Plasmidpräparation - molekulargenetsiche Experimente IV

Molekulargenetische Experimente IV:
Plasmidpräparation
Plasmide sind kleine, ringförmige DNA-Moleküle in Bakterien, die in der
Lage sind, sich selbst mit Hilfe von Enzymen zu replizieren. Gene, die auf
Plasmiden lokalisiert sind, besitzen eine große Mobilität, das heißt, in der
Natur tauschen Bakterien in parasexuellen Vorgängen Erbinformationen
aus, die auf Plasmid-DNA sitzt. Diese Informationen stellen häufig
Resistenzgene gegen Antibiotika dar, sind also für die Bakterien extrem
wichtig im Überlebenskampf, allerdings sehr zum Nachteil bei der
Bekämpfung von Infektionskrankheiten.
Plasmide haben eine große Bedeutung in der Gentechnologie erlangt. Da sie
sich so leicht isolieren und einschleusen lassen, kann man sie als Vektoren
verwenden, um bestimmte Erbanlagen in andere Organismen künstlich
einzubauen und ihnen damit Fähigkeiten zu verleihen, die sie von Natur aus
nicht hätten. Paradebeispiel sind Bakterien, die durch Einbau menschlicher
Gene in der Lage sind, das Hormon Insulin zu produzieren, das an Diabetes
erkrankte Personen injiziert werden kann. Diesen Prozess bezeichnet man
als Transformation.
Im Rahmen unseres Praktikums im Februar 2007 führten wir im Genlabor
der EFS von Frau Dr. Hausmann auch eine Plasmid-Präparation durch. Wir
experimentierten mit den für Menschen harmlosen Escherichia coli K-12
Stämmen DH-5α
α und HB101.
Die Plasmid-Präparation besteht im Wesentlichen aus folgenden Schritten:
1.
Alkalische Lyse der Bakterienzellen und Reinigung der Plasmid-DNA
Hierzu werden die Bakterienzellwände mit einer alkalischen Lösung
aufgeschlossen und denaturiert. Durch den TENS-Puffer werden die
Wasserstoffbrückenbindungen der gesamten DNA aufgehoben. Durch
anschließende Neutralisation mit Natriumacetat finden
die
Einzelstränge des Plasmids wieder zusammen, sie bleiben in Lösung.
Die zelluläre DNA des Bakteriums ist zu groß, um basengenau
zusammen zu finden, es kommt zu Fehlbasenpaarungen, deshalb kann
man sie als Knäuel durch Zentrifugation vom Plasmid abtrennen.
Reinigungsprozesse, Abzentrifugieren und Verdau durch eine RNase
sollen für einen hohen Reinheitsgrad der Plasmid-DNA sorgen.
2.
Restriktionsanalyse
Die Restriktionsanalyse liefert in erster Näherung, ob ein Plasmid,
das man in Bakterien eines anderen Stammes einschleusen wollte, dort
auch tatsächlich repliziert wurde, also ob die Transformation auch
gelungen ist. Dazu wird in einem Restriktionsverdau Plasmid-DNA mit
Hilfe eines spezifischen Enzyms, das wie eine molekulare Schere
arbeitet, in Fragmente geschnitten. Wir verwendeten die Nuclease
EcoRI. Durch einen Probenpuffer färbten wir die Reaktionslösung
blau.
3.
Gelelektrophorese
Die Proben werden zusammen mit einer DNA-Leiter als Maßstab in die
Taschen eins Agarose-Gels gefüllt. Dabei muss man aufpassen, dass
man mit der Pipettenspitze nicht das Gel durchstößt. Die Fragmente
werden nun im elektrischen Feld der Größe nach aufgetrennt. Dabei
kann man übrigens auch sehen, wer sauber gearbeitet hat!
4.
Transformation
Es gibt verschiedene Methoden der Transformation, aber in jedem
Fall möchte man ein ausgetestetes Plasmid mit einem bestimmten Gen
(oder mehreren) in einen anderen Organismus schleusen. Unser
Plasmid enthielt zusätzlich ein Resistenzgen gegen das Antibiotikum
Ampicillin (ampr). Damit die Bakterien die Plasmide aufnehmen,
„stressten“ wir sie in der Kälte, so dass die Zellwände perforiert
wurden. Nach Inkubation und Schütteln plattierten wir die Bakterien
auf Ampicillin-Platten. Das Antibiotikum selektierte also alle
Bakterien aus, die kein Plasmid aufgenommen haben.
das Verlaufsschema
Frau Dr. Hausmann gießt die Agarose-Gele in den vorbereiteten
Kammern.
Vanessa zentrifugiert bei 13000 rpm feste Bestandteile und
denaturierte DNA ab.
Aufgepasst Mädels: Nichts ist kribbliger als Vortexen!
Julia, Mikela, Tamara und Angela
Höchste Konzentration beim Umgang
Eppendorf-Pipetten: Patrick und Eduard
mit den sensiblen
UV-Licht bringt es an den Tag! Hier kann man auch sehen,
wer sauber gearbeitet hat!