ZIP - FreiDok - Albert-Ludwigs

Aus der Abteilung Innere Medizin II / Infektiologie
der Medizinischen Universitätsklinik Freiburg
Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
Die Aktivität unterschiedlicher antimikrobieller Peptide
gegenüber verschiedenen Nocardia-Spezies
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
vorgelegt:
2010
von:
Benjamin Meier
geboren in:
Backnang
Dekan:
Prof. Dr. Dr. hc. mult. Hubert Erich Blum
1. Gutachter:
Prof. Dr. Winfried V. Kern
2. Gutachter:
Prof. Dr. Reinhard Berner
Jahr der Promotion:
2010
Meinen Eltern
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung ____________________________________________________________ 1
1.1
1.1.1
Geschichte ____________________________________________________ 1
1.1.2
Eigenschaften und Vorkommen ____________________________________ 2
1.1.3
Epidemiologie _________________________________________________ 3
1.1.4
Pathogenese und Manifestationen der Nocardiose______________________ 3
1.1.5
Therapie ______________________________________________________ 5
1.2
Antimikrobielle Peptide _____________________________________________ 6
1.2.1
Bedeutung_____________________________________________________ 6
1.2.2
Vorkommen und Funktionen ______________________________________ 6
1.2.3
Struktureller Aufbau und Gemeinsamkeiten verschiedener AMPs _________ 7
1.2.4
Wirkmechanismus ______________________________________________ 7
1.2.5
Einteilung der AMPs ____________________________________________ 8
1.3
2
Nocardien ________________________________________________________ 1
1.2.5.1
Defensine ___________________________________________________ 8
1.2.5.2
Cathelicidine_________________________________________________ 9
1.2.5.3
Ausgewählte bovine AMPs ____________________________________ 10
Zielsetzung ______________________________________________________ 12
Material und Methoden ________________________________________________ 13
2.1
Material _________________________________________________________ 13
2.1.1
Bakterienstämme ______________________________________________ 13
2.1.2
Antimikrobielle Substanzen ______________________________________ 13
2.1.3
Nährmedien, Puffer und sonstige Lösungen _________________________ 15
2.1.4
Verbrauchsmaterialien __________________________________________ 16
2.1.5
Geräte _______________________________________________________ 16
2.2
Methoden________________________________________________________ 17
2.2.1
Herstellung der Mueller-Hinton-Agarplatten _________________________ 17
2.2.2
Lagerung_____________________________________________________ 17
2.2.3
Kultivierung __________________________________________________ 17
2.2.4
Bestimmung der Wachstumskurven________________________________ 18
2.2.5
Bestimmung der Keimzahlen _____________________________________ 18
2.2.6
Präperation der antimikrobiellen Substanzen_________________________ 18
Inhaltsverzeichnis
3
2.2.7
Präperation des Inokulums _______________________________________ 19
2.2.8
Killing-Assay _________________________________________________ 19
2.2.9
Variation des Killing-Assays _____________________________________ 20
2.2.10
Auswertung des Killing-Assays ___________________________________ 21
Ergebnisse ___________________________________________________________ 22
3.1
3.1.1
Nocardia farcinica _____________________________________________ 22
3.1.2
Nocardia nova ________________________________________________ 23
3.1.3
Nocardia asteroides ____________________________________________ 24
3.1.4
Nocardia brasiliensis ___________________________________________ 25
3.1.5
Zusammenfassung der Vorversuche________________________________ 25
3.2
Etablierung des Killing-Assays ______________________________________ 26
3.3
Antimikrobielle Aktivität humaner AMPs gegenüber Nocardia-Spezies ____ 26
3.3.1
Nocardia farcinica _____________________________________________ 27
3.3.2
Nocardia nova ________________________________________________ 27
3.3.3
Nocardia asteroides ____________________________________________ 29
3.3.4
Nocardia brasiliensis ___________________________________________ 30
3.3.5
Additive Wirkung humaner AMPs ________________________________ 31
3.4
Antimikrobielle Aktivität boviner AMPs gegenüber Nocardia-Spezies _____ 32
3.4.1
Nocardia farcinica _____________________________________________ 32
3.4.2
Nocardia nova ________________________________________________ 33
3.4.3
Nocardia asteroides ____________________________________________ 34
3.4.4
Nocardia brasiliensis ___________________________________________ 35
3.5
4
Wachstumskurven und Keimzahlen (Vorversuche) _____________________ 22
Zusammenfassung der Ergebnisse ___________________________________ 36
Diskussion ___________________________________________________________ 37
4.1
Aktivität humaner AMPs gegenüber verschiedenen Nocardia-Spezies _____ 37
4.2
Aktivität boviner AMPs gegenüber verschiedenen Nocardia-Spezies ______ 42
5
Zusammenfassung ____________________________________________________ 44
6
Literaturverzeichnis___________________________________________________ 45
7
Anhang _____________________________________________________________ 54
7.1
Abkürzungen ____________________________________________________ 54
7.2
Aminosäuren im Einbuchstabencode _________________________________ 56
7.3
Einheiten ________________________________________________________ 57
Inhaltsverzeichnis
7.4
Auswertungen aller Killing-Assays___________________________________ 58
7.4.1
Nocardia farcinica _____________________________________________ 58
7.4.2
Nocardia nova ________________________________________________ 61
7.4.3
Nocardia asteroides ____________________________________________ 64
7.4.4
Nocardia brasiliensis ___________________________________________ 67
8
Danksagung _________________________________________________________ 71
9
Lebenslauf ___________________________________________________________ 72
Einleitung
1
1 Einleitung
___________________________________________________________________________
Infektionskrankheiten gehören auch heute noch zu den häufigsten Todesursachen weltweit
(WHO 2003). Einerseits konnte die mit diesen Erkrankungen einhergehende Morbidität und
Mortalität innerhalb des letzten Jahrhunderts aufgrund von besseren Hygienestandards,
Impfprogrammen und der Entwicklung zahlreicher Antibiotika deutlich gesenkt werden.
Andererseits entwickelten sich mit dem steigenden und großzügig gehandhabten
Antibiotikaverbrauch im Laufe der Jahre zunehmend resistente Bakterienstämme (Levy, S. B.
2005). Die ständige Vermehrung dieser Stämme (Witte, W. und Klare I. 1999) bei
gleichzeitiger zögerlicher Suche und Entwicklung neuer Antibiotika (Holzgrabe, U. 2004)
stellt eine aktuelle Bedrohung der allgemeinen Gesundheit der Weltbevölkerung dar (WHO
2007). Es bedarf daher dringend der Entwicklung weiterer und neuer Strategien zur
Bekämpfung von Infektionskrankheiten und deren Folgen. Antimikrobielle Peptide (AMPs)
stellen vielversprechende neuartige Substanzen dar. Es handelt sich hierbei um körpereigene
Abwehrstoffe, welche als Bestandteile des angeborenen Immunsystems gelten. Im Rahmen
der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von AMPs gegenüber Bakterien der Gattung
Nocardia untersucht. Hierfür wurde die antimikrobielle Wirksamkeit unterschiedlicher
humaner und boviner AMPs gegenüber verschiedenen Nocardia-Spezies bestimmt.
1.1 Nocardien
1.1.1
Geschichte
Die Taxonomie der Nocardien ist bis heute im Wandel. Bakterien der Gattung Nocardia
wurden erstmals im Jahre 1888 vom Veterinärmediziner Edmund Nocard (1850-1903) aus
einem Rind isoliert. 1889 definierte Trevisan die Gattung Nocardia und bezeichnete das Isolat
von Edmund Nocard als Nocardia farcinica. In den folgenden Jahrzehnten fanden sich
weitere Nocardia-Isolate, welche meist nicht eindeutig identifiziert und differenziert werden
konnten. Alle Nocardia-Isolate, die nicht im Stande waren Xanthin, Tyrosin und Casein zu
spalten, wurden somit definitionsgemäß als Nocardia asteroides bezeichnet (Gordon, R. E. et
al. 1978). Im Jahre 1988, einhundert Jahre nach ihrer Erstbeschreibung, schlugen Wallace und
Mitarbeiter insgesamt sechs Hauptgruppen vor, in welche die Nocardien anhand ihrer
Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Antibiotika eingeteilt werden konnten (Wallace, R.
J., Jr. et al. 1988). Es schlossen sich zahlreiche Studien mit der Fragestellung an, ob diese
Einleitung
2
sechs Hauptgruppen taxonomischen Gruppen entsprachen, oder ob sich bereits beschriebene
Nocardia-Spezies in diese Gruppen einordnen ließen. In den 90er Jahren waren Wallace und
Mitarbeiter maßgeblich daran beteiligt, dass dieser Zusammenhang beispielsweise für die
Spezies Nocardia nova und Nocardia farcinica hergestellt werden konnte (Brown-Elliott, B.
A. et al. 2006). 1991 schlugen Wallace und Mitarbeiter vor, die Spezies Nocardia asteroides,
Nocardia farcinica und Nocardia nova unter dem Namen „Nocardia asteroides Komplex“
zusammenzufassen, da sich diese drei Spezies im Labor nur schwierig differenzieren ließen
(Wallace, R. J., Jr. et al. 1991). Auch heute noch gelten Vertreter der Spezies Nocardia
asteroides als ein äußerst heterogenes Cluster, im Gegensatz zu Vertretern der Spezies
Nocardia brasilienis. Heutzutage sind über 50 verschiedene Nocardia-Spezies bekannt, von
denen ungefähr 30 als human- und/oder tierpathogen gelten.
1.1.2
Eigenschaften und Vorkommen
Nocardien gehören wie Aktinomyzeten, Streptomyzeten, Corynebakterien und Mykobakterien
zur Ordnung der Aktinomyzetales und sind Gram-positive, obligat aerobe, partiell säurefeste,
verzweigend wachsende Bakterien. Sie gelten im Allgemeinen als opportunistische
Krankheitserreger beim Menschen sowie beim Tier. Nocardien zeichnen sich durch ein
aggregierendes und langsames Wachstum aus. Ihre Eigenschaft der Lysozymresistenz ist ein
wichtiges Unterscheidungskriterium zu anderen Aktinomyzeten. Nocardien kommen ubiquitär
in Erdreich, Staub und Wasser vor. Möglicherweise können sie auch die menschliche Haut
und den oberen Respirationstrakt besiedeln (Brown-Elliott, B. A. et al. 2006). Die Prävalenz
verschiedener Nocardia-Spezies unterscheidet sich weltweit. So kommen Nocardia farcinica
und Nocardia asteroides vor allem in gemäßigten Klimazonen vor. Nocardia brasiliensis
wird hingegen hauptsächlich in tropischen und subtropischen Regionen gefunden (BrownElliott, B. A. et al. 2006). Vorherrschende Nocardia-Spezies in Deutschland ist Nocardia
farcinica (Schaal, K. P. und Lee, H. J. 1992), welche außerdem die Spezies mit der höchsten
Antibiotikaresistenz darstellt (Moylett, E. H. et al. 2003, Wallace, R. J., Jr. et al. 1990). In den
USA werden überwiegend Nocardia brasiliensis und Nocardia asteroides isoliert.
Einleitung
1.1.3
3
Epidemiologie
Es liegen keine aussagekräftigen Studien vor, welche über genaue Inzidenzen der Nocardiose
Auskunft geben können. In der Vergangenheit wurde von einem äußerst seltenen Vorkommen
der Nocardiose ausgegangen. Es stellte sich jedoch heraus, dass die Inzidenz der Nocardiose
unterschätzt wurde und innerhalb der letzten Jahrzehnte deutlich zugenommen hat (Boiron, P.
et al. 1992, Georghiou, P. R. und Blacklock, Z. M. 1992, Schaal, K. P. und Lee, H. J. 1992).
1976 schätzten Beaman und Mitarbeiter die Anzahl der jährlichen Nocardiosen in den USA
auf 500 bis 1000 Fälle (Beaman, B. L. et al. 1976). Für Deutschland liegen keine verlässlichen
Zahlen vor; es wird aber von mindestens 100 Fällen pro Jahr ausgegangen (Köhler, W et al.
2001). Ein Grund für die vermeintlich unterschätzte Prävalanz der Nocardiose ist die
Tatsache, dass sich ein kultureller Nachweis aufgrund langer Generationszeiten als schwierig
darstellt oder oft nicht erfolgt, sei es dadurch, dass Kulturen zu früh entsorgt werden, oder
dass die Nocardien von schneller wachsenden Erregern innerhalb der Kultur verdrängt
werden. Außerdem gibt es keine zuverlässigen diagnostischen Tests, welche routinemäßig
eingesetzt werden können, um eine Nocardiose festzustellen. Die schlechte Qualität der
diagnostischen Tests basiert auf einer minimalen und unspezifischen Antikörperantwort,
welche außerdem starke Kreuzreaktionen mit Aktinomyzeten, Corynebakterien und
Mykobakterien zeigt. Hinzu kommt, dass eine Nocardien-Infektion aufgrund der relativ
unspezifischen klinischen Manifestationen nur in wenigen Fällen erwogen wird. Die Zunahme
der dokumentierten Nocardiosen basiert einerseits darauf, dass eine Infektion durch besser
ausgebildetes Personal heutzutage häufiger in Betracht gezogen wird, andererseits auf einem
wachsenden Patientenkollektiv, welches unter immunsuppresiver oder chirurgischer Therapie
steht. Nicht zuletzt können neuere Erkrankungen, wie beispielsweise AIDS, das Vorkommen
der Nocardiose weiter erhöhen (Beaman, B. L. und Beaman, L. 1994, Brown-Elliott, B. A. et
al. 2006).
1.1.4
Pathogenese und Manifestationen der Nocardiose
Eine Infektion erfolgt durch Inhalation des Erregers oder durch direkte Inokulation. Während
der Frühphase der Infektion kommt es im Rahmen der Immunantwort zur Akkumulation von
polymorphonukleären Zellen (PMNs), insbesondere von neutrophilen Granulozyten. Von
weiterer Bedeutung der zellulären Immunantwort sind mononukleäre Zellen (MNCs) wie
Monozyten
und
Lymphozyten.
Hauptaufgabe
der
T-Lymphozten
ist
die
Makrophagenaktivierung, die Rolle von B-Lymphozyten ist bei der Nocardiose bis heute
Einleitung
4
unklar. Nocardien besitzen Resistenzmechanismen gegenüber Effektormechanismen des
angeborenen Immunsystems. Sie sind in der Lage, in wichtige Schritte der Phagozytose
einzugreifen. Durch Hemmung der Phagosom-Lysosom-Fusion, der pH-Neutralisierung
innerhalb des Phagosoms und der Expression von Katalase können Nocardien innerhalb ihres
Wirtes persistieren. Die Nocardiose ist zumeist eine opportunistische Infektion bei
immuninkompetenten Patienten. Häufigste Prädispositionen für eine Nocardiose sind neben
einer immunsuppresiven Therapie (z.B. bei rheumatologischen Erkrankungen oder nach
Organtransplantation) Alkoholabusus, Diabetes mellitus, AIDS oder andere Immunopathien.
Weitere wichtige Prädispositionen sind Operationen, chronische Lungenerkrankungen (COPD
und Asthma), Sarkoidose, Tuberkulose, Leukämie, Morbus Hodgkin und Malignome
(Beaman, B. L. und Beaman, L. 1994).
Eine Infektion durch Inhalation manifestiert sich meist als pulmonale Nocardiose. Diese
kann subakut oder akut verlaufen und äußert sich durch starken Husten, Auswurf, Fieber und
Gewichtsverlust. Wichtige Differentialdiagnosen sind (Pilz-)Pneumonie, Tuberkulose und
Malignome, welche aufgrund des wenig spezifischen klinischen Bildes in Erwägung gezogen
werden müssen. Die disseminierte (systemische) Nocardiose entsteht durch hämatogene
Streuung von einem Lungenherd ausgehend oder nach direkter Inokulation und kann sich im
ganzen Körper manifestieren. Häufigste Manifestationsorte der disseminierten Nocardiose
sind ZNS (Abszesse, Meningitis), Haut, Niere, Gelenke, Knochen, Auge und Herz (Beaman,
B. L. und Beaman, L. 1994). Ein septisches Krankheitsbild ist in diesem Zusammenhang
selten, wird aber in der Literatur beschrieben (Abdel-Hadi, Alvarez H. und Cardenete Aljama,
M. A. 2007, Cassar, C. L. 2007, Shin, S. und Wilson, M. R. 2006).
Bei Abwesenheit eines Lungenherdes spricht man von einer extrapulmonalen Nocardiose.
Hierzu gehören die kutane, subkutane und die lymphokutane Nocardiose. Die Infektion
erfolgt im Rahmen von Verletzungen durch direkte Inokulation bei immunkompetenten
Patienten. Häufig findet sich Nocardia brasiliensis als Erreger (Maraki, S. et al. 2004,
Satterwhite, T. K. und Wallace, R. J., Jr. 1979). Die kutane und subkutane Nocardiose
präsentiert sich als Pyodermie oder als lokaler Abszess und gleicht dem Bild von
Hautinfektionen, die von Staphylokokken und Streptokokken hervorgerufen werden. Eine
spezielle Manifestation der kutanen Nocardiose stellt das Nocardien-induzierte Myzetom dar,
welches auch als Aktinomyzetom (Bakterien-assoziiertes Myzetom) bezeichnet wird. In
Mexiko wird es zu 90 % von Nocardia brasiliensis verursacht (Salinas-Carmona, M. C.
2000).
Einleitung
5
Beim Rind manifestiert sich die Nocardiose überwiegend als Mastitis (Beaman, B. L. und
Beaman, L. 1994). Die Infektion erfolgt durch direkte Inokulation (Ribeiro, M. G. et al. 2008).
Meist findet sich Nocardia asteroides als Erreger (Beaman, B. L. und Beaman, L. 1994),
andere Nocardia-Spezies wie Nocardia farcinica und Nocardia nova konnten jedoch ebenfalls
isoliert werden (Ribeiro, M. G. et al. 2008).
In Tabelle 1 sind abschließend die wichtigsten Merkmale der in der vorliegenden Arbeit
untersuchten Nocardia-Spezies zusammengefasst.
Tabelle 1 Merkmale der untersuchten Nocardia-Spezies
Spezies
Vorkommen
Manifestation
Besonderheiten
Nocardia
farcinica
ubiquitär; gemäßigte
Klimazonen; Europa
pulmonal, disseminiert
hohe Antibiotikaresistenz;
vorherrschende Spezies in
Deutschland
Nocardia
nova
Nocardia
asteroides
ubiquitär
pulmonal, disseminiert
längste Generationszeit
ubiquitär; bevorzugt
in Amerika
subtropische und
tropische Regionen;
Amerika
pulmonal, disseminiert,
(sub-) kutan, lymphokutan
überwiegend (sub-) kutan
und lymphokutan;
Aktinomyzetom
Nocardia
brasiliensis
1.1.5
heterogenes Cluster
homogenes Cluster;
Infektion bei
Immunkompetenten
Therapie
Seit 1940 gelten Sulfonamide als die Therapie der Wahl bei einer Nocardiose. Vor Einführung
dieser Substanzklasse lag die Mortalität der pulmonalen Nocardiose bei annähernd 100 %. Bei
disseminierter
Nocardiose
Trimethoprim/Sulfamethoxazol
oder
ZNS-Befall
(TMP/SMX)
ist
nicht
eine
alleinige
ausreichend.
Therapie
Ein
mit
schlechtes
Therapieansprechen von TMP/SMX bei AIDS-Patienten ist außerdem beschrieben (Long, P.
F. 1994). Deswegen wird bei schweren Verläufen eine Kombinationstherapie empfohlen.
Eingesetzte Substanzen sind hierbei TMP/SMX, Amikacin und Ceftriaxon (oder Imipenem)
(Brown-Elliott, B. A. et al. 2006). Eine neue Therapieoption stellt Linezolid dar, welches
gegen alle humanpathogenen Nocardia-Spezies aktiv ist und den Vorteil hat, dass es oral
verabreicht werden kann (Brown-Elliott, B. A. et al. 2001, Moylett, E. H. et al. 2003). Obwohl
mittlerweile mehrere in vitro Untersuchungen zur Empfindlichkeit von Nocardia-Spezies
gegenüber zahlreichen Antibiotika vorliegen, existieren bis heute keine etablierten
Therapierichtlinien (McNeil, M. M. et al. 1990). Im Jahre 2000 publizierte das National
Comitee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), heute Clinical and Laboratory Standards
Einleitung
6
Institute (CLSI) genannt, provisorische Grenzwerte zur Resistenztestung von Nocardien.
Diese korrelierten jedoch nur gering mit der Wirksamkeit von Antibiotika in experimentellen
Modellen (Fux, C. et al. 2003).
1.2 Antimikrobielle Peptide
1.2.1
Bedeutung
Der Mensch ist permanent verschiedensten Mikroorganismen ausgesetzt. Um eine
Vermehrung und Invasion dieser Organismen und eine damit verbundene Erkrankung zu
verhindern, hat sich im Laufe der Evolution ein effizientes Abwehrsystem herausgebildet.
Dieses besteht aus zwei wesentlichen Komponenten: der entwicklungsgeschichtlich älteren
Komponente,
dem
angeborenen
(unspezifischen)
Immunsystem
und
der
jüngeren
Komponente, dem erworbenen (spezifischen) Immunsystem. Das angeborene Immunsystem
bildet eine Schutzbarriere gegenüber potentiellen Krankheitserregern. Ein Mechanismus
dieses Systems Krankheitserreger zu bekämpfen, ist die Produktion von antimikrobiellen
Peptiden (AMPs). Diese Peptide werden auch als „Effektormoleküle des angeborenen
Immunsystems“ bezeichnet (Boman, H. G. 1995). AMPs stellen ein effizientes Abwehrsystem
gegenüber einer Vielzahl von Pathogenen wie Bakterien, Viren und Protozoen dar.
