
O
O
O
O
O
122
111
147
O
O
O
O
O
N
O
O
124
125
Eintrag
Acyldonor
T[°C]
Umsatz[%]
eeP [%]
eeS[%]a)
E
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
122
122
147
147
111
111
124
124
125
125
60
40
60
40
60
40
60
40
60
40
0
0
0
0
2
0
33
12
93
81
‐
‐
‐
‐
n.b.
‐
3
5
0
0
‐
‐
‐
‐
n.b.
‐
1
n.b.
13
4
‐
‐
‐
‐
n.b.
‐
1
1
1
1
a)Bestimmtmittels„Enantioselectiviy“[258];n.b.=nichtbestimmt.
7.2.2.8.3
KinetikderRacematspaltungvonrac‐4mitMalonsäurediethylester(9)
DieSynthesenerfolgenanalogderAAV6.Zu1‐Phenylethylamin(rac‐4,0.5mmol)werdenMalonsäure‐
diethylester(9,1Äq.)undCAL‐B(40mg/mmol)gegebenundbei60°Cfür1min–24hgerührt.Die
AufarbeitungerfolgtanalogderAAV6.DieErgebnissesindinTabelle59aufgelistet.
Tabelle59.
KinetikderenzymatischenRacematspaltungvonrac‐4mitMalonsäurediethylester(9).
Eintrag
t[min]
Umsatz[%]
eeP [%]
eeS[%]a)
E
1
1
15
97
n.b.
78
2
5
26
95
n.b.
54
3
10
30
94
40
48
4
20
32
95
45
61
5
30
33
97
48
>100
183
7 ExperimentellerTeil
Eintrag
t[min]
Umsatz[%]
eeP [%]
eeS [%]a)
E
6
45
36
97
55
>100
7
60
37
98
58
>100
8
120
41
97
67
>100
9
180
46
98
83
>100
10
270
43
96
70
>100
11
480
45
89
73
37
12
1440
49
98
94
>100
a)Bestimmtmittels„Enantioselectivity“
;n.b.=nichtbestimmt.
[258]
7.2.2.8.4
KinetikderRacematspaltungvonrac‐4mitPhenoxyessigsäureethylester(122)
Die Synthesen erfolgenanalog der AAV6. Zu 1‐Phenylethylamin (rac‐4, 0.5mmol) werden Phenoxy‐
essigsäureethylester (122, 1 Äq.) und CAL‐B (40mg/mmol) gegeben und bei 60°C für 1 min – 24 h
gerührt.DieAufarbeitungerfolgtanalogderAAV6.DieErgebnissesindinTabelle60aufgelistet.
Tabelle60.
KinetikderenzymatischenRacematspaltungvonrac‐4mitPhenoxyessigester122.
Eintrag
t[min]
Umsatz[%]
eeP [%]
eeS [%]a)
E
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1
5
10
20
30
45
60
120
180
270
480
1440
30
43
41
42
47
49
50
52
51
57
51
56
79
74
73
71
71
64
62
64
65
68
69
61
34
56
51
51
63
61
62
69
67
90
72
78
12
12
11
10
11
8
8
9
9
16
12
9
a)Bestimmtmittels„Enantioselectiviy“[258];n.b.=nichtbestimmt.
184
7 7.2.2.8.5
ExperimentellerTeil
KinetikderRacematspaltungvonrac‐4mitCyanessigsäureethylester(124)
DieSynthesenerfolgenanalogderAAV6.Zu1‐Phenylethylamin(rac‐4,0.5mmol)werdenCyanessig‐
säureethylester(124,1Äq.)undCAL‐B(40mg/mmol)gegebenundbei60°Cfür1min–24hgerührt.
DieAufarbeitungerfolgtanalogderAAV6.DieErgebnissesindinTabelle61aufgelistet.
Tabelle61.
Kinetik der enzymatischen Racematspaltung von rac‐4 mit Cyanessigsäureethylester
(124).
Eintrag
t[min]
Umsatz[%]
eeP [%]
eeS[%]a)
E
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1
5
10
20
30
45
60
120
180
270
480
1440
21
27
18
20
21
29
27
29
41
48
51
65
2
4
2
4
3
2
7
0
10
10
12
2
n.b.
n.b.
n.b.
n.b.
n.b.
n.b.
n.b.
n.b.
