bactiflow - Paul-Ehrlich

KOLT 2013
Langen, 16./17.04.2013
Bakterienscreening von
Thrombozytenkonzentraten:
alte und neue Strategien
PD Dr. J. Dreier
Institut für Laboratoriums‐ und Transfusionsmedizin
Bad Oeynhausen
Einleitung
Aktuelles Restinfektionsrisiko für transfusions‐assoziierte Virus‐ und Bakterieninfektionen
Schmidt, M. et al. 2010, Hämotherapie
Einleitung
Bakterien‐Infektionen in der Transfusionsmedizin:
Bedeutung, Prävention und Restrisiko
•
Bakterielle Kontaminationen stellen ein um den Faktor 10–100 höheres
Restinfektionsrisiko dar als Viren
•
besonders gefährdet sind Thrombozytenkonzentrate (Lagerung aerob bei
22°C ± 2°C = gute Wachstumsbedingungen für Bakterien)
•
2002: Einführung des „Pre-Donation Samplings“ (Verwurf der ersten 30–40
ml Blut bei Spende) (Votum 27)
•
2008: Reduktion der maximalen Haltbarkeit der TKs in Deutschland auf 4
Tage nach der Spende (Votum 38)
•
2012: Mindestanforderungen an die mikrobiologische Kontrolle von
Blutkomponenten zur Transfusion (Votum 43)
•
•
•
•
„mikrobiologische Kontrolle“ anstelle „Sterilitätstestung“
Bezugsgröße N zur Berechnung der zu testenden Stichprobe
verbindliche Durchführung einer zweiten Kultur bei positivem Signal
Vorgaben für die Entnahme und Aufbewahrung des Untersuchungsmaterials
Einleitung
Transfusionsbedingte bakterielle Infektionen (TBBI) und assoziierte Todesfälle
1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011
RBC
PPC
APC
FFP
4 (2)
0
0
0
5 (2)
3 (1)
0
4
1
3
1
0
0
1
3 (1)
0
4
1
3
0
1
3
3 (1)
0
2
3 (1)
2
0
2
1
2 (1)
1
2002: Einführung des Pre‐donation sampling 3
4 (1)
3
0
2
3
3 (1)
0
6
1
1
0
3
2
1
0
0
1 (1)
1
0
1
0
2
0
4
2 (1)
2
0
2008: AK‐Blut‐Empfehlung verkürzte TK‐Haltbarkeit
Im Zeitraum von 1997–2011 wurden 13 tödlich verlaufende
bakterielle Übertragungen durch Blutkomponenten gemeldet (4x EK, 9x TK)
1 Toter pro ~620 000 TK‐Einheiten
PEI, Heiden & Doll
Schnellmethode: BactiFlow
Bakterien‐Screening mittels BactiFlow
Durchflusszytometrie
PRINZIP:
• Enzymatischer Verdau von TK/EK
• nicht‐fluoreszentes Substrat wird der Probe zugesetzt • bei lebenden Zellen mit Enzymaktivität und Membranintegrität passiert das Färbesubstrat passiv die Zellen und wird im Zellinnern durch zytoplastische Enzyme (Esterase) gespalten. • fluoreszierendes Material bleibt in der Zelle und wird durchflusszytometrisch
quantifiziert
• Manuelle und semi‐automatisierte Version
BactiFlow‐Technologie (AES‐Chemunex, bioMérieux)
Schnellmethode: BactiFlow
BactiFlow zur Sterilitätstestung von TKs
Platelet control
Validation
beads
K. pneumoniae
Validation
beads
Bakterien
untere Nachweisgrenze 150 CFU/mL TK
Dreier et al., Clin. Chem. (2009)
Multizenter‐Studie
Studienprotokoll: Multizentrische Studie
Tag 4
(bzw. nach Verfall > 6 d [DRK])
PEI-Zulassung:
TK-Haltbarkeit 4 + 1
Vollmer et al 2011. Transfusion Medicine
Multizenter‐Studie
Auswertung: Multizentrische Studie
Gesamtzahl getestete Produkte: 1913
Bad Oeynhausen
BF‐Studie
Bakterien‐Screening in TKs mittels BactiFlow:
frühe Testung (Tag 2 oder 3)
BACTIFLOW
BF BF‐ALS
(manuell)
(automatisiert)
total number
negative (< 300 C/mL)
initially reactive*
day 2
1026
day 3
1074
1008 (97.7%)
1068 (99.4%)
18 (1.75‰)
6 (0.55‰)
false‐positive**
6 (0.58‰)
6 (0.55‰)
‐
‐
positive ***
* Initial testing ≥300 C/mL, retesting (ILTM: duplicate, GRCW: single) <300 C/mL
** Initial testing ≥300 C/mL, retesting ≥300 C/mL, negative culture result
*** Initial testing ≥300 C/mL, retesting ≥300 C/mL, positive culture result
automatisiertes BF‐System (BF‐ALS) mit geringerer Anzahl
von initial‐reaktiven Proben
Vollmer et al. 2013, submitted
BF‐Studie
Bakterielles Wachstum und Detektion mittels BF und Kultur:
Falsch‐negative BF‐Ergebnisse
Portion
APC‐2
APC‐3
APC‐4
Anaerobic culture
