Interferon-Rezeptoren - Goethe

Rekombinante Wirkstoffe!
6. Vorlesung!
Prof. Dr. Theo Dingermann Ins2tut für Pharmazeu2sche Biologie Goethe-­‐Universität Frankfurt [email protected]­‐frankfurt.de 1. Interferone!
Interferon-Rezeptoren:
Typ-I-Interferone binden jeweils als Monomere an den gleichen Rezeptor, der auf
sensitiven Zellen in Kopienzahlen von 200 bis 10 000 exprimiert wird und aus zwei
Proteinketten besteht: IFNAR1 und IFNAR2.
•  Wahrscheinlich nur eine Isoform von IFNAR1.
•  Aber drei unterschiedliche Isoformen von IFNAR2. Diese entstehen durch
alternatives Spleißen, überspringen von Exons und die Wahl unterschiedlicher
Polyadenylierungsstellen. Letztendlich resultieren daraus eine lange und eine
kurze transmembranäre Version, die als IFNAR2c beziehungsweise IFNAR2b
bezeichnet werden. Die dritte Isoform ist eine lösliche IFNAR2a-Kette.
1. Interferone!
Interferon-Rezeptoren:
Die Signaltransduktion von Typ-I-Interferonen moduliert die Expression von mehr
als 150 Genen, über die z.B. die Reifung dendritischer Zellen, das Überleben von
T-Zellen oder die Antigenpräsentation mittels MHC-I-Proteinen gesteuert werden.
Polymorphismen der IFNAR stehen im klaren Zusammenhang mit der Anfälligkeit
gegenüber Multiple Sklerose, Trypanosomiasis, HIV, und Hepatitis-B- und -C-Viren.
Während einer chronischen Hepatitis-C-Infektion werden mehr als 10-fach mehr
IFNAR2-Transkripte gebildet und die erhöhte Serumkonzentration von sIFNAR2a
korreliert mit der erhöhten 2´-5´-Oligoadenylat-Synthetase-Aktivität.
Die intrazellulären
Signaltransduktionswege werden durch
Tyrosinkinasen
aktiviert, die als JanusKinasen (JAKs) und als
"Tyrosin-spezifische
Kinase" (TYK)
bezeichnet werden.
Werden diese aktiviert,
phosphorylieren sie so
genannte STATProteine (signal
transducers and
activators of
transcription), die
dimerisieren und in den
Zellkern einwandern.
Dort fungieren sie dann
als spezifische
Transkriptionsfaktoren
1. Interferone!
Bei der Typ-ISignaltransduktion
komplexieren STATKomplexe mit IRF9
(IFN-regulierender
Faktor 9). Der
Transkriptionsfaktor
bindet dann an ein
"interferon-stimulated
response
element" (ISRE), das
sich im Bereich solcher
Gene befindet, deren
Transkription durch
Typ-I-Interferone
induziert wird.
1. Interferone!
1. Interferone!
Interferon-Rezeptoren:
Das Typ-II-Interferon IFN-γ bindet als Homodimer an einen Rezeptor, der aus den
Untereinheiten IFNGR1 und IFNGR2 aufgebaut wird und sich in variablen Mengen
auf allen kernhaltigen Zellen in einer Kopienzahl von 200 bis 25 000 Molekülen
befindet.
IFNGR1 gilt als die Ligand-bindende Untereinheit, während IFNGR2 als SignalVermittler agiert.
Zunächst führt die Ligandbindung zu einer Dimerisierung von IFNGR1. An diesen
Komplex assoziieren dann noch zwei Moleküle IFNGR2 und es kommt zur
Transphosphorylierung und Aktivierung der Janus-Kinasen (JAKs) und zur
weiteren Signalweiterleitung.
Mutationen im IFNGR1, die eine Interaktion mit IFN-γ verhindern, führen zu
lebensbedrohlichen autosomal rezessiven Störungen des Immunsystems und sind
die molekulare Ursache für die so genannte disseminierte atypische
Mycobakterium-Infektion.
Typ-II-Interferon
induziert die
Homodimerisierung von
STAT-1. Dieser
Komplex bindet im Kern
an so genannte
"gamma-interferon
activation sites" (GAS)
und aktiviert dadurch
die nachgeschalteten
Gene.