7
9
12
4
1
1
1
1
1
1
1
0
1
1
1
1
a)Bestimmtmittels„Enantioselectiviy“[258];n.b.=nichtbestimmt
7.2.2.8.6
KinetikderRacematspaltungvonrac‐4mitMethoxyessigsäureethylester(111)
DieSynthesenerfolgenanalogderAAV6.Zurac‐1‐Phenylethylamin(rac‐4,0.5mmol)werdenMethoxy‐
essigsäureethylester (111,1 Äq.) und CAL‐B (40mg/mmol)gegeben und bei 60 °C für 1 min – 24 h
gerührt.DieAufarbeitungerfolgtanalogderAAV6.DieErgebnissesindinTabelle62aufgelistet.
185
7 ExperimentellerTeil
Tabelle62. KinetikderenzymatischenRacematspaltungvonrac‐4mitMethoxyessigsäureethylester
(111).
Eintrag
t[min]
Umsatz[%]
ee[%]
E
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
1
5
10
20
30
45
60
120
180
270
480
1440
16
17
17
16
18
19
18
24
19
22
27
33
72
74
76
77
79
78
78
79
72
92
77
83
7
8
9
9
9
10
10
11
7
31
10
16
7.2.2.9
1‐Aminoindan(rac‐130)alsSubstrat
7.2.2.9.1
AnalysedesDiamidsN1,N3‐bis(2,3‐dihydro‐1H‐inden‐1‐yl)malonamid(129)
Abbildung145. BildungdesDiamids131alsNebenprodukt.
Bei der Reaktion des 1‐Aminoindans (rac‐130) mit Malonsäurediethylester (9, 1 Äq.) als Acyldonor
analogderAAV6entstehtdasgewünschteIndan‐Amid(rac‐129,Abbildung145).AlsNebenprodukt
wirddabeidasentsprechendeDiamid131erhalten,welchesdurchSäulenchromatographie(Laufmittel:
CH/EtOAc1:4)isoliertwerdenkann.DasDiamid131wirdalsfarbloserFeststofferhalten.
186
7 ExperimentellerTeil
Umsatz:11%,Ausbeute:9%(29.9mg,0.09mmol).
1H‐NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm):1.89(m,2H,H‐2
+H‐22),2.57(m,2H,H‐1+H‐23),2.90(m,2H,H‐2+
H‐22), 3.02 (m, 2H, H‐1 + H‐23), 3.27 (s, 2H, H‐12),
5.14(q,3J=7.8Hz,2H,H‐9+H‐15),7.21–7.31(m,8H,
Har),(t,3J=7.5Hz,2H,H‐10+H‐14).
13C‐NMR(500MHz,CDCl3):30.36(C‐2+C‐22),33.82
(C‐1+C‐23),43.31(C‐12),54.90(C‐9+C‐15),124.11
(C‐4+C‐20),124.89(C‐5+C‐19),126.86(C‐6+C‐18),
128.11(C‐7+C‐17),142.81(C‐8+C‐16),143.41(C‐3+C‐21),167.24(C‐11+C‐13).
MS(ESI):m/z(%)=357.2(100)[M+Na]+,691.2(30)[2M+Na]+.
EA(C21H22N2O2):berechnetC:75.42%,H:6.63%,N:8.38%;gefunden:C:74.27%,H:6.63%,N:8.08%.
DiespektroskopischenDatensindnichtliteraturbekannt.
7.2.2.9.2
BestimmungdesVerlustsvon1‐Aminoindan(rac‐130)währendderAufarbeitung
ZurBestimmungdesVerlustsvon1‐Aminoindan(rac‐130)währendderAufarbeitungwerden49.6mg
derSubstanzeingewogenundübereinenbestimmtenZeitraumbei550mbargerührt.DurchAuswaage
wirdderVerlustvonrac‐130bestimmt.DieErgebnissesindinTabelle63aufgelistet.
Tabelle63.BestimmungdesVerlustsvon1‐Aminoindan(rac‐130)währendderAufarbeitung.
Eintrag
Zeit[min]
Verlustrac‐130[mg]
Verlustrac‐130[%]
1
2
3
4
0
5
10
15
0
0.33
1.12
1.44
0
0.7
2.3
2.9
7.2.2.9.3
Temperatur‐undZeiteffektderenzymatischenRacematspaltungvon
1‐Aminoindan(rac‐130)
Die enzymatische Racematspaltung von 1‐Aminoindan (rac‐130) mit Malonsäurediethylester (9, 1 –
5Äq.)undCAL‐B(40mg/mmol)wurdeanalogderAAV6mitunterschiedlichenReaktionsbedingungen
untersucht.DieSyntheseerfolgteanalogderAAV6.DieErgebnissesindinTabelle64dargestellt.
