In-vitro- und In-vivo-Entwicklung von Kerntransferkomplexen aus

Aus dem Institut für Tierzucht (Mariensee)
der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL)
Braunschweig
Experimentelle Untersuchungen zum somatischen
Klonen beim Schwein: In-vitro- und In-vivo-Entwicklung
von Kerntransferkomplexen aus in vitro gereiften Oozyten
INAUGURAL–DISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines
DOKTORS DER VETERINÄRMEDIZIN
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Michael Hölker
aus Vreden
Hannover 2003
Wissenschaftliche Betreuung:
Apl.-Prof. Dr. H. Niemann
1. Gutachterin(nen)/Gutachter:
Apl.-Prof. Dr. H. Niemann
2. Gutachterin(nen)/Gutachter:
Prof. Dr. Burkhard Meinecke
Tag der mündlichen Prüfung:
17.11.2003
Die vorliegende Arbeit wurde durch finanzielle Mittel der DFG gefördert (SFB 265)
Nicht in der Erkenntnis liegt das Glück,
sondern im Erwerben der Erkenntnis
Edgar Allan Poe, Schriftsteller (1809-1849)
Inhaltsverzeichnis
1
EINLEITUNG -------------------------------------------------------------------------------------- 1
2
SCHRIFTTUM ------------------------------------------------------------------------------------ 4
2.1
Biologische Grundlagen ------------------------------------------------------------------ 4
2.1.1
Keimzellentwicklung beim Schwein---------------------------------------------------- 4
2.1.2
Physiologie der Befruchtung------------------------------------------------------------- 8
2.1.3
Embryonalentwicklung beim Schwein------------------------------------------------11
2.1.4
Relevante Aspekte des Zellzyklus ----------------------------------------------------15
2.2
Biotechnologische Grundlagen--------------------------------------------------------18
2.2.1
In-vitro-Reifung porziner Oozyten -----------------------------------------------------18
2.2.2
In-vitro-Entwicklung porziner Embryonen -------------------------------------------24
2.2.3
2.2.4
2.2.5
Parthenogenetische Entwicklung beim Schwein ----------------------------------26
In-vitro-Entwicklung porziner parthenogenetischer Embryonen ---------------31
Transfer porziner Embryonen auf Empfängertiere --------------------------------33
2.3
Genetisch identische Nachkommen -------------------------------------------------35
2.3.1
Monozygote Zwillinge durch Blastomeren-Isolierung ----------------------------35
2.3.2
Monozygote Zwillinge durch mikrochirurgische Teilung -------------------------37
2.3.3
Genetisch identische Mehrlinge durch Kerntransfer------------------------------37
2.4
Technik beim Klonen mittels Kerntransfer-----------------------------------------39
2.4.1
Effizienz des Kerntransfers bei verschiedenen Tierarten -----------------------42
2.4.2
Einflußfaktoren auf die Effizienz des Kerntransfers-------------------------------43
2.4.2.1
Biologischer Status der Spenderzelle ---------------------------------------------------- 43
2.4.2.2
Biologischer Status der Empfängerzelle ------------------------------------------------ 45
2.4.2.3
Einfluß der Zellzyklen von Oozyte und Spenderzelle ---------------------------- 46
2.5
Klonen beim Schwein mittels Kerntransfer ----------------------------------------49
2.5.1
Klonen beim Schwein mittels embryonalen Kerntransfers ----------------------49
2.5.2
Klonen beim Schwein mittels somatischen Kerntransfers ----------------------51
2.5.2.1
In vitro Entwicklung nach somatischem Kerntransfer beim Schwein ----- 53
2.5.2.2
In vivo Entwicklung nach somatischem Kerntransfer beim Schwein ----- 56
2.5.2.3
Transgene Schweine aus somatischem Kerntransfer --------------------------- 59
2.5.3
Anwendungsperspektiven für transgene Schweine-------------------------------61
2.5.4
Normalität geklonter Nachkommen aus somatischem Kerntransfer----------62
Inhaltsverzeichnis
3
MATERIAL UND METHODEN --------------------------------------------------------------65
3.1
Anfertigung der Pipetten -----------------------------------------------------------------66
3.1.1
Transportpipetten--------------------------------------------------------------------------66
3.1.2
Arbeitspipetten -----------------------------------------------------------------------------66
3.2
Medien------------------------------------------------------------------------------------------69
3.2.1
Selektionsmedien -------------------------------------------------------------------------69
3.2.2
Reifungsmedien ---------------------------------------------------------------------------69
3.2.3
Arbeitsmedien ------------------------------------------------------------------------------70
3.2.4
Fusions- und Aktivierungsmedien-----------------------------------------------------70
3.2.5
Kulturmedien -------------------------------------------------------------------------------70
3.3
3.3.1
3.3.2
3.3.3
3.3.4
In-vitro-Reifung porziner Oozyten ----------------------------------------------------71
Gewinnung unreifer porziner Kumulus-Oozyten-Komplexe --------------------71
In-vitro-Reifung porziner Kumulus-Oozyten-Komplexe in NCSU37 ----------72
Entkumulierung und Selektion in vitro gereifter Oozyten ------------------------73
Medienzusatz zur optischen Markierung von DNA -------------------------------76
3.4
Gewinnung und Präparation der Kernspenderzellen ---------------------------77
3.4.1
Herstellung einer Explantatkultur------------------------------------------------------77
3.4.2
Vorbereitung der Spenderzellen für den Kerntransfer ---------------------------79
3.4.3
Präparation der Spenderzellen für den Kerntransfer -----------------------------79
3.5
Mikromanipulation -------------------------------------------------------------------------79
3.5.1
Destabilisierung des Zytoskelettes----------------------------------------------------79
3.5.2
Aufbau des Mikromanipulators---------------------------------------------------------80
3.5.3
Durchführung der Enukleation ---------------------------------------------------------82
3.5.4
Durchführung des Kerntransfers ------------------------------------------------------86
3.6
Fusion ------------------------------------------------------------------------------------------90
3.6.1
Aufbau der Fusionseinheit --------------------------------------------------------------90
3.6.2
Durchführung der Fusion ----------------------------------------------------------------91
3.6.3
Bestimmung der Fusionsrate-----------------------------------------------------------92
3.7
Artifizielle Aktivierung --------------------------------------------------------------------92
3.7.1
Aufbau der elektrischen Aktivierungskammer--------------------------------------92
3.7.2
Aktivierung im elektrischen Feld-------------------------------------------------------93
Inhaltsverzeichnis
3.7.3
Aktivierung durch Proteinkinase-Inhibierung ---------------------------------------94
3.8
In-vitro-Entwicklung porziner Embryonen -----------------------------------------94
3.8.1
In-vitro-Kultur porziner Embryonen ---------------------------------------------------94
3.8.2
Beurteilung der In-vitro-Entwicklung porziner Embryonen ----------------------95
3.8.2.1
Bestimmung der Blastozystenrate --------------------------------------------------------- 95
3.8.2.2
Bestimmung der Kernzahlen der einzelnen Embryonen ------------------------ 95
3.8.2.3
Bestimmung der Teilungsrate ---------------------------------------------------------------- 95
3.8.2.4
Bestimmung der Durchschnitts-Kernzahl pro Blastozyste --------------------- 95
3.9
In-vivo-Entwicklung porziner Kerntransfer-Embryonen -----------------------96
3.9.1
Synchronisation der Empfängertiere -------------------------------------------------96
3.9.2
Transfer porziner Kerntransfer-Embryonen im Zygotenstadium---------------96
3.9.3
3.9.4
Aufrechterhaltung der Trächtigkeit ----------------------------------------------------97
Beurteilung der In-vivo-Entwicklungsfähigkeit--------------------------------------98
3.10
Nachweis genetischer Identität der geborenen Ferkel -------------------------98
3.11
Statistische Auswertung -----------------------------------------------------------------99
3.12
Versuchsaufbau--------------------------------------------------------------------------- 100
4
ERGEBNISSE --------------------------------------------------------------------------------- 101
4.1
Entwicklung eines Kerntransferprotokolls--------------------------------------- 102
4.1.1
Bestimmung der Reifungsrate ------------------------------------------------------- 102
4.1.2
Auswahl des elektrischen Feldes zur Aktivierung ------------------------------- 102
4.1.3
Auswahl eines geeigneten Kulturmediums --------------------------------------- 103
4.1.4
Auswahl eines geeigneten Arbeitsmediums -------------------------------------- 104
4.1.5
4.1.6
4.1.7
Auswahl einer geeigneten Osmolarität des Arbeitsmediums----------------- 106
Auswahl des optimalen Aktivierungsprotokolls ---------------------------------- 107
Versuche zur Aktivierbarkeit---------------------------------------------------------- 108
4.2
In-vitro-Entwicklung rekonstruierter Kerntransfer-Embryonen ----------- 110
4.2.1
Auswahl eines geeigneten Fusionsmediums------------------------------------- 110
4.2.2
Fusion von Kerntransfer-Embryonen ----------------------------------------------- 111
4.2.3
In-vitro-Entwicklung von Kerntransfer-Embryonen------------------------------ 112
Inhaltsverzeichnis
4.3
In-vivo-Entwicklung rekonstruierter Kerntransfer-Embryonen ----------- 119
4.3.1
Transfer von Kerntransfer-Embryonen auf Empfängertiere ------------------ 120
4.3.2
Bestimmung der genetischen Identität der geklonten Ferkel----------------- 126
5
DISKUSSION ---------------------------------------------------------------------------------- 127
5.1
Entwicklung eines Kerntransfer-Protokolls-------------------------------------- 127
5.2
Entwicklungspotential von Kerntransfer-Embryonen ------------------------ 132
5.3
Schlußfolgerungen und Ausblick in die Zukunft------------------------------- 142
6
ZUSAMMENFASSUNG --------------------------------------------------------------------- 144
7
SUMMARY ------------------------------------------------------------------------------------- 148
8
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS------------------------------------------------------------ 152
9
LITERATURVERZEICHNIS ---------------------------------------------------------------- 155
10 MEDIENANHANG ---------------------------------------------------------------------------- 197
10.1
Kulturmedien------------------------------------------------------------------------------- 197
10.2
Arbeitsmedien ----------------------------------------------------------------------------- 198
10.3
Fusions- und Aktivierungsmedien -------------------------------------------------- 199
10.4
Zellkulturmedium ------------------------------------------------------------------------- 199
11 VERZEICHNIS DER TABELLEN --------------------------------------------------------- 200
12 VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN --------------------------------------------------- 202
-1-
Einleitung
1 Einleitung
Das Klonen durch somatischen Kerntransfer ist zur Zeit Gegenstand intensiver
Forschungsarbeit und einer ethischen Diskussion. Vor allem durch die mediale
Vermarktung des weltweit ersten somatischen Klonschafs „Dolly“ (WILMUT et al.
1997) gelangte das Klonen in das Bewusstsein der breiten Öffentlichkeit. Während
es für das von vielen Kritikern befürchtete Klonen von Individuen kaum sinnvolle
Anwendungsperspektiven gibt, wird das Klonen von Wissenschaftlern als wichtig für
die Grundlagenforschung und als ein potentes Hilfsmittel zur Erstellung transgener
Tiere angesehen (NIEMANN u. KUES 2000). Durch den somatischen Kerntransfer
kann aus einer einzelnen genetisch modifizierten Körperzelle ein transgenes Tier
erzeugt werden, das die genetische Modifikation auf sexuellem Weg an die nächste
Generation weitergeben kann (SCHNIEKE et al. 1997; CIBELLI et al. 1998; BAGUISI
et al. 1999; PARK et al. 2001a). Das große Potential des Kerntransfers kann vor
allem in Kombination mit der „homologen Rekombination“ genutzt werden. Diese
ermöglicht gezielte genetische Modifikationen von Kulturzellen (DENNING et al.
2001). Besonders das Schwein steht zur Zeit im Blickpunkt des Interesses für die
Generierung transgener Tiere, insbesonders im Kontext der Xenotransplantation
(MACHATY et al. 2002; NIEMANN et al. 2003). Die Organe geeigneter transgener
Schweine sollen in Zukunft das Defizit, das weltweit in der Zahl geeigneter humaner
Spenderorgane besteht, reduzieren. Die größte Hürde hierfür stellt ein Komplementvermittelter Prozess, die „Hyperakute Abstoßungsreaktion“ (HAR), dar. Die HAR wird
ausgelöst durch die Bindung humaner Antikörper an α1,3-Gal Epitope porziner
Epithelien, was die Komplement-Kaskade aktiviert (PLATT et al. 1991). Diese
Epitope werden in der Schweinezelle durch die α-1,3-Galactosyltransferase
produziert, die durch ein einzelnes Gen kodiert wird. Da Menschen dieses Gen fehlt,
besitzen sie natürlicherweise Antikörper gegen α1,3-Gal Epitope (GALILI et al. 1988).
Deshalb
werden
international
Anstrengungen
unternommen,
um
α-1,3-
Galactosyltransferase-Knockout Schweine zu erzeugen, mit dem Ziel die HAR
dauerhaft zu unterbinden. Erreicht werden soll dies in einem ersten Schritt durch die
Generierung von α1,3-Gal-Knockout-Zellen, aus denen in einem zweiten Schritt
-2-
Einleitung
α1,3-Gal-Knock-out-Schweine durch somatischen Kerntransfer geklont werden
sollen. Dies ist kürzlich erstmals bei einem Allel (heterozygot) (DAI et al. 2002; LAI et
al. 2002a; RAMSOONDAR et al. 2003), und in einem Fall mit beiden Allelen
(homozygot) (PHELPS et al. 2003), gelungen.
Der Kerntransfer selbst besteht aus 5 Hauptschritten; der Enukleation, dem Transfer
der Spenderzelle, der Fusion, der Aktivierung der Kerntransferkomplexe und der
Kultur der rekonstruierten Embryonen (zum Überblick: COLMAN 2000). Bis heute
führte der somatische Kerntransfer bei 9 verschiedenen Tierarten zur Geburt von
lebenden Nachkommen. So wurden bisher Schaf (CAMPBELL et al. 1996b), Rind
(CIBELLI et al. 1998), Ziege (BAGUISI et al. 1999), Maus (WAKAYAMA et al. 1998),
Schwein (POLEJAEVA et al. 2000), Kaninchen (CHESNE et al. 2002), Katze (SHIN
et al. 2003), Maultier (WOODS et al. 2003) und das Pferd (GALLI et al. 2003)
erfolgreich geklont. Die Technik erreicht jedoch nur geringe Erfolgsraten und führt bei
den Nachkommen häufig zu Abnormalitäten, die bei Wiederkäuern unter dem Begriff
„Large Offspring Syndrome“ (LOS) zusammengefasst werden (YOUNG et al. 1998).
Nur beim Rind wird eine Erfolgsrate von 15-20% lebender Nachkommen, bezogen
auf alle übertragenen geklonten Embryonen, erreicht. Bei den anderen Tierarten
betragen die Erfolgsraten weniger als 3%, wobei die Effizienz beim Schwein sogar
unter 1% liegt (zum Überlick: ONISHI 2002; BREM u. KÜHHOLZER 2002). Aufgrund
dieser Schwierigkeiten sind die weltweit ersten geklonten Schweine erst im Jahre
2000 zur Welt gekommen (BETTHAUSER et al. 2000; POLEJAEVA et al. 2000;
ONISHI et al. 2000), und bis heute ist es erst wenigen Arbeitsgruppen gelungen,
lebensfähige Ferkel aus somatischem Kerntransfer zu erhalten.
Die vorliegende Arbeit wurde im Rahmen eines Projektes zur Erzeugung transgener
Schweine für die Xenotransplantation angefertigt. In enger Kooperation mit einer
weiteren Dissertation, in der Aspekte der Spenderzellen, sowie deren gezielte
Modifikation, erarbeitet wurden (PETERSEN in Vorbereitung, persönliche Mitteilung),
war das Ziel der vorliegenden Arbeit die Entwicklung eines Protokolls zum Klonen
von Schweinen mittels somatischen Kerntransfer. Ein solches Kerntransfer-Protokoll
soll zukünftig die Generierung transgener Schweine verbessern, was bisher über das
Mikroinjektionsverfahren erfolgte (Niemann et al. 2001a). Beweis der Funktionalität
Einleitung
-3-
des entwickelten Kerntransfer-Protokolls sollte die Entwicklungsfähigkeit geklonter
Embryonen nach Transfer auf Empfängertiere sein. Als Ausgangsmaterial sollten in
vitro gereifte Oozyten genutzt werden, da diese, im Gegensatz zu in vivo gereiften
Oozyten, in ausreichender Anzahl regelmäßig und kostengünstig verfügbar sind. In
der ersten Versuchsphase sollten zur Entwicklung eines Kerntransfer-Protokolls
entwicklungsbeeinflussende Parameter für Kerntransfer-Embryonen ermittelt werden.
Hierzu wurden umfangreiche Untersuchungen an parthenogenetischen Embryonen
durchgeführt, die als „Modell“ benutzt wurden. Im zweiten Versuchsabschnitt sollte
das Protokoll auf KT-Embryonen übertragen und optimiert werden, um eine
möglichst weitreichende In-vitro-Entwicklung geklonter porziner Embryonen zu
gewährleisten. In der dritten Versuchsphase wurde das optimierte KerntransferProtokoll hinsichtlich der In-vivo-Entwicklungsfähigkeit so erzeugter Embryonen
überprüft. Als Kriterium zur Ermittlung des Entwicklungspotentials der erzeugten
Klon-Embryonen sollte der Transfer auf Empfängertiere und die Geburt von Ferkeln
dienen.
-4-
Schrifttum
2 Schrifttum
2.1 Biologische Grundlagen
2.1.1 Keimzellentwicklung beim Schwein
Die Entwicklung der Oozyten beginnt in der frühen Fetalentwicklung: Bereits bei den
ersten Furchungsteilungen entsteht in einigen Blastomeren das „germinative
Plasma“, aus dem die Primordialkeimzellen (PKZ, Abbildung 1/A) hervorgehen.
Diese Urkeimzellen, die sich durch ihre Größe und ihren kugeligen Kern, sowie dem
hohen Gehalt an alkalischer Phosphatase und Glykogen, von den kleineren
somatischen Zellen unterscheiden, finden sich beim fetalen Säuger in unmittelbarer
Nähe der Allantoisanlage. Sie wandern durch amöboide Eigenbewegung, wobei
diese durch chemotaktische Reize der Keimdrüsenanlage unterstützt werden soll,
über das Bindegewebe des Enddarms ins Mesenterium und gelangen schließlich
über die Nierenanlage in die Genitalleiste (PICTON u. GOSDEN 1995). Hier bilden
sie die Oogonien (Abbildung 1/B). Während der Wanderung, sowie in der
Keimdrüsenanlage, durchlaufen die PKZ eine Reihe von Mitosezyklen. Wenn sie
ihren Bestimmungsort erreicht haben verlieren sie ihre Motilität (SCHNORR 1996).
Die PKZ differenzieren sich in der ersten Wachstumsperiode zu den Oozyten 1.
Ordnung, d.h. zu den primären Oozyten (Abbildung 1/C), wobei die Meiose in der
Prophase der ersten Reifeteilung (spätes Diplotän) unterbrochen wird (FULKA et al.
1972). Nach Abschluss dieser ersten Wachstumsperiode, die beim Schwein bis in
die postnatale Periode hineinreicht, ist die Gesamtpopulation an Keimzellen
festgelegt (SCHNORR 1996). Zum Zeitpunkt der Geburt sind ca. 99% der primären
Oozyten in dieser Ruhephase arretiert, die unter Umständen viele Jahre dauert und
erst zu Beginn der präovulatorischen Follikelreifung beendet wird (FULKA et al.
1972). Die 30-50 µm große Schweineeizelle wird in dieser Entwicklungsstufe von
einem einschichtigem Plattenepithel umgeben und bildet mit diesem zusammen den
Primordialfollikel. Eizellen, die nicht in einen Follikel eingeschlossen werden, gehen
zugrunde (MOOR et al. 1990; HUNTER 1991; SCHNORR 1996).
-5-
Schrifttum
Etwa vom 60. Tag nach der Geburt an tritt beim Schwein ein Teil der
Primordialfollikel in die zweite Wachstumsperiode ein, bei der die Eizelle ihre
endgültige Größe (ca. 150 µm) erreicht und die Follikel unter dem Einfluß der
Hormone über Primär- und Sekundärfollikel zu den vesikulären Tertiärfollikeln
heranwachsen (MAULEON 1964; OXENEDER et al. 1979). In dieser 2.
Wachstumsphase weisen die primären Oozyten eine ausgeprägte metabolische und
synthetische
Aktivität
auf.
Proteine,
Energiesubstrate
und
Lipide,
sowie
Mitochondrien und Ribosomen, werden von ihnen selbst, sowie von den
Granulosazellen, synthetisiert und in Form von Granula gespeichert (PICTON u.
GOSDEN 1995). Sie sind notwendig für den Metabolismus, die Zellstruktur während
der Reifung, sowie für die ersten Teilungen in der Embryonalentwicklung, bevor das
embryonale Genom aktiviert wird (CRAN u. CHENG 1985; MOOR et al. 1990;
HUNTER 1991; HYTTEL et al. 1993). Im Stadium des Primärfollikels beginnen
primäre Oozyten und Granulosazellen darüber hinaus mit der Synthese der aus
mehreren Glykolipidschichten bestehenden Zona pellucida, die die spätere Oozyte
umgibt. Parallel dazu wird das flache Follikelepithel erst kubisch, später zylindrisch
(MAULEON 1964; HUNTER 1991). Gegen Ende der Wachstumsperiode nimmt die
RNA-Syntheseaktivität ab, wobei die Synthese von Makromolekülen bis in die
spätere Reifungsphase anhält (MOOR et al. 1990; WASSERARMAN u. ALBERTINI
1994). Aus dem Primärfollikel entsteht der Sekundärfollikel, dessen Wand aus einem
mehrschichtigen kubischem Epithel besteht. In diesem Stadium hat die Eizelle einen
Durchmesser von ca. 100 µm erreicht, und die Zona pellucida ist als vollständige
Hülle ausgebildet. Das Follikelepithel entwickelt sich im folgenden durch mitotische
Teilungen zum mehrschichtigen Stratum granulosum, das durch eine Basalmembran
von der Theca folliculi interna und externa abgegrenzt ist. Durch Sekretion der
Granulosazellen entsteht Liquor follicularis, der sich zwischen den Zellen ansammelt,
was zu einer Hohlraumbildung führt, und so den Tertiärfollikel entstehen lässt. Die
Oozyte wird an die Wand des Follikels gedrängt und in der Folge von mehreren
Granulosazellschichten umgeben. Diese Struktur wird als Kumulus-Oozyten-Komplex
(KOK) bezeichnet (SCHNORR 1996).
-6-
Schrifttum
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Keimzellentwicklung beim Schwein
A
B
C
praenatal
Geburt
ab Tag 60 nach Geburt
postnatal
D
praepuberal
E
ab Geschlechtsreife
postpuberal
(modifiziert nach ALBERTS et al. 1995)
-7-
Schrifttum
Die präovulatorische Freisetzung der gonadotropen Hormone induziert schließlich
die Bildung des ovulationsbereiten Graafschen Follikels. Hierbei führt ein LH-Anstieg,
der letztlich auch die Ovulation auslöst, zur Vermehrung der Granulosazellen und zur
Zunahme der Follikelflüssigkeit. Die ursprüngliche breitflächige Verbindung des
Cumulus Oophorus mit dem Stratum granulosum wird bis auf einen dünnen Stiel, der
schließlich einreißt, reduziert, so dass die Eizelle samt umgebenden Kumuluszellen
frei in der Follikelflüssigkeit flotiert (SCHNORR 1996). Ebenso induziert der LHAnstieg, durch Wiederaufnahme der meiotischen Aktivität, die Reifung der im
Diktyotän verharrenden primären Oozyte (HUNTER 1966). Die Auflösung des
ringförmigen
Germinalvesikels
(Germinal
Vesicle
Break
Down,
GVBD)
ist
charakteristisch für dieses Stadium (DAGUET 1980; DEKEL 1988). Zugleich wird
durch ungleiche Zytokinese der erste Polkörper ausgeschleust, was die sekundäre
Oozyte (Abbildung 1/D) entstehen lässt (TSAFRIRI et al. 1982). Unmittelbar darauf
beginnt diese die zweite meiotische Reifeteilung zu durchlaufen, die jedoch in der
Metaphase (Metaphase II-Oozyte, MII-Oozyte) bis zur Aktivierung durch ein
penetrierendes Spermium erneut arretiert wird (HUNTER et al. 1987; THIBAULT et
al. 1987; HUNTER 1991; BEARDEN u. FUQUA 1993). Erst mit Abschluss der
zweiten Reifeteilung, im Anschluss an die Befruchtung, entsteht die haploide reife
Eizelle, das Ovum (Abbildung 1/E). Pro Zyklus entstehen beim Schwein 25-50
Tertiärfollikel, von denen nur eine begrenzte Anzahl ovuliert. Die übrigen Oozyten
degenerieren
zusammen
mit
den
umgebenen
Follikeln
(BYSKOV
1978;
ARMSTRPONG u. LEUNG 1990). Verglichen mit den Eizellen von Schaf und Rind ist
ein relativ hoher Lipidgehalt speziesspezifisch für die Schweineeizelle. Besonders
der Anteil mehrfach ungesättigter Fettsäuren ist beim Schwein wesentlich höher als
bei den genannten Wiederkäuern (McEVOY et al. 2000). Der hohe Lipidgehalt, der
später auch typisch für den porzinen präeimplantativen Schweineembryo ist, bedingt
eine hohe Empfindlichkeit von Eizelle und Embryo gegen Temperaturschwankungen,
was unter anderem zu Schwierigkeiten bei der Kryokonservierung porziner
Embryonen führt (zum Überlick: DOBRINSKY 1997).
Schrifttum
-8-
2.1.2 Physiologie der Befruchtung
Bei der Befruchtung erfüllt das Spermium zwei zentrale Aufgaben: Es liefert der
Oozyte in Form des haploiden Chromosomensatzes die genetische Information für
das diploide Genom und aktiviert die Eizelle, so dass diese ihre 2. meiotische
Reifeteilung vollenden kann, den 2. Polkörper ausschleust und nach Verschmelzung
des männlichen- und weiblichen Vorkerns schließlich die Embryonalentwicklung
einleitet. Beim Schwein findet die Befruchtung am Übergang der Eileiterampulle zum
Isthmus tubae uterinae statt. Die Oozyten gelangen nach der Ovulation über die
Fimbrientrichter in die Eileiter und erreichen nach 30-45 Minuten die Eileiterampulle
(HUNTER 1991). Ihre optimale Befruchtungsfähigkeit bleibt jedoch nur maximal
sechs Stunden bestehen (HUNTER 1991). Die ersten Spermien erreichen bereits 15
Minuten nach der Konzeption den Eileiter, was durch die intrauterine Deposition, das
große Ejakulatvolumen, sowie durch kranial gerichtete Myometriumskontraktionen
unterstützt wird (HUNTER 1991). Im Bereich des kaudalen Isthmus tubae uterinae
wird ein Spermienreservoir gebildet, wobei die Spermien an epitheliale Zellen binden
(HUNTER 1991). Die periovulatorische Freisetzung der Spermien erfolgt aufgrund
vom
Follikel
ausgehender
Befruchtungsfähigkeit
durchlaufen
zu
(HUNTER
hormoneller
erlangen,
u.
DZIUK
Signale
müssen
die
1968),
die
(HUNTER
1994).
Spermien
die
durch
Um
die
Kapazitation
biochemische
und
biophysikalische Umgestaltungsprozesse gekennzeichnet ist (FLESCH u. GADELLA
2000) und die Voraussetzung für die Akrosomreaktion darstellt (AUSTIN 1951;
CHANG 1951). Diese befähigt die Spermien zur Penetration durch die Zona
pellucida und zur anschließenden Gametenfusion. Bei der Akrosomreaktion kommt
es zur Verschmelzung der Plasmamenbran des Spermienkopfes mit der äußeren
Akrosommembran
und
zu
anschließender
Exozytose
akrosomaler
Enzyme
(BARROS et al. 1967; YANAGIMACHI 1988). Nach Passieren der Zona pellucida
erfolgt die Fusion der nebeneinanderliegenden Plasmamembranen von Samenzelle
und Oozyte. Aus dem Halsstück der Samenzelle entwickelt sich das Zentriol für die
später stattfindende erste Teilung (YLLERA-FERNANDEZ et al. 1992). Durch die
Gametenfusion gelangt der Zellkern des Spermiums in die Oozyte, von da an besitzt
die Oozyte einen vollständigen Chromosomensatz. Dieser liegt in Form von 2
Schrifttum
-9-
haploiden Vorkernen vor, die zunächst noch voneinander getrennt sind. Ebenfalls
durch die Fusion gelangt ein lösliches zytosolisches Protein („Cytosolic Sperm
Factor“, CSF, „oscillin“) aus dem Zytoplasma des Spermiums in die Oozyte
(Abbildung 2), was repetitive intrazelluläre Ca2+ Oscillationen auslöst (PARRINGTON
et al. 1996; MACHATY et al. 2000; SWANN et al. 2001; SAUNDERS et al. 2002).
CSF besitzt ein relatives Molekulargewicht von 33KDa und befindet sich im
Spermienkopf auf Höhe des Äquatorialsegmentes, wo die Spermien-Oozyten-Fusion
ihren Anfang nimmt (PARRINGTON et al. 1996). Es wurde gezeigt, dass durch
Injektion von porzinem CSF in Oozyten von Rind und Schwein eine vollständige
Aktivierung eingeleitet werden kann (MACHATY et al. 2000; KNOTT et al. 2002).
Zunächst glaubte man an ein Protein, das die Phospholipase C (PLC) stimuliert (WU
et al. 2001). Später wurde es als eine spermientypische Isoform der Phospholipase
C identifiziert, die Phosphatidylinositol4,5-bisphosphat (PIP2) zu Inositol1,4,5triphosphat (Ins3P) und Diacylglycerin hydrolysiert (SAUNDERS et al. 2002). Ins3P
als second messenger aktiviert die Oozyte (INOUE et al. 2002). Durch Bindung an
Ins3P-Kalziumkanalrezeptoren kommt es zu einer Erhöhung des intrazellulär
verfügbaren Ca2+ (BERRIDGE 1993; MACHATY et al. 1997a). Das freigesetzte Ca2+
wiederum verstärkt die PLC-Aktivität (RICE et al. 2000). Dieses positive Feedback ist
ursächlich für die Induktion der Ca2+ Oszillationen, die in der Schweineeizelle bei
Eintritt des Spermiums für etwa 2-3 Stunden (SUN et al. 1992; MACHATY et al.
1997a) bis zur Bildung der Vorkerne anhalten (JONES et al. 1995; DAY 2000). Sie
werden als das zentral auslösende Signal für die weiteren Vorgänge im Rahmen der
Oozyten-Aktivierung angesehen (OZIL 1990; VITULLO u. OZIL 1992). Die Exozytose
der kortikalen Granula führt zu Veränderungen von Oolemm und Zona pellucida. Der
Inhalt der kortikalen Granula entleert sich dabei in den perivitellinen Raum, und es
kommt zu physikochemischen und biochemischen Zustandsänderungen der
Plasmamembran und zur Aushärtung der Zona pellucida (CRAN u. CHENG 1986).
Hierdurch wird ein Polyspermieblock aufgebaut, der das Eindringen weiterer
Spermien in die Oozyte verhindert (HUNTER 1991). Ursächlich für die meiotische
Arretierung der gereiften Oozyte ist ein hoher Plasmaspiegel von aktivem „Meiosis
Promoting Factor“ (MPF) (NURSE 1990; VERLHAC et al. 1994), einem Komplex aus
- 10 -
Schrifttum
einem regulatorischem Protein, dem Cyclin B (GAUTIER et al. 1990), und einem
katalytischen Protein, der CdK (Cyclin dependent kinase). Die Aktivität von MPF wird
durch die Aneinanderlagerung dieser beiden Proteine aufrechterhalten, wobei der
intrazytoplasmatische Abbau von Cyclin B durch einen Cyclin-stabilisierenden
Komplex (CsK) unterbunden wird (MASUI 1991; KUBIAK et al. 1993; MASUI 2000).
Als Folge der Ca2+ Oszillationen stimuliert freies Ca2+ Calmodulin-Moleküle, die
ihrerseits eine calmodulinabhängige Kinase stimulieren, die den CsK dann inaktiviert
(LORCA et al. 1993). Durch intrazytoplasmatischen Abbau sinkt in der Folge der
Cyclin B-Plasmaspiegel, was zum MPF-Abbau (Abbildung 2) und schließlich zum
Überwinden der meiotischen Arretierung führt (MURRAY 1989).
Abbildung 2: Biochemische Vorgänge bei der Aktivierung der Schweineoozyte durch ein
Spermium
Calmodulin(Ca2+)
Calmodulin
+
CsK (aktiv)
CsK (inaktiv)
+
Cyclin B
Cyclin B
+
MPF
CdK + Cyclin B
(modifiziert nach SWANN et al. 2001)
Eine wichtige bisher jedoch noch nicht vollständig geklärte Rolle bei der Aktivierung
der Schweineoozyte spielt die „Mitogen Activated Protein Kinase“ (MAPK) (LIU u.
- 11 -
Schrifttum
YANG 1999), die die Oozyte während der meiotischen Arretierung bei hoher
Plasmaaktivität vor parthenogenetischer Aktivierung bewahrt (PICARD et al. 1996).
Diese Kinase, deren Aktivitätsabfall mit der Vorkernbildung in Verbindung gebracht
wird (MOOS et al. 1995; LIU u. YANG 1999), wird vermutlich durch eine spezifische
Proteinkinase C (PKC) inaktiviert (SUN et al. 1999). Dies geschieht bei der Spezies
Schwein zeitlich versetzt zur MPF-Inaktivierung (MIYANO et al. 2000). Die
Wiederaufnahme der Meiose führt zur Ausschleusung des 2. Polkörpers und zur
Ausbildung des weiblichen und männlichen Vorkerns (HANCOCK 1961). Die ersten
Vorkerne sind beim Schwein frühestens 6 Stunden nach Besamung bzw. Konzeption
zu sehen (HANCOCK 1961; LAURINCIK et al. 1994). Für die Syngamie wandern
beide Vorkerne aufeinander zu und verschmelzen miteinander zur diploiden Zygote.
Die erste Furchungsteilung vollzieht sich in Form einer normalen Mitose, und tritt bei
der Spezies Schwein etwa 21h nach Konzeption auf (HANCOCK 1961).
2.1.3 Embryonalentwicklung beim Schwein
Die
Schweinezygote
vollzieht
14-16
h
nach
der
Befruchtung
die
erste
Furchungsteilung, gefolgt von der 2. Teilung nach 20-25 h (HUNTER 1974), die zum
4-Zellembryo führt (Abbildung 3). Dieser tritt nach 46-48 h vom Eileiter in den Uterus
über (BRÜSSOW 1985; BAVISTER 1988). Bereits in dieser frühembryonalen
Entwicklungsphase findet beim präimplantativen Schweineembryo eine progressive
Umstellung von der maternalen zur embryonalen RNA-Synthese statt (TELFORD et
al. 1990; JARRELL et al. 1991). Der wachsende porzine Embryo erreicht nach 3-4
Tagen das Entwicklungsstadium der Morula und nach 5 Tagen das der Blastozyste
(Abbildung 3). Die Blastozyste schlüpft am 6. Tag aus der Zona pellucida, was auch
als „Hatching“ bezeichnet wird (SCHNORR 1996). Bereits in der kompaktierten
Morula, sowie deutlicher in der Blastozyste erkennbar, differenziert sich der Embryo
in 2 Zellpopulationen, die innere Zellmasse („Inner Cell Mass“ = ICM) und das
Trophektoderm (TE, Abbildung 3) (DORST 1991). Der Schweinefetus geht nur aus
der ICM hervor, weshalb diese Zellen auch als Embryoblast bezeichnet werden. Aus
dem TE bilden sich später die Fruchthüllen, das Chorion- und Amnionepithel
(SCHNORR 1996).
Schrifttum
- 12 -
Abbildung 3: Präimplantative Stadien des frühen Schweineembryos
Oozyte
Metaphase II
arretiert
Zygote
~ 6 Stunden
nach Befruchtung
8-Zeller
am 3. Tag
nach Befruchtung
Morula
am 4. Tag
nach Befruchtung
2-Zeller
14-16 Stunden
nach Befruchtung
4-Zeller
~20-25 Stunden
nach Befruchtung
Blastozyste
am 5.Tag
nach Befruchtung
ICM
TE
(modifiziert nach SCHNORR 1996)
Das uterine Signal zur Luteolyse der Corpora lutea (Gelbkörper), die das Trächtigkeit
erhaltende Steroid Progesteron synthetisieren, erfolgt an Tag 14 der Trächtigkeit. Die
wichtigste Aufgabe, die porzine Embryonen zunächst für ihre weitere Existenz zu
bewältigen haben, ist deshalb die Verhinderung der Luteolyse, um damit die
Lebensspanne der Corpora lutea zu verlängern. Hierzu produzieren die Embryonen
an Tag 11-12 der Gravidität, dem Stadium, in dem sich der Primitivstreifen bildet, viel
Östradiol-17ß (HEAP et al. 1979b; HEAP et al. 1981). Unter dem Einfluss dieses
lokal wirkenden Östrogens tritt das endometriale PGF2α, das am Ovar die Luteolyse
- 13 -
Schrifttum
hervorruft, aus den Uterusvenen in den arteriellen Schenkel des Gefäßsystems über
und gelangt in das Uteruslumen, so dass das Ovar nicht erreicht wird. Aus einem
endokrinen wird ein exokriner Sekretionsmodus, und die zyklische Luteolyse bleibt
aus. Um genügend Östradiol-17ß zu bilden sind bei der multiparen Spezies Schwein
am Tag 10-14 der Gravidität mindestens 4-5 Embryonen nötig (POLGE et al. 1966;
POPE et al. 1972). Zu späteren Zeitpunkten ist die Aufrechterhaltung der Gravidität
mit einer geringeren Embryonen- oder Fetenzahl vereinbar. Am 14. Tag der
Gravidität, dem Stadium in dem sich das Neuralrohr ausbildet, erfolgt die Anheftung
an
die
uterine
Schleimhaut
(POPE
et
al.
1972).
Hierzu
wachsen
die
Schweineembryonen, die bis zum 13. Tag der Gravidität die Gestalt einer 2 mm
großen
kugelförmigen
Keimblase
aufweisen,
innerhalb
von
4
Tagen
zu
schlauchförmigen, bis zu 150 cm langen, Gebilden aus, bei denen der eigentliche
Embryo in der Mitte lokalisiert ist. Die Schläuche liegen aufgeknäult im Uterus und
entwickeln sich ab dem 20. Tag, durch Weitenzunahme im Mittelteil und Rückbildung
an den Enden, zur typischen zweizipfeligen Form. Als Vorstufen der Zotten bilden
sich an der Oberfläche Epithelfalten, in die in der 4. Woche Mesenchym einwächst.
Die
endgültige
Ausbildung
und
Einsenkung
der
Chorionzotten
in
die
Uterusschleimhaut erfolgt etwa in der 5. Graviditätswoche. Die Zotten sind bei der
Spezies Schwein auf dem Chorion gleichmäßig verteilt, fehlen jedoch an den Enden;
man spricht deshalb von einer Semiplacenta diffusa incompleta. Da an der Plazenta
keine Gewebsverluste auftreten, besitzt das Schwein eine Placenta epitheliochorialis
(SCHNORR 1996). Bis zum 28 Tag der Gravidität hat der Schweineembryo eine
Größe von ca. 23 mm erreicht (KEIBEL 1897). Eine detailliertere Betrachtung des
spätembryonalen Wachstums gibt Abbildung 4. Ab dem 30 Tag der Gravidität sind
beim späten Schweineembryo alle Organe angelegt, so dass von nun an vom frühen
Schweinefetus gesprochen wird, der in der Folge bis zur Geburt an Tag 114 der
Gravidität im wesentlichen nur noch ein Größenwachstum erfährt (SCHNORR 1996).
- 14 -
Schrifttum
Abbildung 4: Morphologische Veränderungen während der späten Embryonalentwicklung des
Schweines
Tag 17:
6,8 mm Körperlänge
Tag 21:
9,6 mm Körperlänge
Tag 22:
12 mm Körperlänge
Tag 25:
19,5 mm Körperlänge
Tag 28:
23 mm Körperlänge
(modifiziert nach KEIBEL 1897)
Schrifttum
- 15 -
2.1.4 Relevante Aspekte des Zellzyklus
Jede mitotisch aktive Zelle unterliegt dem Zellzyklus (Abbildung 5), der Zellwachstum
und Zellteilung koordiniert. Seine Dauer ist je nach Zelltyp sehr unterschiedlich. Der
Zellzyklus frühembryonaler Zellen ist verkürzt, da diese Zellen sich ohne vorheriges
Wachstum teilen. Embryonen von Fliegen haben mit etwa 8 Minuten die kürzesten
bekannten Zellzyklen, der Zellzyklus von Leberzellen aus einem Säuger kann
dagegen länger als ein Jahr dauern (ALBERTS et al. 1995). Im allgemeinen wird der
Zellzyklus in 2 Hauptphasen eingeteilt, von denen die Mitose (M-Phase) die
eigentliche Zellteilung darstellt. Zu Beginn der Mitose, der Prophase, zerfällt die
Kernmembran, der Inhalt des Zellkerns kondensiert zu sichtbaren Chromosomen und
zelluläre Mikrotubuli bilden die Mitosespindel, die schließlich die Chromosomen
trennt. Daraufhin scheint die Zelle kurz in einem als Metaphase bezeichneten
Stadium zu verharren, in welchem die bereits verdoppelten Chromosomen an der
Mitosespindel aufgereiht werden. Die Trennung der verdoppelten Chromosomen
markiert den Beginn der Anaphase, in der sich die Chromosomen zu den jeweiligen
Polen der Spindel hinbewegen, wo sie in der Telophase dekondensieren und neue
intakte Zellkerne bilden. In der sich anschließenden Zytokinese teilt sich die Zelle in
zwei Tochterzellen, was als das Ende der M-Phase des Zellzyklus betrachtet wird
(ALBERTS et al. 1995). Der Zeitabschnitt zwischen den Mitosen, der den größten
Teil im Zyklus ausmacht und in dem Zellwachstum und DNA-Replikation erfolgen,
bezeichnet man als Interphase. Diese wird in die G1-Phase (engl. gap = Lücke
zwischen M-Phase und S-Phase), die S-Phase (Synthesephase) und die G2-Phase
(Lücke zwischen S-Phase und M-Phase) unterteilt (ALBERTS et al. 1995). Aus der
G1-Phase können die Zellen, z.B. durch Kontaktinhibition oder Serumentzug, in ein
Ruhestadium (G0-Phase) gelangen (BOQUEST et al. 1999b) und so den Zellzyklus
arretieren, wobei ein länger andauernder Serumentzug bei porzinen Fibroblasten zu
apoptotischen Erscheinungen führen kann (KUES et al. 2002). Da die DNAReplikation in der S-Phase erfolgt, besitzen Zellen in der G0/G1-Phase einen
diploiden Chromosomensatz, in der G2- und M-Phase einen tetraploiden
Chromosomensatz, sowie in der S-Phase einen DNA-Gehalt, der zwischen diesen
Werten liegt (BOQUEST et al. 1999b). Dies wird auch in Abbildung 5 verdeutlicht.
