2 - Paul-Ehrlich
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Ergebnisse des Externen Qualitätssicherungsprogramms zur Detektion bakterieller Kontamination in Thrombozytenkonzentraten PD Dr. Jens Dreier KOLT 2015 28. – 29. April 2015 Herz- und Diabeteszentrum NRW Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum Institut für Laboratoriums- und Transfusionsmedizin Bad Oeynhausen Einleitung Pharmazeutische Blutprodukte Blutprodukte zelluläres Blutprodukt azelluläres Blutprodukt Erythrozytenkonzentrat (EK) therapeutisches Frischplasma (FFP) Thrombozytenkonzentrat (TK) 30 • EK TK Haltbarkeit: 42 Tage 0.24 % 4+1 Tage Lagerung: 4°C 22°C Bakterielle Kontamination pro 10.000 Produkt: 20 0.13 % 10 Bakterielle Kontaminationen stellen ein um den Faktor 10–100 höheres FFP Restinfektionsrisiko dar als Viren 36 Monate • - 30°C besonders gefährdet sind Thrombozytenkonzentrate (Lagerung aerob bei 22°C ± 2°C = gute Wachstumsbedingungen für Bakterien) 0.07 % EK TK FFP mod. Walther‐Wenke et al., Vox Sang (2006) Maßnahmen zur Risikoreduktion • 1997 – Votum 16: Mindestanforderungen zur Sterilitätstestung von Blutkomponenten • 2002 – Votum 27: Einführung des Predonation Samplings • 2008 – Votum 38: Festlegung der Haltbarkeitsfrist von Thrombozytenkonzentraten mit dem Ziel der Reduktion lebensbedrohlicher septischer Transfusionsreaktionen durch bakterielle Kontamination 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 RBC PPC APC FFP 4 (2) 0 0 0 5 (2) 3 (1) 0 4 1 3 1 0 0 1 3 (1) 0 4 1 3 0 1 3 3 (1) 0 2 3 (1) 2 0 2 1 2 (1) 1 2002: Einführung des Pre‐donation sampling 3 4 (1) 3 0 2 3 3 (1) 0 6 1 1 0 3 2 1 0 0 1 (1) 1 0 1 0 2 0 4 2 (1) 2 0 2008: AK‐Blut‐Empfehlung verkürzte TK‐Haltbarkeit Im Zeitraum von 1997–2011 wurden 13 tödlich verlaufende bakterielle Übertragungen durch Blutkomponenten gemeldet (4x EK, 9x TK): 1 Toter pro ~620 000 TK‐Einheiten PEI, Heiden & Doll (mod.) Einleitung Bakterieller Titer und Transfusionsreaktion Bacillus cereus, Staphylococcus (Gram‐pos.) Gram‐neg. Kritische Titer > 10 E5 CFU/ml Transfusionsreaktionen sind vor allem titer-, aber auch spezies- und stammabhängig (und Patienten-)! Jacobs et al. 2008 CID Wachstumskinetik von Bakterien in TKs frühe späte Probenahme Bakterientiter (CFU / TK) Diagnostisches Fenster 108 (hohes Risiko des Sampling Errors) 106 4 3 1 Selbst‐Sterilisation 2 Bakterien persistieren, ohne Wachstum 3 Bakterien‐Wachstum (schnell‐ bzw. langsam wachsend) transfusionsmed. kritischer Bakterientiter 104 102 10‐100 Bakterien/TK 2 Untere Nachweisgrenze der Schnell‐Methoden 1 Tag 1 (NAT: 20 , BF: 300, PGD: 10E4 CFU/ml) Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Zeit nach Spende Aktuelle Übersichtsarbeit Zugelassene Testverfahren zur Verlängerung der TK-Haltbarkeit Janetzko K, Schmidt M. Transfusionsmedizin 2015; 5: 27–30 KONZEPT Externe