187
7 ExperimentellerTeil
Tabelle64. Temperatur‐undZeiteffektderenzymatischenRacematspaltungvonrac‐130.
Eintrag
9(Äq.)
T[°C]
t[h]
Umsatz[%]
eeP [%]
eeS [%]a)
E
1
2
3
4
4
5b)
6b)
7b)
8
9
10
1
1
1
1
1.5
5
1
1
1
1
1
80
80
60
60
60
60
60
60
40
RT
RT
4.5
24
4.5
24
4.5
24
4.5
24
24
4.5
24
39
42
49
44
49
63
46
52
50
43
45
73
97
79
98
91
76
70
83
90
67
54
47
70
79
77
87
n.b.
60
92
90
51
44
10
>100
20
>100
61
12
10
40
58
8
5
a)Bestimmtmittels„Enantioselectiviy“[258];b)Zugabevon0.2mLMTBE;n.b.=nichtbestimmt.
7.2.2.9.4
ParallelablaufendechemischeAcylierungvon1‐Aminoindan(rac‐130)
Die Synthesen werden analog der AAV 7 durchgeführt. Zu 1‐Aminoindan (rac‐130, 0.22 mmol) wird
Malonsäurediethylester(9,1Äq.)gegebenundbeiRT–60°Cfür4.5–24hgerührt.Eswird,analogder
AAV6,filtriert,mitDCMundMTBE(je10mL)gewaschenunddieLösungsmitteli.Vak.entfernt.Der
Umsatzwirdmittels1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmt.DieErgebnissesindinTabelle65aufgelistet.
Tabelle65.
ParallelablaufendechemischeAcylierungvonrac‐130.
188
Eintrag
T[°C]
t[h]
Umsatz[%]
1
2
3
4
5
80
80
60
60
RT
24
4.5
24
4.5
24
8
4
9
3
1
7 ExperimentellerTeil
7.2.2.10
SekundäreAminealsSubstrate
7.2.2.10.1
BestimmungdesVerlustsdersekundärenAmine149bzw.150
Zur Bestimmung des Verlusts von 2‐Methyl‐ bzw. 3‐Methylpiperidin (149 bzw. 150) während der
Aufarbeitung werden 43.7 bzw. 41.2 mg der Substanzen eingewogen und über einen bestimmten
Zeitraum bei 550 mbar gerührt. Durch Auswaage wird der Verlust der Substanzen bestimmt. Die
ErgebnissesindinTabelle66aufgelistet.
Tabelle66.
BestimmungdesVerlustsdersekundärenAmine149und150.
Eintrag
Amin
Rührzeit[min]
Verlust[mg]
Verlust [%]
1
2
3
149
149
149
5
10
15
9.2
18.7
28.2
21
43
64
4
5
6
150
150
150
5
10
15
2.6
6.0
11.1
6
15
27
7.2.2.10.2
SynthesevonEthyl‐3‐(2‐methylpiperidin‐1‐yl)‐3‐oxopropanoat(rac‐151)
DieSyntheseerfolgtanalogderAAV5.[253]Zu2‐Methylpiperidin(149,1mmol,99.8mg)wirdDiethyl‐
Malonester (9, 1 mmol, 161.2 mg) gegeben und für 3 h bei 180°C erhitzt. Der Umsatz wird mittels
1H‐NMR‐Spektroskopie bestimmt. Das Produkt
rac‐151 wird mittels Säulenchromatographie (Lauf‐
mittel:EtOAc)isoliert.
Umsatz:56%,Ausbeute:41%(87.9mg,0.41mmol).
1H‐NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm):1.16(d,3J=7.0Hz,3H,H‐6),1.27
–1.30(t, 3J=7.0Hz,3H,H‐11),1.35–1.47(m,2H,H‐3),1.52–1.69
(m,2H,H‐2),2.69(td,3J=13.5Hz,1H,H‐4),3.16(td,3J=13.5Hz,1H,
H‐4),3.43(s,2H,H‐8),3.48(m,1H,H‐5),4.19(q,3J=7.0Hz2H,H‐10),
4.49(m,1H,H‐1),4.90(m,1H,H‐1).
13C‐NMR (500 MHz, CDCl3): 14.22 (C‐11), 18.66 (C‐6), 25.46 (C‐3),
26.13(C2),29.71(C‐4),36.68(C‐8),41.96(C‐1),61.41(C‐10),164.46
(C‐9),167‐96(C‐7).
