2 - Paul-Ehrlich

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Ergebnisse des
Externen Qualitätssicherungsprogramms
zur Detektion bakterieller Kontamination
in Thrombozytenkonzentraten
PD Dr. Jens Dreier
KOLT 2015
28. – 29. April 2015
Herz- und Diabeteszentrum NRW
Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum
Institut für Laboratoriums- und Transfusionsmedizin
Bad Oeynhausen
Einleitung
Pharmazeutische Blutprodukte
Blutprodukte
zelluläres Blutprodukt
azelluläres Blutprodukt
Erythrozytenkonzentrat (EK)
therapeutisches Frischplasma (FFP)
Thrombozytenkonzentrat (TK)
30
•
EK
TK
Haltbarkeit:
42 Tage
0.24 %
4+1
Tage
Lagerung:
4°C
22°C
Bakterielle Kontamination pro 10.000
Produkt:
20
0.13 %
10
Bakterielle Kontaminationen stellen
ein um den Faktor 10–100 höheres
FFP
Restinfektionsrisiko dar als Viren
36 Monate
• - 30°C
besonders gefährdet sind
Thrombozytenkonzentrate
(Lagerung aerob bei 22°C ± 2°C =
gute Wachstumsbedingungen für
Bakterien)
0.07 %
EK
TK
FFP
mod. Walther‐Wenke et al., Vox Sang (2006)
Maßnahmen zur Risikoreduktion
•
1997 – Votum 16: Mindestanforderungen zur Sterilitätstestung von
Blutkomponenten
•
2002 – Votum 27: Einführung des Predonation Samplings
•
2008 – Votum 38: Festlegung der Haltbarkeitsfrist von
Thrombozytenkonzentraten mit dem Ziel der Reduktion lebensbedrohlicher
septischer Transfusionsreaktionen durch bakterielle Kontamination
1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011
RBC
PPC
APC
FFP
4 (2)
0
0
0
5 (2)
3 (1)
0
4
1
3
1
0
0
1
3 (1)
0
4
1
3
0
1
3
3 (1)
0
2
3 (1)
2
0
2
1
2 (1)
1
2002: Einführung des Pre‐donation sampling 3
4 (1)
3
0
2
3
3 (1)
0
6
1
1
0
3
2
1
0
0
1 (1)
1
0
1
0
2
0
4
2 (1)
2
0
2008: AK‐Blut‐Empfehlung verkürzte TK‐Haltbarkeit
Im Zeitraum von 1997–2011 wurden 13 tödlich verlaufende
bakterielle Übertragungen durch Blutkomponenten gemeldet (4x EK, 9x TK): 1 Toter pro ~620 000 TK‐Einheiten
PEI, Heiden & Doll (mod.)
Einleitung
Bakterieller Titer und Transfusionsreaktion
Bacillus cereus,
Staphylococcus
(Gram‐pos.)
Gram‐neg.
Kritische Titer
> 10 E5 CFU/ml
Transfusionsreaktionen sind
vor allem titer-, aber auch
spezies- und
stammabhängig (und
Patienten-)!
