Gentechnik - pumpkin-take-off
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[Biologie] pumpkin-take-off [Genetik] Gentechnik [Alle Angaben ohne Gewähr.] Gentechnik Biotechnologische Methoden wurden schon lange genutzt: Kenntnisse über biochemische Prozesse → Herstellung alkoholischer Getränke und von Milchprodukten durch Gärprozesse Anwendung klassischer Genetik bei Züchtungsverfahren (Neukombination, Kreuzung) Neue Zweige: Gentechnik und Gentechnologie Kennzeichen: Gezielter Eingriff in das Erbgut von Lebewesen Identifikation und Isolation einzelner Gene, gezielter Transfer zwischen Arten → transgene Lebewesen Um bestimmte Erbanlagen zu identifizieren, zu isolieren und zu verändern bedient sich die Gentechnik bestimmter „Werkzeuge“. Restriktionsenzyme: Ursprung: in Bakterien, um Phagen (= best. Viren)-DNA zu zerstören. „Scheren“, die die DNA in bestimmte Abschnitte zerlegen. Erkennen palindromische Stellen der DNA = Abschnitt, der, jeweils von 5` nach 3` gelesen, auf beiden Strängen die identische Basenfolge besitzt: Schneiden entweder „blunt“ (= glatt durch), was eher selten genutzt wird, oder so, dass überstehende Einzelstrangenden, so genannte „sticky ends“ (=klebrige Enden) entstehen. „blunt“: „sticky ends“: Vektoren: „Gentaxis“ Meist Plasmide (= ringförmige Bakterien-DNA) Wird durch Restriktionsenzyme so geschnitten, dass sticky ends entstehen → Fremd-DNA-Fragment kann eingebaut werden Ligase: Knüpft Zucker-Phosphat-Rückgrat im Bereich der sticky ends → Hybridplasmid mit rekombinanter DNA (= neu kombinierte DNA) Übersicht: Markergene Durch Markergene kann festgestellt werden, ob Bakterien das veränderte Plasmid aufgenommen haben. Dies sind oft Gene für Resistenzen gegen Antibiotika. Beispiel: Ein Vektor mit den Genen für die Resistenzen gegen Ampicillin und Tetracyclin wird verwendet. → Verwendung eines Restriktionsenzyms, das in der Mitte des Gens für Tetracyclinresistenz schneidet →Zerstörung dieser Resistenz! Behandelte Bakterien werden auf Medium mit Ampicillin gezogen: → Bakterien dieser Kolonie haben einen Fremdvektor aufgenommen (Ampicillin resistent) → per Stempel werden Kolonien auf Medium mit Tetracyclin übertragen → Bakterien dieser (fehlenden) Kolonie haben keine Teracyclinresistenz. → Bakterien der Kolonie besitzen den Vektor mit Fremd-DNA! Im Beispiel kann nun die Kolonie von der Ampicillin-Platte entnommen werden. Alle Bakterien dieser Kolonie tragen den Vektor mit Fremd-DNA. → KLONIERUNG Das heißt, eine Reinkultur wird angelegt, in der jeder Verdopplungszyklus erbgleiche Bakterien hervorbringt. → alle entstehenden Bakterien tragen das Hybrid-Plasmid! Weitere Marker: GFP-Gen: „grün fluoreszierendes Protein-Gen“ Blau-Weiß-Test: Fremd-DNA zerstört Gen für ein Enzym das Kolonien unter bestimmten Bedingungen blau färbt. Isolierung gewünschter Gene Schrotschussklonierung und Genbibliothek Restriktionsenzyme zerlegen das gesamte Genom eines Organismus in Fragmente → Einbau der Fragmente in Vektoren Einschleusen der veränderten Vektoren in Bakterien → Viele Klone von Bakterien mit Vektoren mit unterschiedlichen Fremd-DNA-Fragmenten → Genbibliothek: Sammlung von unterschiedlichen Gen Fragmenten Neben den gesuchten Fragmenten erhält man viele weitere Fragmente → „Schrotschuss“ Gensonden → Möglichkeit, um gesuchtes Gen in Genbibliothek zu finden Kurze, radioaktiv markierte DNA/RNA-Fragmente, die mit gesuchtem Gen komplementär sind → Können mit gesuchtem Gen Basenpaarung eingehen (= Hybridisieren) → Bildung von Einzelsträngen nötig (Sonde und DNA-Fragment)! Stempeln der Kolonien auf Nylon-Membran (Ausgangsplatte bleibt erhalten) → Kolonien auf Membran werden mit Alkalien behandelt, die Einzelstränge voneinander lösen → Bindung der Sonden an komplementäre Sequenz → Autoradiographie: Kolonien mit den Fragmenten, an welche die Sonden gebunden haben, werden sichtbar! Anwendung: Bluterkranken fehlt der Blutgerinnungsfaktor VIII. Das Gen, welches für dieses Protein codiert kann auf beschriebene Weise isoliert und gefunden werden, obwohl dieses Gen nur einen geringen Anteil am Gesamtgenom eines Organismus ausmacht. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Will man einen bestimmten DNA-Abschnitt genauer untersuchen, z.B. zur Herstellung eines genetischen Fingerabdrucks, oder die DNA des HI-Virus vor dem Ausbruch von Aids nachweisen, so reicht die vorliegende Menge an DNA oft nicht aus. Vor einer Analyse ist dann eine Vervielfältigung des genetischen Materials erforderlich. Die Methode der Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction = PCR) erlaubt die unbeschränkte Replikation von DNA-Stücken, ausgehend von einem einzigen Molekül. Zunächst wird der DNA-Doppelstrang durch Erhitzen auf 94°C aufgetrennt (Denaturiert). Setzt man die vier Nucleotidbausteine und DNA-Polymerase zu, so kann an jedem der beiden Einzelstränge ein komplementärer Strang aufgebaut werden. Die neuen Doppelstränge lassen sich erneut auftrennen und wieder replizieren. So kann ein DNA-Molekül sehr rasch vervielfältigt werden. Zur Replikation benötigt man eine hitzestabile Polymerase. Sie wird aus Thermus aquaticus, einer Archaea-Art aus heißen Quellen, gewonnen. Diese Taq-Polymerase synthetisiert nach Abkühlen auf 70°C die neuen Stränge. Zum Start der Synthese werden für beide Strangenden kurze, synthetisch hergestellte DNA-Primer verwendet. Nach einiger Synthesezeit erhitzt man wieder auf 94°C, um die neu gebildeten Doppelstränge aufzutrennen. Nach erneuter Abkühlung auf 70°C lagern die Einzelstränge wieder Primer-Moleküle an, und es erfolgt die Synthese der komplementären Stränge. Diesen PCR-Zyklus lässt man in automatischen Geräten etwa 25- bis 50-mal ablaufen. Nach 30 Zyklen sind 230 (= 1,07 x 109) Kopien der Ausgangssequenz entstanden. mRNA und cDNA Ist in Zellen ein bestimmtes Gen besonders aktiv, so lässt sich aus diesen viel RNA für das bestimmte Gen isolieren (z.B. mRNA für das Insulingen aus Zellen der Bauchspeicheldrüse). Diese reife mRNA kann mithilfe des Enzyms Reverse Transkriptase in einen DNADoppelstrang umgeschrieben werden. → cDNA (complementary DNA) Diese entspricht den codierenden Exons eines Eukaryoten-Gens. Um das Fragment in einen Vektor einbauen zu können, müssen mit Hilfe von Ligase „sticky ends“ angefügt werden. Genetischer Fingerabdruck Für die Identifikation eines Menschen eigenen sich für wichtige Proteine codierende Abschnitte der DNA kaum, da diese bei allen Menschen gleich sind. Daher stützt man sich auf nichtcodierende Bereiche, da hier Mutationen nicht ins Gewicht fallen und somit von Person zu Person stark variieren können. Hauptsächlich konzentriert man sich dabei auf Sequenzen, in denen sich bestimmte Basenfolgen mehrfach wiederholen (= „short tandem repeats“, STR). Findet man solche STRs, so werden sie mit Hilfe der PCR vervielfältigt und durch Gelelektrophorese nach ihrer Länge aufgetrennt. Hierbei wandern die Fragmente durch ein Agarosegel in einem elektrischen Feld von einem Pol zum anderen, wobei die Wandergeschwindigkeit je nach Länge unterschiedlich ist. Somit sammeln sich gleiche Fragmente in Banden an, einer Arte „Strichcode“, der für jede Person typisch ist, entsteht. Dabei ähnelt sich dieser „Strichcode“ zwischen verwandten Personen, so dass eine Verwandtschaft ausgeschlossen werden kann, wenn sich die Bandenmuster vollständig voneinander unterscheiden. Auf diese Weise werden Vaterschaftstests durchgeführt. Auch in der Kriminalistik kann über den genetischen Fingerabdruck die Fahndung nach dem Täter vereinfacht werden, wenn wenig Genmaterial am Tatort sichergestellt werden kann, und Verdächtige bereit sind, Genproben abzugeben. Transgene Pflanzen Einführen von Fremd-DNA durch das Bakterium Agrobacterium tumefaciens Kann bei Verletzungen von Pflanzen eindringen Bakterielles Plasmid (= Vektor) mit Tumor-DNA wird teilweise in die Pflanzen-DNA eingebaut → Tumorbildung (= Gewebswucherung) im Bereich der Verletzung Nutzung in der Gentechnik: Tumorgen im Vektor wird durch Gen für gewünschtes Merkmal ersetzt → Einschleusen des Vektors in vermehrungsfähige Pflanzenzellen mit Hilfe des Bakteriums Eingesetzte Eigenschaften: Resistenzen gegen Krankheiten (Viren, Bakterien) beschleunigtes und erhöhtes Wachstum Resistenz gegen Insektenfraß (z.B. durch Bildung von Protease-Hemmern) klimatische Widerstandsfähigkeit Herbizidresistenz Problematiken: Strikte Monokulturen führen zur Verarmung des Genpools Verdrängung schlechter angepasster Pflanzen Einige gebildete Proteine stehen im Verdacht, Allergien auszulösen Natürliche Resistenzbildung bei „Schädlingen“ Abhängigkeit (wirtschaftlich) von einigen Großkonzernen Transgene Tiere Transgene Tiere entstehen durch Injektion der Fremd-DNA in den Kern der Eizelle. Aber: DNA-Übertragung nur selten erfolgreich, da nicht sicher ist, ob das Gen eingebaut wird und wenn ja, ob es an der richtigen Stelle landet. Ziele gentechnischer Veränderungen bei Tieren: Wachstumssteigerung Erhöhung der Fleischqualität Krankheits- und Stressresistenz Milchtiere: o erhöhte Milchqualität o Produktion von Magermilch o Milch, die Arzneien enthält → „Gene Pharming“ Problematik: „Leidensfähigkeit“ von Tieren Ökologische Probleme, falls solche Tiere in die natürliche Ökosysteme gelangen → Verdrängung nat. Populationen → Verarmung des Genpools