1. Interferone!
1. Interferone!
Biochemische und pharmakologische Eigenschaften der Interferone:
Nach Bindung des Interferons an seinen Rezeptor werden "IFN-induzierbarer
Gene" exprimiert.
•  “Antivirale Aktivität”
•  Inhibition der Zellproliferation
•  Regulation der Zelldifferenzierung und andere zelluläre Aktivitäten
•  Modulation des Immunsystems.
Obwohl sich die Typ-I- und die Typ-II-Interferone strukturell deutlich voneinander
unterscheiden, obwohl sie unterschiedliche Rezeptoren ansteuern und damit
verschiedene Signaltransduktionswege initiieren und obwohl sie unterschiedliche
Gene induzieren, sind die Effekte, die die Typ-I- und die Typ-II-Interferone
auslösen, zwar quantitativ durchaus unterschiedlich, qualitativ aber in weiten
Zügen auch deutlich überlappend.
1. Interferone!
Biochemische und pharmakologische Eigenschaften der Interferone:
Protein
Funktion
Induktion durch
Typ-I-IFN
Typ-II-IFN
2'-5'(A)-Synthetase
dsRNA-abhängige Synthese
von 2'-5'(A); Aktivator der
RNase L
+
+
Protein (p68) Kinase
(PKR) (durch dsRNA
aktivierbare
Proteinkinase)
Phosphorylierung des
Translations-Initiationsfaktors
eIF-2a
+
±
Klasse-I-MHC-Antigene
(HLA-A,B,C) (incl.β2Mikroglobulin)
Antigenpräsentation
gegenüber zytotoxische TLymphozyten
+
+
Klasse-II-MHC-Antigene
(HLA-DR)
Antigenpräsentation
gegenüber TH-Lymphozyten
±
+
1. Interferone!
Biochemische und pharmakologische Eigenschaften der Interferone:
Protein
Funktion
Induktion durch
Typ-I-IFN
Typ-II-IFN
Indolamin-2,3dioxygenase
Tryptophanmetabolismus
(Katabolismus)
±
+
Guanylat-Bindeproteine
(GPB; γ67)
GTP-, GDP-Bindung
±
+
Mx-Protein
GTPase, spezifischer
Inhibitor des Influenza-Virus
+
-
IP-10
CXC-Chemokin
±
+
Metallothionin
Metall-Entgiftung
+
+
TNF-Rezeptoren
Vermittler von TNF-Effekten
±
+
IL-2-Rezeptoren
Vermittler von IL-2-Effekten
-
+
1. Interferone!
Biochemische und pharmakologische Eigenschaften der Interferone:
Protein
Funktion
Induktion durch
Typ-I-IFN
Typ-II-IFN
GM-CSF-Rezeptor
Vermittler von GM-CSFEffekten
-
+
Interzelluläres
Adhäsionsmolekül-1
(ICAM-1; CD54)
Endotheliales
Zelladhäsionsmolekül GTP-,
GDP-Bindung
-
+
Immunglobulin-FcRezeptor (FcR)
Immunglobulinbindung durch
Makrophagen/Neutrophile
±
+
Thymosin β4
Induktion der Terminalen
Transferase in BLymphozyten
+
?
1. Interferone!
Die antivirale Aktivität:
Interferone versetzen Zellen in einen "antiviralen Zustand“.
• Die 2'-5'-Oligoadenylat-(2'-5'[A])-Synthetase wird durch eine doppelsträngige RNA
(dsRNA) aktiviert. Sie katalysiert die Synthese eines Oligonukleotids, das nur aus
A-Nukleotiden besteht, wobei die einzelnen Nukleotide untypischer Weise 2' —> 5'
miteinander verknüpft sind.
• Das atypische Oligonukleotid 2'-5'-(A) aktiviert nun seinerseits die Ribonuklease L
(RNase L), die sowohl mRNA als auch rRNA im Zytoplasma degradiert.
1. Interferone!
Die antivirale Aktivität:
Interferone versetzen Zellen in einen "antiviralen Zustand“.