Bacterial strains
detection (d)b
BactiFlow results (counts/mL)
b
2
< 24 h
Positive (1.23)
Positive (1.20)
a
2
< 24 h
Negativec
Negativec
S. epidermidis
isolate 545
S. epidermidis
isolate 545
‐
b
2
< 24 h
Negativec
Positive (1.02)
S. hominis
Negative (0)
a
2
< 12 h
Negativec
Negativec
‐
Negative (61)
b
2
< 24 h
Negativec
Positive (0.93)
Negative (30)
a
2
< 12 h
Negativec
Negativec
S. hominis
isolate 4224
‐
b
2
< 12 h
Negativec
Positive (0.97)
S. epidermidis
isolate 186
Negative (0)
a
APC‐1
Day of testing Time of TF Aerobic after after culture
a
donation (d0)
testing
detection (d)b
2
< 24 h
Positive (1.24)
Positive (1.25)
Negative (30)
Negative (0)
Negative (0)
Negative (0)
aTF: transfusion of PC based on the negative BactiFlow
results and negative‐to‐date concept of BacT/alert culture results
time after sampling
cNegative, negative after 7 day incubation
dRetesting was performed for available products immediately after receipt of positive culture result
bDetection
BF falsch-negativ:
•
Tag 2: 0,58% (best. pos. 0,19%)
•
Tag 4: 0,52% (best. pos. 0,26%)
BF‐Studie
Bakterielles Wachstum und Detektion mittels BF und Kultur:
Falsch‐negative BF‐Ergebnisse
Nachtestung der Isolate durch
Inokulation in frische TKs:
- Bact/Alert (Detionszeit [h])
- BactiFlow (C/ml)
- Titerbestimmung (CFU/ml)
Fazit:
- langsam-wachsende Isolate (1, 2)
- nicht-wachsendes Isolat (3)
 unterhalb der Nachweisgrenze des
BactiFlow
Screening‐Strategien
Derzeit diskutierte Screening‐Strategien
100% Testung unmittelbar vor der Transfusion
ILTM: Uni.Blutspendedienst OWL (Bad Oeynhausen, Germany)
GRCW: German Red Cross Blood Transfusion Service West (Hagen, Germany) Vollmer et al. 2013, submitted
Ringversuch
Erster Pilot‐Ringversuch (2011)
UniBlutspendedienst OWL, Bad Oeynhausen (BO)
DRK BSPD West, Bad Kreuznach (BK)
Institut für Transfusions‐
medizin und Trans‐
plantationsimmunologie, Münster (MS) • BactiFlow
• BactiFlow
• BactiFlow
• Pan Genera Detetion Assay
• PGD
• PGD
• 23s rDNA RT‐PCR
• BacT/Alert
• Titerbestimmung
Ringversuch
Ziel des Ringversuches
•
Methodenvergleich Schnellmethoden
(BactiFlow, Pan Genera Detection (PGD)
System, RT-PCR)
Konzept
•
Detektionsvergleich unterschiedlicher Stämme (gram-negativ, gram-positiv)
in unterschiedlichen Titern
(4,5 x 10E+03 bis 4,5 x 10E+08 CFU/mL)
•
Herstellung von aliquotierten Probensets (randomisiert für die
verschiedenen Methoden)
•
Sicherstellung der Bakterienkonzentration (Temperaturkontrolle, zeitlich
begrenzte Transportzeit und Ergebnisermittlung)
Vox Sang, 2012, 103:1-9
Ringversuch
Ergebnis des Ringversuches
1. Keine falsch positiven Ergebnisse mit allen Methoden
2. BactiFlow, PCR und Kultur detektieren alle positiven Proben (>10E+03)
korrekt (12/12)
3. PGD erfasst einige Stämme gram-negativer Bakterien erst in hohen
Konzentrationen, insgesamt wurden nur 4/12 positiven Proben richtig
detektiert
Vox Sang, 2012, 103:1-9
Ringversuch
Studie zur externen Qualitätssicherung zum Nachweis von Bakterien in Thromboyztenkonzentraten mit Hilfe von bakteriellen Schnellnachweismethoden
•
•
Referenzinstitut für Bioanalytik, Bonn
(Geschäftsführer ab 10/2012: Prof. Dr. M. Schmidt)
Herz- und Diabeteszentrum NRW, Ruhr-Universität Bochum,
Bad Oeynhausen (Referenzinstitut)
•
•
Zentrallabor DRK Blutspendedienst West, Hagen
DRK Blutspendedienst Baden-Württemberg – Hessen, Frankfurt
•
Paul-Ehrlich-Institut, Langen
Träger des RfB ist die Stiftung für Pathobiochemie und Molekulare Diagnostik der
Ringversuch
Externe Qualitätssicherung zum Schnellnachweis von Bakterien in TKs
Ziele:
•
Entwicklung eines Ringversuchs als externe Qualitätskontrolle für
den Nachweis von Bakterien in Thrombozytenkonzentraten mit
validierten Schnellmethoden (Bactiflow, 16/23S rDNA PCR u.a.)
