Genetisches Praktikum 2010 (20160)

Genetisches Praktikum 2010 (20160)
Anwesenheitspflicht - maximal ein Fehltag
Klausur: 01.04.2010 (Gründonnerstag) im H15
09:00 - 10.15
Klausur zu Vorlesung u. Repetitorium
10:30 - 11:30
Klausur zum Praktikum
Anmeldung bis Do. 25.03. über FlexNow – nur die, die planen zu kommen!
(für Nachholklausur: Anmeldung im Sekretariat der Genetik)
Um zu bestehen, müssen ! 50% der max. erreichbaren Punktzahl in jeder der
beiden Klausuren erreicht werden.
nur eine Nachholklausur in 2010! – danach erst ca. 1 Jahr später wieder neuer
Versuch möglich!!!
Protokolle
keine Abgabe von Protokollen; Auswertungen gemeinsam im Kurs;
Protokollieren der Ergebnisse sowie gute Vor- und Nachbereitung sind essentiell,
um Überblick zu behalten
Genetisches Praktikum 2010 (20160)
Mitzubringen sind:
Laborkittel
Taschenrechner
Millimeterpapier
Organisatorischer Ablauf:
Morgens: Repetitorium H12, Beginn 9:00 (s.t.)
(Theorie zu Versuchen, Bezug zur Vorlesung, Gelegenheit zum Fragen!)
Anschließend: praktischer Teil (Mikroskopiersaal)
Mittagspause variabel (siehe Zeitplan)
Ende zwischen 16:00 und 18:00 Uhr
Skript:
Versuche sind übergeordneten Themen zugeordnet (I - IV, s.S. 3)
Skript-Aufbau: Unterpunkte 1-7 zu jedem Versuch
Warnhinweise beachten
Zeitplan: Verschachtelung der Versuche (s.S. 38)
Zuordnung:
Sitzplätze zu
Gruppennamen:
36 – 39
Zweiergruppen
ausgehend
von A1 die
Plätze bitte
lückenlos
füllen!
H
H
H
H
H
Genetik Praktikum
Praktikumsversuche
I. Allgemeines
A. Plasmid-Curing
B. F-Plasmid-Nachweis
C. Komplementations-Test mit rII-Mutanten des Phagen T4
D. PCR-Fingerprint mittels STR-Analyse
II. Methoden
A. Titerbestimmung bei Bakterienkulturen
B. !-Galaktosidase-Test
III. Mutagenese und DNA-Reparatur
A. Isolierung und Identifizierung von Auxotrophie-Mutanten
B. Nachweis der Transposon-Mutagenese des Plasmids pTS115
C. Ames-Test
IV. Projekt: Klonierung eines Genfragments
A. PCR
B. Gelelektrophorese
C. Ligation
D. Elektrotransformation
E. Plasmid-Präparation
Versuch IIA
Modellorganismus Escherichia coli
•! benannt seinem Entdecker Theodor Escherich (1919)
•! kommt im menschlichen und tierischen Darm vor
•! Familie der Enterobacteriaceae (griech. „enteron“: Darm)
•! Gram-negativ, stäbchenförmig, peritrich begeißelt
•! einer der am besten untersuchten Organismen der Welt
•! 4,6 Mb zirkuläres Chromosom; ca. 4000 Gene
•! Plasmide:
kleine, zirkuläre, autonom replizierende, extrachromosomale DNA-Moleküle
Versuch IIA
Titerbestimmung bei Bakterienkulturen
(Wachstumskurve)
In der Molekularbiologie werden Bakterien z.B. verwendet:
- zur Vermehrung rekombinanter DNA-Moleküle
- zur Expression und Isolation von Proteinen
Am häufigsten verwendet: Escherichia coli - K12
- harmloser Stamm
- mikrobiologisch, biochemisch und genetisch sehr gut untersucht
("Haustierchen aller Molekularbiologen")
Kultivierung im Labor
- meist in Komplett- oder Vollmedium: z.B. LB (Luria Bertani) Medium
- Trypton (Pepton): enzymatisch verdaute Proteine (Aminosäurequelle)
- Hefeextrakt: Vitamine, Spurenelemente
- NaCl: Osmolarität
- Flüssigkultur oder
feste Nährböden durch Zugabe von Agar
- Minimalmedium: def. Zusammensetzung; zur Identifikation von Auxotrophien (s.u.)