1.2.2
Vorkommen und Funktionen
AMPs können in nahezu allen Organismen gefunden werden. So kommen sie nicht nur beim
Menschen, sondern auch im Tier- und Pflanzenreich, wie auch bei Bakterien und Pilzen vor.
Mittlerweile sind über 700 verschiedene AMPs beschrieben (Koczulla, A. R. und Bals, R.
2003). Beim Menschen werden sie in Epithelzellen (respiratorischer Trakt, Paneth-Zellen des
Dünndarms, Rektums und Magens, urogenitaler Trakt, Keratinozyten der Haut) und in
spezialisierten Abwehrzellen wie Makrophagen oder Neutrophilen gebildet. AMPs werden
konstitutiv produziert oder bei Entzündung und Infektion induziert (Stolzenberg, E. D. et al.
1997). AMPs besitzen eine mikrobiozide Wirkung gegenüber einer Vielzahl von Bakterien,
Viren und Protozoen. Selbst resistente Pathogene wie Methillicin-resistente Staphyloccocus
aureus (MRSA), Vancomycin-resistente Enterokokken (VRE) und Extended-Spectrum BetaLactamase (ESBL)-bildende Erreger werden erfasst (Hancock, R. E. 1997). Eine
antimikrobielle Aktivität stellt sich sehr schnell ein (Hancock, R. E. 2001), die minimalen
Hemmkonzentrationen liegen in vitro im Bereich von 0,1-100 µg/ml (Bals, R. 2000a).
Weitere Funktionen der AMPs sind direkte Endotoxinneutralisierung (Golec, M. 2007,
Einleitung
7
Hancock, R. E. 1997, Kai-Larsen, Y. und Agerberth, B. 2008), Einfluss auf Zellproliferation
(Murphy, C. J. et al. 1993), extrazelluläre Matrixproduktion, Wundheilung (Gallo, R. L. et al.
1994, Stolzenberg, E. D. et al. 1997), Angiogenese (Li, J. et al. 2000) sowie eine
immunmodulierende Wirkung (Yang, D. et al. 2002).
1.2.3
Struktureller Aufbau und Gemeinsamkeiten verschiedener AMPs
AMPs sind durch ihre kurze Sequenz (11-50 Aminosäuren) und ihre positive Ladung (durch
hohen Gehalt an basischen Aminosäuren wie Arginin und Lysin) charakterisiert. Sie werden
deshalb auch häufig als kationische antimikrobielle Peptide (CAMP) bezeichnet.
Kennzeichnend ist außerdem der amphipatische Charakter der Peptide, welcher durch das
Vorhandensein einer hydrophoben und hydrophilen Seite innerhalb ihrer dreidimensionalen
Struktur hervorgerufen wird (Hancock, R. E. 1997). Die positive Nettoladung und der
amphipatische Charakter sind die wesentlichen Voraussetzungen für die antimikrobielle
Aktivität der Peptide. AMPs werden von individuellen Genen kodiert, welche als Cluster
innerhalb des Genoms angelegt sind. Das primäre Translationsprodukt ist ein Präpropeptid,
welches aus einem meist negativ geladenem N-terminalen Propeptidanteil und einem positiv
geladenem C-terminalen Anteil besteht, welcher nach Abspaltung im Rahmen der weiteren
Prozessierung seine antimikrobielle Aktivität ausüben kann. Aufgabe des Propeptidanteils ist
die Zielsteuerung zum endoplasmatischen Retikulum, die korrekte Faltung und die
Funktionshemmung des C-terminalen Peptidanteils. Sowohl die Propeptidform, als auch das
gereifte Peptid können intrazellulär gespeichert werden (Bals, R. 2000b).
1.2.4
Die
Wirkmechanismus
antimikrobielle
Aktivität
der
Peptide
wird
durch
ihre
Interaktion
mit
Bakterienmembranen erklärt (Brogden, K. A. 2005, Hancock, R. E. 1997). Aufgrund der
positiven Nettoladung kommt es zur Anlagerung des Peptids an die negativ geladenen
Komponenten der Bakterienmembranen: Lipopolysaccharide (LPS) bei Gram-negativen
Bakterien, Lipoteichonsäuren bei Gram-positiven Bakterien. Der amphipatische Charakter
ermöglicht dem Peptid die weitere Wechselwirkung mit der Bakterienmembran. Durch
Porenbildung kommt es zum Einstrom wasserlöslicher Bestandteile, welcher das
Membranpotential zusammenbrechen lässt und schließlich den Tod des Bakteriums
verursacht (Yeaman, M. R. und Yount, N. Y. 2003). Es sind drei verschiedene Modelle
beschrieben (barrel-stave, aggregate channel und carpet-like Modell), die diese Vorgänge
näher umschreiben (Brogden, K. A. 2005, van 't, Hof W. et al. 2001). Die Toxizität gegenüber
Einleitung
8
eukaryoten Zellen ist gering, was am unterschiedlichen Aufbau der Zellmembranen liegt. Bei
Eukaryoten zeichnet sich die Zellmembran durch eine deutlich geringere Ladung aus,
wodurch eine Interaktion mit AMPs erschwert wird (Schroder, J. M. 2002).
Resistenzentwicklung von Mikroorganismen gegenüber AMPs gilt als selten (Hancock, R. E.
1997). Es sind jedoch Resistenzentwicklungen von Pathogenen gegenüber AMPs durch
Membranmodifikation, Proteasensekretion und Efflux-Pumpen-Induktion beschrieben (Ganz,
T. 2001, Perron, G. G. et al. 2006). In der Literatur werden zwei Bakterienstämme
beschrieben, welche von Natur aus gegenüber AMPs widerstandsfähiger zu sein scheinen. So
sind Burkholderia capacia und Serratia marcescens vermutlich aufgrund einer speziellen
äußeren Membran und der Produktion von Proteasen gegenüber den bisherig untersuchten
AMPs unempfindlich (Baird, R. M. et al. 1999, Hancock, R. E. 1997, Sahly, H. et al. 2003,
Turner, J. et al. 1998).
1.2.5
Einteilung der AMPs
Humane AMPs können anhand ihrer Aminosäuresequenz, Größe und Struktur in
unterschiedliche Gruppen eingeteilt werden. Die wichtigsten Eigenschaften der in der
vorliegenden Arbeit untersuchten AMPs sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Neben den im
Folgenden näher beschriebenen Defensinen und Cathelicidinen sind beim Menschen noch
Vertreter der Histatine bekannt, welche sich durch einen vorwiegend intrazellulären
Wirkmechanismus auszeichnen (van 't, Hof W. et al. 2001). Sie sind durch eine histatinreiche
Aminosäuresequenz charakterisiert, kommen im Speichel vor und sind vor allem gegen Pilze
wirksam (Oppenheim, F. G. et al. 1988). Das Dermcidin stellt ein weiteres konstitutiv in den
Schweiß sezerniertes humanes AMP dar (Schittek, B. et al. 2001).
1.2.5.1 Defensine
Defensine sind argininreiche AMPs, welche sechs Cysteine und drei intramolekulare
Disulfidbrücken besitzen. Sie haben eine molekulare Masse von 3,5-4,5 kDa und weisen eine
β-Faltblattstruktur
auf.
Aufgrund
unterschiedlicher
Anordnung
der
Cysteine
und
Disulfidbrücken unterscheidet man α- und β-Defensine. Bis zum heutigen Zeitpunkt sind
beim Menschen sechs α-Defensine und vier β-Defensine bekannt. α-Defensine besitzen eine
Aminosäuresequenz von 29-35 Aminosäuren, die sechs Cysteine sind über drei
Disulfidbrücken 1-6, 2-4 und 3-5 verknüpft (Bals, R. 2000a). Das erste α-Defensin wurde
beim Menschen 1985 aus neutrophilen Granulozyten isoliert (Ganz, T. et al. 1985). Heute
unterscheidet man vier humane neutrophile Peptide (HNP 1-4), welche in den primären
Einleitung
9
(azurophilen) Granula der neutrophilen Granulozyten konstitutiv gebildet werden (Kaiser, V.
und Diamond, G. 2000). Dort erreichen sie Konzentration von bis zu 10 mg/ml (Hancock, R.
E. 2001). β-Defensine besitzen eine Aminosäuresequenz von 36-42 Aminosäuren, die sechs
Cysteine sind über drei Disulfidbrücken 1-5, 2-4 und 3-6 verknüpft (Bals, R. 2000a). Das erste
β-Defensin wurde beim Menschen 1995 isoliert. Heute unterscheidet man vier humane βDefensine (hBD 1-4), welche hauptsächlich von Epithelien der Körperoberflächen gebildet
werden und dort Konzentrationen von 0,3 bis 8 µg/ml erreichen (Hancock, R. E. 2001). βDefensine kommen auf der Haut, im Respirationstrakt, im Gastrointestinaltrakt und im
Urogenitaltrakt vor (Bals, R. 2000a). Mit der Ausnahme von hBD-1 stellen humane βDefensine induzierbare AMPs dar (Ali, R. S. et al. 2001).
1.2.5.2 Cathelicidine
AMPs der Cathelicidinfamilie zeichnen sich durch eine hoch konservierte N-terminale
Proregion (auch als Cathelin-ähnliche Domäne bezeichnet) und eine weniger konservierte Cterminale, antimikrobiell aktive Region aus. Sie werden in den sekundären (spezifischen)
Granula von neutrophilen Granulozyten gespeichert und auf Stimuli exozytiert und
prozessiert. Hierbei wird die antimikrobiell aktive C-terminale Region durch Proteasen
abgespaltet und somit aktiviert. Vertreter der Cathelicidinfamilie kommen bei zahlreichen
Säugetieren vor.
Die C-terminalen Regionen der AMPs unterscheiden sich in Länge, Aminosäuresequenz und
Sekundärstruktur. Im Gegensatz zu den Defensinen enthalten Cathelicidine keine Cysteine
und somit keine Disulfidbrücken. Einziger Vertreter eines humanen Cathelicidins, welches
erstmals 1995 beschrieben wurde, ist das LL-37/hCAP-18 (Zanetti, M. et al. 1995). Es besitzt
eine Länge von 37 Aminosäuren (an den ersten beiden Positionen zwei namensgebende
Leucine), weist eine α-helikale Sekundärstruktur auf und wird durch die Protease 3 aktiviert
(Gallo, R. L. und Huttner, K. M. 1998). Die Bezeichnung hCAP-18 beschreibt das
Präpropeptid, welches als humanes kationisches antimikrobielles Peptid bezeichnet wird und
eine molekulare Masse von 18 kDa besitzt. LL-37/hCAP-18 wird konstitutiv von neutrophilen
Granulozyten gebildet. Weiterhin wird es in Epithelzellen induziert (Koczulla, A. R. und Bals,
R. 2003) und kommt somit auf der Haut, im Respirationstrakt, im Gastrointestinaltrakt und im
Urogenitaltrakt vor (Golec, M. 2007). Auf den Körperoberflächen werden Konzentrationen
zwischen 1-5 µg/ml erreicht (Bals, R. und Wilson, J. M. 2003).
Einleitung
10
1.2.5.3 Ausgewählte bovine AMPs
Indolicidin wurde 1992 erstmals aus neutrophilen Granulozyten von Rindern isoliert (Selsted,
M. E. et al. 1992). Es ist das kürzeste aller bisher bekannten AMPs mit einer Sequenz von 13
Aminosäuren. Es besteht aus sechs verschiedenen Aminosäuren, wobei die Aminosäuren
Tryptophan und Prolin überproportional häufig vertreten sind (zu 39 und 23 %). Eine äußerst
starke antimikrobielle Aktivität von Indolicidin, welche die des HNP 1-3 um ein fünffaches
übertrifft (Falla, T. J. et al. 1996), wird in der Literatur beschrieben. Abgesehen von
Interaktionen mit Bakterienmembranen entfaltet Indolicidin intrazelluläre Wirkmechanismen.
Eine Hemmung der DNA- und Proteinsynthese und der Septumbildung der zytoplasmatischen
Membran im Rahmen der bakteriellen Zellteilung sind hier beschrieben (Subbalakshmi, C.
und Sitaram, N. 1998).
Die trachealen und lingualen antimikrobiellen Peptide (TAP und LAP) gehören zur Familie
der bovinen β-Defensine. TAP ist das erstbeschriebene β-Defensin, welches 1991 isoliert
wurde, und insgesamt 38 Aminosäuren umfasst (Diamond, G. et al. 1991). Die Expression
von TAP ist induzierbar (Diamond, G. et al. 1996) und findet in der Mukosa des
Respirationstraktes statt. LAP wurde 1995 aus dem Zungenepithel von Rindern isoliert
(Schonwetter, B. S. et al. 1995). Die Expression von LAP ist ebenfalls von Pathogenen
induzierbar. Die bovinen β-Defensine LAP und TAP können im Rahmen einer Mastitis beim
Rind in Epithelzellen der Milchdrüse induziert werden. Es wird davon ausgegangen, dass die
Induktion von AMPs im Rahmen der bovinen Mastitis bei der Erregerabwehr eine wichtige
Rolle spielt (Boehmer, J. L. et al. 2008, Lopez-Meza, J. E. et al. 2009, Roosen, S. et al. 2004,
Swanson, K. et al. 2004).
Einleitung
11
Tabelle 2 Merkmale humaner und boviner AMPs
AMP
Klasse
strukturelle
Merkmale
Expressionsort
Expressionsart
Konzentration in vivo
HNP 1-3
humane
α-Defensine
β-Faltblatt, drei
Disulfidbrücken
(1-6, 2-4, 3-5
verknüpft)
neutrophile
Granulozyten
konstitutiv
bis 10 mg/ml
humanes
β-Defensin
β-Faltblatt, drei
Disulfidbrücken
(1-5, 2-4, 3-6
verknüpft)
Keratinozyten,
Epithelzellen des
Respirations-,
Gastrointestinalund
Urogenitaltraktes
induzierbar
0,3-8 µg/ml
humanes
Cathelicidin
α-helikales Peptid,
hoch konservierte
N-terminale
Proregion,
geringer
konservierte
C-terminale
antimikrobiell
aktive Region,
keine
Disulfidbrücken
neutrophile
Granulozyten,
Keratinozyten,
Epithelzellen des
Respirations-,
Gastrointestinalund
Urogenitaltraktes
konstitutiv
(Neutrophile)
+
induzierbar
(Epithelzellen)
1-5 µg/ml
Indolicidin
lineares,
bovines
AMP
linear, kurze
Sequenz von 13
Aminosäuren
(39 % Tryptophan,
23 % Prolin),
zusätzliche
intrazelluläre
Wirkmechanismen
neutrophile
Granulozyten
konstitutiv
keine
Angaben
LAP
bovines
β-Defensin
β-Faltblatt, drei
intramolekulare
Disulfidbrücken
induzierbar
keine
Angaben
TAP
bovines
β-Defensin
β-Faltblatt, drei
intramolekulare
Disulfidbrücken
induzierbar
keine
Angaben
hBD-3
LL-37/
hCAP-18
Zungenepithel,
Epithelzellen der
Milchdrüse
Mukosa des
Respirationstraktes,
Epithelzellen der
Milchdrüse
Einleitung
12
1.3 Zielsetzung
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität
verschiedener AMPs gegenüber wichtigen humanpathogenen Nocardia-Spezies. Hiermit sollte
die Bedeutung von AMPs als Bestandteil des angeborenen Immunsystems in der
körpereigenen Abwehr gegenüber Nocardien beurteilt werden. Eine antimikrobielle Aktivität
von AMPs gegenüber verschiedenen Mykobakterien und Aktinomyzeten, welche mit den
Nocardien eng verwandt sind, konnte bereits gezeigt werden (Joly, S. et al. 2004, Martineau,
A. R. et al. 2007).
Die vorliegende Arbeit bestand aus drei wesentlichen Schwerpunkten. Der erste Schwerpunkt
ergab sich aus den anspruchsvollen Kultivierungsbedingungen der Nocardien. Er galt der
Bestimmung
der
optimalen
Kultivierungsbedingungen
und
der
Bestimmung
der
Wachstumskurven mit den entsprechenden Keimzahlen der verschiedenen Bakterienstämme.
Hierzu wurden unterschiedliche Nährmedien, Kultivierungsbedingungen und Methoden zur
Homogenisierung der Bakterienkultur untersucht. Der zweite Schwerpunkt lag in der
Etablierung eines Killing-Assays, mit welchem die antimikrobielle Aktivität der AMPs
gegenüber Nocardien beurteilt werden sollte. Durch das Auswählen der bakteriziden
Kontrollsubstanz Levofloxacin, der entsprechenden Kultivierungsbedingungen und der
Inkubationszeiten sowie der Mittestung des antimikrobiell inaktiven Peptides DPY konnten
aussagekräftige Ergebnisse erzielt werden. Der dritte Schwerpunkt und Hauptbestandteil der
Arbeit bestand aus der AMP-Testung anhand des etablierten Protokolls. Hierzu wurden die
jeweiligen Nocardia-Spezies in mindestens drei unabhängigen Killing-Assays getestet.
Material und Methoden
13
2 Material und Methoden
___________________________________________________________________________
2.1 Material
2.1.1
Bakterienstämme
In der vorliegenden Arbeit wurden vier unterschiedliche Bakterienspezies der Gattung
Nocardia untersucht (Tabelle 3). Verwendet wurden ATCC-Stämme (American Type Culture
Collection). Diese wurden bei -80°C gelagert und vor jedem neuen Versuchsansatz auf
Columbia-Blutagarplatten rekultiviert (vgl. Kapitel 2.2.2).
Tabelle 3 Untersuchte Bakterienstämme
Spezies
Nocardia farcinica
Nocardia nova
Nocardia asteroides
Nocardia brasiliensis
2.1.2
Beschreibung
ATCC 3318
ATCC 33726
ATCC 19247
ATCC 19296
Herkunft
DSMZ, Braunschweig
DSMZ, Braunschweig
DSMZ, Braunschweig
DSMZ, Braunschweig
Antimikrobielle Substanzen
In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene humane und bovine AMPs untersucht.
Verwendet wurden die humanen neutrophilen Peptide HNP 1-3 (α-Defensine), das humane βDefensin hBD-3, das humane Cathelicidin LL-37 sowie das bovine neutrophile Peptid
Indolicidin und die bovinen lingualen und trachealen β-Defensine LAP und TAP (Tabelle 4).
Durch Lösen in 0,01 % Essigsäure wurden AMP-Stammlösungen mit einer Konzentration von
1 mg/ml hergestellt. Levofloxacin wurde als Positivkontrolle verwendet („Killing-Control“),
durch Lösen in sterilem destilliertem Wasser wurde eine Stammlösung von 1 mg/ml
hergestellt. Außerdem wurde das Peptid DPY als Negativkontrolle mit getestet. DPY besitzt
keine antimikrobielle Aktivität und weist eine Sequenz von 30 Aminosäuren auf:
DPYAEAASGPNPGSKSHESAQAENCGADPE (Aminosäuren im Einbuchstabencode, vgl.
Kapitel 7.2). Alle Substanzen wurden bei -20 °C gelagert. Es wurde darauf geachtet, dass die
antimikrobiellen Substanzen maximal dreimal eingefroren und wieder aufgetaut wurden, um
eine konstante antimikrobielle Aktivität zu gewährleisten.
Material und Methoden
14
Tabelle 4 Verwendete antimikrobielle Substanzen
antimikrobielle
Substanz
HNP 1-3
hBD-3
Lösungsmittel
10 mM
Natriumphosphat
Puffer (pH 7,4)
+ 0,01 % Essigsäure
10 mM
Natriumphosphat
Puffer (pH 7,4)
+ 0,01 % Essigsäure
Beschreibung
Herkunft
humane α-Defensine
isoliert aus
neutrophilen
Granulozyten
humanes β-Defensin
PeptaNova
(Sandhausen,
Deutschland)
LL-37/h-CAP-18
10 mM
Natriumphosphat
Puffer (pH 7,4)
+ 0,01 % Essigsäure
humanes Cathelicidin
Indolicidin
10 mM
Natriumphosphat
Puffer (pH 7,4)
+ 0,01 % Essigsäure
bovines neutrophiles
Peptid
LAP
10 mM
Natriumphosphat
Puffer (pH 7,4)
+ 0,01 % Essigsäure
bovines β-Defensin
TAP
10 mM
Natriumphosphat
Puffer (pH 7,4)
+ 0,01 % Essigsäure
bovines β-Defensin
Levofloxacin
H2O (destilliert)
Fluorchinolon
DPY
10 mM
Natriumphosphat
Puffer (pH 7,4)
+ 0,01 % Essigsäure
Kontroll-Peptid
(antimikrobiell inaktiv)
Aminosäurensequenz:
DPYAEAASGPNPGSKSHESAQAENCGADPE
Hubert Kalbacher,
Universität Tübingen,
Peptidsynthesizer
SyroII (MultiSynTech,
Witten, Deutschland)
Hubert Kalbacher,
Universität Tübingen,
Peptidsynthesizer
SyroII (MultiSynTech,
Witten, Deutschland)
Hubert Kalbacher,
Universität Tübingen,
Peptidsynthesizer
SyroII (MultiSynTech,
Witten, Deutschland)
Hubert Kalbacher,
Universität Tübingen,
Peptidsynthesizer
SyroII (MultiSynTech,
Witten, Deutschland)
Roussel-Uclaf
(Frankreich)
Hubert Kalbacher,
Universität Tübingen,
Peptidsynthesizer
SyroII (MultiSynTech,
Witten, Deutschland)
Material und Methoden
2.1.3
15
Nährmedien, Puffer und sonstige Lösungen
Alle Nährmedien, Puffer und sonstige Lösungen wurden nach der Herstellung autoklaviert.