Jacobs et al. 2008 CID
Wachstumskinetik von Bakterien in TKs
frühe späte Probenahme
Bakterientiter (CFU / TK)
Diagnostisches Fenster
108
(hohes Risiko des
Sampling Errors)
106
4
3
1
Selbst‐Sterilisation
2
Bakterien persistieren, ohne Wachstum
3
Bakterien‐Wachstum
(schnell‐ bzw. langsam wachsend)
transfusionsmed. kritischer Bakterientiter
104
102
10‐100 Bakterien/TK
2
Untere Nachweisgrenze der Schnell‐Methoden 1
Tag 1
(NAT: 20 , BF: 300, PGD: 10E4 CFU/ml)
Tag 2
Tag 3
Tag 4
Tag 5
Zeit nach Spende
Aktuelle Übersichtsarbeit
Zugelassene Testverfahren zur Verlängerung der TK-Haltbarkeit
Janetzko K, Schmidt M. Transfusionsmedizin 2015; 5: 27–30
KONZEPT
Externe Qualitätssicherung zum Schnellnachweis von Bakterien in TKs
Ziele:
•
Entwicklung eines Ringversuchs als externe Qualitätskontrolle für
den Nachweis von Bakterien in Thrombozytenkonzentraten mit
validierten Schnellmethoden:
- 16S/23S rDNA (RT)-PCR
- Bactiflow Durchflußzytometrie
- Pan Genera Detection Assay
- andere
•
Erleichterte Einführung des Bakterienscreening mit zugelassenen
Schnelltestmethoden an Blutspendediensten, die bisher keine
Komplettvalidierung durchgeführt haben
•
Geräte-/Methoden-Qualifizierung
KONZEPT
Externe Qualitätssicherung zum Schnellnachweis von Bakterien in TKs
Zu prüfende Parameter:
•
Nachweis von transfusionsmedizinisch-relevanten
Bakterien-Spezies (QUALITÄT -> Spezifität)
•
Nachweis von transfusionsmedizinisch-relevanten
Bakterien-Titern (QUANTITÄT -> Sensitivität), in Abhängigkeit
zum Zeitpunkt der Transfusion (10E+3 – 10E+5 CFU/ml)
•
Test-Performance (SCHNELLMETHODE, time-to-result,
point-of-issue Testung): BactiFlow, NAT, PGD, BacTx
In Analogie zum Virus-Screening (HBV, HCV, HIV-1, s. Bescheid vom
7.1.2013) sollten Anforderungen an Sensitivität, Spezifität (Spezies)
vom Paul-Ehrlich-Institut definiert werden.
KONZEPT
Externe Qualitätssicherung zum Schnellnachweis von Bakterien in TKs
Praktische Durchführung:
•
•
•
•
•
•
•
•
Inokulation von TK mit definierten Titern von nachweislich in TKwachsenden Bakterienstämmen (PEI-Stämme, WHO-Standards)
Verschickung der Proben gekühlt (4-8°C, ggf. stabilisiert) zur
Stabilisierung des Titers
Transportboxen mit Thermo-Loggern
Ankunft der Proben bis 10.00 Uhr im Labor
Lagerung max. 1 h (+/- 10 min) beim RV-Teilnehmer bei 22°C-24°C
Beginn der Untersuchungen der Ringversuchsproben um 11:00 Uhr
Ergebnismitteilung Online bis 16:00 Uhr
Probenset:
• mind. 2 negative Probe
• mind. 2 verschiedene Bakterienstämme
• mind. 2 verschiedene Titer (z.B. 10E+3 CFU/ml und 10E+5 CFU/ml)
STAMMAUSWAHL
Auswahl eines Antibiotikums zur Hemmung des Wachstum während der Transportphase Störmer et al, 2012, Vox sanguinis
Cotrimoxazol = Das Wirkungsspektrum von Cotrimoxazol ist sehr breit, sowohl im
Gram-positiven, als auch im Gram-negativen Bereich (z. T. auch
gegen Protozoen und einige Pilzarten).
Vollmer et al., 2015
PROTOKOLLOPTIMIERUNG
Stabilität des Bakterientiters – Übernacht‐Transport AB: antibiotic cotrimoxacol
BF:
PC:
B:
A:
A1:
Quantifizierung der Bakterien durch BactiFlow (Counts/ml)
Quantifizierung der Bakterien durch Ausplattieren (CFU/ml)
Bakterientiter vor Verschickung
Bakterientiter nach Transport, Messung direkt nach Öffnung der Transportbox