HPLC: AD‐H‐Säule, 95:5 (n‐Hexan/i‐PrOH, v/v), 210 nm, flow: 0.8mL/min, tR=18.29 min (R),
19.68min(S),ee‐Wert:0%.
189
7 ExperimentellerTeil
IR (ATR): (cm‐1) = 2935.4, 2864.0, 2357.9, 1733.0, 1634.9, 1437.3, 1367.5, 1319.5, 1239.4, 1149.7,
1032.0,850.0,608.6.
MS(ESI):m/z(%)=236.0(100)[M+Na]+,277.1(10),449.2(23)[2M+Na]+.
EA(C14H17NO3):berechnetC:61.95%,H:8.98%,N:6.57%,O:22.50%;gefunden:C:61.08%,H:8.99%,
N:6.47%,O:23.46%.
DiespektroskopischenDatensindlautSciFinderinderLiteraturbeschriebenworden.[280]
7.2.2.10.3
SynthesevonEthyl‐3‐(3‐methylpiperidin‐1‐yl)‐3‐oxopropanoat(rac‐152)
Die Synthese erfolgt analog der AAV 5.[253] Zu 3‐Methylpiperidin (150, 1 mmol, 99.6 mg) wird
Malonsäurediethylester(9,1mmol,159.8mg)gegebenundfür3hbei180°Cerhitzt.DerUmsatzwird
mittels 1H‐NMR‐Spektroskopie bestimmt. Das Rohprodukt wird mittels Säulenchromatographie
(LaufmittelCH/EtOAc1:4)aufgereinigtumdasisolierteProduktzuerhalten.
Umsatz:63%,Ausbeute:42%(87.9mg,0.41mmol).
1H‐NMR(500MHz,CDCl3):δ(ppm):0.90(d,3J=6.5Hz,3H,H‐6),1.08
–1.18(m,1H,H‐11),1.40–1.73(m,2H,H‐3),1.80–1.84(m,1H,H‐2),
2.30(dd, 3J=12.5Hz,10,5Hz,1H,H‐4),2.62(td, 3J=12.5Hz,3.0Hz,
1H,H‐4),2.69(dd,3J=13.5Hz,10.5Hz,1H,H‐4),2.97–3.03(m,1H,
H‐8),3.55–3.66(m,1H,H‐5),4.38–4.45(m,1H,H‐1).
13C‐NMR (500 MHz, CDCl3): 14.26 (C‐11), 18.93 (C‐6), 21.11 (C‐2),
24.74(C‐4),30.90(C‐3),32.89(C‐8),41.52(C‐1),54.00(C‐5),60.44
(C‐10),164.20(C‐7),171.19(C‐9).
HPLC:AD‐H‐Säule,95:5(n‐Hexan/i‐PrOH,v/v),210nm,flow:0.8mL/min,tR=19.11min(R),21.01min
(S),ee‐Wert:0%.
IR (ATR): (cm‐1) = 2929.0, 2852.3, 2360.1, 2341.4, 1733.0, 1603.5, 1440.1, 1366.8, 1316.8, 1266.2,
1224.5,1157.9,1139.5,1030.7,969.2,851.8,667.6,578.6.
MS(ESI):m/z(%)=214.0(5),236.1(100)[M+Na]+,277.1(3),449.2(97)[2M+Na]+.
DiespektroskopischenDatensindlautSciFinderinderLiteraturbeschriebenworden.[280]
7.2.2.10.4
EnzymatischeAcylierungvon3‐Methylpiperidin(rac‐150)
Abbildung146. EnzymatischeRacematspaltungvonrac‐150.
190
7 ExperimentellerTeil
Die Synthese erfolgt analog der AAV 6. Zu 3‐Methylpiperidin (150, 0.5 mmol, 47.4mg) werden
Malonsäurediethylester(9,0.5mmol,79.6mg)undCAL‐B(40mg/mmol,20mg)gegebenundbei60°C
für 24 h erhitzt. Die Aufarbeitung erfolgt analog zur AAV 6. Der Umsatz wird mittels 1H‐NMR‐
Spektroskopiebestimmt.
Umsatz:15%.
HPLC:AD‐H‐Säule,95:5(n‐Hexan/i‐PrOH,v/v),210nm,flow:0.8mL/min,tR=19.35min(R),21.27min
(S),ee‐Wert:10%.
DieanalytischenDatenstimmenmitdenVergleichsdatenausAbschnitt7.2.2.10.3überein.