Schrifttum
- 16 -
Abbildung 5: Schematische Darstellung des Zellzyklus einer Säugetierzelle
(4 C)
MPF
CdK
+Cyclin
(2 C)
(2-4 C)
C: Chromosomensatz, MPF (Meiosis Promoting Factor), CdK (Cyclin dependent Kinase)
(modifiziert nach ALBERTS et al. 1995)
Die Meiose der Säugeroozyte kann als eine Abfolge von 2 Zellzyklen betrachtet
werden, wobei die S-Phase der 2. meiotischen Reifeteilung entfällt, was einen
haploiden Chromosomensatz des Ovums zur Folge hat (SCHNORR 1996).
Schlüsselprotein zur Kontrolle des Zellzyklus ist der „Meiosis Promoting Factor“
(MPF). Nur die hohe Aktivität dieses Komplexes aus einer „Cyclin dependent kinase“
(CdK) und einem regulatorischen Cyclin erlaubt es der Zelle von der G2-Phase in die
- 17 -
Schrifttum
M-Phase fortzuschreiten; nur ein niedriger Spiegel an aktivem MPF erlaubt ein
Verlassen der Mitose (ALBERTS et al. 1995). So verhindert bei der Metaphase IIarretierten Säugeroozyte ein Cyclin stabilisierender Komplex den Abbau des Cyclins
(MASUI 1991), was einen vorzeitigen Eintritt in die Interphase ohne Befruchtung
verhindert. Aktives MPF besitzt Proteinkinaseaktivität; es induziert die Aufösung der
Kernmembran durch Phosphorylierung von Serin-Resten an Lamin-Molekülen, lässt
durch
Phosphorylierung
Mikrotubuli-assoziierter
Proteine
die
Mitosespindel
entstehen und führt über direkte oder indirekte Phosphorylierung von Histon H1, das
an der Verpackung der DNA in Nucleosomen beteiligt ist, zur DNA Kondensation
(WEHNER u. GEHRING 1995; ALBERTS et al. 1995). Da der Cyclingehalt
zyklischen Schwankungen unterworfen ist, stellt Cyclin den eigentlichen Taktgeber
des Zellzyklus dar. In der G2-Phase wird Cyclin durch Proteinbiosynthese
angereichert und bildet mit CdK Molekülen den MPF-Komplex. Dieser wird durch
Abbau von Cyclin zwischen Meta- und Anaphase inaktiviert, was die Zelle in die
Interphase eintreten lässt (MURRAY 1989). Bei der gereiften Schweineoozyte
unterscheidet man zwischen aktivem- und inaktivem MPF (preMPF). Entscheidend
ist das Phosphorylierungsmuster; aktiver MPF ist stets am Threoninrest 14 und
Thymidinrest 15 dephosphoryliert, und am Threoninrest 161 phosphoryliert (KIKUCHI
et al. 2000; KIKUCHI et al. 2002). Wenn gereifte Schweineoozyten, die einen hohen
Spiegel an aktivem MPF aufweisen (VERLHAC et al. 1994; KIKUCHI et al. 2000),
spät
oder
gar
nicht
aktiviert
werden,
sinkt
durch
Änderungen
des
Phosphorylierungsmusters das Verhältnis von aktivem MPF zugunsten des Anteils
an pre-MPF (KIKUCHI et al. 1999) ohne Veränderung der MPF-Gesamtmenge
(KIKUCHI et al. 2002). Dieser Aktivitätsverlust führt neben spontanem Eintritt in die
Interphase
zu
erhöhten
Aktivierungsraten
bei
gleichzeitig
vermindertem
Entwicklungspotential und erhöhten Fragmentationsraten nach artifizieller Aktivierung
(KIKUCHI et al. 2000). Die Gesamtheit dieser Alterungserscheinungen werden als
„Aging“ bezeichnet (KIKUCHI et al. 2000; FISSORE et al. 2002). Bei der Spezies
Schwein sind bei gealterten Oozyten mitochondriale Dysfunktionen (GREEN u.
REED 1998; WANG 2001) und veränderte Mitosespindeln (FISSORE et al. 2002)
beschrieben worden.
Schrifttum
- 18 -
2.2 Biotechnologische Grundlagen
2.2.1 In-vitro-Reifung porziner Oozyten
Für die IVM (In vitro Maturation) werden primäre Oozyten im Germinal-VesikelStadium (GV-Stadium) (MOOR u. GANDOLFI 1987) aus Ovarien geschlachteter
Sauen durch Aspritation aus 2-5 mm großen Follikeln gewonnen und in geeigneten
Reifungsmedien inkubiert. Oozyten aus kleineren Follikeln können zur Zeit noch nicht
verwendet werden, da sie eine verminderte Kompetenz zur Fortsetzung der Meiose
besitzen (MOTLIK et al. 1984; MARCHAL et al. 2002) und nach IVF (In-vitroFertilisation) nur zu einem geringeren Anteil das Blastozystenstadium erreichen
(MARCHAL et al. 2002). Oozyten aus den Ovarien postpuberaler Sauen reifen dabei
schneller
(TAKAHASHI
u.
NAGAI
1990)
und
weisen
ein
höheres
Entwicklungspotential auf als Oozyten präpuberaler Sauen (MARCHAL et al. 2001).
Es wird zwischen Kernreifung und zytoplasmatischer Reifung unterschieden. Die
Kernreifung beinhaltet die Wiederaufnahme der ersten meiotischen Reifeteilung, die
Ausschleusung des 1. Polkörpers, sowie das Fortschreiten der 2. meiotischen
Reifeteilung bis zur Metaphase, und ist bei Schweineoozyten bereits nach 36 h
vollendet, während die zytoplasmatische Reifung, die mit morphologischen
Veränderungen im Verteilungsmuster der Mitochondrien und der kortikalen Granula
einhergeht (MOOR et al. 1990), frühestens nach 44 h abgeschlossen ist (zum
Überblick: PRATHER u. DAY 1998). Bei der Reifung porziner Oozyten sollte der
osmotische Druck des Mediums 265 bis 355 mOsmol (optimal 285 mOsmol)
betragen (McGAUGHEY u. VAN BLERKOM 1977) und der pH-Wert auf 7,2-7,4
eingestellt sein (SATO u. KOIDE 1987). Als optimal gilt eine Temperatur von 38,539°C (CRAN u. CHENG 1985; YOSHIDA 1987) bei einer Gasatmosphäre von 5%
CO2 (TSAFRIRI u. CHANNING 1975). Das Ölüberschichten des Reifungsmediums
ist mit verzögerter Kernreifung und einem geringeren Entwicklungspotential in
Verbindung gebracht worden. Hierbei wird die Diffusion von Steroiden aus dem
Reifungsmedium in das Öl diskutiert (SHIMADA et al. 2002). Unterschiedliche
Medien wurden verwendet: Krebs Ringer Bicarbonatlösung (NAITO et al. 1988),
Waymouth Medium (HIRAO et al. 1994; KIKUCHI et al. 1995), Tissue Culture
Schrifttum
- 19 -
Medium (TCM)199 (MOTLIK et al. 1986; MATTIOLI et al. 1989; FUNAHASHI u. DAY
1993; GRUPEN et al. 1995), North Carolina State Universiy (NCSU) Medium 23
(ABEYDEERA u. DAY 1997; BOQUEST et al. 1999a) und NCSU37 (PETTERS u.
WELLS 1993; FUNAHASHI et al. 1997; RATH et al. 1999; LONG et al. 1999). Die
Medien, die auf TCM199 und NCSU basieren, werden heute vielfach als
Standardmedien zur Reifung von Schweineoozyten eingesetzt. In Tabelle 1 wird ein
Überblick über die Reifungsergebnisse verschiedener Autorengruppen gegeben.
Eine Verbesserung der Reifung porziner Eizellen wurde durch Zusatz porziner
Follikelflüssigkeit (pFF) als Proteinquelle erzielt (NAITO et al. 1988; YOSHIDA et al.
1992; ABEYDEERA et al. 1998a; VATZIAS u. HAGEN 1999; RATH et al. 1999).
Morphologisch intakte Oozyten sollten ein fein granuliertes Zytoplasma und
mindestens 3 Lagen an Kumuluszellen besitzen (LEIBFRIED u. FIRST 1979), wobei
einer ausreichenden Zahl an Kumuluszellen besondere Bedeutung zukommt
(MOTLIK et al. 1986; MATTIOLI et al. 1988; MOOR et al. 1990; THOMAS u. SEIDEL,
JR. 1993). Diese fördern aufgrund ihrer metabolischen Kapazität (TANGHE et al.
2002), über ein Netzwerk an Gap junctions zwischen Kumuluszellen und Oozyte
(MOOR et al. 1980; EPPIG 1982), die zytoplasmatische Reifung durch einen direkten
Substanztransfer. Die Kumuluszellen sind auch an der meiotischen Arretierung der
Oozyte in der Prophase der 1. meiotischen Reifeteilung beteiligt. Von den
Kumuluszellen befreit, nehmen einige Schweineoozyten spontan die Meiose wieder
auf (NAGAI et al. 1993). Dies wird als passive Reaktion auf die Abwesenheit einer
Meiosis Inhibiting Substance gedeutet (THIBAULT et al. 1987). Beim Schwein wird
dem Transport von cAMP über die Gap junctions in die Eizelle eine Beteiligung an
der Aufrechterhaltung der meiotischen Arretierung zugeschrieben (KUMAR u.
GILULA 1996). Da in kleinen Follikeln stetig geringe Mengen an cAMP von den
Kumuluszellen in die Eizelle transportiert werden, um diese in der Prophase zu
arretieren (DEKEL 1988), gilt die Aufrechterhaltung eines optimalen intrazellulären
cAMP-Spiegels als Voraussetzung, um der Eizelle eine zytoplasmatische Reifung zu
ermöglichen (LUCIANO et al. 1999). Vermutlich führt deshalb ein cAMP-Zusatz zum
Reifungsmedium für die ersten 20 h der Reifung zu einer verbesserten
präimplantativen Entwicklung bei der Spezies Schwein (FUNAHASHI et al. 1997).
46-48 h, 39°C
32 h, 39°C
47-48 h, 39°C
44-48 h, 39°C
44 h, 39°C
36 h, 39°C
36 h, 38°C
48 h, 39°C
47 h, 39°C
48 h, 39°C
TCM199 + Glutamin + Hepes +15%CBS
TCM 199 + Hepes + LH + PS + Estradiol
TCM199 + FSH + LH + Prolaktin + Glutamin + 5%FCS
+ 5%NBCS
TCM199 + 15%NPS
TCM199 + pFSH + LH +10%FCS
TCM199 + eCG + hCG + Estradiol + 10%FCS
TCM199 + eCG + hCG + Estradiol + 10% pFF + 10%FCS
TCM199 + FSH + LH + Prolaktin + Glutamin + 5%FCS
+ 5%NBCS
TCM199 + pFSH + LH + Glutamin + Vit.C + Insulin +10%FCS
TCM199 + 10%FCS + pFF + FSH
RR (Reifungsrate), CBS (Castrated Boar Serum), FCS (Fetal Calf Serum), NBCS (Newborn Calf Serum)
NPS (Newborn Piglet Serum), pFF (porzine Follikelflüssigkeit)
RATH et al. 1995a
DING u. FOXCROFT 1994
DING et al. 1992
YOSHIDA et al. 1990
WANG et al. 1991
GALEATI et al. 1991
NAKANISHI et al. 1990
NAGAI u. MOOR 1990
NAGAI et al. 1988
ENG et al. 1986
Autor
Inkubationsbedingungen
Reifungsmedien
Tabelle 1: Reifungsergebnisse porziner Oozyten
60
96
70
90
71
85
80
87-100
53-72
71
RR
(%)
- 20 Schrifttum
78-89
79
90
85,2
71-82
20h, 39°C, 24h ohne
Hormone + cAMP
44 h, 39°C
20 h, 39°C, weitere
22 h ohne Hormone
44 h 39°C
22 h, 39°C, weitere
22 h ohne Hormone
20 h, 39°C, 22h ohne
Hormone + cAMP
22 h, 39°C, weitere
20 h ohne Hormone
22 h, 39°C, weitere
20 h ohne Hormone
NCSU37 + ß-Merkaptoethanol + Cystein + Insulin +10%pFF
+ eCG + hCG + cAMP
BSA freies NCSU23 + Cystein + eCG + hCG + 10%pFF
NCSU23 + Cystein + LH + FSH + pFF
TCM199 + Cystein + EGF + LH + FSH
BSA freies NCSU23 + Cystein + EGF + eCG + hCG + pFF
TCM199 + Cystein + EGF + eCG + hCG + pFF+cAMP
BSA freies NCSU23 + EGF+ eCG + hCG + pFF
TCM199 + EGF + eCG + hCG + pFF
71-84
80-87
83,6
44 h, 39°C
93
87
RR(%)
NCSU23 + eCG + hCG + Cystein + 10%pFF
44 h, 39°C
TCM199 + eCG + hCG + Cystein + 10%pFF
RR (Reifungsrate), pFF (porzine Follikelflüssigkeit)
HYUN et al. 2003b
MIYOSHI et al. 2002
ZHU et al. 2002
ABEYDEERA et al. 2001
ABEYDEERA et al. 1999
ABEYDEERA et al. 1998b
FUNAHASHI et al. 1997
WANG et al. 1997
Autoren
Inkubationsbedingungen
Reifungsmedien
Fortsetzung Tabelle 1: Reifungsergebnisse porziner Oozyten
Schrifttum
- 21 -
Schrifttum
- 22 -
Als Antwort auf den präovulatorischen Gonadotropin-Impuls wird die meiotische
Arretierung aufgehoben und die Kumuluszellen beginnen mit der Produktion von
Hyaluronsäure,
die
in
den
interzellulären
Räumen
gelangt
und
zur
Kumulusexpansion führt (CHEN et al. 1990; MATTIOLI et al. 1994).
Der Zusatz von FSH und LH, sowie deren Analoga PMSG und hCG, zum
Reifungsmedium führt bei den Oozyten vieler Säugetiere zu einer Verbesserung der
Kumulusexpansion und der Spermienpenetration nach IVF (In vitro Fertilization)
(EPPIG 1979; MOOR et al. 1980). Die Vorkernbildungsraten werden bei der Spezies
Schwein optimiert, wenn die Hormone sich für die ersten 20h der Reifung im Medium
befinden (FUNAHASHI u. DAY 1993). Ebenfalls einen günstigen Einfluss auf die
Kumulus-Expansion und die präimplantative Entwicklung der Schweineembryonen
nach IVF übt der Epidermal Growth Factor (EGF) aus (DING u. FOXCROFT 1994;
SINGH et al. 1997; ABEYDEERA et al. 1998b; ABEYDEERA et al. 2000). Durch die
Kumulusexpansion werden die Gap-junctions zu den äußeren Kumuluszellen
unterbrochen (WERT u. LARSEN 1989; SUZUKI et al. 2000). Wahrscheinlich wird
hierdurch auch die Überführung von Meiosis-Inhibitory Signalen unterbunden (ISOBE
et al. 1998). Letztlich sind die Gap junctions auf die Corona radiata beschränkt
(MATTIOLI 2000), wohingegen die Kumulus-Kumulus-Verbindungen intakt bleiben
(SUZUKI et al. 2000). Für eine vollständige Zytoplasmareifung der Schweineoozyten
müssen anheftende Kumuluszellen vorhanden sein (YAMAUCHI u. NAGAI 1999), da
diese die weitere Entwicklung fördern (NAGAI 2001). Vermutet werden intrazelluläre
Einflüsse auf pH-Wert und Ca2+ Konzentration (YAMAUCHI u. NAGAI 1999; MORI et
al. 2000). Glucose kann von der Schweineoozyte nicht verstoffwechselt werden. Sie
ist auf Pyruvat als Energiesubstrat angewiesen, das die Kumuluszellen aus Glucose
metabolisieren (TANGHE et al. 2002).
Die Kumuluszellen erhöhen darüber hinaus den intrazellulären Glutathion (GSH)Gehalt in porzinen Oozyten (YAMAUCHI u. NAGAI 1999), der auch als Indikator für
eine vollständige zytoplasmatische Reifung angesehen wird (YOSHIDA 1993).
Glutathion reduziert die Disulfidbrücken in den Protaminen, was zur Dekondensation
der Spermienköpfe führt (MAHI u. YANAGIMACHI 1975), und trägt so zur Ausbildung
der männlichen Vorkerne („male pronuclei“, MPN) bei. GSH stimuliert den
Schrifttum
- 23 -
Aminosäuretransport, sowie die Proteinsynthese und schützt die Zelle durch Bindung
freier Radikale vor oxidativem Stress (MEISTER 1983; YOSHIDA et al. 1993;
TATEMOTO et al. 2000). Mauszygoten, die transgen für eine Überexpression der
GSH-Synthetase sind, zeigten unter suboptimalen Kulturbedingungen eine deutlich
bessere Entwicklung als normale Zygoten (RZUCIDLO u. BRACKETT 2000).
Cysteinzusatz im Reifungsmedium kann von Schweineoozyten direkt aufgenommen
werden und bewirkt metabolisiert eine Erhöhung des GSH Gehaltes (YOSHIDA et al.
1993; ABEYDEERA et al. 1999). Allerdings wird Cystein unter in Vitro Bedingungen
durch Sauerstoff zu Cystin oxidiert (MOHINDRU et al. 1985), was nur von den
Kumuluszellen aufgenommen werden kann und über Gap junctions an die Oozyte
weitergeleitet wird. Durch Zusatz von ß-Merkaptoethanol (ABEYDEERA et al. 1998a;
TAKAHASHI et al. 2002) oder Cysteamin (GRUPEN et al. 1995; YAMAUCHI u.
NAGAI 1999) wird Cystin teilweise wieder zu Cystein reduziert. In NCSU23 gereifte
Schweineoozyten zeigen einen höheren GSH Gehalt als Oozyten, die in Whittens
Medium und TCM 199 gereift werden, sowie eine bessere Entwicklung zur
Blastozyste (WANG et al. 1997). Organische Osmolyte, wie Taurin und Sorbitol (z.B
in NCSU37), erhöhen den GSH Gehalt der Oozyte ebenfalls (FUNAHASHI et al.
1996). Dennoch weisen in vitro gereifte Schweineoozyten, verglichen mit in vivo
gereiften Oozyten, nur 25% des Gehaltes an GSH auf (BRAD et al. 2003). Sie zeigen
geringere Penetrationsraten, verzögerte und asynchrone Vorkernentwicklungen und
geringere Teilungsraten nach IVF (LAURINCIK et al. 1994), sowie geringere
Blastozystenraten (NAGASHIMA et al. 1996). Während in vivo maturierte Oozyten
häufig helle Areale im Cortex-Bereich aufweisen, fehlten diese bei in vitro maturierten
Oozyten. In vivo maturierte Schweineoozyten sind größer (176mm vs. 149µm) und
besitzen einen weiteren perivitellinen Spalt (2.4µm vs. 3.1µm) als in vitro gereifte
Oozyten (WANG et al. 1998b). In vitro gereifte Oozyten weisen zudem häufig
Chromosomenabnormalitäten auf (SOSNOWSKI et al. 2003). Dennoch wurden im
Jahre 1989 die ersten Ferkel aus Embryonentransfer nach In-vitro-Maturation (IVM)
und In-vitro-Fertilisation (IVF) geboren (MATTIOLI et al. 1989). Später sind in vitro
gereifte Oozyten mit Erfolg verwendet worden, um transgene (CABOT et al. 2001)
und geklonte Schweine (BETTHAUSER et al. 2000) zu produzieren.
Schrifttum
- 24 -
2.2.2 In-vitro-Entwicklung porziner Embryonen
Bei der In-vitro-Kultur (IVC: „In Vitro Culture“) porziner Embryonen ist oft eine
Entwicklungsblockade
im
Vierzellstadium
(Vierzellblock)
beschrieben
worden
(BAVISTER 1988; BAVISTER 1995), der durch Zusatz von Taurin und Hypotaurin
zum Kulturmedium jedoch überwunden werden konnte (PETTERS u. REED 1991).
Porzine Embryonen besitzen das Potential sich in Gegenwart von Glucose und
Glutamin als Energiequelle in vitro bis zur Blastozyste (Abbildung 6) zu entwickeln
(PETTERS et al. 1990) und zu schlüpfen (Abbildung 7). Zusätzlich wurde berichtet,
dass Serumzugaben zum Kulturmedium einen positiven Einfluss auf die Entwicklung
zur Blastozyste ausüben (PETTERS u. WELLS 1993). Ein Austausch des Serums
durch BSA (Bovines Serum Albumin) erhöht die Blastozystenraten (DOBRINSKY et
al. 1996), verringert jedoch das Verhältnis von ICM zu TE (RATH et al. 1995b). Als
Basismedien für die Kultur porziner Embryonen wurden Whitten’s Medium
(WHITTEN u. BIGGERS 1968), BECM-3 (DOBRINSKY et al. 1996), NCSU23
(PETTERS u. WELLS 1993) und SOF (Synthetic Oviductal Fluid)(MARCHAL et al.
2001) eingesetzt, die als Proteinquelle allesamt Serumbestandteile (BSA) enthalten.
Dies erschwert die Standardisierung der Kultur, da Serumchargen erheblich in ihrer
Zusammensetzung variieren können (KANE 1983; BAVISTER 1995). Aus diesem
Grund wurde das definierte „Porcine Zygote Medium“ (PZM) entwickelt (YOSHIOKA
et al. 2002). Obwohl viele verschiedene Kulturmedien entwickelt worden sind, zeigen
in vitro kultivierte porzine Embryonen nach Embryotransfer ein geringeres
Entwicklungspotential als Embryonen, die zuvor aus dem Genitaltrakt trächtiger Tiere
gewonnen wurden (HYTTEL u. NIEMANN 1990). Eine mögliche Ursache wird in
einem negativen Einfluss des Kulturmediums auf die Struktur der Mikrofilamente
gesehen (zum Überblick: NIEMANN u. RATH 2001b). Nach In-vitro-Fertilisation und
anschließender In-vitro-Kultur porziner Embryonen konnten Blastozystenraten von
bis zu 50% erreicht werden (WANG u. DAY 2002). In vitro kultivierte Embryonen
zeigen jedoch eine geringere Gesamtzellzahl als gleichalte in vivo kultivierte
Embryonen, sowie ein geringeres Verhältnis von ICM- zu TE-Zellen (RATH et al.
1995b; MACHATY et al. 1998; YOSHIOKA et al. 2002).
Schrifttum
Abbildung 6: In vitro kultivierte Blastozyste vom Schwein an Tag 6 nach Befruchtung
Abbildung 7: In vitro kultivierte „geschlüpfte“ Blastozyste vom Schwein an Tag 7 nach
Befruchtung
- 25 -
- 26 -
Schrifttum
In Anlehnung an Milieuveränderungen, die der Embryo beim Übertritt vom Eileiter in
den Uterus erfährt, wurde ein zweiphasiges Kultursystem entwickelt, bei dem
Pyruvat/Lactat Glucose als Energiequelle für die ersten 3 Tage ersetzt. Dies kann die
präimplantative Entwicklung verbessern (KIKUCHI et al. 2002), was kürzlich auch für
KT-Embryonen gezeigt wurde (LEE et al. 2003a). Ebenfalls deuten neuere
Ergebnisse von NGUYEN et al. (2003) an, dass der porzine Embryo während der
ersten 48 h seiner Entwicklung andere Anforderungen an die Osmolarität stellt, als
zu späteren Entwicklungsphasen.
2.2.3 Parthenogenetische Entwicklung beim Schwein
Die Parthenogenese ist definiert als reduzierte Form der Fortpflanzung, bei der die
Oozyte ohne vorherige Vereinigung mit der männlichen Geschlechtszelle aktiviert
wird und die Embryonalentwicklung aus einer unbefruchteten Oozyte beginnt
(WEHNER u. GEHRING 1995). Bei der typischen Parthenogenese sind 2
Phänomene abzugrenzen: Bei der Gynogenese wird die Oozyte durch ein Spermium
aktiviert, ohne dass männliches genetisches Material beigesteuert wird. Bei der
Androgenese entwickelt sich nach Eindringen des Spermiums nur der männliche
Vorkern weiter (KAUFMAN u. SACHS 1976). Im Tierreich ist die Parthenogenese,
mit Ausnahme des Säugers, eine relativ weit verbreitete Art der Reproduktion.
Natürlicherweise kommt sie bei verschiedenen Insekten, Reptilien und Fischen vor
(WEHNER u. GEHRING 1995). In der Literatur wird auch über Parthenogenese bei
Hühnern (OLSEN 1966) und Truthühnern (DARCEY et al. 1971) berichtet. Durch
Ausbleiben der meiotischen Teilung, sowie durch Retention des Polkörpers, kann ein
diploider Chromosomensatz gebildet werden (zur Übersicht KAUFMAN u. SACHS
1976). Im Jahre 1970 wurde eine parthenogenetische Entwicklung erstmalig bei der
Maus experimentell ausgelöst (TARKOWSKI et al. 1970). Die Parthenogenese kann
auch beim Schwein durch eine artifizielle nicht Spermium-induzierte Aktivierung
ausgelöst werden (JOLLIFF u. PRATHER 1997; KURE-BAYASHI et al. 2000).
Solche Embryonen können sich nach Embryotransfer auf ein synchronisiertes
Empfängertier bis ins postimplantative Stadium (min. Tag 29) entwickeln. Sie zeigen
aber schwere Abnormalitäten, wie Herz- und Leberzysten, sowie eine reduzierte
- 27 -
Schrifttum
Ausbildung der Kopfregion, oder sogar Kopflosigkeit (KURE-BAYASHI et al. 2000).
Da für eine vollständige Entwicklung bei Säugetieren männlich- und weiblich
geprägte Genome erforderlich sind (SURANI et al. 1984; SURANI et al. 1990), ist
über eine vollständige parthenogenetische Entwicklung mit der Geburt normaler
Nachkommen bei Säugetieren bisher nicht berichtet worden.
Beim
Schwein
hat
die
parthenogenetische
Aktivierung
im
Rahmen
der
Untersuchungen zum Kerntransfer zunehmend an Bedeutung gewonnen. Nach
Austausch der Chromosomen durch Kerntransfer müssen die rekonstruierten
Kerntransferkomplexe für eine weitere Entwicklung aktiviert werden (BETTHAUSER
et
al.
2000).
Zusätzlich
werden
parthenogenetisch
aktivierte
Oozyten
als
Kontrollgruppe zu Kerntransferembryonen genutzt (BETTHAUSER et al. 2000; KOO
et al. 2000). Daher wurden im Laufe der letzten Jahre viele Methoden getestet, um
Schweineoozyten
durch
externe
Stimuli
in
vitro
zu
aktivieren
und
eine
parthenogenetische Entwicklung auszulösen. Die vielfältigen Aktivierungsmethoden
lassen sich in physikalische-, chemische- und biochemische Reize einteilen, wie in
Tabelle 2 dargestellt wird.
Tabelle 2: Methoden zur parthenogenetischen Aktivierung von Schweineoozyten
physikalisch
chemisch
biochemisch
Aktivierungsmethode
Literatur
Elektrostimulation
JOLLIFF u. PRATHER 1997
Ca2+-Ionophor
WANG et al. 1998c
Ethanol
DIDION et al. 1990
Thimerosal
MACHATY et al. 1997b
Protein-Synthese-Inhibitoren
NUSSBAUM u. PRATHER 1995
Protein-Kinase-Inhibitoren
MAYES et al. 1995
GTP-Injektion
MACHATY et al. 1995
Inositol-1,4,5-Triphosphat-Injektion
MACHATY et al. 1997a
CSF-Injektion
MACHATY et al. 1997a
CaCl2-Injektion
MACHATY et al. 1996
Schrifttum
- 28 -
Da bei der Befruchtung intrazytoplasmatische Ca2+-Oszillationen einen Impuls von
zentraler Bedeutung darstellen (WHITAKER u. SWANN 1993), führen die meisten
Aktivierungsprotokolle zu einer intraooplasmatischen Ca2+ Erhöhung, die in der
Schweineoozyte die erfolgreiche Befruchtung durch ein Spermium simulieren soll.
Während die spermieninduzierte Aktivierung jedoch zu Ca2+-Oszillationen führt, die in
der porzinen Oozyte für 2-3 h anhalten (MACHATY et al. 1997a), tritt bei der
artifiziellen Aktivierung ein konstanter Anstieg des intrazellulären Kalziums ein, der
nach einer Plateauphase wieder abfällt (SUN et al. 1992; RICKORDS u. WHITE
1992;
TESARIK
u.
TESTART
1994;
TESARIK
et
al.
1994).
Eine
intrazytoplasmatische Ca2+-Injektion bei Oozyten verschiedener Spezies induziert die
Aktivierung (FULTON u. WHITTINGHAM 1978; IGUSA u. MIYAZAKI 1983). Bei der
Schweineoozyte führt eine solche Behandlung zur Exozytose kortikaler Granula und
zum Beginn der präimplantativen Entwicklung (MACHATY et al. 1996). Weniger
aufwendig kann auf physikalischem Weg, durch einen kurzzeitigen DC Puls im
elektrischem Feld, die Bildung von Membranporen in der Oozyte induziert werden
(ZIMMERMANN u. VIENKEN 1982). In Medien mit hohen Ca2+-Konzentration
ermöglichen diese Poren einen transmembranen Ca2+-Influx der erfolgreich zur
Aktivierung bei verschiedenen Säugetierspezies eingesetzt wurde (TARKOWSKI et
al. 1970; PRATHER et al. 1989a). Obwohl die Ca2+-Quelle extrazellulär liegt, glaubt
man, dass die Elektroportation bei der Schweineoozyte ebenfalls zu einer
Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern führt (MACHATY et al. 1999). Die
elektrische Aktivierung erlaubt eine präimplantative Entwicklung, obwohl sie nur
selten zur Ausschleusung des Polkörpers und zu keinem Polyspermieblock führt
(WANG et al. 1998c; ZHU et al. 2002). Die Effizienz korreliert mit gewissen Ca2+Konzentration im Extrazellularraum (CHEONG et al. 2002).
Eine Erhöhung des intrazellulären Ca2+-Spiegels gelingt darüber hinaus auf
chemischem Weg durch Einsatz von Ca-Ionophor A23187 (IONO), das intrazellulär
Ca2+-Ionen über Membrankompartimente hinweg transportiert, und dadurch die
Verteilung zwischen den Kompartimenten zugunsten des Zytoplasmas verändert.
Dies löst in vielen Säugerspezies die Exozytose der kortikalen Granula und die
Ausschleusung des 2. Polkörpers aus und ermöglicht eine präimplantative
- 29 -
Schrifttum
Entwicklung (STEINHARDT et al. 1974; DUCIBELLA et al. 1990; KLINE u. KLINE
1992; WANG et al. 1998c). Obwohl Ca-Ionophor A23187 in den meisten Oozyten
auch bei Abwesenheit extrazellulären Kalziums eine Aktivierung induziert, zeigen
Schweineoozyten in Ca2+ freiem Medium signifikant schwächere Ca2+-Oszillationen
als in Ca2+ supplementiertem Medium (SHINA et al. 1993; WANG et al. 1999).
Vermutlich kann das Ca-Ionophor auch einen Übertritt von extrazellulärem Ca2+ über
das Oolemm fördern. Thimerosal (TIM), eine organische Quecksilberverbindung,
oxidiert
Sulfhydrylgruppen
an
Rezeptoren
intrazellulärer
Ca2+-Speicher
und
mobilisiert so deren Ausschüttung (SWANN 1991; FISSORE u. ROBL 1993). Diese
Wirkung muss bei der Schweineoozyte nach ca. 10 Minuten durch den Antagonisten
Dithiolthreitol (DTT), eine sulfhydrylreduzierende Substanz, wieder aufgehoben
werden, da sonst die meiotische Spindel zerstört werden kann (MACHATY et al.
1997b). Da sich auf der Oberfläche der intrazellulären Ca2+-Speicher Inositol3Phosphat- (Ins3P) und Ryanodinrezeptoren befinden, führt bei porzinen Oozyten
auch eine Injektion mit ADP-Ribose oder Ins3P zur Ausschüttung der Ca2+-Speicher
(MACHATY et al. 1997a). Darüber hinaus stimuliert Ethanol als temporärer
Medienzusatz die intrazelluläre Ins3P-Bildung in porzinen Oozyten, was durch seine
Wirkung auf den oben angeführten Rezeptor die präimplantative Entwicklung einleitet
(CUTHBERTSON 1983). MACHATY et al. (1995) konnten durch Injektion von GTP
(Guanosintriphosphat) intrazelluläre G-Proteine in porzinen Oozyten stimulieren, die
ihrerseits die Phospholipase C stimulieren (GILMAN 1987), die wiederum die
Synthese von Ins3P katalysiert (MACHATY et al. 1995). Mit dem Ziel, die
Aktivierungskaskade an einem Kontrollpunkt zu beginnen, der den physiologischen
Verhältnissen möglichst nahe kommt, injizierten MACHATY et al. (2000) und
SAUNDERS et al. (2002) Schweineoozyten einen Extrakt aus porzinem Ejakulat
(„Cytosolic Sperm Factor“, CSF), der zuvor von Kern-DNA befreit worden war. Damit
wurden ähnliche Verhältnisse wie bei der physiologischen Aktivierung ausgelöst
(MACHATY et al. 2000). Durch porzinen CSF wurde darüberhinaus sogar in bovinen
Oozyten die Embryonalentwicklung ausgelöst (KNOTT et al. 2002), was auf
speziesübergreifende Mechanismen hindeutet. Darüber hinaus wurden Stimulantien
an Kontrollpunkten jenseits der Ca2+-Ausschüttung eingesetzt. Mit der Hemmung der
Schrifttum
- 30 -
Proteinsynthese wird die Produktion von Cyclin B1 unterbunden, das ein Bestandteil
vom MPF ist. Ohne kontinuierliche Produktion von Cyclin B1 sinkt der Plasmaspiegel
an
aktivem
MPF,
und
die
Oozyte
gelangt
in
die
Interphase.
Proteinsyntheseinhibitoren, wie Cycloheximide (CYCLO) und Puromycin, aktivierten
Oozyten von Mensch und Maus (SIRACUSA et al. 1978), waren jedoch ohne Effekt
bei Rind und Schwein (NUSSBAUM u. PRATHER 1995). Bei den Oozyten der
meisten Säugetierarten ist die Kombination eines Proteinsyntheseinhibitors mit
einem
Ca2+-mobilisierenden
Stimulus
deutlich
effektiver
in
der
Aktivierung
(NUSSBAUM u. PRATHER 1995; PRESICCE u. YANG 1994; TANAKA u.
KANAGAWA 1997).
Durch die Inhibition von Proteinkinasen, vor allem der „Mitogen Activated Protein
Kinase“ (MAPK), können die Oozyten vieler Spezies aktiviert werden. So führt die
Inhibierung
allgemeiner
Proteinkinasen
mit
6-Dimethylaminopurin
(DMAP)
(SZÖLLÖSIS et al. 1993), H7 (5-Isoquinolinesulfonyl-2-Methylpiperazin) (MAYES et
al. 1995), oder Staurosporine (RICKORDS et al. 1992) zur Aufhebung der
meiotischen Arretierung. In Folge der Protein-Kinase-Inhibition ist bei der Oozyte des
Schweins weder eine Exozytose der kortikalen Granula noch eine Entwicklung bis
zur Blastozyste zu beobachten. Dies ist ein Hinweis darauf, dass damit nur ein Teil
der Aktivierungskomponente ausgelöst werden kann (MAYES et al. 1995; GREEN et
al. 1999). Bei Rind und Schwein wurden Kombinationen von Ca-Ionophor zusammen
mit 6-DMAP erfolgreich zur Aktivierung von Oozyten eingesetzt (RHO et al. 1998;
BETTHAUSER et al. 2000; CHUNG et al. 2000; BOQUEST et al. 2002). Einige
Autoren aktivierten porzine Oozyten zudem durch eine Elektrostimulation, gefolgt von
einer Inkubation in Gegenwart von 6-DMAP (GRUPEN et al. 2002; ROH u. HWANG
2002).
- 31 -
Schrifttum
2.2.4 In-vitro-Entwicklung porziner parthenogenetischer Embryonen
Da die Entwicklung der parthenogenetischen Embryonen unter anderem durch die
Oozytenherkunft, den Aktivierungsstimuls und das Kulturmedium beeinflusst wird,
sind Literaturangaben nur schwer miteinander vergleichbar. Unterschiedliche
elektrische oder chemische Stimuli bewirkten beim Schwein parthenogenetische
Entwicklungen mit zunächst Vorkernstadien (HAGEN et al. 1991). Mit der
Weiterentwicklung der IVC konnten sich die aktivierten Oozyten zu frühen
Teilungsstadien (LIU u. MOOR 1997), sowie später zu parthenogenetischen
Blastozysten, weiterentwickeln (NUSSBAUM u. PRATHER 1995; KURE-BAYASHI et
al.
1996;
MACHATY
et
al.
1997b).
Tabelle
3
stellt
parthenogenetische
Entwicklungsraten porziner Embryonen von verschiedenen Autoren dar. Es wurde
gezeigt, dass sich parthenogenetische Embryonen mit diploidem Chromosomensatz
besser entwickeln als solche mit haploidem Chromosomensatz (KURE-BAYASHI et
al. 1996). Parthenogenetische Embryonen zeigten in verschiedenen Versuchsreihen
nach der Aktivierung vergleichbare Teilungsraten wie KT-Embryonen (KOO et al.
2000; PARK et al. 2001b), erreichten jedoch zu einem wesentlich höheren
Prozentsatz als KT-Embryonen das Blastozystenstadium (BETTHAUSER et al. 2000;
KOO et al. 2000; PARK et al. 2001b), wobei die durchschnittliche Kernzahl
parthenogenetischer Blastozysten geringer ist als bei Blastozysten aus IVF (WANG
et al. 1998a; KOO et al. 2000). Unterschiede in der Entwicklung zu KT- und IVFEmbryonen werden unter anderem auf das Fehlen eines paternalen Genoms
(SURANI
et
al.
1984;
SURANI
et
al.
1990),
auf
ein
verändertes
Energiestoffwechselprofil (SWAIN et al. 2002), sowie auf einen potentiell haploiden
Chromosomensatz (KURE-BAYASHI et al. 1996) zurückgeführt. Deshalb können
Erkenntnisse, die an parthenogenetischem Embryonen gewonnen werden, nur mit
Vorsicht auf KT-Embryonen übertragen werden. Trotz dieser Unzulänglichkeiten
werden
parthenogenetisch
aktivierte
Oozyten
häufig
als
Kontrollgruppe
zu
Embryonen aus KT und IVF eingesetzt (BETTHAUSER et al. 2000; KOO et al. 2000;
PARK et al. 2001b).
ES
Cycloheximid
Cycloheximid + ES
ES
ES
ES
Thimerosal (+DTT)
ES
ES
Ca-Ionophor
Sperm Factor
ES
ES/Ca-Ionophor/DMAP
ES
ES
ES/ DAMP/ CB
TCM199
Waymouth-M
Waymouth-M
TCM199
TCM199
TCM199
TCM199
in vivo
NCSU23
NCSU23
TCM199
NCSU23
NCSU37
TCM199
NCSU23
TCM199
HAGEN et al. 1991
LIU u. MOOR 1997
MACHATY et al. 1997b
GRUPEN et al. 1997
MACHATY et al. 2000
KOO et al. 2000
BETTHAUSER et al. 2000
PARK et al. 2001b
ZHU et al. 2002
GRUPEN et al. 2002
TCM199
NCSU23
NCSU23
NCSU23
NCSU23
NCSU23
NCSU23
NCSU23
NCSU23
NCSU23
TCM199
Whitten-M
TCM199
Whitten-M
Whitten-M
TCM199
Kulturmedium
73,8
86,7
92
5,3
88
AR
(%)
92,2
84,3
85,5
71
89,2
39
74
94
78,8
TR
(%)
51,7
42
MBR
(%)
AR (Aktivierungsrate), TR (Teilungsrate), MBR (Morula/Blastozystenrate), BR (Blastozystenrate), ES (Elektrostimulation)
DMAP (6-Dimethylaminopurin),CB (Cytochalasin B),Whitten-M (Whitten Medium), Waymouth-M (Waymouth Medium)
WANG et al. 1998a
KURE-BAYASHI et al. 1996
NUSSBAUM u. PRATHER 1995
Stimulus
Reifungs
medium
Autor
Tabelle 3: Erfolgsraten bei der parthenogenetischen Entwicklung porziner Embryonen
46,8
32
19,1
23
22,4
2,0
5
11
49
12
5
BR
(%)
43,2
26,0
29,4
29,9
26,0
21,5
25,9
40,1
16,1
Kerne/
Blastozyste (n)
- 32 Schrifttum
Schrifttum
- 33 -
2.2.5 Transfer porziner Embryonen auf Empfängertiere
Die Geburt von Ferkeln nach Transfer von Embryonen aus IVF ist sowohl bei
Verwendung von in vivo (YOSHIDA 1987; NAGAI et al. 1988), als auch mit in vitro
gereiften Oozyten (MATTIOLI et al. 1989; ABEYDEERA et al. 1998a; RATH et al.