• In erster Linie Typ-I-Interferone induzieren die Doppelstrang-RNA-abhängige
Proteinkinase PKR. PKR hat eine N-terminale regulatorische und eine C-terminale
katalytische Domäne. Bindet doppelsträngige RNA an die regulatorische Domäne,
dimerisiert PKR und phosphoryliert sich selbst, so dass die Kinase aktiviert wird.
• Ein wichtiges Substrat der PKR ist der eukaryontische TranslationsInitiationsfaktor eIF2α, der durch die PKR phosphoryliert und damit inaktiviert wird.
• Als Konsequenz wird dann die Translation viraler mRNA gestoppt. Als weitere
Funktionen der PKR werden die Induktion der Apoptose sowie die Regulation der
Interferon-Synthese diskutiert.
1. Interferone!
Die antivirale Aktivität:
Interferone versetzen Zellen in einen "antiviralen Zustand“.
• Typ-I-Interferone induzieren Mx-Proteine, die eine Unterklasse der DynaminFamilie großer GTPasen bilden. Diese Proteine haben eine N-terminale GTPaseDomäne, in der Mitte eine central interactive domain (CID) und eine C-terminale
Effektor-Domäne mit Leucin-Zipper-Motiven und sind an der Abschnürung von
Vesikeln und somit am intrazellulären Transport beteiligt. Das MxA erkennt das
virale Ribonukleotid im Capsid einiger Orthomyxo- und Bunyaviren. Zu den
Orthomyxoviren gehören z.B. die Influenzaviren, so dass MxA auch hier aktiv ist.
• Ferner sind noch weitere, eventuell antiviral aktive Proteine bekannt, wie die IFNinduzierte 3’-5’ Exonuklease ISG20, die spezifisch einzelsträngige RNA abbaut,
oder P56, das an den eukaryontischen Translations-Initiationsfaktor 3e (eIF3e)
bindet und die Translation generell inhibiert. Oder das Guanylat-Bindeprotein-1
(GBP-1), das ebenfalls antiviral wirkt.
1. Interferone!
Die antiproliferative Aktivität:
•  Die bereits als antiviral wirksam beschriebenen Proteinsysteme 2'-5'(A)Synthetase/RNaseL und PKR/eIF2α scheinen auch antiproliferative Effekte zu
entfalten.
•  Typ-I-Interferone scheinen auch die Cyclin-abhängige CDK-2-Kinase zu
inhibieren. Dieser wichtige Regulator des Zellzyklus vermittelt die
Phosphorylierung des Retinoblastoma-Proteins (RB) und wirkt somit
antiproliferativ.
•  In vitro konnte die antiproliferative Wirkung der Interferone u.a. dadurch bestätigt
werden, dass beispielsweise Interferon alfa-2b das Wachstum menschlicher
Osteosarkomzellen und das Wachstum der menschlichen
Lymphozytenleukämiezelllinie RPMI-8402 zu 80 bis 100 % inhibiert.
1. Interferone!
Die immunmodulierende Aktivität:
•  Interferone verstärken die Expression verschiedener Oberflächenproteine, z.B.
das β2-Microglobulin, die MHC-I-Antigene und der Immunglobulin-G-Fc-Rezeptor
(IgG-FcR).
•  Sowohl die Typ-I- als auch die Typ-II-Interferone können die Expression der
MHC-I-Antigene stimulieren und damit die Reaktion der zytotoxischen T-Zellen
verstärken.
•  Von IFN-γ ist bekannt, dass es die Bildung des Immunproteasoms induziert, das
das normale zelluläre Proteasom ersetzt. Vermutlich beeinflusst IFN-γ darüber
die Quantität, Qualität und das Repertoire der über MHC-I präsentierten Peptide
und verstärkt dadurch die Reaktivität der CD8+-T-Zellen.
•  Nur IFN-γ, nicht die Typ-I-Interferone, kann die Expression von MHC-II-Molekülen
steigern.
•  IFN-γ besitzt einen potenzierenden Effekt auf die Immungobulinsekretion von BZellen in der späten Phase der Immunantwort und induziert den Wechsel des
Immunglobulin-Isotyps.