7.2.2.10.5
ProzessoptimierungderenzymatischenRacematspaltungvon3‐Methylpiperidin
(rac‐150)
DieenzymatischeRacematspaltungvon3‐Methylpiperidin(rac‐150)mitMalonsäurediethylester(9,1
–5Äq.)undLipaseCAL‐B(40mg/mmol)wurdeanalogderAAV6mitunterschiedlichenReaktions‐
bedingungen untersucht. Die Synthese erfolgte analog der AAV 6. Der Umsatz wird mittels 1H‐NMR‐
Spektroskopiebestimmt.DieErgebnissesindinTabelle67dargestellt.
Tabelle67.
ProzessoptimierungderenzymatischenRacematspaltungvonrac‐150.
Eintrag
MTBE[mL]
T[°C]
Umsatz[%]
eeP [%]
eeS[%]a)
E
1
2
3
4b)
5
6c)
‐
‐
0.1
0.1
‐
‐
80
60
60
60
40
40
5
15
34
75
19
22
10
10
13
18
11
10
n.b.
n.b.
7
54
n.b.
n.b.
<2
1
<2
2
<2
<2
a)Bestimmtmittels„Enantioselectiviy“[258];b)CAL‐B:80mg/mmol;c)Reaktionsdauer:48h,;n.b.=nichtbestimt.
7.2.2.10.6
ParallelablaufendechemischeAcylierungvonrac‐150
Die Synthesen werden analog der AAV 6 durchgeführt. Zu 3‐Methylpiperidin (150, 0.5 mmol) wird
Malonsäurediethylester(9,1Äq.)gegebenundbei40–80°Cfür24‐48hgerührt.DerUmsatzwird
ohneweitereAufarbeitungmittels1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmt.DieErgebnissesindinTabelle68
aufgelistet.
191
7 ExperimentellerTeil
Tabelle68. ParallelablaufendechemischeAcylierungvonrac‐150.
Eintrag
T[°C]
t[h]
Umsatz[%]
ee[%]
E
1
2
3
80
60
40
24
24
48
5
9
6
n.b.
<1
<1
n.b.
1
1
n.b.=nichtbestimmt.
7.2.2.11
Verwendungvonɛ–Caprolacton(3)alsAcyldonor
7.2.2.11.1
BestimmungderStabilitätvonɛ–Caprolacton(3)währendderReaktionund
Aufarbeitung
ɛ‐Caprolacton(3)wirdübereinenZeitraumvon24hbei60°CinAnwesenheitundohneCAL‐Bgerührt.
BeiAbwesenheitvonCAL‐BwirddirekteineNMR‐Probeentnommen.BeimAnsatzmitEnzymerfolgt
zusätzlich eine Aufarbeitung analog AAV 6. Das Verhältnis von ɛ–Caprolacton(3) zum Zersetzungs‐
produkt 6‐Hydroxyhenxansäure (54) wird mittels 1H‐NMR‐Spektroskopie bestimmt. Die Ergebnisse
sindinTabelle69aufgelistet.
Tabelle69.
BestimmungderStabilitätvonɛ–Caprolacton(3).
Eintrag
Bedingungen
Verhältnis3/54
1
RührenohneCAL‐B
RührenmitCAL‐Bund
AufarbeitungnachAAV6
100:0
2
192
1:77
7 7.2.2.11.2
ExperimentellerTeil
EnzymatischeAcylierungvonBenzylamin(134)mitɛ‐Caprolacton(3)
Abbildung147. EnzymatischeAcylierungvonBenzylamin(134)mitɛ‐Caprolacton(3).
DieSyntheseerfolgtnachderAAV6.ZuBenzylamin(134,1mmol,105.7mg)werdenɛ–Caprolacton(3,
1mmol,113.7mg)undCAL‐B(40mg/mmol)gegebenundfür24hbei60°Cgerührt(Abbildung147).
DerUmsatzwirdmittels1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmt.DieAufarbeitungerfolgtanalogderAAV6.
Umsatz:>99%.
1H‐NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm): 1.38 – 1.44 (m, 2H,
H‐12),1.55–1.60(m,2H,H‐13),1.66–1.72(m,2H,H‐11),
2.23(t,3J=7.5Hz,2H,H‐14),3.63(t,3J=6.5Hz,2H,H‐10),
4.43(d,3J=5.7Hz,2H,H‐7),5.84(br,1H,H‐8),7.28–7.35
(m,5H,Har).
13C‐NMR
(500 MHz, CDCl3): 172.95 (C9), 138.45 (C6),
128.85 (C2 + C4), 127.97 (C1 + C5), 127.66 (C3), 62.68
(C14),43.75(C7),36.69(C10),32.39(C14),25.50(C12),25.40(C13).