Versuch IIA
Bestimmung der Bakterienzahl
Gesamtzellzahl:
- Bakterien sind sehr klein, für das blosse Auge nicht zu erkennen
- Auszählen in dünner Schicht unter dem Mikroskop (Thoma Zählkammer)
- Automatisiert durch elektrisches Zählgerät, basierend auf
Leitfähigkeitsverlust einer Elektrolytlösung beim Durchtritt eines
Bakteriums durch eine enge Öffnung (Coulter-Counter)
- Nachteil: lebende von toten Bakterien nicht
ohne zusätzliche Färbung zu unterscheiden
Versuch IIA
Bestimmung der Bakterienzahl
Lebendzellzahl:
- Koch‘sches Plattengussverfahren
- Spatelplattenverfahren
- jedes lebende Bakterium führt zur Bildung einer Kolonie
bzw. jede Kolonie geht auf ein einzelnes Bakterium zurück
- cfu = colony forming unit
- Titer = cfu / ml Kultur
- Nachteil: Inkubationszeit von mindestens einem Tag
Versuch IIA
Lebendzellzahl:
Bestimmung der Bakterienzahl
je 0,9 ml Saline
vorgelegt
Versuch IIA
Bestimmung der Bakterienzahl
Indirekte Methoden:
- Trübungsmessung bei einer bestimmten Wellenlänge (578 nm)
- Messung der Lichtabsorption und Lichtstreuung als "optische Dichte" (OD)
- lineare Proportionalität nur im Bereich OD ! 0,05 – 0,5
(Beschattungseffekte)
- schnelle Methode, aber relativ unempfindlich (noch keine Trübung bei 106 cfu/ml
» geringe Zellzahlen schlecht messbar
- muss jeweils geeicht werden, da sehr von der Größe und Gestalt der Bakterien und
dem jeweiligen Gerät abhängig (Eichkurve)
Versuch IIA
Wachstum durch Zweiteilung
20 " 21 " 22 " 23 "24 " 25 " 26 " ..... " 2n
N = N0!2n
(n = Anzahl der Zellteilungen)
(N = Bakterienzahl, N0 = Ausgangsbakterienzahl)
Exponentieller Anstieg (» Gerade bei halblogarithmischer Auftragung)
Steilheit der Gerade entspricht der Teilungsrate
Berechnung der Anzahl der Zellteilungen » Auflösen nach n (:
N = N0 2n " N / N0 = 2n
" lg(N/N0) = n ! lg2 " n = lg(N/N0) / lg2
Teilungsrate " = n / t
n / t = lg(N/N0) / [lg2 ! (t – t0)]
Generationszeit g = 1 / " = t / n
Beispielrechnung (lg2 = 0,3010): in 10 h Vermehrung von 103 auf 109 Bakterien
n / t = lg(109/103) / [lg2 ! 10 h] = 6 / [0,3010 ! 10 h] ! 2 h-1
» Teilungsrate = 2 h-1; » Generationszeit = 0,5 h
Versuch IIA
Wachstum in statischer Kultur
Wachstum bestimmt durch: Temperaturoptimum, aerobe / anaerobe Bedingungen
Wuchstoffbedürfnis
lag-Phase: Anlaufphase, Anpassung an neue Bedingungen durch
ansteigende RNA-, Ribosomen- und Enzymsynthese
log-Phase: exponentielles Wachstum
konstante maximale Teilungsrate
abhängig von Bakterienart und Wachstumsbedingungen
stationäre Phase: maximale Bakteriendichte, Ausbeute, Ertrag
bestimmter Faktor aufgebraucht, Übergang allmählich,
zunächst Wachstumsabnahme, schließlich kein Wachstum
Absterbephase: Autolyse
Versuch III.A
Isolierung und Identifizierung von Auxotrophie Mutanten
Ein durch eine Mutation hervorgerufener Phänotyp lässt
Rückschlüsse auf die Funktion des mutierten Gens zu.