1. Interferone!
Die immunmodulierende Aktivität:
•  Als eine Reaktion auf ein IFN-γ-Signal wird verstärkt IL-12 gebildet, das
zusammen mit IFN-γ die Entwicklung von CD4+-T-Zellen in Richtung Th1-Zellen
treibt. Gleichzeitig inhibiert IFN-γ das Wachstum von Th2-Zellen.
•  Zusammen mit anderen Lymphokinen kann Gamma-Interferon auch die Reifung
und Proliferation von ruhenden B-Lymphozyten induzieren.
•  Es aktiviert reife Neutrophile und Monozyten/Makrophagen.
•  Wahrscheinlich ist IFN-γ auch identisch mit einem (oder repräsentiert einen) der
so genannten Makrophagen-aktivierenden Faktoren (MAF).
•  Schließlich inhibiert IFN-γ die Migration von Makrophagen und ist identisch mit
dem Migrations-inhibierenden Faktor oder MIF.
2. Indikationen!
für Alpha-Interferone!
Hepatitiden als Hauptindikation für rekombinante Alfa-Interferone:
Die Hauptindikation der rekombinanten Alfa-Interferon-Präparate ist
zwischenzeitlich ganz eindeutig die Behandlung der chronischen Hepatitis C. AlfaInterferone haben die Behandlung dieser schweren Infektionskrankheit
revolutioniert.
2. Indikationen!
für Alpha-Interferone!
Hepatitis-Viren:
Von den bisher fünf bekannten Hepatitis-Viren sind die Hepatitis-Viren A (HAV), B
(HBV) und C (HCV) von größter medizinischer Relevanz
2. Indikationen!
für Alpha-Interferone!
Hepatitis A
In Deutschland macht sie ca. 50 % aller viral bedingten Leberentzündungen aus,
besonders weit verbreitet ist sie jedoch in Asien, Afrika, südlichen
Mittelmeerländern und großen Teilen Osteuropas
HAVRegion
Endemierate
Sehr hoch
Afrika, Teile Südamerikas,
des Mittlerer Osten und
Südostasiens
Alter der Patienten
[Jahre]
Unter 5
Wahrscheinlicher Übertragungsweg
Hoch
Brasiliens
Amazonasbecken, China,
Lateinamerika
5 - 14
Mensch-zu-Mensch, kontaminiertes
Essen oder Wasser
Mittel
Süd- und Osteuropa,
einige Regionen des
Mittleren Osten
5 - 24
Mensch-zu-Mensch, kontaminiertes
Essen oder Wasser
Niedrich
Australien, USA,
Westeuropa
5 - 40
Kontakt zu einer einzigen Quelle (nicht
Mensch-zu-Mensch)
Sehr niedrich
Nordeuropa, Japan
Über 20
Exposition während Reisen in HochEndemiegebieten, vereinzelte Fälle
Mensch-zu-Mensch, kontaminiertes
Essen oder Wasser
2. Indikationen!
für Alpha-Interferone!
Hepatitis A
HAV gehört zur Gruppe der Picornaviren und hat eine einzelsträngige RNA von ca.
7500 Basen Länge in Plusstrangorientierung, d.h. das RNA-Molekül kann in der
infizierten Zelle direkt als mRNA zur Proteinbiosynthese verwendet werden.
2. Indikationen!
für Alpha-Interferone!
Hepatitis A
HAV hat keine Lipidhülle, ist extrem widerstandsfähig gegenüber verschiedene
Umwelteinflüsse und kann gut in kontaminiertem Trinkwasser, Meerwasser,
Abwasser, Erde, Meeressediment überdauern. Es übersteht selbst eine
Hitzebehandlung von 70°C für bis zu 10 min, eine 2-stündige Säurebehandlung bei
pH 1 oder auch eine Inkubation mit 1% SDS-Lösung für 30 min bei 37°C recht
unbeschadet. Inaktiviert wird das Virus durch Erhitzen auf 85°C oder Autoklavieren
bei 121°C für 20 min bzw. auch durch UV-Bestrahlung.