IR (ATR): (cm‐1) = 3406.0, 3234.6, 3062..7, 2925.6, 2856.9, 1732.4, 1626.8, 1540.7, 1449.6, 1361.0,
1233.1,1058.3,1025.0,1006.8,989.6,792.1,739.7,708.2,615.6,592.8,508.4.
MS(ESI):m/z(%)=244.0(100)[M+Na]+,358.2(76),425.3(4),465.2(28)[2M+Na]+,579.1(4).
EA(C14H17NO3):berechnetC:68.00%,H:6.93%,N:5.66%;gefunden:C:61.23%,H:8.96%,N:6.83%.
DiespektroskopischenDatenstimmenmitdeninderLiteraturangegebenenWertenüberein.[281]
7.2.2.11.3
VariationderReaktionsbedingungenderenzymatischenAcylierungvon
Benzylamin(134)mitɛ‐Caprolacton(3)
Die enzymatische Acylierung von Benzylamin (134) mit ɛ‐Caprolacton (3, 1Äq.) und Lipase CAL‐B
(40mg/mmol)wurdeanalogderAAV6mitunterschiedlichenReaktionsbedingungenuntersucht.Die
Synthese erfolgte analog der AAV 6. Der Umsatz wird mittels 1H‐NMR‐Spektroskopie bestimmt. Die
ErgebnissesindinTabelle70dargestellt.
193
7 ExperimentellerTeil
Tabelle70.
Prozessoptimierung der enzymatischen Racematspaltung von Benzylamin (134) mit
ɛ‐Caprolacton(3).
Eintrag
MTBE[mL]
T[°C]
t[h]
Umsatz[%]
1
2
3
0
0.5
0
80
80
RT
4.5
4.5
4.5
51
65
57
7.2.2.11.4
ParallelablaufendechemischeAcylierungvonBenzylamin(134)mit
ɛ‐Caprolacton(3)
DieSynthesenwerdenanalogderAAV7durchgeführt.ZuBenzylamin(134,0.5mmol)wirdɛ‐Capro‐
lacton (3, 1 Äq.) gegeben und bei verschiedenen Temperaturen und Reaktionszeiten gerührt. Der
UmsatzwirdohneweitereAufarbeitungmittels 1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmt.DieErgebnissesind
inTabelle71aufgelistet.
Tabelle71.
ParallelablaufendeAcylierungvonBenzylamin(134)mitɛ–Caprolacton(3).
194
Eintrag
T[°C]
t[h]
Umsatz[%]
1
2
3
4
5
80
60
RT
RT
0
4.5
4.5
4.5
24
4.5
30
69
12
53
3
7 7.2.2.11.5
ExperimentellerTeil
Synthesevon6‐Hydroxy‐N‐(1‐phenylethyl)hexanamid(157)
Abbildung148. Synthesevon157ausgehendvonrac‐4.[253]
Die Synthese erfolgt analog der AAV 5.[253] Zu 1‐Phenylethylamin (rac‐4, 2.5 mmol, 303.4 mg) wird
ɛ‐Caprolacton(3,2.5mmol,288.1mg)gegebenundfür4hauf180°Cerhitzt(Abbildung148).Der
UmsatzwirdohneweitereAufarbeitungmittels1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmt.
Umsatz:62%.
1H‐NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm): 1.34 – 1.42 (m, 3H,
O
12
8
1
2
HN
7
6
3
10
11
14
13
OH
15
9
5
4
157
C14H21NO2
M = 235.33 g/mol
H‐13), 1.49 (d, 3J = 6.9 Hz, 2H, H‐9), 1.54 – 1.60 (m, 2H,
16
H‐12), 1.61 – 1.71 (m, 2H, H‐14), 2.19 (t, 3J=7.4Hz, 2H,
H‐15),3.63(t,3J=6.6Hz,2H,H‐11),5.14(p,3J=7.2Hz,1H,
H‐7),5.70(br,1H,H‐8),7.25–7.35(m,5H,Har).
HPLC: AD‐H‐Säule, 95:5 (n‐Hexan/i‐PrOH, v/v), 210 nm,
flow: 0.8 mL/min, tR=32.21 min (R), 39.69 min (S),
ee‐Wert:0%.
DiespektroskopischenDatensindinderLiteraturnichtbekannt.
7.2.2.11.6
EnzymatischeAcylierungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)mitɛ‐Caprolacton(3)
Abbildung149. EnzymatischeAcylierungvonrac‐4mitɛ–Caprolacton(3).