Bakterientiter nach Lagerung für 1h bei Raumtemperatur
Vollmer et al., 2015
PROTOKOLLOPTIMIERUNG
Stabilität des Bakterientiters – Übernacht‐Transport Aerobe Kultur
Anaerobe Kultur
Vollmer et al., 2015
Ergebnismitteilung per Fax
Ergebnismitteilung:
Modul 1: 7 Stunden (von 09:00 Uhr bis 16:00 Uhr)
Modul 2‐3: 14 Tage
Resultate der Ringversuche
NAT
Culture
(detection)
Culture
(identification)
3
3
3
1
Sensitivity
100 %
100 %
100 %
100 %
Specificity
100 %
100 %
100 %
-
3
3
5
2
Sensitivity
100 %
93,8 %
100 %
100 %
Specificity
100 %
100 %
100 %
-
4
5
15
7
Sensitivity
100 %
93,3 %
100 %
100 %
Specificity
100 %
100 %
100 %
-
4
3
16
7
Sensitivity
100 %
86,6 %
100 %
100 %
Specificity
100 %
100 %
100 %
-
BactiFlow
Bak TK 1_13 (4 positive samples, 2 negative samples)
Participant (n)
Bak TK 2_13 (4 positive samples, 2 negative samples)
Participant (n)
Bak TK 1_14 (6 positive samples, 2 negative samples)
Participant (n)
Bak TK 2_14 (6 positive samples, 2 negative samples)
Participant (n)
Vollmer et al., 2015
Resultate der Ringversuche 2014
BAK TK 1_14
BF
NAT
CULT DT
CULT ID
sample
target value (CFU/ml)
n = 4
n = 5
n = 15
n = 2
S1
negative
4/4
5/5
15/15
2/2
S2
S. epidermidis (5.31E+03)
4/4
4/5*
15/15
2/2
S3
E. coli (2.71E+05)
4/4
5/5
15/15
2/2
S4
S. aureus (5.47E+04)
4/4
5/5
15/15
2/2
S5
B. cereus (3.50E+05)
4/4
5/5
15/15
2/2
S6
K. pneumoniae (2.05E+03)
4/4
4/5*
15/15
2/2
S7
negative
4/4
5/5
15/15
2/2
S8
S. pyogenes (2.25E+04)
4/4
5/5
15/15
2/2
Sensitivity (%)
100
93.3
100
100
Specificity (%)
100
100
100
‐
BAK TK 2_14
sample
target value (CFU/ml)
BF
NAT
CULT DT
CULT ID
n = 4
n = 3
n = 16
n = 7
S1
E. coli (4.60E+04)
4/4
3/3
16/16
7/7
S2
S. epidermidis (3.10E+04)
4/4
3/3
16/16
7/7
S3
S. aureus (8.63E+05) 4/4
3/3
16/16
7/7
S4
S. aureus (3.55E+04)
4/4
3/3
16/16
7/7
S5
negative
4/4
3/3 16/16
7/7
S6
E. coli (9.33E+02)
4/4
1/3*
16/16
7/7
Sensitivity (%)
100
86.6
100
100
Specificity (%)
100
100
100
‐
NAT mit geringerer Sensitivität (< 5.000 CFU/ml)
Vollmer et al., 2015
Resultat: Ringversuch BAK-TK 2/2014
Bestimmung der Sensitivität der
Schnellmethoden
Bakterientiter (CFU / TK)
Messung der
Bakterien im TK
108
1
1
Langsames
Bakterien‐Wachstum
2
Schnelles Bakterien‐Wachstum
106
2
transfusionsmed. kritischer Bakterientiter
104
102
Inokulation mit 10‐100 Bakterien/TK
Untere Nachweisgrenze der Schnell‐Methoden (NAT: 20 , BF: 300, PGD: 10E4 CFU/ml)
Tag 1
Tag 2
Tag 3
Tag 4
Tag 5
Zeit nach Spende
Analytische Sensitivität der Schnellmethoden muss auf Bakterientiter zum Zeitpunkt der Probennahme bezogen sein (nicht Inokulationstiter)!
Dates
Nächster BAK‐TK Ringversuch:
Oktober 2015
Danksagung
Referenzinstitut für Bioanalytik, Bonn
Zentrallabor DRK Blutspendedienst West, Hagen
DRK Blutspendedienst Baden-Württemberg – Hessen, Frankfurt
DRK Blutspendedienst Ost, Plauen
Dank
für Ihre Aufmerksamkeit !
PD Dr. rer. nat. Jens Dreier
Herz‐ und Diabeteszentrum Nordrhein‐Westfalen Universitätsklinik der Ruhr‐Universität Bochum
Institut für Laboratoriums‐ und Transfusionsmedizin
Georgstraße 11
32545 Bad Oeynhausen
Tel.: +49 (0) 57 31 / 97‐2033
Fax: +49 (0) 57 31 / 97‐2950
E‐Mail: jdreier@hdz‐nrw.de
www.hdz‐nrw.de
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