Rep1_Gen Prakt_2014_Kurs C

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Genetisches Praktikum 2014 (20160)
Organisatorischer Ablauf:
Morgens: Repetitorium Kurs A & B: H10; Kurs C: H12, Beginn 9:00 (s.t.)
(Theorie zu Versuchen, Bezug zur Vorlesung, Gelegenheit zum Fragen!)
Anschließend: Praktischer Teil im großen Mikroskopiersaal
Mittagspause variabel (siehe Zeitplan)
Ende zwischen 16:00 und 18:00 Uhr
Skript: Versuche (A – O) sind übergeordneten Themen zugeordnet und unterteilt in:
Einführung, Aufgabe, Material (Wo finde ich was wie beschriftet?),
Vorbereitung, Durchführung, Auswertung, Literatur, Gruppeneinteilung
Zeitplan: Verschachtelung der Versuche (s.S. 40); selbstständiges Arbeiten »
Vorherige Beschäftigung mit Skript ist wichtig, um Überblick zu behalten
und zu wissen, was zu tuen ist!
Genetisches Praktikum 2014 (20160)
Protokolle
keine Abgabe von Protokollen; Auswertungen gemeinsam im Kurs;
Protokollieren der Ergebnisse sowie gute Vor- und Nachbereitung sind
essentiell, um Überblick zu behalten
Mitzubringen sind:
Laborkittel
Taschenrechner
Anwesenheitspflicht - maximal ein Fehltag
Zuordnung:
Sitzplätze zu
Gruppennamen:
maximal 40
Zweiergruppen
Ausgehend
von A1 die
Plätze bitte
lückenlos
füllen!
H
H
H
H
H
Praktikumsversuche
Allgemeines
A. Plasmid-Curing
B. F-Plasmid-Nachweis
C. Komplementations-Test mit rII-Mutanten des Phagen T4
D. PCR-Fingerprint mittels STR-Analyse
Methoden
E. Titerbestimmung bei Bakterienkulturen
F. β-Galaktosidase-Test
Mutagenese und DNA-Reparatur
G. Isolierung und Identifizierung von Auxotrophie-Mutanten
H. Nachweis der Transposon-Mutagenese des Plasmids pTS115
I. Ames-Test
Projekt: Klonierung eines Genfragments
J. PCR
K. Gelelektrophorese
L. Gelextraktion & Restriktionsverdau
M. Ligation
N. Transformation
O. Plasmid-Präparation
Versuch E
Modellorganismus Escherichia coli
•  benannt seinem Entdecker Theodor Escherich (1919)
•  kommt im menschlichen und tierischen Darm vor
•  Familie der Enterobacteriaceae (griech. „enteron“: Darm)
•  Gram-negativ, stäbchenförmig, peritrich begeißelt
•  einer der am besten untersuchten Organismen der Welt
•  4,6 Mb zirkuläres Chromosom; ca. 4000 Gene
•  Plasmide:
kleine, zirkuläre, autonom replizierende, extrachromosomale DNA-Moleküle
Titerbestimmung bei Bakterienkulturen
(Wachstumskurve)
Versuch E
In der Molekularbiologie werden Bakterien z.B. verwendet:
- zur Vermehrung rekombinanter DNA-Moleküle
- zur Expression von Proteinen
Am häufigsten verwendet: Escherichia coli - K12
- harmloser Stamm
- mikrobiologisch, biochemisch und genetisch sehr gut untersucht
("Haustierchen aller Molekularbiologen")
Kultivierung im Labor
- meist in Komplett- oder Vollmedium: z.B. LB (Lysogeny broth, G. Bertani 1951)
- Trypton (Pepton): enzymatisch verdaute Proteine (Aminosäurequelle)
- Hefeextrakt: Vitamine, Spurenelemente
- NaCl: Osmolarität
- Flüssigkultur oder
feste Nährböden durch Zugabe von Agar
- Minimalmedium: def. Zusammensetzung; zur Identifikation von Auxotrophien (s.u.)
