Methoden der künstlichen DNA-Rekombination

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Gentechnik
1 Methoden der künstlichen DNA-Rekombination
106.1 Grundoperationen der
Gentechnik
1973 gelang es den amerikanischen Wissenschaftlern COHEN und BOYER erstmals, DNAFragmente von verschiedenen Bakterien im
Reagenzglas neu zu kombinieren und in das
Bakterium Escherichia coli einzuschleusen.
Das Bakterium erhielt so neue Antibiotikaresistenzen. Diese Experimente leiteten den
Beginn der Gentechnik ein.
Bakterium
Zelle
Plasmid
wird isoliert
Bakterien- Plasmid
chromosom
gereinigte
DNA
Gen X
DNA mit dem Gen X
Isolation
rekombinante DNA
(Plasmid)
Gen X wird in
Plasmid eingebaut
Rekombination
rekombinantes
Bakterium
Plasmid wird in
Bakterienzelle
übertragen
Transformation
Genkopien werden
isoliert und auf
andere Organismen
übertragen
Pflanzen werden
resistent gegen
Insekten
Anwendung
106
Gentechnik
Zellen mit Gen X
werden kloniert
produziertes Protein
wird isoliert und
wirkt als Enzym
Chymosin stellt aus
Milch Käse her
Plasminogen Aktivator
löst Blutgerinnsel nach
einem Herzinfarkt auf
Gentechnik beinhaltet die Isolierung von
DNA, deren Rekombination im Reagenzglas
und ihre Übertragung in vermehrungsfähige
Zellen.
Ein wichtiges Werkzeug der Gentechnik wurde
bereits in den 60er Jahren entdeckt. Man beobachtete, dass E. coli eine Phageninfektion
erfolgreich verhindert, indem die Phagen-DNA
von Enzymen zerschnitten wird. Den Prozess
bezeichnet man als Restriktion und die Enzyme als Restriktionsenzyme. Die eigene DNA
wird nicht geschnitten, da diese durch Methylgruppen geschützt ist. Heute sind sehr viele
Restriktionsenzyme bekannt. Sie werden nach
der Bakterienart benannt, aus der sie stammen.
So bedeutet der Name EcoRI, dass es als erstes
Restriktionsenzym aus dem Stamm R des Bakteriums Escherichia coli isoliert wurde. HindIII
wurde als drittes Restriktionsenzym aus dem
Stamm d des Bakteriums Haemophilus influenzae gewonnen.
Die unterschiedlichen Restriktionsenzyme finden die spezifische Schnittstelle durch eine
ganz bestimmte Basensequenz aus zumeist
vier bis acht Nucleotiden. Diese Stelle nennt
man deshalb Erkennungssequenz. Bei den
gentechnisch wichtigen Enzymen liegt die
Schnittstelle in der Erkennungssequenz. Für
EcoRI heißt diese Sequenz GAATTC, die
Schnittstelle liegt zwischen G und A. Häufig
ist diese Basensequenz am Komplementärstrang der DNA entgegengesetzt gelesen identisch. So ein Phänomen heißt Palindrom.
Dafür gibt es auch sprachliche Beispiele:
ERIKA FEUERT NUR UNTREUE FAKIRE. Da
der DNA-Doppelstrang versetzt geschnitten
wird, entstehen überstehende Einzelstrangenden. Sie sind zu den Enden der DNA-Fragmente, die mit dem gleichen Restriktionsenzym
geschnitten wurden, komplementär. Man nennt
diese Enden „klebrige Enden“ (sticky ends),
da sie sich leicht über Wasserstoffbrücken verbinden. Das hinzugefügte Enzym Ligase verknüpft dann die DNA-Fragmente kovalent
unter Ausbildung einer Phospho-Esterbindung. Auf diese Weise lässt sich ein DNA-Fragment mit einem gewünschten „Gen X“ in ein
Plasmid einbringen. Man erhält eine rekombinante DNA. Plasmide dienen als Transportmittel, die ein Gen X in Wirtszellen einschleusen. So ein „Gentaxi“ nennt man Vektor. Der
Vorgang des Einschleusens wird als Transformation bezeichnet.
Restriktionsenzym
5’
3’
5’
G
A
A
T
T
C
C
T
T
A
A
G
A
A
T
A
A
Die Bakterien produzieren jetzt das Protein,
das durch das eingeschleuste Gen codiert
wird. Für die Medizin werden auf diese Weise
Enzyme und Hormone hergestellt. So hergestelltes Humaninsulin wird zur nebenwirkungsfreien Behandlung von Diabetes
eingesetzt. Bei einem Herzinfarkt wird ein
gentechnisch hergestelltes Enzym, der Plasminogen Aktivator, in hohen Konzentrationen
injiziert, um das Blutgerinnsel im Herzen in
Sekundenschnelle aufzulösen. Der Jahresumsatz solchermaßen hergestellter Proteine beläuft sich weltweit auf zweistellige Milliardenbeträge. Die Anwendung der Resistenzgene
als Marker nimmt in zunehmendem Maße zugunsten von Genen ab, die für fluoreszierende
Proteine codieren.
T
3’
C
G
T
T
Zugabe eines
DNA-Fragments
klebrige Enden
A
Um herauszufinden, welche Bakterienzellen
Plasmide mit einem Gen X auch wirklich aufgenommen haben, muss noch eine Selektion
durchgeführt werden. Daher verwendet man
als Vektor ein Plasmid, das zwei Antibiotikaresistenzen aufweist, zum Beispiel gegen Tetracyclin und gegen Ampicillin. Das Wirtsbakterium weist diese Resistenzen nicht auf. Die
Schnittstelle auf dem Plasmid, in die das
Gen X eingefügt wird, liegt im Gen für die Ampicillin-Resistenz. Hat das Plasmid das Gen
aufgenommen, so wurde die Resistenz gegen
Ampicillin durch den Schnitt zerstört. Das rekombinante Bakterium kann also auf Nährböden mit Ampicillin nicht mehr wachsen,
wohl aber auf einem Nährboden mit Tetracyclin. Nicht transformierte Wirtszellen können
auf keinem der beiden Nährböden wachsen.
Nach der Transformation lässt man die Zellen
zunächst auf Tetracyclin-haltigem Nährboden
wachsen (1) und überträgt dann durch Stempeln die Kolonien auf den Nährboden mit Ampicillin (2). Aus dem Vergleich der Koloniemuster lässt sich die Kolonie ermitteln, die auf
Ampicillin nicht mehr wächst (3). Diese enthält das rekombinante Plasmid und wird deshalb in einer Nährflüssigkeit vermehrt (4).
unmethylierte
DNA
G
C
5’
EcoR I
A
T
C
T
G
G
3’
C
T
T
A
A
G
A
A
T
T
C
C
T
T
A
A
G
Ligase
5’
3’
Restriktionsenzym
CH3
5’
3’
G
A
A
T
T
C
C
T
T
A
A
G
EcoR I
methylierte
DNA
CH3
EcoR I kann die methylierte DNA an den Schnittstellen nicht schneiden.
107.1 Wirkungsweise von Restriktionsenzymen und Ligase
Plasmide
Gen für
Ampicillin-Resistenz
Gen für
Tetracyclin-Resistenz
Restriktionsenzym
Fremd-DNA
DNA-Ligase
Transformation
von E.-coli-Zellen
DNA der Wirtszelle
1
Kolonie fehlt
Abdruck mit
Samtstempel
2
3 Vergleich
Nährboden mit
Ampicillin
Nährboden mit
Tetracyclin
4
Vermehrung in
Nährflüssigkeit
107.2 Prinzip der Selektion
Gentechnik
107
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