Charakterisierung von Bakterien

Grünes Licht für Bakterien
Für viele molekularbiologische Untersuchungen eignen sich Plasmide in besonderem Maße als
Vektormoleküle. Über sie gelangt ein Fremdgen in die Bakterien (Transformation), deren Kolonien dann als
Klone die rekombinierte DNA enthalten und als Lieferanten für das gewünschte Gen-Produkt dienen.
In unserem Experiment verwenden wir das Plasmid pGLO, in dem ein Teil des Arabinose-Operons durch ein
eukaryotisches Gen ersetzt wurde, das für ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) kodiert. Durch dessen
Anregung mit UV-Bestrahlung können die erfolgreich transformierten Bakterienkolonien auf einfache Weise
sichtbar gemacht werden.
1. Isolierung
der Plasmid-DNA mit Hilfe
von Silika-Technologie
und Zentrifugation
Es werden Bakterienzellen aus ÜbernachtKulturen von Escherichia coli verwendet, deren
Plasmide pGLO das GFP-Gen enthalten.
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Durch Zentrifugation werden die Plasmide
von den übrigen Zellbestandteilen getrennt.
Mit Hilfe eines speziellen Verfahrens wird die DNA
an einer Silika-Membran (Pfeil) in einem Reaktionsgefäß gebunden.
DNA
2. Transformation der
Bakterien
3. Inkubation der
transformierten Bakterien
4. Kultivierung und
Selektion
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GFPPlasmid
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4
5. Auswertung
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6. Restriktion
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7. Gelelektrophorese
und Auswertung
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Kompetente
Bakterien
Schließlich wird die hoch gereinigte Plasmid-DNA
– in einem Puffer gelöst – in einem Reaktionsgefäß
aufgefangen und auf Eis gestellt.
(Der Aufbau des Plasmids wird in den Schritten 6 und7
weiter untersucht. )
Die Plasmide, die das GFP-Gen tragen, werden durch
Hitze- und Kälte-Schock in kompetente Bakterienzellen
eingeschleust.
Während der Inkubation bei 37°C in einem geeigneten
Nährmedium exprimieren die transformierten
Bakterienzellen das Resistenzgen, das sich auch auf
dem Plasmid befindet.
Die inkubierten Bakterienzellen werden unter sterilen
Bedingungen auf verschiedenen Nährböden ausplattiert und über Nacht kultiviert.
Die transformierten Bakterien werden durch
Bestrahlung mit UV-Licht sichtbar. Die Transfektionseffizienz kann berechnet werden.
Die anfangs isolierte Plasmid-DNA wird mit Restriktionsendonucleasen geschnitten. Diese Enzyme zeichnen
sich dadurch aus, dass sie nur innerhalb spezifischer
DNA-Sequenzen das Plasmid auseinander schneiden.
Um die DNA-Fragmente sichtbar zu machen, wird die
geschnittene Plasmid-DNA in die Taschen eines
Agarosegels pipettiert. Nach Anlegen einer Spannung
wandern die DNA-Fragmente durch das Porensystem
des Gels und werden entsprechend ihrer Länge aufgetrennt. Mit Hilfe der Ergebnisse kann eine Karte des
Plasmids pGLO erstellt werden.
Zeitbedarf für dieses Experiment mit Auswertung 1,5 Kurstage (8h + 5h)