Versuch E
Bestimmung der Bakterienzahl
Gesamtzellzahl:
- Bakterien sind sehr klein (≈ 1 µm), für das blosse Auge nicht zu erkennen
- Auszählen in dünner Schicht unter dem Mikroskop (Thoma Zählkammer)
- Automatisiert durch elektrisches Zählgerät, basierend auf
Leitfähigkeitsverlust einer Elektrolytlösung beim Durchtritt eines
Bakteriums durch eine enge Öffnung (Coulter-Counter)
- Nachteil: lebende von toten Bakterien nicht
ohne zusätzliche Färbung zu unterscheiden
Versuch E
Bestimmung der Bakterienzahl
Lebendzellzahl:
- Koch‘sches Plattengussverfahren
- Spatelplattenverfahren
- jedes lebende Bakterium führt zur Bildung einer Kolonie
bzw. jede Kolonie geht auf ein einzelnes Bakterium zurück
- cfu = colony forming unit
- Titer = cfu / ml Kultur
- Nachteil: Inkubationszeit von mindestens einem Tag
oder Glasperlen
Versuch E
Bestimmung der Bakterienzahl
Indirekte Methoden:
- Trübungsmessung bei einer bestimmten Wellenlänge (578 nm)
- Messung der Lichtabsorption und Lichtstreuung als "optische Dichte" (OD)
- lineare Proportionalität nur im Bereich OD ≈ 0,05 – 0,5
(Beschattungseffekte)
- schnelle Methode, aber relativ unempfindlich (noch keine Trübung bei 106 cfu/ml
» geringe Zellzahlen schlecht messbar
- muss jeweils geeicht werden, da sehr von der Größe und Gestalt der Bakterien und
dem jeweiligen Gerät abhängig (Eichkurve)
Wachstum in statischer Kultur
Versuch E
Wachstum bestimmt durch: Temperaturoptimum, aerobe / anaerobe Bedingungen
Wuchstoffbedürfnis
Bereich direkter Proportionalität
zwischen Titer und OD
lag-Phase: Anlaufphase, Anpassung an neue Bedingungen durch
ansteigende RNA-, Ribosomen- und Enzymsynthese
log-Phase: exponentielles Wachstum
konstante, maximale Teilungsrate
abhängig von Bakterienart und Wachstumsbedingungen
stationäre Phase: maximale Bakteriendichte, Ausbeute, Ertrag
bestimmter Faktor aufgebraucht, Übergang allmählich,
zunächst Wachstumsabnahme, schließlich kein Wachstum
Absterbephase: Autolyse
Versuch E
Bestimmung der Bakterienzahl
in 0,9 ml Saline
Warum nicht 86 × 100 = 8,6 × 103?
Titer bezieht sich immer auf 1 ml!
0,9 ml Saline
Tragen Sie lg (Titer) gegen die Zeit auf » Gerade? War Ihre Kultur in der log-Phase?
Versuch E
Teil A:
Logarithmisch wachsende E. coli-Kultur
Bestimmung des Titers [cfu/ml]
...& der Optischen Dichte bei 578 nm
OD578nm von 1 entspricht einem Titer von: _____cfu/ml
Teil B:
Logarithmisch wachsende E. coli-Kulturen
(zwei versch. Stämme in Gegenwart unterschiedl. Zusätze)
Bestimmung der β-Gal Aktivität
[pkat/ml]
...& der OD578 nm
pkat/ml
cfu/ml
= pkat/cfu
Bestimmung der spezifischen β-Gal Aktivität [pkat/cfu]
Versuch E
Exponen'elles Wachstum Die Zunahme der Bakterien x (Titer oder OD578nm) über die Zeit t: k = Wachstumskonstante (für jeden Zelltyp/Stamm charakterisFsch) Wachstum durch Zweiteilung
20 → 21 → 22 → 23 →24 → 25 → 26 → ..... → 2n
(n = Anzahl der Zellteilungen)
ld = dualer Logarithmus, d.h. Basis: 2
Versuch E
Experimentelle Ermi4lung der Wachstumskonstante k: OD578nm zum Zeitpunkt t2 OD578nm zum Zeitpunkt t1 z.B. = 120 min z.B. 1100 Uhr ... übrigens gilt: 1
tV =
k
z.B. 900 Uhr tV = Genera'ons-­‐/Verdopplungszeit in min Annahme: Sie haben die Wachstumskonstante Ihres Bakterienstamms experimentell auf k = 0,035 min-­‐1 bes'mmt. ...und wozu ist das gut? » Prak'sche Anwendungen im Labor: Versuch E
Beispiel 1: Ihre Bakterienkultur hat eine OD578nm von 0,05. Sie benöFgen aber eine OD578nm von 1 (z.B. um dann durch IPTG-­‐Zugabe die Expression Ihres Lieblingsproteins zu induzieren). Können Sie noch in die Mensa gehen oder müssen Sie hungern, damit Ihre Kultur nicht zu dicht wächst? ...wenn Sie den Zeitpunkt Ihrer ersten Messung gleich Null setzen Ihr Kollege (der die Formel nicht kennt) bi]et Sie, ihm eine Semmel mitzubringen... Versuch E
Beispiel 2: Ausgehend von einer Vorkultur eines Hefestamms mit k = 0,008 min-­‐1 wollen Sie am Abend eine größere Kultur so animpfen, dass diese am nächsten Morgen eine OD578nm von 2 hat und Sie gleich mit Ihrem Experiment loslegen können. Welche OD578nm müssen Sie einstellen, wenn Sie (wie für den emsigen Forscher üblich) nach 8 Stunden wieder im Labor sind? Ihr Kollege (der mit der Semmel) impc viel zu dicht an und verliert den nächsten Tag... Versuch E
Bei der Titerbestimmung sollen Sie Verdünnungsreihen mithilfe von
Mikroliterpipetten (auch Kolbenhubpipetten genannt) herstellen, daher...
