Industrie-Applikationen
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Industrie-Applikationen 313 Plasmid-DNA Aufreinigung für Hochdurchsatz-Anwendungen Andreas Gigler, Barbara Behrens Einführung Plasmide sind die „Arbeitspferde“ in der Molekularbiologie, was sich unter anderem darin widerspiegelt, dass Plasmid-DNA das am häufigsten aufgereinigte Probenmaterial in molekularbiologischen Laboren ist. Die rapide wachsende Bedeutung molekularbiologischer Arbeitstechniken bedingt daher gerade bei Plasmiden die Notwendigkeit zur Durchsatzerhöhung und damit zur verstärkten Parallelisierung der Aufreinigung. Gleichwohl stellt dies sehr hohe Anforderungen an die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse bei höchster Qualität und an eine minimale Störanfälligkeit. Ferner muß die Handhabung einfach gestaltet sein, um eine schnelle Einarbeitung zu gewährleisten. Diesen Ansprüchen an ein Hochdurchsatzsystem aus optimierten Reagenzien, automatisierungstauglichen Verbrauchsmaterialien und einem zuverlässigem Liquid-Handling-Automat haben sich die Eppendorf AG und Robbins Scientific’s gemeinsam gestellt. Das Ergebnis ist eine optimal aufeinander abgestimmte Applikation der High Throughput Eppendorf Perfectprep Plasmid Kits mit dem Robbins Hydra Microdispenser. Die Aufreinigungstechnologie Der Perfectprep Plasmid 384 Kit verwendet Filterplatten mit einer neuartigen Membrantechnologie und darauf abgestimmte Reagenzien. Das ergibt im Zusammenspiel folgende gute Ergebnisse: • Hohe Konzentration: Durch den Einsatz der komplett neu entwickelten ultradünnen Membran und optimierter Filterplatten sind minimale Totvolumen bei der Elution sichergestellt. Das gewährleistet minimale Verluste, ermöglicht geringe Elutionsvolumina und damit sehr hohe Plasmidkonzentrationen nach der Aufreinigung. • Hohe Ausbeute: Die Membran weist spezielle Oberflächenvergrößerungen auf. Diese führen zu einer besonders hohen Bindungskapazität und ermöglichen selbst bei den sehr kleinen Durchmessern eines 384 wells hohe Ausbeuten. • Gute Reproduzierbarkeit: Durch optimierte Filterplatten konnte eine hohe well to well Uniformität innerhalb Abbildung 2: Der Robbins Hydra Microdispenser. BIOspektrum · 3/02 · 8. Jahrgang Abbildung 1: Schematischer Ablauf der Perfectprep Plasmid 384 Aufreinigung. einer Platte und auch zwischen verschiedenen Platten erreicht werden. Da außerdem keine umständliche Alkoholfällungen notwendig sind, ist der gesamte Ablauf sehr einfach durchführbar. Trotz des Einsatzes dieser neuen Technologien unterscheidet sich der Ablauf nicht grundlegend von den anderen membranbasierten EppendorfAufreinigungsverfahren. Dadurch ist eine schnelle Einarbeitung gewährleistet: • Nach der Anzucht und Pelletierung der Bakterien im Mirotiterplattenformat folgt eine modifizierte alkalischen Lyse und eine Filtration des Lysats, über Zentrifugation oder mittels Vakuum. Dabei werden sowohl die chromosomale bakterielle DNA als auch Zelltrümmer abgetrennt. RNA wird während der Lyse und der Filtration über RNasen abgebaut. • Anschließend bindet die Plasmid-DNA selektiv an die Membran der Filterplatten, so dass verbleibende Rückstände weggewaschen werden können. • Final wird die Plasmid-DNA mit molecular biology grade water oder einem Elutionspuffer (10 mM Tris, 0,1 mM EDTA, pH 8,5) wieder von der Membran eluiert und ist sofort für Downstream Anwendungen einsetzbar. Die gewonnene Plasmid-DNA ist hochrein und weist keine Kontamination an chromosomaler DNA oder RNA auf. Der Automat Beim Robbins Hydra Microdispenser handelt es sich um sehr kompaktes Gerät, das mit einem 96er oder einem 384er Pipet- Industrie-Applikationen 314 Abbildung 3: a) Ausschnitt aus einer Sequenz einer mit dem Perfectprep Plasmid 384 Kit aufgereinigten Probe. b) Agarosegel (1% in 0,5 x TBE). Je 2 µl von 96 repräsentativen Proben einer Perfectprep Plasmid 384 Aufreinigung wurden aufgetragen. tierkopf und drei unabhängigen Pumpen ausgerüstet ist, und so eine extrem schnelle