1999) beschrieben worden, allerdings ist der Prozentsatz geborener Ferkel, in
Relation zu den transferierten Embryonen, mit zumeist weniger als 5% sehr gering.
Einige Autorengruppen erhielten kürzlich lebende Ferkel nach Transfer von
Blastozysten (KIKUCHI et al. 2002; BEEBE et al. 2002; MISUMI et al. 2003), wobei
die erstgenannte Autorengruppe eine Geburtenrate von 12,7% erreichte. Die beiden
letzgenannten Autorengruppen übertrugen sogar zuvor tiefgefrorene und aufgetaute
„in vivo“-Blastozysten (BEEBE et al. 2002; MISUMI et al. 2003). Tabelle 4 gibt eine
Übersicht über die Resultate nach Transfer verschiedener Entwicklungsstadien.
Späte Morulae und Blastozysten werden ihrem Entwicklungsstand entsprechend in
die Uterushörner synchroner Empfängertiere transferiert (CAMERON et al. 2000;
HUANG et al. 2002; KIKUCHI et al. 2002; MISUMI et al. 2003). Embryonen bis zum
Vierzellstadium werden in die Eileiter übertragen (RATH et al. 1994; KIKUCHI et al.
1999; KING et al. 2002). Die Trächtigkeit kann allerdings nur aufrechterhalten
werden, wenn mindestens 4-5 vitale Embryonen an den Tagen 11-14 der Gravidität
intrauterin Östradiol-17ß (HEAP et al. 1979b; HEAP et al. 1981) produzieren
(POLGE et al. 1966; POPE et al. 1972). Dies kann ein Problem darstellen, falls
Embryonen mit verringertem Entwicklungspotential übertragen werden. Es wurde
gezeigt, dass tägliche systemische Verabreichungen von Östradiol-17ß vom 11. bis
15. Graviditätstag (KING et al. 2002), oder Injektionen von eCG und hCG, mit dem
Ziel der erhöhten Östradiol-17ß Synthese durch akzessorisches Follikelwachstum
(CHRISTENSON u. DAY 1971; POLEJAEVA et al. 2000; WALKER et al. 2002),
einen Mangel an intrauterinem Östradiol-17ß kompensieren können. Auf diese Weise
wurden Trächtigkeiten mit weniger als 4 Embryonen ausgetragen (KING et al. 2002).
Auch der Co-Transfer von parthenogenetischen Embryonen (sog. Helfer-Embryonen)
ist zur Aufrechterhaltung von Trächtigkeiten versucht worden. KING et al. (2002)
berichten nach Transfer von 3 Zygoten und 60 Helferembryonen über die Geburt von
zwei gesunden Ferkeln (KING et al. 2002).
Schrifttum
- 34 -
Tabelle 4: Embryotransfer porziner Embryonen verschiedener Entwicklungsstadien
Stadien
TG
Embryonen/
Sau (n)
Sauen (n)
Würfe (%)
Ferkel (n)
geb. Ferkel/
Embryo (%)
2-Zeller
(-)
17
2
50,0
1
2,9
(-)
30-35
28
28,6
35
~3,8
(-)
48
8
12,5
9
2,3
Embryonen- übertragene
Autor
Herkunft
in vivo
NAGAI et al. 1988
Oozyten
+IVF
ABEYDEERA et al.
1998a
MATTIOLI et al.
1989
RATH et al. 1999
in vitro
in vitro
8-Zeller
Morulae
2-Zeller
4-Zeller
in vitro
2-Zeller
(-)
50
26
34,6
57
4,4
in vitro
Zygoten
(-)
100
2
100
9
4,5
in vitro
2-Zeller
(-)
100
2
50,0
8
4,0
KIKUCHI et al. 2002
in vitro
Blastozysten
(-)
50
3
100
19
12,7
BEEBE et al. 2002
in vivo
Blastozysten
(+) 32-37
5
40,0
8
~4,6
MISUMI et al. 2003
in vivo
(+) 30-36
5
40,0
17
~10,0
KIKUCHI et al. 1999
Morulae
Blastozysten
TG (Tiefgefrierlagerung und Auftauen der Embryonen vor dem Transfer)
- 35 -
Schrifttum
2.3 Genetisch identische Nachkommen
Der Begriff Klon kommt aus dem Griechischen, bedeutet Ast oder Zweig und ist
deshalb meist für eine asexuelle Vermehrung, wie Knospung und Sprossung,
gebraucht worden, was beinhaltet, dass die Nachkommen genetisch identisch zu
dem Elternteil sind. Im Pflanzenreich treten häufig Klone auf (z. B. Kartoffeln). Beim
Säuger wird der Begriff für die Erstellung genetisch identischer Nachkommen
gebraucht. In der Natur wird dieses Phänomen selten beobachtet, jedoch werden bei
bestimmten Gürteltierarten bis zu 10 genetisch identische Nachkommen festgestellt.
Bei landwirtschaftlichen Nutztieren treten monozygote (eineiige) Zwillinge dagegen
selten auf. Die Häufigkeit ihres Auftretens ist jedoch nicht exakt bekannt, da
Nachkommen im allgemeinen nicht auf den Grad ihrer Verwandschaft hin analysiert
werden (NIEMANN u. MEINECKE 1993). Auf artifizielle Art können beim Säuger
genetisch
identische
Mehrlinge
durch
verschiedene
Eingriffe
bei
frühen
Embryonalstadien erzeugt werden. Hierzu gehören die Isolierung frühembryonaler
Blastomeren
und
die
mikrochirurgische
Embryonenteilung
zur
Erzeugung
monozygotischer Zwillinge, sowie das Klonen durch Kerntransfer. Bei monozygoten
Zwillingen ist davon auszugehen, dass sie genetisch weitestgehend identisch sind,
im Gegensatz zum Kerntransfer, bei dem Variationen auf Seiten der Eizelle in Kauf
genommen werden müssen.
2.3.1 Monozygote Zwillinge durch Blastomeren-Isolierung
Die ersten Versuche zur Isolierung frühembryonaler Blastomeren wurden in den 60er
und 70er Jahren an Labornagern durchgeführt. Im Gegensatz zur Situation bei den
landwirtschaftlichen Nutztieren, waren damals bereits für Embryonen der Labortiere
Kulturmedien verfügbar, die es erlaubten, einen Embryo über mehrere Tage zu
inkubieren, sein Schicksal zu verfolgen, und ihn anschließend zu transferieren. Erst
1979 wurde diese Barriere für landwirtschaftliche Nutztiere, durch die Entwicklung
einer temporären in vivo Kultur für Embryonen im Eileiter von Schafen oder
Kaninchen, überwunden (WILLADSEN 1979). Dazu wird zuerst die Zona pellucida
enzymatisch oder chemisch entfernt, gefolgt von einer kurzzeitigen Inkubation in
Schrifttum
- 36 -
kalzium- und magnesiumfreien Medium, um die interzellulären Verbindungen zu
lockern. Danach schließt sich die mechanische Separation der Blastomeren des
frühen Embryos durch sanftes Pipettieren an. Die vereinzelten Blastomeren werden
dann in eine leere Zona pellucida übertragen, und anschließend
verpackt. Daraufhin wird eine Übertragung
in
die
in Agarzylinder
abgebundenen
Eileiter,
beispielsweise von Schafen und Kaninchen, vorgenommen, aus denen die
Embryonen nach 4-6 tägiger in vivo Kultur zurückgewonnen werden. Blastomeren,
die sich bis zur Blastozyste entwickelt haben, können dann aus dem Agar befreit und
auf die endgültigen Empfängertiere übertragen werden (WILLADSEN 1979). Dieses
Verfahren ist erfolgreich bei der Spezies Rind (WILLADSEN u. POLGE 1981), Schaf
(WILLADSEN 1979; WILLADSEN 1980), Schwein (ROBL u. FIRST 1985) und Pferd
(ALLEN u. PASHEN 1984) angewandt worden, und hat gezeigt, dass beide
Blastomeren des 2-Zellembryos die Potenz besitzen, sich zu einer Blastozyste und
nach Transfer in normale Jungtiere zu entwickeln. Beim Rind ist es gelungen durch
Isolation der Blastomeren eines 4-Zellembryos 4 genetisch identische Kälber zu
erhalten (JOHNSON et al. 1995). Bei Schaf und Schwein können sich mit dieser
Methode sogar isolierte Blastomeren des 8-Zellembryonen zu normalen Jungtieren
entwickeln (WILLADSEN 1980; SAITO u. NIEMANN 1991). Die Zeitpunkte der
Teilungen und der Blastozystenbildung sind durch die Zellreduzierung am Anfang
nicht verändert. Die Halben-, Viertel- oder Achtelembryonen bildeten zum gleichen
Zeitpunkt wie normale Embryonen ein Blastozoel aus, wobei jedoch die Anzahl der
Zellen
in
der
ICM,
in
Abhängig
vom
Teilungsstadium
der
isolierten
Stammblastomere, reduziert ist (WILLADSEN u. POLGE 1981). Hierauf führt man die
fehlende
Entwicklungsfähigkeit
isolierter
Blastomeren
aus
fortgeschritteneren
Entwicklungstadien zurück (zum Überblick: NIEMANN & MEINECKE 1993).
- 37 -
Schrifttum
2.3.2 Monozygote Zwillinge durch mikrochirurgische Teilung
Für
die
mikrochirurgische
Embryonenteilung
werden
meist
Morula-
oder
Blastozystenstadien (ca. 40-80 Zellen) verwendet, da diese Stadien die Zona
pellucida für ihre weitere Entwicklung nicht mehr unbedingt benötigen (WARFIELD et
al. 1987) und direkt im Anschluss an die mikrochirurgische Teilung in den Uterus
eines Rezipienten transferiert werden können (OZIL et al. 1982). Die Teilung der
Embryonen erfolgt dabei mikrochirurgisch möglichst exakt in zwei Hälften, bei
annähernd gleichgroßer Aufteilung der ICM. OZIL et al. (1982) ermittelten nach
Transfer von 28 „Hälften“ 15 implantierte bovine Feten, was einer Trächtigkeitsrate
von 53,5% entspricht. In einem weiteren Versuch teilte diese Arbeitsgruppe 11
Blastozysten und erhielt nach Transfer der 22 „Hälften“ 11 gesunde Kälber (OZIL
1983). Bezogen auf 11 Blastozysten vor der Teilung entspricht dies einer
Geburtenrate von 100%. Da nach Transfer ungeteilter Embryonen Trächtigkeitsraten
von etwa 60-70% erreicht werden können, kann die mikrochirurgische Teilung beim
Rind zu einer deutlichen Effizienzsteigerung führen. Vergleichbare Entwicklungsraten
können auch bei den kleinen Wiederkäuern (WILLADSEN u. GODKE 1984) erzielt
werden. Im Gegensatz dazu ist die Effizienz beim Schwein, wo sich aus 100
transferierten „Hälften“ etwa 20 Ferkel entwickeln können, deutlich geringer
(NAGASHIMA et al. 1989; REICHELT u. NIEMANN 1994). Eine wiederholte Teilung
der Hälften zur Generierung einer größeren Anzahl genetisch identischer
Nachkommen scheitert zumeist am Unterschreiten einer kritischen Zellzahl, die für
die Aufrechterhaltung einer Embryonalentwicklung erforderlich ist (zum Überblick:
NIEMANN & MEINECKE 1993; NIEMANN & RATH 2001b).
2.3.3 Genetisch identische Mehrlinge durch Kerntransfer
Das Verfahren des Kerntransfers geht auf Arbeiten von Hans Spemann zurück, in
denen er nachweisen konnte, dass sich normale Nachkommen aus einem der vielen
embryonalen Kerne beim Wassermolch entwickeln konnten. Er berichtete 1938, dass
er bereits 1905 mit einem Babyhaar eine Ligatur durch die befruchtete Eizelle
(Zygote) eines Wassermolchs gelegt hatte. Daraufhin begann sich die Hälfte mit dem
Schrifttum
- 38 -
Kern normal zu teilen, und im 16-Zellstadium wanderte ein Kern in die kernlose
Hälfte. Nachdem beide Hälften durch vollständiges Festziehen von einander getrennt
wurden, entwickelten sich aus beiden Hälften zwei identische Larven. Auf Grundlage
dieser Befunde entwickelte Spemann das Konzept des Kerntransfers, wie es noch
heute bekannt ist. Später konnte durch Transfer von Kernen differenzierter Zellen in
aktivierte unbefruchtete Froscheier eine Embryonalentwicklung induziert werden
(BRIGGS u. KING 1952). Bei der Gattung Xenopus (Krallenfrosch) führte der
Transfer einzelner Kerne zu lebenden Fröschen (GURDON 1962). Bei der
Amphibienart Rana pipiens (Leopardenfrosch) wurden sogar fortgeschrittene
Kaulquappenstadien erreicht, wenn Kerne aus Erythrozyten und Leukozyten in
entkernte Empfängeroozyten injiziert worden waren (LEONARD et al. 1982;
DIBERARDINO 1987). Diese Erkenntnisse flossen jedoch erst in den 70er-Jahren in
Arbeiten
mit
kleinen
Säugern
ein,
nachdem
verfeinerte
optische
und
mikrochirugische Geräte und Techniken zur Verfügung standen. Illmensee und
Hoppe entfernten mit einer feinen Glaspipette in einem Arbeitsgang den Vorkern
einer Mauszygote und injizierten im Austausch einen Kern der ICM-Zelle eines
frühen Embryos. Dieses Verfahren erbrachte bei niedriger Effizienz lebende
Nachkommen (HOPPE u. ILLMENSEE 1982), löste jedoch aufgrund fehlender
Reproduzierbarkeit (McGRATH u. SOLTER 1984) kontroverse Diskussionen
innerhalb der wissenschaftlichen Gemeinschaft aus. Wesentliche Innovationen
waren der Zusatz von Cytochalasin B, einem Pilzprodukt, das die Oozyte durch
Abbau des Zytoskelettes weitestgehend resistent gegen den mikochirurgische
Eingriff
macht
(McGRATH
membranumschlossenen
u.
SOLTER
Spenderkerns
per
1983),
Fusion
sowie
durch
der
das
Transfer
des
Sendai-Virus
(GRAHAM 1969). Im Rahmen dieser Versuche konnte nach Austausch von
Vorkernen durch Kerne im 2-Zellstadium eine normale Entwicklung beobachtet
werden, nach Transfer von Kernen im 8-Zellstadium jedoch nicht (McGRATH u.
SOLTER 1984). Andere Arbeitsgruppen wählten die kernlose Hälfte einer
unbefruchteten Eizelle (MII-Oozyte) als Empfänger, was aber eine artifizielle
Aktivierung erforderlich macht. Aus einer solchen geteilten Empfängeroozyte wurde
nach Transfer des Kernes eines 8-Zellers im Jahre 1986 das erste geklonte
- 39 -
Schrifttum
landwirtschaftliche Nutztier, ein Schaf, geboren (WILLADSEN 1986). Auf der Suche
nach einem Spenderzelltyp, der sowohl eine Entwicklung nach Kerntransfer
unterstüzt, als auch in großer Anzahl zur Verfügung steht, konzentrierten sich
nachfolgene Autoren auf ICM-Zellen (COLLAS u. BARNES 1994). Dies resultierte im
Jahre 1994 in der Geburt von Kälbern nach Kerntransfer von ICM-Zellen (KEEFER et
al. 1994), sowie in der Geburt von Lämmern nach Kerntransfer in vitro kulivierter
ICM-Zellen eines 13 Tage alten Embryos (CAMPBELL et al. 1996b). Im darauf
folgendem Jahr wurden schließlich lebende Lämmer aus in vitro kultivierten fetalen
Fibroblasten, sowie ein lebendes Lamm, das auf eine in vitro kultivierte adulte
Euterzelle zurückging, geboren (WILMUT et al. 1997). Letztgenanntes Lamm, das
auf den Namen „Dolly“ getauft wurde, erlangte weltweite Bekanntheit. Es war,
nachdem seine Identität durch die Ergebnisse von DNA-Mikrosatelliten-Analysen
(ASHWORTH et al. 1998) und DNA-Fingerprinting (SIGNER et al. 1998) eindeutig
belegt werden konnte, der lebende Beweis, dass die Zelldifferenzierung späterer
Entwicklungsstadien nicht auf Genverluste oder irreversible Abschaltung von
Gensequenzen zurückzuführen ist, und dass selbst ein hochdifferenzierter Zellkern
zurückprogrammiert
werden
und
danach
eine
vollständige
Embryogenese
durchlaufen kann (WILMUT et al. 1997).
2.4 Technik beim Klonen mittels Kerntransfer
Die Grundlage für das heute übliche Vorgehen beim Kerntransfer wurde 1986 im
wesentlichen bereits von S.M. Willadsen (Cambridge, U.K.) beschrieben, der nach
Fusion von frühembryonalen Blastomeren mit halbierten kernlosen Oozyten beim
Schaf erstmalig geklonte Nachkommen erzeugen konnte (WILLADSEN 1986). Bei
der heute üblichen Technik wird mit einer geeigneten Pipette eine Spenderzelle in
den perivitellinen Raum einer Empfängeroozyte eingesetzt (Abbildung 8/B), in der
vorher die eigenen Chromosomen entfernt oder zerstört wurden. Eine Zerstörung der
Chromosomen kann durch fokussierte Bestrahlung mit UV-Licht erreicht werden
(LEAL et al. 1999). Doch bilden so zerstörte Chromosomen im Anschluss
Mikrokerne, die für die weitere Entwicklung hinderlich sein können (LEAL et al.
- 40 -
Schrifttum
1999). Eine weitere Technik zur Enukleation besteht in der Aspiration der
Metaphasenplatte mit einer feinen Glaspipette (Abbildung 8/A), was nach der Bildung
des 1. Polkörpers durch Aspiration angrenzenden Cytosplasmas „blind“ (COLLAS u.
ROBL 1990), oder aber nach vorheriger Markierung mit Fluoreszensfarbstoffen, wie
Hoechst 33342, Sybr 14 und Rhodamin-tubulin, erfolgen kann (DOMINKO et al.
2000). Da die hierzu notwendige UV-Bestrahlung bei längerer Exposition zu
Veränderungen von Plasmamembran und intrazellulären Komponenten führt, sollte
diese so kurz wie möglich gehalten werden (SMITH u. WILMUT 1989; BRADSHAW
et al. 1995). Die Aspiration mit feinen Glaspipetten führt weder zu einer Umverteilung
der Zellorganellen (GREISING u. JONAS 1999), noch zu einer Aktivitätsminderung
von MPF und MAPK (GOTO et al. 2002). Einige Autoren erarbeiteten eine Methode,
bei der die Trennung der Chromosomen während der Telophase durch chemische
Agentien, wie Etopside (FULKA, JR. u. MOOR 1993; KARNIKOVA et al. 1998) oder
Demecolcine (GASPARRINI et al. 2003; IBANEZ et al. 2003), gehemmt wird; mit
dem Ziel der vollständigen Chromosomenauschleusung bei der Bildung des 2.
Polkörpers. Unter der Voraussetzung, dass die Membranen von Spenderzelle und
Empfängeroozyte eng und in ausreichendem Umfang einander anliegen, wird durch
Anlegen eines elektrischen Feldes eine lokal begrenze Fusion der beiden
Membranen erreicht (Abbildung 8/C), wodurch die Spenderzelle in das Zytoplasma
der Empfängerzelle aufgenommen wird (ZIMMERMANN u. VIENKEN 1982;
BONDIOLI et al. 1990). Die Fusionseffizienz hängt hierbei von Feldstärke, Zellgröße
und Zellkontakt ab (COLLAS et al. 1993). Bei der Maus wurde darüber hinaus auch
das Sendai-Virus zur Fusion eingesetzt (GRAHAM 1969). Bei der Maus, sowie
vereinzelt bei anderen Spezies, werden auch „nackte“ Spenderkerne direkt ins
Ooplasma enukleierter Oozyten injiziert (WAKAYAMA et al. 1998; ONISHI et al.
2000; GALLI et al. 2002). LEE et al. (2003c) injizierten sogar ganze Spenderzellen in
Schweineoozyten. Beides macht die Fusion überflüssig. Alternativ zur klassischen
Methode wurde ein „zona-freies“ Verfahren entwickelt, bei dem gereifte Oozyten
chemisch von der Zona pellucida befreit und dann in 2 Hälften zerteilt werden. Die so
gewonnenen kernfreien Hälften werden schließlich mit der Kernspenderzelle
fusioniert (VAJTA et al. 2001; OBACK et al. 2003; VAJTA et al. 2003).
- 41 -
Schrifttum
Abbildung 8: Schematische Darstellung der Schritte beim somatischen Kerntransfer
Empfängeroozyte
Kernspenderzellen
Metaphasenplatte
A
enukleierte Oozyte
B
Spenderzelle
mit Zellkern
C
Fibroblasten-Oozyten-Komplex
Kryokonservierung
IVC
Transfer
Blastozyste
- 42 -
Schrifttum
Vor, während oder nachdem die Oozyte den Spenderkern aufgenommen hat, erfolgt
durch geeignete chemische und/ oder elektrische Stimuli die artifizielle Aktivierung
der Empfängeroozyte (Abbildung 8/C). Nachdem die Spenderzelle in das Zytoplasma
aufgenommen wurde, sind vermutlich eine Reihe molekularer und biochemischer
Veränderungen erforderlich, um eine erfolgreiche Entwicklung zu erreichen. Dies
geschieht nach heutigem Verständniss durch „epigenetisches Reprogramming“ vom
differenzierten Status der Spenderzelle zu einem totipotenten embryonalen
Ausgangsstatus (GURDON u. COLMAN 1999), bei dem der Spenderkern sein
eigenes Genexpressionsmuster in ein Expressionsmuster, das für eine embryonale
Entwicklung erforderlich ist, verändern muss. Dies umfasst unter anderem globale
Änderungen der DNA-Methylierung, ein Rückmodelieren der Chromatinstruktur,
sowie ein Wiederherstellen der Telomerenlängen (KONO 1997; HAN et al. 2003).
Nach erfolgreicher Aktivierung erfolgt eine In-vitro-Kultur bis zum gewünschtem
Entwicklungsstadium, der Transfer der Embryonen auf synchrone Empfängertiere,
oder aber ein Tiefgefrieren.
2.4.1 Effizienz des Kerntransfers bei verschiedenen Tierarten
Bis zum heutigen Tag gelang das Klonen durch somatischen Kerntransfer bei 9
Säugetieren (Tabelle 5). Trotz intensiver Forschungsarbeiten führt diese Technik
bezogen auf die Zahl an übertragenen Embryonen jedoch nur zu einer geringen
Geburtenrate. Nur beim Rind wird mit 15-20% eine relativ hohe Erfolgsrate erreicht.
Dies wird darauf zurückgeführt, dass die In vitro Techniken für das Rind wesentlich
intensiver erforscht und etabliert sind, als für andere Tierarten (DINNYES et al.
2002). Im Gegensatz zum Rind wird bei den anderen Tierarten bisher eine
Erfolgsrate von weniger als 3% erreicht (zum Überblick: BREM u. KÜHHOLZER
2002). Besonders gering sind die Erfolgsraten beim Schwein, hier werden bisher
Erfolgsraten von weniger als 1% erreicht (zum Überblick: ONISHI 2002). Dies liegt
zum einem daran, dass In-vitro-Techniken für das Schwein noch nicht den Standard
des Rindes erreicht haben, zum anderen liegt es an einer ReproduktionsCharakteristik des Schweines, denn zur Aufrechterhaltung der Gravidität werden 4-5
Embryonen an Tag 11-14 benötigt (POLGE et al. 1966). Diese Probleme führten
- 43 -
Schrifttum
dazu, dass die weltweit ersten geklonten Schweine erst im Jahre 2000 geboren
wurden (POLEJAEVA et al. 2000), wobei es bisher erst wenigen Arbeitsgruppen
gelungen ist dies zu reproduzieren (zum Überblick: BREM u. KÜHHOLZER 2002;
ONISHI 2002).
Tabelle 5: Überblick über die Effizienz beim Klonen verschiedener Tierarten
lebensfähige
angenommene
Nachkommen/
Anzahl lebender
transferierten Embryo
Klone (n)
Schaf
3-8%
<400
CAMPBELL et al. 1996b
Rind
15-20%
<3000
CIBELLI et al. 1998
Maus
<2%
>250
WAKAYAMA et al. 1998
Ziege
3%
<400
BAGUISI et al. 1999
Schwein
<1%
<250
POLEJAEVA et al. 2000
Kaninchen
<1%
6
CHESNE et al. 2002
Katze
<1%
1
SHIN et al. 2003
Maultier
?
1
WOODS et al. 2003
Pferd
<1%
1
GALLI et al. 2003
Tierart
erstes gelungenes
Experiment
2.4.2 Einflußfaktoren auf die Effizienz des Kerntransfers
Der Erfolg des Kerntransfers ist abhängig vom biologischen Status der Spenderzelle,
dem biologischen Status der Empfängerzelle, sowie der relativen Vereinbarkeit der
Zellzyklen zueinander (SUN u. MOOR 1995).
2.4.2.1 Biologischer Status der Spenderzelle
Als Spenderzellen führten sowohl embryonale Blastomeren (WILLADSEN 1986;
PRATHER et al. 1987; PRATHER et al. 1989a; CHEONG et al. 1993), frische Zellen
der ICM (HOPPE u. ILLMENSEE 1982; SMITH u. WILMUT 1989; KEEFER et al.
Schrifttum
- 44 -
1994), kultivierte Zellen der ICM (CAMPBELL et al. 1996b), sowie fetale und adulte
Zellen aus der Kultur (WILMUT et al. 1997; CIBELLI et al. 1998; ONISHI et al. 2000),
nach Kerntransfer zur Geburt lebender Nachkommen. Embryonale Blastomeren,
aufgrund schwach ausgebildeter interzellulärer Verbindungen (BONDIOLI et al.
1990) meist Zellen des 8-32 Zellstadiums, sind sowohl frisch gewonnen, wie auch
nach Tiefgefrieren und Auftauen (WESTHUSIN et al. 1991), erfolgreich im
Kerntransfer
eingesetzt
worden.
Gleiches
Reklonierung
erzeugt
wurden.
Diese
gilt
für
besitzen
Blastomeren,
die
jedoch
geringeres
ein
durch
Entwicklungspotential (STICE u. KEEFER 1993).
Heute
werden
aufgrund
ihrer
guten
Verfügbarkeit,
der
Möglichkeit
der
Kryokonservierung, und der Tatsache, dass Subpassagen keine Verschlechterung
der Ergebnisse nach sich ziehen (LEE et al. 2003b), vielfach fetale und adulte
Fibroblasten aus der Zellkultur genutzt, wobei die Entwicklungsrate nach Nutzung
fetaler Zellinien besser ist als bei adulten Zellinien (WILMUT et al. 1997; KATO et al.
2000; LUCAS-HAHN et al. 2002; LEE et al. 2003b). Mit Erfolg wurden hierbei
mitotisch aktive Zellen (CIBELLI et al. 1998; WAKAYAMA et al. 1999), Zellen im
Ruhestadium (WILMUT et al. 1997; KATO et al. 1998), sowie nicht lebensfähige,
zuvor erhitzte Zellen (LOI et al. 2002), eingesetzt. Einflüsse auf die Entwicklung nach
Kerntransfer können von der eingesetzten Zellinie stammen (RIDEOUT, III et al.
2000; EGGAN et al. 2001), da eine Variabilität in der Effizienz verschiedener
Klonlinien des selben Fetus möglich ist (KUHHOLZER et al. 2001), und die Genetik
der Spenderzelle, insbesondere bei der Maus, den Erfolg des Kerntransfer
beeinflussen kann (RIDEOUT, III et al. 2000; AMANO et al. 2001; EGGAN et al.
2001; WAKAYAMA u. YANAGIMACHI 2001). Diskutiert wird auch ein Einfluss des
genetischen Geschlechts der Spenderzelle (SOLTER 1998). Unter anderem führte
ein Transfer von Kumulus- (KATO et al. 1998), Granulosa- (WELLS et al. 1999),
Muskel- (SHIGA et al. 1999), Epithel- (WELLS et al. 1997), Fibroblasten- (WILMUT
et al. 1997), Euter- (WILMUT et al. 1997), Ovidukt- (KATO et al. 1998) und
Keimzellen (ZAKHARTCHENKO et al. 1999) zur Geburt von Klonen, was darauf
hindeutet, dass im Grunde jede somatische Zelle unter geeigneten Bedingungen
„rückprogrammiert“ und im Kerntransfer eingesetzt werden kann (STEWART 1997).
Schrifttum
- 45 -
2.4.2.2 Biologischer Status der Empfängerzelle
Das Zytoplasma besitzt großen Einfluss auf die Spenderchromosomen (CAMPBELL
et al. 1993; CAMPBELL et al. 1996a) und bestimmt somit wesentlich das
Entwicklungsschicksal des Spenderkerns (CHENG et al. 2003). Als Empfängerzellen
führten bisher enukleierte Oozyten (WILLADSEN 1986), enukleierte Zygoten
(HOPPE u. ILLMENSEE 1982; POLEJAEVA et al. 2000) und enukleierte
Blastomeren im 2-Zellstadium (KONO u. TSUNODA 1989) zur Geburt lebender
Klone. Die vollständige Entfernung der eigenen Chromosomen ist notwendig, denn
Chromosomenabnormalitäten oder Ploidien nach Kerntransfer induzieren ansonsten
Zytofragmentationen (LIU et al. 2002b). Die Enukleation kann auch nach dem
Einbringen des Spenderzellkernes, im sog. Reverse-Order-Kloning, erfolgen
(PEURA 2003). Hierbei ist noch unklar, ob dies eventuell sogar von Vorteil ist, denn
Laminine, spezielle Oozytenkern-assoziierte Proteine, nehmen nach Kerntransfer
Kontakt mit dem Spenderzellkern auf (PRATHER et al. 1989b; PEURA 2003). Am
besten geeignet als Empfängerzelle ist die Oozyte (WILLADSEN 1986; WILMUT et
al. 1997). Sowohl MI-Oozyten, aber besonders MII-Oozyten, letztere in vivo wie auch
in vitro gereift (BONDIOLI et al. 1990), ermöglichen als Kernempfänger eine
präimplantative Embryonalentwicklung (MIYOSHI et al. 2001; MIYOSHI et al. 2003).
Die MII-Oozyte weist im Kerntransfer eine wesentlich höhere Effizienz auf als die MIOozyte (MIYOSHI et al. 2001), wobei mit Oozyten adulter Tiere, verglichen mit
Oozyten präpuberaler Tiere, höhere Entwicklungsraten erzielt werden (KATO et al.
2000; MIYOSHI et al. 2003; HYUN et al. 2003a). Auch das Fehlen der Zona pellucida
wirkt sich auf die In-vitro-Entwicklung nicht nachteilig aus (OBACK et al. 2003). Für
das Schaf konnte darüber hinaus ein Einfluss der Rasse auf die Eignung der
Empfängeroozyte nachgewiesen werden (DINNYES et al. 2001). Selbst im
heterologen Kerntransfer, bei dem Empfängerzelle und Spenderkern verschiedenen
Tierarten entstammen, wurden MII-Oozyten eingesetzt (DOMINKO et al. 1999). So
wurde nach Transfer eines Spenderkerns vom Gaur in eine enukleierten MII-Oozyte
des Rindes ein Gaurkalb geboren, das allerdings nach 3 Tage verstarb (LANZA et al.
2001).
- 46 -
Schrifttum
2.4.2.3 Einfluß der Zellzyklen von Oozyte und Spenderzelle
Als Kernspender wurden bisher diploide Kerne der G0/G1-Phase (WILMUT et al.
1997; CIBELLI et al. 1998), tetraploide Kerne der G2/M Phase (KUROSAKA et al.
2002; LAI et al. 2002b), sowie Kerne der S-Phase (DU et al. 2002), deren
Chromosomen teils diploid, teils tetraploid vorliegen, verwendet. Allerdings wurde in
keinem Fall der Zyklusstand eines einzelnen Kerns bestimmt, sondern nur eine
statistische Wahrscheinlichkeit (BOQUEST et al. 1999b). Als Empfängerzytoplasten
können aktivierte Oozyten (BAGUISI et al. 1999), nicht aktivierte Oozyten, die
simultan zur Fusion aktiviert werden (PRATHER et al. 1989a), oder nicht aktivierte
Oozyten, die erst im Anschluss an die Fusion aktiviert werden (WILMUT et al. 1997),
eingesetzt werden. Die Synchronität der Zellzyklen von Oozyte und Spenderzelle
bestimmt hierbei Ploidie und Schicksal der Chromosomen (CAMPBELL et al. 1993;
CAMPBELL et al. 1996a; CHENG et al. 2003). Die Fusion eines Spenderkerns mit
einer unaktivierten Oozyte (M-Phase) führt aufgrund eines hohen MPF-Spiegels der
Oozyte, unabhängig vom Zellzyklus des Kernspenders, zur sofortigen Auflösung der
Kernmembran („Nuclear Envelope Breakdown“, NEBD) und zur Kondensation der
Chromosomen („Premature Chromosome Condensation“, PCC). Im Anschluss an
eine Aktivierung bildet sich die Kernmembran zurück, und es kommt zur
Kernschwellung, wobei die vorausgegangene Exposition des Kerns zum Zytoplasma
der Oozyte als auslösender Stimulus einer DNA-Replikation verstanden wird
(COLLAS u. ROBL 1991; CAMPBELL et al. 1993). Diploide Zellkerne der G0/G1Phase können bei Fusion mit einer nicht aktivierten MII-Oozyte (M-Phase) eine
Normoploidie aufrechterhalten, da sie bedingt durch den zytoplasmatischen Einfluss
der MII-Oozyte, ihre DNA noch vor der 1. Furchungsteilung replizieren (CAMPBELL
et al. 1993). Dies gelingt jedoch nur, wenn bei der Aktivierung eine Ausschleusung
des halben Chromosomensatzes mit dem Polkörper verhindert wird (Abbildung 9/B).
Die Fähigkeit der Zellkerne nach der Fusion mit einer unaktivierten Eizelle in
morphologisch normal erscheinende Chromosomen zu kondensieren sinkt mit
Fortschreiten von der G1 zur S-Phase (COLLAS et al. 1992). Spenderkerne in der SPhase erleiden bei der PCC irreversible Schäden (CAMPBELL et al. 1993), was
Fehlentwicklungen nach sich zieht (LIU et al. 2002b). Tetraploide Spenderkerne der
Schrifttum
- 47 -
G2/M-Phase verdoppeln nach Fusion mit nicht aktivierten Oozyten (M-Phase),
bedingt durch den zytoplasmatischen Einfluss, ihren Chromosomensatz erneut
(CAMPBELL et al. 1993). Sie können jedoch durch Ausschleusung eines Polkörpers
mit halbem Chromosomensatz vor der DNA-Replikation in der nächsten S-Phase,
theoretisch eine Normoploidie aufrechterhalten (Abbildung 9/A), was verschiedene
Autoren bereits durch lebende Klone bewiesen haben (KWON u. KONO 1996; ROBL
1999; LAI et al. 2002b). Aktivierte MII-Oozyten (G1-Phase) können sowohl diploide
Kerne der G0/G1-Phase (BAGUISI et al. 1999), ES-Zellen (GASPARRINI et al. 2003)
und frühembyronale Blastomeren (DU et al. 2002), die sich aufgrund ihrer stark
verkürzten Interphase zumeist in der S-Phase befinden (ALBERTS et al. 1995),
sowie tetraploide Kerne der G2/M-Phase (KUROSAKA et al. 2002; LAI et al. 2002b),
aufnehmen (Abbildung 9/C). Aufgrund eines niedrigen MPF-Spiegels in aktivierten
Oozyten (G1-Phase) unterbleiben NEBD und PCC (COLLAS u. ROBL 1991), und
somit der Stimulus einer zusätzlichen DNA-Replikation. Bei Zellen in der G0/G1/SPhase wird die DNA-Replikation durch Fortschreiten des Zellzyklus abgeschlossen,
so dass bei allen Embryonen nach der ersten Furchungsteilung eine Normoploidie
vorliegt (CAMPBELL et al. 1993). Obwohl der Einsatz voraktivierter MII-Oozyten
Ploidieprobleme von vornherein vermeiden kann (CAMPBELL et al. 1996a), ist
dieser Ansatz weniger potent im Bezug auf die „Reprogrammierung“ des Zellkerns,
denn der Vorteil der unaktivierten MII-Oozyte (M-Phase) wird darin gesehen, dass
kernassoziierte Substanzen, die sich während der Metaphase im Zytoplasma der
Eizelle befinden, auf den Spenderkern einwirken (PRATHER et al. 1989b). Eine
zeitliche Ausweitung der Phase des Einwirkens zytoplasmatischer Faktoren, etwa
durch eine zur Fusion verzögerte Aktivierung, wurde von vielen Autoren als positiv
herausgestellt (ALBERIO et al. 2001; TANI et al. 2001; BOQUEST et al. 2002; DE
SOUSA et al. 2002). Um Chromosomenabnormalitäten zu vermeiden und eine
bestmögliche „Reprogrammierung“ zu gewährleisten, wird deshalb heute zumeist
die MII-Oozyte mit einer diploiden Spenderzelle in G0/G1 fusioniert.
Schrifttum
- 48 -
Abbildung 9: Übersicht über das Schicksal des Spenderkerns nach Kerntransfer
Zellzyklus des Spenderzellkerns nach Kerntransfer
NEBD
DNA Replikation
PCC
A
nicht aktivierte Oozyte
Pb
Pb
Pb
nicht aktivierte Oozyte
B
aktivierte Oozyte
C
NEBD (Nuclear Envelope Breakdown), PCC (Premature Chromosome Condensation)
Pb (Polar body)
- 49 -
Schrifttum
2.5 Klonen beim Schwein mittels Kerntransfer
2.5.1 Klonen beim Schwein mittels embryonalen Kerntransfers
Seit den ersten Berichten über geklonte Säugetiere wurden international zahlreiche
Anstrengungen unternommen, um auch den Kerntransfer beim Schwein zu
etablieren und zu verbessern. Hierzu wurden beim embryonalen Klonen zumeist
Blastomeren undifferenzierter früher Embryonalstadien als Kernspender eingesetzt
(PRATHER et al. 1989a; TERLOUW et al. 1992; NAGASHIMA et al. 1997; VERMA
et al. 1999; LI et al. 2000). Mit dieser Methode wurden beim Schwein erfolgreich
lebende Klone erzeugt (Tabelle 6), jedoch mit einer sehr geringen Effizienz. Es sind
bisher erst 2 Fälle bekannt, bei denen Versuche zu lebenden Klonen führten
(PRATHER et al. 1989a; LI et al. 2000). Dabei wurden in der Regel in vivo gereifte
MII-Oozyten als Empfängerzellen genutzt. Fusion und Aktivierung erfolgten simultan
im elektrischem Feld (PRATHER et al. 1989a). Lebende Nachkommen resultierten
dabei
aus
Embryonen,
die
in
den
Eileitern
temporärer
Empfängertiere
zwischenkultiviert wurden, bevor sie erneut intrauterin auf sekundäre Empfängertiere
übertragen wurden.
vivo
Blastomere 4-Zeller
vivo
Blastomere 4-Zeller
86
97
88,0
84,6
82,6
83
77
76
FR
(%)
in vivo/ Kaninchen 66,1
in vivo/ Kaninchen 91,5
in vivo/ Schwein
in vitro
in vitro
in vitro
in vitro
in vitro
in vitro
in vivo/ Schwein
in vivo/ Schwein
in vivo/ Schwein
Kultur
55,0
75,0
53,8
53,0
36,4
33,3
80,0
46,0
69,0
TR
(%)
19,0
5,0
35,0
27,6
17,0
4,5
11,9
8,0
9,0
38,0
MR
(%)
5,9
10,3
0,0
24,0
15,0
8,0
BR
(%)
39
94
21
34
33
56
Transfer1
(n)
2
7
1
0
7
geborene
Ferkel (n)
transferiert wurden Morulae und Blastozysten, die aus den Eileitern temporärer Trägertiere rückgewonnen wurden
vivo
vivo
Blastomere 8-Zeller
Blastomere 4-Zeller
vivo
vivo
Blastomere > 8 Zeller
Blastomere > 8-Zeller
vivo
Blastomere Morula
vivo
vivo
Blastomere 4-Zeller
Blastomere 4/8-Zeller
vivo
Blastomere 2-Zeller
vivo
Zygote
Zygote mit Vorkern
Blastomere 8-Zeller
Oozyte
Spenderkern
FR (Fusionsrate), TR (Teilungsrate), MR (Morularate), BR (Blastozystenrate)
1
LI et al. 2000
VERMA et al. 1999
NAGASHIMA et al. 1997
TERLOUW et al. 1992
PRATHER et al. 1989a
Autor
Tabelle 6: Entwicklung porziner Embryonen aus embryonalem Kerntransfer
- 50 Schrifttum
Schrifttum
- 51 -
2.5.2 Klonen beim Schwein mittels somatischen Kerntransfers
Das somatische Klonen beim Schwein wurde wesentlich später als bei anderen
Nutztieren etabliert. Neue Anwendungsperspektiven außerhalb der Tierproduktion,
vor allem in der Humanmedizin, rückten insbesondere das Schwein im Rahmen der
Xenotransplantation als Organlieferant in den Blickpunkt (NIEKRASZ et al. 1992; YE
et al. 1994; ONISHI 2002). Aus diesem Grund gab es beim Schwein eine starke
Nachfrage für die Entwicklung einer Technologie zum Klonen mittels somatischem
Kerntransfer. Mehrere Autorengruppen konnten als Antwort darauf nahezu zeitgleich
Erfolge bekannt geben (BETTHAUSER et al. 2000; POLEJAEVA et al. 2000; ONISHI
et al. 2000). Abbildung 10 veranschaulicht die Methoden, die gegenwärtig erfolgreich
angewendet werden (zum Überblick: ONISHI 2002). POLEJAEVA et al. (2000)
führten einen seriellen Embryotransfer durch, dessen Technik ursprünglich bei der
Spezies Maus entwickelt wurde (KWON u. KONO 1996). Hierbei wurde eine
Granulosazelle in der G0-Phase mit einer nicht aktivierten, in vivo gereiften,
enukleierten MII-Oozyte simultan fusioniert und aktiviert (Abbildung 10/B). Nach der
Aktivierung wurde der Vorkern dann in einem 2. Kerntransfer mit einer enukleierten
Zygote fusioniert (Abbildung 10/A). Die Mikroinjektionstechnik, unsprünglich bei der
Maus entwickelt (WAKAYAMA et al. 1998), wurde ebenfalls mit Erfolg beim Schwein
angewendet (Abbildung 10/C): Hierbei wird ein Spenderkern in der G0/G1-Phase
direkt in das Zytoplasma einer nicht aktivierten enukleierten Oozyte injiziert (ONISHI
et al. 2000), ohne die Oozyte parallel zu aktivieren, wodurch der Zellkern einem
hohen MPF-Spiegel ausgesetzt wird, was das „Reprogramming“ unter Umständen
positiv unterstützen kann (ALBERIO et al. 2001; TANI et al. 2001; BOQUEST et al.