Versuch E
Versuch E
Versuch E
Welche Volumina sind eingestellt?
Welche Einstellung ist falsch?
Versuch G
Isolierung und Identifizierung von Auxotrophie Mutanten
Ein durch eine Mutation hervorgerufener Phänotyp lässt
Rückschlüsse auf die Funktion des mutierten Gens zu.
Mutation
- ungerichtete, zufällige Veränderung des Erbmaterials
spontan
- selten, ca. 10-8 pro Basenpaar, Zelle und Generation
induziert (Erhöhung der Effizienz in Mutagenese Screens)
- physikalisch: Strahlung
- chemisch: mutagene Substanzen (s. Ames Test, I)
- biologisch: durch Transposons (s. Versuch H)
Versuch G
Auxotrophe Bakterien als Beispiele für Mutanten
Auxotrophie
Wuchsstoffbedürftigkeit
auxotrophe Bakterien können auf Minimalmedium nicht
wachsen, sondern benötigen bestimmte Wuchsstoffe
(Aminosäuren, Vitamine, Purinbasen etc.)
Prototrophie
alle Zellbestandteile können selbst hergestellt werden
prototrophe Bakterien können auf Minimalmedium
(anorganische Salze; Kohlenstoffquelle) wachsen
Auxotrophie wird meist hervorgerufen durch Mutation in einem Gen, das für
ein Enzym des Aufbaustoffwechsels kodiert, wobei Stoffwechselwege meist
mehrere Schritte beinhalten.
Vorstufe A
Enzym 1
Gen 1
Vorstufe B
Enzym 2
Gen 2
Vorstufe C
Enzym 3
Gen 3
Endprodukt
Versuch G
Wechselwirkung von Genen in Stoffwechselwegen
verschiedene Arginin auxotrophe Mutanten lassen sich unterschiedlich supplementieren
Vorstufe
Enzym 1
arg1
Ornithin
Enzym 2
arg2
Citrullin
Enzym 3
Arginin
arg3
...so können die in einem Stoffwechselweg liegenden Gene hierachisch geordnet werden!
Versuch G
Auxotrophe Bakterien als Beispiele für Mutanten
Replika Plattierung nach Lederberg:
Versuch G
Mutagenese einer Bakterienkultur
Teil A:
Isolierung von Auxotrophie-Mutanten
Ÿ Verdünnungsreihe erstellen
Ÿ Ausplattieren auf Vollmedium
Ÿ Replika-Plattieren auf Voll- und Minimalmedium
Teil B:
Identifikation versch. Auxotrophien mittels Spot-Test (Auxanographie)
Ordnen der Mutanten innerhalb einzelner Stoffwechselwege
mittels Wachstumsanalyse in Gegenwart versch. Vorstufen
Versuch G
Zu Beginn von Versuch G (Isolierung von Auxotrophie-Muanten) sollen Sie
eine Verdünnungsreihe mithilfe von Glaspipetten herstellen, daher...
Benutzung von Glaspipetten
Pipettierhilfen benutzen; nicht mit dem Mund pipettieren
Verletzungsgefahr beim Einstecken in die Pipettierhilfe
» Glaspipette optisch auf Haarrisse überprüfen
» Glaspipette nahe am Schaft anfassen
Glaspipetten sind steril; kein „durch die Flamme ziehen“ nötig
Nur die Spitze in die zu pipettierende Flüssigkeit eintauchen
Außen anhaftende Flüssigkeit an der Gefäßwand abstreichen
Glaspipetten sind auf Auslauf geeicht
Benutzte Pipetten nicht in die Eimer „schmeißen“
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