Qualitätssicherung zum Schnellnachweis von Bakterien in TKs Ziele: • Entwicklung eines Ringversuchs als externe Qualitätskontrolle für den Nachweis von Bakterien in Thrombozytenkonzentraten mit validierten Schnellmethoden: - 16S/23S rDNA (RT)-PCR - Bactiflow Durchflußzytometrie - Pan Genera Detection Assay - andere • Erleichterte Einführung des Bakterienscreening mit zugelassenen Schnelltestmethoden an Blutspendediensten, die bisher keine Komplettvalidierung durchgeführt haben • Geräte-/Methoden-Qualifizierung KONZEPT Externe Qualitätssicherung zum Schnellnachweis von Bakterien in TKs Zu prüfende Parameter: • Nachweis von transfusionsmedizinisch-relevanten Bakterien-Spezies (QUALITÄT -> Spezifität) • Nachweis von transfusionsmedizinisch-relevanten Bakterien-Titern (QUANTITÄT -> Sensitivität), in Abhängigkeit zum Zeitpunkt der Transfusion (10E+3 – 10E+5 CFU/ml) • Test-Performance (SCHNELLMETHODE, time-to-result, point-of-issue Testung): BactiFlow, NAT, PGD, BacTx In Analogie zum Virus-Screening (HBV, HCV, HIV-1, s. Bescheid vom 7.1.2013) sollten Anforderungen an Sensitivität, Spezifität (Spezies) vom Paul-Ehrlich-Institut definiert werden. KONZEPT Externe Qualitätssicherung zum Schnellnachweis von Bakterien in TKs Praktische Durchführung: • • • • • • • • Inokulation von TK mit definierten Titern von nachweislich in TKwachsenden Bakterienstämmen (PEI-Stämme, WHO-Standards) Verschickung der Proben gekühlt (4-8°C, ggf. stabilisiert) zur Stabilisierung des Titers Transportboxen mit Thermo-Loggern Ankunft der Proben bis 10.00 Uhr im Labor Lagerung max. 1 h (+/- 10 min) beim RV-Teilnehmer bei 22°C-24°C Beginn der Untersuchungen der Ringversuchsproben um 11:00 Uhr Ergebnismitteilung Online bis 16:00 Uhr Probenset: • mind. 2 negative Probe • mind. 2 verschiedene Bakterienstämme • mind. 2 verschiedene Titer (z.B. 10E+3 CFU/ml und 10E+5 CFU/ml) STAMMAUSWAHL Auswahl eines Antibiotikums zur Hemmung des Wachstum während der Transportphase Störmer et al, 2012, Vox sanguinis Cotrimoxazol = Das Wirkungsspektrum von Cotrimoxazol ist sehr breit, sowohl im Gram-positiven, als auch im Gram-negativen Bereich (z. T. auch gegen Protozoen und einige Pilzarten). Vollmer et al., 2015 PROTOKOLLOPTIMIERUNG Stabilität des Bakterientiters – Übernacht‐Transport AB: antibiotic cotrimoxacol BF: PC: B: A: A1: Quantifizierung der Bakterien durch BactiFlow (Counts/ml) Quantifizierung der Bakterien durch Ausplattieren (CFU/ml) Bakterientiter vor Verschickung Bakterientiter nach Transport, Messung direkt nach Öffnung der Transportbox Bakterientiter nach Lagerung für 1h bei Raumtemperatur Vollmer et al., 2015 PROTOKOLLOPTIMIERUNG Stabilität des Bakterientiters – Übernacht‐Transport Aerobe Kultur Anaerobe Kultur Vollmer et al., 2015 Ergebnismitteilung per Fax Ergebnismitteilung: Modul 1: 7 Stunden (von 09:00 Uhr bis 16:00 Uhr) Modul 2‐3: 