2002; DE SOUSA et al. 2002). BETTHAUSER et al. (2000) verfuhren schließlich
nach der klassischen Methode (Abbildung 10/B): Nicht aktivierte, in vitro gereifte,
enukleierte MII-Oozyten wurden mit Spenderzellen der G0/G1-Phase fusioniert. Die
klassische Fusionstechnik hat den Nachteil, dass unbehandelt ein hoher Anteil der
Oozyten simultan zur Fusion aktiviert wird. Aus diesem Grunde sind in der Folge
Fusionsmedien entwickelt worden, die keine zweiwertigen Kationen enthalten, was
die Oozytenaktivierung von der Fusion entkoppeln soll (BOQUEST et al. 2002).
Sowohl bei der Kerninjektion, wie auch bei der entkoppelten Fusion, muss die
- 52 -
Schrifttum
Oozyte deshalb zu einem späteren Zeitpunkt zusätzlich artifiziell aktiviert werden.
Neben Zellen der G0/G1 sind auch Spenderzellen der G2/M Phase erfolgreich als
Kernspender eingesetzt worden (LAI et al. 2002b). Wenn Spenderzellen der G0/G1Phase eingesetzt werden, muss zur Aufrechterhaltung der Ploidie die Ausschleusung
des halben Chromosomensatzes mit dem Polkörper unterdrückt werden (Abbildung
10/C). Da der Chromosomensatz einer Spenderzelle der G2/M-Phase jedoch
verdoppelt ist, muss in diesem Fall zur Aufrechterhaltung der Normoploidie der halbe
Chromosomensatz mit dem Polkörper ausgeschleust werden (Abbildung 10/D).
Abbildung 10: Strategien des Klones beim Schwein mittels somatischem Kerntransfer
Serieller Kerntransfer einer Spenderzelle in der G0/G1-Phase (A+B), Fusion einer Spenderzelle in der
G0/G1-Phase mit simultaner oder anschliessender Aktivierung (B), Injektion einer Spenderzelle in der
G0/G1-Phase mit anschließender Aktivierung (C), sowie Injektion oder Fusion einer Spenderzelle in
der G2/M-Phase mit anschließender Aktivierung (D) (modifiziert nach ONISHI 2002).
Schrifttum
- 53 -
2.5.2.1 In-vitro-Entwicklung nach somatischem Kerntransfer beim
Schwein
In den letzten Jahren ist es einigen Arbeitsgruppen gelungen, eine In-vitroEntwicklung bis zum Blastozystenstadium nach somatischem Kerntransfer zu
erreichen (Tabelle 7). Nahezu alle Autorengruppen nutzten hierzu fetale Fibroblasten
als Kernspenderzellen und in vitro gereifte MII-Oozyten als Empfängerzellen. Bei der
Reifungsdauer gibt es jedoch erhebliche Unterschiede (24-46 h). Während die
Elektrofusion, mit einer Fusionseffizienz von 68-90%, die bewährte Methodik beim
Kerntransfer darstellt, wurden zur artifiziellen Aktivierung nahezu alle potentiell
möglichen Methoden eingesetzt. In vitro kultivierte Kerntransferembryonen wiesen
nach der Aktivierung eine Teilungsrate von bis zu 94% (LEE et al. 2003b), und eine
Blastozystenrate von zumeist deutlich unter 15% auf, wobei drei Autorengruppen
eine höhere Blastozystenrate von 21,2% (LEE et al. 2003a), 23% (BOQUEST et al.
2002) und 26% (HYUN et al. 2003) berichteten.
Fusion
Fusion
Injektion
Fusion
Fusion
Fusion/ ES (gleichzeitig)
Fusion/ ES (gleichzeitig)
ES/ CYCLO
Fusion
Fusion/ ES (gleichzeitig)
ES /CYCLO
Fusion
Fusion
Fusion
40-42 h
40-42 h
40-42 h
in vivo
44 h
44 h
46 h
44 h
44 h
44 h
44 h
33 h
44 h
fet. Fibroblast
fet. Fibroblast
fet. Fibroblast
fet. Fibroblast
fet. Fibroblast
fet. Fibroblast
ad. Kumuluszellen
fet. Fibroblast
fet. Fibroblast
fet. Fibroblast
fet. Fibroblast
fet. Fibroblast
fet. Fibroblast
fet. Fibroblast
TAO et al. 1999
KOO et al. 2000
BETTHAUSER et al. 2000
PARK et al. 2001b
ES/ IONO/ DMAP
ES
ES
ES
Fusion/ ES (gleichzeitig)
ES
IONO/ DMAP
TIM/ DTT
TIM/ DTT
ES (Elektrostimulation), FR (Fusionsrate), TR (Teilungsrate), BR (Blastozystenrate)
CYCLO (Cycloheximid), DMAP (6-Dimethylaminopurin), TIM (Thimerosal), DTT (Dithiolthreitol), IONO (Ca-Ionophor)
IKEDA u. TAKAHASHI 2001
PARK et al. 2001a
UHM et al. 2000
VERMA et al. 2000
TAO et al. 2000
Injektion
44 h
Kernspenderzelle
Autor
Aktivierung
Kerntransfer
OozytenReifung
in vitro
Technik
Tabelle 7: In-vitro-Entwicklung porziner Embryonen aus somatischem Kerntransfer
68,4
81,1
FR
(%)
38,9
58,8
52,8
71,8
40,0
58,0
79,0
52,4
48,8
58,8
46,3
TR
(%)
1,8
13.6
9,3
15,9
5,9
8,0
11,6
4,0
8,0
3,0
9,4
2,5
10,0
5,3
BR
(%)
In vitro Entwicklung
- 54 Schrifttum
ES/ DMAP
ES
ES
Fusion
Fusion
Fusion
Fusion
Fusion
Fusion
Fusion
46 h
46 h
24 h
42 h
44 h
44 h
44 h
in vivo
38-44 h
42 h
42 h
fet. Fibroblast
fet. Fibroblast
ad. Fibroblast
ad. Fibroblast
fet. Fibroblast
fet. Fibroblast
fet. Fibroblast
fet. Fibroblast
ad. Herzmuskelzelle
fet. Fibroblast
ad. Fibroblast
LAI et al. 2002b
DE SOUSA et al. 2002
PARK et al. 2002
BOQUEST et al. 2002
YIN et al. 2002
fet. Fibroblast
LEE et al. 2003a
ES
Fusion/ ES (gleichzeitig)
Fusion/ ES (gleichzeitig)
42 h
IONO/ DMAP
42 hs
Fusion
Fusion/ ES (gleichzeitig)
Fusion
Fusion/ ES (gleichzeitig)
ES
ES
IONO
IONO/ DMAP
ES
:keine Enukleationskontrolle,
1
s
: Oozyten auschließlich von Sauen
DMAP (6-Dimethylaminopurin), IONO (Ca-Ionophor), FR (Fusionsrate), TR (Teilungsrate), BR (Blastozystenrate)
fet. Fibroblast
HYUN et al. 2003
LEE et al. 2003b
MIYOSHI et al. 2002
KOO et al. 2001
1
Fusion
46 h
fet. Fibroblast
Aktivierung
Kerntransfer
Kernspenderzelle
Autor
OozytenReifung
in vitro
Technik
Fortsetzung Tabelle 7: In-vitro-Entwicklung porziner Embryonen aus somatischem Kerntransfer
70-78,4
76,0
73,2
77,5
71,5
81,0
86,8
90,2
FR
(%)
72,2
69,0
88,1
87,9
93,0
21,2
26,0
7,9
15,9
11,0
23,0
9,4
4,0
57,0
14,1
41,0
9,4
2,2
58,1
77,2
2,2
60,7
6,0
11,0
74,9
42,9
BR
(%)
TR
(%)
In vitro Entwicklung
Schrifttum
- 55 -
Schrifttum
- 56 -
2.5.2.2 In-vivo-Entwicklung nach somatischem Kerntransfer beim
Schwein
Bis zum heutigen Tag ist die Effizienz des somatischen Kerntransfers, beurteilt
anhand der Anzahl geborener Tiere in Bezug zur Anzahl der übertragenen
rekonstruierten Embryonen, insbesondere bei der Spezies Schwein, sehr gering. Die
Gründe hierfür liegen in den In-vitro-Techniken, die für die Spezies Schwein noch
nicht so weit entwickelt sind wie für andere Spezies (zum Überblick: NIEMANN u.
RATH 2001b), sowie in der reproduktiven Eigenschaft des Schweins, da zur
Etablierung einer dauerhaften Trächtigkeit 4-5 Embryonen am Trächtigkeitstag 11 bis
14 benötigt werden (POLGE et al. 1966). Tabelle 8 verdeutlicht die Erfolgsraten
verschiedener
Autorengruppen.
Es
wird
deutlich,
dass
vorwiegend
fetale
Fibroblasten als Spenderzelle eingesetzt werden. Während in den Anfängen zumeist
in vivo gereifte Eizellen als Empfängerzelle genutzt wurden, bediente man sich
später in der Regel in vitro gereifter MII-Oozyten. Die klassische Fusionstechnik wird
fast ausschließlich angewandt, wobei einige Autorengruppen eine simultane (PARK
et al. 2001a; PARK et al. 2002; LAI et al. 2002b), andere eine zeitverzögerte
artifizielle Aktivierung durchführen (WALKER et al. 2002; BOQUEST et al. 2002; DE
SOUSA et al. 2002). Lediglich eine Autorengruppe verzichtete auf eine Aktivierung
im elektrischen Feld (BOQUEST et al. 2002), alle anderen Gruppen bevorzugen die
Elektrostimulation (ES). LEE et al. (2003c) entwickelten erst kürzlich eine
vollkommen neue Technik; Sie injizierten ganze Spenderzellen direkt in das
Zytoplasma einer Oozyte, so dass eine Fusion nicht mehr nötig ist. Bei
durchschnittlich 35% der Empfängerschweine konnte eine Trächtigkeit etabliert
werden, aber nur 24% aller Empfängertiere warfen. Die durchschnittliche Wurfgröße
betrug etwa 3 Ferkel. Da pro Trägersau durchschnittlich 100 KT-Embryonen
transferiert wurden, verdeutlicht dies die gegenwärtig geringe Effizienz von weniger
als 1%.
Fusion/ ES (gleichzeitig)
Fusion/ ES (gleichzeitig)
44 h
44 h
fet.Fibroblast
fet.Fibroblast
PARK et al. 2002
LAI et al. 2002a
DAI et al. 2002
Fusion/ ES (gleichzeitig)
Fusion/ ES (gleichzeitig)
44 h
40-42 h
fet.Fibroblast
fet.Fibroblast
14 Sauen hatten zum Zeitpunkt der Veröffentlichung noch nicht geworfen
ES (Elektrostimulation), DMAP (6-Dimethylaminopurin)
2
Fusion/ ES (gleichzeitig)
44 h
fet.Fibroblast
PARK et al. 2001a
LAI et al. 2002b
Fusion/ ES (gleichzeitig)
in vivo
ad. Fibroblast
BONDIOLI et al. 2001
163
113
50
91
102
44
128
Fusion
44 h
fet.Fibroblast
BETTHAUSER et al. 2000
ES/ DMAP
27
KernInjektion
in vivo
Embryonen/
Trägertier (n)
fet.Fibroblast
39
28
4
5
5
23
10
10,7
25,0
20,0
40,0
30,4
10,0
10,0
17 43,6
3
1
1
3
2
7
1
1
trächtig (n)
ONISHI et al. 2000
Trägertiere (n)
10
trächtig (%)
59
ES
Fusion/ ES (gleichzeitig)
32
3
1
1
1
1
2
1
1
Würfe (n)
Fusion
in vivo
Artifizielle
Aktivierung
10,7
25,0
20,0
33,3
20,0
8,6
10,0
10,0
Würfe (%)
Zygote
ad.
Granulosazelle
Kerntransfer
6
7
1
4
5
2
5
1
7
geborene
Ferkel (n)
Vorkern
POLEJAEVA et al. 2000
Autor
Kernspenderzelle
Oozyten
Reifung
in vitro
Tabelle 8: In-vivo-Entwicklung porziner Embryonen aus somatischem Kerntransfer
Schrifttum
- 57 -
Fusion
Fusion/ ES (gleichzeitig)
Fusion
Fusion
38-44 h
40-42 h
in vivo
38-40 h
ad.
Herzmuskelzelle
fet. Fibroblast
fet. Fibroblast
fet. Fibroblast
fet. Fibroblast
ad. Fibroblast
YIN et al. 2002
PHELPS et al. 2003
RAMSOONDAR et al. 2003
ARCHER et al. 2003
HYUN et al. 2003
LEE et al. 2003c
76
ES
ZellInjektion
ES (Elektrostimulation), DMAP (6-Dimethylaminopurin), s Oozyten ausschließlich von Sauen
in vivo
150
146
240
102
Fusion/ ES (gleichzeitig)
ES
ES
ES/DMAP
Embryonen/
Trägertier (n)
ES
Trägertiere (n)
42 hs
Fusion
38-40 h
fet.Fibrblast
WALKER et al. 2002
9
42
20
16
6
5
trächtig (n)
50,0
100
35,0
6
66,6
25 59,5
7
10 62,5
3
5
50,0
trächtig (%)
5
34
3
2
2
3
2
2
4
2
Würfe (n)
10
2
33,3
4,7
15,0
12,5
106
4
3
9
6
5
33,3 11
80,0 28
20,0
Würfe (%)
80
geborene
Ferkel (n)
IONO/DMAP
Fusion
BOQUEST et al. 2002
in vivo
fet.Fibrblast
Autor
Artifizielle
Aktivierung
Kerntransfer
Kernspenderzelle
Oozyten
Reifung
in vitro
Fortsetztung Tabelle 8: In-vivo-Entwicklung porziner Embryonen aus somatischem Kerntransfer
- 58 Schrifttum
- 59 -
Schrifttum
2.5.2.3 Transgene Schweine aus somatischem Kerntransfer
Zur genetischen Modifikation von Säugetieren wurde ursprünglich bei der Maus die
Vorkern-Mikroinjektion
entwickelt.
Hierbei
werden
Kopien
der
erwünschten
Gensequenz in den Vorkern einer Zygote injiziert, wo diese mit einer geringen
Wahrscheinlichkeit zufällig in ein Chromosom, oder auch in mehrere, eingebaut
werden können. Die Gensequenz ist dann später in den Keimzellen präsent, so dass
das Transgen auf die nächste Generationen übertragen wird. Mit dieser Methode
wurden erstmals 1985 transgene Schweine erzeugt (HAMMER et al. 1985).
Problematisch ist, dass ein großer Anteil der Nachkommen die Gensequenz nicht
einbaut, der Einbau zufällig erfolgt, und die Anzahl der eingebauten Kopien nicht
kontrolliert werden kann (PURSEL u. REXROAD, JR. 1993). Ein weiterer Nachteil ist,
dass der Einbau nicht immer während des ersten Zellzyklus stattfindet, so dass
Mosaik-Embryonen entstehen (BURDON u. WALL 1992). Mosaik-Tiere, bei denen
das Transgen nur in den somatischen Zellen eingebaut ist, können es nicht an die
nächste Generation weitergeben.
Mit Hilfe des Kerntransfers kann ein lebendes Tier aus einer einzelnen Zelle erzeugt
werden. Die Spenderzellen können in vitro kultiviert, genetisch modifiziert und
selektiert werden. Wenn ein gewebespezifischer Promoter benutzt wird, wird das
Transgen im gewünschtem Gewebe des Klons exprimiert (EYESTONE u.
CAMPBELL 1999). Der große Vorteil des Klonens aus kultivierten Zellen liegt in der
Möglichkeit gezielt genetische Modifikationen durch die „homologe Rekombination“
durchzuführen (DENNING et al. 2001), da Zellen mit erwünschten Eigenschaften
selektiert werden können, selbst wenn sie sehr selten vorkommen. Wenn die
Lebensspanne der Zellpopulation für Mehrfachmodifikationen zu kurz ist, können
auch Zellen von Tieren gewonnen werden, die das Transgen bereits aufweisen.
Diese Zellen können dann in der Zellkultur zusätzlich modifiziert und zur Erzeugung
polytransgener Tiere im Kerntransfer eingesetzt werden. Tabelle 9 zeigt eine
Übersicht über bisher erfolgreiche Kerntransferexperimente zur Erzeugung genetisch
modifizierter Schweine.
Fusion/ ES (gleichzeitig)
Fusion/ ES (gleichzeitig)
Fusion/ ES (gleichzeitig)
Fusion
Fusion/ ES (gleichzeitig)
fet. Fibroblast
(heterozygoter α1,3-Gal Knockout)
fet. Fibroblast
(heterozygoter α1,3-Gal Knockout)
fet. Fibroblast
(homozygoter α1,3-Gal Knockout)
Fet Fibroblast
(humane α1,2 Fucosyltransferase)
(heterozygoter α1,3-Gal Knockout)
fet. Fibroblast
(Enhanced Green Fluorescent Protein)
ad. Fibroblast
(porzines Lactoferin)
(humaner Faktor IX)
LAI et al. 2002a
DAI et al. 2002
PHELPS et al. 2003
RAMSOONDAR et al. 2003
HYUN et al. 2003
LEE et al. 2003c
ES
76
150
146
163
113
91
102
9
25
20
16
39
28
5
10,7
20,0
40,0
35,0
6
66,6
12 48,0
7
10 62,5
17 43,6
3
1
3
2
3
1
3
2
32
3
1
1
1
ES (Elektrostimulation), s Oozyten auschließlich von Sauen, 2 14 Sauen hatten bei Veröffentlichung noch nicht geworfen
ZellInjektion
Fusion/ ES (gleichzeitig)
fet. Fibroblast
(Enhanced Green Fluorescent Protein)
PARK et al. 2002
ES
Fusion/ ES (gleichzeitig)
Embryonen/
Trägertier (n)
fet. Fibroblast
(Enhanced Green Fluorescent Protein)
Trägertiere (n)
5
trächtig (n)
44
trächtig (%)
PARK et al. 2001a
Artifizielle
Aktivierung
Würfe (n)
Fusion/ ES (gleichzeitig)
KernTransfer
33,3
4,0
15,0
12,5
10,7
20,0
33,3
20,0
Würfe (%)
ad. Fibroblast
(humane α1,2 Fucosyltransferase)
Kernspenderzelle
(Transgen)
4
1
6
5
6
7
4
5
2
geborene
Ferkel (n)
BONDIOLI et al. 2001
Autor
Tabelle 9: Transgene Ferkel aus somatischem Kerntransfer mit genetisch modifizierten Zellen
- 60 Schrifttum
- 61 -
Schrifttum
2.5.3 Anwendungsperspektiven für transgene Schweine
Transgene Schweine könnten in der biopharmazeutischen Industrie eingesetzt
werden, um humane Proteine herzustellen (EYESTONE u. CAMPBELL 1999).
Bereits zuvor wurde über die Erstellung transgener Schweine berichtet, die humanes
Protein C (VELANDER et al. 1992; COTT et al. 2001) und humanen
Blutgerinnungsfaktor VIII (PALEYANDA et al. 1997) in ihrer Milch exprimieren.
Darüber hinaus könnten modifizierte Schweine als Modell zum Studium humaner
Gen-Defekte dienen. Eine Steigerung bestimmter tierischer Krankheitsresistenzen ist
durch den Einsatz genetischer Modifikationen ebenfalls denkbar, so wurde kürzlich
bei Schafen über die Entfernung des Prion-Proteins, das beim Krankheitsbild der
Spongiformen Encephalopathie eine Rolle spielt, berichtet (DENNING et al. 2001).
Desweiteren
könnten
transgene
Schweine
Einsatz
im
Rahmen
der
Xenotransplantation (Organtransplantation zwischen verschiedenen Spezies) finden.
Da im Rahmen der humanen Allotransplantation (Organtransplantation innerhalb
einer Spezies) nicht genügend Organe zur Verfügung stehen (COZZI et al. 2000),
wird daran gearbeitet durch genetisch modifizierte Schweine diesen Mangel zu
kompensieren. Die größte Hürde hierfür stellt ein Komplement-vermittelter Prozess,
die „Hyperakute Abstoßungsreaktion“ (HAR), dar. Die HAR wird ausgelöst durch die
Bindung humaner Antikörper an das α1,3-Galepitop porziner Epithelien, was die
Komplement-Kaskade aktiviert (PLATT et al. 1991). Diese Epitope werden in der
Schweinezelle durch die α-1,3-Galactosyltransferase produziert, die durch ein
einzelnes Gene kodiert wird. Da es dieses Gen beim Menschen nicht gibt, haben
Menschen natürlicherweise Antikörper gegen das α1,3-Galepitop (GALILI et al.
1988). Aus diesem Grund werden intensive Anstrengungen unternommen um α-1,3Galactosyltransferase-Knockout Schweine zu erzeugen, mit dem Ziel die HAR zu
umgehen. Dies ist kürzlich erstmals einer Arbeitsgruppe gelungen (PHELPS et al.
2003). In diesem speziellen Fall gelang dies durch die homologe Rekombination und
die spontane Mutation je eines Allels (homologer Knockout). Schweine, die auf
einem Allel einen Knockout aufweisen und auf dem anderen Allel das Gen für die
Galaktosyltransferase (Wildtyp) tragen (heterologer Knockout), wurden von 3
weiteren Arbeitsgruppen erzeugt (DAI et al. 2002; LAI et al. 2002a; RAMSOONDAR
Schrifttum
- 62 -
et al. 2003; LEE et al. 2003a). RAMSOONDAR et al. (2003) erzeugten dabei
Schweine, die neben einem heterologen Galaktosyltransferase-Knockout zusätzlich
transgen für die α1,2-Fucosyltransferase sind, die normalerweise als Epitop auf der
Oberfläche menschlicher Körperzellen vorkommt.
2.5.4 Normalität geklonter Nachkommen aus somatischem Kerntransfer
Für somatische Klone, insbesondere von Rind und Schaf, wurde von verschiedenen
Arbeitsgruppen das LOS („Large Offspring Syndrom“) berichtet (YOUNG et al. 1998;
KUBOTA et al. 2000). Dieser Krankheitskomplex beinhaltet gehäufte Aborte,
überlange Tragzeiten, übergroße Früchte und eine erhöhte perinatale Sterblichkeit
der Früchte durch eine verminderte Vitalität der Neugeborenen (YOUNG et al. 1998).
Eine verminderte Vitalität stellt sich häufig in Form von körperlicher Schwäche und
Saugschwierigkeiten dar. Darüber hinaus zeigen betroffene Jungtiere häufig
Herzkreislaufinsuffizienzen und respiratorische Leiden (GARRY et al. 1996), die
durch einen Surfactant-Mangel verursacht werden (HILL et al. 1999). Als
pathologische
Befunde
können
Herzkreislauf-,
Lungen-,
Leber-
und
Nierenveränderungen auftreten (CIBELLI et al. 1998). 35 Tage alte Schaffeten aus
dem Kerntransfer zeigten gehäuft eine insuffiziente Gefäßsystemausbildung der
Plazenta, sowie eine verminderte Anzahl an Kotyledonen (DE SOUSA et al. 2001).
Ebenso wurde beim Schaf gehäuft eine Hydro-Allantois beschrieben (DENNING et
al. 2001). Ähnliches wurde beim Rind beobachtet; so zeigen Rinderfeten aus
somatischem Kerntransfer zwischen dem 30. und 90. Tag eine Sterblichkeit von bis
zu 80% (HILL et al. 1999). Eine verringerte Lebensfähigkeit zwischen dem 35. und
60. Tag wurde mit einer insuffizienten Ausbildungen von Chorion und Allantois in
Verbindung gebracht, was aufgrund einer gestörten fetal-maternalen Interaktion zu
Dysversorgungen führt (HILL et al. 2000). Im Gegensatz zu Rindern und Schafen
zeigen somatische Mäuseklone normale Geburtsgewichte und besitzen tendenziell
erhöhte Plazentagewichte (WAKAYAMA et al. 1998). Da das LOS auch nach
Transfer in vitro kultivierter Embryonen aus IVF beobachtet wird, vermuten einige
Autoren, dass es primär keine Folge des Klonens, sondern vielmehr ein
Medieneinfluss der In vitro Kultur darstellt (BEHBOODI et al. 2001; FARIN et al.
- 63 -
Schrifttum
2001). Sicher ist jedoch, dass all diese Krankheitsbilder auf ein atypisches
Methylierungsmuster der DNA geklonter Embryonen zurückgehen, das sich von dem
normaler Embryonen unterscheidet (KANG et al. 2001a; HAN et al. 2003). Bei KTEmbryonen vom Rind wurde ein abnormales mRNA-Expressionsmuster beschrieben,
dass sich deutlich von in vitro produzierten Embryonen unterscheidet (WRENZYCKI
et al. 2001; NIEMANN et al. 2002). NIEMANN et al. (2002) konnten zeigen, dass in
vivo produzierte Rinderembryonen „Connexin43“ exprimieren, während dieses bei in
vitro produzierten Rinderembryonen nicht nachgewiesen werden konnte. Dafür
exprimierten in vitro produzierte Rinderembryonen den „bovinen leukemia inhibitory
factor“ sowie den „LIF-Rezeptor-ß“. Diese ließen sich bei in vivo produzierten
Embryonen nicht nachweisen.
Sehr wenig ist bisher bezüglich Abnormalitäten bei Klonschweinen bekannt
geworden.
Während
geklonte
Rinderembryonen
ein
generell
verändertes
Methylierungsmuster aufweisten (KANG et al. 2001a), ist die DNA geklonter
Schweine zumindest graduell typisch demethyliert (KANG et al. 2001b; ARCHER et
al. 2003). Im Gegensatz zu Kälbern und Lämmern sind die bisher geborenen KlonFerkel tendenziell eher zu leicht als zu schwer (PARK et al. 2001a; PARK et al. 2002;
LAI et al. 2002a). Eine Autorengruppe berichtete von einer übergroßen Niere bei
einem transgenen Klonferkel (PHELPS et al. 2003).
In einer aktuellen Arbeit wurden 10 Klonferkel von der Geburt bis zum Einsetzen der
Pubertät beobachtet (CARTER et al. 2002). Die Geburtsgewichte, die Gewichte der
Plazenta und die Wachstumsraten unterschieden sich nicht von denen normaler
Ferkel aus dem gleichen Stall. Keines der 10 Ferkel wies zum Zeitpunkt der Geburt
morphologisch erkennbare anatomische Defekte auf; dennoch wurden während der
Studie 5 Ferkel euthanasiert oder verstarben, was eine erhöhte Sterblichkeit
geklonter Ferkel andeutet. Zwei der Ferkel verstarben an bakteriellen Infektionen,
weitere 2 Ferkel erlagen einer Herzkreislauferkrankung. Ein Herzkreislauf-Leiden
eines Klonferkels war auch schon von LAI et al. (2002a) berichtet worden. Bei einem
Ferkel wurde nach Kümmern ein erniedrigter Plasmaspiegel an IgM, IgG und TZellen (CD4, CD4/CD8, CD8) ermittelt. Da das betreffende Ferkel jedoch zuvor an
Diarrhoe litt, ist unklar, worin die primäre Ursache lag. Die verbleibenden 5 Ferkel
Schrifttum
- 64 -
zeigten ein normales Wachstum bei unauffälligem Verhalten. Eines der Ferkel
erreichte zum heutigen Zeitpunkt bereits die sexuelle Reife, und wurde erfolgreich
besamt (CARTER et al. 2002).
Eine andere Autorengruppe verglich 9 adulte Klonschweine mit 8 gleichalten
Schweinen aus sexueller Vermehrung. Verglichen wurde das Methylierungsmuster
bestimmter DNA-Regionen, der Gehalt verschiedener Proteine und Mineralien im
Blut, sowie die körperliche Entwicklung (ARCHER et al. 2003). Um eine bessere
Vergleichbarkeit zu erreichen, waren beide Gruppen rassegleich, gleich alt, sowie in
gleicher Art aufgezogen worden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde festgestellt, dass
der allgemeine Grad der Methylierung zwischen den Klonschweinen und der
Kontrollgruppe keinen Unterschied aufwies. Ebenfalls zeigten sich hinsichtlich der
Blutparameter keine Unterschiede. Die Klonferkel entwickelten sich körperlich nicht
unterschiedlich zu der Kontrollgruppe, mit Ausnahme eines Ferkels, das schon bei
der Geburt sehr leicht gewesen war, und diesen Rückstand nie aufgeholt hatte.
Ebenfalls
zeigten
die
geklonten
Schweine
während
des
gesamten
Beobachtungszeitraums ein Verhalten, dass sich von dem der anderern Schweine,
die im gleichen Stall gehalten wurden, nicht unterschied (ARCHER et al. 2003).
- 65 -
Material und Methoden
3 Material und Methoden
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines Protokolls zum Klonen von
Schweinen durch somatischen Kerntransfer. Da Versuche zur In-vivo-Entwicklung
porziner Kerntransferembryonen, aufgrund einer Trächtigkeitsdauer von 115 Tagen,
sehr zeitaufwendig sind, wurde zuvor durch verschiedene Experimente die In-vitroEntwicklung porziner Kerntransfer-Embryonen optimiert. Da die Durchführbarkeit von
Versuchen mit porzinen Kerntransfer-Embryonen, aufgrund der Arbeitsintensität der
einzelnen Mikromanipulationsschritte, zeitlich und mengenmäßig ebenfalls begrenzt
ist, wurden intensive „Modellversuche“ mit parthenogenetischen Embryonen
durchgeführt.
Letztere
sind
im
Gegensatz
zu
Kerntransfer-Embryonen
bei
geringerem Aufwand in großer Anzahl herstellbar. Aus diesem Grund lässt sich der
gesamte Versuchsaufbau dieser Arbeit in drei Abschnitte einteilen (zur graphischen
Übersicht siehe Abbildung 32):
1.
Phase: Versuche im „parthenogenetischen Modell“, zur Entwicklung eines
Kerntransferprotokolls, das die Entwicklungsfähigkeit der Oozyten über einen 7,5
stündigen Zeitraum aufrechterhält, die vorzeitige (spontane) parthenogenetische
Aktivierung verhindert, und die Oozyten zu einem definierten Zeitpunkt effizient
aktiviert.
2. Phase:
Versuche
mit
Kerntransfer-Embryonen,
zur
Erarbeitung
eines
effizienten Fusionsprotokolls und Bestimmung verschiedener Parameter, die die
in vitro Entwicklung von Kerntransfer-Embryonen optimieren. Hierbei wurde das
Kerntransfer-Protokoll, das in der 1. Phase entwickelt worden ist, auf KTEmbryonen übertragen.
3. Phase:
Erstellung von Kerntransfer-Embryonen nach dem optimierten Protokoll
aus der 2. Versuchsphase und Transfer der Kerntransfer-Embryonen auf
synchronisierte Empfängertiere zur Beurteilung der In-vivo-Entwicklung.
Material und Methoden
- 66 -
3.1 Anfertigung der Pipetten
3.1.1 Transportpipetten
Für den Transport der Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOK) wurde eine über einer
Alkoholbrennerflamme im Winkel ausgezogene Pasteurpipette (#747720, Fa. Brand,
Wertheim) eingesetzt (siehe Abbildung 11/1).
Transport und Selektion der Oozyten erfolgten mit selbst erstellten OozytenTransportpipetten (Schmelzpunktbestimmungsröhrchen, 90x1,5 mm, #2005, Fa.
Assistent). Diese wurden an einem Ende über einer Alkoholbrennerflamme per Hand
fadenförmig ausgezogen und in einem zweiten Arbeitsschritt mittels einer
Mikroschmiede
(Mikroschmiede,
Typ
de
Fronbrune,
Fa.
Bachhofer,
Reutlingen/Deutschland) so gebrochen, dass ein Pipettenspitzenlumen mit einem
Innendurchmesser von 180 µm resultierte (Abbildung 11/2).
3.1.2 Arbeitspipetten
Für die Mikromanipulation kamen drei selbst angefertigte Arten von Arbeitspipetten
zum Einsatz: Haltepipette, Enukleationspipette und Kerntransferpipette.
Zur Fixierung der Oozyte unter der Manipulationseinheit wurden Haltepipetten selbst
hergestellt:
Hierzu
wurden
Glaskapillarröhrchen
(Schmelzpunktbestimmungs-
röhrchen, 90x1,5 mm, #2005, Fa. Assistent) mit einem automatischem Kapillar-Puller
(Micropipette Puller MPP11, Fa. Research Instruments Ltd., Cornwall/England)
ausgezogen und die fadenförmige Verjüngung der Haltepipette mit Hilfe der
Elektroschmiede
derart
gebrochen,
dass
ein
Außendurchmesser
der
Haltepipettenspitze von ~150 µm entstand. Deren scharfe Bruchkante wurde zuletzt
noch durch Annäherung an den vor Hitze glühenden Glastropfen innerhalb der
Mikroschmiede geglättet, was zu einer weiteren Verengung des Lumens führte
(Abbildung 11/3).
Zur
Herstellung
der
Enukleationspipetten
wurden
Glaskapillarröhrchen
(Schmelzpunktbestimmungsröhrchen, 100x1 mm, #9208100, Fa. OMNILAB) mit
einem automatischem Kapillar-Puller (Micropipette Puller P-87, Fa. SUTTER
INSTRUMENT
CO.,
USA)
ausgezogen.
Beide
daraus
resultierenden
sich
- 67 -
Material und Methoden
verjüngenden Kapillarenden wurden später in der Mikroschmiede auf einen
Außendurchmesser von 20 µm gebrochen. Die Bruchkante wurde während eines
fünf
minütigen
Schleifvorgangs
(Kapillarenschleifgerät,
Fa.
Bachhofer,
Reutlingen/Deutschland) auf 45° angeschliffen. Die Anschliffspitze wurde daraufhin
erneut spitz ausgezogen, was innerhalb der Mikroschmiede durch kurzes Eintauchen
der Anschliffspitze in einen glühenden Glastropfen und sofortigem Ausziehen, unter
gleichzeitiger Abkühlung des Glastropfens, realisiert wurde (Abbildung 11/4).
Zur
Herstellung
der
Kerntransferpipetten
wurden
beide
sich
verjüngenden
Kapillarenden analog zu den Enukleationspipetten weiterverarbeitet, abweichend von
diesen jedoch auf einen Außendurchmesser von 30 µm gebrochen und im Winkel
von 50° angeschliffen (Abbildung 11/5).
Material und Methoden
- 68 -
Abbildung 11: Abmessung und Spitzen der verschiedenen Arbeitspipetten
5 1.) KOK-Transportpipette
200 mm
4 2.) Oozyten-Transportpipette
70 mm
3 3.) Oozyten-Haltepipette
70 mm
2 4.) Enukleationspipette
70 mm
1 5.) Kerntransferpipette
70 mm
- 69 -
Material und Methoden
3.2 Medien
In allen Versuchen wurden nur Medien eingesetzt, die zuvor für mindestens eine
Stunde äquilibriert worden waren. Dies erfolgte bei den phosphatgepufferten Medien
(PBS) im Wasserbad bei 38,5°C, bei den hepesgepufferten Medien (Tl-HepesMedien und Hb-NCSU23) bei 38,5°C im Wärmeschrank (Incubat 85, Fa. Melag oHG,
Berlin/Deutschland), sowie bei den bikarbonatgepufferten Medien (NCSU23 und
in feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre im
NCSU37) bei 38,5°C und 5% CO2
Brutschrank
(Function
Line,
Typ
BB16,
Fa.
Heraeus
Instruments,
Haunau/Deutschland). Hepes benötigt als Reaktionspartner im Puffersystem O2,
Bicarbonat nutzt CO2. Nichtgepufferte Medien (SOR2, SOR2 Ca-free und BoquestFusionsmedium)
wurden,
ähnlich
wie
die
hepesgepufferten
Medien,
im
Wärmeschrank äquilibriert. Unter Luft waren hepesgepufferte Medien (mit Ausnahme
der
Entkumulierung)
Fusionsmedium),
und
zur
Fusionsmedien
Stabilisierung
des
(SOR2
Ca-free
Mikromilieus,
und
mit
Boquest-
auf
38,5°C
vortemperiertem Mineralöl (Silicone DC200 fluid, #35135, Fa. Serva Feinbiochemica,
Heidelberg/Deutschland) überschichtet. Zur Aufrechterhaltung der Temperatur
wurden außerhalb von Wärme- und Brutschrank beheizbare Arbeitsplatten
(Microscope Stage HT200, Fa. MiniTüb, Tiefenbach/Deutschland) eingesetzt.
3.2.1 Selektionsmedien
Die Suche nach geeigneten Kumulus-Oozyten-Komplexen im Punktat erfolgte
ausschließlich in PBS+1% NBCS (PBS: Dulbecco’s phosphatgepufferte Salzlösung,
#D-6650, Fa. Sigma, St. Louis, MO, USA; NBCS: Newborn Calf Serum).
3.2.2 Reifungsmedien
Für die Reifung der Oozyten wurde als Standardmedium NCSU37 (North Carolina
State University, die genaue Komposition der Medien ist dem Anhang: Tabelle 22 zu
entnehmen) eingesetzt. Das Medium wurde mit Follikelflüssigkeit, Cystein, Glutamin,
Merkaptoethanol und EGF supplementiert. Für die ersten 22 h der Reifung wurden
zudem cAMP und die gonadotropen Hormone eCG und hCG zugesetzt.
- 70 -
Material und Methoden
3.2.3 Arbeitsmedien
Zur Selektion, Manipulation und Aufbewahrung gereifter Oozyten außerhalb des
Brutschranks unter Luft, wurden ausschließlich Hepes gepufferte Medien verwendet.
In den parthenogenetischen Modellversuchen kamen Hb-NCSU23 und Tl-Hepes
(siehe Anhang: Tabelle 23) zum Einsatz. Hierbei wurden je nach Arbeitsschritt und
Erkenntnisstand Tl-Hepes Medien mit Modifikationen eingesetzt. So wurde zur
Erweiterung der Perivitellarräume Tl-Hepes Medien mit Osmolaritäten von 270-, 295und 320 mosmol verwendet. Die Osmolarität wurde mit einem Cryoscopic
Osmometer (Osmomat 030, Fa. Gonotec, Berlin/Deutschland) gemessen und durch
Sucrosezusatz eingestellt. Darüber hinaus wurde Ca-freies Tl-Hepes (Tl-Hepes Cafree) bei der Enukleation und beim Kerntransfer benutzt, um eine vorzeitige
Aktivierung zu unterbinden.
3.2.4 Fusions- und Aktivierungsmedien
Für die Fusion wurden zwei verschiedene Fusionsmedien eingesetzt: das BoquestFusionsmedium und das SOR2 Ca-free Medium. Die elektrische Aktivierung fand im
SOR2 Medium (siehe Anhang: Tabelle 24) statt. Eine zusätzliche chemische
Aktivierung geschah ausschließlich in NCSU23 Medium (North Carolina State
University), das mit dem Proteinkinaseinhibitor 6-DMAP (6-Dimethylaminopurin)
supplementiert war.
3.2.5 Kulturmedien
Die In-vitro-Kultur erfolgte in den parthenogenetischen Modellversuchen entweder im
dreiphasigen Kultursystem, d.h. Kultur für 48 h in CR2 Medium, gefolgt von 24 h
Kultur in NCSU23 Medium (North Carolina State University) und 96 h Kultur in
NCSU23+10% FCS (Fetal Calf Serum), oder aber im einphasigen Kultursystem für
168 h ausschließlich in NCSU23 Medium. Aktivierte Kerntransferkomplexe und deren
parthenogenetische „Kontrollgruppen“ wurden für 168 h in NCSU23 Medium
kultiviert.
- 71 -
Material und Methoden
3.3 In-vitro-Reifung porziner Oozyten
3.3.1 Gewinnung unreifer porziner Kumulus-Oozyten-Komplexe
In allen Versuchen wurden in vitro gereifte Oozyten eingesetzt. Zur Gewinnung
unreifer Kumulus-Oozyten-Komplexe (KOKs) wurden aus einem nahe gelegenen
Schlachthaus (Lübbecke/ Entfernung ca. 70-80 km) die Ovarien präpuberaler
Jungsauen
unbekannter
Herkunft,
unmittelbar
nach
dem
Ausweiden
der
Schlachtkörper, gesammelt, und in einem auf 38,5°C vortemperiertem Thermogefäß
schnellstmöglich
zum
Institut
physiologischer
Kochsalzlösung
transportiert.
(38,5°C),
Hier
die
wurden
zudem
die
Oozyten
Penicillin
G
mit
und
Streptomycinsulfat enthielt, abgespült. Zur Gewinnung von KOKs wurden alle Follikel
mit einem Durchmesser von 2-5 mm punktiert. Über Kanülen der Stärke 18-gauge
(Microlance 3, Fa. Becton Dickinson, Drogheda, Irland) wurde das Punktat über
einen
Adapteraufsatz
in
einen
sterilen
Auffangbehälter
geleitet
(50
ml
Zentrifugenröhrchen, Fa. Greiner Labortechnik, Frickhausen/Deutschland), der
sowohl
die
KOKs,
wie
auch
die
Follikelflüssigkeit
sammelte.