Tabelle 5 Zusammensetzung der Nährmedien, Puffer und sonstigen Lösungen
Bezeichnung
Columbia-Blutagar
Essigsäure (0,01%)
MH-Agar
MHB
MHB + 1% Tween®80
10 mM
Natriumphosphat
Puffer (pH 7,4)
10 mM
Natriumphosphat
Puffer (pH 7,4)
+
1% MHB
Proteasen Inhibitor
Cocktail (complete,
Mini)
Tween®80 (100%)
Bestandteile
Agar
Natriumchlorid
Schafsblut
Spezialpepton
Stärke
destilliertes Wasser
+
Essigsäure (100 %)
Agar
Caseinhydrolysat
Rinderinfus
Stärke
Caseinhydrolysat
Fleischinfus
Stärke
Caseinhydrolysat
Fleischinfus
Stärke
Tween®80 (100 %)
Na2HPO4
NaH2PO4
HCl oder NaOH
siehe oben
Menge/l (H2O)
14,0 g
5,0 g
50 ml
23,0 g
1,0 g
999,9 ml
0,1 ml
17,0 g
17,5 g
2,0 g
1,5 g
17,5 g
2,0 g
1,5 g
17,5 g
2,0 g
1,5 g
10 ml
1,42 g
1,56 g
wenige Tropfen
siehe oben
Hersteller
Nährbodenküche,
Universitätsklinikum
Freiburg
Merck, Darmstadt
Roth, Karlsruhe
Merck, Darmstadt
Merck, Darmstadt
Serva, Heidelberg
Merck, Darmstadt
Sigma-Aldrich,
Taufkirchen
Merck, Darmstadt
+
siehe oben
Mischung aus
Inhibitoren gegenüber
verschiedenen Serin-,
Cystein- und
Metalloproteasen
Oleylsorbitanpolyethylenglykolether
+
10 ml
1 Tablette/10 ml
Roche, Mannheim
einige ml
Serva, Heidelberg
Material und Methoden
2.1.4
16
Verbrauchsmaterialien
Vor ihrer Verwendung wurden alle Erlenmeyerkolben, Glas beads, LidBacs und
Reaktionsgefäße autoklaviert. Die restlichen Einmalartikel wurden vom Hersteller steril
ausgeliefert.
Tabelle 6 Verwendete Verbrauchsmaterialien
Verbrauchsmaterialien
Cellstar®, 96 Well Mikrotitrationsplatten
Cryobank™ System
Falcons mit Stehrand (50 ml)
Glas beads (1 mm)
Impfschlingen
LidBacs
Petrischalen, rund/quadratisch
Reaktionsgefäße (1,5 ml)
Reaktionsgefäße (Safe-Lock Tubes, 2 ml)
2.1.5
Hersteller
Greiner-Bio-One, Frickenhausen
MAST Diagnostica GmbH, Reinfeld
Greiner-Bio-One, Frickenhausen
BioSpec Products, USA
Sarstedt, Nümbrecht
Eppendorf, Hamburg
Greiner-Bio-One, Frickenhausen
Greiner-Bio-One, Frickenhausen
Eppendorf, Hamburg
Geräte
Zur Durchführung der beschriebenen Experimente wurden folgende Geräte benutzt:
Tabelle 7 Verwendete Geräte
Gerät
Typ
Autoklav
Hiclave, HA-300M3CF
Brutschrank
Kühlschrank (-80 °C)
Photometer
Reagenzglasschüttler
(Vortexer)
Schüttelinkubator
Sterilbank
Zentrifuge
B5061 EK/CO2
HERA freeze
Bio-Photometer
Hersteller
Firma Wolf,
Geislingen/Bad Überkingen
Heraeus, Hanau
Heraeus, Hanau
Eppendorf, Hamburg
Reagenzglasschüttler
VWR International, Darmstadt
Aerotron
HERA safe
5415 R
Infors HT, Schweiz
Heraeus, Hanau
Eppendorf, Hamburg
Material und Methoden
17
2.2 Methoden
Alle Arbeiten wurden stets unter sterilen Bedingungen durchgeführt (Sterilbank HERA safe,
Heraeus).
2.2.1
Herstellung der Mueller-Hinton-Agarplatten
Mueller-Hinton (MH)-Agar wurde entsprechend der Herstellerangaben zubereitet und bei
einer Temperatur von 121 °C für 20 Minuten autoklaviert. Der flüssige Agar wurde in
quadratische Petrischalen gegossen (jeweils 30 ml) und bei Raumtemperatur ausgekühlt.
2.2.2
Lagerung
Die Lagerung der Bakterienstämme erfolgte mithilfe des CryobankTM Systems (MAST
Diagnostica GmbH, Reinfeld) bei -80 °C. Zur Rekultivierung wurde jeweils eine Glasperle
dem CryobankTM System unter sterilen Bedingungen entnommen und auf eine Columbia
Blutagarplatte gegeben. Mittels einer sterilen Impföse wurde ein Drei-Ösen-Ausstrich
angefertigt.
2.2.3
Kultivierung
Die Columbia Blutagarplatten wurden bei allen vier Bakterienstämmen für 72 Stunden bei
einer
Temperatur
von
37
°C
bebrütet. Anschließend wurden alle verwendeten
Bakterienstämme in Mueller-Hinton-Bouillon (MHB) + 1% Tween®80 angezüchtet. Zu
Versuchsbeginn wurde eine Vorkultur in MHB + 1% Tween®80 angelegt. Dazu wurden,
mithilfe einer sterilen Impföse, einige Kulturen von der Columbia Blutagarplatte genommen.
Durch gleichmäßiges Verreiben an der Gefäßwand eines 150 ml Erlenmeyerkolbens wurden
diese in 30 ml MHB + 1% Tween®80 resuspendiert. Die Vorkultur wurde bei 37 °C und 220
rpm im Schüttelinkubator inkubiert. Abhängig von der entsprechenden Nocardia-Spezies
musste die Inkubationszeit unterschiedlich lange erfolgen (vgl. Kapitel 3, Tabelle 9).
Anschließend wurde aus der Vorkultur durch Überimpfung in MHB + 1% Tween®80 eine
neue Hauptkultur mit einem Gesamtvolumen von 50 ml und einer optischen Dichte (bei 600
nm, OD600) von 0,1 in einem 250 ml Erlenmeyerkolben hergestellt. Diese neue Kultur wurde,
abhängig von der verwendeten Nocardia-Spezies, so lange im Schüttelinkubator inkubiert (37
°C, 220 rpm) bis die midlogarithmische Phase erreicht wurde (vgl. Kapitel 3, Tabelle 9). Vor
der Überimpfung musste die Vorkultur stets vorbehandelt werden, denn das beigefügte
Tween®80, welches die starke Aggregation der Nocardien verhindern sollte, erzielte alleine
Material und Methoden
18
nicht die gewünschte volle Wirkung. Die Vorkultur wurde mittels einer sterilen 10 ml Pipette
durch mehrmaliges Auf- und Abziehen resuspendiert. Anschließend wurden einige Milliliter
der Vorkultur in ein vorbereitetes 50 ml Falconröhrchen, welches einige 1 mm Glas beads
enthielt, überführt. Dieses wurde für 5-10 Sekunden gevortext, anschließend wurde ihm das
zur OD600-Messung benötigte Volumen wieder entnommen. Das zur Überimpfung
verwendete Volumen wurde, stets nach vorangegangenem Vortexen, ebenfalls aus dem
Falcon entnommen. Dieses Verfahren war nötig, um konstante Ergebnisse zu erhalten. Ohne
die beschriebenen Schritte wurden stärkere Abweichungen erzielt, da durch die Aggregation
der Nocardien inhomogene Lösungen erhalten wurden.
2.2.4
Bestimmung der Wachstumskurven
Im Rahmen von mehreren Vorversuchen wurden die Wachstumskurven der vier
verschiedenen Bakterienstämme unter den oben beschriebenen Kultivierungsbedingungen
bestimmt. Dazu wurde in unterschiedlichen Zeitabständen die OD600 der Hauptkultur
gemessen. Die OD600 wurde in einem Diagramm gegen die Zeit dargestellt. Vor jeder OD600Messung wurde das entsprechend benötigte Volumen, wie oben beschrieben, durch Vortexen
mit 1 mm Glas beads vorbehandelt.
2.2.5
Bestimmung der Keimzahlen
Parallel zur Bestimmung der Wachstumskurven erfolgte die Keimzahlbestimmung. Dazu
wurde von der Bakteriensuspension, von welcher zuvor die OD600 für die Wachstumskurve
gemessen wurde, eine Verdünnungsreihe in 10 mM Natriumphosphat Puffer (pH 7,4)
hergestellt. Die entsprechenden Verdünnungen wurden als Zweifachbestimmung auf eine
MH-Agarplatte aufgebracht. Die MH-Agarplatte wurde im Brutschrank bei 37 °C für eine
Dauer von 48 Stunden (N. asteroides, N. farcinica) bis 96 Stunden (N. brasiliensis, N. nova)
bebrütet. Die sichtbaren Kolonien wurden ausgezählt und die Kolonien bildenden Einheiten
(Colony Forming Units, CFU) pro Milliliter berechnet.
2.2.6
Präperation der antimikrobiellen Substanzen
Verwendet wurden die oben genannten Substanzen und Lösungsmittel (vgl. Tabelle 4).
Ausgehend von einer Stammlösung der Konzentration 1 mg/ml wurden im Vorfeld
unterschiedlich konzentrierte Gebrauchslösungen der antimikrobiellen Substanzen angefertigt.
Material und Methoden
2.2.7
19
Präperation des Inokulums
Die entsprechenden Bakterienstämme wurden unter den oben beschriebenen Bedingungen so
lange kultiviert, bis sie die midlogarithmische Wachstumsphase erreicht hatten (vgl. Kapitel 3,
Tabelle 9). Anschließend wurden unter sterilen Bedingungen einige Milliliter der Hauptkultur
in ein vorbereitetes 50 ml Falconröhrchen überführt, welches mit einigen 1 mm Glas beads
versehen wurde. Nach 5-10 sekündigem Vortexen wurde dem Röhrchen 1 ml der
Bakteriensuspension entnommen, um die OD600 zu messen bzw. die erwartete OD600 der
midlogarithmischen Phase zu kontrollieren. Anschließend wurden, nach erneutem Vortexen, 2
ml der Bakteriensuspension in ein 2 ml Reaktionsgefäß überführt. Es folgten zwei
Waschschritte. Hierfür wurde die Suspension für 5 Minuten bei 13200 rpm und 4 °C
zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und verworfen, das Bakterienpellet in 2 ml
Natriumphosphat Puffer (10 mM, pH 7,4) wieder aufgenommen. Eine erneute Zentrifugation
unter den oben genannten Bedingungen schloss sich an. Der Überstand wurde erneut
abgenommen und verworfen, das Bakterienpellet diesmal in 2 ml Natriumphosphat Puffer (10
mM, pH 7,4) + 1% MHB resuspendiert. Beide Resuspensionsschritte erfolgten innerhalb des 2
ml Reaktionsgefäßes und wurden mittels einer 1000 µl Pipette durch mehrmaliges Auf- und
Abziehen bewerkstelligt. Durch diese beiden Waschschritte konnte eine homogene
Bakteriensuspension hergestellt werden. Auf der Grundlage der vorangegangenen
Keimzahlbestimmung wurde berechnet, wie viel der gewonnenen Bakteriensuspension
benötigt wurde, um ein Inokulum mit einer Keimzahl von 1*107 CFU/ml zu erhalten. Dieses
Inokulum wurde in einem frischen 2 ml Reaktionsgefäß in Natriumphosphat Puffer (10 mM,
pH 7,4) hergestellt. Zur Kontrolle der Keimzahl wurde aus 100 µl des Inokulums eine
Verdünnungsreihe in 10 mM Natriumphosphat Puffer angelegt. 10 µl der Verdünnungen
1/100 und 1/1000 wurde als Zweifachbestimmung auf MH-Agar aufgebracht. Nach einer
Inkubationszeit (im Brutschrank bei 37 °C) von 24 Stunden (N. asteroides und N. farcinica)
bis 96 Stunden (N. brasiliensis und N. nova) wurden die sichtbaren Kolonien ausgezählt.
Anschließend wurde der Mittelwert der beiden Ausplattierungen einer Verdünnungsstufe
gebildet und daran die Keimzahl (CFU/ml) berechnet.
2.2.8
Killing-Assay
Mithilfe eines Killing-Assays kann die Aktivität antimikrobieller Substanzen gegenüber
Bakterien beurteilt werden. Hierfür werden die Pathogene in Gegenwart der antimikrobiellen
Substanz für eine bestimmte Zeit bebrütet. Nach anschließender Ausplattierung des
Material und Methoden
20
Inkubationsgemisches kann die Aktivität der antimikrobiellen Substanz (“Killing”) anhand
des bakteriellen Wachstums beurteilt werden.
Es wurden jeweils 20 µl der entsprechend zu testenden antimikrobiellen Substanzen in 2 ml
Reaktionsgefäße vorgelegt. Die Substanzen wurden aufgrund des sich anschließenden
Verdünnungsschrittes fünffach höher konzentriert. Pro Versuchsreihe einer antimikrobiellen
Substanz wurde eine Wachstumskontrolle, welche aus 20 µl des entsprechenden
Lösungsmittels bestand (0,01 % Essigsäure oder Wasser), mitgetestet. Zusätzlich wurde pro
Assay eine Kontrolle mit DPY angelegt. Levofloxacin diente als Positivkontrolle.
Anschließend wurden in jedes Reaktionsgefäß 80 µl des vorbereiteten Inokulums (8*105
CFU/ml) pipettiert. Die Reaktionsgefäße wurden mit LidBacs verschlossen, um eine
Kontamination zu verhindern und gleichzeitig ein aerobes Milieu aufrecht zu erhalten. Nach
kurzem Vortexen der Reaktionsgefäße für wenige Sekunden wurden sie, je nach
Bakterienstamm, unterschiedlich lange bei 37 °C und 220 rpm im Schüttelinkubator inkubiert
(Tabelle 8). Nach abgeschlossener Inkubation wurden die Reaktionsgefäße erneut für wenige
Sekunden gevortext. Aus 10 µl der Inhalte der jeweiligen Reaktionsgefäße wurde eine
Verdünnungsreihe in der Cellstar® 96 Well Mikrotitrationsplatte hergestellt (in 10 mM
Natriumphosphatpuffer). Beim Herstellen der Verdünnungsreihe wurde stets darauf geachtet,
dass vor jedem Verdünnungsschritt der Inhalt der Wells durch mehrmaliges Auf- und
Abziehen mittels einer Pipette gut durchmischt wurde. Abschließend wurden die
Verdünnungsstufen 1/100 und 1/1000 als Zweifachbestimmung auf MH-Agar aufgebracht
und für 24-72 Stunden bei 37 °C im Brutschrank bebrütet (Tabelle 8).
Tabelle 8 Inkubationszeiten der Killing-Assays
Spezies
Nocardia farcinica
Nocardia nova
Nocardia asteroides
Nocardia brasiliensis
2.2.9
Inkubationszeit mit
antimikrobieller Substanz (h)
12
16
16
16
Inkubationszeit der
MH-Platten (h)
24-48
72
24-48
72
Variation des Killing-Assays
Bei der Testung von Nocardia brasiliensis wurden einige Killing-Assays durch den Zusatz
eines Proteasen-Inhibitoren-Mixes ergänzt. Hierzu wurde zunächst der Proteasen-InhibitorenMix gemäß den Herstellerangaben gelöst und anschließend unverdünnt und in einer 1/10
Verdünnung zur Testung verwendet. Dem Inkubationsgemisch, bestehend aus 80 µl Inokulum
Material und Methoden
21
und 20 µl AMP (in einer Konzentration von 160 µg/ml), wurden 10 µl des ProteasenInhibitoren-Mixes (bzw. 10 µl der 1/10 Verdünnung) zugefügt. Die weitere Testung erfolgte
analog zum bereits beschriebenen Protokoll.
Weiterhin wurde eine mögliche synergistische Aktivität von AMPs untersucht. Hierzu wurde
exemplarisch die Aktivität von LL-37 in Kombination mit HNP 1-3 gegenüber Nocardia
farcinica getestet. Das verwendete Inkubationsgemisch bestand hierbei aus 80 µl Inokulum
und 20 µl AMP (10 µl LL-37 + 10 µl HNP 1-3), die weitere Testung erfolgte anhand des
beschriebenen Protokolls.
2.2.10 Auswertung des Killing-Assays
Nach abgeschlossener Inkubationszeit des MH-Agars wurden die sichtbaren Kolonien
ausgezählt und die Keimzahl in CFU/ml berechnet. Die Wachstumsreduktion („Killing“)
unter Zugabe der antimikrobiellen Substanzen wurde im Verhältnis zum Wachstum in der
Wachstumskontrolle (0,01 % Essigsäure oder Wasser) berechnet:
Killing [%] =
CFU / ml nach Peptidinkubation
CFU / ml der Wachstumskontrolle
Das Ergebnis eines Assays wurde mindestens zweimal reproduziert und das Endergebnis als
Mittelwert von mindestens drei unabhängigen Assays dargestellt. Das endgültige Ergebnis
wurde zusätzlich als LD90 [µg/ml] dargestellt. Die LD90 [µg/ml] entspricht derjenigen
Konzentration einer antimikrobiellen Substanz, welche zu einem Killing von mindestens 90%
der Nocardien führte. Alle Killing-Assay Auswertungen sind zusammenfassend im Anhang
aufgeführt (Kapitel 7.4).
Ergebnisse
22
3 Ergebnisse
___________________________________________________________________________
Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität
verschiedener humaner und boviner AMPs gegenüber unterschiedlichen Nocardia-Spezies.
Hierfür wurden zunächst die spezifischen Kultivierungsbedingungen der verwendeten Spezies
bestimmt. Anschließend wurde ihre Empfindlichkeit gegenüber den getesteten AMPs mit
Hilfe des etablierten Killing-Assays untersucht.
3.1 Wachstumskurven und Keimzahlen (Vorversuche)
Die Wachstumskurven und die entsprechenden Keimzahlen wurden für die einzelnen
Nocardia-Spezies bestimmt. Es ergaben sich unterschiedlich lange Generationszeiten der vier
verschiedenen Nocardia-Spezies. Bei Nocardia farcinica und Nocardia nova waren
Vorkulturen mit langen Inkubationszeiten notwendig, um nach Überimpfung die
midlogarithmische Phase nach verhältnismäßig kurzer Inkubationszeit zu erreichen. Bei
Nocardia asteroides und Nocardia brasiliensis korrelierten diese Inkubationszeiten eng
miteinander (Tabelle 9).
Nocardia farcinica
3.1.1
Die Vorkultur benötigte eine Inkubationszeit von 72 Stunden. Die sich anschließende
Generationszeit der Hauptkultur bis zum Erreichen der midlogarithmischen Phase betrug 12
Stunden und entsprach einer OD600 von 2,2 (Abbildung 1).
Abbildung 1 Wachstumskurve und Keimzahlbestimmung von N. farcinica
N. farcinica ATCC 3318
OD [bei 600nm]
2,5
2
1,5
1,00E+07
1
0,5
0
1,00E+06
0
5
10
15
Zeit [Stunden]
20
25
30
Wachstum [CFU/ml]
1,00E+08
3
Wachstumskurve
Keimzahl
Ergebnisse
23
Nocardia nova
3.1.2
Die Vorkultur benötigte die längste Inkubationszeit von acht bis elf Tagen. Es wurde darauf
geachtet, dass die Vorkultur eine OD600 von mindestens 2,0 erreichte. Aus einer Vorkultur mit
kürzerer Inkubationszeit und geringerer OD600 resultierte nach der Überimpfung stets eine
wachstumsunfähige Hauptkultur. Die sich anschließende Generationszeit der Hauptkultur bis
zum Erreichen der midlogarithmischen Phase variierte zwischen den verschiedenen
Versuchsansätzen
und
betrug
zwischen
24
und
120
Stunden.
Die
OD600 der
midlogarithmischen Phase lag, unabhängig von der Generationszeit, im Bereich von 2 bis 2,5.
In Abbildung 2 ist eine Wachstumskurve mit den entsprechenden Keimzahlen exemplarisch
für einen schnelleren Wachstumszyklus dargestellt. Das im Vergleich zur Vorkultur schnelle
und variable Wachstum der Hauptkultur könnte durch ein vitaleres Inokulum, welches zum
Zeitpunkt der Überimpfung vorlag, erklärt werden. Außerdem handelte es sich um ein
deutlich variableres Inokulum im Vergleich zu den anderen Nocardia-Spezies, da Nocardia
nova das am stärksten aggregierende Wachstum aufwies. Um eine Kontamination nach der
Überimpfung auszuschließen, wurde von der Hauptkultur zunächst ein Gram-Präparat
angefertigt und exemplarisch einmalig eine 16S-rRNA Gensequenzierung durchgeführt.
Abbildung 2 Wachstumskurve und Keimzahlbestimmung von N. nova (exemplarisch)
Nocardia nova ATCC 33726
4,5
1,00E+09
OD [bei 600 nm]
3,5
3
1,00E+08
2,5
2
1,5
1,00E+07
1
0,5
0
0
24
48
72
96
Zeit [Stunden]
120
144
1,00E+06
168
Wachstum [CFU/ml]
4
Wachstum
Keimzahl
Ergebnisse
24
Nocardia asteroides
3.1.3
Die Vorkultur benötigte die kürzeste Inkubationszeit der vier Nocardia-Spezies und erfolgte
als Übernachtkultur (12 bis maximal 24 Stunden). Die sich anschließende Generationszeit der
Hauptkultur bis zum Erreichen der midlogarithmischen Phase betrug 16 Stunden und
entsprach einer OD600 von 2,4 (Abbildung 3).
Abbildung 3 Wachstumskurve und Keimzahlbestimmung von N. asteroides
N. asteroides ATCC 19247
1,00E+09
4,5
4
1,00E+08
3
2,5
2
1,00E+07
1,5
1
0,5
0
1,00E+06
0
10
20
30
Zeit [Stunden]
40
50
Wachstum [CFU/ml]
OD [bei 600nm]
3,5
Wachstum
Keimzahl
Ergebnisse
25
Nocardia brasiliensis
3.1.4
Die Vorkultur benötigte eine Inkubationszeit von vier bis fünf Tagen, eine kürzere
Inkubationszeit erbrachte stets eine wachstumsunfähige Hauptkultur nach Überimpfung. Die
charakteristische Gelbfärbung der Vorkultur nach vier bis fünf Tagen stellte einen
verlässlichen Indikator für eine ausreichende Inkubationszeit dar. Die sich anschließende
Generationszeit der Hauptkultur bis zum Erreichen der midlogarithmischen Phase betrug 72
Stunden und entsprach einer OD600 von 4,0 bis 4,5 (Abbildung 4).
