Rep1_Gen Prakt_2014_Kurs C
Werbung
Genetisches Praktikum 2014 (20160) Organisatorischer Ablauf: Morgens: Repetitorium Kurs A & B: H10; Kurs C: H12, Beginn 9:00 (s.t.) (Theorie zu Versuchen, Bezug zur Vorlesung, Gelegenheit zum Fragen!) Anschließend: Praktischer Teil im großen Mikroskopiersaal Mittagspause variabel (siehe Zeitplan) Ende zwischen 16:00 und 18:00 Uhr Skript: Versuche (A – O) sind übergeordneten Themen zugeordnet und unterteilt in: Einführung, Aufgabe, Material (Wo finde ich was wie beschriftet?), Vorbereitung, Durchführung, Auswertung, Literatur, Gruppeneinteilung Zeitplan: Verschachtelung der Versuche (s.S. 40); selbstständiges Arbeiten » Vorherige Beschäftigung mit Skript ist wichtig, um Überblick zu behalten und zu wissen, was zu tuen ist! Genetisches Praktikum 2014 (20160) Protokolle keine Abgabe von Protokollen; Auswertungen gemeinsam im Kurs; Protokollieren der Ergebnisse sowie gute Vor- und Nachbereitung sind essentiell, um Überblick zu behalten Mitzubringen sind: Laborkittel Taschenrechner Anwesenheitspflicht - maximal ein Fehltag Zuordnung: Sitzplätze zu Gruppennamen: maximal 40 Zweiergruppen Ausgehend von A1 die Plätze bitte lückenlos füllen! H H H H H Praktikumsversuche Allgemeines A. Plasmid-Curing B. F-Plasmid-Nachweis C. Komplementations-Test mit rII-Mutanten des Phagen T4 D. PCR-Fingerprint mittels STR-Analyse Methoden E. Titerbestimmung bei Bakterienkulturen F. β-Galaktosidase-Test Mutagenese und DNA-Reparatur G. Isolierung und Identifizierung von Auxotrophie-Mutanten H. Nachweis der Transposon-Mutagenese des Plasmids pTS115 I. Ames-Test Projekt: Klonierung eines Genfragments J. PCR K. Gelelektrophorese L. Gelextraktion & Restriktionsverdau M. Ligation N. Transformation O. Plasmid-Präparation Versuch E Modellorganismus Escherichia coli • benannt seinem Entdecker Theodor Escherich (1919) • kommt im menschlichen und tierischen Darm vor • Familie der Enterobacteriaceae (griech. „enteron“: Darm) • Gram-negativ, stäbchenförmig, peritrich begeißelt • einer der am besten untersuchten Organismen der Welt • 4,6 Mb zirkuläres Chromosom; ca. 4000 Gene • Plasmide: kleine, zirkuläre, autonom replizierende, extrachromosomale DNA-Moleküle Titerbestimmung bei Bakterienkulturen (Wachstumskurve) Versuch E In der Molekularbiologie werden Bakterien z.B. verwendet: - zur Vermehrung rekombinanter DNA-Moleküle - zur Expression von Proteinen Am häufigsten verwendet: Escherichia coli - K12 - harmloser Stamm - mikrobiologisch, biochemisch und genetisch sehr gut untersucht ("Haustierchen aller Molekularbiologen") Kultivierung im Labor - meist in Komplett- oder Vollmedium: z.B. LB (Lysogeny broth, G. Bertani 1951) - Trypton (Pepton): enzymatisch verdaute Proteine (Aminosäurequelle) - Hefeextrakt: Vitamine, Spurenelemente - NaCl: Osmolarität - Flüssigkultur oder feste Nährböden durch Zugabe von Agar - Minimalmedium: def. Zusammensetzung; zur Identifikation von Auxotrophien (s.u.) Versuch E Bestimmung der Bakterienzahl Gesamtzellzahl: - Bakterien sind sehr klein (≈ 1 µm), für das blosse Auge nicht zu erkennen - Auszählen in dünner Schicht unter dem Mikroskop (Thoma Zählkammer) - Automatisiert durch elektrisches Zählgerät, basierend auf Leitfähigkeitsverlust einer Elektrolytlösung beim Durchtritt eines Bakteriums durch eine enge Öffnung (Coulter-Counter) - Nachteil: lebende von toten Bakterien nicht ohne zusätzliche Färbung zu unterscheiden Versuch E Bestimmung der Bakterienzahl Lebendzellzahl: - Koch‘sches Plattengussverfahren - Spatelplattenverfahren - jedes lebende Bakterium führt zur Bildung einer Kolonie bzw. jede Kolonie geht auf ein einzelnes Bakterium zurück - cfu = colony forming unit - Titer = cfu / ml Kultur - Nachteil: Inkubationszeit von mindestens einem Tag oder Glasperlen Versuch E Bestimmung der Bakterienzahl Indirekte Methoden: - Trübungsmessung bei einer bestimmten Wellenlänge (578 nm) - Messung der Lichtabsorption und Lichtstreuung als "optische Dichte" (OD) - lineare Proportionalität nur im Bereich OD ≈ 0,05 – 0,5 (Beschattungseffekte) - schnelle Methode, aber relativ unempfindlich (noch keine Trübung bei 106 cfu/ml » geringe Zellzahlen schlecht messbar - muss jeweils geeicht werden, da sehr von der Größe und Gestalt der Bakterien und dem jeweiligen Gerät abhängig (Eichkurve) Wachstum in statischer Kultur Versuch E Wachstum bestimmt durch: Temperaturoptimum, aerobe / anaerobe Bedingungen Wuchstoffbedürfnis Bereich direkter Proportionalität zwischen Titer und OD lag-Phase: Anlaufphase, Anpassung an neue Bedingungen durch ansteigende RNA-, Ribosomen- und Enzymsynthese log-Phase: exponentielles Wachstum konstante, maximale Teilungsrate abhängig von Bakterienart und Wachstumsbedingungen stationäre Phase: maximale Bakteriendichte, Ausbeute, Ertrag bestimmter Faktor aufgebraucht, Übergang allmählich, zunächst Wachstumsabnahme, schließlich kein Wachstum Absterbephase: Autolyse Versuch E Bestimmung der Bakterienzahl in 0,9 ml Saline Warum nicht 86 × 100 = 8,6 × 103? Titer bezieht sich immer auf 1 ml! 0,9 ml Saline Tragen Sie lg (Titer) gegen die Zeit auf » Gerade? War Ihre Kultur in der log-Phase? Versuch E Teil A: Logarithmisch wachsende E. coli-Kultur Bestimmung des Titers [cfu/ml] ...& der Optischen Dichte bei 578 nm OD578nm von 1 entspricht einem Titer von: _____cfu/ml Teil B: Logarithmisch wachsende E. coli-Kulturen (zwei versch. Stämme in Gegenwart unterschiedl. Zusätze) Bestimmung der β-Gal Aktivität [pkat/ml] ...& der OD578 nm pkat/ml cfu/ml = pkat/cfu Bestimmung der spezifischen β-Gal Aktivität [pkat/cfu] Versuch E Exponen'elles Wachstum Die Zunahme der Bakterien x (Titer oder OD578nm) über die Zeit t: k = Wachstumskonstante (für jeden Zelltyp/Stamm charakterisFsch) Wachstum durch Zweiteilung 20 → 21 → 22 → 23 →24 → 25 → 26 → ..... → 2n (n = Anzahl der Zellteilungen) ld = dualer Logarithmus, d.h. Basis: 2 Versuch E Experimentelle Ermi4lung der Wachstumskonstante k: OD578nm zum Zeitpunkt t2 OD578nm zum Zeitpunkt t1 z.B. = 120 min z.B. 1100 Uhr ... übrigens gilt: 1 tV = k z.B. 900 Uhr tV = Genera'ons-­‐/Verdopplungszeit in min Annahme: Sie haben die Wachstumskonstante Ihres Bakterienstamms experimentell auf k = 0,035 min-­‐1 bes'mmt. ...und wozu ist das gut? » Prak'sche Anwendungen im Labor: Versuch E Beispiel 1: Ihre Bakterienkultur hat eine OD578nm von 0,05. Sie benöFgen aber eine OD578nm von 1 (z.B. um dann durch IPTG-­‐Zugabe die Expression Ihres Lieblingsproteins zu induzieren). Können Sie noch in die Mensa gehen oder müssen Sie hungern, damit Ihre Kultur nicht zu dicht wächst? ...wenn Sie den Zeitpunkt Ihrer ersten Messung gleich Null setzen Ihr Kollege (der die Formel nicht