Über
ein
Schlauchsystem war dieser Auffangbehälter mit einer Unterdruckpumpe (VM AR 5100, Fa. Cook, Queensland 4113 Australien) verbunden, deren Unterdruck so
eingestellt wurde, dass in einer Minute 20 ml Flüssigkeit aspiriert werden konnten. Im
Normalfall wurden 4 dieser Adapter mit Auffangbehälter in einer Reihe an die
Unterdruckpumpe angeschlossen. Im Anschluss an die Punktion wurden die vom
Adapterkopf befreiten Auffangbehälter mit PBS+1% NBCS (PBS: Dulbecco’s
phosphatgepufferte Salzlösung, #D-6650, Fa. , St. Louis, MO, USA; NBCS: Newborn
Calf Serum) aufgefüllt und für 10 Minuten stehen gelassen, damit die KOKs
sedimentieren konnten. Daraufhin wurde der Überstand abgegossen und der
Vorgang ein zweites Mal wiederholt. Nach erneutem Abgießen wurden 1-2 ml des
verbliebenen Pellets, aus KOKs und Follikelwandzellen, in eine Petrischale (∅ 90
mm, Fa. Greiner Labortechnik, Frickenhausen/Deutschland) gegeben und mit 10 ml
PBS+1% NBCS aufgefüllt. Bei 20-50 facher Vergrößerung wurden die KOKs unter
einem Stereomikroskop mit Hilfe einer KOK-Transportpipette herausselektiert und
zweimal
in
Petrischalen
(∅35
mm,
Fa.
Greiner
Labortechnik,
- 72 -
Material und Methoden
Frickenhausen/Deutschland), die jeweils mit 2 ml PBS+1% NBCS befüllt waren,
gewaschen. Es wurden nur die KOKs ausgewählt, die von mindestens zwei
kompakten Lagen Kumuluszellen umgeben waren und ein feingranuliertes
homogenes Zytoplasma aufwiesen (Abbildung 12). Die Petrischalen waren während
dieses Zeitraumes auf beheizbaren Arbeitsplatten abgestellt, bei einer konstanten
Oberflächentemperatur von 38,5°C (Microscope Stage HT200, Fa. Minitüb,
Tiefenbach/Deutschland). Zum Verdünnen bestimmtes PBS+1% NBCS lagerte bis
zum Verbrauch im Wärmeschrank bei 38,5°C.
3.3.2 In-vitro-Reifung porziner Kumulus-Oozyten-Komplexe in NCSU37
Für die In-vitro-Reifung der gewonnenen KOKs wurde als Medium NCSU37 (North
Carolina State University Medium) verwendet, das mit porziner Follikelflüssigkeit,
Cystein, Glutamin, Merkaptoethanol und EGF supplementiert und anschließend
sterilfiltriert (Einmal-Filterhalter FP 030/3, Fa. Schleicher & Schuell, Dassel) worden
war. Je 500 µl dieses Reifungsmediums wurden in die Vertiefungen einer
Zellkulturschale (NUNCLON™,#176740, Fa. Brand Products, Dänemark) pipettiert.
Für geeignet befundene KOKs (Abbildung 12) wurden zweimal in Reifungsmedium
gewaschen und dann zu je 70-80 KOKs in die Vertiefungen einer Zellkulturschale
überführt, die während der Reifung im Brutschrank (Function Line, Typ BB16, Fa.
Heraeus Instruments, Haunau/Deutschland) aufbewahrt wurde. Während der ersten
22 h der Reifung wurden dem Medium cAMP und die gonadotropen Hormone PMSG
und hCG zugesetzt, danach erfolgte die Reifung für weitere 16-22 h in NCSU37
Medium ohne Zusatz von db-cAMP, PMSG und hCG (Abbildung 13). Bei 38,5°C und
5% CO2 in feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre wurden die KOKs je nach Versuch
für 38-44 h inkubiert (Abbildung 14).
- 73 -
Material und Methoden
3.3.3 Entkumulierung und Selektion in vitro gereifter Oozyten
Nach der Reifung wurden die Oozyten durch Inkubation mit Hyaluronidase von den
expandierten Kumuluszellen befreit. Dazu wurden die Oozyten in eine mit Tl-Hepes
gefüllte
Petrischale
(∅35
mm,
Fa.
Greiner
Labortechnik,
Frickenhausen/
Deutschland) mit einer Konzentration von 0,1% Hyaluronidase (#H-3506, Fa.
SIGMA,
St.
Louis/USA)
überführt.
Nach
fünfzehn
Minuten
Einwirkung
im
Wärmeschrank erfolgte die Entkumulierung durch wiederholtes heftiges Auf- und
Abpipettieren, wodurch der größte Teil der Kumuluszellen abgelöst wurde. Nach
weiteren fünf Minuten Inkubation im Wärmeschrank wurden für die nächsten
Arbeitsschritte nur Oozyten ausgewählt, die vollständig von den Kumuluszellen
befreit worden waren und ein feingranuliertes homogenes Zytoplasma aufwiesen
(Abbildung 15). Nach zweimaligem Waschen in Tl-Hepes Medium wurden die
Oozyten für alle Kerntransferversuche zusätzlich auf das Vorhandensein eines gut
ausgebildeten Polkörpers selektiert. Hierzu wurden unter einem Stereomikroskop
(Olympus SZ-PT, Fa. Olympus optical CO., Japan) nur solche Oozyten ausgewählt,
die einen möglichst abgerundeten, deutlich abgegrenzten Polkörper aufwiesen
(Abbildung
16).
Diese
Selektion
entfiel
bei
den
parthenogenetischen
Modellversuchen. Bis zum weiteren Gebrauch wurden die Oozyten in einem 300 µl
Tropfen Tl-Hepes verwahrt.
- 74 -
Material und Methoden
Abbildung 12: Kumulus-Oozyten-Komplexe nach der Ovarpunktion
Abbildung 13: Kumulusexpansion zum Zeitpunkt des Medienwechsels (nach 22 h Reifung)
Material und Methoden
Abbildung 14: Hochgradig expandierter Kumulus nach 38-44 h Reifung
Abbildung 15: Porzine Oozyten direkt nach der Entkumulierung
- 75 -
Material und Methoden
- 76 -
Abbildung 16: Metaphase II arretierte Oozyte mit ausgeschleustem Polkörper auf „3 Uhr“
Polkörper
3.3.4 Medienzusatz zur optischen Markierung von DNA
Zur Identifizierung von DNA wurde das jeweilige Medium mit 5 µg/ml Hoechst 33342,
einem stark basophilen Farbstoff, versetzt. Dieser lagert sich mit hoher Affinität an
basische Molekülgruppen, die in der DNA in hohem Maße vorhanden sind, an. Durch
UV-Leuchten
wurde
der
Farbstoff
mit
UV-Licht
bestrahlt.
Bei
einem
Anregungsmaximum von 350 nm Wellenlänge emittiert Hoechst 33342 seinerseits
bei einer Wellenlänge von 460 µm ein blaues Fluoreszenzlicht, das vom
menschlichen Auge gut wahrgenommen wird. Mit dieser Technik wurde somit optisch
DNA markiert, was zur Ermittlung der Reifungsrate, der Lokalisation von Polkörper
und Metaphase bei der Enukleation, sowie der Kernzahlbestimmung im Anschluss
an die In-vitro-Kultur, genutzt wurde.
- 77 -
Material und Methoden
3.4 Gewinnung und Präparation der Kernspenderzellen
Die vorliegende Arbeit wurde in enger Kooperation zu einer weiteren Dissertation
angefertigt, die sich mit der Eignung porziner Fibroblasten für den somatischen
Kerntransfer, sowie deren genetische Modifikation, befasste (PETERSEN in
Vorbereitung, persönliche Mitteilung). Für alle Kerntransfer-Versuche wurden in der
vorliegenden Arbeit Fibroblasten der 1. und 2. Passage benutzt.
3.4.1 Herstellung einer Explantatkultur
Zur Gewinnung von porzinen Feten wurde eine Sau am Tag 25 der Trächtigkeit
geschlachtet. Unmittelbar im Anschluss wurden die Feten aus dem Uterus
entnommen, zweimal in PBS gewaschen und in eine mit PBS aufgefüllte Petrischale
(Ø90 mm, Fa. Greiner Labortechnik, Frickenhausen) überführt. Nach Dekapitation,
Evisceration und Amputation der Extremitäten wurde der verbleibende Corpus mittels
zweier Kanülen der Stärke 18-gauge (Microlance 3, Fa. Becton Dickinson, Drogheda
Irland) in 1-2 mm große Stücke zerlegt.
Parallel dazu wurden in Zellkulturflaschen (T25-Zellkulturschale, Tissue Culture
Flask, #9025, Fa. TPP/Schweiz) jeweils 12 recalzifizierte Plasmatropfen (4 Teile
FBS: Fetal Bovine Serum, #10270-106, GIBCO™, Fa. Invitrogen Corporation, South
America, und 1 Teil CaCl2,) mit Hilfe einer Glaspipette (Pasteurpipette, #747720, Fa.
Brand,
Wertheim)
aufgebracht.
In
diese
Plasmatropfen
wurden
einzelne
Gewebsstücke verbracht. Danach blieben die Zellkulturflaschen zur Agglutination für
20 Minuten in einem Wärmeschrank (Hera Cell, Typ BB16, Fa. Heraus Instruments,
Hanau) bei 38°C. Anschließend wurde den Zellkulturflaschen DMEM (DMEM:
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) +10% FBS hinzugegeben; alle 2-3 Tage
erfolgte ein Medienwechsel. Wenn die auswachsenden Fibroblasten einen Hof von
zwei Zentimetern erreicht hatten, wurden sie subkultiviert, später wurden Aliquots in
Eppendorf Cups (Micro Test Tubes, Safe Lock 1,5 ml, Fa. Eppendorf, Hamburg)
eingefroren. Hierzu wurde dem Medium 10% DMSO (Dimethyl Sulphoxide, #D2650,
Fa. SIGMA, St. Louis, USA) als Kryoprotektivum zugesetzt. Nach einer Lagerung für
24 Stunden bei –80°C wurden die Aliquots in flüssigen Stickstoff überführt. Eine
Übersicht zum Fibroblasten Handling gibt Abbildung 17.
Material und Methoden
- 78 -
Abbildung 17: Herstellung und Handling einer porzinen Explantatkultur für den Kerntransfer
EDTA/
TRYPSIN
aussäen
EDTA/
TRYPSIN
einfrieren
Kontaktinhibition
EDTA/
TRYPSIN
Kerntransfer
- 79 -
Material und Methoden
3.4.2 Vorbereitung der Spenderzellen für den Kerntransfer
Eingefrorene porzine Fibroblasten wurden im Wasserbad bei 37°C aufgetaut und
anschließend in DMEM +10% FBS auf einer Zellkulturschale (Tissue Culture Test
Plates 6, #92406, Fa. TPP/Schweiz)
ausgesät. Für den Kerntransfer wurden
Zellkulturen verwendet, die das Stadium der Kontaktinhibition erreicht hatten.
3.4.3 Präparation der Spenderzellen für den Kerntransfer
Am Transfertag wurde das Medium der Zellkultur abgesaugt und die anhaftenden
Fibroblasten zweimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die Fibroblasten
zur Ablösung für 10 Minuten einer 10 prozentigen EDTA/TRYPSIN- (#T-4174, Fa.
SIGMA, St. Louis, USA) Lösung in PBS ausgesetzt. Die abgelösten Zellen wurden in
4
ml
Tl-Hepes296
Ca-free
+100
µl
FCS
aufgenommen
und
in
einem
Zentrifugenröhrchen (PP Tubes, Cellstar®, 15 ml, #188261, Fa. Greiner bioone/Frickenhausen) bei 1000 rpm für zwei Minuten zentrifugiert (Megafuge 1.0, Fa.
Heraeus Instruments, Hanau). Nach Entfernen des Überstandes und erneutem
Waschen standen die vereinzelten Fibroblasten für den Kerntransfer zur Verfügung.
3.5 Mikromanipulation
Die
Mikromanipulation
setzte
sich
aus
der
Oozytenenukleation
und
dem
Fibroblastentransfer in den Perivitellarraum der Oozyte zusammen.
3.5.1 Destabilisierung des Zytoskelettes
Um die Toleranz der Oozyten gegenüber Enukleation und Kerntransfer zu erhöhen,
wurde das Manipulationsmedium mit 7,5 µg/ml Cytochalasin B, (#C-6762, Fa.
SIGMA, St. Louis/USA) supplementiert. Dieses bindet intrazellulär an Actinfilamente
und inhibiert so deren Polymerisation, was zu einem reversiblen Abbau des
Zytoskelettes
führt.
Dadurch
wurde
das
Zytoplasma
„gallertig“,
was
eine
Ooplasmaentnahme ohne Schädigung der Oozyte ermöglichte. Darüber hinaus
führte es zu „flexiblen Oozyten“, die in der Lage waren „Penetrationswunden“, die
Material und Methoden
- 80 -
durch Enukleation und Kerntransfer entstehen, über die Oberflächenspannung zu
regenerieren. Die Destabilisierung des Zytoskelettes wurde nach Transfer der
Oozyten in Cytochalasin B-freies Medium beendet.
3.5.2 Aufbau des Mikromanipulators
Die Kerntransferversuche wurden an einer Mikromanipulationseinheit mit inversem
Mikroskop (Axiovert 135, Fa. Zeiss, Göttingen) bei 100-400facher Vergrößerung
durchgeführt (Abbildung 18). Das Mikroskop war mit einer Hoffmann ModulationContrast-Optik® (HMC, Fa. Modulation Optics Inc., Greenvale, New York, USA)
ausgestattet, die eine kontrastreiche Darstellung gewährleistete. Darüber hinaus
konnte mittels einer Quecksilberdampfkurzbogenlampe (HBO 50, Fa. Zeiss,
Oberkochen/Deutschland) eine temporäre UV-Bestrahlung durchgeführt werden. Der
Objektkreuztisch (Fa. Minitüb, Tiefenbach) war mit einer Aussparung (85x60 mm)
versehen, um ein Objektträgerglas (Deckel einer Gewebekulturplatte, Microtest®
Terasaki, #3034F, Fa. Beckton Dickinson, Drogheda/Irland) aufzunehmen. Sowohl
für die Enukleation, wie auch für den Kerntransfer kamen zwei verschiedene
Mikromanipulatoren gleichzeitig zum Einsatz. Auf der linken Seite des Mikroskops
übernahm ein manueller Mikromanipulator (#11520138, Fa. Leitz, Wetzlar) die
Führung
der
Oozytenhaltepipette.
Er
besaß
eine
Halterung,
um
einen
Kapillarenhalter zu fixieren, der rückseitig über einen ca. 80 cm langen Schlauch (Ø
ca. 5 mm) mit einer 1 ml-Einmalspritze verbunden war. Vorderseitig wurde eine
Oozytenhaltepipette mit Hilfe einer Dichtung fixiert. Durch Bewegung des Stempels
der Einmalspritze ließen sich Über- und Unterdruck in der Oozytenhaltepipette
variieren. Auf diese Weise konnte die Oozyte abgestoßen und angesaugt werden, so
dass sie sich hierdurch bewegen, drehen und fixieren ließ. Auf der rechten Seite des
Mikroskops übernahm eine elektrische Mikromanipulationseinheit (LN-MINI 25 XYZ
motorisch, Fa. Luigs & Neumann, Ratingen) je nach Arbeitsschritt entweder die
Führung der Enukleations-, oder der Kerntransferpipette. Diese bestand aus drei
Anteilen. Zum einen aus der Fixiereinheit, die rechts am Mikroskop befestigt war und
der Führung der Arbeitspipette diente. Über eine Kapillarhalterung konnte ein
Kapillarenhalter (# KP-000100, Fa. Luigs & Neumann, Ratingen) an der Fixiereinheit
- 81 -
Material und Methoden
eingeklemmt werden. Mit Hilfe einer Stellschraube wurde ein Winkel von ca. 25°
gewählt. Am Vorderende des Kapillarhalters wurde die Arbeitspipette mit Hilfe von
Spannzange
und
Mutter
verankert,
hinterendig
wurde
ein
Druckschlauch
(#05011515, Angiodyn® HD-Schlauch, Fa. Braun, Melsungen) angeschlossen und
mit einer Mutter fixiert. Der Druckschlauch führte zu einem Dreiwegehahn
(#05012155, Angiodyn® HD-Hahn, Fa. Braun, Melsungen), der die Verbindung zu
einer gasdichten Spritze (Hamilton Microliter™ Syringe, Fa. Hamilton Bonaduz AG,
7402 Schweiz) und einem weiteren Schlauch stellte. Die Hamilton-Spritze wurde in
eine motorische Dosiereinheit (LN-Mini-25-Manipulator mit Dosieradapter, Fa. Luigs
&Neumann, Ratingen) eingespannt, über die Öl in die Arbeitspipette gepresst
werden- oder zurückweichen konnte. Am Ende des zweiten Schlauches wurde eine
10 ml Spritze (Fa. Becton Dickinson, Drogheda, Irland) befestigt; mit ihrer Hilfe
konnte Öl (#M-3516, mineral oil, light white oil, Fa. , St. Louis, MO, USA) in das
System eingefüllt werden. Dazu musste der Weg zur Hamilton-Spritze über den
Dreiwegehahn verschlossen werden. Sowohl Fixier- wie auch Dosiereinheit waren
über elektrische Schrittmotoren ansteuerbar. So war die Fixiereinheit über die drei
Raumachsen variabel. Sie wurde über eine Bedieneinheit, die sowohl Tastenfelder
als auch einen Trackball enthielt, gesteuert und über ein Netzgerät (SM2/2-96-023,
Fa. Luigs & Neumann, Ratingen) mit Strom versorgt. Es wurde in einer Ebene im
Proportional-Modus (P-Modus) gearbeitet. Hierbei verhielt sich die Fixiereinheit über
die X- und Y-Achse proportional zu den Bewegungen des Trackballs auf einer
definierten Ebene, die über die Z-Taste veränderlich war. Über die D-Taste wurde die
Dosiereinheit angesteuert, so führte eine zurückweichende Ölsäule in der Spitze der
Arbeitspipette zu einem Unterdruck, mit dessen Hilfe zum Beispiel Anteile des
Zytoplasmas einer Ooyzte in das Lumen der Pipette gesaugt werden konnten,
andererseits konnte es bei fortschreitender Ölsäule auch wieder ausgestoßen
werden. Darüber hinaus war es möglich die Sensitivität der Bedieneinheit genau zu
justieren. Einerseits bestand die Wahlmöglichkeit zwischen den Einstellungen
„HIGH“ (1-6 mm/sec) und „LOW“ (0,04-0,68 mm/sec), andererseits konnten durch
Betätigung der Tasten XYZ↑ und XYZ↓, bzw. D↑ und D↓, genauere Abstufungen in
32 Schritten vorgenommen und gespeichert werden.
Material und Methoden
- 82 -
Abbildung 18: Mikromanipulationseinheit zum Erstellen von porzinen Kerntransfer-Komplexen
3.5.3 Durchführung der Enukleation
Unmittelbar
zu
Beginn
eines
Experiments
wurde
zuerst
der
manuelle
Mikromanipulator so justiert, dass die Oozytenhaltepipette mit ihrer Öffnung minimal
auf dem Objektträger aufsetzte. Die Öffnung der Oozytenhaltepipette befand sich
damit im Tropfen in der gleichen Ebene wie die abgesunkenen Oozyten.
Gereifte Oozyten mit deutlichem Polkörper wurden in Gruppen von etwa 10 für ca. 10
min in Tl-Hepes296 Ca-free Medium, das zusätzlich mit 5 µg/ml Hoechst 33342 und
7,5 µg/ml Cytochalasin B supplementiert war, präinkubiert, und dann in einen der
Tropfen auf dem Objektträger unter die Mikromanipulationseinheit verbracht. Diese
Tropfen waren aus Tl-Hepes296 Ca-free Medium, das mit 7,5 µg/ml Cytochalasin B
ergänzt war. Hierzu wurde ein Objektträger vorbereitet, auf dem, zentral zu den
Seitenkanten in vertikaler Linie, 4 Tropfen a 75 µl Volumen aufgebracht worden
- 83 -
Material und Methoden
waren. Diese wurden zur Stabilisierung, sowie um eine Veränderung des
Mikromilieus durch Verdunstung zu verhindern, mit Mineralöl (Silicone DC200 fluid,
#35135, Fa. Serva Feinbiochemica, Heidelberg/Deutschland) überschichtet. Vor der
Enukleation wurden die Oozyten stets an den unteren Rand des Tropfens abgelegt.
Von hier aus wurden sie nacheinander mit der Oozytenhaltepipette fixiert und durch
Bewegung des Kreuztisches in die Mitte des Tropfens gebracht, wo die Enukleation
erfolgte.
Die
Oozyte
wurde
unmittelbar
vor
der
Enukleation
an
der
Oozytenhaltepipette ausgerichtet, dass sich der Polkörper direkt unter der äußeren
Begrenzung, in Analogie zu einer Uhr, „auf etwa 5 Uhr„ befand (Abbildung 19). Durch
kurzzeitiges Abdunkeln des Hellfeldes, kombiniert mit einer UV-Licht Bestrahlung der
einzelnen Oozyte, wurde die exakte Lage der Metaphasenplatte ermittelt (Abbildung
20). Die Enukleationspipette wurde dann, in Abhängigkeit zur Position der
Metaphasenplatte, horizontal kurz über dem Polkörper nach links vorgeführt. Damit
wurde die Zona pellucida penetriert und in das Ooplasma eingedrungen, wobei
darauf geachtet wurde, dass das Lumen der Enukleationspipette nur zur Hälfte in
den Ooplasten eindrang und mit der anderen Hälfte im Perivitellarraum verblieb.
Durch Rücknahme der Ölsäule wurden der Polkörper, sowie das angrenzende 1/10
des Ooplasmas, in dem die Metaphasenplatte lokalisiert worden war, aspiriert
(Abbildung 21). Durch erneutes Betrachten von Oozyte und entnommenem
Zytoplasma unter UV-Licht, wurde im positiven Fall die erfolgreiche Enukleation
sämtlicher Kern DNA festgestellt (Abbildung 22); bei verbliebener DNA innerhalb der
Oozyte galt die Enukleation als nicht gelungen. Enukleierte Oozyten wurden zum
oberen Rand des Tropfens befördert, bei einem Fehlschlag jedoch an den rechten
Rand. So war es jederzeit möglich die Oozyten zu differenzieren. Im Anschluss
wurden die enukleierten Oozyten zweimal in einem Tl-Hepes 296 Tropfen
gewaschen, wo sie bis zum Kerntransfer aufbewahrt wurden.
Material und Methoden
- 84 -
Abbildung 19: Ausrichtung der Metaphase II - arretierten Oozyte mit Polkörper auf „5 Uhr“
Abbildung 20: Bestrahlung mit UV-Licht zur Lokalisation der Metaphasenplatte
Fluoreszenz der
Metaphasenplatte
Fluoreszenz der
DNA des Polkörpers
(fluoreszierende DNA von Metaphasenplatte und Polkörper befinden sich in der Oozyte)
- 85 -
Material und Methoden
Abbildung 21: Aspiration von Polkörper und angrenzendem Zytoplasma
Abbildung 22: Bestrahlung mit UV-Licht zur Überprüfung der erfolgreichen Enukleation
Metaphasenplatte
PolkörperDNA
(fluoreszierende DNA von Metaphasenplatte und Polkörper befinden sich im Pipettenlumen)
- 86 -
Material und Methoden
3.5.4 Durchführung des Kerntransfers
Vor Durchführung des Kerntransfers wurde die Enukleationspipette durch eine
Kerntransferpipette ersetzt. Auf dem Objektträger wurden vier ölüberschichtete
Tropfen von 75 µl Volumen in vertikaler Linie aufgebracht. Im obersten und dritten
Tropfen war Tl-Hepes296 Ca-free Medium, das mit mit 7,5 µg/ml Cytochalasin B
supplementiert worden war. In diesen Tropfen befanden sich auch die enukleierten
Oozyten. Der zweite und vierte Tropfen bestand aus einer Suspension von porzinen
fetalen Fibroblasten in Tl-Hepes296 Ca-free Medium. Im ersten Schritt tauchte die
Kerntransferpipette in einen Tropfen mit porzinen fetalen Fibroblasten ein (Abbildung
23) und nahm durch Zurücknehmen der Ölsäule über die Bedieneinheit einzelne
Fibroblasten auf (Abbildung 24). Hierbei wurden morphologisch intakt erscheinende
möglichst kleine Fibroblasten mit glatter Oberfläche ausgewählt. Im zweiten Schritt
tauchte die so befüllte Kerntransferpipette in den Oozyten-Tropfen, wo sich 10-15
Oozyten befanden, die für 15-20 Minuten in Tl-Hepes296 Ca-free, supplementiert mit
7,5 µg/ml Cytochalasin B, präinkubiert worden waren. Die Oozytenhaltepipette, die
schon zur Enukleation benutzt worden war, fixierte die einzelne Oozyte (Abbildung
25). Durch Scharfstellen der Äquatorialebene der entkernten Oozyte am Mikroskop,
wurde die Zona pellucida dargestellt. Anschliessend wurde die Kerntransferpipette
über die elektrische Bedieneinheit in die gleiche Ebene gebracht. Durch horizontales
Vorführen der Kerntransferpipette nach links wurde die Zona pellucida penetriert
(Abbildung 26). Hierbei wurde die Kerntransferpipette soweit vorgeschoben, bis sich
der Anschliff der Pipette vollständig im Perivitellarraum befand (Abbildung 27). Durch
Vorschieben der Ölsäule über die Bedieneinheit wurde ein einzelner Fibroblast im
Perivitellarraum abgesetzt (Abbildung 28). In Analogie zur Enukleation wurden
erfolgreich rekonstruierte Komplexe am oberen Rand des Tropfens abgelegt, die
anderen an den rechten Rand des Tropfens. Im Anschluss wurden die Oozyten
zweimal in Tl-Hepes 296 Tropfen gewaschen, wo sie bis zur Fusion verblieben.
Material und Methoden
Abbildung 23: Auswahl eines abgerundeten Fibroblasten mit glatter Oberfläche
Abbildung 24: Aufnahme eines geeigneten Fibroblasten in die Kerntransferpipette
- 87 -
- 88 -
Material und Methoden
Abbildung 25: Ausrichtung der enukleierten Oozyte für die Überführung des Fibroblasten
Abbildung 26: Penetration der Zona pellucida mit der Kerntransferpipette
Material und Methoden
Abbildung 27: Korrekte Positionierung der Kerntransferpipette im subzonalen Spalt
Abbildung 28: Absetzen des Fibroblasten im subzonalen Spalt
- 89 -
- 90 -
Material und Methoden
3.6 Fusion
3.6.1 Aufbau der Fusionseinheit
Die Fusionseinheit bestand aus einem Stereomikroskop (Leica DM IRB, Fa. Leica
Microsystems Wetzlar/Deutschland) und zwei mechanischen Mikromanipulatoren
(#11520138, Fa. Leica Microsystems, Wetzlar/Deutschland), die rechts und links vom
Mikroskop positioniert waren. Jeder mechanische Mikromanipulator fasste über eine
Fixiervorrichtung jeweils eine Stabelektrode, die mit einem der beiden Pole einer
Spannungsquelle
(Multiporator®,
Fa.
Eppendorf
AG,
Hamburg/Deutschland)
verbunden war. Beide Mikromanipulatoren wurden so ausgerichtet, dass die freien
Enden der Elektroden, in einem Abstand von ca. 200 µm, auf den Boden einer
Petrischale (Ø90 mm, Fa. Greiner Labortechnik, Frickenhause/Deutschland)
einander zugewandt aufsetzten. Der Manipulationstropfen aus SOR2 Ca-free war zur
Stabilisierung, sowie zur Aufrechterhaltung des Mikromilieus, mit Mineralöl (Silicone
DC200 fluid, #35135, Fa. Serva Biochemica, Heidelberg/Deutschland) überschichtet.
Abbildung 29 verdeutlicht die Ausrichtung der beiden Elektroden makroskopisch,
Abbildung 30 zeigt die mikroskopische Ausrichtung eines Fibroblasten-OozytenKomplexes zwischen den beiden Enden der Stabelektroden.
- 91 -
Material und Methoden
Abbildung 29: Makroskopische Anordnung von Fusionselektroden und Fusionstropfen
3.6.2 Durchführung der Fusion
Durch Anstoßen mit den Enden der
Stabelektroden,
vermittelt
über
die
Bewegungen der beiden mechanischen
Mikromanipulatoren, wurde jeder einzelne Fibroblasten-Oozyten-Komplex (im
+
Fibroblast
Oozyte
-
folgenden nur Komplex genannt) so
ausgerichtet, dass sich die Berührungstangente zwischen Fibroblast und Oozyte im rechten Winkel zum elektrischen
Feldvektor befand. Danach wurden die
Elektrodenenden
dem
Komplex
von
beiden Seiten angenähert (Abbildung
Abbildung 30: Mikroskopische Ausrichtung
30). Nach Ausrichtung wurde jeder
eines Fibroblasten-Oozyten-Komplexes zwi-
Komplex
schen den Enden der Fusionselektroden
einzeln
einem
elektrischen
- 92 -
Material und Methoden
Feld von 10 Volt DC über 99 µs ausgesetzt. Hierbei wurden stets 10-12 Komplexe,
die zuvor für zwei Minuten in einem Öl überschichtetem SOR2 Ca-free Tropfen
äquilibriert worden waren, gleichzeitig in den Fusions-Tropfen verbracht. Im
Anschluss an den Fusionspuls wurden die Komplexe nach zweimaliger Waschung in
35 µl große Einzeltropfen aus Tl-Hepes296 Medium überführt. Diese Tropfen
verblieben, nur durch die Fusionsbeurteilung unterbrochen, bis zur Aktivierung bei
38,5 °C im Wärmeschrank.
3.6.3 Bestimmung der Fusionsrate
Der Erfolg der Fusion wurde frühestens 30 Minuten nach Fusionspuls durch
morphologische Beurteilung unter einem Stereomikroskop (Olympus SZ-PT, FaOlympus optical CO., Japan) festgestellt. Hierbei wurde der jeweilige Komplex durch
Ansaugen und Auspressen von Flüssigkeit mit einer Oozytentransport-Pipette
gedreht. Entwicklungsfähig erscheinende Komplexe, deren Perivitellarraum weder
einen intakten, noch einen lysierten Fibroblasten enthielt, wurden als „fusioniert“
definiert, während lysierte Komplexe, unabhängig vom Fusionsstatus als „lysiert“
angesehen wurden. Die Lagerung der Komplexe in Einzeltropfen war hierbei die
Voraussetzung für eine spätere Identifizierung.
3.7 Artifizielle Aktivierung
Für die artifizielle Aktivierung porziner Oozyten wurden folgende 2 Methoden
angewendet: Aktivierung durch einen einzelnen elektrischen Impuls im elektrischem
Feld und Aktivierung durch einen elektrischen Impuls gefolgt von einer 3 stündigen
Inkubation mit dem Proteinkinaseinhibitor 6-Dimethylaminopurin (6-DMAP, #D-2629,
Fa. SIGMA, St. Louis/USA).
3.7.1 Aufbau der elektrischen Aktivierungskammer
Die Aktivierung im elektrischem Feld erfolgte in einer Bügel-Fusionskammer (Fa.
Krüss, Hamburg), in der 2 Platin-Iridium Drähte mit einem Durchmesser von 200 µm
- 93 -
Material und Methoden
in einem Abstand von 230 µm, unmittelbar einer Glasscheibe aufliegend, parallel
angeordnet waren (Abbildung 31). Mit diesen beiden Elektrodendrähten war ein
elektrisches Fusionsgerät (CFA 400, Elektro Zellfusion, Fa. Krüss, Hamburg)
verbunden. Als Medium während der Aktivierung diente SOR2 Medium, von dem 400
µl tropfenförmig auf die Glasscheibe in der Aktivierungskammer aufgetragen wurden.
Abbildung 31: Bügel-Fusionskammer zur artifiziellen Aktivierung porziner Oozyten und
rekonstruierter Kerntransfer-Komplexe
3.7.2 Aktivierung im elektrischen Feld
Jeweils 20 Oozyten wurden unmittelbar vor der elektrischen Aktivierung für 2
Minuten in SOR2 Medium präinkubiert, bevor sie gleichzeitig zwischen die
Elektrodendrähte
der
Aktivierungskammer
gebracht
wurden.
Bei
einem
Pulslängenintervall von 45 µs wurden in den parthenogenetischen Modellversuchen
0,8-1,75 KV/cm DC angelegt, während die fusionierten Kerntransferkomplexe für ein
Zeitintervall von 45 µs einem Puls von 1,0 KV/cm DC ausgesetzt wurden.
Material und Methoden
- 94 -
3.7.3 Aktivierung durch Proteinkinase-Inhibierung
NCSU23 Medium wurde in einer Konzentration von 2 mM mit 6-DMAP (6Dimethylaminopurin) versetzt. Hierzu wurde 6-DMAP in einer Konzentration von
122,5 mM in DMSO gelöst. Davon wurden 24,42 µl in Eppendorf Cups (Micro Test
Tubes, Safe Lock 1,5 ml, Fa. Eppendorf, Hamburg/Deutschland) aliquotiert und
eingefroren. Bei Bedarf wurde ein Cup mit 1,5 ml NCSU23 aufgefüllt, und hiervon
jeweils 500 µl in die Vertiefungen einer Zellkulturschale (NUNCLON™,#176740, Fa.
Brand Products, Dänemark) gegeben, so dass letztlich eine Konzentration von 2 mM
resultierte. Oozyten, die dieser Aktivierung unterzogen wurden, wurden einmal in
einer solchen Vertiefung gewaschen, und verblieben dann für drei Stunden in einer
zweiten Vertiefung. Für diese Zeitspanne wurde die Zellkulturschale bei 38,5°C und
5% CO2, sowie feuchtigkeitsgesättigter Atmosphäre, im Brutschrank aufbewahrt.
3.8 In-vitro-Entwicklung porziner Embryonen
3.8.1 In-vitro-Kultur porziner Embryonen
Die Weiterkultivierung der aktivierten Oozyten erfolgte für einen Zeitraum von 168
Stunden in einem Brutschrank (Function Line, Typ BB16, Fa.Heraeus Instruments,
Hanau/Deutschland) bei 38,5°C und 5% CO2 in feuchtigkeitsgesättigter Luft. Hierzu
wurden
die
Oozyten
in
den
Vertiefungen
einer
Zellkulturschale
(NUNCLON™,#176740, Fa. Brand Products, Dänemark) gelagert, die jeweils mit 500
µl Kulturmedium befüllt waren. Je nach Versuchsstadium kamen zwei verschiedene
Kulturprotokolle zum Einsatz: Die parthenogenetischen „Modell-Embryonen“ wurden
entweder dreiphasig, d.h. für 48 h Kultur in CR2 Medium, gefolgt von 24 h Kultur in
NCSU23 und 96 h Kultur in NCSU23+10% FCS (Fetal Calf Serum), kultiviert, oder
einphasig für 168 Stunden in NCSU23 Medium. Kerntransfer-Embryonen wurden in
allen Versuchen einphasig in NCSU23 kultiviert.
- 95 -
Material und Methoden
3.8.2 Beurteilung der In-vitro-Entwicklung porziner Embryonen
Die Beurteilung der In-vitro-Entwicklung der porzinen Embryonen erfolgte am Tag 7
nach Aktivierung (nach ca.168 Stunden In-vitro-Kultur).
3.8.2.1 Bestimmung der Blastozystenrate
Für jeden einzelnen Embryo wurde nach 168 h In vitro Kultur ermittelt, ob er die
morphologischen Kriterien des Blastozystenstadiums aufwies. Die Zahl der als
Blastozyste eingestuften Embryonen wurde durch die Gesamtzahl der kultivierten
Embryonen geteilt und das Ergebnis als Blastozystenrate definiert
3.8.2.2 Bestimmung der Kernzahlen der einzelnen Embryonen
Nach DNA Färbung mit Hoechst 33342 wurden die Embryonen zwischen einem
Objektträger
(Microscope
Slides,
76x26
mm,
Fa.
Menzel-Gläser,
Braunschweig/Deutschland) und einem Deckgläschen (24x32 mm, Fa. MenzelGläser, Braunschweig/Deutschland), das durch beidseitig aufgesetzte Vaselinestege
(Riedel,
16415)
auf
Abstand
gehalten
wurde,
fixiert.
Unter
einem
Fluoreszenzmikroskop (Olympus Bx60F-3, Fa. Olympus Optical CO., Japan) mit
integrierter UV-Dampfleuchte (Modell U-ULS100HG, Fa. Olympus Optical CO.,
Japan) wurde dann für jeden einzelnen Embryo die Anzahl fluoreszierender
Zellkerne ermittelt.
3.8.2.3 Bestimmung der Teilungsrate
Alle Embryonen die zwei oder mehr Zellkerne aufwiesen wurden retrospektiv als
„geteilt“ eingestuft. Die Anzahl der als geteilt eingestuften Embryonen wurde durch
die Gesamtzahl der kultivierten Embryonen geteilt und das Ergebnis als Teilungsrate
definiert. Ermittelt wurde die Teilungsrate frühestens 48 Stunden nach Aktivierung.
3.8.2.4 Bestimmung der Durchschnitts-Kernzahl pro Blastozyste
Die Kernzahlen aller Blastozysten wurden addiert und durch die Gesamtzahl der
ausgewerteten Blastozysten geteilt. Das Ergebnis wurde als durchschnittliche
Kernzahl pro Blastozyste definiert.
Material und Methoden
- 96 -
3.9 In-vivo-Entwicklung porziner Kerntransfer-Embryonen
Bis zum eigentlichen Embryotransfer wurden die rekonstruierten Embryonen bis zu 2
Stunden in einem Brutschrank (Nuaire Nu 2700 E, Fa. Zapf Instrumente, Sarstedt),
bei 38,5°C und 5% CO2 in feuchtigkeitsgesättigter Luft, in 500 µl NCSU23
Kulturmedium aufbewahrt.
3.9.1 Synchronisation der Empfängertiere
Als Empfängertiere für die chirurgische Embryonenübertragung dienten ca. 90 kg
schwere,
präpuberale,
mindestens
fünf
Monate
alte,
geschlechts-
und
allgemeingesunde Jungsauen der deutschen Landrasse aus institutseigener Zucht.
Zur Ovulationsinduktion erhielten die Tiere 117 h vor dem Embryotransfer jeweils
eine
intramuskuläre
Injektion
von
800-1500
I.E.
eCG
(equine
Chorionic
Gonadotropin) Gonadotropin, Intergonan®, Fa. Intervet. Tönisvorst) und 72 h später
eine intramuskuläre Injektion von 500 I.E. hCG (human Chorionic Gonadotropin,
Ovogest®, Fa. Intervet, Tönisvorst). Zu jedem Embryotransfertermin wurden zwei bis
drei Jungsauen nach beschriebenem Muster synchronisiert, wobei am Vorabend und
am Morgen des Embryotransfertages Rauschekontrollen durchgeführt wurden.
Embryonen wurden nur auf Jungsauen übertragen, die spätestens am Morgen des
Embryotransfertages
„in
Rausche
standen“,
und
deren
Ovarien
mehrere
Ovulationsstellen aufwiesen.
3.9.2 Transfer porziner Kerntransfer-Embryonen im Zygotenstadium
Spätestens zwei Stunden nach Abschluss der Aktivierung wurden die Oozyten aus
dem Brutschrank entnommen, dreimal in vorgewärmtem Tl-Hepes296 Medium
gewaschen und anschließend in zwei sterile Plastik-Straws (Paillette Cristal 133, Ref
ZA 176, L’Aigle, France) aufgezogen. Das untere Ende der Straws war mit ca. 7 mm
langen Schlauchstücken aus weichem Kunststoff überzogen, um beim Einführen in
die Eileiter eine Traumatisierung zu vermeiden. Bis zum Embryotransfer, sowie
während des Transportes zum Operationsraum, wurden die Straws in einem auf
38°C erwärmten mit Stahlkugeln gefülltem Thermogefäß (Embryo Gefäß, MT 35/42,
- 97 -
Material und Methoden
Minitüb GmbH, 8311 Tiefenbach) aufbewahrt. Die Übertragung der Embryonen
wurde chirurgisch vorgenommen. Hierzu wurden die Empfängertiere durch eine
intramuskuläre Injektion mit Azaperon (Stresnil®, Janssen-Cilag GmbH, Neuss)
vorbehandelt, das Toleranzstadium der Narkose wurde anschließend durch
intravenöse Injektion von Thiamylal (Surital®, Fa. Pharmacia & Upjohn, Erlangen)
eingeleitet und aufrechterhalten. Zur Operation wurden die Empfängertiere in
Rückenlage auf einem Operationstisch fixiert. Zwischen den beiden letzten
Zitzenpaaren in der Linea alba wurde die Bauchhöhle eröffnet. Der Uterus wurde
aufgesucht, ein Uterushorn mit Ovar vorgelagert, und die Zahl der Ovulationsstellen
ermittelt. Bei ausreichender Anzahl wurde der Straw vorsichtig über den
Fimbrientrichter in den Eileiter eingeführt und die Embryonen dort vorsichtig
abgesetzt. In gleicher Art und Weise wurde mit dem zweiten Straw und dem anderen
Uterushorn
verfahren.
Während
der
Vorlagerung
wurden
die
inneren
Geschlechtsorgane durch regelmäßiges Benetzen mit körperwarmer physiologischer
Kochsalzlösung vor Austrockung geschützt. Nach vollständiger Übertragung aller KTEmbryonen wurden Ovarien und Uterus reponiert und die Bauchhöhle mit BauchfellMuskel-, Unterhaut- und Hautnaht, unter Verwendung von Catcut (Catcut chrom., 6metric, Fa. B. Braun Surgical GmbH, Melsungen), verschlossen. Jedes Tier erhielt
anschließend eine systemische Antibiose (Tardomyocel® comp II, Fa. Bayer
Leverkusen).
3.9.3 Aufrechterhaltung der Trächtigkeit
Zur Erhöhung der intrauterinen Östradiol-17ß Synthese an den Tagen 11-14 durch
akzessorisches Follikelwachstum, und nachfolgend der Anzahl endokrin aktiver
Gelbkörper, erhielt jedes Empfängertier an Tag 9 nach Embryotransfer eine
intramuskuläre Injektion von 1000 I.E. eCG (equine Chorionic Gonadotropin,
Intergonan®, Fa. Intervet. Tönisvorst) und 72 h später eine intramuskuläre Injektion
von 500 I.E. hCG (human Chorionic Gonadotropin, Ovogest®, Fa. Intervet,
Tönisvorst).