Abbildung 4 Wachstumskurve und Keimzahlbestimmung von N. brasiliensis
N. brasiliensis ATCC 19296
1,00E+10
7
5
1,00E+09
4
3
1,00E+08
2
Wachstum [CFU/ml]
OD [bei 600nm]
6
Wachstum
Keimzahl
1
0
0
20
40
60
80
100
1,00E+07
120
Zeit [Stunden]
3.1.5
Zusammenfassung der Vorversuche
In Tabelle 9 sind die Ergebnisse der Vorversuche bezüglich Inkubationszeiten und
Wachstumszyklen zusammenfassend dargestellt.
Tabelle 9 Zusammenfassung der Ergebnisse der Vorversuche
Spezies
Inkubationszeit der
Vorkultur (h)
Nocardia farcinica
Nocardia nova
Nocardia asteroides
Nocardia brasiliensis
72
192-264
12-24
96-120
Inkubationszeit bis
zum Erreichen der
mid-log Phase (h)
12
24-120
16
72
OD600 bei mid-log
Phase
2,2
2,0 bis 2,5
2,4
4,0 bis 4,5
Ergebnisse
26
3.2 Etablierung des Killing-Assays
Zur Testung der antimikrobiellen Aktivität verschiedener humaner und boviner AMPs
gegenüber unterschiedlichen Nocardia-Spezies wurde ein Killing-Assay etabliert. Durch das
Auswählen
der
entsprechenden
Kultivierungsbedingungen,
Inkubationszeiten
und
Wachstumskontrollen konnten reproduzierbare Ergebnisse erhalten werden. In Abbildung 5
ist ein Killing-Assay exemplarisch dargestellt. Es zeigt sich die konzentrationsabhängige
antimikrobielle Aktivität von LL-37 gegenüber Nocardia nova.
Abbildung 5 Killing-Assay: N.nova und LL-37 (exemplarisch)
N. nova ATCC 33726
1,00E+08
CFU/ml
1,00E+07
1,00E+06
1,00E+05
Kontrolle
1
8
16
32
64
LL-37 (µg/ml)
3.3 Antimikrobielle Aktivität humaner AMPs gegenüber
Nocardia-Spezies
Die Aktivität der humanen AMPs gegenüber den unterschiedlichen Nocardia-Spezies wurde
anhand des etablierten Killing-Assays untersucht. Levofloxacin diente als Positivkontrolle,
mit
welcher
die
antimikrobielle
Aktivität
der
AMPs
verglichen
wurde.
Als
Wachstumskontrollen dienten die entsprechenden Lösungsmittel der AMPs. Das Peptid DPY,
welches keine antimikrobielle Aktivität aufweist, wurde als zusätzliche Negativkontrolle
verwendet. Es ergaben sich spezies- und peptidspezifische Unterschiede.
Ergebnisse
3.3.1
27
Nocardia farcinica
Alle getesteten humanen AMPs zeigten eine konzentrationsabhängige antimikrobielle
Aktivität gegenüber Nocardia farcinica. Das humane β-Defensin hBD-3 zeigte die stärkste
Aktivität mit einer LD90 von 16 µg/ml. Das humane Cathelicidin LL-37 zeigte eine LD90 von
32 µg/ml. Die humanen α-Defensine HNP 1-3 zeigten im Vergleich eine geringere
antimikrobielle Aktivität. Konzentrationen von 32 µg/ml (höchste getestete Konzentration)
führten zu einem Killing von 82 %, die LD90 lag somit für HNP 1-3 über 32 µg/ml. Im
Konzentrationsbereich von 32 µg/ml zeigten die humanen AMPs eine stärkere (hBD-3),
vergleichbare (LL-37) sowie eine geringere (HNP 1-3) Aktivität im Vergleich zu
Levofloxacin (Abbildung 6).
Abbildung 6 Antimikrobielle Aktivität humaner AMPs gegenüber N. farcinica
N. farcinica ATCC 3318
100
80
60
CFU [%]
40
20
HNP 1-3
hBD-3
LL-37
0
Kontrolle
1
8
Levofloxacin
16
32
Konzentration [µg/ml]
3.3.2
Nocardia nova
Alle getesteten humanen AMPs zeigten eine konzentrationsabhängige antimikrobielle
Aktivität gegenüber Nocardia nova. Das humane β-Defensin hBD-3 zeigte die stärkste
Aktivität mit einer LD90 von 16 µg/ml. Die LD90 für das humane Cathelicidin LL-37 betrug 32
µg/ml. Für Levofloxacin zeigte sich bei einer Konzentration von 32 µg/ml (höchste getestete
Konzentration) ein Killing von 81 %, die LD90 lag dementsprechend über 32 µg/ml. LL-37
und hBD-3 zeigten somit eine stärkere antimikrobielle Aktivität gegenüber Nocardia nova als
Levofloxacin bei vergleichbaren Konzentrationen. Für die humanen α-Defensine HNP 1-3
Ergebnisse
28
fand sich eine LD90 von 64 µg/ml. Die Aktivität von HNP 1-3 gegenüber Nocardia nova war
mit der Aktivität von Levofloxacin vergleichbar (Abbildung 7).
Abbildung 7 Antimikrobielle Aktivität humaner AMPs gegenüber N. nova
N. nova ATCC 33726
100
80
60
CFU [%]
40
20
HNP 1-3
hBD-3
LL-37
Levofloxacin
0
Kontrolle
1
8
16
32
Konzentration [µg/ml]
64
Ergebnisse
3.3.3
Die
29
Nocardia asteroides
humanen
α-Defensine
HNP
1-3
zeigten
als
einzige
humane
AMPs
eine
konzentrationsabhängige antimikrobielle Aktivität gegenüber Nocardia asteroides. Die LD90
für HNP 1-3 betrug 32 µg/ml. HNP 1-3 zeigte eine geringere Aktivität als Levofloxacin bei
vergleichbaren Konzentrationen. Die humanen AMPs LL-37 und hBD-3 zeigten keine
antimikrobielle Aktivität (Abbildung 8).
Abbildung 8 Antimikrobielle Aktivität humaner AMPs gegenüber N. asteroides
N. asteroides ATCC 19247
100
80
60
CFU [%]
40
20
HNP 1-3
hBD-3
0
LL-37
Kontrolle
1
8
Konzentration [µg/ml]
Levofloxacin
32
64
Ergebnisse
3.3.4
30
Nocardia brasiliensis
Keines der getesteten humanen AMPs zeigte eine antimikrobielle Aktivität gegenüber
Nocardia brasiliensis in einem Konzentrationsbereich zwischen 1 und 64 µg/ml.
Levofloxacin zeigte eine LD90 von 32 µg/ml (Abbildung 9). Es fand sich ein stärkeres
Wachstum nach Peptidexposition im Vergleich zur Wachstumskontrolle. Im Gegensatz zur
Wachstumskontrolle wurde nach Inkubation mit DPY kein verstärktes Wachstum beobachtet.
Zusätzlich wurde untersucht, ob Nocardia brasiliensis durch Proteasensekretion in der Lage
ist, AMPs proteolytisch zu spalten und ihre Funktion somit zu beeinträchtigen. Hierzu wurde
ein Proteasen-Inhibitoren-Mix während der Inkubationsphase des Killing-Assays zugefügt.
Hierdurch konnte die Resistenz von Nocardia brasiliensis gegenüber den getesteten humanen
AMPs nicht aufgehoben werden. Das verstärkte Wachstum nach Peptidexposition blieb
bestehen. Darüber hinaus war auch nach alleiniger Inkubation mit dem Proteasen-InhibitorenMix verstärktes Wachstum zu beobachten. Der erweiterte Killing-Assay mit ProteasenInhibitoren-Mix wurde mit LL-37 und hBD-3 in einer Konzentration von 32 µg/ml
durchgeführt (Abbildung 10).
Abbildung 9 Antimikrobielle Aktivität humaner AMPs gegenüber N. brasiliensis
N. brasiliensis ATCC 19296
100
80
CFU [%]
60
40
20
HNP
hBD-3
0
Kontrolle
LL-37
1
8
32
Levofloxacin
16
Konzentration [µg/ml]
64
Ergebnisse
31
Abbildung 10 Modifizierter N. brasiliensis Killing-Assay unter Zugabe eines Proteasen-Inhibitoren-Mixes
N. brasiliensis ATCC 19296
700
600
500
400
CFU [%]
Protease Inhibitoren
300
LL-37 (32 µg/ml) + Protease Inhibitoren
LL-37 (32 µg/ml)
200
hBD-3 (32 µg/ml) + Protease Inhibitoren
hBD-3 (32 µg/ml)
100
DPY
0
3.3.5
Kontrolle
Additive Wirkung humaner AMPs
Zur Beurteilung synergistischer oder additiver Effekte von AMPs wurde exemplarisch die
Aktivität von LL-37 in Kombination mit HNP 1-3 gegenüber Nocardia farcinica untersucht.
Hierbei zeigten sich additive Aktivitäten beider Peptide. Die antimikrobielle Aktivität der
Kombination von LL-37 und HNP 1-3 war vergleichbar mit der Aktivität der einzelnen AMPs
bei doppelten Konzentrationen (Abbildung 11).
Abbildung 11 Additive Wirkung humaner AMPs gegenüber N. farcinica
µg
/m
l
16
µg
/m
l
je
32
H
N
P
+
LL
-3
7
LL
-3
7
32
H
N
P
LL
-3
7
+
H
N
P
µg
/m
l
µg
/m
l
je
16
8
µg
/m
l
µg
/m
l
LL
-3
7
16
je
+
LL
-3
7
LL
-3
7
H
N
P
H
N
P
4
µg
/m
l
8
µg
/m
l
8
µg
/m
l
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
H
N
P
CFU [%]
N. farcinica ATCC 3318
Ergebnisse
32
3.4 Antimikrobielle Aktivität boviner AMPs gegenüber NocardiaSpezies
Die Aktivität von drei unterschiedlichen bovinen AMPs wurde ebenfalls anhand des
etablierten Killing-Assays untersucht. Hierbei ergaben sich spezies- und peptidspezifische
Unterschiede. Das neutrophile Rinderpeptid Indolicidin zeigte eine antimikrobielle Aktivität
gegenüber allen getesteten Nocardia-Spezies.
3.4.1
Nocardia farcinica
Alle getesteten bovinen AMPs zeigten eine konzentrationsabhängige antimikrobielle Aktivität
gegenüber Nocardia farcinica. Das bovine β-Defensin LAP zeigte die stärkste Aktivität mit
einer LD90 von 16 µg/ml. Für das neutrophile Indolicidin und das bovine β-Defensin TAP
zeigte sich eine LD90 von 32 µg/ml (Abbildung 12). Verglichen mit Levofloxacin waren alle
bovinen AMPs bei einer Konzentration von 32 µg/ml ähnlich aktiv (TAP) oder aktiver
(vollständiges Killing für Indolicidin und LAP).
Abbildung 12 Antimikrobielle Aktivität boviner AMPs gegenüber N. farcinica
N. farcinica ATCC 3318
100
80
60
CFU [%]
40
20
TAP
LAP
0
Indolicidin
Kontrolle
1
8
Levofloxacin
16
Konzentration [µg/ml]
32
Ergebnisse
3.4.2
33
Nocardia nova
Es wurde ausschließlich die Aktivität von Indolicidin gegenüber Nocardia nova bestimmt.
Hier zeigte sich eine starke und konzentrationsabhängige Aktivität mit einer LD90 von 8
µg/ml. Indolicidin zeigte eine größere Aktivität als Levofloxacin bei vergleichbaren
Konzentrationen (Abbildung 13).
Abbildung 13 Antimikrobielle Aktivität von Indolicidin gegenüber N. nova
N. nova ATCC 33726
100
80
60
CFU [%]
40
20
0
Kontrolle
Indolicidin
1
8
16
Levofloxacin
32
Konzentration [µg/ml]
64
Ergebnisse
3.4.3
34
Nocardia asteroides
Indolicidin zeigte gegenüber Nocardia asteroides eine konzentrationsabhängige Aktivität mit
einer LD90 von 64 µg/ml. Die Aktivität des Indolicidins lag unterhalb derjenigen von
Levofloxacin (Abbildung 14).
Abbildung 14 Antimikrobielle Aktivität von Indolicidin gegenüber N. asteroides
N. asteroides ATCC 19247
100
80
60
CFU [%]
40
20
0
Kontrolle
Indolicidin
1
8
16
Konzentration [µg/ml]
Levofloxacin
32
64
Ergebnisse
3.4.4
35
Nocardia brasiliensis
Das bovine Indolicidin zeigte als einziges AMP eine konzentrationsabhängige antimikrobielle
Aktivität gegenüber Nocardia brasiliensis. Die LD90 für Indolicidin betrug 64 µg/ml.
Indolicidin
zeigte
eine
geringere
Aktivität
als
Levofloxacin
bei
vergleichbaren
Konzentrationen. Nocardia brasiliensis war resistent gegenüber den bovinen β-Defensinen
LAP und TAP (Abbildung 15). Hier zeigte sich, wie bei den humanen AMPs, ein deutlich
stärkeres Wachstum nach Peptidexposition im Vergleich zur Wachstumskontrolle.
Abbildung 15 Antimikrobielle Aktivität boviner AMPs gegenüber N. brasiliensis
N. brasiliensis ATCC 19296
100
80
60
CFU [%]
40
20
TAP
LA P
Indo licidin
0
Kont rolle
1
8
Levo flo xacin
16
32
Konzentration [µg/m l]
64
Ergebnisse
36
3.5 Zusammenfassung der Ergebnisse
Für die vier untersuchten Nocardia-Spezies wurden Unterschiede sowohl in ihrem
Wachstumsverhalten,
als
auch
in
der
Empfindlichkeit
gegenüber
den
getesteten
antimikrobiellen Substanzen festgestellt. Levofloxacin wurde im Killing-Assay als
Positivkontrolle benutzt, um die antimikrobielle Aktivität der AMPs vergleichen zu können,
und war gegenüber allen vier Nocardia-Spezies aktiv. Das Peptid DPY, welches keine
antimikrobielle Aktivität aufweist, wurde als zusätzliche Negativkontrolle eingesetzt und
zeigte keinen Einfluss auf das Wachstum.
Nocardia farcinica und Nocardia nova waren gegenüber allen getesteten AMPs empfindlich.
Die antimikrobiellen Aktivitäten der AMPs waren vergleichbar mit Levofloxacin und
übertrafen dessen Aktivität teilweise. Gegenüber Nocardia asteroides zeigten nur die
neutrophilen AMPs (das humane HNP 1-3 und das bovine Indolicidin) eine antimikrobielle
Aktivität, welche unterhalb derjenigen von Levofloxacin lag. Nocardia brasiliensis war
gegenüber allen getesteten humanen AMPs resistent. Nach Peptidexposition konnte ein
verstärktes Wachstum beobachtet werden. Die Zugabe eines Proteasen-Inhibitoren-Mixes bei
der Testung von Nocardia brasiliensis führte zu keinen abweichenden Ergebnissen. Das
bovine Indolicidin zeigte als einziges der getesteten Peptide eine Aktivität gegenüber
Nocardia brasiliensis, welche leicht unterhalb der Aktivität des Levofloxacins lag. Eine
additive Wirkung der humanen AMPs HNP 1-3 und LL-37 konnte exemplarisch in einem
Killing-Assay gegenüber N. farcinica gezeigt werden. In Tabelle 10 sind abschließend die
Ergebnisse zusammenfassend dargestellt.
Tabelle 10 Zusammenfassung der Ergebnisse
Spezies
Nocardia
farcinica
Nocardia
nova
Nocardia
asteroides
Nocardia
brasiliensis
LD90 [µg/ml]
LL-37
hBD-3
Indolicidin
Levofloxacin
HNP 1-3
8
> 32
32
16
32
> 32
64
32
16
8
8
32
> 64
> 64
64
32
> 64
> 64
> 64
64
LAP
TAP
16
32
nicht
getestet
nicht
getestet
nicht
getestet
nicht
getestet
> 64
> 64
Diskussion
37
4 Diskussion
___________________________________________________________________________
AMPs sind Effektormoleküle des angeborenen Immunsystems und stellen als erste
Abwehrbarriere gegenüber Krankheitserregern eine wichtige Komponente dieses Systems dar.
Es sind heute zahlreiche dieser Peptide bekannt, welche aufgrund ihrer vielfältigen
Eigenschaften
als
eine
interessante
neue
Substanzklasse
zur
Bekämpfung
von
Infektionserkrankungen angesehen werden. Obwohl ihr genauer Wirkungsmechanismus bis
heute nicht vollständig verstanden ist, geht man davon aus, dass AMPs ihre antimikrobielle
Wirkung durch Membraninteraktion entfalten. Für einzelne Peptide sind jedoch auch
intrazelluläre Wirkmechanismen beschrieben. Die Entwicklung von AMPs für den klinischen
Einsatz ist Gegenstand aktueller Forschung. Sie könnte dazu beitragen, Infektionskrankheiten
effektiver zu bekämpfen und die wachsende Bedrohung von multiresistenten Erregern
einzudämmen. Trotz intensiver Forschung auf dem Gebiet der AMPs stellt sich eine klinische
Anwendung bis zum heutigen Zeitpunkt als schwierig dar.
4.1 Aktivität humaner AMPs gegenüber verschiedenen NocardiaSpezies
In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals die antimikrobielle Aktivität humaner AMPs
gegenüber verschiedenen Nocardia-Spezies untersucht. Hierbei zeigten sich unterschiedliche
Aktivitäten von epithelialen und neutrophilen AMPs gegenüber den vier getesteten NocardiaSpezies. Nocardia farcinica und Nocardia nova waren gegenüber allen getesteten AMPs
empfindlich. Nocardia asteroides war ausschließlich gegenüber den humanen α-Defensinen
HNP 1-3 sensibel, welche von neutrophilen Granulozyten produziert werden. Nocardia
brasiliensis zeigte sich gegenüber allen getesteten humanen AMPs resistent.
Die Pathogenese der Nocardiose war bereits in der Vergangenheit Gegenstand intensiver
Forschung (Beaman, B. L. und Beaman, L. 1994). Ein besonderes Augenmerk lag hierbei auf
der Interaktion zwischen Krankheitserreger und Wirt. Die Manifestation und die Schwere der
Nocardiose werden einerseits von der Eintrittspforte, dem Inokulum, der Wachstumsphase
und der Virulenz des Erregers, sowie andererseits von der Immunantwort des Wirtes
beeinflusst. Das angeborene Immunsystem scheint eine bedeutende Rolle während der
Frühphase der Infektion zu spielen. So kommt es während dieser Phase hauptsächlich zur
Akkumulation von neutrophilen Granulozyten und Makrophagen, welche für den weiteren
Infektionsverlauf wichtig zu sein scheint. Aus histopathologischen Befunden humaner
Diskussion
38
Nocardiosen sowie aus Mausmodellen ist bekannt, dass in der Infektionsfrühphase
charakteristischerweise ein neutrophiles Infiltrat gefunden wird, auf welches im weiteren
Infektionsverlauf ein mononukleäres Infiltrat folgt (Ellis, T. N. und Beaman, B. L. 2002,
Filice, G. A. und Niewoehner, D. E. 1987). Obwohl diese Reaktion allein eine Infektion
wahrscheinlich nicht verhindern kann, wird angenommen, dass sie den Infektionsverlauf
abschwächt und die Zeit bis zur Aktivierung des spezifischen Immunsystems überbrückt
(Deem, R. L. et al. 1982, Deem, R. L. et al. 1983, Filice, G. A. und Niewoehner, D. E. 1987).
Durch Inhibition von neutrophilen Granulozyten und Monozyten wurde bei einer Infektion
mit Nocardia asteroides im Mausmodell ein stärkeres Nocardienwachstum sowie ein
schwerer klinischer Verlauf beobachtet (Filice, G. A. und Niewoehner, D. E. 1987). Einer der
unterschiedlichen Effektormechanismen von neutrophilen Granulozyten, die dem Abtöten von
Krankheitserregern dienen, ist die Produktion von AMPs. Darüber hinaus werden AMPs von
anderen Effektorzellen des angeborenen Immunsystems produziert, von welchen ebenfalls
angenommen wird, dass sie eine Rolle bei der Abwehr von Nocardien spielen. So konnten
LL-37 und HNP 1-3 in Monozyten/Makrophagen, natürlichen Killerzellen und TLymphozyten nachgewiesen werden (Agerberth, B. et al. 2000). Im Rahmen der vorliegenden
Arbeit konnte gezeigt werden, dass die humanen neutrophilen AMPs (HNP 1-3) ein breiteres
Aktivitätsspektrum als die humanen epithelialen AMPs gegenüber Nocardien besitzen. Die in
mehreren Publikationen geäußerten Vermutungen, dass neutrophile Granulozyten im Rahmen
der Abwehr einer Nocardien-Infektion eine wichtige Rolle spielen, konnten somit durch die
vorliegende Arbeit gestützt werden.