14 Tage Resultate der Ringversuche NAT Culture (detection) Culture (identification) 3 3 3 1 Sensitivity 100 % 100 % 100 % 100 % Specificity 100 % 100 % 100 % - 3 3 5 2 Sensitivity 100 % 93,8 % 100 % 100 % Specificity 100 % 100 % 100 % - 4 5 15 7 Sensitivity 100 % 93,3 % 100 % 100 % Specificity 100 % 100 % 100 % - 4 3 16 7 Sensitivity 100 % 86,6 % 100 % 100 % Specificity 100 % 100 % 100 % - BactiFlow Bak TK 1_13 (4 positive samples, 2 negative samples) Participant (n) Bak TK 2_13 (4 positive samples, 2 negative samples) Participant (n) Bak TK 1_14 (6 positive samples, 2 negative samples) Participant (n) Bak TK 2_14 (6 positive samples, 2 negative samples) Participant (n) Vollmer et al., 2015 Resultate der Ringversuche 2014 BAK TK 1_14 BF NAT CULT DT CULT ID sample target value (CFU/ml) n = 4 n = 5 n = 15 n = 2 S1 negative 4/4 5/5 15/15 2/2 S2 S. epidermidis (5.31E+03) 4/4 4/5* 15/15 2/2 S3 E. coli (2.71E+05) 4/4 5/5 15/15 2/2 S4 S. aureus (5.47E+04) 4/4 5/5 15/15 2/2 S5 B. cereus (3.50E+05) 4/4 5/5 15/15 2/2 S6 K. pneumoniae (2.05E+03) 4/4 4/5* 15/15 2/2 S7 negative 4/4 5/5 15/15 2/2 S8 S. pyogenes (2.25E+04) 4/4 5/5 15/15 2/2 Sensitivity (%) 100 93.3 100 100 Specificity (%) 100 100 100 ‐ BAK TK 2_14 sample target value (CFU/ml) BF NAT CULT DT CULT ID n = 4 n = 3 n = 16 n = 7 S1 E. coli (4.60E+04) 4/4 3/3 16/16 7/7 S2 S. epidermidis (3.10E+04) 4/4 3/3 16/16 7/7 S3 S. aureus (8.63E+05) 4/4 3/3 16/16 7/7 S4 S. aureus (3.55E+04) 4/4 3/3 16/16 7/7 S5 negative 4/4 3/3 16/16 7/7 S6 E. coli (9.33E+02) 4/4 1/3* 16/16 7/7 Sensitivity (%) 100 86.6 100 100 Specificity (%) 100 100 100 ‐ NAT mit geringerer Sensitivität (< 5.000 CFU/ml) Vollmer et al., 2015 Resultat: Ringversuch BAK-TK 2/2014 Bestimmung der Sensitivität der Schnellmethoden Bakterientiter (CFU / TK) Messung der Bakterien im TK 108 1 1 Langsames Bakterien‐Wachstum 2 Schnelles Bakterien‐Wachstum 106 2 transfusionsmed. kritischer Bakterientiter 104 102 Inokulation mit 10‐100 Bakterien/TK Untere Nachweisgrenze der Schnell‐Methoden (NAT: 20 , BF: 300, PGD: 10E4 CFU/ml) Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Zeit nach Spende Analytische Sensitivität der Schnellmethoden muss auf Bakterientiter zum Zeitpunkt der Probennahme bezogen sein (nicht Inokulationstiter)! Dates Nächster BAK‐TK Ringversuch: Oktober 2015 Danksagung Referenzinstitut für Bioanalytik, Bonn Zentrallabor DRK Blutspendedienst West, Hagen DRK Blutspendedienst Baden-Württemberg – Hessen, Frankfurt DRK Blutspendedienst Ost, Plauen Dank für Ihre Aufmerksamkeit ! PD Dr. rer. nat. Jens Dreier Herz‐ und Diabeteszentrum Nordrhein‐Westfalen Universitätsklinik der Ruhr‐Universität Bochum Institut für Laboratoriums‐ und Transfusionsmedizin Georgstraße 11 32545 Bad Oeynhausen Tel.: +49 (0) 57 31 / 97‐2033 Fax: +49 (0) 57 31 / 97‐2950 E‐Mail: jdreier@hdz‐nrw.de www.hdz‐nrw.de
