Transgene Organismen

Transgene
Organismen
Themenübersicht
1)
2)
3)
4)
Einführung
Komplementäre DNA (cDNA)
Vektoren
Einschleusung von Genen in
Eukaryontenzellen
5) Ausmaß der Genexpression
6) Genausschaltung (Gen-Knockout)
7) Einschleusung von Genen in Pflanzenzellen
Einführung
Eukaryontengene können in
Bakterienzellen und in höhere
Organismen, also tierische Zellen und
solche höherer Pflanzen, eingeschleust
werden.
Die gentechnisch veränderten
Organismen bezeichnet man als transgen.
Welchen Nutzen bringen uns transgene
Organismen?
▪ Bakterien als Proteinfabriken
▪ Erkenntnis über Wirkungsweise der
Gene
▪ Grundlagen der Gentherapie
▪ Schädlingsresistenz
▪ Erhöhung des Nährstoffgehalts
Komplementäre DNA
Problem: Introns der Eukaryonten-DNA
→ Aufnahme von zur mRNA
komplementären DNA (cDNA)
Bsp. Insulinherstellung
Herstellung von cDNA
• Reverse Transkriptase (Retroviren)
• Bildung eines RNA-DNA-Hybrids
• Oligo(T)-Primer an Poly(A)-Schwanz der
mRNA
• Hydrolyse des RNA-Stranges durch pHErhöhung
• Herstellung von dDNA
Herstellung von cDNA
• Terminale Transferase
• Oligo-Primer
• synthetische Linker zur Ligation in einen
Vektor
→ cDNA-Bibliothek
Herstellung von cDNA
(Stryer: Biochemie, 5.Auflage)
Vektoren
▪ Einbringen der fremden DNA in die
Wirtszelle
▪ Plasmide oder Phagen
→ Expressionsvektoren
▪ Einfügen der cDNA in der Nähe eines
starken bakteriellen Promotors
Suche nach den cDNA-Klonen
• radioaktiv markierte Antikörper
• Überführung der Bakterien auf eine
Replikaplatte
• Lyse der Bakterien
• Identifizierung der gesuchten Kolonien
durch Autoradiographie
Geneinbau in Eukaryotenzellen
Problem: Bakterien führen keine
posttranslationalen Modifikationen aus.
→ Deshalb können viele eukaryontische
Gene nur in eukaryontischen Wirtszellen
korrekt exprimiert werden.
Geneinbau in Eukaryotenzellen
• Aufnahme von mit Calciumphosphat
gefällten fremden DNA-Molekülen
• Mikroinjektion mit feiner Glasmikropipette
• Geneinbau über Viren (Retroviren)
Beispiele: Moloney-Mäuse-LeukämieVirus, Vaccinia-Virus, BaculoVirus
Experiment:
▪ Einbringen des Gens für das
Wachstumshormon der Ratte in
Mäuseeizellen
▪ Somatotropingen auf Plasmid neben
Metallothioneinpromotors der Maus
▪ Initiation der Genexpression durch Gabe
von Cadmium
Experiment:
▪ die transgenen Mäuse wachsen weitaus
schneller als die Kontrollmäuse
▪ unter Cadmium-Gabe Konzentration des
Hormons 500-mal so hoch und
Körpergewicht doppelt so hoch wie bei
normalen Mäusen
→ Veranschaulichung der Integration und
effizienten Expression fremder Gene unter
Kontrolle eines neuen Promotors in
Säugetierzellen
Ausmaß der Genexpression
Verwendung von DNA-Chips
Durch Hybridisierung der immobilisierten
DNA mit fluoreszierender cDNA kann man
den Expressionslevel des Gens
identifizieren
→ Intensität des fluoreszierenden Punktes
Genausschaltung
(Gen-Knockout)
Prinzip: Homologe Rekombination
Durch in eine Zelle eingebrachte Fremd-DNA
kann ein Gen, dessen Sequenz zumindest in
Teilen homolog ist, durch Austausch von
Segmenten unterbrochen werden.
Bsp.: Gen für gas regulatorische Protein
Myogenin
Homologe Rekombination
(Stryer: Biochemie, 5.Auflage)
Einschleusung von Genen in
Pflanzenzellen
Infektion von Pflanzen durch
Agrobacterium tumefaciens
(tumorinduzierendes Plasmid)
→ Wurzelhalsgalle (Tumorgewebe)
→ Synthese von Opinen
► Umstellung des Stoffwechsels der
Pflanzenzelle
Ti-Plasmid
(Stryer: Biochemie, 5.Auflage)
Ti-Plasmide als Vektoren
▪ Einbau eines fremden DNA-Segments in
die T-DNA-Region eines kleinen Plasmids
▪ Synthetisches Plasmid in AgrobacteriumKolonie
▪ Rekombination → Ti-Plasmide mit dem
fremden Gen
Problem: Transformation gelingt nicht bei
wichtigen monokotylen Getreidepflanzen
Weitere Möglichkeiten der
Geneinschleusung
• Elektroporation: Anlegen elektrischer
Felder → Passierbarkeit der Membran für
große Moleküle
• Genkanonen: mit DNA beschichtete
Wolframkügelchen → Transformation
durch Beschuss