Verschiedene Virulenzfaktoren von Nocardien wurden beschrieben. So zeichnen sich
Nocardien unter anderem durch eine Lysozymresistenz und durch die Fähigkeit der Hemmung
der Phagosom-Lysosom-Fusion aus (Davis-Scibienski, C. und Beaman, B. L. 1980). Am
besten untersucht wurden diese Mechanismen bei Nocardia asteroides. Es konnte gezeigt
werden, dass Nocardia asteroides in der Lage ist, wichtige Schritte der Phagozytose zu
beeinflussen, um somit der Immunabwehr zu entgehen. Die Expression von Katalase und
Superoxid-Dismutase ermöglicht es Nocardia asteroides den oxidativen Stress, ausgeübt von
Abwehrzellen, wie neutrophilen Granulozyten, abzuschwächen (Beaman, B. L. und Beaman,
L. 1994, Filice, G. A. et al. 1980). Die Produktion von HNP 1-3 gehört zu den nichtoxidativen Effektormechanismen der neutrophilen Granulozyten. Filice und Mitarbeiter
beobachteten bereits 1985, dass kationische Proteine aus den Granula von neutrophilen
Granulozyten (welche HNP 1-3 beinhalten) das Wachstum und die Verzweigung von
Diskussion
39
Nocardia asteroides hemmen (Filice, G. A. 1985). Durch die vorliegende Arbeit konnte
erstmals
die
Empfindlichkeit
von
Nocardien
gegenüber
dieser
spezifischen
Abwehrkomponente der neutrophilen Granulozyten gezeigt werden.
Die humanen α-Defensine HNP 1-3 werden als aktive Peptide in den primären (azurophilen)
Granula der neutrophilen Granulozyten gespeichert und erreichen dort Konzentrationen von
bis zu 10 mg/ml (Ganz, T. 1987, Hancock, R. E. 2001). In der vorliegenden Arbeit lagen
antimikrobiell aktive Konzentrationen für HNP 1-3 gegenüber Nocardia asteroides, Nocardia
farcinica und Nocardia nova im Bereich von 32 und 64 µg/ml. Da diese Konzentrationen in
vivo erreicht bzw. um ein Vielfaches übertroffen werden, ist davon auszugehen, dass HNP 1-3
eine Rolle bei der Erregerabwehr während der Infektionsfrühphase der Nocardiose spielt.
Darüber hinaus wirkt HNP 1-3 chemotaktisch auf T-Zellen und Monozyten (Bals, R. 2000a),
welche ebenfalls bei der Abwehr gegenüber Nocardien relevant sind.
Das humane Cathelicidin wird hingegen zunächst als inaktives Peptid hCAP-18 in den
sekundären (spezifischen) Granula der neutrophilen Granulozyten gebildet und gespeichert.
Nach Sekretion in den extrazellulären Raum wird es durch Proteinase 3 in die antimikrobiell
aktive Form LL-37 überführt. Vergleichbar mit dem humanen β-Defensin hBD-3, kann die
Produktion von LL-37 auch in Epithelzellen des Respirations- und Gastrointestinaltraktes und
in
Keratinozyten
induziert
werden.
LL-37
kann
auf
Körperoberflächen
Konzentrationsbereiche zwischen 1-5 µg/ml erreichen (Bals, R. und Wilson, J. M. 2003). Die
humanen β-Defensine erreichen dort Konzentrationen zwischen 0,3-8 µg/ml (Ghosh, S. K. et
al. 2007, Hancock, R. E. 2001). In der vorliegenden Arbeit lagen antimikrobiell aktive
Konzentrationen für hBD-3 und LL-37 gegenüber Nocardia farcinica und Nocardia nova im
Bereich von 16 und 32 µg/ml und somit oberhalb des in vivo vorherrschenden
Konzentrationsbereiches. Es ist daher anzunehmen, dass LL-37 und hBD-3 in vivo nicht dazu
in der Lage sind, eine Infektion durch Nocardia farcinica und Nocardia nova direkt
abzuwehren. Dennoch können die humanen AMPs hBD-3 und LL-37 indirekt durch ihre
Fähigkeit der Immunmodulation (Yang, D. et al. 2002) an der Abwehr von Nocardien beteiligt
sein. LL-37 wirkt chemotaktisch auf Monozyten, T-Zellen und neutrophile Granulozyten (De,
Yang et al. 2000). Das humane β-Defensin hBD-3 wirkt chemotaktisch auf Monozyten
(Funderburg, N. et al. 2007). Alle genannten Abwehrzellen spielen eine wichtige Rolle bei der
zellulären Abwehr gegenüber Bakterien der Gattung Nocardia. Darüber hinaus ist eine
additive oder synergistische Wirkung von AMPs denkbar. Hinweise hierfür ergaben sich in
Diskussion
40
einem exemplarischen Assay, in welchem die additive Aktivität von LL-37 und HNP 1-3
gegenüber Nocardia farcinica gezeigt werden konnte.
Wirksame Konzentrationen der genannten AMPs könnten durch externe Zufuhr im Rahmen
von therapeutischen Applikationen erreicht werden. Die ausgeprägte Empfindlichkeit von
Nocardia farcinica stellt in diesem Zusammenhang eine interessante Tatsache dar, da diese
Nocardia-Spezies ein großes Potential zur Dissemination (Schaal, K. P. und Lee, H. J. 1992)
sowie eine hohe Antibiotikaresistenz aufweist (Moylett, E. H. et al. 2003, Wallace, R. J., Jr. et
al. 1990). Die Entwicklung von AMPs als zusätzliche Therapieoption gegenüber Nocardia
farcinica wäre somit besonders interessant.
Nocardia brasiliensis zeigte sich als einzige der getesteten Nocardia-Spezies gegenüber allen
untersuchten humanen AMPs resistent und unterschied sich somit maßgeblich von den
anderen getesteten Nocardia-Spezies. Interessanterweise zeichnet sich Nocardia brasiliensis
durch besondere Eigenschaften aus. So unterscheidet sich Nocardia brasiliensis unter
anderem in seiner klinischen Manifestation mit überwiegend kutanen und lymphokutanen
Infektionen bei immunkompetenten Patienten (Beaman, B. L. und Beaman, L. 1994, Maraki,
S. et al. 2004, Satterwhite, T. K. und Wallace, R. J., Jr. 1979). Die Inaktivität der epithelialen
humanen AMPs hBD-3 und LL-37 ist somit gut in Einklang mit der bevorzugten
Hautmanifestation von Nocardia brasiliensis beim Menschen zu bringen.
Aufgrund der schwierigen routinemäßigen Differenzierung von Nocardia asteroides,
Nocardia farcinica und Nocardia nova werden diese Nocardia-Spezies oft auch als „Nocardia
asteroides Komplex“ zusammengefasst (Wallace, R. J., Jr. et al. 1991), welcher ein sehr
heterogenes Cluster darstellt. Demgegenüber gilt Nocardia brasiliensis als äußerst homogenes
Cluster. Die verschiedenen Spezies der Gattung Nocardia wurden zudem maßgeblich anhand
unterschiedlicher Empfindlichkeitsmuster gegenüber konventionellen Antibiotika eingeteilt.
Auch hierbei zeigten sich spezifische Erkennungskriterien für Nocardia brasiliensis (Wallace,
R. J., Jr. et al. 1988). Anhand der in der vorliegenden Arbeit erhobenen Befunde zeigt sich
somit, dass sich Nocardia brasiliensis auch im Verhalten gegenüber AMPs deutlich von
anderen Nocardia-Spezies unterscheidet.
Da AMPs ihre Wirkung hauptsächlich durch Membraninteraktion entfalten, könnte die
Ursache für die Resistenz von Nocardia brasiliensis gegenüber humanen AMPs im
Zellwandaufbau liegen. Der Aufbau der Zellwand von Nocardien ist komplex, ändert sich
während des Wachstumszyklus und scheint einen Einfluss auf die Virulenz der Nocardien zu
Diskussion
41
haben (Beaman, B. L. und Beaman, L. 1994). Wichtige Bestandteile der Nocardienzellwand
sind Peptidoglykane, Mykolsäuren, Arabinose, Galaktose und spezielle Fettsäuren (Beaman,
B. L. und Beaman, L. 1994, Salinas-Carmona, M. C. 2000). Beadles und Mitarbeiter
beobachteten auch unabhängig vom gegenwärtigen Wachstumszyklus eine unterschiedliche
Zellwanddicke und einen unterschiedlichen Peptidoglykangehalt bei verschiedenen NocardiaSpezies (Beadles, T. A. et al. 1980). Es konnte gezeigt werden, dass sich Nocardia-Spezies
mit einer dickeren Zellwand als virulenter erweisen als Nocardia-Spezies mit dünnerer
Zellwand (Beaman, B. L. 1973). Außerdem wurde vermutet, dass die Eigenschaft der
Lysozymresistenz von Nocardien mit einer großen Zellwanddicke und einem hohen
Petidoglykangehalt der Zellwand zusammenhängen könnte (Beadles, T. A. et al. 1980). Eine
mögliche Erklärung für die Resistenz von Nocardia brasiliensis gegenüber unterschiedlichen
humanen AMPs könnte somit im Zellwandaufbau dieser Nocardia-Spezies liegen.
Nocardia brasiliensis zeichnet sich im Gegensatz zu den anderen untersuchten NocardiaSpezies durch eine erhöhte Proteasensekretion aus (Brown-Elliott, B. A. et al. 2006, SalinasCarmona, M. C. 2000, Zlotnik, H. et al. 1984). Die proteolytische Spaltung von AMPs könnte
eine weitere Ursache für die Resistenz von Nocardia brasiliensis gegenüber humanen AMPs
darstellen. Zur weiteren Untersuchung dieser Hypothese wurde einigen Killing-Assays ein
Proteasen-Inhibitoren-Mix zugefügt. Diese Variation der Killing-Assays ergab jedoch keine
Hinweise auf einen möglichen Zusammenhang zwischen Proteasensekretion und dem
Resistenzverhalten von Nocardia brasiliensis gegenüber humanen AMPs. Weitere
Mechanismen, wie das Vorhandensein von Effluxpumpen, sind für eine Resistenz gegenüber
AMPs denkbar.
AMPs weisen ein sehr breites Erregerspektrum auf. Dennoch sind Pathogene beschrieben
worden, die eine natürliche Resistenz gegenüber AMPs zu besitzen scheinen. So sind
Burkholderia capacia und Serratia marcescens vermutlich aufgrund eines speziellen
Zellmembranaufbaus und einer ausgeprägten Proteasensekretion resistent gegenüber allen
bisher untersuchten AMPs (Baird, R. M. et al. 1999, Hancock, R. E. 1997, Sahly, H. et al.
2003, Turner, J. et al. 1998). Bessere Kenntnisse über Eigenschaften, wie Zellwandaufbau und
Zellwandladung von Nocardia brasiliensis sind notwendig, um das Resistenzverhalten
gegenüber humanen AMPs erklären zu können.
Neben dem Resistenzverhalten von Nocardia brasiliensis gegenüber humanen AMPs wurde
ein weiteres Phänomen beobachtet. Nach Peptidexposition fand sich ein signifikant stärkeres
Wachstum im Vergleich zur Wachstumskontrolle. Ein stärkeres Wachstum wurde auch unter
Diskussion
42
Anwendung des Proteasen-Inhibitoren-Mixes beobachtet. Eine Erklärung für diese
Beobachtung könnte sein, dass Nocardia brasiliensis in der Lage ist, Peptide bzw. Proteine zu
metabolisieren. Nach Inkubation mit dem antimikrobiell inaktiven Peptid DPY zeigte sich
jedoch kein verstärktes Wachstum. Dies spricht gegen eine mögliche Metabolisierung von
Peptiden.
4.2 Aktivität boviner AMPs gegenüber verschiedenen NocardiaSpezies
Alle getesteten bovinen AMPs zeigten eine starke Aktivität gegenüber Nocardia farcinica und
Nocardia nova. Die Empfindlichkeit dieser beiden Nocardia-Spezies gegenüber AMPs konnte
somit bei der Testung der bovinen Peptide bestätigt werden. Weiterhin fand sich eine starke
antimikrobielle Aktivität von Indolicidin gegenüber Nocardia asteroides, welche mit der
Aktivität der humanen α-Defensine HNP 1-3 vergleichbar war. Die Empfindlichkeit von
Nocardia asteroides gegenüber neutrophilen AMPs konnte somit ebenfalls bestätigt werden.
Indolicidin zeigte zudem eine Aktivität gegenüber Nocardia brasiliensis, welche leicht
unterhalb derjenigen des Levofloxacins lag. Indolicidin war somit gegenüber allen getesteten
Nocardia-Spezies aktiv und stellte das einzige wirksame AMP gegenüber Nocardia
brasiliensis dar. Gegenüber den bovinen β-Defensinen LAP und TAP erwies sich Nocardia
brasiliensis als resistent. Vergleichbar mit den humanen AMPs konnte hier ebenfalls ein
verstärktes Wachstum nach Peptidexposition beobachtet werden.
Die bovine Nocardiose manifestiert sich überwiegend als Mastitis (Beaman, B. L. und
Beaman, L. 1994). Eine Infektion erfolgt in der Regel durch direkte Inokulation unter
schlechten hygienischen Bedingungen in der Natur, beim Melken oder im Rahmen von
invasiven Behandlungen (Ribeiro, M. G. et al. 2008). In einer Studie, welche 5216 an Mastitis
erkrankte Rinder umfasste, zeigten sich in 6,6 % aller Fälle Nocardien als ursächliche Erreger
(Ribeiro, M. G. et al. 2008). Nocardia asteroides gilt als häufigster Erreger der bovinen
Nocardiose (Beaman, B. L. und Beaman, L. 1994). Es konnten jedoch auch andere NocardiaSpezies, wie Nocadia farcinica und Nocardia nova, als Erreger isoliert werden (Ribeiro, M.
G. et al. 2008). Das angeborene Immunsystem spielt eine wichtige Rolle während der
Infektionsfrühphase der Mastitis. Diese wird maßgeblich von neutrophilen Granulozyten,
Makrophagen und in geringem Ausmaß von Epithelzellen bestimmt (Sordillo, L. M. et al.
1997). Die somatische Zellzahl (SCC) der genannten Abwehrzellen in der Milch gilt als
wichtiger Indikator für die Aktivität des angeborenen Immunsystems der bovinen Brustdrüse
Diskussion
43
und ist bei der Milchhygiene von Bedeutung (Sarikaya, H. und Bruckmaier, R. M. 2006). Es
konnte gezeigt werden, dass die Schwere und Dauer einer Mastitis maßgeblich von der
somatischen Zellzahl bestimmt wird (Grommers, F. J. et al. 1989). Eine geringe SCC ist mit
einem erhöhten Risiko für einen schweren Verlauf einer Mastitis assoziiert (Suriyasathaporn,
W. et al. 2000).
Es wird angenommen, dass die Produktion von AMPs eine wichtige Rolle im Rahmen der
Immunantwort der bovinen Mastitis spielt (Sordillo, L. M. et al. 1997, Swanson, K. et al.
2004). Indolicidin konnte bei der bovinen Mastitis in der Milch nachgewiesen werden
(Boehmer, J. L. et al. 2008). Die Produktion von LAP und TAP in Epithelzellen der bovinen
Brustdrüse ist in diesem Zusammenhang ebenfalls beschrieben (Lopez-Meza, J. E. et al. 2009,
Roosen, S. et al. 2004, Swanson, K. et al. 2004). In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals
die Aktivität von verschiedenen bovinen AMPs gegenüber Erregern der bovinen Nocardiose
gezeigt werden. Das breite Aktivitätsspektrum von Indolicidin, welches von neutrophilen
Granulozyten produziert wird, ist gut mit der bedeutenden Rolle dieser Abwehrzellen
während der Infektionsfrühphase einer Mastitis in Einklang zu bringen.
Indolicidin unterscheidet sich in mehrerlei Hinsicht von den anderen getesteten AMPs. Mit
einer Sequenz von 13 Aminosäuren gilt Indolicidin als das kürzeste AMP unter allen bisher
beschriebenen AMPs. Indolicidin besitzt einen hohen Anteil der Aminosäuren Tryptophan
und Prolin und gilt als das tryptophanreichste Protein überhaupt (Falla, T. J. et al. 1996,
Selsted, M. E. et al. 1992). Indolicidin zeichnet sich zudem durch seine antimikrobiellen
Wirkmechanismen aus. Neben der Fähigkeit zur Permeabilisierung von Bakterienmembranen
(Falla, T. J. et al. 1996) besitzt Indolicidin intrazelluläre Wirkmechanismen. Es wird davon
ausgegangen, dass Indolicdin in einem bestimmten Konzentrationsbereich, welcher nicht
ausreichend für eine vollständige Zelllyse ist, in den intrazellulären Raum vordringen kann
und dort seine Wirkung durch DNA-, RNA- und Proteinsynthese-Hemmung entfalten kann
(Hsu, C. H. et al. 2005, Subbalakshmi, C. und Sitaram, N. 1998). Weitere Untersuchungen
sind notwendig, um zu klären, ob eine Aktivität von Indolicidin gegenüber Nocardia
brasiliensis durch diese Eigenschaften erklärt werden kann.
Zusammenfassung
44
5 Zusammenfassung
__________________________________________________________________________
Nocardien
sind
Gram-positive
Bakterien,
welche
zumeist
als
opportunistische
Krankheitserreger pulmonale, disseminierte und kutane Infektionen bei Menschen und Tieren
verursachen. Das angeborene Immunsystem bildet eine erste Schutzbarriere gegenüber
eindringenden Krankheitserregern. Antimikrobielle Peptide (AMPs) werden von Leukozyten
und Epithelzellen der Haut und der Schleimhäute produziert und stellen einen integralen
Bestandteil dieses Systems dar.
In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals die Aktivität unterschiedlicher AMPs gegenüber
verschiedenen Nocardia-Spezies untersucht. Hiermit sollte die Bedeutung von AMPs im
Rahmen der Nocardiose näher beurteilt werden. Die Empfindlichkeit gegenüber den
getesteten AMPs variierte zwischen den verschiedenen Nocardia-Spezies. Nocardia farcinica
und Nocardia nova waren gegenüber allen getesteten AMPs, Nocardia asteroides hingegen
nur gegenüber den neutrophilen AMPs (HNP 1-3 und Indolicidin) empfindlich. Nocardia
brasiliensis zeigte sich resistent gegenüber allen getesteten humanen AMPs und war
ausschließlich gegenüber Indolicidin sensibel.
Neutrophile AMPs zeigten im Vergleich zu den epithelialen AMPs ein breiteres
Aktivitätsspektrum. Antimikrobiell aktive Konzentrationen lagen für HNP 1-3 in Bereichen,
die in vivo erreicht werden. Diese Ergebnisse unterstützen die bereits in mehreren
Publikationen geäußerten Vermutungen, dass neutrophile Granulozyten eine wichtige Rolle
im Rahmen der Immunantwort gegenüber Nocardien spielen.
Antimikrobiell aktive Konzentrationen der überwiegend epithelial-exprimierten AMPs hBD-3
und LL-37 lagen unterhalb der in vivo vorherrschenden Konzentrationsbereichen. Eine
Bedeutung dieser Peptide ist jedoch durch synergistische Effekte in vivo denkbar. Hinweise
hiefür ergaben sich in der vorliegenden Arbeit durch die additive Testung zweier AMPs
gegenüber Nocardia farcinica.
Die beobachtete Resistenz von Nocardia brasiliensis gegenüber epithelialen AMPs ist gut in
Einklang mit der bevorzugten Hautmanifestation dieser Spezies zu bringen. Da AMPs ihre
Wirkung maßgeblich durch Membraninteraktion entfalten, ist ein spezieller Zellwandaufbau
von Nocardia brasilienis als Ursache für die Resistenz gegenüber den getesteten AMPs
denkbar. Die Aktivität von Indolicidin gegenüber Nocardia brasiliensis ist möglicherweise
durch den besonderen Aufbau und Wirkmechanismus dieses Peptides zu erklären.
Literaturverzeichnis
45
6 Literaturverzeichnis
___________________________________________________________________________
Abdel-Hadi, A.H. and Cardenete Aljama, M.A. (2007) Severe sepsis induced by Nocardia
asteroides in a patient with prolonged corticosteroid treatment. Med.Intensiva. 31:411-412.
Agerberth, B., Charo, J., Werr, J., Olsson, B., Idali, F., Lindbom, L., Kiessling, R.,
Jornvall, H., Wigzell, H., and Gudmundsson, G.H. (2000) The human antimicrobial and
chemotactic peptides LL-37 and alpha-defensins are expressed by specific lymphocyte and
monocyte populations. Blood 96:3086-3093.
Ali, R.S., Falconer, A., Ikram, M., Bissett, C.E., Cerio, R., and Quinn, A.G. (2001)
Expression of the peptide antibiotics human beta defensin-1 and human beta defensin-2 in
normal human skin. J.Invest Dermatol. 117:106-111.
Baird, R.M., Brown, H., Smith, A.W., and Watson, M.L. (1999) Burkholderia cepacia is
resistant to the antimicrobial activity of airway epithelial cells. Immunopharmacology 44:267272.
Bals, R. (2000b) Antimicrobial peptides and peptide antibiotics. Med.Klin.(Munich) 95:496502.
Bals, R. (2000a) Epithelial antimicrobial peptides in host defense against infection.
Respir.Res. 1:141-150.
Bals, R. and Wilson, J.M. (2003) Cathelicidins--a family of multifunctional antimicrobial
peptides. Cell Mol.Life Sci. 60:711-720.
Beadles, T.A., Land, G.A., and Knezek, D.J. (1980) An ultrastructural comparison of the
cell envelopes of selected strains of Nocardia asteroides and Nocardia brasiliensis.
Mycopathologia 70:25-32.
Beaman, B.L. (1973) An ultrastructural analysis of Nocardia during experimental infections
in mice. Infect.Immun. 8:828-840.
Beaman, B.L. and Beaman, L. (1994) Nocardia species: host-parasite relationships.
Clin.Microbiol.Rev. 7:213-264.
Literaturverzeichnis
46
Beaman, B.L., Burnside, J., Edwards, B., and Causey, W. (1976) Nocardial infections in
the United States, 1972-1974. J.Infect.Dis. 134:286-289.
Boehmer, J.L., Bannerman, D.D., Shefcheck, K., and Ward, J.L. (2008) Proteomic
analysis of differentially expressed proteins in bovine milk during experimentally induced
Escherichia coli mastitis. J.Dairy Sci. 91:4206-4218.