Mutation
- ungerichtete, zufällige Veränderung des Erbmaterials
spontan
- selten, ca. 10-8 pro Basenpaar, Zelle und Generation
induziert (Erhöhung der Effizienz in Mutagenese Screens)
- physikalisch: Strahlung
- chemisch: mutagene Substanzen (s. Ames Test)
- biologisch: durch Transposons
Versuch III.A
Auxotrophe Bakterien als Beispiele für Mutanten
Auxotrophie
Wuchsstoffbedürftigkeit
auxotrophe Bakterien können auf Minimalmedium nicht
wachsen, sondern benötigen bestimmte Wuchsstoffe
(Aminosäuren, Vitamine, Purinbasen etc.)
Prototrophie
alle Zellbestandteile können selbst hergestellt werden
prototrophe Bakterien können auf Minimalmedium
(anorganische Salze; Kohlenstoffquelle) wachsen
Auxotrophie wird meist hervorgerufen durch Mutation in einem Gen, das für
ein Enzym des Aufbaustoffwechsels kodiert, wobei Stoffwechselwege meist
mehrere Schritte beinhalten.
Vorstufe B
Vorstufe A
Endprodukt
Vorstufe C
Enzym 1
Enzym 2
Enzym 3
Gen 1
Gen 2
Gen 3
Versuch III.A
Wechselwirkung von Genen in Stoffwechselwegen
verschiedene Arginin auxotrophe Mutanten lassen sich unterschiedlich supplementieren
Ornithin
Vorstufe
Enzym 1
arg1
Ein-Gen - Ein-Enzym Hypothese
Citrullin
Arginin
Enzym 2
Enzym 3
arg2
arg3
Ein-Gen - Ein-Polypeptid Hypothese
Warum ist auch diese Hypothese streng genommen nicht zutreffend?
Versuch III.A
Auxotrophe Bakterien als Beispiele für Mutanten
Replika Plattierung nach Lederberg:
Versuch IV.A
Klonierung eines Genfragments - Übersicht
PCR zur
Amplifikation
der rDNA
Isolierung
genomischer
DNA
SacI
Ligation
SacI
Transformation
KpnI
KpnI
Schnitt mit KpnI
und SacI
Versuch IV.A
Klonierung eines Genfragments - Übersicht
Identifizierung positiver Klone:
Plasmidpräparation
Gelelektrophoretische Analyse
1
M
1
2
2
Versuch IV.A
!-Komplementation
lacZ! auf Plasmid kodiert für !-Peptid der "-Galaktosidase
(Aminosäuren 1-26)
lacZ# im Genom von E. coli $M15 kodiert für "-Galaktosidase
der die Aminosäuren 11-41 fehlen
LacZ# und LacZ! komplementieren sich
zu aktiver tetramerer "-Galaktosidase
Monomer der "-Galaktosidase
Blau-Weiß-Screening
X-Gal
"-Gal
blaugrüner
Farbstoff
Versuch IV.A
Expressionsplasmid
Replikationsursprung (ori)
Selektionsmarker: Antibiotikumsresistenz
(z.B. AmpR: #-Lactamase)
Polylinker
Promotor / Terminator
(Operator)
RBS / Start / Stop
- z.B. Produktion Humaninsulin seit 1982
Verfahren von Hoechst entwickelt, aber Verbot der
Produktion in Deutschland, Zulassung seit 1987
Versuch IV.A
Polymerase Kettenreaktion (PCR)
Kary Banks Mullis, Nobelpreis 1993
5‘ Primer
GAATTC ATG GAG GAA TGT ACA GAA
... ATG GAG GAA TGT ACA GAA ATC GTG ....... CTC CTA GGA CCC AAA ATA TAA ...
... TAC CTC CTT ACA TGT CTT TAG CAC ....... GAG GAT CCT GGG TTT TAT ATT ...
GAT CCT GGG TTT TAT ATT AAGCTT
HindIII
Anhängen von Schnittstellen mittels 5' verlängerter Primer
3‘ Primer
EcoRI