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Stundenprotokoll vom 3.04.2014 Protokollführerin: Nadine Klinkhammer
1) Gentechnik
1.1 Methode der künstlichen DNA-Rekombination (siehe S.106)
Gentechnik beinhaltet die Isolierung von DNA, deren Rekombination im Reagenzglas und
ihre Übertragung in vermehrungsfähige Zellen.
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1973 gelang es Cohen und Boyer erstmals DNA-Fragmente verschiedener Bakterien zu
kombinieren
Restriktionsenzyme sind die zentralen Werkzeuge der Gentechnik. Sie
 spalten den DNA-Doppelstrang im Inneren und wirken somit wie biochemische
Scheren.
 sind hochspezifisch, das heißt, sie schneiden nur an den Erkennungssequenz.
Diese besteht meist aus vier bist acht Nucleotiden. Bei gentechnisch wichtigen
Enzymen ist die Erkennungssequenz die Schnittstelle. Häufig entspricht die
Basenabfolge des einen DNA-Stranges der Sequenz des komplementären
Stranges in umgekehrter Richtung (Palindrom).
 erzeugen beim versetzten Schneiden überstehende Einzelstrangenden. Enden
die durch das gleiche Restriktionsenzym entstanden sind, sind komplementär.
Man nennt diese Enden sticky ends, da sie sich leicht über
Wasserstoffbrückenbindungen binden.
 schneiden nur DNA, die nicht über Methylgruppen geschützt ist.
Ligasen: Restriktionsenzyme können sticky-ends erzeugen, die sich über schwache
Wasserstoffbrückenbindungen verbinden. Das Enzym Ligase verknüpft die DNAFragmente kovalent unter Ausbildung von Phospho-Esterbindungen.
Grundoperationen der Gentechnik (S.106)
Die Abbildung zeigt:
die Rekombination von DNA
 zunächst wird aus einem Bakterium der Plasmidring isoliert und aus einer
Zelle eine gereinigte DNA mit einem Gen X (Isolation)
 Fremd DNA und Plasmid werden mit dem gleichen Restriktionsenzym
bearbeitet
 es kommt zu einer zufälligen Paarung zwischen den sticky-ends der
verschiedenen DNA-Fragmente  es entsteht eine rekombinante DNA
(Rekombination)
 die rekombinante DNA (Plasmid) wird mit dem Gen X durch das Enzym Ligase
verbunden Ausbildung einer Phospho-Esterbindung
 Plasmide werden als Vektoren („Gentaxis“) genutzt, um Fremd-DNA in einen
anderen Organismus zu transferieren
 abschließend transformiert man die Plasmide in die Bakterien
(Transformation)
 das rekombinante Bakterium kann nun auf andere Organismen übertragen
werden (Organismus besitzt dadurch weitere Eigenschaften)
Zusatzinformationen zur Rekombination:
 Strukturgene von zum Beispiel einem Lac-Operon können ebenfalls als
Fremdgen in Plasmide eingebaut werden  es können Enzyme für den
Laktose- Abbau gebildet werden
 es ist möglich die Produktion an- und abzuschalten  die eingebauten Gene
des Lactose-Operons dienen als Steuerungssequenz in der rekombinanten
DNA
 es können auch Marker-Gene eingebaut werden dienen der Selektion
 dies können Gene sein für Antibiotika-Resistenzen oder Gene deren
Auswirkungen im Organismus sofort zu erkennen sind. (z.B. Farbstoffe)
 Marker sind variabel und können auch mehrfach eingesetzt werden
Prinzip der Selektion/ Genklonierung (siehe S. 107 und Arbeitsblatt Prinzip der Genklonierung)
Die Selektion muss durchgeführt werden, um zu ermitteln welche Plasmide das Fremd-Gen
enthalten.
Ligase kann in diesem Fall nämlich:
 ein Original-Plasmid, mit beiden Resistenzen wieder verbinden
ein rekombinantes Plasmid verbinden, welches die Fremd-DNA besitzt, somit nicht resistent
gegen Ampicillin ist
einen Fremd-DNA-Ring verbinden
es besteht auch die Möglichkeit, dass gar kein Plasmid im Bakterium enthalten ist
Durchführung:
 man nutzt als Vektor ein Plasmid, das Resistenzgene für zum Beispiel die Antibiotika
Ampicillin und Tetracyclin enthält
 Wirtsbakterium weist diese Resistenzen nicht auf
 der Einbau des Fremd-Gens durch das Restriktionsenzym führt zum Verlust der
Ampicillinresistenz (Schnittstelle auf dem Plasmid, liegt auf dem Gen für die AmpicillinResistenz)
 rekombinantes Bakterium kann nur noch auf Nährboden mit Tetracyclin wachsen
 nicht transformierte Wirtszellen können auf keinem der beiden Nährböden wachsen
 nach der Transformation gibt man die Zellen zunächst auf Nährböden mit Tetracyclin
dort wachsen nur Bakterienkolonien mit Plasmid
 mit einem Samtstempel wird die Kolonie auf den Nährboden mit Ampicillin übertragen
 Kolonienmuster werden verglichen man kann ermitteln welche Kolonie nicht mehr auf
Ampicillin wächst
 diese Kolonie enthält das rekombinante Plasmid und wird in Nährflüssigkeit vermehrt
 da so zahlreiche Kopien eines Fremd-Gens entstehen, spricht man von Gen-Klonierung
Restriktionsenzyme und Gelelektrophorese (S. 108):
 trennt DNA-Fragmente auf der Basis ihrer Wandergeschwindigkeit/Größe
 man benötigt ein Gel und elektrisches Feld
 das Agarose-Gel entsteht durch heiße Agaroselösung, die in die Taschen im Gel gegeben wird
 nachdem das Agarose-Gel erstarrt ist wird es mit einer Pufferlösung überschichtet
Bereich zwischen den Elektroden wird elektrisch leitend
 DNA-Fragmente werden mit einem Ladepuffer vermischt (enthält Markerstoff und Glycerin)
 die negativ geladene DNA wandert im elektrischen Feld durch das Gel zur Anode (positiven
Elektrode)
 Gel wirkt wie ein Sieb, durch welches sich kleinere Fragmente schneller bewegen können
 Fragmente werden so der Größe nach aufgetrennt
 abschließend müssen die DNA-Banden durch Farbstoff sichtbar gemacht werden