•
Erleichterte Einführung des Bakterienscreening mit zugelassenen
Schnelltestmethoden an Blutspendediensten, die bisher keine
Komplettvalidierung durchgeführt haben
•
Geräte-/Methoden-Qualifizierung
Ringversuch
Externe Qualitätssicherung zum Schnellnachweis von Bakterien in TKs
Zu prüfende Parameter:
•
Nachweis von transfusionsmedizinisch-relevanten
Bakterien-Spezies (QUALITÄT -> Spezifität)
•
Nachweis von transfusionsmedizinisch-relevanten
Bakterien-Titern (QUANTITÄT -> Sensitivität), in Abhängigkeit
zum Zeitpunkt der Transfusion (10E+3 – 10E+5 CFU/ml)
•
Test-Performance (SCHNELLMETHODE, time-to-result,
point-of-issue Testung): BactiFlow, NAT, PGD, BacTx
In Analogie zum Virus-Screening (HBV, HCV, HIV-1, s. Bescheid vom
7.1.2013) sollten Anforderungen an Sensitivität, Spezifität (Spezies)
vom Paul-Ehrlich-Institut definiert werden.
Ringversuch
Externe Qualitätssicherung zum Schnellnachweis von Bakterien in TKs
Konzeption:
•
•
•
•
•
•
•
Inokulation von TK mit definierten Titern von nachweislich in TKwachsenden Bakterienstämmen (PEI-Stämme, WHO-Standards)
Verschickung der Proben gekühlt (4-8°C, ggf. stabilisiert) zur
Stabilisierung des Titers
Transportboxen mit Thermo-Loggern
Ankunft der Proben bis 10.00 Uhr im Labor
Lagerung max. 1 h (+/- 10 min) beim RV-Teilnehmer bei 22°C-24°C
Beginn der Untersuchungen der Ringversuchsproben um 11:00 Uhr
Ergebnismitteilung Online bis 17:00 Uhr
Ringversuch
Externe Qualitätssicherung zum Schnellnachweis von Bakterien in TKs
Konzeption:
•
mind. eine Probe als Negativkontrolle und mindestens zwei
verschiedene Bakterienstämme in zwei Konzentrationen
(10E+3 CFU/ml und 10E+5 CFU/ml)
Schnellmethoden
Methodenvergleich: Bakterien‐Screening von TKs
Schnellmethoden
CE IVD / FDA
BactiFlow
NAT
(AES Chemunex,
bioMérieux)
(16S rDNA,
DRK Frankfurt)
(Verax Biomedical)
demnächst/ nein
ja / nein
ja / ja
PGD
Test-Spezifikationen
untere
Nachweisgrenze
>105 CFU/mL
150 CFU/mL
20-30 CFU/mL
Hands-on-time
5 min
30 - 60 min
5 min
Time-to-result
0,75-1 h
4h
1,5 h
(Problem Gramneg. Bakt.)
Weitere Methoden:
• BacT/Alert‐Kultur keine Schnellmethode (time‐to‐result >12 h)
• 23S rDNA RT‐PCR (ILTM, Bad Oeynhausen), nicht PEI angemeldet
• BacTx (Immunetics) noch nicht in Deutschland in der Erprobung
Ringversuch
Externe Qualitätssicherung zum Schnellnachweis von Bakterien in TKs
Zielgrößen des RV
Zeitplan / Ausblick
•
•
•
Pilotringversuch für Juni 2013 geplant
Quartalsweise Durchführung von RV ab Okt. 2013
Erweiterung des RV für Kultivierungsmethoden
(u.a. nur qualitativer Bakteriennachweis)
Dank
für Ihre Aufmerksamkeit !
Priv.‐Doz. Dr. rer. nat. Jens Dreier
Herz‐ und Diabeteszentrum Nordrhein‐Westfalen Universitätsklinik der Ruhr‐Universität Bochum
Institut für Laboratoriums‐ und Transfusionsmedizin
Georgstraße 11
32545 Bad Oeynhausen
Tel.: +49 (0) 57 31 / 97‐20 33
Fax: +49 (0) 57 31 / 97‐2013
E‐Mail: jdreier@hdz‐nrw.de
www.hdz‐nrw.de