5.2 Vektoren und Selektion

Biologie 11, Herr Blaurock
5.2 Vektoren und Selektion: Begriffe und Definitionen
Die Aufgabe eines Vektors ist der Transport eines DNA-Abschnitts in eine Zielzelle. Daher werden sie
auch als „Gentaxi“ bezeichnet. Dabei gibt es unterschiedliche Arten von Vektoren.
Plasmide sind ein typischer Vektor und können genutzt werden um DNA in
Bakterienzellen einzuschleusen. Plasmide sind in der Zelle nicht in das
große Bakterienchromosom eingebaut, sondern liegen als separater DNARing im Cytoplasma vor. Diese DNA wird jedoch vom Bakterium genauso
verwendet
(transkribiert)
und,
falls
auf
dem
Plasmid
ein
Rekplikationsstartpunkt (kurz ori für „origin of replication) liegt, bei der
Zellteilung repliziert und an die Tochterzellen weitergegeben.
Die gentechnische Veränderung eines Plasmids findet außerhalb des Bakteriums statt. Hierzu muss
sowohl der gewünschte DNA-Abschnitt aus dem Ursprungschromosom ausgeschnitten als auch das
Plasmid
an
der
Einbaustelle
aufgetrennt
werden.
Dazu
verwenden
Gentechniker
ein
Restriktionsenzym das bestimmte DNA-Sequenzen erkennen und auftrennen kann. Die DNA kann
dabei glatt durchgeschnitten werden, so entstehen sogenannte blunt ends, oder aber es stehen nach
dem Schnitt am 3‘- bzw 5‘-Ende einige Basen über, die sogenannten sticky ends. Letztere haben den
Vorteil, dass zwei vom gleichen Enzym geschnittene Enden durch die Wechselwirkung der
korrespondierenden DNA-Basen von selbst aneinanderhaften.
Nach dem Einbau der rekombinanten DNA in das Plasmid muss
noch das DNA-Rückgrat geschlossen werden. Hierzu dient, wie bei
der DNA-Replikation, das Enzym Ligase. Ein DNA-Molekül, das im
Labor
(in
vitro)
durch
gentechnische
Methoden
neu
zusammengesetzt wurde bezeichnet man als rekombinante DNA.
Aus dieser DNA entstehen rekombinante Proteine.
Transformation und Selektion
Das rekombinante Plasmid, auch Hybridplasmid genannt, muss nun in Bakterienzellen eingebracht
werden. Dieser Vorgang wird als Transformation bezeichnet. In der Gentechnik wird hierzu die
Zellwand der Bakterien durch Zugabe von Calciumchlorid oder mithilfe von Ultraschall durchlässig
gemacht, im Anschluss nehmen die Zellen die Plasmide teilweise selbstständig auf.
Nach der Transformation müssen schließlich diejenigen Bakterien aussortiert werden, die kein
Hybridplasmid bzw. ein Plasmid ohne die rekombinante DNA aufgenommen haben. Dieser Vorgang
wird als Selektion bezeichnet. Ein Typ der Selektion beruht darauf, dass die richtigen Bakterien an
Proteinen, die durch die rekombinante DNA produziert werden, erkannt werden können
(beispielsweise durch fluoreszierende Eigenschaften unter UV-Licht [GFP, green flourescent
protein]). Alternativ wird ein Selektorprotein durch einen Plasmidabschnitt codiert, in dem die
Bindungsstelle des Restriktionsenzyms liegt. Im rekombinanten Plasmid ist die Proteinsequenz durch
die neue DNA unterbrochen und das Selektorprotein wird durch die gewünschten Bakterien nicht
mehr hergestellt (beispielsweise ein Enzym, dass Indikatormoleküle färbt: Nicht gefärbte Bakterien
enthalten das gewünschte Plasmid). In diesem Fall müssen aber Bakterien ganz ohne Plasmid zuerst
aussortiert werden. Dies geschieht meist durch eine Antibiotikaresistenz, deren Gen auf einem
anderen Plasmidabschnitt liegt. Die Selektion kann aber auch rein aufgrund von Antibiotikaresistenzen erfolgen (siehe Rückseite). Gene die der Selektion dienen heißen Markergene.
Biologie 11, Herr Blaurock
5.2 Vektoren und Selektion: Selektion durch Antibiotikaresistenzen
Die Abbildung rechts stellt die sogenannte „Stempeltechnik“ zur
Selektion von transformierten Bakterienkulturen dar. Hierbei
wird
ein
Plasmid
mit
zwei
Markergenen
für
Antibiotikaresistenzen eingesetzt: eine Ampicilinresistenz sowie
eine Tetracyclinresistenz in deren Gen die Schnittstelle für das
eingesetzte Restriktionsenzym sitzt (Siehe Abbildung 1 auf
Natura 11, Seite 113).
a) Kreuze die unten dargestellten Bakterientypen (ohne
Plasmid, mit ursprünglichem Plasmid, mit Hybridplasmid)
aus, die auf den zwei Nährmedien nicht vorkommen.
Begründe deine Antwort kurz.
Master plate:
Begründung: Das Resistenzgen liegt auf dem Plasmid, alle
transformierten Bakterien besitzen also die Ampicilinresistenz und können überleben.
Replica plate:
Begründung: Das Resistenzgen für Tetracyclin liegt zwar auf dem Plasmid, die Sequenz wird aber
durch den Einbau der fremd-DNA unterbrochen und geht damit im Hybridplasmid verloren.
b) Markiere auf der Abbildung zur Stempeltechnik diejenigen Kolonien auf der master plate, die
das Hybridplasmid enthalten. Die Kolonien von der master plate, die bei der replica fehlen.
Zusatzaufgaben (schriftlich ins Heft unter der Überschrift 5.2 Vektoren und Selektion)
1) Bei der Selektion durch Antibiotika werden zwei unterschiedliche Antibiotikaresistenzen
benötigt, ein Resistenzgen alleine reicht nicht aus. Erkläre.
2) Restriktionsenzyme erkennen meist ihre Schnittstelle an palindromischen DNA-Sequenzen
(sprich Sequenzen, die aus 3‘/5‘-Richtung abgelesen auf beiden Strängen identisch sind), wo
ein DNA-Molekül aufgetrennt werden soll. Schreibe ein Beispiel für eine palindromische
Sequenz auf (beide Stränge!). Erkläre welchen Vorteil diese Ansatzstelle für das Enzym hat.
3) Der Austausch von Plasmiden zwischen zwei Bakterien gleicher Spezies ist einer der
Möglichkeiten zum Gentransfer bei Eukaryoten (die sich ansonsten genetisch identisch
teilen). Erkläre anhand der kennengelernten Beispiele welchen Vorteil die Transformation für
Bakterien in der Natur haben könnte.
4) Sogenannte multiresistente Erreger (MRE), die Resistenzgene gegen mehrere Antibiotika
tragen, sorgen jährlich für tausende Tode. In der Tierhaltung ist das Problem noch
dramatischer. Versuche mithilfe deines Wissens zu erklären, warum der Abbruch einer
Antibiotikabehandlung dazu führt, dass vermehrt resistente Keime auftreten. Recherchiere
zuhause, was die moderne Medizin gegen MRE unternimmt.