- 98 -
Material und Methoden
3.9.4 Beurteilung der In-vivo-Entwicklungsfähigkeit
Die Beurteilung des In-vivo-Entwicklungspotentials der porzinen KT-Embryonen
erfolgte durch sonographische Untersuchung auf Trächtigkeit an den Tagen 26, 33
und 77 nach Transfer mit Hilfe eines Real-time Ultraschallgerätes (Modell CS 9100,
Fa. Picker International GmbH, Espelkamp). Die Geburtsgewichte der Ferkel wurden
ermittelt und deren weitere Lebensfähigkeit dokumentiert. Verstorbene Ferkel
wurden zur pathologischen Untersuchung dem Pathologischem Institut der
Tierärztlichen Hochschule Hannover übergeben.
3.10 Nachweis genetischer Identität der geborenen Ferkel
Der Nachweis der genetischen Identität der aus geklonten Embryonen geborenen
Ferkel und der Ausschluss des Empfängertieres als genetische Mutter, erfolgte durch
eine Abstammungskontrolle mittels DNA-Marker. Hierzu wurden die VNTR’s
(Variable Number of Tandem Repeats) an zwölf verschiedenen hochpolymorphen
Mikrosatellitenloci (zur Übersicht siehe Tabelle 10) ausgewertet. Probenmaterial der
Zellkultur, aus der die Spenderzellen für den Kerntransfer stammten, des
Trägertieres und der Ferkel wurden entnommen und für jeden Microsatellitenlocus
mittels Polymerase Chain Reaction (PCR) amplifiziert (Mastercycler, Fa. EppendorfNetheler-Hinz GmbH, Hamburg). Auftrennung und Längenbestimmung der PCRProdukte erfolgten mit einem automatischem Sequenziergerät (LI-COR,DNASequenzer Modell 4000l, Fa. MWG-BIOTECH) in einem Polyacrylamidgel (6%,
rotiphorese® Gel 40, #3030.1, Fa. Roth+Co., Karlsruhe). Die Auswertung der
Elektrophorese Gele erfolgte mit Hilfe des Programms „RFLPscan®, Version 3.5“.
Alle Arbeitsschritte für die Abstammungskontrolle wurden vom Labor Dr. Steffen
Weigend (Fachbereich Genetik) durchgeführt.
- 99 -
Material und Methoden
Tabelle 10: Übersicht über die für den Abstammungsnachweis eingesetzten Mikrosatelliten
Chromosomen
Länge
Mikrosatellit
(Nr.)
(Basenpaare)
Literaturreferenz
CGA
1
263-318
MORAN 1993
S0002
3
169-216
S0068
13
226-260
S0178
8
106-120
S0090
12
244-251
S0101
7
197-216
SW122
6
95-119
SW632
7
159-180
SW911
9
147-196
SW951
10
120-132
SW857
14
138-161
SW936
15
81-116
FREDHOLM et al. 1993
ELLENGREN et al. 1993
ELLENGREN et al. 1994
ROHRER et al. 1994
3.11 Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung erfolgte mit Hilfe des Programms „Sigma Stat for
Windows®“ (Jandel Scientific Cooperation, Erkrath). Dazu wurde zunächst für jeden
einzelnen Versuchsdurchgang der prozentuale Anteil an fusionierten Komplexen,
geteilter Zygoten, unterschiedlicher Entwicklungsstadien, sowie der Blastozysten, für
jede Versuchsgruppe ermittelt. Nach mehreren Versuchsdurchgängen wurden
arithmetischer Mittelwert ( x ) und Standardabweichung (±SD) für die einzelnen
Entwicklungsstadien und für die jeweiligen Versuchsgruppen errechnet. Bei
gegebener Normalverteilung (Kolmogorov-Smirnov-Test mit Lilliefor-Korrektur) und
gleicher Varianz (Levene-Median-Test) der einzelnen Entwicklungsraten (%), wurde
die Signifikanz mittels ANOVA (Tukey Test) berechnet. Unterschiede zwischen den
Gruppen galten ab einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,05 als signifikant und
ab einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,001 als hochsignifikant.
Material und Methoden
- 100 -
3.12 Versuchsaufbau
Eine Übersicht über die durchgeführten Versuche ist Abbildung 32 zu entnehmen.
Abbildung 32: Schematischer Überblick über den 3-phasigen Versuchsaufbau
Parthenogenetische Embryonen
Kerntransfer-Embryonen
2. Phase
1. Phase
Bestimmung
In-vitro-Entwicklung
der Maturationsrate
Wahl eines elektr.
Aktivierung
Aktiverungsfeldes
durch Fusionspuls
Wahl eines
Auswahl eines
Kulturmediums
Arbeitsmediums
Wahl der Osmolarität
des Arbeitsmediums
Optimierung der arti-
Auswahl eines
fiziellen Aktivierung
Fusionsmediums
Wahl der Maturationsdauer
hinsichtlich Fusionsrate und In-vitro-Entwicklung
In-vivo-Entwicklung
3. Phase
Bestimmung der
In-vivo-Entwicklung
Bestimmung der
genetischer Identität
- 101 -
Ergebnisse
4 Ergebnisse
Alle Versuche fanden im Zeitraum von März 2002 - März 2003 statt. Die Ergebnisse
beziehen
sich
auf
Untersuchungen
zum
Entwicklungsverhalten
von
parthenogenetischen und Kerntransfer-Embryonen nach Fusionierung, Aktivierung
und
In-vitro-Kultur.
Hierzu
wurden
in
vitro
gereifte
porzine
Oozyten
als
Ausgangsmaterial benutzt. Der gesamte Versuchsaufbau gliederte sich in drei
Phasen: In der 1. Versuchsphase wurde mit den Erkenntnissen aus zahlreichen
Modellversuchen zur parthenogenetischen Entwicklung ein Kerntransfer-Protokoll
entwickelt,
das
die
Grundlage
für
die
Mikromanipulation
in
der
zweiten
Versuchsphase darstellte. Insbesondere sollte die Entwicklungsfähigkeit der Oozyten
während einer 7,5 stündigen Verweildauer außerhalb des Brutschrankes, dem
Zeitraum, der insgesamt für die Konstruktion der Kerntransfer-Embryonen benötigt
wird, aufrechterhalten werden. Darüber hinaus sollte eine vorzeitige spontane
Aktivierung der Oozyten verhindert werden, um die Oozyten zu einem definierten
Zeitpunkt hocheffizient aktivieren zu können. In der 2. Versuchsphase wurde das
Kerntransfer-Protokoll auf die Erzeugung von Kerntransfer-Embryonen übertragen
und hinsichtlich der In-vitro-Entwicklung porziner Kerntransfer-Embryonen optimiert.
Der Schwerpunkt dieser Versuchsphase lag in der Entwicklung eines effizienten
Fusionsprotokolls, sowie der Identifikation weiterer Parameter, die die In vitro
Entwicklung positiv beeinflussen können. In der 3. Versuchsphase wurde das
optimierte Kerntransfer-Protokoll auf das In-vivo-Entwicklungspotential in vitro
erzeugter porziner Kerntransfer-Embryonen überprüft.
Ergebnisse
- 102 -
4.1 Entwicklung eines Kerntransferprotokolls
In dieser Versuchsphase sollten durch die Auswertung mehrere Experimente zur Invitro-Entwicklung porziner parthenogenetischer Embryonen erfolgsbeeinflussende
Parameter identifiziert werden. Die Erkenntnisse dieser Versuche sollten die
Grundlagen für die Entwicklung eines Kerntransfer-Protokolls bilden.
4.1.1 Bestimmung der Reifungsrate
Durchschnittlich 71% (71,0 ± 7,8%) der eingesetzten Oozyten hatten 44 h nach
Reifungsbeginn die Metaphase der 2. meiotischen Reifeteilung erreicht und wurden
als erfolgreich gereift eingestuft. In 13 Durchläufen wurden von allen Oozyten, die für
44 h in vitro maturiert und anschließend entkumuliert worden waren, 20 Oozyten als
Kontrollstichprobe
mit
Hoechstfarbstoff
Fluoreszenzmikroskop
morphologisch
unmittelbarer
zur
Nähe
DNA
angefärbt
ausgewertet.
des
und
Oozyten,
Polkörpers
unter
bei
einem
denen
intraooplasmatisch
in
eine
Metaphasenplatte abgegrenzt sichtbar war, und die frei von intraooplasmatisch
verstreuten
DNA-Bestandteilen
waren,
wurden
dem
Metaphase-II
Stadium
zugeordnet.
4.1.2 Auswahl des elektrischen Feldes zur Aktivierung
In diesem Versuchsteil wurde überprüft, welche elektrische Feldstärke bei gegebener
Impulsdauer nach der Aktivierung die höchste parthenogenetische Entwicklungsrate
zur Blastozyste erlaubt. Hierzu wurden für 44 h gereifte Oozyten zufällig auf
verschiedene Gruppen verteilt und dann, je nach Gruppe, bei konstanter Impulslänge
(45 µs), einem elektrischem Feld von 0,8-1,75 KV/cm DC ausgesetzt. Nach 7 Tagen
In vitro Kultur im dreiphasigen Kultursystem (CR2, NCSU23, NCSU23+ FCS) wurde
die weitere Entwicklung bestimmt. Für die Versuche standen in 7 Durchgängen
insgesamt 1467 Oozyten zur Verfügung, wobei jeweils 49-67 Oozyten auf insgesamt
25 Versuchsgruppen verteilt wurden. In Tabelle 11 sind die Entwicklungsraten für die
verschiedenen Feldstärken dargestellt.
- 103 -
Ergebnisse
Tabelle 11: Einfluß der elektrischen Feldstärke auf die parthenogenetische In-vitro-Entwicklung
porziner MII-Oozyten ( x ±SD)
Elektrische Feldstärke (KV/cm)
0, 8
1,0
1,25
1,5
1,75
Durchgänge (n)
n=4
n=7
n=7
n=6
n=1
Gesamt (n)
241
412
412
344
58
64,6 a
72,9 a
60,5 a
25,9 b
13,8 b
± 10,5
± 6,1
± 9,0
± 14,4
25,8 a
29,6 a
12,9 b
4,3 b
± 3,5
± 5,3
± 4,7
± 4,8
22,5
20,3
18,5
17,2
± 3,0
± 4,5
± 2,9
± 6,7
Teilungsrate (%)
Blastozystenrate (%)
Zellkerne/ Blastozyste (n)
0,0 b
(ANOVA, Tukey Test: a:b < 0,05)
Signifikante Unterschiede zeigten sich in Abhängigkeit zum eingesetzten elektrischen
Feld: Feldstärken über 1,25 KV/cm reduzierten die Teilungsrate signifikant,
wohingegen Feldstärken über 1,0 KV/cm die Blastozystenrate signifikant senkten.
Die
höchsten
Blastozystenraten
(29,6
±
5,3
%)
resultierten
aus
einem
Aktivierungspotential von 1,0 KV/cm. In der durchschnittlichen Kernzahl pro
Blastozyste gab es zwischen den verschiedenen Gruppen keine signifikanten
Unterschiede. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde für alle weiteren Versuche zur
Aktivierung eine elektrische Feldstärke von 1,0 KV/cm eingesetzt.
4.1.3 Auswahl eines geeigneten Kulturmediums
In diesem Versuchsteil wurden 2 verschiedene Kultursysteme auf ihre Eignung, eine
möglichst weitreichende parthenogenetische In-vitro-Entwicklung zu gewährleisten,
untersucht. Verglichen wurden hierbei die einphasige Kultur in NCSU23 Medium und
das dreiphasige Kultursystem in CR2-, NCSU23- und NCSU23+ FCS Medium. Dazu
wurden in 8 Durchgängen insgesamt 940 Oozyten, die für 44 h maturiert waren,
durch ein elektrisches Feld (1,0 KV/cm DC für 45 µs) parthenogenetisch aktiviert und
Ergebnisse
- 104 -
zufällig auf die beiden Kultursysteme in Gruppengrößen von 46-63 aufgeteilt. Die
Beurteilung der parthenogenetischen Entwicklung erfolgte nach 7 Tagen; die
genauen Entwicklungsraten dieses Experiments sind in Tabelle 12 dargestellt.
Tabelle 12: Einfluss des Kulturmediums auf die In-vitro-Entwicklung porziner Embryonen nach
parthenogenetischer Aktivierung ( x ± SD)
NCSU23
CR2 / NCSU23 / NCSU23 + FCS
(einphasig)
(dreiphasig)
Durchgänge (n)
n=8
n=8
Gesamt (n)
474
466
62,9 a
54,7 b
± 8,6
± 5,9
31,3
25,2
± 9,2
± 4,5
29,0
30,0
± 7,2
± 8,4
Kulturmedien
Teilungsrate (%)
Blastozystenrate (%)
Zellkerne/ Blastozyste (n)
(ANOVA, Tukey Test: a:b <0,05)
Mit einer durchschnittlichen Teilungsrate von 62,9 ± 8,6% war die einphasige
Embryonenkultur in NCSU23 Medium dem mehrphasigem Kultursystem (54,7 ±
5,9%) signifikant überlegen. Bei den Blastozystenraten zeigten sich keine
signifikanten Unterschiede (31,3 ± 9,2% vs. 25,2 ± 4,5%). Aufgrund der Ergebnisse
dieses Versuchs wurden die Embryonen in allen nachfolgenden Versuchen
einphasig für 7 Tage in NCSU23 Medium kultiviert.
4.1.4 Auswahl eines geeigneten Arbeitsmediums
In diesem Versuchsabschnitt wurde ermittelt, welches der beiden Hepes gepufferten
Arbeitsmedien, Tl-Hepes271 Ca-free oder Hb-NCSU, während einer 7,5 stündigen
Verwahrungszeit, dem Zeitraum, der für die Mikromanipulation nötig ist, am besten
das Entwicklungspotential der nicht aktivierten Oozyten erhalten kann. Zu diesem
- 105 -
Ergebnisse
Zweck wurden 44 h gereifte Oozyten entkumuliert und in Gruppen zu 49-68 Oozyten
zufällig auf die beiden Arbeitsmedien verteilt. Dort verblieben die Oozyten für 7,5 h
und wurden anschließend im elektrischem Feld (1,0 KV/cm DC für 45 µs) aktiviert.
Nach
7
tägiger
Kultur
wurde
retrospektiv
die
Entwicklung
von
794
parthenogenetischen Embryonen bestimmt. Tabelle 13 stellt die durchschnittlichen
Entwicklungsraten
aus
7
Versuchsdurchgängen
dar:
Keine
signifikanten
Unterschiede zeigten sich in der Teilungs- (70,8% vs. 64,9%) und Blastozystenrate
(17,6% vs. 15,2%). Allerdings ergaben sich signifikante Unterschiede in der
durchschnittlichen Kernzahl pro Blastozyste. Blastozysten aus der Tl-Hepes271 Cafree Versuchsgruppe besaßen mit durchschnittlich 22,3 ± 5,3 Kernen signifikant mehr
Zellkerne als Blastozysten aus Hb-NCSU23 Arbeitsmedium (18,7 ± 3,2). Aus diesem
Grund wurde Tl-Hepes für alle folgenden Versuche als Basis-Arbeitsmedium
gewählt.
Tabelle 13: Einfluß des Arbeitsmediums auf das Entwicklungspotential parthenogenetischer
porziner Embryonen nach 7,5 stündiger Einwirkzeit ( x ±SD)
Geprüfte Arbeitsmedien
Tl-Hepes271 Ca-free
Hb-NCSU23
Durchgänge (n)
n=7
n=7
Gesamt (n)
385
409
70,8
64,9
±13,7
±6,0
17,6
15,2
±7,0
±3,2
22,3 a
18,7 b
±2,2
±3,2
Teilungsrate (%)
Blastozystenrate (%)
Zellkerne/Blastozyste (n)
(ANOVA, Tukey Test: a:b <0,05)
Ergebnisse
- 106 -
4.1.5 Auswahl einer geeigneten Osmolarität des Arbeitsmediums
In diesem Versuchsabschnitt wurde der Einfluss der Osmolarität im Arbeitsmedium,
dem Oozyten während der Mikromanipulation für ca. 7,5 Stunden ausgesetzt sind,
bestimmt. In 9 Versuchsdurchgängen wurden insgesamt 1716 in vitro gereifte
Oozyten in Gruppengrößen von 57-74 zufällig auf drei Tl-Hepes Medien, die durch
Sucrosezusatz auf 271-, 296- und 321 mOsmol eingestellt worden waren, aufgeteilt.
Nach Ablauf der 7,5 stündigen Einwirkzeit der verschiedenen Arbeitsmedien wurden
die Oozyten in einem elektrischen Feld (1,0 KV/cm DC für 45 µs) aktiviert und für 7
Tage in vitro kultiviert. Tabelle 14 stellt die durchschnittlichen Entwicklungsraten der
parthenogenetischen porzinen Embryonen in Abhängigkeit zur Osmolarität des
benutzten Arbeitsmediums dar.
Tabelle 14: Einfluss der Osmolarität im Arbeitsmedium auf das Entwicklungspotential
parthenogenetischer porziner Embryonen nach 7,5 h Einwirkzeit ( x ±SD)
Tl-Hepes (mOsmol)
Geprüfte Osmolarität
271
296
321
Durchgänge (n)
9
9
9
Gesamt (n)
555
572
589
69,2
74,8
73,7
±5,5
±6,7
±7,7
18,3 a
24,4 b
26,2 b
±6,4
±3,0
±4,3
26,1
27,0
25,9
±2,9
±2,0
±2,2
Teilungsrate (%)
Blastozystenrate (%)
Zellkerne/ Blastozyste (n)
(ANOVA, Tukey Test: a:b <0,05)
Die
Ergebnisse
dieses
Experiments
zeigen,
dass
die
Osmolarität
des
Arbeitsmediums im gewählten Spektrum keinen signifikanten Einfluss auf die
Teilungsrate parthenogenetischer Embryonen ausübte (69,2% vs. 74,8% vs. 73,7%).
Allerdings führten höhere Osmolaritäten im gewählten Spektrum zu signifikant
Ergebnisse
- 107 -
höheren Blastozystenraten (18,3 ± 6,4 vs. 24,4 ± 3,0 vs. 26,2 ± 4,3), wobei es
zwischen den Blastozysten aus den verschiedenen Gruppen bezüglich der
durchschnittlichen Kernzahl keine Unterschiede gab. Aufgrund dieser Ergebnisse
wurde ein Tl-Hepes Arbeitsmedium mit einer Osmolarität von 296 mOsmol (Tl-Hepes
296) zum Basismedium gewählt, um Embryonen außerhalb des Brutschranks
aufzubewahren und zu manipulieren.
4.1.6 Auswahl des optimalen Aktivierungsprotokolls
In dieser Versuchsreihe sollte das am besten geeignete Aktivierungsprotokoll für in
vitro gereifte Schweineoozyten ermittelt werden. Es wurde die Aktivierung mit Hilfe
eines einzelnen elektrischen Feldes (1,0 KV/cm DC für 45 µs) mit einer Aktivierung
im elektrischem Feld gefolgt von einer 3 stündigen Inkubation in 6-DMAP, verglichen.
In 6 Durchgängen standen insgesamt 731 Oozyten zur Verfügung, die zuvor für 43 h
gereift worden waren. Sie verblieben bis zur Aktivierung für 7,5 h in Tl-Hepes296
Medium, was der Zeitdauer entspricht, die bei der Erzeugung der KerntransferEmbryonen für die Mikromanipulation benötigt wird. Nach zufälliger Aufteilung in zwei
Gruppen und elektrischer Aktivierung wurde eine der Gruppen zusätzlich für drei
Stunden in NCSU23 Medium, supplementiert mit 6-DMAP, inkubiert. Tabelle 15 zeigt
die Entwicklungsraten nach 7-tägiger Kultur in NCSU23-Medium.
Ergebnisse
- 108 -
Tabelle 15: Einfluss des Aktivierungsregimes auf die In-vitro-Entwicklung parthenogenetischer
porziner Embryonen ( x ±SD)
Aktivierungsprotokoll
Elektrischer Impuls
Elektrischer Impuls
(1,0 KV/cm für 45 µs)
(1,0 KV/cm für 45 µs)
+ 6-DMAP (3 h)
Durchgänge (n)
n=6
n=6
Gesamt (n)
360
371
74,9
71,8
±12,0
±8,0
40,4 a
26,5 b
±10,5
±8,1
22,7
20,6
±3,1
±2,1
Teilungsrate (%)
Blastozystenrate (%)
Zellkerne/ Blastozyste (n)
(ANOVA, Tukey Test: a:b <0,05)
Zwischen den beiden Aktivierungsprotokollen zeigten sich keine signifikanten
Unterschiede im Bezug auf die Teilungsrate (74,9 ± 12,2% vs. 71,8 ± 8,1%). Eine
zusätzlichen Aktivierung durch Inkubation mit 6-DMAP führte jedoch zu einer
signifikant höheren Blastozystenrate als nach alleiniger elektrischer Aktivierung (40,4
± 10,5% vs. 26,5 ±8,1%), wobei zwischen den Blastozysten beider Gruppen kein
Unterschied hinsichtlich der Zellzahl bestand (22,7 ± 3,1 vs. 20,6 ± 2,1). Aufgrund
des höheren Entwicklungspotentials nach Aktivierung durch zusätzliche 6-DMAP
Inkubation,
wurde
das
kombinierte
Aktivierungsregime
in
allen
weiteren
Experimenten zur Aktivierung von Kerntransferkomplexen eingesetzt.
4.1.7 Versuche zur Aktivierbarkeit
Um Fusion und Aktivierung der Kerntransferkomplexe zu optimieren, wurden beide
Vorgänge zeitlich voneinander getrennt, denn eine vorzeitige Aktivierung der zu
fusionierenden Komplexe durch den Fusionsvorgang sollte verhindert werden.
- 109 -
Ergebnisse
Deshalb wurden verschiedene Fusionsmedien, in Hinblick auf die Fähigkeit eine
Fusion ohne begleitende Aktivierung einzuleiten, geprüft. In 5 Durchläufen wurden
dafür 908 in vitro gereifte Oozyten in drei verschiedenen Medien (SOR2, SOR2 Cafree und Boquest) einem elektrischen Feld (10 V DC, 99 µs) ausgesetzt, das später
auch zur Fusion von Kerntransferkomplexen eingesetzt werden sollte. Eine vierte
Oozytengruppe („0-Kontrolle“) wurde für einige Minuten in SOR2-Fusionsmedium
aufbewahrt, ohne dass ein elektrisches Feld angelegt wurde. Abbildung 33 stellt die
Aktivierungsraten, bestimmt anhand der Teilungsraten nach 48 Stunden Kultur in
NCSU23-Medium, graphisch dar: Etwa 30% der Oozyten, die dem elektrischem
Fusionsfeld im SOR2 Medium ausgesetzt wurden, teilten sich (29,1 ± 3,5%).
Hochsignifikant weniger Oozyten aus den kalziumfreien Medien (SOR2 Ca-free: 8,9
± 2,7%, Boquest: 6,7 ± 7,6%) und der „0-Kontrolle“ (1,1 ± 1,5%) befanden sich im 2Zellstadium. Für alle Fusionsversuche an Kerntransfer-Embryonen wurden deshalb
ausschließlich SOR2 Ca-free und Boquest-Fusionsmedium verwendet.
Abbildung 33: Einfluß des Fusionsmediums auf die parthenogenetische Aktivierung porziner
MII-Oozyten während der Fusion ( x ±SD)
35
a
Teilungsrate (%)
30
25
20
b
15
bc
10
c
5
0
SOR2
SOR2 Ca-free
(ANOVA, Tukey Test:
Boquest
a:bc < 0,001
0-Kontrolle
b:c < 0,05)
Ergebnisse
- 110 -
4.2 In-vitro-Entwicklung rekonstruierter Kerntransfer-Embryonen
In dieser Versuchsphase wurde das mit Hilfe des „parthenogenetischen Modells“
entwickelte Kerntransfer-Protokoll auf die Erzeugung von Kerntransfer-Komplexen
übertragen. Durch Auswertung von Experimenten zur Fusion und zur In-vitroEntwicklung porziner Kerntransfer-Embryonen, wurden weitere Einflussfaktoren
bestimmt, die die Effizienz der einzelnen Arbeitsschritte im Kerntransferprotokoll und
die In-vitro-Entwicklung porziner Kerntransfer-Embryonen optimierten.
4.2.1 Auswahl eines geeigneten Fusionsmediums
In diesem Versuch wurden zwei Fusionsmedien, das Boquest-Fusionsmedium und
das SOR2 Ca-free Medium, hinsichtlich der Fusionseffizienz überprüft. Für beide
Fusionsmedien
wurden
an
jeweils
4
Versuchstagen
35-52
Fibroblasten-
Oozytenkomplexe einem elektrischem Feld (10 V DC, 99 µs) zwischen zwei
Fusionselektroden ausgesetzt und die Fusionsraten bestimmt. Es zeigte sich, dass
die durchschnittliche Fusionsrate im SOR2 Ca-free Medium signifikant höher war als
im Boquest Fusionsmedium (84,2 ± 5,2% vs. 67,1 ± 6,4%). Dieser Vergleich wird in
Abbildung 34 graphisch dargestellt. In den folgenden Versuchen wurden alle
Fibroblasten-Oozytenkomplexe in SOR2 Ca-free Fusionsmedium (10 V DC, 99 µs)
fusioniert.
- 111 -
Ergebnisse
Abbildung 34: Einfluß des Fusionsmediums auf die Fusionsraten porziner FibroblastenOozyten Komplexe unter ansonsten konstanten Fusionsbedingungen ( x ±SD)
95
90
a
Fusionsrate (%)
85
80
b
75
70
65
60
55
50
SOR2 Ca-free
Boquest
(ANOVA, Tukey Test: a:b < 0,05)
4.2.2 Fusion von Kerntransfer-Embryonen
Zusätzlich zu den vier Durchgängen zur Ermittlung des geeigneteren Fusionsmediums, bei denen insgesamt 193 Fibroblasten-Oozytenkomplexe im SOR2 Cafree Fusionsmedium einem identischem Fusionsfeld zwischen 2 Elektroden
ausgesetzt wurden (10 V DC, 45 µs), wurden bei den im Anschluss stattfindenden
Hauptversuchen unterschiedlich lang gereifte Oozyten verwendet, wobei an 20
Versuchstagen insgesamt 1200 Fibroblasten-Oozytenkomplexe im SOR2 Ca-free
Fusionsmedium fusioniert wurden (10 V DC, 45 µs). Zusammen mit den Versuchen
zur Bestimmung des geeigneten Fusionsmediums, wurden insgesamt 1393
Fibroblasten-Oozytenkomplexe, an insgesamt 24 Versuchstagen, unter identischen
Fusionsbedingungen im SOR2 Medium fusioniert (10 V DC, 45 µs). Die
Fusionseffizienz wurde hierbei nicht signifikant von der Reifungsdauer der Oozyten
beeinflusst (38 h Reifung: 75,0 ± 9,8%, 40 h Reifung: 76,0 ± 9,8%, 42 h Reifung: 83,6
Ergebnisse
- 112 -
± 6,8%, 43 h Reifung: 84,2 ± 6,4%). Wenn die Gruppen 38-40 h Reifung und 42-43 h
Reifung miteinander verglichen wurden, konnte jedoch eine signifikant höhere
Fusionsrate bei den länger maturierten Oozyten (83,8 ± 6,3% vs. 75,5 ± 9,4%)
errechnet werden. Diese Überlegenheit stellt Abbildung 35 in graphischer Form dar.
Abbildung 35: Einfluss der Oozytenreifungsdauer auf die Fusionsraten daraus erstellter porziner Fibroblasten-Oozyten-Komplexe bei ansonsten identischen Fusionsbedingungen ( x ±SD)
100
95
90
85
80
75
70
65
60
55
50
b
Fusionsrate (%)
a
38 – 40 h
Maturation
(n=14)
42 – 43 h
Maturation
(n=10)
(ANOVA, Tukey Test: a:b < 0,05)
4.2.3 In-vitro-Entwicklung von Kerntransfer-Embryonen
In diesem Versuch wurde das Entwicklungspotential rekonstruierter KerntransferEmbryonen ermittelt. In einem 3x3x2 Versuchsmodell wurde der Einfluss der
Oozyten-Reifungsdauer (38 h, 40 h oder 42 h) und der Dauer der Kontaktinhibition
der porzinen fetalen Fibroblasten (24 h, 48 h oder 72 h) untersucht. Bei zwei
Wiederholungen
je
Kombinationsmöglichkeit,
wurden
an
18
Versuchstagen
insgesamt 1475 Oozyten mit einer Effizienz von 78,6% enukleiert; 1113 FibroblastenOozytenkomplexe
konnten
hergestellt
durchschnittlichen
Effizienz
von
78,9%
werden
(95,7%),
fusioniert
werden
die
mit
konnten.
einer
Die
durchschnittliche Blastozystenrate von insgesamt 878 fusionierten und aktivierten
- 113 -
Ergebnisse
Kerntransferkomplexen lag bei 9,8%. Tabelle 16 zeigt die Blastozystenraten
(Mittelwert aus zwei Durchgängen) der einzelnen Kombinationen.
Tabelle 16: Blastozystenrate ( x ) porziner Kerntransfer-Embryonen in Relation zur Dauer der
Oozytenreifung und Kontaktinhibitionsdauer der fetalen Fibroblasten (3 x 3 x 2 Versuch)
fetalen Fibroblasten
Kontaktinhibitionsdauer der
Reifungsdauer der porzinen Oozyten
38 h
40 h
42 h
gesamt
~24 h
8,2%
14,0%
5,1%
9,1%
~48 h
10,0%
14,6%
4,2%
9,6%
~72 h
10,6%
15,9%
5,4%
10,6%
gesamt
9,6%a
14,8%b
4,9%c
9,8%
(Two way ANOVA, Tukey Test:
a:b<0,001
b:c<0,001
a:c<0,05)
Während die Kontaktinhibitionsdauer der fetalen Fibroblasten keinen signifikanten
Einfluss bezüglich der Blastozystenrate aufwies (9,1% vs. 9,6% vs. 10,6%), ließ sich
für die Reifungsdauer der Oozyten ein hochsignifikanter (p<0,001) Einfluss
errechnen (9,6% vs. 14,8% vs. 4,9%). Die beste Entwicklung zeigten KerntransferEmbryonen, die aus 40 h gereiften porzinen Oozyten rekonstruiert wurden (14,8%).
Tabelle 17 stellt die In-vitro-Entwicklung der rekonstruierten Kerntransfer-Embryonen
und ihre „Kontrollgruppen“, in Abhängigkeit zur Reifungsdauer der Oozyten, detailliert
dar.
373
82,4
± 3,9
58,2d
± 10,7
47,5d
± 9,4
24,2b
± 2,7
285
82,7
± 7,1
10,2a
± 2,1
9,6a
± 2,0
17,4a
± 4,2
Gesamt (n)
(ANOVA, Tukey Test:
Zellkerne / Blastozyste (n)
Blastozystenrate (%)
Embryonen > 4 Zellblock (%)
d:abc <0,001
n=6
n=6
Durchgänge (n)
Teilungsrate (%)
Kontrolle
KTKomplexe
38 h
b:ac < 0,001
± 5,8
16,0a
± 1,7
14,8b
± 1,0
18,0b
± 4,3
81,1
279
n=6
KTKomplexe
42 h
± 4,7
17,1a
± 2,1
4,9c
± 3,2
5,7c
± 4,6
86,7
314
n=6
KTKomplexe
a:c< 0,05)
± 4,3
24,3b
± 14,8
44,4d
± 18,7
56,5d
± 9,7
80,0
368
n=6
Kontrolle
40 h
Reifungsdauer
± 4,3
24,3b
± 6,6
44,1d
± 8,7
60,2d
± 7,2
75,8
384
n=6
Kontrolle
Tabelle 17: In-vitro-Entwicklung rekonstruierter porziner Kerntransfer-Embryonen und parthenogenetischer „Kontrollgruppen“ in
Relation zur Reifungsdauer der Oozyten ( x ± SD)
- 114 Ergebnisse
- 115 -
Ergebnisse
Bezogen auf die Reifungsdauer (n=6) war kein signifikanter Einfluss auf die
Teilungsrate (82,7 ± 7,1% vs. 81,1 ± 4,3% vs. 86,7 ± 4,6%) festzustellen. Jedoch war
der Anteil der Blastozystenstadien von Kerntransfer-Komplexen, die aus 40 h
gereiften Oozyten rekonstruiert worden waren (14,8 ± 1,7%), gegenüber den beiden
anderen Gruppen (38 h: 9,6 ± 2,0%, 42 h: 4,9 ± 2,1%) hochsignifikant (p<0,001)
verbessert. Die 38 h Gruppe zeigte gegenüber der 42 h Gruppe eine signifikant
(p<0,05) erhöhte Blastozystenrate. Das gleiche Signifikanzmuster spiegelte sich bei
der relativen Anzahl an Kerntransfer-Embryonen, die den 4-Zellblock überwand
(mehr als 8 Zellkerne), wieder (10,2 ± 2,1% vs. 18,0% ± 1,0 vs. 5,7% ± 3,3). Von
Abbildung 36 bis Abbildung 39 sind Entwicklungsstadien verschiedener KerntransferEmbryonen nach Hoechstfärbung dargestellt. Die einzelnen blauen Punkte stellen
hierbei die fluoreszierenden Zellkerne der Embryonen dar. Abbildung 40 zeigt eine
Gruppe von KT-Blastozysten, mit einer Morphologie, die für die im Rahmen dieser
Arbeit erzeugten KT-Blastozysten typisch war. Einige der im Rahmen dieser Arbeit
erzeugten Kerntransfer-Blastozysten schlüpften am Tag 7 (Abbildung 41). Im
Gegensatz
zu
den
Kerntransfer-Embryonen
zeigten
die
parthenogenetisch
aktivierten „Kontrollgruppen“ mit Reifungszeiten von 38 h, 40 h und 42 h, weder im
Bezug auf die Teilungsrate (82,4% vs. 80,0% vs. 75,8%) noch auf Blastozystenrate
(47,6% vs. 44,4% vs. 44,1%) und Überwinden des 4-Zellblocks (58,2% vs. 56,5% vs.
60,2%),
signifikante
Unterschiede.
Die
durchschnittliche
Kernzahl
pro
parthenogenetischer Blastozyste war nahezu identisch (24,2 vs. 24,2 vs. 24,3). Im
Vergleich zu den KT-Embryonen überwanden die parthenogenetischen Embryonen
jedoch hochsignifikant häufiger das 4-Zellstadium (56,5 - 60,2% vs. 5,7 - 18,0%),
erreichten zu einem hochsignifikant höheren Prozentsatz das Blastozystenstadium
(44,1 - 47,5% vs. 4,9 - 14,8%) und besaßen hochsignifikant höhere durchschnittliche
Kernzahlen pro Blastozyste (24,2 - 24,3 vs. 16,0 - 17,4).
- 116 -
Ergebnisse
Abbildung 36: Kerntransfer- Embryo im 32-Zellstadium nach Hoechstfärbung
Abbildung 37: Schlüpfender Kerntransfer- Embryo mit ~50 Zellen nach Hoechstfärbung
Ergebnisse
Abbildung 38: Geschlüpfter Kerntransfer-Embryo mit ~90 Zellen nach Hoechstfärbung
Abbildung 39: Geschlüpfter Kerntransfer-Embryo mit ~144 Zellen nach Hoechstfärbung
- 117 -
- 118 -
Ergebnisse
Abbildung 40: Schlüpfende Kerntransfer-Blastozysten an Tag 6 der In-vitro-Kultur
Abbildung 41: Geschlüpfte In-vitro-Kerntransfer-Blastozyste an Tag 7 der Kultur
- 119 -
Ergebnisse
4.3 In-vivo-Entwicklung rekonstruierter Kerntransfer-Embryonen
In dieser Versuchsphase wurde das entwickelte Kerntransfer-Protokoll, im Hinblick
auf
die
Fähigkeit
der
Kerntransfer-Embryonen
eine
In-vivo-Entwicklung
zu
durchlaufen, überprüft. Dazu wurden rekonstruierte Kerntransfer-Embryonen auf
synchronisierte Empfängertiere übertragen. Tabelle 18 fasst das dabei verwendete
Protokoll zusammen.
Tabelle 18: Protokoll nach dem in dieser Arbeit rekonstruierte Embryonen erzeugt wurden
Prozesschritt
Medium
benötigte Zeit
Eizellreifung
NCSU37
22+18 h
Entkumulierung
Tl-Hepes 296
30 min
Polkörperselektion
Tl-Hepes 296
30 min
Enukleation
Tl-Hepes 296 Ca-free
2,5 h
Kerntransfer
Tl-Hepes 296 Ca-free
2 h1
Fusion (10 V, 99 µs)
SOR2 Ca-free
Verweildauer
Tl-Hepes 296
1,75 h
elektrische Aktivierung (1,0 KV/cm, 45 µs)
SOR2
15 min
6-DMAP - Aktivierung (2 mM, 3 h)
NCSU23
3h
Transfer auf Empfängertiere
Tl-Hepes 296
1
Kerntransfer und Fusion fanden parallel statt
7,5 h
Ergebnisse
- 120 -
4.3.1 Transfer von Kerntransfer-Embryonen auf Empfängertiere
Auf vier synchronisierte Empfängerschweine wurden chirurgisch durchschnittlich 150
rekonstruierte Kerntransfer-Embryonen übertragen. Dabei wurde der Ovarbefund
(Anzahl der Ovulationsstellen) erhoben. Es wurden 40 h gereifte Oozyten und fetale
Fibroblasten, die sich seit ~48 h im Stadium der Kontaktinhibition befanden, zur
Herstellung der Fibroblasten-Oozytenkomplexe eingesetzt. Über vier Versuchstage
konnten bei einer Fusionsrate von durchschnittlich 77,1% 641 fusionierte Komplexe
erzeugt werden, wobei sich insgesamt 599 Embryonen nach der Aktivierung als
transfertauglich erwiesen (Tabelle 19).
Tabelle 19: Transfer porziner Kerntransfer-Zygoten auf synchronisierte Empfängerschweine
GesamtSau-Nr. Komplexe
fusionierte
übertragene
Komplexe
Komplexe
Trächtigkeitstag
(n)
(n)
(%)
(n)
26
33
1. ET
10/5
200
166
83,0
161
(+)
(+)
2. ET
969/20
202
158
78,2
144
(-)
(-)
3. ET
868/85
213
166
77,9
156
(+)
(-)
4. ET
978/25
218
151
69,3
138
(-)
(-)
x=
208
160
77,1
150
34
115
4 Ferkel
5 Implantationen
(+) : positiver Ultraschallbefund, (-) : negativer Ultraschallbefund
Von diesen 4 Empfängertieren hatten an Tag 26 zwei Sauen eine Trächtigkeit
etabliert. In Abbildung 42 und Abbildung 43 sind die Aufnahmen der positiven
Ultraschallbefunde dargestellt.
Ergebnisse
Abbildung 42: Ultraschallbild von Sau 10/5 an Tag 22 der Trächtigkeit
Abbildung 43: Ultraschallbild von Sau 686/85 an Tag 26 der Trächtigkeit
- 121 -
- 122 -
Ergebnisse
Abbildung 44: Ultraschallbild von Sau 10/5 an Tag 29 der Trächtigkeit
Abbildung 45: Ultraschallbild von Sau 10/5 an Tag 59 der Trächtigkeit
- 123 -
Ergebnisse
Die Sau mit der Stall-Nr. 686/85 zeigte jedoch am Tag 33 der Trächtigkeit
Rauschesymptome. Deshalb wurde das Tier zur genaueren Uterusanalyse am Tag
34
der
Trächtigkeit
geschlachtet.
Hierbei
konnten
5
Implantationsstellen
nachgewiesen werden. Das verbleibende Trägertier mit der Nr. 10/5 kam nach
unauffälliger Trächtigkeit (Abbildung 44 und Abbildung 45) am 115. Tag zur
Abferkelung und warf 4 Ferkel, deren Entwicklungszustand Tabelle 20 darstellt.
Tabelle 20: Entwicklungszustand und Vitalität der Klonferkel bei der Geburt
Geburtsgewicht
Geschlecht
Vitalität
Ferkel Nr.1
1480 g
weiblich
tot
Ferkel Nr.2
400 g
weiblich
lebensschwach1
Ferkel Nr.3
680 g
weiblich
munter
Ferkel Nr.4
1550 g
weiblich
munter
1
: Ferkel Nr. 2 verstarb 8 h post partum
Von den 4 weiblichen Ferkeln verstarb eines bereits im Geburtsweg, ein zweites 8 h
post partum. Durch pathologische Untersuchung konnten bei beiden Ferkeln keine
Missbildungen festgestellt werden. Die verbliebenen beiden Ferkel zeigten ein
unauffälliges Verhalten und erschienen morphologisch normal (Abbildung 46 und
Abbildung 47). Bis heute zeigten sie eine unauffällige Entwicklung, die sich von der
Entwicklung anderer Ferkel im Stall nicht unterscheidet (Abbildung 48).
- 124 -
Ergebnisse
Abbildung 46: Klonferkel Nr.3 („Björna“) am Tag nach der Geburt
Abbildung 47: Klonferkel Nr. 4 („Michaela“) am Tag nach der Geburt
Abbildung 48: „Michaela“ und „Björna“, die ersten Klonschweine auf dem europäischem Festland
Ergebnisse
- 125 -
Ergebnisse
- 126 -
4.3.2 Bestimmung der genetischen Identität der geklonten Ferkel
Tabelle 21 stellt die Ergebnisse der 12 Loci umfassenden Mikrosatelliten-Analyse
von der gepoolten Zellkultur, von den 4 Ferkeln und dem Trägertier, dar.