Boiron, P., Provost, F., Chevrier, G., and Dupont, B. (1992) Review of nocardial infections
in France 1987 to 1990. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. 11:709-714.
Boman, H.G. (1995) Peptide antibiotics and their role in innate immunity.
Annu.Rev.Immunol. 13:61-92.
Brogden, K.A. (2005) Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in
bacteria? Nat.Rev.Microbiol. 3:238-250.
Brown-Elliott, B.A., Brown, J.M., Conville, P.S., and Wallace, R.J., Jr. (2006) Clinical
and laboratory features of the Nocardia spp. based on current molecular taxonomy.
Clin.Microbiol.Rev. 19:259-282.
Brown-Elliott, B.A., Ward, S.C., Crist, C.J., Mann, L.B., Wilson, R.W., and Wallace,
R.J., Jr. (2001) In vitro activities of linezolid against multiple Nocardia species.
Antimicrob.Agents Chemother. 45:1295-1297.
Cassar, C.L. (2007) Nocardia sepsis in a multigravida with systemic lupus erythematosus and
autoimmune hepatitis. Anaesth.Intensive Care 35:601-604.
Davis-Scibienski, C. and Beaman, B.L. (1980) Interaction of alveolar macrophages with
Nocardia asteroides: immunological enhancement of phagocytosis, phagosome-lysosome
fusion, and microbicidal activity. Infect.Immun. 30:578-587.
De, Y., Chen, Q., Schmidt, A.P., Anderson, G.M., Wang, J.M., Wooters, J., Oppenheim,
J.J., and Chertov, O. (2000) LL-37, the neutrophil granule- and epithelial cell-derived
cathelicidin, utilizes formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) as a receptor to chemoattract
human peripheral blood neutrophils, monocytes, and T cells. J.Exp.Med. 192:1069-1074.
Deem, R.L., Beaman, B.L., and Gershwin, M.E. (1982) Adoptive transfer of immunity to
Nocardia asteroides in nude mice. Infect.Immun. 38:914-920.
Literaturverzeichnis
47
Deem, R.L., Doughty, F.A., and Beaman, B.L. (1983) Immunologically specific direct T
lymphocyte-mediated killing of Nocardia asteroides. J.Immunol. 130:2401-2406.
Diamond, G., Russell, J.P., and Bevins, C.L. (1996) Inducible expression of an antibiotic
peptide gene in lipopolysaccharide-challenged tracheal epithelial cells.
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 93:5156-5160.
Diamond, G., Zasloff, M., Eck, H., Brasseur, M., Maloy, W.L., and Bevins, C.L. (1991)
Tracheal antimicrobial peptide, a cysteine-rich peptide from mammalian tracheal mucosa:
peptide isolation and cloning of a cDNA. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 88:3952-3956.
Ellis, T.N. and Beaman, B.L. (2002) Murine polymorphonuclear neutrophils produce
interferon-gamma in response to pulmonary infection with Nocardia asteroides.
J.Leukoc.Biol. 72:373-381.
Falla, T.J., Karunaratne, D.N., and Hancock, R.E. (1996) Mode of action of the
antimicrobial peptide indolicidin. J.Biol.Chem. 271:19298-19303.
Filice, G.A. (1985) Inhibition of Nocardia asteroides by neutrophils. J.Infect.Dis. 151:47-56.
Filice, G.A., Beaman, B.L., Krick, J.A., and Remington, J.S. (1980) Effects of human
neutrophils and monocytes on Nocardia asteroides: failure of killing despite occurrence of the
oxidative metabolic burst. J.Infect.Dis. 142:432-438.
Filice, G.A. and Niewoehner, D.E. (1987) Contribution of neutrophils and cell-mediated
immunity to control of Nocardia asteroides in murine lungs. J.Infect.Dis. 156:113-121.
Funderburg, N., Lederman, M.M., Feng, Z., Drage, M.G., Jadlowsky, J., Harding, C.V.,
Weinberg, A., and Sieg, S.F. (2007) Human -defensin-3 activates professional antigenpresenting cells via Toll-like receptors 1 and 2. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 104:18631-18635.
Fux, C., Bodmer, T., Ziswiler, H.R., and Leib, S.L. (2003) [Nocardia cyriacigeorgici: First
report of invasive human infection]. Dtsch.Med.Wochenschr. 128:1038-1041.
Gallo, R.L. and Huttner, K.M. (1998) Antimicrobial peptides: an emerging concept in
cutaneous biology. J.Invest Dermatol. 111:739-743.
Literaturverzeichnis
48
Gallo, R.L., Ono, M., Povsic, T., Page, C., Eriksson, E., Klagsbrun, M., and Bernfield,
M. (1994) Syndecans, cell surface heparan sulfate proteoglycans, are induced by a proline-rich
antimicrobial peptide from wounds. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 91:11035-11039.
Ganz, T. (1987) Extracellular release of antimicrobial defensins by human
polymorphonuclear leukocytes. Infect.Immun. 55:568-571.
Ganz, T. (2001) Fatal attraction evaded. How pathogenic bacteria resist cationic polypeptides.
J.Exp.Med. 193:F31-F34.
Ganz,T ., Selsted, M.E., Szklarek, D., Harwig, S.S., Daher, K., Bainton, D.F., and
Lehrer, R.I. (1985) Defensins. Natural peptide antibiotics of human neutrophils. J.Clin.Invest
76:1427-1435.
Georghiou, P.R. and Blacklock, Z.M. (1992) Infection with Nocardia species in
Queensland. A review of 102 clinical isolates. Med.J.Aust. 156:692-697.
Ghosh, S.K., Gerken, T.A., Schneider, K.M., Feng, Z., McCormick, T.S., and Weinberg,
A. (2007) Quantification of human beta-defensin-2 and -3 in body fluids: application for
studies of innate immunity. Clin.Chem. 53:757-765.
Golec, M. (2007) Cathelicidin LL-37: LPS-neutralizing, pleiotropic peptide.
Ann.Agric.Environ.Med. 14:1-4.
Gordon, R.E., Mishra, S.K., and Barnett, D.A. (1978) Some bits and pieces of the genus
Nocardia: N. carnea, N. vaccinii, N. transvalensis, N. orientalis and N. aerocolonigenes.
J.Gen.Microbiol. 109:69-78.
Grommers, F.J., Van de, G.D., Van,d., V, Henricks, P.A., and Nijkamp, F.P. (1989)
Polymorphonuclear leucocyte function: relationship between induced migration into the
bovine mammary gland and in vitro cell activity. Vet.Immunol.Immunopathol. 23:75-83.
Hancock, R.E. (1997) Peptide antibiotics. Lancet 349:418-422.
Hancock, R.E. (2001) Cationic peptides: effectors in innate immunity and novel
antimicrobials. Lancet Infect.Dis. 1:156-164.
Literaturverzeichnis
49
Holzgrabe, U. (2004) Antibiotika-Entwicklung gestern und heute. Chemotherapie Journal
13:142-147.
Hsu, C.H., Chen, C., Jou, M.L., Lee, A.Y., Lin, Y.C., Yu, Y.P., Huang, W.T., and Wu,
S.H. (2005) Structural and DNA-binding studies on the bovine antimicrobial peptide,
indolicidin: evidence for multiple conformations involved in binding to membranes and DNA.
Nucleic Acids Res. 33:4053-4064.
Joly, S., Maze, C., McCray, P.B., Jr., and Guthmiller, J.M. (2004) Human beta-defensins
2 and 3 demonstrate strain-selective activity against oral microorganisms. J.Clin.Microbiol.
42:1024-1029.
Kai-Larsen, Y. and Agerberth, B. (2008) The role of the multifunctional peptide LL-37 in
host defense. Front Biosci. 13:3760-3767.
Kaiser, V. and Diamond, G. (2000) Expression of mammalian defensin genes.
J.Leukoc.Biol. 68:779-784.
Koczulla, A.R. and Bals, R. (2003) Antimicrobial peptides: current status and therapeutic
potential. Drugs 63:389-406.
Köhler, W., Eggers, H., Fleischer, B., Marre, R., Pfister, H., und Pulverer, G. (2001)
Medizinische Mikrobiologie. 8. Aufl. Urban und Fischer Verlag, München, S. 447.
Levy, S.B. (2005) Antibiotic resistance-the problem intensifies. Adv.Drug Deliv.Rev.
57:1446-1450.
Li, J., Post, M., Volk, R., Gao, Y., Li, M., Metais, C., Sato, K., Tsai, J., Aird, W.,
Rosenberg, R.D., Hampton, T.G., Sellke, F., Carmeliet, P., and Simons, M. (2000) PR39,
a peptide regulator of angiogenesis. Nat.Med. 6:49-55.
Long, P.F. (1994) A retrospective study of Nocardia infections associated with the acquired
immune deficiency syndrome (AIDS). Infection 22:362-364.
Lopez-Meza, J.E., Gutierrez-Barroso, A., and Ochoa-Zarzosa, A. (2009) Expression of
tracheal antimicrobial peptide in bovine mammary epithelial cells. Res.Vet.Sci. 87:59-63.
Literaturverzeichnis
50
Maraki, S., Chochlidakis, S., Nioti, E., and Tselentis, Y. (2004) Primary lymphocutaneous
nocardiosis in an immunocompetent patient. Ann.Clin.Microbiol.Antimicrob. 3:24.
Martineau, A.R., Newton, S.M., Wilkinson, K.A., Kampmann, B., Hall, B.M., Nawroly,
N., Packe, G.E., Davidson, R.N., Griffiths, C.J., and Wilkinson, R.J. (2007) Neutrophilmediated innate immune resistance to mycobacteria. J.Clin.Invest 117:1988-1994.
McNeil, M.M., Brown, J.M., Jarvis, W.R., and Ajello, L. (1990) Comparison of species
distribution and antimicrobial susceptibility of aerobic actinomycetes from clinical specimens.
Rev.Infect.Dis. 12:778-783.
Moylett, E.H., Pacheco, S.E., Brown-Elliott, B.A., Perry, T.R., Buescher, E.S.,
Birmingham, M.C., Schentag, J.J., Gimbel, J.F., Apodaca, A., Schwartz, M.A., Rakita,
R.M., and Wallace, R.J., Jr. (2003) Clinical experience with linezolid for the treatment of
nocardia infection. Clin.Infect.Dis. 36:313-318.
Murphy, C.J., Foster, B.A., Mannis, M.J., Selsted, M.E., and Reid, T.W. (1993)
Defensins are mitogenic for epithelial cells and fibroblasts. J.Cell Physiol 155:408-413.
Oppenheim, F.G., Xu, T., McMillian, F.M., Levitz, S.M., Diamond, R.D., Offner, G.D.,
and Troxler, R.F. (1988) Histatins, a novel family of histidine-rich proteins in human parotid
secretion. Isolation, characterization, primary structure, and fungistatic effects on Candida
albicans. J.Biol.Chem. 263:7472-7477.
Perron, G.G., Zasloff, M., and Bell, G. (2006) Experimental evolution of resistance to an
antimicrobial peptide. Proc.Biol.Sci. 273:251-256.
Ribeiro, M.G., Salerno, T., Mattos-Guaraldi, A.L., Camello, T.C., Langoni, H., Siqueira,
A.K., Paes, A.C., Fernandes, M.C., and Lara, G.H. (2008) Nocardiosis: an overview and
additional report of 28 cases in cattle and dogs. Rev.Inst.Med.Trop.Sao Paulo 50:177-185.
Roosen, S., Exner, K., Paul, S., Schroder, J.M., Kalm, E., and Looft, C. (2004) Bovine
beta-defensins: identification and characterization of novel bovine beta-defensin genes and
their expression in mammary gland tissue. Mamm.Genome 15:834-842.
Literaturverzeichnis
51
Sahly, H., Schubert, S., Harder, J., Rautenberg, P., Ullmann, U., Schroder, J., and
Podschun, R. (2003) Burkholderia is highly resistant to human Beta-defensin 3.
Antimicrob.Agents Chemother. 47:1739-1741.
Salinas-Carmona, M.C. (2000) Nocardia brasiliensis: from microbe to human and
experimental infections. Microbes.Infect. 2:1373-1381.
Sarikaya,H. and Bruckmaier, R.M. (2006) Importance of the sampled milk fraction for the
prediction of total quarter somatic cell count. J.Dairy Sci. 89:4246-4250.
Satterwhite, T.K. and Wallace, R.J., Jr. (1979) Primary cutaneous nocardiosis. JAMA
242:333-336.
Schaal, K.P. and Lee, H.J. (1992) Actinomycete infections in humans--a review. Gene
115:201-211.
Schittek, B., Hipfel, R., Sauer, B., Bauer, J., Kalbacher, H., Stevanovic, S., Schirle, M.,
Schroeder, K., Blin, N., Meier, F., Rassner, G., and Garbe, C. (2001) Dermcidin: a novel
human antibiotic peptide secreted by sweat glands. Nat.Immunol. 2:1133-1137.
Schonwetter, B.S., Stolzenberg, E.D., and Zasloff, M.A. (1995) Epithelial antibiotics
induced at sites of inflammation. Science 267:1645-1648.
Schroder, J.M. (2002) Antimicrobial peptides: effector molecules of the skin as immune
organ. Hautarzt 53:424-434.
Selsted, M.E., Novotny, M.J., Morris, W.L., Tang, Y.Q., Smith, W., and Cullor, J.S.
(1992) Indolicidin, a novel bactericidal tridecapeptide amide from neutrophils. J.Biol.Chem.
267:4292-4295.
Shin, S. and Wilson, M.R. (2006) Nocardiosis in septic arthritis of the knee. Orthopedics
29:945-947.
Sordillo, L.M., Shafer-Weaver, K., and DeRosa, D. (1997) Immunobiology of the
mammary gland. J.Dairy Sci. 80:1851-1865.
Literaturverzeichnis
52
Stolzenberg, E.D., Anderson, G.M., Ackermann, M.R., Whitlock, R.H., and Zasloff, M.
(1997) Epithelial antibiotic induced in states of disease. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 94:86868690.
Subbalakshmi, C. and Sitaram, N. (1998) Mechanism of antimicrobial action of indolicidin.
FEMS Microbiol.Lett. 160:91-96.
Suriyasathaporn, W., Schukken, Y.H., Nielen, M., and Brand, A. (2000) Low somatic cell
count: a risk factor for subsequent clinical mastitis in a dairy herd. J.Dairy Sci. 83:1248-1255.
Swanson, K., Gorodetsky, S., Good, L., Davis, S., Musgrave, D., Stelwagen, K., Farr, V.,
and Molenaar, A. (2004) Expression of a beta-defensin mRNA, lingual antimicrobial
peptide, in bovine mammary epithelial tissue is induced by mastitis. Infect.Immun. 72:73117314.
Turner, J., Cho, Y., Dinh, N.N., Waring, A.J., and Lehrer, R.I. (1998) Activities of LL-37,
a cathelin-associated antimicrobial peptide of human neutrophils. Antimicrob.Agents
Chemother. 42:2206-2214.
van 't, H.W., Veerman, E.C., Helmerhorst, E.J., and Amerongen, A.V. (2001)
Antimicrobial peptides: properties and applicability. Biol.Chem. 382:597-619.
Wallace, R.J., Jr., Brown, B.A., Tsukamura, M., Brown, J.M., and Onyi, G.O. (1991)
Clinical and laboratory features of Nocardia nova. J.Clin.Microbiol. 29:2407-2411.
Wallace, R.J., Jr., Steele, L.C., Sumter, G., and Smith, J.M. (1988) Antimicrobial
susceptibility patterns of Nocardia asteroides. Antimicrob.Agents Chemother. 32:1776-1779.
Wallace, R.J., Jr., Tsukamura, M., Brown, B.A., Brown, J., Steingrube, V.A., Zhang,
Y.S., and Nash, D.R. (1990) Cefotaxime-resistant Nocardia asteroides strains are isolates of
the controversial species Nocardia farcinica. J.Clin.Microbiol. 28:2726-2732.
WHO (2003) World Health Report 2003.
WHO (2007) World Health Report 2007.
Witte, W. und Klare I. (1999) Antibiotikaresistenz bei bakteriellen Infektionserregern.
Bundesgesundheitsblatt 42:8-16.
Literaturverzeichnis
53
Yang, D., Biragyn, A., Kwak, L.W., and Oppenheim, J.J. (2002) Mammalian defensins in
immunity: more than just microbicidal. Trends Immunol. 23:291-296.
Yeaman, M.R. and Yount, N.Y. (2003) Mechanisms of antimicrobial peptide action and
resistance. Pharmacol.Rev. 55:27-55.
Zanetti, M., Gennaro, R., and Romeo, D. (1995) Cathelicidins: a novel protein family with
a common proregion and a variable C-terminal antimicrobial domain. FEBS Lett. 374:1-5.
Zlotnik, H., Schramm, V.L., and Buckley, H.R. (1984) Purification and partial
characterization of a Nocardia brasiliensis extracellular protease. J.Bacteriol. 157:627-631.
Anhang
54
7 Anhang
___________________________________________________________________________
7.1 Abkürzungen
AIDS
acquired immunodeficiency syndrome (erworbenes Immundefektsyndrom)
AMP
antimikrobielle Peptide
ATCC
American Type Culture Collection
bzw.
beziehungsweise
CAMP
cationic animicrobial peptides (kationische antimikrobielle Peptide)
CFU
colony forming units (Kolonien bildende Einheiten)
CLSI
Clinical and Laboratory Standards Institute
COPD
chronic obstructive pulmonary disease (chronisch obstruktive
Lungenerkrankung)
DNA
Desoxyribonukleinsäure
ESBL
extended spectrum beta-lactamase
H2O
Wasser
hBD
humanes Beta-Defensin
hCAP
human cationic antimicrobial peptide (humanes kationisches antimikrobielles
Peptid)
HCl
Chlorwasserstoff (Salzsäure)
HNP
humane neutrophile Peptide
LAP
linguales antimikrobielles Peptid
LD
letale Dosis
LD90
letale Dosis, welche zu einer Keimreduktion von mindestens 90 % führt
LPS
Lipopolysaccharid
MH
Mueller-Hinton
MHB
Mueller-Hinton-Bouillon
Anhang
mid-log
midlogarithmisch
MNC
mononuclear cells (mononukleäre Zellen)
MRSA
Methillicin-resistenter Staphyloccocus aureus
N.
Nocardia
Na2HPO4
Dinatriumhydrogenphosphat
NaH2PO4
Natriumdihydrogenphosphat
NaOH
Natriumhydroxid (Natronlauge)
NCCLS
National Comitee for Clinical Laboratory Standards
OD
optische Dichte
OD600
optische Dichte bei 600 nm
pH
potentia hydrogenii (Maß für die Stärke der sauren oder basischen Wirkung
einer wässrigen Lösung)
PMN
polymorphonukleär
rpm
rounds per minute (Umdrehungen pro Minute)
rRNA
ribosomale Ribonukleinsäure
SCC
somatic cell count (somatische Zellzahl)
SMX
Sulfamethoxazol
TAP
tracheales antimikrobielles Peptid
TMP
Trimethoprim
USA
United States of America (Die Vereinigten Staaten von Amerika)
vgl.
