Allg.Gen.6_Ãœbung_WS 13_14_Lsg

6. Übung 1) Ordnen Sie die unten gelisteten Modellsysteme den Begriﬀen zu. Anmerkung: Mehrfachzuordnungen sind möglich und einer der Begriﬀe passt zu keinem der genannten Modellsysteme a) Meiose b) Reverse TranskripEon 1) λ-‐Phage f c) Prokaryont 2) E. coli c, d d) KonjugaEon 3) S. cerevisiae a, e, g e) Mitochondrien 4) A. thaliana
a , e, g f) Temperenz g) Intron b passt gar nicht 2) Deﬁnieren Sie die folgenden Begriﬀe: Auxotrophie = WuchsstoYedür[igkeit horizontaler Gentransfer = Übertragung von DNA über Artgrenzen hinweg tra-‐Gene = transfer-‐Gene, die Bakterien befähigen, als Donor bei der KonjugaEon zu fungieren (Bsp.: Fähigkeit zur Ausbildung eines Sex-‐Pilus) Hfr = Durch IntegraEon eines F-‐Plasmids ins bakterielle Genom, kommt es bei der KonjugaEon zur Übertragung chromosomaler Abschni`e und im Rezipienten-‐Bakterium somit häuﬁg zu RekombinaEon durch doppeltes crossover („high frequency of recombinaEon“) F'-‐Plasmid = ein F-‐Plasmid, das durch ungenaues Heraus-‐Rekombinieren (Excision) aus dem Nukleoid eines Hfr Bakteriums einen Abschni` genomischer DNA erhalten hat merozygot = teilweise diploid Exogenot = genomische DNA vom Donor, die bei KonjugaEon vom Rezipient aufgenommen wurde 3) Nennen Sie Unterschiede und Gemeinsamkeit von: KonjugaEon – TransdukEon – TransformaEon KonjugaEon = „Paarung“ von Bakterien und Übertragung von ErbinformaEon über eine Zytoplasmabrücke von einer Spender-‐ in eine Empfängerzelle; TransdukEon = Gentransfer in Bakterien mi`els Viren/Phagen; TransformaEon = Übertragung von “nakter” DNA in Bakterien ohne Hilfe von Spenderbakterien oder Phagen (2. Bedeutung: Entartung von höheren eukaryonEschen Zellen hin zu ungehemmtem Teilungsverhalten » Krebs); Gemeinsamkeit: Gentransfer in Bakterien 4) Welche klassischen Möglichkeiten der GenkarEerung bei Bakterien kennen Sie? BesEmmung der Frequenz, mit der Gene/Allele zusammen übertragen werden bei: -‐ KonjugaEon (die nach unterschiedlichen Zeiten abgebrochen wird) -‐ TransdukEon 5) Thema: Klonieren a) Welche Eigenscha[en sollte ein Plasmid (= Vektor) stets haben, damit sich bequem DNA-‐Fragmente einfügen lassen, und damit es sich nach Einschleusen in E. coli nicht verloren geht sondern mit den Zellen vervielfälEgt wird? •  mul=ple cloning site (MCS) = polylinker •  bakteriellen ReplikaEonsursprung = origin of replica=on ini=a=on (ori) •  SelekEonsmarker, typischerweise AnEbioEkaresistenz wie z.B. Gen für β-‐Lactamase, die Resistenz gegen Penicillin (und deren Derivaten wie Ampicillin) vermi`elt b) Aus der Vorlesung wissen Sie, wie Sie dsDNA sequenzspeziﬁsch schneiden können. Aber welches Enzym kann geschni`ene dsDNA-‐Fragmente wieder kovalent miteinander verbinden? -‐ Recherchieren Sie! 3’OH 5’Pi 5’Pi 3’OH (Pi = Phosphat) h`p://www.addgene.org DNA-‐Ligase ATP Katalysemechanismus: AdenylaEon (AMPylaEon) AMP Katalysemechanismus -‐ Fortsetzung: DNA-‐AMP-‐Intermediat c) Sie wollen sich eine Bibliothek von genomischer Hefe-‐DNA konstruieren. (Anmerkung: Dies ist eine KollekEon von Plasmiden, in die jeweils ein Stück Hefe-‐DNA eingefügt wurde, und die in ihrer Gesamtheit das ganze Hefe-‐Genom abdeckt/repräsenEert.) Beschreiben Sie die hierzu notwendigen Arbeitsschri`e! Plasmid aus entsprechender E. coli-‐Kultur isolieren genomische DNA aus S. cerevisiae-‐Kultur isolieren Insert Mischung aller Insert-‐tragender Plasmide = Hefe-‐DNA-‐Bibliothek 6) Thema: GeneEsche InterakEon a) Eine temperatursensiEve Mutante ist eine, die sich bei normaler Temperatur noch wildtypisch verhält, bei erhöhter (oder erniedrigter) Temperatur aber einen FunkEonsverlust aufweist. Mutagenese einer Hefekultur Modellvorstellung: Ausplaxeren & bei 23°C inkubieren Wildtyp ts-‐Mutante bei permissiver T *
ts-‐Mutante bei restrikEver T Sie haben eine temperatursensiEve Hefemutante mit einem interessanten Phänotyp isoliert. Wie ﬁnden Sie heraus, ob es sich auch wirklich um eine EinzelmutaEon handelt? Annahme: Haploider Stamm » Kreuzung mit Wildtyp (maEng => SporulaEon) » 50% der haploiden Nachkommen zeigen wieder den gleichen Phänotyp, wenn nur ein Gen betroﬀen ist b) Schlagen Sie einen geneEschen Screen vor, mit dem Sie herausﬁnden können, welches der 6.500 Gene in Ihrer interessanten ts-‐Mutante verändert ist. (Tipp: Sie benöEgen dazu die oben erstellte Hefe-‐DNA-‐Bibliothek.) IsolaEon des jeweiligen Plasmids aus Klonen, die jetzt wieder bei 36°C wachsen und Sequenzierung des hierin jeweils enthaltenen wildtypischen Gens; zur Kontrolle: Sequenzierung des entsprechenden chromosomalen Gens in der ts-‐Mutante und Sequenzvergleich, um MutaEon zu ﬁnden Shu0le Plasmide Plasmid, das in E. coli und einer weiteren Spezies repliziert und selekEoniert werden kann. Vorteil: Klonierung (u.a. ManipulaEonen des Plasmids) können in E. coli vorgenommen werden. Ein E. coli S. cerevisiae-‐Shu`le Plasmid: Hefe-‐ReplikaEonsursprung Hefe-‐Auxotrophiemarker E.coli-‐Resistenzmarker E.coli-‐ReplikaEonsursprung MCS (mulEple cloning site)