Tabelle 21: Mikrosatellitenanalyse von Zellkultur, Ferkeln und Trägertier zum Nachweis der
genetischen Abstammung der Klonferkel
Quelle des Probenmaterials
Mikrosatellit
Spender
Zellen
Ferkel 1
Ferkel 2
Ferkel 3
Ferkel 4
Trägertier
CGA
293/289
293/289
293/289
293/289
293/289
Nicht
amplifiziert
S0002
208/206/18
208/206
206/188
208/206
206/188
206/198
S0090
238/237
237/237
238/237
237/237
238/237
238/237
S0101
214/212
212/212
214/212
212/212
214/212
212/212
SW122
122/116
122/116
122/116
122/116
122/116
122/112
SW632
171/165
165/165
171/165
165/165
171/165
173/173
SW951
125/123
123/123
125/123
123/123
125/123
125/125
SW857
105/94/92
105/92
105/94
105/92
105/94
110/94
SW936
109/107/97
97/97
109/107
97/97
109/107
107/97
S0068
nicht polymorph
S0178
nicht polymorph
SW911
nicht polymorph
Im Bezug auf den Locus SW632 ist jedes Ferkel ohne allelische Übereinstimmung
mit dem Trägertier, das damit als genetische Mutter auszuschließen ist. Die
Mikrosatelliten SW951 und SW857 zeigen zusätzlich, dass Ferkel 1 und Ferkel 3
biologisch nicht vom Trägertier stammen, da bei ihnen ausschließlich Allele typisiert
wurden, die das Trägertier nicht besitzt. Ferkel 1 und Ferkel 3, sowie Ferkel 2 und
Ferkel 4, sind im Bezug auf 12 Mikrosatelliten vollkommen identisch. Keines der
Ferkel weist ein Allel auf, das nicht auch in der Zellkultur typisiert wurde, wobei die
Mikrosatelliten S0002, SW936 und SW857 anzeigen, dass die Zellkultur aus 2
Zellinien bestand; 3 Allele pro Locus wurden typisiert.
- 127 -
Diskussion
5 Diskussion
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines Verfahrens zum Klonen von
Schweinen mittels somatischem Kerntransfer. In der ersten Versuchsphase wurden
zur Entwicklung eines KT-Protokolls entwicklungsbeeinflussende Parameter für
Kerntransfer-Embryonen ermittelt. Hierzu wurden zahlreiche Versuche an einer
großen Anzahl parthenogenetischer Embryonen durchgeführt, die als „Modell“
benutzt wurden. Wichtiges Kriterium war der Erhalt des Entwicklungspotentials von
Eizellen außerhalb des Brutschrankes, während des Zeitraums der zur Herstellung
von Kerntransferkomplexen nötig ist. Außerdem sollte eine vorzeitige (spontane)
Aktivierung der Oozyten, insbesondere während der Fusion, verhindert werden, um
eine effiziente, zeitlich bestimmbare, parthenogenetische Entwicklung induzieren zu
können. Im zweiten Versuchsabschnitt sollte das Protokoll auf KerntransferEmbryonen übertragen und optimiert werden, um eine möglichst weitreichende In
vitro Entwicklung geklonter porziner Embryonen zu gewährleisten. In der dritten
Versuchsphase wurde das optimierte Kerntransfer-Protokoll hinsichtlich der In vivo
Entwicklungsfähligkeit
Kerntransfer-Embryonen
der
auf
erzeugten
Embryonen
synchronisierte
überprüft.
Empfängertiere
Dazu
wurden
übertragen.
Die
Untersuchungen der vorliegenden Arbeit führten zur Entwicklung eines KerntransferProtokolls, dessen Eignung durch die Geburt der ersten geklonten Ferkel auf dem
europäischen Festland nachgewiesen wurde.
5.1 Entwicklung eines Kerntransfer-Protokolls
In dieser Versuchsphase sollten vor allem arbeitstechnische Aspekte untersucht
werden, mit denen das aufwendige Verfahren des somatischen Kerntransfers
optimiert und das Entwicklungspotential der Oozyte, bzw. der KT-Komplexe,
während des Zeitraums der Mikromanipulation aufrechterhalten werden kann. Hierzu
wurden alle Versuche im „parthenogenetischem Modell“ durchgeführt, um die
Erkenntnisse in der folgenden Versuchsphase auf KT-Embryonen zu übertragen.
Durch Färbung einer repräsentativen Stichprobe konnte bei 71% der Oozyten, die für
44 h (22 h in Gegenwart von cAMP und 22 h ohne cAMP) gereift waren, eine
Diskussion
- 128 -
morphologisch normal erscheinende Metaphasenplatte identifiziert werden. Andere
Autoren gaben nach gleicher Reifungsdauer geringfügig höhere Reifungsraten von
83,6% (FUNAHASHI et al. 1997), 85,2% (MIYOSHI et al. 2002) und ~90% (ZHU et
al. 2002) an. In diesen Arbeiten wurden jedoch lysierte Oozyten nicht mit
einbezogen, während im Rahmen der vorliegenden Arbeit die Reifungsraten auf die
Gesamtheit der eingesetzten Oozyten bezogen wurden. Eine dieser Autorengruppen
verwendete außerdem ein anderes Reifungsmedium (MIYOSHI et al. 2002). Die
Ermittlung der Reifungsrate war zur Beurteilung der nachfolgenden Versuche im
„parthenogenetischen Modell“ von großer Bedeutung, da für diese Versuche nach
der Reifung keine Selektion der Oozyten betrieben werden konnte.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde für die elektrische Aktivierung porziner Oozyten eine
Feldstärke von 1,0 KV/cm als am besten geeignet ermittelt. Dies deckt sich mit
Untersuchungen anderer Autoren (BETTHAUSER et al. 2000; ZHU et al. 2002). Oft
ist auch eine Feldstärke von 1,2 KV/cm benutzt worden (JOLLIFF u. PRATHER
1997; KOO et al. 2000; PARK et al. 2001b). Diese höheren Feldstärken waren
jedoch
mit
kürzeren
Impulslängen
verbunden.
Die
letztgenannten
Autoren
verwendeten ein elektrisches Feld von 1,2 KV/cm für 30 µs; in der vorliegenden
Arbeit wurde dagegen ein elektrisches Feld von 1,0 KV/cm für 45 µs erzeugt und
hierdurch eine artifizielle Teilungsrate von 72,9% erreicht. Die danach erreichte
Blastozystenrate von 29,6% deckt sich mit der Blastozystenrate von ZHU et al.
(2002), die bei gleicher Feldstärke eine Blastozystenrate von 29% erreichen konnten.
Andere
Autoren
erreichten
bei
alleiniger
elektrischer
Aktivierung
eine
Blastozystenrate von 25% (JOLLIFF u. PRATHER 1997), 22,4% (KOO et al. 2000)
und 18% (PARK et al. 2001b). Ferner konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass
eine zusätzliche Stimulierung der Oozyten nach der elektrischen Aktivierung mit 6DMAP für 3h, gegenüber der alleinigen Elektrostimulation, zu einer signifikant
verbesserten Blastozystenrate führt. Diese Beobachtung wurde kürzlich von weiteren
Autorengruppen (GRUPEN et al. 2002; ROH u. HWANG 2002) bestätigt. Die
erstgenannte Arbeitsgruppe konnte bei zusätzlicher Aktivierung mit 6-DMAP einen
schnelleren
und
anhaltenderen
Abfall
der
MPF-Aktivität
als
bei
alleiniger
Elektrostimulation nachweisen (GrUPEN et al. 2002). Dies spricht für einen stärkeren
- 129 -
Diskussion
Stimulus durch die kombinierte Aktivierung, was auf die Stimulation einer
zusätzlichen Aktivierungskaskade durch 6-DMAP zurückzuführen sein könnte, die
durch das elektrische Feld nicht stimuliert wird. Diese Autorengruppe stellte fest,
dass bei alleiniger elektrischer Aktivierung der porzinen Oozyten die MPF-Aktivität
bereits nach 8 Stunden wieder auf höhere Werte als bei unaktivierten Oozyten
ansteigt und damit von der physiologischen Situation abweicht. Es wird vermutet,
dass ein vorzeitiger erneuter Anstieg der MPF-Aktivität durch Inaktivierung der MAPK
verhindert werden kann (LIU u. YANG 1999). Da 6-DMAP unter anderem die MAPK
inaktiviert, schließen die Autoren daraus, dass eine kombinierte Aktivierung durch
Elektrostimulation und 6-DMAP den Verlauf der MPF-Aktivität bei der Aktivierung
durch ein Spermium exakter wiederspiegelt als eine alleinige Elektrostimulation
(GRUPEN et al. 2002). Zusätzlich wurde gezeigt, dass 6-DMAP zu einem hohen
Prozentsatz die Ausschleusung der Polkörper nach der Aktivierung verhindert, was
bei parthenogenetisch aktivierten Embryonen zu einem höheren Prozentsatz
diploider Embryonen als nach Aktivierung durch alleinigen Elektrostimulus führt
(LEAL
u.
LIU
1998).
Die
verbesserte
Entwicklungskompetenz
diploider
parthenogenetischer Embryonen gegenüber haploiden Embryonen wurde bereits
früher berichtet (KURE-BAYASHI et al. 1996). Die Retention des Polkörpers ist
darüber hinaus auch beim somatischen Kerntransfer wichtig, falls diploide
Spenderzellen aus der G0/G1 Phase benutzt werden (CAMPBELL et al. 1996a).
Obwohl die Versuche zur Aktivierung zeigten, dass ein hoher Prozentsatz der
gereiften
Oozyten
in
der
Lage
war
sich
nach
der
Aktivierung
zu
(parthenogenetischen) Blastozysten zu entwickeln, war es enorm schwierig, gereifte
Oozyten anhand des ausgeschleusten Polkörpers für die Mikromanipulation zu
selektieren, denn der subzonale Spalt, der in dieser Arbeit gereiften Ooyzten, war
sehr schmal. Deshalb wurde durch Zusatz von Sucrose die Osmolarität des
Arbeitsmediums um 25-50 mOsmol erhöht. Durch die Erhöhung des osmotischen
Drucks schrumpften die Oozyten geringgradig, was die Perivitellarräume erweiterte
und das Auffinden der Polkörper erleichterte. Dieses Vorgehen wurde ursprünglich
zur Aufweitung der Perivitellarräume von Kaninchenoozyten angewendet. In diesen
Arbeiten führten selbst Konzentrationen von 0,5 M Sucrose (für 60 min) nicht zu
Diskussion
- 130 -
Einschränkungen der weiteren Entwicklung (YANG et al. 1990a; YANG et al. 1990b).
Ein Zusatz von Sucrose wurde auch bei Oozyten von Rindern und Mäusen
eingesetzt (WANG et al. 2001; LIU et al. 2002a), um die perivitellinen Räume der
Oozyten aufzuweiten. In einem Experiment zur Abklärung eines potentiell
schädlichen Einflusses des Sucrosezusatzes, wurden Oozyten Arbeitsmedien mit
verschiedenen Osmolaritäten, eingestellt duch Sucrosezusatz, für 7,5 Stunden
ausgesetzt und anschließend im elektrischem Feld aktiviert. Hierbei zeigte sich eine
signifikant verbesserte Entwicklung bis zur Blastozyste, wenn die Osmolarität der
Arbeitsmedien durch Sucrosezusatz von 271 mOsmol auf 296 oder 321 mOsmol
erhöht worden war (18,3% vs. 24,4% vs. 26,2%). Worauf der positive Effekt des
Sucrosezusatzes beruht, ist noch ungeklärt. Auszuschließen ist, dass Sucrose einen
direkten positiven Einfluss als Energiequelle ausübt, denn Sucrose kann von der
Oozyte nicht aufgenommen werden (SAITO et al. 1994). Durch Schrumpfen des
Zytoplasmas der Eizelle wird die Konzentration verbleibender Proteine im
Zytoplasma
erhöht.
Dies
könnte
protektive
Wirkung
auf
den
Erhalt
des
Entwicklungspotentials der Ooyzte ausüben. Ferner ist gezeigt worden, dass die
Osmolarität die Stabilität des Zytoskelettes der Oozyte beeinflusst (SAITO et al.
1994; WANG et al. 2001). Da das Reifungsmedium der vorliegenden Arbeit
(NCSU37) eine Osmolarität von 296 mOsmol aufwies, ist vorstellbar, dass eine
niedrigere Osmolarität des Arbeitsmediums von 271 mOsmol über einen Zeitraum
von 7,5 Stunden bereits die Organisation des Zytoskelettes beeinflusste und so das
Entwicklungspotential der Oozyten beeinträchtigte. Erst kürzlich konnte eine
Autorengruppe zeigen, dass die Osmolarität in den ersten 48 h der In vitro Kultur
einen starken Einfluss auf die parthenogenetische Entwicklung ausübt (NGUYEN et
al. 2003). Da es in dieser Phase der vorliegenden Arbeit jedoch in erster Linie um
den Erhalt einer möglichst hohen Entwicklungsfähigkeit der Oozyten ging, und
weniger um genaue biochemische Zusammenhänge, wurde dieser Frage nicht weiter
nachgegangen.
Dies
wäre
jedoch
sicherlich
ein
gezielte,
zeitlich
abstimmbare,
interessanter
Aspekt
für
Aktivierung
der
Folgeexperimente.
Um
später
eine
artifizielle
rekonstruierten Kerntransfer-Komplexe zu ermöglichen, musste eine vorzeitige
- 131 -
Diskussion
(spontane) Aktiverung dieser Komplexe verhindert werden, denn die Fusion eines
Spenderkerns mit einer aktivierten Oozyte führt zu einer schlechteren Entwicklung
als wenn hierzu eine nicht aktivierte Ooyzte verwendet wird (TANI et al. 2001). Eine
spontane Aktivierung porziner Oozyten stellte in früheren Arbeiten ein wesentliches
Problem dar, da 29% der Oozyten die meiotische Arretierung auch ohne einen
artifiziellen Stimulus überwanden (REICH 2001). Insbesondere während der Fusion
sollte eine vorzeitige Aktivierung der Oozyten verhindert werden, da eine zur Fusion
zeitlich verzögerte Aktivierung von vielen Arbeitsgruppen als positiv bewertet wird
(ALBERIO et al. 2001; TANI et al. 2001; BOQUEST et al. 2002; DE SOUSA et al.
2002). Um Parameter ausfindig zu machen, die eine Aktivierung bei der Fusion
vermeiden, wurden in einem „Modellversuch“ parthenogenetische Embryonen einem
Fusionsfeld ausgesetzt (10V DC, 99 µs), dem in einer späteren Phase die KTEmbryonen ausgesetzt werden sollten. Als „0-Kontrollgruppe“ dienten Oozyten, die
nur zwischen die Fusionselektroden gebracht wurden, ohne dass ein elektrisches
Feld angelegt wurde. Die Teilungsrate dieser Oozyten sollte den Anteil der spontan
aktivierten Oozyten anzeigen, während die Teilungsraten der anderen Gruppen den
Anteil der durch den Fusionsprozess induzierten Aktivierung wiederspiegeln sollte.
Es stellte sich heraus, dass parthenogenetische Embryonen nach Fusionspuls in den
Ca2+-freien Fusionsmedien nur zu einem geringen Prozentsatz das 2-Zellstadium
erreichten (7-9%). Dies deckt sich mit den Ergebnissen von BOQUEST et al. (2000),
wo die Teilungsrate nach Fusion in Ca2+-freiem Fusionsmedium bei 10% lag. Aus der
„0-Kontrollgruppe“ dieses Versuchs teilten sich anschließend nur 1,0%. Diese sehr
geringe spontane Aktivierungsrate weist auf die gute Kontrollierbarkeit der
parthenogenetischen Aktivierung in diesem Protokoll hin. Um die verringerte
Aktivierbarkeit von Schweineeizellen in Ca2+-freien Medien zu nutzen, wurden Ca2+Ionen später auch aus allen Mikromanipulationsmedien entfernt. Ca2+-freie
Manipulationsmedien wurden bereits zuvor von anderen Arbeitsgruppen benutzt
(BETTHAUSER et al. 2000; BOQUEST et al. 2002), allerdings ist die Effektivität
bisher nicht näher untersucht worden
Im
Rahmen
dieser
Arbeit
wurden
routinemäßig
parthenogenetische
Blastozystenraten von 40-50% erreicht. Dies entspricht den höchsten bisher
Diskussion
- 132 -
berichteten
parthenogenetischen
Blastozystenraten
(GRUPEN
et
al.
2002).
Entscheidend an diesem Ergebnis ist, dass das Entwicklungspotential der Oozyten
vor der Aktivierung für den Zeitraum, der für die Mikromanipulation benötigt wird,
außerhalb
des
Brutschranks
aufrecht
erhalten
werden
konnte.
Zusätzlich
ermöglichten die Ergebnisse eine zeitlich kontrollierbare parthenogenetische
Aktiverung der Oozyten. Während die spontane Aktivierungsrate auf einen geringen
Wert reduziert werden konnte, wurden nach artifizieller Aktivierung sehr hohe
Teilungs- und Entwicklungsraten verzeichnet. Aus diesen Erkenntnissen wurde ein
Kerntransferprotokoll entwickelt, dass in den folgenden Versuchen zur Erstellung von
Kerntransfer-Embryonen angewendet wurde.
5.2 Entwicklungspotential von Kerntransfer-Embryonen
Im Rahmen des Kerntransfers wird in der Literatur von Fusionsraten zwischen 68,4%
(PARK et al. 2001a) und 90,2% (MIYOSHI et al. 2002) berichtet. Diese beiden Werte
können allerdings nicht mit den Fusionsraten dieser Arbeit verglichen werden, da
PARK et al. (2001) in vivo gereifte Oozyten und MIYOSHI et al. (2002) Oozyten, die
mit 24 h extrem kurz gereift waren, benutzten. Bezogen auf In vitro Reifungszeiten
von 42-44 h, wurden Fusionsraten von 70,0% (LEE et al. 2003a) bis 86,8%
(MIYOSHI et al. 2002) berichtet. Diese Werte sind mit den Ergebnissen dieser Arbeit
gut vergleichbar, nur MIYOSHI et al. (2002) berichtete von einer höheren
Fusionsrate. Ursächlich für die hohen Fusionsraten in der vorliegenden Arbeit könnte
die Differenz der Osmolaritäten zwischen Arbeitsmedium (Tl-Hepes296: 296
mOsmol) und Fusionsmedium (SOR2: 256 mOsmol) sein. Da sich der subzonale
Spalt, aufgrund der hohen Osmolarität während des Kerntransfers, relativ weit
darstellt, gelingt der Transfer des Fibroblasten unter die Zona pellucida leicht. Wenn
dieser Spalt später aufgrund der geringen Osmolarität im Fusionsmedium verstreicht,
führt dies zu einem engen Kontakt zwischen Oozyte und Fibroblast, was für die
Fusion als positiv beschrieben wurde (ZIMMERMANN u. VIENKEN 1982).
Die Dauer der Reifung übte einen Einfluss auf die Fusionsrate der FibroblastenOozytenkomplexe aus. Oozyten, die für 42-43 h gereift waren, konnten signifikant
- 133 -
Diskussion
häufiger als Oozyten, die für 38-40 h gereift waren, fusioniert werden (83,8% vs.
75,5%). Das ist ein Ergebnis, das für das Schwein bisher noch nicht beschrieben
worden ist. Interessant ist jedoch, dass die höchsten bisher im Rahmen des
Kerntransfers veröffentlichten Fusionsraten (90,2%) bei der Fusion mit den am
kürzesten gereiften Oozyten erreicht wurden (MIYOSHI et al. 2002). Eine höhere
Fusionsrate älterer Oozyten beschrieben allerdings einige Autoren für das Rind
(SIMS et al. 1991; RAO et al. 1993).
In der besten Kerntransfergruppe der vorliegenden Arbeit konnte eine Teilungsrate
von
81,1%
und
eine
Blastozystenrate
von
14,8%
erreicht
werden.
Das
Aktivierungsregime dieser Arbeit wurde auch von anderen Autoren zur Aktivierung
rekonstruierter Komplexe nach somatischem Kerntransfer eingesetzt und führte zur
Geburt lebender Ferkel (WALKER et al. 2002; YIN et al. 2002). Während YIN et al.
(2002) in vitro eine Blastozystenrate von 11% erreichten, berichten WALKER et al.
(2002) von dem bisher höchsten Anteil an In vivo Entwicklung, wobei nach Transfer
von 510 Kerntransfer-Zygoten auf 5 synchronisierte Empfängertiere 28 Ferkel (5,5%)
geboren
wurden.
Andere
Arbeitsgruppen
erreichten
mit
anderen
Aktivierungsprotokollen Teilungsraten zwischen 38,9% (IKEDA u. TAKAHASHI 2001)
und 94,2% (LEE et al. 2003b). Innerhalb dieser Spannbreite sind die Teilungsraten
dieser Arbeit (82,7-86,7%) im internationalen Vergleich relativ hoch. Diese Befunde
zeigen,
dass
die
Effizienz
des
Aktivierungsregimes,
das
bei
den
parthenogenetischen Embryonen in dieser Arbeit zu einer hohen Teilungsrate führte,
auch bei der Erstellung von Kerntransfer-Embryonen effektiv war.
Nach Verwendung von 40 h gereiften Oozyten, wurde mit einer Blastozystenrate von
14,8% das beste Ergebniss erzielt. Lediglich drei Arbeitsgruppen berichten mit 21,2%
(LEE et al. 2003a), 23,0% (BOQUEST et al. 2002) und 26,0% (HYUN et al. 2003)
höhere In vitro Blastozystenraten. Die Werte dieser Autorengruppen sind jedoch
kaum mit denen der vorliegenden Arbeit vergleichbar. So benutzten BOQUEST et al.
(2002) ausschließlich in vivo gereifte Schweineoozyten, von denen bekannt ist, dass
sie ein höheres Entwicklungspotential besitzen als in vitro gereifte Oozyten.
Außerdem müssen die Ergebnisse dieser Arbeitsgruppe kritisch hinterfragt werden,
da diese MII-Oozyten „blind“ enukleiert hat, und die erfolgreiche Enukleation somit
- 134 -
Diskussion
nicht kontrolliert werden konnte. Deshalb muss davon ausgegangen werden, dass es
sich bei einigen der Blastozysten nicht um geklonte sondern um parthenogenetische
Embryonen handelte. HYUN et al. (2003) benutzten ausschließlich Oozyten von
postpuberalen Sauen für die In vitro Reifung. In der vorliegenden Arbeit wurden
dagegen Oozyten unbekannter Herkunft aus dem Schlachthaus, und damit
größtenteils von präpuberalen Jungsauen, gewonnen. Es ist bekannt, dass Oozyten
von geschlechtsreifen Sauen den Oozyten präpuberaler Jungsauen im Hinblick auf
ihr Entwicklungspotential nach In-vitro-Reifung überlegen sind (MARCHAL et al.
2001). LEE et al. (2003) führten ihre hohe Blastozystenrate (21,2%) auf eine
verbesserte In-vitro-Kultur zurück. Während alle anderen Arbeitsgruppen KTEmbryonen in NCSU23 Medium kultivieren, benutzte diese Arbeitsgruppe ein
modifiziertes NCSU23 Medium, bei dem Laktat und Pyruvat statt Glucose die
Energiequelle bilden. Die KT-Kontrollgruppe, die diese Arbeitsgruppe in normalem
NCSU23 Medium kultivierte, erreichte dagegen nur eine Blastozystenrate von 10,9%.
Arbeitsgruppen, die mit vergleichbaren Oozyten als Empfängermaterial arbeiteten
und KT-Embryonen in vergleichbaren Medien kultivierten wie in der vorliegenden
Arbeit, berichteten eine Blastozystenrate von 15,9% (PARK et al. 2001b; LEE et al.
2003b), was den Ergebnissen dieser Arbeit entspricht.
Embryonen, die aus 38 h gereiften Oozyten rekonstruiert wurden, erreichten
signifikant seltener das Blastozystenstadium als Embryonen aus Oozyten, die zuvor
für 40 h gereift worden waren. Letztere erreichen das Blastozystenstadium
hochsignifikant häufiger als Embryonen aus Oozyten, die für 42 h gereift worden
waren. Diese Befunde deuten darauf hin, dass das Zeitfenster für die technischen
Schritte des Kerntransfers beim Schwein nach der In-vitro-Reifung sehr eng ist.
Bereits zuvor hatten einige Autoren spekuliert, dass der Einsatz kürzer gereifter
Oozyten für den Kerntransfer vorteilhaft sein könnte (IKEDA u. TAKAHASHI 2001;
WALKER et al. 2002; MIYOSHI et al. 2002). Die ersten beiden Autorengruppen
erreichten In-vitro-Blastozystenraten von 13,6 und 14,1%. Die letztgenannte
Arbeitsgruppe, die die Oozyten für etwa 38 h reifte, berichtete von der bisher besten
In-vivo-Entwicklung, wobei sich aus 510 Embryonen 28 lebende Ferkel entwickelten
(5,5%). Es ist bekannt, dass Schweineoozyten nur in einem sehr engen Zeitfenster
Diskussion
- 135 -
befruchtet werden können, das auf etwa 6 h festgelegt ist (HUNTER 1991). Es ist
ebenso bekannt, dass in vitro gereifte Oozyten einen deutlich geringeren Spiegel an
Gluthation (GSH) aufweisen als in vivo gereifte Oozyten (BRAD et al. 2003). GSH
spielt jedoch bei der physiologischen Befruchtung und der Vorkernbildung eine
entscheidende Rolle (MAHI u. YANAGIMACHI 1975). Es wäre denkbar, dass ein
verringerter GSH-Spiegel das Zeitfenster, in welchem der Kerntransfer erfolgen
muss, weiter einengt, so dass eine Aktivierung 49,5 h (42 h Reifung+7,5 h bis zur
Aktivierung) nach Reifungsende bereits am äußeren Rand des geeigneten
Zeitfensters liegt. Darüberhinaus ist bekannt, dass ältere MII-Oozyten leichter
aktivierbar sind (KIKUCHI et al. 2000). Daher ist auch vorstellbar, dass ein höherer
Anteil der länger gereiften Oozyten bereits bei der Fusion aktiviert wurde als dies bei
den kürzer gereiften Oozyten der Fall war. Eine verzögerte Aktivierung nach Fusion
gilt jedoch als positiv für die „Reprogrammierung“ des Spenderkernes nach
Kerntransfer (ALBERIO et al. 2001; TANI et al. 2001; BOQUEST et al. 2002; DE
SOUSA et al. 2002). Auf der anderen Seite benötigen Oozyten bei der Reifung für
die zytoplasmatische Reifung in vitro eine Zeitspanne von mindestens 38 h
(Überblick: PRATHER & DAY 1998). Doch da die Aktivierung bei der kürzer gereiften
Gruppe (38 h) 45,5 h nach Reifungsbeginn stattfindet, ist es unwahrscheinlich, dass
der Abfall der Blastozystenrate bei Nutzung der 38 h Gruppe, auf eine unvollständige
zytoplasmatische Reifung zurückzuführen ist. Es stellt sich die Frage, ob der
ermittelte Einfluss der Reifungsdauer nicht auf einen Selektionseffekt bezüglich der
Oozyten zurückzuführen ist, der durch die Reifungsdauer beeinflusst wird. Im
verwendeten Reifungsprotokoll werden die Oozyten für die ersten 22 h der Reifung
cAMP ausgesetzt, das Oozyten im Germinal Vesikel Stadium II (GVII) arretiert.
Dadurch wird eine bessere Entwicklungssynchronität erreicht (FUNAHASHI et al.
1997). So arretierte Oozyten erreichen etwa ab 16 h nach Überführen in ein cAMPfreies Medium (38 h Gesamtreifungszeit) das erwünschte MII-Stadium (FUNAHASHI
et al. 1997; ZHU et al. 2002; MIYOSHI et al. 2002). Allerdings können sich
unmittelbar zu Beginn der Reifung bereits 23% der Oozyten in einem Stadium
jenseits von GV II befinden, und werden deshalb durch cAMP nicht in ihrem
meiotischem Fortschreiten gehindert (FUNAHASHI et al. 1997). Letztere bilden eine
Diskussion
- 136 -
2. Oozytenpopulation mit einer abweichenden Entwicklungsgeschwindigkeit. Nach 24
h Gesamtreifungszeit haben bereits ~35% aller eingesetzten Oozyten das MIIStadium erreicht, wobei davon auszugehen ist, dass es sich dabei um Oozyten
handelt, die ungehindert meiotisch fortgeschritten sind (MIYOSHI et al. 2002). 16
Stunden nach Überführen in ein cAMP-freies Medium (38 h Gesamtreifungszeit)
ermittelte die gleiche Autorengruppe eine Reifungsrate von 67,5%, nach 44 h
Gesamtreifungszeit waren es schließlich 85,2%. Wenn alle gereiften Oozyten
aufgrund der Präsenz eines Polkörpers nach einer Gesamtreifungszeit von 38 h
selektiert werden, so befinden sich von den selektierten Oozyten, die zu diesem
Zeitpunkt etwa 67,5% aller Oozyten ausmachen, etwa 35 % seit ca. 14 h im MIIStadium. Das sind 50% der für den Kerntransfer ausgewählten Oozyten. Solche
Oozyten werden als gealtert bezeichnet, und es ist bereits früher gezeigt worden,
dass sie ein vermindertes Entwickungspotential besitzen (KIKUCHI et al. 2000;
FISSORE et al. 2002). Selektiert man Oozyten allerdings erst 40 h nach
Reifungsbeginn auf die Anwesenheit eines Polkörpers, so ist der relative Anteil der
gealterten Oozyten auf etwa 1/3 zurückgegangen, da die Gesamtzahl der frisch
gereiften Oozyten angestiegen ist (MIYOSHI et al. 2002). Für einen Einfluss
gealterter Oozyten spricht zudem, dass sich die Teilungsrate in den verschiedenen
Gruppen gegensätzlich zur Blastozystenrate darstellte (keine Signifikanz). Dies ist
plausibel, denn gealterte Oozyten sind sehr leicht aktivierbar (FISSORE et al. 2002).
Diese Vermutung wird auch dadurch untermauert, dass bei den parthenogenetischen
„Kontrollgruppen“ kein Einfluss der Reifungsdauer auf die Blastozystenrate auftrat.
Da die parthenogenetischen Gruppen zuvor nicht auf die Anwesenheit eines
Polkörpers selektiert wurden, ist davon auszugehen, dass der Anteil der gealterten
Oozyten in allen 3 Gruppen nahezu identisch war. Damit ist zu erklären, weshalb
Oozyten, die 40 h nach Reifungsbeginn selektiert wurden, eine bessere Entwicklung
nach Kerntransfer aufweisen als Oozyten, die bereits nach 38 h selektiert wurden.
Zusätzlich wurde beschrieben, dass bei Schweineoozyten, die den Polkörper in vitro
erst
nach
40
h
oder
später
bilden,
eine
höhere
Wahrscheinlichkeit
für
Chromosomenabnormalitäten (unreduzierte Chromosomensätze, Anaploidien und
hyperhaploide Chromosomensätze) vorliegt als bei schneller gereiften Oozyten
- 137 -
Diskussion
(SOSNOWSKI et al. 2003). Vor diesem Hintergrund würde eine Selektion der
Oozyten auf Anwesenheit eines Polkörpers nach 42 h zu einem gehäuften Einsatz
abnormaler Empfängeroozyten im Kerntransfer führen als eine Selektion nach 38
oder 40 h. Zwar werden die Chromosomen im Zuge der Enukleation entfernt, doch
die
Abnormalitäten
können
auch
den
Spindelapparat,
Zytoskelett
oder
zytoplasmatische Faktoren betreffen. Diese Oozyten sind als Empfängerzellen für
den
somatischen
Kerntransfer
ungeeignet.
Ebenso
bedingen
einzelne
Chromosomenbrüche oftmals eine unvollständige Enukleation, was zu abnormen
Ploidien nach Kerntransfer führt.
Die gleichen Signifikanzverhältnisse wie bei der Blastozystenrate zeigten sich in
Abhängigkeit zur Reifungsdauer hinsichtlich der Rate an Embryonen, die das 4Zellstadium
überwanden.
Dieser
Einfluss
der
Reifungsdauer
trat
bei
der
parthenogenetischen „Kontrollgruppe“ nicht auf. Darüber hinaus überwanden die
parthenogenetischen Embryonen das 4-Zellstadium (>8 Zellkerne) hochsignifikant
häufiger.
In
der
vorliegenden
Arbeit
teilten
sich
jeweils
~80%
der
parthenogenetischen „Kontroll“-und Kerntransfer-Embryonen zum 2-Zeller. Während
jedoch ~58% der parthenogenetischen „Kontroll“-Embryonen den 4-Zellblock
überwanden, schafften dies in Abhängigkeit zur Reifungsdauer der Oozyten nur 1018%
der
Kerntransfer-Embryonen.
Daher
kann
man
vermuten,
dass
die
präimplantative Entwicklung von KT-Embryonen durch einen für KT-Embryonen
spezifischen
Effekt
beeinflusst
wird.
Denkbar
ist,
dass
dieser
Effekt
in
Zusammenhang mit der „Reprogrammierung“ der somatischen Spenderkerne steht,
denn Hauptunterschied zwischen parthenogenetischen und KT-Embryonen ist die
Herkunft des Zellkerns. Während die Zelllkerne von KT-Embryonen für eine
präimplantative Entwicklung „reprogrammiert“ werden müssen, ist dies bei
parthenogenetischen Embryonen nicht erforderlich. Die signifikant unterschiedliche
Entwicklung von parthenogenetischen und Kerntranfer-Embryonen während des 4Zellstadiums deckt sich auch mit der Erkenntnis, dass der porzine Embryo ab dem 4Zellstadium mRNA transkribiert (TELFORD et al. 1990; JARRELL et al. 1991).
Wahrscheinlich erlaubt nur eine erfolgreiche „Reprogrammierung“ die Translation
entwicklungsrelevanter Gene ab dem 4-Zellstadium. Darüber hinaus besitzen KT-
Diskussion
- 138 -
Embryonen, da sie auf somatische Zellen zurückgehen, Genome maternaler und
paternaler Herkunft; die parthenogenetischen Embryonen besitzen dagegen nur
Genome maternaler Herkunft (SURANI et al. 1984). Diese können darüber hinaus
bei einigen parthenogenetischen Embryonen in haploider Form vorliegen (KUREBAYASHI et al. 1996). Die präimplantative Entwicklung von parthenogenetischen
und KT-Embryonen ist aus den oben angeführten Gründen deshalb ab dem 4Zellstadium nicht mehr vergleichbar.
Ziel der zweiten Versuchsphase war die Optimierung des KT-Protokolls für eine
effiziente In vitro Entwicklung porziner Embryonen nach somatischem Kerntransfer.
Es stellte sich heraus, dass die Übertragung der Ergebnisse aus dem erstem
Versuchsabschnitt dieser Arbeit zu einer akzeptablen Entwicklung der KTEmbryonen führte. Im Rahmen der Versuche mit Kerntransferembryonen konnte
routinemäßig
eine
Fusionsrate
von
75,7-83,4%
erreicht
werden,
was
im
internationalen Vergleich eine hohe Effizienz ist (MIYOSHI et al. 2002; LEE et al.
2003a). Durch weitere Experimente zur Reifungsdauer konnte die In vitro
Blastozystenrate
der
KT-Embryonen
optimiert
werden
(14,8%),
was
im
internationalen Vergleich ebenfalls im oberen Bereich liegt (BETTHAUSER et al.
2000; BONDIOLI et al. 2001; BOQUEST et al. 2002; LEE et al. 2003b). Sie ist
vermutlich die Kombination einer optimalen Reifungsdauer, eines Arbeitsmediums,
das
die
Entwicklungsfähigkeit
der
Oozyte
über
einen
langen
Zeitraum
aufrechterhalten kann, einer Fusion, die eine vorzeitige Aktivierung wirkungsvoll
vermeidet, und eines effektiven Aktivierungsprotokolls.
Mit diesem Protokoll erstellte Kerntransfer-Embryonen wurden auf synchronisierte
Empfängertiere übertragen, um die Entwicklung in vivo zu überprüfen. Es wurden
durchschnittlich 150 Embryonen pro Empfängertier übertragen, was etwa das Mittel
der
aus
der
Literatur
berichteten
Zahlen
(44-240
Embryonen)
darstellt.
Autorengruppen, die mit 123 (BETTHAUSER et al. 2000), 146 (RAMSOONDAR et al.
2003), 150 (HYUN et al. 2003) und 163 Embryonen (DAI et al. 2002) eine
vergleichbare Anzahl an Embryonen übertrugen, berichteten von Trächtigkeitsraten
zwischen 30 und 59%, sowie einer Abferkelrate von 4,7-15%. Die durchschnittliche
Wurfgröße betrug 2 Ferkel. In der vorliegenden Arbeit konnte bei 2 der 4 Sauen eine
Diskussion
- 139 -
Trächtigkeit etabliert werden, wovon eine zur Abferkelung kam und 4 Ferkel warf.
Zwei der Ferkel waren vital. Diese Werte entsprechen den aus der Literatur
gemeldeten Erfolgsraten. Dieser Versuchsabschnitt erbrachte damit den eindeutigen
Nachweis, dass das im Rahmen dieser Arbeit entwickelte KT-Protokoll eine In-vivoEntwicklung bis zur Geburt lebender Ferkel erlaubt. Von diesen Ferkeln wies keines
Anzeichen des LOS auf. Ähnlich wie schon bei anderen Arbeitsgruppen zuvor (PARK
et al. 2002; LAI et al. 2002a; ARCHER et al. 2003) wurde ein sehr leichtes Ferkel
geboren. In der vorliegenden Arbeit wog Klonferkel Nr. 2 lediglich 400 g. Die anderen
Ferkel lagen mit Geburtsgewichten zwischen 680 g und 1550 g innerhalb der Norm.
An den verstorbenen Ferkeln konnten keine pathologischen Befunde festgestellt
werden. Für Klonferkel Nr. 1, das mit einem Gewicht von 1480 g körperlich gut
entwickelt war, ergab die pathologische Untersuchung, dass der Tod im Geburtsweg
eintrat. Da das Trägertier eine erstgebärende Jungsau war, könnte das Ferkel relativ
lange im Geburtsweg gesteckt haben und der Tod aufgrund einer gerissenen
Nabelschnur durch Sauerstoffmangel eingetreten sein. Pathologische Befunde, die
auf eine andere Todesursache schliessen lassen, wurden nicht erhoben. Die
verbliebenen beiden Ferkel waren frei von klinischen Befunden und entwickeln sich
bis heute körperlich normal. Sie zeigen ein „unbekümmertes“ normales Verhalten,
das ihrem Alter entspricht und sich nicht von dem anderer Jungschweine des selben
Stalles unterscheidet. Diese Beobachtung deckt sich mit Berichten anderer Autoren,
die ebenfalls über eine normale körperliche Entwicklung geklonter Schweine
berichteten (CARTER et al. 2002), und keine Verhaltensabnormalitäten erkennen
konnten (CARTER et al. 2002; ARCHER et al. 2003).
Zur Aufrechterhaltung der Gravidität müssen Schweineembryonen an den Tagen 1114 eine ausreichende Menge Östradiol17ß produzieren (HEAP et al. 1979a; HEAP et
al. 1981), wozu mindestens 4-5 Embryonen nötig sind (POLGE et al. 1966; POPE et
al. 1972). Um dies zu gewährleisten, wird meistens eine große Anzahl KT-Zygoten
(100-200) übertragen (BETTHAUSER et al. 2000; DAI et al. 2002; HYUN et al. 2003;
RAMSOONDAR et al. 2003). Es ist jedoch bekannt, dass besonders Jungsauen eine
begrenzte Uteruskapazität für sich entwickelnde Früchte aufweisen, so dass eine
erhöhte Embryonensterblichkeit zur Regulierung der Gravidität ein normaler
Diskussion
- 140 -
biologischer Vorgang ist (BOSTEDT 1995). Der Transfer einer geringeren
Embryonenzahl mit verbesserter Qualität wäre deshalb ein Vorteil, denn eine hohe
Anzahl übertragener Embryonen führt zu einer Platzkonkurrenz und damit
möglicherweise zu einer zusätzlich erhöhten Embryonensterblichkeit (BOSTEDT
1995). Dies könnte durch Verbesserungen der In vitro Kultur erreicht werden. Einen
guten Ansatzpunkt hierzu könnte die kürzlich veröffentlichte Arbeit von LEE et al.
(2003c) darstellen, die in ihren Experimenten, durch Veränderung der Energiequelle
des Kulturmediums, eine Verdopplung der Blastozystenrate (21,2% vs. 10,9%)
erreichen konnten. Eine verbesserte präimplantative In-vitro-Entwicklung der
Embryonen würde eine bessere Selektion der zu übertragenden Embryonen
erlauben, die dann zu einem späteren Zeitpunkt in kleinerer Zahl, „unblutig“
intrauterin übertragen werden könnten (GALVIN et al. 1994; HAZELEGER et al.
2000).
Ein weiterer Aspekt der zukünftig erforscht werden sollte, stellt die Aufrechterhaltung
der Trächtigkeit bei weniger als 4 Embryonen an den Tagen 11-14 dar. Damit
Trächtigkeiten auch ausgetragen werden, falls nur 1 bis 3 KT-Embryonen eine
normale Entwicklung bis Tag 14 erreichen, wurden Empfängertiere von mehreren
Autoren zusätzlich zu den transferierten KT-Embryonen besamt (PRATHER et al.
1989a; ONISHI et al. 2000). Mit diesem Ansatz wurden einzelne lebende Klone
ausgetragen. Bekannt ist jedoch, dass sich die Anzahl der Embryonen in der
Gebärmutter, durch direkte Konkurrenz der Embryonen untereinander, verringern
kann (BOSTEDT 1995). Betroffen sind besonders die Embryonen, die in ihrer
Entwicklung zurück geblieben sind (POPE et al. 1990). Dies würde somit auch für
KT-Embryonen zutreffen, denn diese besitzen ein geringeres Entwicklungspotential
als Embryonen aus sexueller Vermehrung (HAO et al. 2003). Andere Arbeitsgruppen
übertrugen zusätzlich zu den Kerntransfer-Embryonen parthenogenetische „HelferEmbryonen“ (BETTHAUSER et al. 2000; DE SOUSA et al. 2002). Da diese eine
eingeschränkte Entwicklungskapazität besitzen und sich in vitro höchstens bis Tag
29
entwickeln
(KURE-BAYASHI
et
al.
