5.2 Gentechnikhot!

5.2 Gentechnik
1.Grundlagen und Anfänge der Gentechnik
1.1 Grundlagen
1.1.1 Versuchsobjekte
- Bakterien, wie z. B. Escherichia coli (E. coli)
- Bakteriophagen (Phagen), wie z. B. Lambda
Phagen sind Viren, die Bakterien befallen und eine Auflösung (Lyse) der
Bakterien verursachen. Ihr Wirken ist an Löchern (Plaques) im Bakterienrasen zu
erkennen.
1.1.2 Enzyme aus Bakterien und Phagen = Werkzeuge der Gentechnik
a) Restriktions- endo-nucleasen (aus Bakterien)= molekulare Scheren, schneiden DNA
↓
↓
↓
restringieren
greifen
zerschneiden
die Vermehrung die DNA Phagen- DNA
von Phagen
innen an
Restriktionsendonucleasen erkennen und schneiden DNA immer an bestimmten Sequenzen.
Es entstehen meist DNA-Fragmente mit klebrigen Enden (sticky ends), die auf Grund der
Komplementarität der Basen dazu neigen sich zu paaren.
Name der Restriktionsendonuclease
Erkennungssequenz
ApaI
G ↓ GGCC C
C CCGG ↑ C
BamHI
G ↓ GATC C
C CTAG ↑ G
EcoRI
G ↓AATT C
C TTAA ↑ G
HindIII
A ↓AGCT T
T TCGA ↑ A
HinfI
G ↓ANT C
C TNA ↑ G
PstI
C ↓TGCA G
G ACGT ↑ C
StyI
C ↓ CAAG G
G GTTC ↑ C
b) Reverse Transkriptase (aus Retroviren): schreibt RNA in DNA um (sozusagen rückwärts)
1.2 Definition von Gentechnik:
Definition
Gezieltes Zerschneiden
und Neuverknüpfen von DNA
und Einschleusen und
Vermehren der rekombinierten DNA in
Wirtszellen
Werkzeuge / Methoden
Restriktionsendonucleasen
Ligasen
Transformation bei Plasmidvektoren
(mit Ca Cl2)
Infektion bei Phagenvektoren
1.3 Das erste Experiment der Gentechnik (Cohen und Boyer)
1.3.1 Schneiden und Neuverknüpfen von DNA
geschnitten mit EcoRI
geschnitten mit EcoRI
→
+
Plasmid mit Gen für
Tetrazyklinresistenz (▼)
Ligase
Plasmid mit Gen für
Kanamycinresistenz( ■)
Mischplasmid mit beiden
Resistenzgenen (▼+ ■)
1.3.2 Einschleusen des Mischplasmids in Bakterien durch Transformation
CaCl2 macht die Bakterienmembran „durchlässiger“ für die Aufnahme freier DNA bzw. von
Plasmiden (= Transformation)
1.3.3 Selektion (Auslese) der Bakterien, die das Mischplasmid enthalten
Auf Nährböden, die die beiden Antibiotika Tetrazyklin und Kanamycin enthalten, können
nur die Bakterien Kolonien bilden, die das Mischplasmid tragen.
1.3.4 Weiterführung des ersten Experimentes
- In das mit Eco RI geschnittene Plasmid wird DNA anderen Ursprungs, die
ebenfalls mit EcoRI geschnitten wurde, eingebaut.
- Fremd-DNA kann auch in einen Phagen eingebaut werden, welcher sie über eine
Infektion in die Wirtszelle schleust. Phagen und Plasmide werden als Vektoren
bezeichnet.
2 Methoden der Gentechnik
2.1 Einbau von Fremd-DNA in einen Vektor und Vermehrung in einer Wirtszelle
2.1.1 Ziele des Einbaus von DNA
A: Aufklärung der Struktur eines Gens (z. B. Insulingen)
B: Herstellung des Genprodukts der Fremd-DNA durch die Wirtszellen (=Expression).
z. B. Produktion von Humaninsulin durch Bakterien
2.1.2 Vorgehen bei A: Reinigung von DNA , Schneiden mit EcoRI , Einbau der
entstehenden DNA-Fragmente in einen Vektor, Einschleusen des Vektors in einen
Wirt, Vermehren der eingebauten DNA durch Vermehren des Wirtes, Selektion auf
rekombinante DNA, Sequenzierung. Die Gesamtheit der Bakterien mit einem
rekombinanten Vektor bezeichnet man als DNA-Bibliothek.
2.1.3 Vorgehen bei B:
Problem: Bakterien können eukaryotische DNA mit Introns nicht exprimieren.
Ausweg: Herstellung von copy-DNA (cDNA) aus mRNA mit Hilfe von Reverser
Transkriptase, Versehen mit Linkern, Schneiden mit EcoRI, Einschleusen in Wirt,
Exprimieren (=Transkription u. Translation, d. h. Proteinsynthese)