kennt) bi]et Sie, ihm eine Semmel mitzubringen... Versuch E Beispiel 2: Ausgehend von einer Vorkultur eines Hefestamms mit k = 0,008 min-­‐1 wollen Sie am Abend eine größere Kultur so animpfen, dass diese am nächsten Morgen eine OD578nm von 2 hat und Sie gleich mit Ihrem Experiment loslegen können. Welche OD578nm müssen Sie einstellen, wenn Sie (wie für den emsigen Forscher üblich) nach 8 Stunden wieder im Labor sind? Ihr Kollege (der mit der Semmel) impc viel zu dicht an und verliert den nächsten Tag... Versuch E Bei der Titerbestimmung sollen Sie Verdünnungsreihen mithilfe von Mikroliterpipetten (auch Kolbenhubpipetten genannt) herstellen, daher... Versuch E Versuch E Versuch E Welche Volumina sind eingestellt? Welche Einstellung ist falsch? Versuch G Isolierung und Identifizierung von Auxotrophie Mutanten Ein durch eine Mutation hervorgerufener Phänotyp lässt Rückschlüsse auf die Funktion des mutierten Gens zu. Mutation - ungerichtete, zufällige Veränderung des Erbmaterials spontan - selten, ca. 10-8 pro Basenpaar, Zelle und Generation induziert (Erhöhung der Effizienz in Mutagenese Screens) - physikalisch: Strahlung - chemisch: mutagene Substanzen (s. Ames Test, I) - biologisch: durch Transposons (s. Versuch H) Versuch G Auxotrophe Bakterien als Beispiele für Mutanten Auxotrophie Wuchsstoffbedürftigkeit auxotrophe Bakterien können auf Minimalmedium nicht wachsen, sondern benötigen bestimmte Wuchsstoffe (Aminosäuren, Vitamine, Purinbasen etc.) Prototrophie alle Zellbestandteile können selbst hergestellt werden prototrophe Bakterien können auf Minimalmedium (anorganische Salze; Kohlenstoffquelle) wachsen Auxotrophie wird meist hervorgerufen durch Mutation in einem Gen, das für ein Enzym des Aufbaustoffwechsels kodiert, wobei Stoffwechselwege meist mehrere Schritte beinhalten. Vorstufe A Enzym 1 Gen 1 Vorstufe B Enzym 2 Gen 2 Vorstufe C Enzym 3 Gen 3 Endprodukt Versuch G Wechselwirkung von Genen in Stoffwechselwegen verschiedene Arginin auxotrophe Mutanten lassen sich unterschiedlich supplementieren Vorstufe Enzym 1 arg1 Ornithin Enzym 2 arg2 Citrullin Enzym 3 Arginin arg3 ...so können die in einem Stoffwechselweg liegenden Gene hierachisch geordnet werden! Versuch G Auxotrophe Bakterien als Beispiele für Mutanten Replika Plattierung nach Lederberg: Versuch G Mutagenese einer Bakterienkultur Teil A: Isolierung von Auxotrophie-Mutanten Verdünnungsreihe erstellen Ausplattieren auf Vollmedium Replika-Plattieren auf Voll- und Minimalmedium Teil B: Identifikation versch. Auxotrophien mittels Spot-Test (Auxanographie) Ordnen der Mutanten innerhalb einzelner Stoffwechselwege mittels Wachstumsanalyse in Gegenwart versch. Vorstufen Versuch G Zu Beginn von Versuch G (Isolierung von Auxotrophie-Muanten) sollen Sie eine Verdünnungsreihe mithilfe von Glaspipetten herstellen, daher... Benutzung von Glaspipetten Pipettierhilfen benutzen; nicht mit dem Mund pipettieren Verletzungsgefahr beim Einstecken in die Pipettierhilfe » Glaspipette optisch auf Haarrisse überprüfen » Glaspipette nahe am Schaft anfassen Glaspipetten sind steril; kein „durch die Flamme ziehen“ nötig Nur die Spitze in die zu pipettierende Flüssigkeit eintauchen Außen anhaftende Flüssigkeit an der Gefäßwand abstreichen Glaspipetten sind auf Auslauf geeicht Benutzte Pipetten nicht in die Eimer „schmeißen“