Die Synthese erfolgt analog der AAV 6. Zu 1‐Phenylethylamin (rac‐4, 5.0 mmol, 0.61 g) werden
ɛ‐Caprolacton(3,4.9mmol,0.56g)undCAL‐B(40mg/mmol,200mg)gegebenundfür4.5hbei80°C
gerührt (Abbildung 149). Die Aufarbeitung erfolgt analog AAV 6. Der Umsatz wird mittels 1H‐NMR‐
Spektroskopiebestimmt.DieAufreinigungerfolgtmittelsSäulenchromatographie(Laufmittel:CHCl3/
Aceton7:3).DasProdukt157wirdalsfarbloserFeststofferhalten.
Umsatz:51%,Ausbeute:43%(0.51g,2.15mmol).
195
7 ExperimentellerTeil
1H‐NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm): 1.36 – 1.42 (m, 3H,
O
12
8
1
2
HN
10
7
11
14
13
OH
15
H‐13),1.49(d,3J=6.9Hz,2H,H‐9),1.54–1.60
16
5
4
(m,2H,H‐12),1.64–1.70(m,2H,H‐14),2.19(t,3J=7.4Hz,
2H, H‐15), 3.63 (t, 3J=6.5Hz, 2H, H‐11), 5.14 (p,
9
6
3
157
C14H21NO2
M = 235.33 g/mol
3J=7.2Hz,1H,H‐7),5.73(br,1H,H‐8),7.25–7.35(m,5H,
Har).
13C‐NMR
(500 MHz, CDCl3): 21.84 (C‐9), 25.36 (C‐13),
25.42(C‐12),32.33(C‐14),36.70(C‐11),48.73(C‐7),62.50
(C‐15),126.26(C‐1+C‐5),127.41(C‐3),128.73(C‐2+C‐4),143.38(C‐6),172.27(C‐10).
HPLC:AD‐H‐Säule,95:5(n‐Hexan/i‐PrOH,v/v),210nm,flow:0.8mL/min,tR=32.21min(R),39.69min
(S),ee‐Wert:0%.
IR (ATR): (cm‐1) = 3270.5, 3062.7, 2929.3, 2859.9, 2360.1, 2341.3, 1731.2, 1540.1, 1448.9, 1374.9,
1277.9,1209.4,1129.5,1051.0,1020.7,908.7,759.6,703.5,539.7.
MS(ESI):m/z(%)=258.1(100)[M+Na]+,493.2(47)[2M+Na]+.
EA(C14H21NO2):berechnetC:70.46%,H:9.00%,N:5.95%,O:16.60%;gefunden:C:70.01%,H:9.27%,
N:5.99%,O:14.73%.
DiespektroskopischenDatenstimmenmitdeneninAbschnitt7.2.2.11.5überein.
7.2.2.11.7
TemperaturabhängigkeitderenzymatischenAcylierungvon1‐Phenylethylamin
(rac‐4)mitɛ–Caprolacton(3)
DieenzymatischeAcylierungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4,1mmol)mitɛ‐Caprolacton(3,1Äq.)und
CAL‐B(40mg/mmol)wurdeanalogderAAV6mitunterschiedlichenReaktionsbedingungenuntersucht.
DieSyntheseerfolgteanalogderAAV6.DerUmsatzwirdmittels1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmt.Die
ErgebnissesindinTabelle72dargestellt.
Tabelle72.
ProzessoptimierungderenzymatischenAcylierungvonrac‐4mitɛ‐Caprolacton(3).
Eintrag
T[°C]
t[h]
Umsatz[%]
ee[%]
E
1
2a)
3
4
5
6
7
80
80
60
60
60
40
RT
4.5
4.5
4.5
6
8
4.5
4.5
51
49
41
38
45
25
26
0
0
0
0
0
3
4
<1
<1
<1
<1
<1
1
1
a)Zugabevon0.5mLMTBEnach1h.
196
7 7.2.2.11.8
ExperimentellerTeil
ParallelablaufendechemischeAcylierungvonrac‐4mitɛ‐Caprolacton(3)
Die Synthesen werden analog der AAV 6 durchgeführt. Zu 1‐Phenylethylamin (rac‐4, 1mmol) wird
ɛ‐Caprolacton (3, 1 Äq.) gegeben und bei 0 – 80 °C für 4.5h gerührt. Der Umsatz wird ohne weitere
Aufarbeitungmittels1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmt.DieErgebnissesindinTabelle73aufgelistet.