2000),
sollte
so
eine
schädliche
Konkurrenzsituation für die KT-Embryonen umgangen werden. Auch mit diesem
Ansatz wurden lebende Klon-Ferkel geboren (BETTHAUSER et al. 2000). Es ist
- 141 -
Diskussion
jedoch unklar, ob der Erhalt der Trächtigkeit in diesen Arbeiten auf die
Helferembryonen zurückzuführen ist. Selbst wenn letztlich weniger als 4 Ferkel
geboren werden besteht die Möglichkeit, dass mehr als 4 KT-Embryonen Tag 14 der
Entwicklung erreichten und erst später abgestorben sind. LAI et al. (2002) berichten
nach Transfer von durchschnittlich 113 Kerntransfer-Embryonen und zusätzlicher
Übertragung von Helfer-Embryonen (Anzahl nicht genannt), dass 5 von 7
Trägersauen eine Trächtigkeit etablierten. Dennoch wurden aus diesen 5
Trächtigkeiten keine Ferkel geboren. Dies könnte darauf hindeuten, dass
parthenogenetische Embryonen in der frühen präimplantativen Phase keineswegs
eine eingeschränkte Entwicklung aufweisen. Für diesen Fall würde eine hohe Anzahl
parthenogenetischer Embryonen die Entwicklungsmöglichkeiten der KT-Embryonen
durch direkte Konkurrenz einschränken. Durch die Östradiol-17ß-Produktion
parthenogenetischer
Embryonen
könnte
die
Trächtigkeit
zudem
auch
aufrechterhalten werden, falls kein KT-Embryo implantiert hat, ehe die Trägersauen
nach dem Absterben der parthenogenetischen Embryonen umrauschen. Eine andere
Möglichkeit des Erhalts der Trächtigkeit besteht in der Zufuhr von exogenem
Östradiol-17ß (GEISERT et al. 1991). Diese Strategie resultierte im Rahmen des
Kerntransfers noch nicht zu geborenen Ferkeln. Andere Arbeitsgruppen induzierten
durch Administration von Gonadotropinen an Tag 9 und 11 der Trächtigkeit ein
zusätzliches Follikelwachstum, wodurch von den Follikeln zusätzlich endogenes
Östradiol17ß produziert wurde (CHRISTENSON u. DAY 1971). Dieser Ansatz führte
bei mehreren Arbeitsgruppen zur Geburt lebender Klonferkel (POLEJAEVA et al.
2000; WALKER et al. 2002). Es ist jedoch ungeklärt, ob der Erhalt der Trächtigkeit in
diesen Arbeiten auf den Hormoneinsatz zurückzuführen ist, denn die Anzahl der
Embryonen, die Tag 14 der Entwicklung erreichte, ist auch hier unbekannt.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden den Trägersauen Hormondosen wie
schon zuvor von WALKER et al. (2002) injiziert. Diese Hormonapplikationen
beeinträchtigten die bestehenden Trächtigkeiten nicht. Da die Wurfgröße jedoch 4
Ferkel betrugt bleibt auch hier unklar, ob die Aufrechterhaltung der Trächtigkeit eine
Folge der Hormonapplikation darstellt oder eventuell auch ohne diese fortbestanden
hätte.
- 142 -
Diskussion
5.3 Schlußfolgerungen und Ausblick in die Zukunft
Im Rahmen dieser Arbeit gelang die Geburt der ersten geklonten Ferkel auf dem
europäischem Festland. Um dies zu erreichen, wurde zuvor ein Protokoll für den
somatischen Kerntransfer beim Schwein entwickelt. Dies gelang durch die
erfolgreiche Übertragung von Erkenntnissen aus einem „parthenogenetischen
Modell“ auf die Herstellung von KT-Embryonen. Durch die gute Übertragbarkeit der
Ergebnisse zum Erhalt der Entwicklungsfähigkeit von Oozyten außerhalb des
Brutschranks, der Kontrolle über den Zeitpunkt der parthenogenetischen Aktivierung
und der parthenogenetischen Aktivierungsrate, erfüllte dieses Modell seinen Zweck.
Als wesentliches Ergebnis der vorliegenden Arbeit zeigte sich, dass die Einhaltung
eines Zeitschemas innerhalb enger Grenzen den Erfolg des somatischen
Kerntransfers beim Schwein maßgeblich beeinflusste. Diesen Einfluss konnte das
„parthenogenetische Modell“ zuvor nicht verdeutlichen, was die Grenzen der
Vergleichbarkeit aufzeigte. Durch Anwendung dieser Erkenntnisse konnte die
Entwicklungsrate der KT-Embryonen deutlich verbessert werden. Obwohl das in
dieser Arbeit entwickelte Kerntransfer-Protokoll eine gute Effizienz aufweist, ist die
Entwicklungsrate von übertragenen Embryonen zu geborenen Ferkeln immer noch
unbefriedigend (<1%). Deshalb sollte das Kerntransfer-Protokoll weiter verbessert
werden. Während sich die einzelnen Protokollschritte mit Enukleation, Fusion und
Aktivierung als nahezu optimiert darstellen, sollte die Synchronität der gereiften
Oozyten und die In vitro Kultur der porzinen Embryonen weiter verbessert werden.
Dennoch bewies die Geburt von zwei gesunden geklonten Ferkel die prinzipielle
Eignung des KT-Protokolls zum Klonen von Schweinen (aktuell bestehende
Trächtigkeiten beweisen zudem die Reproduzierbarkeit). Dieses Protokoll stellt damit
eine wichtige Grundlage für weitere Forschungsarbeiten innerhalb der Arbeitsgruppe
in Mariensee dar, denn es ermöglicht das Klonen von lebenden gesunden Ferkeln
aus kultivierten Zellen. Während in den Versuchen der vorliegenden Arbeit nur
„normale“ Fibroblasten als Spenderzellen eingesetzt wurden, sollen in einem
nächsten Schritt genetisch modifizierte Fibroblasten verwendet werden, um auf
diesem Weg transgene Schweine zu erhalten. An der Generierung transgener
Fibroblasten wird im Rahmen einer weiteren Dissertation bereits intensiv gearbeitet
Diskussion
- 143 -
(PETERSEN in Vorbereitung, persönliche Mitteilung). Diese Dissertation befasst sich
mit der Eignung verschiedener Spenderzellen für den Kerntransfer und deren
gezielte genetische Modifikation. Primäres Ziel ist die Generierung von α1,3Galactosyltransferase-Knockout Fibroblasten durch „homologe Rekombination“, um
aus solchen Spenderzellen, mit dem Protokoll der vorliegenden Arbeit, α1,3-GalKnockout Ferkel zu klonen. Zellen die den gesamten Vorgang der „homologen
Rekombination“ durchlaufen haben, wurden bereits im Rahmen der Anfertigung
dieser Arbeit im Kerntransfer eingesetzt und führten zu einer aktuell bestehenden
Trächtigkeit (~ Trächtigkeitstag 90).
Zusammenfassung
- 144 -
6 Zusammenfassung
Michael Hölker
Experimentelle Untersuchungen zum somatischen
Klonen beim Schwein: In-vitro- und In-vivo-Entwicklung von
Kerntransferkomplexen aus in vitro gereiften Oozyten
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines Protokolls zum Klonen
von
Schweinen
durch
somatischen
Kerntransfer,
um
nach
Transfer
auf
synchronisierte Empfängertiere vitale Klonferkel zu erhalten. Als Ausgangsmaterial
wurden dazu in vitro gereifte porzine Eizellen aus Schlachthofovarien genutzt. Zur
Auswertung der Versuche wurden die Kernzahlen, die Entwicklungsraten zu
bestimmten Entwicklungsstadien, sowie in einigen Versuchen die Fusionsrate,
bestimmt.
Hierzu wurden in einer ersten Versuchsphase anhand eines „parthenogenetischen
Modells“ Faktoren bestimmt, die eine effiziente in vitro Entwicklung ermöglichen. Die
Ergebnisse dieser Versuche führten zur Entwicklung eines Protokolls, das die
Entwicklungsfähigkeit porziner Oozyten während einer 7,5 stündigen Lagerung
außerhalb des Brutschrankes aufrechterhält, was für die einzelnen Schritte des
somatischen Kerntransfers nötig ist. Diese Experimente führten auch zur
Optimierung der Aktivierung, was zu hohen parthenogenetischen Teilungs- und
Blastozystenraten führte.
In der zweiten Versuchsphase wurde das Protokoll auf die Erzeugung porziner
Kerntransfer-Embryonen übertragen, was in vitro zu einer zufriedenstellenden
Blastozystenrate
Fusionseffizienz
führte.
Dies
(Fusionsrate)
wurde
erreicht
und
durch
durch
eine
Austesten
Optimierung
der
der
optimalen
Eizellreifungsdauer, was anhand der Entwicklungsrate zum Blastozystenstadium
beurteilt wurde.
- 145 -
Zusammenfassung
In der dritten Versuchsphase wurde das entwickelte Kerntransferprotokoll erfolgreich
hinsichtlich einer In-vivo-Entwicklung in vitro erzeugter Kerntransfer-Embryonen
überprüft. Hierzu wurden nach dem Protokoll dieser Arbeit erstellte KerntransferEmbryonen auf synchronisierte Empfängertiere übertragen.
Folgende Ergebnisse wurden erarbeitet:
1.
Nach Anwendung des zweistufigen Standardreifungsprotokolls konnte 44 h
nach
Reifungsbeginn,
durch
Auffinden
einer
Metaphasenplatte
nach
Hoechstfärbung, eine Reifungsrate von 71% ermittelt werden.
2.
Durch Einsatz eines elektrischen Feldes von 1,0 KV/cm DC für 45 µs konnten
bei 72,9% aller Oozyten die Teilung und bei 29,6% der Oozyten die
parthenogenetische Entwicklung bis zum Blastozystenstadium induziert
werden. Damit war eine elektrische Feldstärke von 1,0 KV den elektrischen
Feldern einer Stärke von 1,25 KV/cm, 1,5 KV/cm und 1,75 KV/cm bezüglich
der Teilungsrate (72,9% vs. 60,5% vs. 25,9% vs. 13,8%) und der
Blastozystenrate (29,6% vs. 12,9% vs. 4,3% vs. 0%), signifikant überlegen.
Keine signifikanten Unterschieden konnten diesbezüglich zu einer elektrischen
Feldstärke von 0,8 KV/cm ermittelt werden.
3.
Eine einphasige In-vitro-Kultur der aktivierten parthenogenetischen porzinen
Embryonen in NCSU23 Medium war einer dreiphasigen Kultur (CR2,
NCSU23, NCSU23+ FCS) bezüglich der Teilungsrate signifikant überlegen
(62,9% vs. 54,7%).
4.
Eine 7,5 stündige Aufbewahrung der Oozyten vor der parthenogenetischen
Aktivierung in Tl-Hepes Ca-free ergab eine signifikant höhere durchschnittliche
Kernzahl der Blastozysten als Aufbewahrung in Hb-NCSU23 (22,3% vs.
18,7%).
Zusammenfassung
- 146 -
5.
Während
einer
7,5
stündigen
Aufbewahrung
der
Oozyten
vor
der
parthenogenetischen Aktivierung führte eine Osmolarität im Arbeitsmedium
von 296 oder 321 mOsmol zu signifikant höheren Blastozystenraten (18,3%
vs. 24,4-26,2%) als eine Osmolarität von 271 mOsmol.
6.
Eine zusätzliche Aktivierung durch Inkubation mit 6-DMAP war einer alleinigen
Aktivierung
im
elektrischem
Feld,
bezüglich
der
Entwicklung
zum
Blastozystenstadium, signifikant überlegen (40,4% vs. 26,5%).
7.
Durch Fusion in den Ca2+-freien SOR2 Ca-free- und Boquest-Fusionsmedien
konnte die vorzeitige Aktivierung der Oozyten (Teilungsrate) gegenüber dem
SOR2 Medium signifikant reduziert werden (8,9% vs. 6,7% vs. 29,1%).
8.
Die spontane Aktivierung (Teilungsrate) der porzinen Oozyten fiel im Protokoll
der vorliegenden Arbeit mit 1% sehr gering aus.
9.
Die
Fusion
von
Fibroblasten-Oozytenkomplexen
in
SOR2
Ca-free-
Fusionsmedium erbrachte signifikant bessere Fusionsraten als die Fusion im
Boquest-Fusionsmedium (84,2% vs. 67,1%).
10.
Die Fusion von Fibroblasten-Oozytenkomplexen, die aus 42-43 h gereiften
Oozyten
rekonstruiert
worden
waren,
führte
zu
signifikant
höheren
Fusionsraten als die Fusion von Komplexen, die aus 38-40 Stunden gereiften
Oozyten hergestellt waren (83,8% vs. 75,5%).
11.
Der Einsatz von 40 h gereiften Oozyten im Kerntransfer führte zu einer
hochsignifikant höheren In vitro Entwicklung zum Blastozystenstadium als der
Einsatz von 38 h und 42 h gereiften Oozyten (9,6% vs. 14,8% vs. 4,9%). Im
Gegensatz dazu führte die Variation der Reifungsdauer von 38-42 h bei der
parthenogenetischen Kontrollgruppe zu keinen signifikanten Unterschieden
bezüglich Teilungsrate und Entwicklung zum Blastozystenstadium.
- 147 -
Zusammenfassung
12.
Nach Übertragung von durchschnittlich jeweils 150 Kerntransfer-Embryonen
auf 4 Empfängersauen, konnten 2 Trächtigkeiten etabliert werden; eine Sau
kam zur Geburt und warf 4 Ferkel. Hiervon waren 2 Ferkel vital und
entwickelten sich bis heute normal.
13.
Durch
Mirkosatellitenanalysen
an
12
verschiedenen
DNA
Loci
(zusammengestellt von der Landwirtschaftlichen Fakultät Bonn) konnte das
Trägertier sicher als biologische Mutter ausgeschlossen werden. Je zwei der
Ferkel waren genetische Klone zueinander.
Die Ergebnisse zeigen, dass durch Lagerung der Oozyten in Tl-Hepes Medium mit
einer Osmolarität von 296 oder 321 mOsmol die Entwicklungsfähigkeit porziner
Oozyten während des Zeitraumes, der zur Herstellung von Kerntransfer-Komplexen
benötigt wird, aufrechterhalten werden kann. Es wurde deutlich, dass eine
zusätzliche Aktivierung im Anschluss an eine elektrische Stimulation, durch
Inkubation in Gegenwart des Protein-Kinase-Inhibitors 6-DMAP, die Aktivierung von
rekonstruierten Kerntransferkomplexen verbessern kann. Darüber hinaus zeigen die
Ergebnisse, dass die einzelnen Arbeitsschritte des Kerntransfers innerhalb eines
sehr engen Zeitfensters erfolgen müssen. Die aufgezeigte In-vitro-Entwicklung,
sowie die Geburt vitaler Ferkeln nach Transfer in vitro produzierter KT-Embryonen
auf Empfängertiere, beweisen die Funktionalität des entwickelten KerntransferProtokolls. Weitere Forschungsarbeiten, insbesondere Verbesserungen bezüglich
der Auswahl der Empfängeroozyten und der Kulturmedien, können zu einer weiteren
Effizienzsteigerung des Systems beitragen.
Summary
- 148 -
7 Summary
Michael Hölker
Experimental studies of somatic cell cloning in porcine:
in vitro and in vivo development of nuclear transfer complexes
derived from in vitro matured oocytes
The aim of the present study was to establish a protocol for porcine somatic cell
cloning and to produce viable piglets from reconstructed embryos transferred to
synchronized gilts. In vitro matured oocytes out of slaughterhouse ovaries were used
as starting material for all experiments. The criteria for evaluating each protocol were
the number of nuclei found at specific developmental stages, blastocyst morphology,
and, in some cases, the fusion rate.
In the first set of experiments, a parthenogenetic model was used for rapid evaluation
of protocols for maintaining matured oocytes in culture and activating them by
electrical stimulation and DMAP. The result of this work was the establishment of a
standard protocol which permitted the storage of embryos for periods up to 7.5 hours
without degradation. This was necessary in order to provide enough time to carry out
subsequent steps of the nuclear transfer procedure. This set of experiments also
permitted the optimization of the activation procedure to get a high cleavage rate and
a high percentage of parthenogenetic embryos reaching the blastocyst stage.
In the second set of experiments, a nuclear transfer protocol was developed which
gave a satisfactory percentage of reconstructed embryos reaching the blastocyst
stage during in vitro culture. This was accomplished by optimization of fusion
efficiency (fusion rate) and by varying the duration of maturation while monitoring the
number of nuclei at each developmental stage and blastocyst morphology.
In the third phase of this work, the viability of the embryos produced by the nuclear
transfer protocol was confirmed by transfer of activated zygotes to synchronized gilts.
This resulted in the birth of two viable piglets.
Summary
- 149 -
The following results were obtained:
1.
Using a standard two step maturation protocol, 71% of all oocytes maintained
in the maturation medium reached the metaphase II stage after 44 hours in
culture, as evaluated by Hoechst staining.
2.
In experiments with parthenogenetic embryos, the optimal electric field
strength for a fixed pulse duration of 45 µsec was 1.0 KV/cm.
With this
combination, 72.9% of all activated oocytes cleaved and 29.6% of the
activated oocytes reached the blastocyst stage. Other field strengths (1.25
KV/cm, 1.5 KV/cm, and 1.75 KV/cm) gave significantly lower cleavage (72.9%
vs. 60.5% vs. 25.9% vs. 13.8%) and blastocyst rates (29.6% vs. 12.9% vs.
4.3% vs. 0%). The difference between the 0.8 KV/cm group and the 1.0 KV/cm
group was not significant.
3.
Again using parthenogenetic embryos, the standard one step NCSU23 culture
system gave significantly higher cleavage rates than a three step culture
system consisting of: sequential use of 1) cr2 for 48 hours; 2) NCSU23+BSA
for 48 hours; and 3) NCSU23+FCS for 72 hours (62.9% vs. 54.7%).
4.
Storage of oocytes for 7.5 hours before activation in TL-Hepes resulted in a
significantly higher number of nuclei at blastocyst stage than storage in HbNCSU23 (22.3% vs. 18.7%).
5.
In a further experiment with parthenogenetic embryos, storage over 7.5h in
TL-Hepes with an osmolarity of 296 mOsmol or 321 mOsmol gave significantly
higher blastocyst rates after activation than storage in TL-Hepes with an
osmolarity of 271 mOsmol (18.3% vs. 24.4-26.2%).
- 150 -
6.
Summary
In a comparison between electrostimulation alone and the combination of
electroactivation followed by a second stimulation with 6-DMAP; the two step
combination gave a significantly higher rate of blastocyst formation (40.4% vs.
26.5%).
7.
In a fusion experiment, two calcium free media, Ca free SOR2 medium and
Boquest fusion medium, resulted in lower precocious activation (cleavage)
rates after administration of the electrical pulse than the calcium containing
Sor 2 medium (8.9% vs. 6.7% vs. 29.1%).
8.
Spontaneous activation (cleavage) of the porcine oocytes without an electric
field was only 1.0%.
9.
Fusion of fibroblast-oocyte complexes in Ca free Sor 2 medium resulted in
significantly higher fusion rates than in Boquest fusion medium (84.2% vs.
67.1%).
10.
Fusion of fibroblast-oocyte complexes matured for 42-43 hours gave
significantly higher fusion rates than fusion of fibroblast-oocyte complexes
matured for 38-40 hours (83.8% vs. 75.5%).
11.
In nuclear transfer experiments, maturation of oocytes for 40 hours resulted in
a highly significant improvement in development to the blastocyst stage as
compared to oocyte maturation for either 38 hours or 42 hours (9.6% vs.
14.8% vs. 4.9%). This was not seen in the parthenogenetic control groups in
which there was no exposure-time effect observed in the blastocyst rate.
12.
After transfer of cloned embryos produced from in vitro matured oocytes, two
of four recipient gilts established a pregnancy. One gilt farrowed and gave birth
to four piglets of which two remain in good health at the time of writing.
Summary
13.
- 151 -
The recipient gilt was excluded from being the biological mother by analysis of
12 highly polymorphic microsatellite loci selected from the set developed at the
University of Bonn. This microsatellite analysis confirmed that, among the four
piglets born, two were derived from one fibroblast line and two were derived
from a second fibroblast line.
In conclusion, the results of this work indicate that it is possible to maintain the
developmental potential of porcine oocytes stored in TL-Hepes media with an
osmolarity of 296 or 321 mOsmol for up to 7.5 hours. This allows sufficient time to
perform subsequent steps in the nuclear transfer protocol. It is clear that additional
activation with DMAP can improve activation rates of reconstructed complexes.
Additional results demonstrate that micromanipulation steps within the nuclear
transfer protocol have to be performed within a relatively short time window. The
development rates of nuclear transfer derived embryos maintained in culture and the
birth of live piglets after transfer to foster mothers demonstrate the functionality of the
nuclear transfer protocol described here. Further changes in the composition of
media and the conditions during embryo culture to gain a better quality of recipient
oocytes will certainly improve the efficiency of this protocol.
- 152 -
Abkürzungsverzeichnis
8 Abkürzungsverzeichnis
AR
Aktivierungsrate
BR
Blastozystenrate
BSA
Bovines Serum Albumin
cAMP
cyclic (zyklisches) Adenosine Mono Phosphat
CB
Cytochalasin B
CBS
Castrated Boar Serum
CdK
Cyclin dependent Kinase
CSF
Cytosolic Sperm Factor
CsK
Cyclin stabilisierender Komplex
CYCLO
Cycloheximid
DC
Direct Chain (Gleichstrom)
d.h.
das heißt
DMAP
6-Di-Methyl-Amino-Purine
DMEM
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
DMSO
Di-Methyl-Sulf-Oxid
DNA
Desoxiribo Nucleotide Acid (Desoxiribonukleinsäure)
eCG
equine Chorionic Gonadrotropin
EDTA
Ethylen-Diamin-Tetra-Acid
EGF
Epidermal Growth Factor
EGFP
Enhanced Green Fluorescent Protein
ES
Elektro-Stimulation
FBS
Fetales Bovines Serum
FCS
Fetal Calf Serum
FSH
Follikel Stimulierendes Hormon
G0-Phase
Gap0 - Phase
G1-Phase
Gap1 - Phase
G2-Phase
Gap2 - Phase
GTP
Guanosine Tri Phoshat
GV-Stadium
Germinal-Vesikel-Stadium
h
Stunde
Abkürzungsverzeichnis
HAR
Hyperakute Abstoßungs Reaktion
hCG
human Chorionic Gonadotropin
Hepes
N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N’-[Ethansulfonsäure]
ICM
Inner Cell Mass
IE
Internationale Einheiten
Ins3P
Inositol 1,4,5-Tri Phosphat
IONO
Ca-Ionophore
IVC
In Vitro Culture (In-vitro-Kultur)
IVF
In Vitro Fertilization (In-vitro-Fertilisation)
IVM
In Vitro Maturation (In-vitro-Reifung)
IVP
In Vitro Production (In-vitro-Produktion)
KDa
KiloDalton
KOK
Kumulus-Oozyten-Komplex
KT
KernTransfer
KV
Kilovolt
KV/cm
Kilovolt pro cm
LH
Luteinisierendes Hormon
M
Mol
MAPK
Mitogen Activated Protein Kinase
MBR
Morula-/Blastozysten Rate
MII
Metaphase II
min
Minute
mMol
Millimol
mOsmol
Milliosmol
MPF
Meiosis Promoting Factor
M-Phase
Mitose-Phase
MR
Morula Rate
NBCS
NewBorn Calf Serum
NCSU
North Carolina State University (Medium)
NEBD
Nuclear Envelop Breakdown
NPS
Newborn Piglet Serum
- 153 -
Abkürzungsverzeichnis
- 154 -
p
Probabilität (Irrtumswahrscheinlichkeit)
PBS
Phosphat Buffered Saline (Medium)
Pb
Polar body (Polkörper)
PCC
Premature Chromosome Condensation
PCR
Polymerase Chain Reaction
PGF2α
Prostaglandin F2α
pFF
porzine Follikel-Flüssigkeit
PIP2
PhosphatidylInositol 4,5-bis-Phosphat
PKC
Proteinkinase C
PKZ
Primordiale Keimzelle
PLC
Phospholipase C
PMSG
Pregnant Mare’s Serum Gonadotropin
PVA
Poly-Vinyl-Alkohol
RNA
Ribo Nucleotide Acid (Ribonukleinsäure)
rpm
rounds per minute
RR
Reifungs Rate
s
Sekunde
SD
Standardabweichung
S-Phase
Synthese-Phase
TCM
Tissue Culture Medium
TE
TrophEktoderm
TIM
Thimerosal
Tl
Tyrode’s Albumin Laktat Pyruvat (Medium)
TR
Teilungs Rate
U
Unit
V
Volt
VNTR
Variable Number of Tandem Repeats
vs.
versus
µs
Mikrosekunde
µm
Mikrometer
x
Mittelwert
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- 197 -
Medienanhang
10 Medienanhang
10.1 Kulturmedien
Tabelle 22: Zusammensetzung der verwendeten Kulturmedien
Komponenten
NaCl
KCl
CaCl2 *
KH2PO4
MgSO4 x 7 H2O *
NaHCO3 *
Glucose x H2O
Sorbitol
HemiCa-lactat
Na-Pyruvat**
Penicillin G
Streptomycin
Phenolrot
Cystein**
Mercaptoethanol**
L-Glutamine**
Taurin**
Hypotaurin**
EGF**
Immature pFF**
BSA**
FCS**
BME (amino acids) SIGMA
#B6766**
MEM (amino acids) SIGMA
#M7145**
MEM Vitamine
SIGMA
#M6895**
Db-cAMP***
PMSG(Ovogest®)***
HCG (Intergonan®)***
NCSU37
108,73mM
4,78mM
1,70mM
1,19mM
1,19mM
25,07mM
5,55mM
12,0mM
NCSU23
108,73mM
4,78mM
1,70mM
1,19mM
1,19mM
25,07mM
5,55mM
NCSU23+FCS
108,73mM
4,78mM
1,70mM
1,19mM
1,19mM
25,07mM
5,55mM
CR2
114,7mM
3,1mM
26,2mM
5mM
100 U/l
50 mg/l
100 U/l
50 mg/l
100 U/l
50 mg/l
0,4mM
100 U/L
50 mg/l
10 µg/ml
0,57mM
10 µg/ml
10 µg/ml
10 µg/ml
50µM
1mM
1mM
7mM
5mM
10ng/ml
10 %
0,004g/ml
0,003g/ml
10%
2%
1%
1%
1mM
10 IU/ml
10 IU/ml
*
: getrennt lösen
**
: Erst direkt vor Gebrauch einwiegen
***
: nur für die ersten 22h der Reifung
Medienanhang
- 198 -
10.2 Arbeitsmedien
Tabelle 23: Zusammensetzung der verwendeten Arbeitsmedien
Komponente
TlHepes
TlTlTlTlHepes296
Hepes271
Hepes296
Hepes321
Ca-free
Ca-free
Sucrose**
25mM
25mM
50mM
HbNCSU23
NaCL
114mM
114mM
114mM
114mM
114mM
131,7mM
KCl
3.2mM
3.2mM
3.2mM
3.2mM
3.2mM
4,78mM
CaCl2 2H2O*
2.0mM
NaHCO3*
2.0mM
2.0mM
2.0mM
2.0mM
2.0mM
NaH2PO4H2O
0.4mM
0.4mM
0.4mM
0.4mM
0.4mM
2.0mM
2.0mM
KH2PO4
MgCl26H20
2mM
1,19mM
0.5mM
0.5mM
0.5mM
0.5mM
0.5mM
MgSO4 x 7H2O*
1,19mM
HEPES
10mM
10mM
10mM
10mM
10mM
Na-Lactat
10mM
10mM
10mM
10mM
10mM
Glucose x H2O
10mM
5,55mM
Penicillin G
100 U/L
100 U/L
100 U/L
100 U/L
100 U/L
100 U/L
Streptomycin
50 mg/l
50 mg/l
50 mg/l
50 mg/l
50 mg/l
50 mg/l
Na-Pyruvat**
0,4mM
0,4mM
0,4mM
0,4mM
0,4mM
L-Glutamine**
1mM
1mM
1mM
1mM
1mM
1mM
Taurine**
7mM
Hypotaurine**
5mM
BSA**
0,0004g/
l
0,0004g/l
0,0004g/l
Mit NaOH auf Ph 7,34 abpuffern
*
: getrennt lösen
**
: Erst direkt vor Gebrauch einwiegen
0,0004g/l
0,0004g/l
0,0004g/l
- 199 -
Medienanhang
10.3 Fusions- und Aktivierungsmedien
Tabelle 24: Zusammensetzung der Fusions- und Aktivierungsmedien
Komponente
SOR2
SOR2 Ca-free
Mannitol
280mM
Sorbitol
250mM
Ca-acetat
0,1mM
Mg-acetat
0,5mM
250mM
0,5mM
MgSO4 x 7H2O
BSA
Boquest
0,2mM
0,0001g/l
0,0001g/l
PVA
0,00001g/l
Mit NaOH auf Ph 7,2 abpuffern
10.4 Zellkulturmedium
Tabelle 25: Zusammensetzung von Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)
Komponente
DMEM
NaHCO3
4,5mM
L-Glutamine
0,2mM
ß-Mercaptoethanol
0,1mM
Penicillin G
100 U/L
Streptomycinsulfat
50 mg/l
DMEM (10x,SIGMA #2554)
10%
Mit HCL auf ph 7,1-7,4 abpuffern
- 200 -
Verzeichnis der Tabellen
11 Verzeichnis der Tabellen
Tabelle 1:
Reifungsergebnisse porziner Oozyten--------------------------------------20
Tabelle 2:
Methoden zur parthenogenetischen Aktivierung von Schweineoozyten -----------------------------------------------------------------------------27
Tabelle 3:
Erfolgsraten bei der parthenogenetischen Entwicklung porziner
Embryonen ------------------------------------------------------------------------32
Tabelle 4:
Embryotransfer porziner Embryonen verschiedener Entwicklungsstadien -----------------------------------------------------------------------34
Tabelle 5:
Überblick über die Effizienz beim Klonen verschiedener Tierarten--43
Tabelle 6:
Entwicklung porziner Embryonen aus embryonalem Kerntransfer --50
Tabelle 7:
In-vitro-Entwicklung porziner Embryonen aus somatischem Kerntransfer------------------------------------------------------------------------------54
Tabelle 8:
In-vivo-Entwicklung porziner Embryonen aus somatischem Kerntransfer------------------------------------------------------------------------------57
Tabelle 9:
Transgene Ferkel aus somatischem Kerntransfer mit genetisch
modifizierten Zellen --------------------------------------------------------------60
Tabelle 10:
Übersicht über die für den Abstammungsnachweis eingesetzten
Mikrosatelliten---------------------------------------------------------------------99
Tabelle 11:
Einfluß der elektrischen Feldstärke auf die parthenogenetische
In-vitro-Entwicklung porziner MII-Oozyten ( x ±SD)-------------------- 103
Tabelle 12:
Einfluss des Kulturmediums auf die In-vitro-Entwicklung porziner
Embryonen nach parthenogenetischer Aktivierung ( x ± SD) ------- 104
Tabelle 13:
Einfluß des Arbeitsmediums auf das Entwicklungspotential
parthenogenetischer porziner Embryonen nach 7,5 stündiger
Einwirkzeit ( x ±SD) ------------------------------------------------------------ 105
Tabelle 14:
Einfluss der Osmolarität im Arbeitsmedium auf das Entwicklungspotential parthenogenetischer porziner Embryonen nach 7,5 h
Einwirkzeit ( x ±SD) ------------------------------------------------------------ 106
Tabelle 15:
Einfluss des Aktivierungsregimes auf die In-vitro-Entwicklung
parthenogenetischer porziner Embryonen ( x ±SD) ------------------- 108
Verzeichnis der Tabellen
- 201 -
Tabelle 16:
Blastozystenrate ( x ) porziner Kerntransfer-Embryonen in Relation zur Dauer der Oozytenreifung und Kontaktinhibitiondauer
der fetalen Fibroblasten (3 x 3 x 2 Versuch) ---------------------------- 113
Tabelle 17:
In-vitro-Entwicklung rekonstruierter porziner KerntransferEmbryonen und parthenogenetischer „Kontrollgruppen“ in
Relation zur Reifungsdauer der Oozyten ( x ± SD) -------------------- 114
Tabelle 18:
Protokoll nach dem in dieser Arbeit rekonstruierte Embryonen
erzeugt wurden ----------------------------------------------------------------- 119
Tabelle 19:
Transfer porziner Kerntransfer-Zygoten auf synchronisierte
Empfängerschweine----------------------------------------------------------- 120
Tabelle 20:
Entwicklungszustand und Vitalität der Klonferkel bei der Geburt -- 123
Tabelle 21:
Mikrosatellitenanalyse von Zellkultur, Ferkeln und Trägertier
zum Nachweis der genetischen Abstammung der Klonferkel------- 126
Tabelle 22:
Zusammensetzung der verwendeten Kulturmedien ------------------- 197
Tabelle 23:
Zusammensetzung der verwendeten Arbeitsmedien ----------------- 198
Tabelle 24:
Zusammensetzung der Fusions- und Aktivierungsmedien ---------- 199
Tabelle 25:
Zusammensetzung von Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
(DMEM)--------------------------------------------------------------------------- 199
- 202 -
Verzeichnis der Abbildungen
12 Verzeichnis der Abbildungen
Abbildung 1:
Schematische Darstellung der Keimzellentwicklung beim
Schwein ----------------------------------------------------------------------------- 6
Abbildung 2:
Biochemische Vorgänge bei der Aktivierung der
Schweineoozyte durch ein Spermium --------------------------------------10
Abbildung 3:
Präimplantative Stadien des frühen Schweineembryos ----------------12
Abbildung 4:
Morphologische Veränderungen während der späten
Embryonalentwicklung des Schweines -------------------------------------14
Abbildung 5:
Schematische Darstellung des Zellzyklus einer Säugetierzelle ------16
Abbildung 6:
In vitro kultivierte Blastozyste vom Schwein an Tag 6 nach
Befruchtung------------------------------------------------------------------------25
Abbildung 7:
In vitro kultivierte „geschlüpfte“ Blastozyste vom Schwein an
Tag 7 nach Befruchtung --------------------------------------------------------25
Abbildung 8:
Schematische Darstellung der Schritte beim somatischen
Kerntransfer -----------------------------------------------------------------------41
Abbildung 9:
Übersicht über das Schicksal des Spenderkerns nach
Kerntransfer -----------------------------------------------------------------------48
Abbildung 10: Strategien des Klones beim Schwein mittels somatischen
Kerntransfers----------------------------------------------------------------------52
Abbildung 11: Abmessung und Spitzen der verschiedenen Arbeitspipetten ---------68
Abbildung 12: Kumulus-Oozyten-Komplexe nach der Ovarpunktion-------------------74
Abbildung 13: Kumulusexpansion zum Zeitpunkt des Medienwechsels (nach
22 h Reifung)----------------------------------------------------------------------74
Abbildung 14: Hochgradig expandierter Kumulus nach 38-44 h Reifung -------------75
Abbildung 15: Porzine Oozyten direkt nach der Entkumulierung -----------------------75
Abbildung 16: Metaphase II arretierte Oozyte mit ausgeschleustem Polkörper
auf „3 Uhr“ -------------------------------------------------------------------------76
Abbildung 17: Herstellung und Handling einer porzinen Explantatkultur für den
Kerntransfer -----------------------------------------------------------------------78
Verzeichnis der Abbildungen
- 203 -
Abbildung 18: Mikromanipulationseinheit zum Erstellen von porzinen Kerntransfer-Komplexen--------------------------------------------------------------82
Abbildung 19: Ausrichtung der Metaphase II - arretierten Oozyte mit Polkörper
auf „5 Uhr“ -------------------------------------------------------------------------84
Abbildung 20: Bestrahlung mit UV-Licht zur Lokalisation der Metaphasenplatte ---84
Abbildung 21: Aspiration von Polkörper und angrenzendem Zytoplasma ------------85
Abbildung 22: Bestrahlung mit UV-Licht zur Überprüfung der erfolgreichen
Enukleation ------------------------------------------------------------------------85
Abbildung 23: Auswahl eines abgerundeten Fibroblasten mit glatter
Oberfläche -------------------------------------------------------------------------87
Abbildung 24: Aufnahme eines geeigneten Fibroblasten in die Kerntransferpipette ---------------------------------------------------------------------------87
Abbildung 25: Ausrichtung der enukleierten Oozyte für die Überführung des
Fibroblasten -----------------------------------------------------------------------88
Abbildung 26: Penetration der Zona pellucida mit der Kerntransferpipette -----------88
Abbildung 27: Korrekte Positionierung der Kerntransferpipette im subzonalen
Spalt ---------------------------------------------------------------------------------89
Abbildung 28: Absetzen des Fibroblasten im subzonalen Spalt-------------------------89
Abbildung 29: Makroskopische Anordnung von Fusionselektroden und
Fusionstropfen --------------------------------------------------------------------91
Abbildung 30: Mikroskopische Ausrichtung eines Fibroblasten-OozytenKomplexes zwischen den Enden der Fusionselektroden --------------91
Abbildung 31: Bügel-Fusionskammer zur artifiziellen Aktivierung porziner
Oozyten und rekonstruierter Kerntransfer-Komplexe -------------------93
Abbildung 32: Schematischer Überblick über den 3-phasigen Versuchsaufbau -- 100
Abbildung 33: Einfluß des Fusionsmediums auf die parthenogenetische
Aktivierung porziner MII-Oozyten während der Fusion ( x ±SD)---- 109
Abbildung 34: Einfluß des Fusionsmediums auf die Fusionsraten porziner
Fibroblasten-Oozyten Komplexe unter ansonsten konstanten
Fusionsbedingungen ( x ±SD)----------------------------------------------- 111
- 204 -
Verzeichnis der Abbildungen
Abbildung 35: Einfluss der Oozytenreifungsdauer auf die Fusionsraten daraus
erstellter porziner Fibroblasten-Oozyten-Komplexe bei ansonsten identischen Fusionsbedingungen ( x ±SD)-------------------------- 112
Abbildung 36: Kerntransfer- Embryo im 32-Zellstadium nach Hoechstfärbung---- 116
Abbildung 37: Schlüpfender Kerntransfer- Embryo mit ~50 Zellen nach
Hoechstfärbung----------------------------------------------------------------- 116
Abbildung 38: Geschlüpfter Kerntransfer-Embryo mit ~90 Zellen nach
Hoechstfärbung----------------------------------------------------------------- 117
Abbildung 39: Geschlüpfter Kerntransfer-Embryo mit ~144 Zellen nach
Hoechstfärbung----------------------------------------------------------------- 117
Abbildung 40: Schlüpfende Kerntransfer-Blastozysten an Tag 6 der in vitro
Kultur ------------------------------------------------------------------------------ 118
Abbildung 41: Geschlüpfte in vitro Kerntransfer-Blastozyste an Tag 7 der
Kultur ------------------------------------------------------------------------------ 118
Abbildung 42: Ultraschallbild von Sau 10/5 an Tag 22 der Trächtigkeit ------------- 121
Abbildung 43: Ultraschallbild von Sau 686/85 an Tag 26 der Trächtigkeit---------- 121
Abbildung 44: Ultraschallbild von Sau 10/5 an Tag 29 der Trächtigkeit ------------- 122
Abbildung 45: Ultraschallbild von Sau 10/5 an Tag 59 der Trächtigkeit ------------- 122
Abbildung 46: Klonferkel Nr.3 („Björna“) am Tag nach der Geburt ------------------- 124
Abbildung 47: Klonferkel Nr. 4 („Michaela“) am Tag nach der Geburt --------------- 124
Abbildung 48: „Michaela“ und „Björna“, die ersten Klon-Schweine auf dem
europäischem Festland------------------------------------------------------- 125
Danksagung
• Ich danke besonders Herrn Prof. Dr. H. Niemann für die Überlassung des Themas
und die große Hilfsbereitschaft bei der Durchführung und Fertigstellung der Arbeit.
• Dem Leiter des Instituts für Tierzucht der FAL (Mariensee), Herrn Prof. Dr. sc. agr.
Dr. habil. Dr. h. c. F. Ellendorf, danke ich für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes.
• Der Arbeitsgruppe von Dr. Steffen Weigend, insbesondere Frau C. Reese, danke
ich für die Durchführung der Arbeiten zur Mikrosatellitenanalyse der Klonferkel.
• Mein besonderer Dank gilt Frau A. Lucas-Hahn und E. Lemme für die
Einarbeitung in die Kerntransfer-Technik, sowie für viele hilfreiche Anregungen.
• Herrn B. Petersen danke ich für die stets vorzügliche Vorbereitung und
Bereitstellung der Spenderzellen, für die intensive Mithilfe während des
Kerntransfers, sowie für unzählige Diskussionen und Anregungen.
• Frau P. Hassel danke ich für die unermüdliche tatkräftige Mithilfe im Bereich der
Oozytengewinnung, -kultivierung und -aktivierung.
• Desweiteren bin ich A. Frentzel und P. Westermann für ihre Hilfsbereitschaft bei
der Oozytengewinnung dankbar.
• Herrn L. Schindler und Frau P. Hassel danke ich für die regelmäßigen
Schlachthoffahrten, die zu einem unerschöpflichen Nachschub an Ovarien führten.
• Allen Mitarbeitern im Schweinestall, insbesondere Herrn H. Hornbostel, danke ich
für die gute Pflege und Beobachtung der Schweine, sowie für ihre umsichtige
Mitarbeit vor, während und nach den Operationen.
• C. Wrenzicky und W. A. Kues danke ich für die stets gewährte Hilfsbereitschaft.
• Bedanken möchte ich mich allgemein bei allen Mitarbeitern der Abteilung
Biotechnologie des Institutes für Tierzucht (Mariensee) der FAL für die freundliche
Arbeitsatmosphäre und die tatkräftige Unterstützung, besonders noch bei Herrn
K.-G. Hadeler für die Narkosen und Herrn D. Bunke für die Fotoarbeiten.
• Einen großen Dank an alle anderen Doktoranden für geteiltes Freud und Leid.
• Ausdrücklich bedanken möchte ich mich auch bei allen Freunden, deren
Gegenwart zu später Stunde oft für Ablenkung sorgte.
• Mein besonderer Dank gilt der DFG für die finanzielle Unterstützung.