vergleiche
VRE
Vancomycin-resistente Enterokokken
ZNS
Zentralnervensystem
55
Anhang
7.2 Aminosäuren im Einbuchstabencode
A
Alanin
C
Cystein
D
Aspartat
E
Glutamat
F
Phenylalanin
G
Glycin
H
Histidin
I
Isoleucin
K
Lysin
L
Leucin
M
Methionin
N
Asparagin
P
Prolin
Q
Glutamin
R
Arginin
S
Serin
T
Threonin
V
Valin
W
Tryptophan
Y
Tyrosin
56
Anhang
57
7.3 Einheiten
Verwendete SI-Einheiten
Länge
m
Meter
Masse
kg
Kilogramm
Stoffmenge
mol
Mol
Zeit
s
Sekunde
Verwendete abgeleitete Einheiten und Konstanten
°C
Grad Celsius
1 °C = 273,15 K
h
Stunde
1 h = 3600 s
M
Molar
1 M = 1 mol l-1
Weitere verwendete Einheiten
Volumen
l
Liter
Masse
Da
Dalton
Verwendete Abkürzungen zur Bezeichnung der Vielfachen und Teile der Einheiten
103
Kilo-
k
10-3
Milli-
m
10-6
Mikro-
µ
10-9
Nano-
n
Anhang
58
7.4 Auswertungen aller Killing-Assays
7.4.1
Nocardia farcinica
N. farcinica
ATCC 3318
HNP 1-3 (µg/ml)
Kontrolle
6
Assay 1
8,8 * 10 CFU/ml
(≙ 100 %)
Assay 2
7,7 * 106 CFU/ml
(≙ 100 %)
Assay 3
1,98 * 107 CFU/ml
(≙ 100 %)
Assay 4
1,03 * 107 CFU/ml
(≙ 100 %)
Assay 5
7,75 * 106 CFU/ml
(≙ 100 %)
Wachstum (%)
100
N. farcinica
ATCC 3318
Assay 1
Assay 2
Assay 3
Assay 4
Assay 5
Wachstum (%)
8
7,5 * 106 CFU/ml
(≙ 85,23 %)
16
9,05 * 105 CFU/ml
(≙ 10,28 %)
32
9,25 * 104 CFU/ml
(≙ 1,05 %)
1,19 * 107 CFU/ml
(≙ 154,55 %)
6,5 * 106 CFU/ml
(≙ 84,42 %)
9,4 * 105 CFU/ml
(≙ 12,21 %)
1,98 * 107 CFU/ml
(≙ 100 %)
1,83 * 107 CFU/ml
(≙ 92,42 %)
5,8 * 106 CFU/ml
(≙ 29,29 %)
1,19 * 107 CFU/ml
(≙ 115,53 %)
1,21 * 107 CFU/ml
(≙ 117,48 %)
2,9 * 106 CFU/ml
(≙ 28,16 %)
9,1 * 106 CFU/ml
(≙ 117,42 %)
4,9 * 106 CFU/ml
(≙ 63,23 %)
1,48 * 106 CFU/ml
(≙ 19,10 %)
114,55
73,57
17,96
Kontrolle
6,8 * 106
CFU/ml
(≙ 100 %)
1
9,6 * 106
CFU/ml
(≙ 141,18 %)
hBD-3 (µg/ml)
8
1,03 * 106
CFU/ml
(≙ 15,15 %)
9,25 * 106
CFU/ml
(≙ 100 %)
8,35 * 106
CFU/ml
(≙ 90,27 %)
1,75 * 107
CFU/ml
(≙ 100 %)
16
32
4,8 * 106
CFU/ml
(≙ 51,89 %)
kein Wachstum
(≙ 0 %)
kein Wachstum
(≙ 0 %)
1,29 * 107
CFU/ml
(≙ 73,71 %)
8,2 * 106
CFU/ml
(≙ 46,86 %)
2,05 * 106
CFU/ml
(≙ 11,71 %)
2,55 * 105
CFU/ml
(≙ 1,46 %)
1,05 * 107
CFU/ml
(≙ 100 %)
8,55 * 106
CFU/ml
(≙ 81,43 %)
8,85 * 106
CFU/ml
(≙ 84,29 %)
1,11 * 106
CFU/ml
(≙ 10,57 %)
1,25 * 104
CFU/ml
(≙ 0,12 %)
1,01 * 107
CFU/ml
(≙ 100 %)
1,05 * 107
CFU/ml
(≙ 103,96 %)
1,07 * 106
CFU/ml
(≙ 10,59 %)
7,95 * 105
CFU/ml
(≙ 7,87 %)
6 * 104 CFU/ml
(≙ 0,59 %)
100
98,11
41,76
7,54
0,54
Anhang
N. farcinica
ATCC 3318
Assay 1
Assay 2
Assay 3
Assay 4
Assay 5
Wachstum (%)
N. farcinica
ATCC 3318
59
Kontrolle
5,7 * 106
CFU/ml
(≙ 100 %)
1
5,5 * 106
CFU/ml
(≙ 96,49 %)
LL-37 (µg/ml)
8
1,19 * 106
CFU/ml
(≙ 20,88 %)
9,75 * 106
CFU/ml
(≙ 100 %)
5,45 * 106
CFU/ml
(≙ 55,9 %)
1,02 * 106
CFU/ml
(≙ 10,46 %)
1,63 * 107
CFU/ml
(≙ 100 %)
1,02 * 107
CFU/ml
(≙ 62,58 %)
2,95 * 106
CFU/ml
(≙ 18,1 %)
9,25 * 105
CFU/ml
(≙ 5,67 %)
4,18 * 105
CFU/ml
(≙ 2,56 %)
1,03 * 107
CFU/ml
(≙ 100 %)
1,4 * 107
CFU/ml
(≙ 135,92 %)
2,7 * 106
CFU/ml
(≙ 26,21 %)
2,37 * 106
CFU/ml
(≙ 23,01 %)
3,28 * 105
CFU/ml
(≙ 3,18 %)
1,01 * 107
CFU/ml
(≙ 100 %)
7,7 * 106
CFU/ml
(≙ 76,24 %)
6,6 * 105
CFU/ml
(≙ 6,53 %)
5,48 * 105
CFU/ml
(≙ 5,43 %)
3,55 * 105
CFU/ml
(≙ 3,51 %)
100
85,43
16,44
11,37
3,08
Kontrolle
6
16
32
2,98 * 105
CFU/ml
(≙ 3,06 %)
Indolicidin (µg/ml)
1
8
1,12 * 106
3,1 * 106
CFU/ml
CFU/ml
(≙ 56,36 %)
(≙ 20,36 %)
16
2,48 * 105
CFU/ml
(≙ 4,51 %)
32
Assay 1
5,5 * 10 CFU/ml
(≙ 100 %)
Assay 2
1,2 * 106 CFU/ml
(≙ 100 %)
8,8 * 105
CFU/ml
(≙ 73,33 %)
1,90 * 105
CFU/ml
(≙ 15,83 %)
2,5 * 104
CFU/ml
(≙ 2,08 %)
kein Wachstum
(≙ 0 %)
6,95 * 106
CFU/ml
(≙ 100 %)
4,25 * 106
CFU/ml
(≙ 61,15 %)
3,55 * 106
CFU/ml
(≙ 51,08 %)
1,85 * 106
CFU/ml
(≙ 26,62 %)
kein Wachstum
(≙ 0 %)
100
63,62
29,09
11,07
0
Assay 3
Wachstum (%)
kein Wachstum
(≙ 0 %)
Anhang
60
1
2,65 * 106
CFU/ml
(≙ 53 %)
LAP (µg/ml)
8
1,4 * 106
CFU/ml
(≙ 28 %)
1,17 * 106
CFU/ml
(≙ 100 %)
6,33 * 105
CFU/ml
(≙ 54,1 %)
1,8 * 105
CFU/ml
(≙ 15,38 %)
4,15 * 106
CFU/ml
(≙ 100 %)
2,05 * 106
CFU/ml
(≙ 49,4 %)
1,17 * 106
CFU/ml
(≙ 28,19 %)
Wachstum (%)
100
52,17
N. farcinica
ATCC 3318
Kontrolle
Assay 1
4,8 * 106 CFU/ml
(≙ 100 %)
N. farcinica
ATCC 3318
Kontrolle
Assay 1
5 * 106 CFU/ml
(≙ 100 %)
Assay 2
Assay 3
Assay 2
Assay 3
Wachstum (%)
16
2,25 * 105
CFU/ml
(≙ 4,5 %)
32
kein Wachstum
(≙ 0 %)
2 * 104 CFU/ml
(≙ 1,71 %)
kein Wachstum
(≙ 0 %)
6,28 * 105
CFU/ml
(≙ 15,13 %)
kein Wachstum
(≙ 0 %)
23,86
7,11
0
1
3,55 * 106
CFU/ml
(≙ 73,96 %)
TAP (µg/ml)
8
2,35 * 106
CFU/ml
(≙ 48,96 %)
16
9,7 * 105
CFU/ml
(≙ 20,21 %)
32
2,2 * 105
CFU/ml
(≙ 4,58 %)
1,26 * 106
CFU/ml
(≙ 100 %)
8,33 * 105
CFU/ml
(≙ 66,11 %)
6,25 * 105
CFU/ml
(≙ 49,6 %)
2,18 * 105
CFU/ml
(≙ 17,3 %)
2,25 * 104
CFU/ml
(≙ 1,79 %)
4 * 106 CFU/ml
(≙ 100 %)
4,45 * 106
CFU/ml
(≙ 61,25 %)
2,05 * 106
CFU/ml
(≙ 51,25 %)
1,06 * 106
CFU/ml
(≙ 26,5 %)
4,65 * 105
CFU/ml
(≙ 11,63 %)
100
67,11
49,94
21,34
6
Assay 1
Kontrolle
8,1 * 106 CFU/ml
(≙ 100 %)
Levofloxacin (µg/ml)
1
8
4,5 * 106 CFU/ml
1,85 * 105 CFU/ml
(≙ 55,56 %)
(≙ 2,28 %)
32
1,1 * 105 CFU/ml
(≙ 1,36 %)
Assay 2
7,4 * 106 CFU/ml
(≙ 100 %)
6,35 * 106 CFU/ml
(≙ 85,81 %)
7,95 * 105 CFU/ml
(≙ 10,74 %)
3,65 * 105 CFU/ml
(≙ 4,93 %)
Assay 3
1,52 * 107 CFU/ml
(≙ 100 %)
1,27 * 107 CFU/ml
(≙ 83,55 %)
1,5 * 106 CFU/ml
(≙ 9,87 %)
3,93 * 105 CFU/ml
(≙ 2,59 %)
Assay 4
1,1 * 107 CFU/ml
(≙ 100 %)
1,08 * 107 CFU/ml
(≙ 98,18 %)
9,05 * 105 CFU/ml
(≙ 8,23 %)
2,3 * 105 CFU/ml
(≙ 2,09 %)
Wachstum (%)
100
80,78
7,78
2,74
N. farcinica
ATCC 3318
Anhang
61
Assay 1
Kontrolle
3,38 * 106 CFU/ml
(≙ 100 %)
DPY (µg/ml)
1
8
3,33 * 106 CFU/ml
1,13 * 106 CFU/ml
(≙ 98,52 %)
(≙ 33,43 %)
32
4,65 * 106 CFU/ml
(≙ 137,57 %)
Assay 2
7,13 * 106 CFU/ml
(≙ 100 %)
5,78 * 106 CFU/ml
(≙ 81,07 %)
2,45 * 106 CFU/ml
(≙ 34,36 %)
3,52 * 106 CFU/ml
(≙ 49,37 %)
Assay 3
4,11 * 106 CFU/ml
(≙ 100 %)
4,89 * 106 CFU/ml
(≙ 118,98 %)
2,98 * 106 CFU/ml
(≙ 72,51 %)
2,79 * 106 CFU/ml
(≙ 67,88 %)
Wachstum (%)
100
99,52
46,77
84,94
N. farcinica
ATCC 3318
N. farcinica
ATCC 3318
Assay 1
Wachstum (%)
7.4.2
Kontrolle
1,09 * 106
CFU/ml
100
1
1,16 * 106
CFU/ml
106,42
LL-37 + HNP 1-3 (µg/ml)
2
4
8
7,68 * 105 6,5 * 105
2,3 * 105
CFU/ml
CFU/ml
CFU/ml
70,46
59,63
21,1
16
5,5 * 104
CFU/ml
5,05
32
7 * 104
CFU/ml
6,42
Nocardia nova
N. nova
ATCC 33726
Assay 1
Assay 2
Assay 3
Assay 4
Wachstum (%)
Kontrolle
8,05 * 106
CFU/ml
(≙ 100 %)
1
7,55 * 106
CFU/ml
(≙ 93,79 %)
HNP 1-3 (µg/ml)
8
16
3,25 * 106
4,4 * 106
CFU/ml
CFU/ml
(≙ 40,37 %) (≙ 54,66 %)
32
2,6 * 106
CFU/ml
(≙ 32,3 %)
64
8,75 * 104
CFU/ml
(≙ 1,09 %)
7 * 106
CFU/ml
(≙ 100 %)
5,55 * 106
CFU/ml
(≙ 79,29 %)
5,15 * 106
CFU/ml
(≙ 73,57 %)
2,8 * 106
CFU/ml
(≙ 40 %)
6,75 * 104
CFU/ml
(≙ 0,96 %)
2,75 * 104
CFU/ml
(≙ 0,39 %)
1,33 * 107
CFU/ml
(≙ 100 %)
1,24 * 107
CFU/ml
(≙ 93,23 %)
7,3 * 106
CFU/ml
(≙ 54,89 %)
5,45 * 106
CFU/ml
(≙ 40,98 %)
1,26 * 106
CFU/ml
(≙ 9,47 %)
1,07 * 106
CFU/ml
(≙ 8,05 %)
1,6 * 107
CFU/ml
(≙ 100 %)
1,33 * 107
CFU/ml
(≙ 83,13 %)
1,43 * 107
CFU/ml
(≙ 89,38 %)
1,5 * 107
CFU/ml
(≙ 93,75 %)
7,1 * 106
CFU/ml
(≙ 44,38 %)
1,23 * 105
CFU/ml
(≙ 0,77 %)
100
87,36
64,55
57,35
21,78
2,57
Anhang
N. nova
ATCC 33726
Assay 1
Assay 2
Assay 3
Wachstum (%)
N. nova
ATCC 33726
62
Kontrolle
6,1 * 106
CFU/ml
(≙ 100 %)
1
4,8 * 106
CFU/ml
(≙ 78,69 %)
hBD-3 (µg/ml)
8
16
9,98 * 105
2,58 * 105
CFU/ml
CFU/ml
(≙ 16,36 %)
(≙ 4,23 %)
32
4,25 * 104
CFU/ml
(≙ 0,7 %)
64
8,75 * 104
CFU/ml
(≙ 1,43 %)
1,41 * 107
CFU/ml
(≙ 100 %)
1,18 * 107
CFU/ml
(≙ 83,69 %)
2,9 * 106
CFU/ml
(≙ 20,57 %)
3,2 * 105
CFU/ml
(≙ 2,27 %)
2,63 * 105
CFU/ml
(≙ 1,87 %)
1,5 * 107
CFU/ml
(≙ 100 %)
1,56 * 107
CFU/ml
(≙ 104 %)
7,38 * 105
CFU/ml
(≙ 4,92 %)
1,58 * 105
CFU/ml
(≙ 1,05 %)
1,68 * 105
CFU/ml
(≙ 1,12 %)
100
88,79
13,95
1,34
1,47
Kontrolle
6
1
6
9,3 * 105
CFU/ml
(≙ 6,6 %)
5,03 * 105
CFU/ml
(≙ 3,35 %)
4,73
LL-37 (µg/ml)
8
16
1,51 * 106
6
2,08 * 10
CFU/ml
CFU/ml
(≙ 26,03 %)
(≙ 35,86 %)
3,68 * 10
CFU/ml
(≙ 6,34 %)
8 * 104
CFU/ml
(≙ 1,38 %)
4,13 * 105
CFU/ml
(≙ 7,31 %)
1,98 * 105
CFU/ml
(≙ 3,5 %)
2,7 * 106
CFU/ml
(≙ 18,49 %)
3,85 * 105
CFU/ml
(≙ 2,64 %)
32
64
5
5,8 * 10
CFU/ml
(≙ 100 %)
4,35 * 10
CFU/ml
(≙ 75 %)
5,65 * 106
CFU/ml
(≙ 100 %)
4,35 * 106
CFU/ml
(≙ 76,99 %)
1,74 * 106
CFU/ml
(≙ 30,8 %)
1,46 * 107
CFU/ml
(≙ 100 %)
8,5 * 106
CFU/ml
(≙ 58,22 %)
4,6 * 106
CFU/ml
(≙ 31,51 %)
1,54 * 107
CFU/ml
(≙ 100 %)
1,44 * 107
CFU/ml
(≙ 93,51 %)
3,95 * 106
CFU/ml
(≙ 25,65 %)
6,2 * 105
CFU/ml
(≙ 4,03 %)
3,4 * 105
CFU/ml
(≙ 2,21 %)
1,98 * 105
CFU/ml
(≙ 1,29 %)
Wachstum (%)
100
75,93
30,95
20,9
8,59
2,2
N. nova
ATCC 33726
Kontrolle
1
1,57 * 107
CFU/ml
(≙ 100 %)
Assay 1
Assay 2
Assay 3
Assay 4
Assay 1
Assay 2
Assay 3
Wachstum (%)
9,55 * 105
CFU/ml
(≙ 16,9 %)
5,35 * 106
CFU/ml
(≙ 36,64 %)
32
64
1,78 * 107
CFU/ml
(≙ 113,38 %)
Indolicidin (µg/ml)
8
16
1,13
* 105
1,61 * 106
CFU/ml
CFU/ml
(≙ 0,72 %)
(≙ 10,25 %)
1 * 104
CFU/ml
(≙ 0,06 %)
3 * 104
CFU/ml
(≙ 0,19 %)
5,7 * 106
CFU/ml
(≙ 100 %)
7,1 * 106
CFU/ml
(≙ 124,56 %)
3,35 * 105
CFU/ml
(≙ 5,88 %)
4,05 * 105
CFU/ml
(≙ 7,11 %)
4,5 * 104
CFU/ml
(≙ 0,79 %)
1,45 * 107
CFU/ml
(≙ 100 %)
1,45 * 107
CFU/ml
(≙ 100 %)
1,8 * 106
CFU/ml
(≙ 12,41 %)
7,75 * 104
CFU/ml
(≙ 0,53 %)
5 * 103
CFU/ml
(≙ 0,03 %)
100
112,65
9,52
2,57
0,34
4,5 * 105
CFU/ml
(≙ 7,89 %)
5,7 * 105
CFU/ml
(≙ 3,93 %)
4,18
Anhang
63
Assay 1
Kontrolle
1,13 * 107 CFU/ml
(≙ 100 %)
Levofloxacin (µg/ml)
1
8
9,75 * 106 CFU/ml
3,8 * 106 CFU/ml
(≙ 86,28 %)
(≙ 33,63 %)
32
1,53 * 106 CFU/ml
(≙ 13,54 %)
Assay 2
8,55 * 106 CFU/ml
(≙ 100 %)
6,9 * 106 CFU/ml
(≙ 80,7 %)
5 * 106 CFU/ml
(≙ 58,48 %)
1,8 * 106 CFU/ml
(≙ 21,05 %)
Assay 3
1,03 * 107 CFU/ml
(≙ 100 %)
9,25 * 106 CFU/ml
(≙ 89,81 %)
7,3 * 106 CFU/ml
(≙ 70,87 %)
2,35 * 106 CFU/ml
(≙ 22,82 %)
Assay 4
1,27 * 107 CFU/ml
(≙ 100 %)
1,19 * 107 CFU/ml
(≙ 93,7 %)
1,16 * 107 CFU/ml
(≙ 91,34 %)
2,65 * 106 CFU/ml
(≙ 20,87 %)
Assay 5
1,96 * 107 CFU/ml
(≙ 100 %)
2 * 107 CFU/ml
(≙ 102,04 %)
1,43 * 107 CFU/ml
(≙ 72,96 %)
3,7 * 106 CFU/ml
(≙ 18,88 %)
Wachstum (%)
100
90,51
65,46
19,43
N. nova
ATCC 33726
N. nova
ATCC 33726
1
6 * 106
CFU/ml
(≙ 67,8 %)
DPY (µg/ml)
8
16
6,3 * 106
8,75 * 106
CFU/ml
CFU/ml
(≙ 71,19 %)
(≙ 98,87 %)
5,8 * 106
CFU/ml
(≙ 100 %)
5,25 * 106
CFU/ml
(≙ 90,52 %)
5 * 106
CFU/ml
(≙ 86,21 %)
1,46 * 107
CFU/ml
(≙ 100 %)
1,55 * 107
CFU/ml
(≙ 106,16 %)
100
88,16
Kontrolle
6
Assay 1
Assay 2
Assay 3
Wachstum
(%)
8,85 * 10
CFU/ml
(≙ 100 %)
7
1,69 * 10
CFU/ml
(≙ 115,75 %)
91,05
6,5 * 106
CFU/ml
(≙ 112,07 %)
1,5 * 107
CFU/ml
(≙ 102,74 %)
104,56
32
6,35 * 106
CFU/ml
(≙ 71,75 %)
64
5,65 * 106
CFU/ml
(≙ 63,84 %)
5,25 * 106
CFU/ml
(≙ 90,52 %)
6,3 * 106
CFU/ml
(≙ 108,62 %)
1,51 * 107
CFU/ml
(≙ 103,42 %)
88,56
1,41 * 107
CFU/ml
(≙ 96,58 %)
89,68
Anhang
7.4.3
64
Nocardia asteroides
N. asteroides
ATCC 19247
Assay 1
Assay 2
Assay 3
Wachstum (%)
N. asteroides
ATCC 19247
Kontrolle
1,63 * 106
CFU/ml
(≙ 100 %)
8
9,38 * 105
CFU/ml
(≙ 57,55 %)
5,65 * 106
CFU/ml
(≙ 100 %)
2,15 * 106
CFU/ml
(≙ 38,05 %)
1,91 * 106
CFU/ml
(≙ 100 %)
100
HNP 1-3 (µg/ml)
16
7,23 * 105
CFU/ml
(≙ 44,36 %)
32
1,48 * 105
CFU/ml
(≙ 9,08 %)
64
2,78 * 105
CFU/ml
(≙ 27,79 %)
1,07 * 106
CFU/ml
(≙ 18,94 %)
5,43 * 105
CFU/ml
(≙ 9,61 %)
4,13 * 105
CFU/ml
(≙ 7,31 %)
1,01 * 106
CFU/ml
(≙ 52,88 %)
8,32 * 105
CFU/ml
(≙ 43,56 %)
1,63 * 105
CFU/ml
(≙ 8,53 %)
4,2 * 105
CFU/ml
(≙ 21,99 %)
49,49
35,62
9,07
15,45
hBD-3 (µg/ml)
Assay 1
Kontrolle
3,95 * 106 CFU/ml
(≙ 100 %)
1
1,88 * 106 CFU/ml
(≙ 47,59 %)
8
4,6 * 106 CFU/ml
(≙ 116,46 %)
64
5,35 * 106 CFU/ml
(≙ 135,44 %)
Assay 2
3,65 * 106 CFU/ml
(≙ 100 %)
1,24 * 106 CFU/ml
(≙ 33,97 %)
2,06 * 106 CFU/ml
(≙ 56,44 %)
1,65 * 106 CFU/ml
(≙ 45,21 %)
Assay 3
4,88 * 105 CFU/ml
(≙ 100 %)
5,73 * 105 CFU/ml
(≙ 117,42 %)
1,33 * 106 CFU/ml
(≙ 272,54 %)
2,95 * 106 CFU/ml
(≙ 604,51 %)
Assay 4
5,95 * 106 CFU/ml
(≙ 100 %)
2,25 * 106 CFU/ml
(≙ 37,82 %)
4,5 * 106 CFU/ml
(≙ 75,63 %)
2,65 * 106 CFU/ml
(≙ 44,54 %)
Assay 5
1,81 * 107 CFU/ml
(≙ 100 %)
1,49 * 107 CFU/ml
(≙ 82,32 %)
1,02 * 107 CFU/ml
(≙ 56,35 %)