Tabelle73.
ParallelablaufendechemischeAcylierungvonrac‐4mitɛ‐Caprolacton(3).
Eintrag
T[°C]
Umsatz[%]
ee[%]
1
2
3
4
5
80
60
40
RT
0
37
4
2
1
0
0
n.b.
n.b.
n.b.
n.b.
n.b.=nichtbestimmt.
7.2.2.11.9
ReaktionskinetikderAcylierungvon1‐Phenylethylamin(rac‐4)mit
ɛ‐Caprolacton(3)
DieSynthesenerfolgenanalogderAAV11.ZuPhenylethylamin(rac‐4,0.5mmol)werdenɛ‐Caprolacton
(3,1Äq.)undCAL‐B(40mg/mmol)gegebenundbei60°Cfür1min–24hgerührt.DieAufarbeitung
erfolgtanalogderAAV7.DieErgebnissesindinTabelle74aufgelistet.
Tabelle74.
KinetikderenzymatischenAcylierungvonrac‐4mitɛ‐Caprolacton(3).
Eintrag
t[min]
Umsatz[%]
ee[%]
E
2
3
4
5
6
7
5
10
20
30
45
60
2
3
7
6
7
12
n.b.
n.b.
0
<2
0
0
n.b.
n.b.
0
1
0
0
197
7 ExperimentellerTeil
Eintrag
t[min]
Umsatz[%]
ee[%]
E
8
9
10
11
11
12
120
180
270
360
480
1440
20
22
41
38
45
65
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
n.b.=nichtbestimmt.
7.2.2.11.10
Synthesevon6‐Hydroxy‐1‐(3‐methylpiperidin‐1‐yl)hexan‐1‐on(155)
Abbildung150. ChemischeAcylierungvon3‐Methylpiperidin(150)mitɛ‐Caprolacton(3).[253]
DieSyntheseerfolgtanalogderAAV6.[253]Zu3‐Methylpiperidin(150,1mmol,99.6mg)wirdɛ‐Capro‐
lacton(3,1mmol,115.5mg)gegebenundfür4hbei180°Cgerührt(Abbildung150).DieAufarbeitung
erfolgtanalogAAV6.DerUmsatzwirdmittels1H‐NMR‐Spektroskopiebestimmt.
Umsatz:17%.
1H‐NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm): 0.90 (d, 3H, 3J=6.7Hz,
H‐6),1.07–1.16(m,3H,H‐10),1.34–1.46(m,H2,H‐3),1.51–
1.71(m,6H,H‐9,H‐11,H2),2.21(t,3J=12.1Hz,2H,H‐8),2.52
– 2.59 (m, 2H, H‐5), 2.93 (t, 3J=12.5Hz, 2H, H‐4), 3.73 (d,
3J=13.6Hz,2H,H‐1),4.39–4.44(m,2H,H‐12).
13C‐NMR
(500 MHz, CDCl3): 19.00 (C‐6), 22.45 (C‐2), 24.50
(C‐10), 25.49 (C‐9), 28.31 (C‐4), 31.56 (C‐11), 31.83 (C‐3),
34.03(C‐8),46.61(C‐1),52.31(C‐5),62.05(C‐12).
DC‐MS(ESI):m/z(%)=214.1(99)[M]+,236.2(40)[M+Na]+,427.2(20)[2M]+,449.2(1)[2M+Na]+.
MS(ESI):m/z(%)=236.1(9)[M+Na]+,350.3(100),464.3(59)[2M+K]+,578.3(10).
DiespektroskopischenDatensindinderLiteraturnichtbekannt.
7.2.2.11.11
EnzymatischeAcylierungensekundärerAminemitɛ‐Caprolacton(3)
DieSynthesenerfolgenanalogderAAV6.ZudemAmin(149bzw.150,0.5mmol)werdenɛ‐Caprolacton
(3,0.5mmol,57.3mg)undCAL‐B(40mg/mmol,20mg)gegebenundinMTBE(0‐0.1mL)für24hbei
198
7 ExperimentellerTeil
60°Cgerührt.DieAufarbeitungerfolgtanalogAAV6.DerUmsatzwirdmittels 1H‐NMR‐Spektroskopie
bestimmt.DieErgebnissesindinTabelle75aufgelistet.
Tabelle75.
EnzymatischeAcylierungderAmine149und150mitɛ‐Caprolacton(3).
Eintrag
Amin
MTBE[mL]
Umsatz[%]
1
2
3
149
150
150
0
0
0.1
7
9
18
199
200
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