Bearbeitung der Perfectprep Plasmid 384 Platten bei hoher Pipettiergenauigkeit gewährleistet. Die Bewegung der Platten, z.B. beim Transfer der Proben in die Filterplatten, wird von einem computergesteuerten Plattenpositioniersystem automatisch ausgeführt. Da der Microdispenser mit Edelstahlnadeln und einer sehr effizienten Waschstation ausgerüstet ist, benötigt er keine Wechselspitzen und ist somit sehr ökonomisch zu betreiben. Das Komplettsystem Der Perfectprep Plasmid 384 Kit ist für den Hochdurchsatz konzipiert. Alle Schritte, von der Anzucht und Lyse der Bakterien bis zur Elution, finden im 384 Format statt. Dadurch wird eine sehr kurze Bearbeitungszeit erreicht. Im System mit dem Robbins Hydra Microdispenser zeigt sich das ganz deutlich: Die Bearbeitung von 384 Proben beansprucht mit einem 96er Kopf weniger als eine Stunde, mit einem 384er Kopf sind es sogar weniger als 40 Minuten. Das entspricht deutlich weniger als 10 Sekunden pro Probe. Zum System gehören neben dem Kit und dem Microdispenser auch ein Vortexer (VWR Microplate Vortexer) und eine Plattenzentrifuge (z.B. die Ep- pendorf 5810 R) und optional eine Vakuumkammer (Eppendorf single oder quad manifold). Typischerweise mit dem System erreichte Werte sind im folgenden dargestellt: Ausbeute Abhängig von der Kopienzahl der Plasmide und den Wirtsstämmen sind Ausbeuten von 1 µg Plasmid-DNA bei lediglich 300 µl Kulturvolumen standardmäßig zu erreichen. Für maximale Ausbeuten können auch problemlos sehr nährstoffreiche Medien wie 2xYT oder TB verwendet werden. Konzentration Da mit lediglich 10 bis 15 µl eluiert wird, sind die DNA-Konzentrationen im Eluat mit ca. 60 bis 100 ng/µl sehr hoch. Durch die Automatisierung wird die Variabilität zwischen den einzelnen Proben (die durch Fehler beim manuellen Pipettieren zustande kommen) drastisch verringert und damit eine Konzentrationsbestimmung aller Proben vor dem Einsatz in downstream Anwendungen überflüssig. Reinheit Der durchschnittliche A260/A280 Wert der aufgereinigten Plasmid-DNA liegt bei 1,86, womit sie für die allermeisten down- stream Anwendungen sofort eingesetzt werden kann z.B. für: • Manuelle und automatische Sequenzierung • Restriktionsverdau • PCR • Transformation und Ligation Fluoreszenz-Sequenzierung der aufgereinigten Plasmid-DNA Die hohe Qualität der aufgereinigte Plasmid-DNA stellt sicher, dass die Sequenzierergebnisse hervorragend sind. Es werden besonders lange Leseweiten ohne „No Calls“ und äußerst geringen Fehlerraten erzielt: Die durchschnittlichen Leseweiten mit einem PHRED Q>20 liegen deutlich über 600 Basen. Dabei können allen gängigen Sequenziersystemen wie den ABI 377, 310 und 3700 (ABI BigDey Terminator Cycle Sequencing Kit), Li-Cor (IR Dye 800 Terminaor Mix) und MegaBACE 1000 DNA Sequencer (DYEnamicET Terminator Kit) verwendet werden. Andere Durchsatzanforderungen Für den noch höheren Durchsatz bietet Eppendorf weitere Komplettsysteme an. Auch diese basieren auf Filterplatten im 384er Format. In der Bearbeitung mit einem Zymark Roboter lässt sich hier der Durchsatz auf fünfzig 384-Well-Platten (19200 Proben) erhöhen, die innerhalb von 16 Stunden bearbeitet werden. Dabei ist während der gesamten Bearbeitung kein Eingriff durch den Bediener notwendig. Auch für kleinere Probendurchsätze gibt es eine perfekte Lösung von Eppendorf: Das Perfectprep Plasmid 96 Vac DB Kit. Abhängig von der Kopienzahl der Plasmide und den Wirtsstämmen sind Ausbeuten von bis zu 15 µg Plasmid-DNA pro ml Kultur bei high-copy Plasmiden und 0,05-0,06 µg Plasmid-DNA bei low-copy Plasmiden zu erreichen. Der Kit kann sowohl manuell als auch halb- oder vollautomatisiert betrieben werden. Hierbei sind Durchsätze von 1–100 Platten pro Tag möglich. Korrespondenzadresse Eppendorf AG 22331 Hamburg Deutschland Tel.: +49 40-5 38 01-0 · Fax: +49 405 38 01-556 E-mail: [email protected] Internet: www.eppendorf.com Anwendungs-Hotline: Tel.: +49 1803 66 67 89 E-mail: [email protected] BIOspektrum · 3/02 · 8. Jahrgang