1,44 * 107 CFU/ml
(≙ 79,56 %)
Wachstum (%)
100
63,82
115,48
181,85
Anhang
N. asteroides
ATCC 19247
65
LL-37 (µg/ml)
1
8
3 * 106 CFU/ml
7,45 * 106 CFU/ml
(≙ 101,69 %)
(≙ 252,54 %)
Assay 1
Kontrolle
2,95 * 106 CFU/ml
(≙ 100 %)
Assay 2
3,45 * 106 CFU/ml
(≙ 100 %)
2,01 * 106 CFU/ml
(≙ 58,26 %)
2,41 * 106 CFU/ml
(≙ 69,86 %)
1,18 * 107 CFU/ml
(≙ 342,03 %)
Assay 3
5,13 * 105 CFU/ml
(≙ 100 %)
6,28 * 105 CFU/ml
(≙ 122,42 %)
1,75 * 106 CFU/ml
(≙ 341,13 %)
1,38 * 106 CFU/ml
(≙ 269,01 %)
Assay 4
5,15 * 106 CFU/ml
(≙ 100 %)
1,7 * 106 CFU/ml
(≙ 33,01 %)
6,3 * 106 CFU/ml
(≙ 122,33 %)
Assay 5
1,84 * 107 CFU/ml
(≙ 100 %)
1,03 * 107 CFU/ml
(≙ 55,98 %)
1,63 * 107 CFU/ml
(≙ 88,59 %)
6,9 * 106 CFU/ml
(≙ 37,5 %)
Wachstum (%)
100
74,27
174,89
221,88
N. asteroides
ATCC 19247
Assay 1
Assay 2
Assay 3
Wachstum
(%)
64
7,05 * 106 CFU/ml
(≙ 238,98 %)
1
1,2 * 106
CFU/ml
(≙ 93,75 %)
Indolicidin (µg/ml)
8
16
4,63 * 105
1,18 * 105
CFU/ml
CFU/ml
(≙ 36,17 %)
(≙ 9,22 %)
32
4,25 * 103
CFU/ml
(≙ 0,33 %)
64
5 * 103
CFU/ml
(≙ 0,39 %)
2,95 * 106
CFU/ml
(≙ 96,72 %)
1,03 * 106
CFU/ml
(≙ 33,77 %)
5,9 * 105
CFU/ml
(≙ 19,34 %)
4,5 * 104
CFU/ml
(≙ 1,48 %)
1,26 * 106
CFU/ml
(≙ 100 %)
1,11 * 106
CFU/ml
(≙ 88,1 %)
6,95 * 105
CFU/ml
(≙ 55,16 %)
1,95 * 105
CFU/ml
(≙ 15,48 %)
1 * 104
CFU/ml
(≙ 0,79 %)
100
92,86
41,7
11,72
0,89
Kontrolle
1,28 * 106
CFU/ml
(≙ 100 %)
3,05 * 106
CFU/ml
(≙ 100 %)
1,06 * 106
CFU/ml
(≙ 34,75 %)
2,08 * 105
CFU/ml
(≙ 16,51 %)
20,16
Anhang
N. asteroides
ATCC 19247
Kontrolle
2,18 * 106 CFU/ml
(≙ 100 %)
66
Levofloxacin (µg/ml)
1
8
32
1,3 * 106 CFU/ml
(≙ 59,63 %)
1,75 * 105 CFU/ml
(≙ 8,03 %)
kein Wachstum
(≙ 0 %)
3,25 * 106 CFU/ml
(≙ 100 %)
1,93 * 105 CFU/ml
(≙ 5,94 %)
kein Wachstum
(≙ 0 %)
7,48 * 105 CFU/ml
(≙ 63,93 %)
4 * 104 CFU/ml
(≙ 3,42 %)
kein Wachstum
(≙ 0 %)
Assay 4
1,19 * 106 CFU/ml
(≙ 100 %)
2,13 * 106 CFU/ml
(≙ 178,99 %)
1,15 * 105 CFU/ml
(≙ 9,66 %)
kein Wachstum
(≙ 0 %)
Assay 5
1,23 * 106 CFU/ml
(≙ 100 %)
1,61 * 106 CFU/ml
(≙ 130,89 %)
1,51 * 105 CFU/ml
(≙ 12,28 %)
kein Wachstum
(≙ 0 %)
Wachstum (%)
100
106,69
7,87
0
Assay 1
Kontrolle
2,45 * 106 CFU/ml
(≙ 100 %)
DPY (µg/ml)
32
1,42 * 106 CFU/ml
(≙ 57,96 %)
128
1,06 * 106 CFU/ml
(≙ 43,27 %)
Assay 2
1,74 * 107 CFU/ml
(≙ 100 %)
1,35 * 107 CFU/ml
(≙ 77,59 %)
1,5 * 107 CFU/ml
(≙ 86,21 %)
Assay 3
5,13 * 106 CFU/ml
(≙ 100 %)
4,23 * 106 CFU/ml
(≙ 82,46 %)
4,88 * 106 CFU/ml
(≙ 95,13 %)
Wachstum (%)
100
72,67
74,87
Assay 1
Assay 2
Assay 3
N. asteroides
ATCC 19247
3,25 * 106 CFU/ml
(≙ 100 %)
1,17 * 106 CFU/ml
(≙ 100 %)
Anhang
7.4.4
67
Nocardia brasiliensis
N. brasiliensis
ATCC 19296
Kontrolle
5
Assay 1
Assay 2
Assay 3
Assay 4
Wachstum
(%)
N. brasiliensis
ATCC 19296
Assay 1
Assay 2
Assay 3
Assay 4
Wachstum
(%)
HNP 1-3 (µg/ml)
8
16
1
6
6
32
6
64
5,8 * 10
CFU/ml
(≙ 100 %)
1,79 * 10
CFU/ml
(≙ 308,62 %)
2,3 * 10
CFU/ml
(≙ 396,55 %)
4,1 * 10
CFU/ml
(≙ 706,9 %)
4,2 * 10
CFU/ml
3,95 * 106
CFU/ml
(≙ 724,14 %)
(≙ 681,03 %)
3,8 * 105
CFU/ml
(≙ 100 %)
3,13 * 105
CFU/ml
(≙ 82,37 %)
2,25 * 106
CFU/ml
(≙ 592,11 %)
3,9 * 106
CFU/ml
2,25 * 106
CFU/ml
2,11 * 106
CFU/ml
(≙ 1026,36 %)
(≙ 592,11 %)
(≙ 555,26 %)
3,05 * 105
CFU/ml
(≙ 100 %)
2,85 * 105
CFU/ml
(≙ 93,44 %)
2,25 * 106
CFU/ml
(≙ 737,7 %)
4,7 * 106
CFU/ml
5 * 106
CFU/ml
5,05 * 106
CFU/ml
(≙ 1540,98 %)
(≙ 1639,34 %)
(≙ 1655,7 %)
1,25 * 105
CFU/ml
(≙ 100 %)
2 * 105
CFU/ml
(≙ 160 %)
1,69 * 106
CFU/ml
(≙ 1352 %)
3,65 * 106
CFU/ml
(≙ 2920 %)
5,25 * 106
CFU/ml
4,7 * 106
CFU/ml
(≙ 4200 %)
(≙ 3760 %)
100
161,11
769,59
1548,55
1788,9
1663,01
32
64
Kontrolle
3,73 * 105
CFU/ml
(≙ 100 %)
4,98 * 105
CFU/ml
(≙ 100 %)
1
1,69 * 106
CFU/ml
(≙ 453,08 %)
hBD-3 (µg/ml)
8
16
6
4,8 * 106
CFU/ml
5,95 * 106
CFU/ml
4,7 * 106
CFU/ml
4,55 * 106
CFU/ml
(≙ 1286,86 %)
(≙ 1595,17 %)
(≙ 1260,05 %)
(≙ 1219,84 %)
5,4 * 106
CFU/ml
4,35 * 106
CFU/ml
5,98 * 105
CFU/ml
(≙ 120,08%)
(≙ 1084,34 %)
9,55 * 105
CFU/ml
(≙ 191,77 %)
3,28 * 105
CFU/ml
(≙ 79,04 %)
2,9 * 106
CFU/ml
(≙ 698,8 %)
3,8 * 106
CFU/ml
(≙ 915,66 %)
4,05 * 106
CFU/ml
5,9 * 106
CFU/ml
(≙ 975,9 %)
(≙ 1421,69 %)
5,58 * 105
CFU/ml
(≙ 100 %)
5,13 * 105
CFU/ml
(≙ 91,94 %)
4,65 * 106
CFU/ml
(≙ 833,33 %)
6,1 * 106
CFU/ml
8,25 * 106
CFU/ml
9,95 * 106
CFU/ml
(≙ 1093,19 %)
(≙ 1478,49 %)
(≙ 1783,15 %)
100
186,03
975,83
948,95
1146,99
1492,72
4,15 * 105
CFU/ml
(≙ 100 %)
(≙ 873,49 %)
7,7 * 106
CFU/ml
(≙ 1546,18 %)
Anhang
N. brasiliensis
ATCC 19296
Assay 1
Assay 2
Assay 3
Assay 4
Wachstum
(%)
N. brasiliensis
ATCC 19296
Assay 2
Assay 3
Assay 4
Assay 5
Wachstum
(%)
LL-37 (µg/ml)
8
Kontrolle
1
4,78 * 105
CFU/ml
(≙ 100 %)
1,24 * 106
CFU/ml
(≙ 259,41 %)
2 * 105
CFU/ml
(≙ 100 %)
7,53 * 105
CFU/ml
(≙ 376,5 %)
3,05 * 105
CFU/ml
(≙ 100 %)
4,18 * 105
CFU/ml
(≙ 137,05 %)
16
32
64
1,02 * 107
CFU/ml
1,31 * 107
CFU/ml
8,15 * 106
CFU/ml
7 * 106
CFU/ml
(≙ 2133,89 %)
(≙ 2740,59 %)
(≙ 1705,02 %)
(≙ 1464,44 %)
1,22 * 107
CFU/ml
(≙ 6100 %)
7,05 * 106
CFU/ml
6,7 * 106
CFU/ml
(≙ 3350 %)
1,12 * 107
CFU/ml
6,2 * 106
CFU/ml
(≙ 3672,13 %)
(≙ 2032,79 %)
6,15 * 106
CFU/ml
6,9 * 106
CFU/ml
(≙ 3450 %)
1,24 * 107
CFU/ml
(≙ 4065,57 %)
(≙ 3525 %)
5,7 * 106
CFU/ml
(≙ 1868,85 %)
1,95 * 105
CFU/ml
(≙ 100 %)
1,55 * 105
CFU/ml
(≙ 79,49 %)
5,85 * 106
CFU/ml
(≙ 3000 %)
7,8 * 106
CFU/ml
(≙ 4000 %)
(≙ 3153,85 %)
100
213,11
3162,37
4128,18
2604,16
2734,92
32
64
Kontrolle
6
Assay 1
68
Indolicidin (µg/ml)
8
16
1
6
5
5
5
8,3 * 106
CFU/ml
(≙ 4256,41 %)
9,5 * 104
CFU/ml
(≙ 8,12 %)
1,17 * 10
CFU/ml
(≙ 100 %)
1,07 * 10
CFU/ml
(≙ 91,45 %)
4,78 * 10
CFU/ml
(≙ 40,85 %)
1,93 * 10
CFU/ml
(≙ 16,5 %)
1,01 * 106
CFU/ml
(≙ 100 %)
8,88 * 105
CFU/ml
(≙ 87,92 %)
5,8 * 105
CFU/ml
(≙ 57,43 %)
2,18 * 105
CFU/ml
(≙ 21,58 %)
1,05 * 105
CFU/ml
1,07 * 106
CFU/ml
(≙ 100 %)
1,12 * 106
CFU/ml
2,38 * 105
CFU/ml
(≙ 22,24 %)
1,68 * 105
CFU/ml
(≙ 104,67 %)
5,63 * 105
CFU/ml
(≙ 52,62 %)
1,01 * 106
CFU/ml
(≙ 100 %)
9,63 * 105
CFU/ml
(≙ 95,35 %)
9,75 * 104
CFU/ml
(≙ 9,65 %)
1,17 * 106
CFU/ml
(≙ 100 %)
9,1 * 105
CFU/ml
(≙ 77,78 %)
4,5 * 104
CFU/ml
(≙ 3,85 %)
100
91,43
50,3
20,11
2 * 10
CFU/ml
(≙ 17,09 %)
(≙ 10,4 %)
(≙ 15,7 %)
14,4
7,25 * 104
CFU/ml
(≙ 7,18 %)
7,25 * 104
CFU/ml
(≙ 6,78 %)
7,11
Anhang
N. brasiliensis
ATCC 19296
Assay 1
Assay 2
Assay 3
Wachstum (%)
N. brasiliensis
ATCC 19296
Assay 1
Assay 2
Assay 3
Wachstum (%)
N. brasiliensis
ATCC 19296
Assay 1
Assay 2
Assay 3
Kontrolle
1
1,18 * 106
CFU/ml
(≙ 100 %)
1,13 * 106
CFU/ml
(≙ 95,76 %)
1,68 * 106
CFU/ml
(≙ 100 %)
1,4 * 106
CFU/ml
(≙ 83,33 %)
1,44 * 106
CFU/ml
(≙ 100 %)
69
LAP (µg/ml)
8
1,3 * 106
CFU/ml
(≙ 110,17 %)
16
32
2,05 * 106
CFU/ml
(≙ 173,73 %)
7,1 * 106
CFU/ml
(≙ 601,69 %)
1,14 * 106
CFU/ml
(≙ 67,86 %)
2,6 * 106
CFU/ml
(≙ 154,76 %)
6 * 106 CFU/ml
(≙ 357,14 %)
1,72 * 106
CFU/ml
(≙ 119,44 %)
1,68 * 106
CFU/ml
(≙ 116,67 %)
2,54 * 106
CFU/ml
(≙ 176,39 %)
100
99,51
98,23
168,29
507,34
Kontrolle
6,93 * 105
CFU/ml
(≙ 100 %)
1
6,88 * 105
CFU/ml
(≙ 99,28 %)
TAP (µg/ml)
8
1,24 * 106
CFU/ml
(≙ 178,93 %)
16
3,65 * 106
CFU/ml
(≙ 526,7 %)
32
3,75 * 106
CFU/ml
(≙ 541,13 %)
6,15 * 105
CFU/ml
(≙ 100 %)
4,73 * 105
CFU/ml
(≙ 76,91 %)
1,9 * 106
CFU/ml
(≙ 308,94 %)
2,95 * 106
CFU/ml
(≙ 479,67 %)
3,8 * 106
CFU/ml
(≙ 617,89 %)
7,12 * 105
CFU/ml
(≙ 100 %)
5,11 * 105
CFU/ml
(≙ 71,77 %)
2,54 * 106
CFU/ml
(≙ 356,74 %)
3,61 * 106
CFU/ml
(≙ 507,02 %)
100
82,65
281,54
504,46
8,11 * 106
CFU/ml
(≙ 563,19 %)
3,67 * 106
CFU/ml
(≙ 515,45 %)
558,15
Levofloxacin (µg/ml)
Kontrolle
4,85 * 106 CFU/ml
(≙ 100 %)
7,38 * 105 CFU/ml
(≙ 100 %)
2,9 * 106 CFU/ml
(≙ 100 %)
Assay 4
4,08 * 105 CFU/ml
(≙ 100 %)
Assay 5
1,6 * 106 CFU/ml
(≙ 100 %)
Wachstum (%)
100
1
8
32
6
3,9 * 10 CFU/ml
(≙ 80,41 %)
5
7,9 * 10 CFU/ml
(≙ 16,29 %)
8,75 * 104 CFU/ml
(≙ 1,8 %)
4,98 * 105 CFU/ml
(≙ 67,48 %)
1,25 * 105 CFU/ml
(≙ 16,94 %)
5,75 * 104 CFU/ml
(≙ 7,79 %)
2,05 * 106 CFU/ml
(≙ 70,69 %)
4,98 * 105 CFU/ml
(≙ 17,17 %)
8,5 * 104 CFU/ml
(≙ 2,93 %)
4 * 105 CFU/ml
(≙ 98,04 %)
1,88 * 105 CFU/ml
(≙ 46,08 %)
1 * 104 CFU/ml
(≙ 2,45 %)
3,5 * 105 CFU/ml
(≙ 21,88 %)
4 * 104 CFU/ml
(≙ 2,5 %)
23,67
3,5
1,13 * 106 CFU/ml
(≙ 70,63 %)
77,45
Anhang
N. brasiliensis
ATCC 19296
Assay 1
Assay 2
Assay 3
Wachstum
(%)
N. brasiliensis
ATCC 19296
Assay 1
Assay 2
Assay 3
Wachstum
(%)
DPY (µg/ml)
8
16
1,65 * 105
1,4 * 105
CFU/ml
CFU/ml
(≙ 200 %)
(≙ 169,7 %)
Kontrolle
1
8,25 * 104
CFU/ml
(≙ 100 %)
1,15 * 105
CFU/ml
(≙ 139,39 %)
1,21 * 106
CFU/ml
(≙ 100 %)
1,33 * 106
CFU/ml
(≙ 109,92%)
1,23 * 106
CFU/ml
(≙ 100 %)
1,55 * 106
CFU/ml
100
Kontrolle
70
1,51 * 106
CFU/ml
(≙ 124,79 %)
1,28 * 106
CFU/ml
(≙ 105,79 %)
32
64
1,45 * 105
CFU/ml
1,55 * 105
CFU/ml
(≙ 175,76 %)
(≙ 187,88 %)
1,9 * 106
CFU/ml
1,41 * 106
CFU/ml
(≙ 157,02 %)
(≙ 116,53 %)
(≙ 126,02 %)
1,42 * 106
CFU/ml
(≙ 115,45 %)
1,68 * 106
CFU/ml
(≙ 136,59 %)
(≙ 138,21 %)
125,11
146,75
137,36
157
DPY
(32 µg/ml)
Substanzen
Mix +
hBD-3
hBD-3
(32 µg/ml)
(32 µg/ml)
3,55 * 106
2,15 * 106
CFU/ml
CFU/ml
1,17 * 106
CFU/ml
(≙ 100 %)
(≙ 111,11 %)
(≙ 303,42 %)
1,01 * 106
CFU/ml
(≙ 100 %)
1,01 * 106
CFU/ml
(≙ 100 %)
1,07 * 106
CFU/ml
(≙ 100 %)
1,03 * 106
CFU/ml
(≙ 96,26 %)
100
102,46
1,3 * 106
CFU/ml
1,7 * 106
CFU/ml
LL-37
(32 µg/ml)
2,08 * 106
CFU/ml
(≙ 169,11 %)
157,84
Mix +
LL-37
Mix
(32 µg/ml)
8,4 * 106
CFU/ml
6,15 * 106
CFU/ml
1,22 * 106
CFU/ml
(≙ 183,76 %)
(≙ 717,95 %)
(≙ 525,64 %)
(≙ 104,27 %)
4,2 * 106
CFU/ml
3,4 * 106
CFU/ml
7,8 * 106
CFU/ml
5,3 * 106
CFU/ml
7,8 * 106
CFU/ml
(≙ 415,84 %)
(≙ 336,63 %)
(≙ 772,28 %)
(≙ 524,75 %)
(≙ 772,28 %)
4,35 * 106
CFU/ml
3,45 * 106
CFU/ml
8,75 * 106
CFU/ml
4,8 * 106
CFU/ml
5,7 * 106
CFU/ml
(≙ 406,54 %)
(≙ 322,43 %)
(≙ 817,76 %)
(≙ 448,6 %)
(≙ 532,71 %)
375,27
280,94
769,32
499,66
469,75
Danksagung
71
8 Danksagung
___________________________________________________________________
Mein Dank gilt allen, die mich in jeglicher Form während meiner Doktoranden-Zeit
unterstützt haben.
Meinem Doktorvater Prof. Dr. Winfried V. Kern danke ich für die Überlassung des
interessanten Themas, die gute Betreuung sowie die wertvolle Kritik während der
verschiedenen Arbeitsphasen.
Prof. Dr. Reinhard Berner danke ich für die Übernahme des Zweitgutachtens.
Meinem direkten Ansprechpartner für alle erdenklichen Fragen, Dr. Siegbert Rieg, danke ich
für die überragend gute Betreuung der Arbeit. Vor allem schätzte ich seine ständige
Verfügbarkeit und hohe Fachkenntnis, die mir beim Durchführen und Schreiben der Arbeit
sehr hilfreich war.
Ich bedanke mich bei Dr. Hubert Kalbacher (Universitätsklinikum Tübingen) für die
Synthese und Bereitstellung der antimikrobiellen Peptide LL-37, Indolicidin, LAP, TAP und
DPY.
Dem gesamten Forschungsteam der Infektiologie Freiburg, bestehend aus PD Dr. Dirk
Wagner, Dr. Jürgen Bohnert, Dr. Anja Huth (nicht mehr im Hause), Sabine Schuster, Eva
Fähnrich (nicht mehr im Hause) und Martina Vavra danke ich für die wertvollen Ratschläge
in den Laborbesprechungen und für die angenehme Arbeitsatmosphäre.
Insbesondere danke ich:
Eva Fähnrich für die Einarbeitung in die verschiedenen Arbeitstechniken im Labor.
Dr. Anja Huth für die Vermittlung der Killing-Assay-Technik und für Ihre wertvollen
Ratschläge.
Sabine Schuster und Martina Vavra für die vielen Hilfen im Laboralltag.
Dr. Annerose Serr (Medizinische Mikrobiologie, Universitätsklinikum Freiburg) für die
Durchführung der 16S-rRNA Gensequenzierung und der Anfertigung der Gram-Präparate von
Nocardia nova.
Darüber hinaus danke ich meinen Eltern, die mich bei allen meinen Plänen unterstützen.
Besonders bedanken möchte ich mich dafür, dass sie es mir ermöglicht haben, Medizin
studieren zu können.
Lebenslauf
72
9 Lebenslauf
___________________________________________________________________________
Die Seiten 72 – 73 enthalten persönliche Daten. Sie sind deshalb nicht Bestandteil der OnlineVeröffentlichung.
Lebenslauf
73
Die Seiten 72 – 73 enthalten persönliche Daten. Sie sind deshalb nicht Bestandteil der OnlineVeröffentlichung.