Das Virus wird mit dem Stuhl ausgeschieden und dann fäkal-oral über Schmutzund Schmierinfektion weitergegeben. Eine Übertragung ist auch über verunreinigte
Lebensmittel (rohe Meeresfrüchte, Eis, Obst, Salat), durch verschmutztes
Trinkwasser und selten auch durch Blut und Speichel oder sexuellen Kontakt mit
Erkrankten in der virämischen Phase möglich.
Zwischen der HAV-Infektion und der akuten Erkrankung liegen etwa 15 bis 50 Tage
(im Allgemeinen 25 bis 30 Tage).
In etwa einem von tausend Fällen kommt es zu einem akuten Leberversagen mit
hoher Sterblichkeit.
2. Indikationen!
für Alpha-Interferone!
Hepatitis A
Für die akute Hepatitis A gibt es keine besondere Behandlungsmöglichkeit
abgesehen von symptomatischen Maßnahmen wie Bettruhe und Behandlung der
Allgemeinsymptome.
Eine aktive Schutzimpfung mit monovalentem Impfstoff bietet bereits nach der
ersten Dosis einen ausreichenden Schutz nach ca. 12 bis 15 Tagen und kann
wegen der relativ langen Inkubationszeit auch noch kurz vor Reiseantritt und sogar
kurz nach der Exposition noch verabreicht werden.
Niedriger dosierte Impfstoffe bzw. auch die Hepatitis-A/B-Kombinationsimpfstoffe
bieten jedoch erst nach zwei bis drei Injektionen einen ausreichenden Schutz.
Der Impfstoff besteht aus in vitro gezüchteten und anschließend mit Formalin
inaktivierten Hepatitis-A-Viren und kann keine Infektion hervorrufen.
Die Dauer des Impfschutzes beträgt im Allgemeinen mindestens 10 Jahre und
kann durch die Bestimmung der Hepatitis-A-Antikörper (Bluttest) festgestellt
werden.
2. Indikationen!
für Alpha-Interferone!
Hepatitis B
Die Hepatitis B gehört weltweit zu den häufigsten ansteckenden Krankheiten.
Weltweit haben etwa 2 Milliarden Menschen eine HBV-Infektion durchgemacht und
5 bis 7% der Weltbevölkerung (ca. 350 Millionen Menschen) sind chronisch mit
HBV infiziert.
Jedes Jahr treten ca. 4 Millionen akute klinische Hepatitis-B-Fälle auf und jedes
Jahr sterben ca. 1 Million Menschen an einer chronischen Hepatitis, Leberzirrhose
oder Leberkarzinom.
In der Bundesrepublik Deutschland ist bei 7 % der Gesamtbevölkerung anti-HBc
als Merkmal einer durchgemachten HBV-Infektion nachweisbar. Davon sind 0,6 %
(95% Vertrauensbereich 0,3 – 0,8%) chronische HBsAg-Träger. Dies entspricht
300.000 bis 650.000 Personen.
Die Hepatitis B steht in Deutschland an zweiter Stelle (30 %) bei den viral
bedingten Leberentzündungen.
2. Indikationen!
für Alpha-Interferone!
Hepatitis B
Die Hepatitis B wird durch das Hepatitis-B-Virus (HBV) verursacht, von dem
mittlerweile acht verschiedene Genotypen (A – H) und acht HBsAg-Subtypen
bekannt sind. HBV gehört zu den Hepatitis-DNA-Viren (Hepadnaviren) mit einem
zirkulären und teilweise doppelsträngigen DNA-Genom und einer Lipidhülle und ist
somit nicht mit HAV verwandt.
Der größte Leserahmen codiert für die
Polymerase, die als Reverse Transkriptase und
RNaseH fungiert und außerdem am N-Terminus
die Sequenzen des terminalen Proteins trägt,
das kovalent mit dem 5’-Ende des
Minusstranges verknüpft wird. Der zweitgrößte
Leserahmen codiert für die verschiedenen
Formen des Oberflächenproteins HBsAg. Die
anderen beiden Leserahmen codieren für das
Capsid-Protein HBcAg und das sezernierte
Protein HBeAg sowie für das so genannte XProtein (HBx).