Auswirkungen einer parasitär bedingten Nephritis auf klinisch

Aus dem Fachgebiet für Fischkrankheiten und Fischhaltung
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Auswirkungen einer parasitär bedingten Nephritis
auf klinisch-chemische Parameter
in Urin und Blut von Karpfen
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Claudia Meyer
aus Münster
Hannover 2001
Wissenschaftliche Betreuung:
Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Körting
Apl.-Prof. Dr. Dieter Steinhagen
1. Gutachter:
Univ.-Prof. Dr. Wolfgang Körting
2. Gutachter:
Univ.-Prof. Dr. Thomas Schnieder
Tag der mündlichen Prüfung:
19. November 2001
Meiner Familie gewidmet
Inhaltsverzeichnis
1
2
EINLEITUNG .................................................................................9
LITERATURÜBERSICHT...........................................................11
2.1
Die Anatomie der Karpfenniere ..............................................................................11
2.2
Histologie des Mesonephros der Karpfen..............................................................12
2.3
Osmo- und Ionenregulation der Süßwasserteleosteer...........................................14
2.4
Osmoregulatorische und exkretorische Funktion der Niere des Karpfens ..........15
2.5
Physiologische Urinzusammensetzung bei Karpfen................................................18
2.6
Ausgewählte chemische und hämatologische Parameter im Karpfenblut .............21
2.7
Pathophysiologische Beobachtungen bei Nephritiden............................................26
2.7.1
Auswirkung von Nephritiden bei Säugetieren...............................................................26
2.7.2
Urinzusammensetzung bei Fischen unter pathologischen Bedingungen...........................27
2.8
Trypanoplasma borreli.............................................................................................29
2.8.1
Biologie und Entwicklung ............................................................................................29
2.8.2
Auftreten, Bedeutung und Immunität............................................................................30
2.8.3
Diagnose und Behandlung ...........................................................................................32
2.8.4
Pathologie...................................................................................................................32
2.8.5
Allgemeine Pathohistologie ..........................................................................................33
2.8.6
Pathohistologie der Niere............................................................................................33
3
MATERIAL UND METHODEN ..................................................35
3.1
Versuchstiere ............................................................................................................35
3.2
Parasiten und Infektion............................................................................................35
3.3
Katheterisierung der Urinblase ...............................................................................36
3.4
Probensammlung ......................................................................................................39
3.5
Probenanalyse ..........................................................................................................39
3.5.1
Osmolalität und pH-Wert............................................................................................39
3.5.2
Ammoniumkonzentration.............................................................................................40
3.5.3
Bestimmung der Parasitämie und der Eythrozytengesamtzahl ........................................40
3.5.4
Hämatokrit .................................................................................................................41
3.5.5
Hämoglobin-Konzentration.........................................................................................41
3.5.6
MCV, MCH, MCHC.................................................................................................41
3.5.7
Kalium und Natrium....................................................................................................41
3.5.8
Calcium und Magnesium .............................................................................................42
3.5.9
Phosphor....................................................................................................................42
3.5.10
Bilirubin......................................................................................................................42
3.5.11
Gesamtproteine...........................................................................................................43
3.5.12
Alkalische Phosphatase (AP) und Gamma-Glutamyl-Transferase (GGT)......................43
3.6
Probenbearbeitung für die Lichtmikroskopie .........................................................43
3.7
Untersuchung zur Glucoseabsenkung .....................................................................44
3.8
Versuchsaufbau........................................................................................................45
3.9
Statistische Methoden.............................................................................................47
4
ERGEBNISSE...............................................................................48
4.1
Sektion......................................................................................................................48
4.2
Lichtmikroskopische Ergebnisse.............................................................................49
4.3
Hämatologische Ergebnisse.....................................................................................53
4.3.1
Infektionsverlauf..........................................................................................................53
4.3.2
Rotes Blutbild .............................................................................................................53
4.4
Klinisch-chemische Parameter im Blutplasma........................................................58
4.4.1
Plasmaosmolalität und -Elektrolyte ..............................................................................58
4.4.2
Gesamtprotein, -Bilirubin und AP-Aktivität..................................................................59
4.4.3
Glucoseverbrauch im Blut durch Trypanoplasma borreli ............................................62
4.5
Klinisch-chemische Parameter im Urin ...................................................................63
4.5.1
Urinfluß, Urin-pH........................................................................................................64
4.5.2
Urinosmolalität und –Elektrolyte..................................................................................64
4.5.3
AP, GGT, Ammonium ................................................................................................68
4.6
Urin-Plasma-Verhältnisse der Elektrolyte ..............................................................69
4.7
Tabellarischer Überblick über Veränderungen in Urin und Blut...........................72
4.8
Chemische Parameter in den Wasserproben..........................................................73
5
DISKUSSION ................................................................................74
5.1
Methodik ..................................................................................................................74
5.2
Histologie, Parasitämie und Hämatologie ...............................................................75
5.3
Urin und Plasma........................................................................................................78
6
7
8
ZUSAMMENFASSUNG ...............................................................85
SUMMARY....................................................................................87
LITERATURVERZEICHNIS.......................................................89
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Seite
Abb. 2.1:
Merkmale der Osmoregulation bei Süßwasserfischen
14
Abb. 2.2:
Funktionsschema der Giebelniere
17
Abb. 3.1:
Uringewinnung bei Karpfen durch Katheterisien der Urinblase
37
Abb. 3.2:
Karpfen in Rückenlage auf OP-Tisch während der
Urinblasenkatheterisierung
Abb. 3.3:
38
Ventrale Aufsicht auf Karpfen und Anordnung der Nahtschlaufen
zur Befestigung
38
Abb. 4.1:
Lichtmikroskopische Aufnahme vom Nierengewebe eines Kontrollkarpfen
51
Abb. 4.2:
Lichtmikroskopische Aufnahme vom Nierengewebe
eines Karpfen 7 Tage p.i.
Abb. 4.3:
Lichtmikroskopische Aufnahme vom Nierengewebe
eines Karpfen 14 Tage p.i.
Abb. 4.4:
51
51
Lichtmikroskopische Aufnahme vom Nierengewebe
eines Karpfen 21 Tage p.i.
51
Abb. 4.5.A-D: Parasitenzahlen und hämatologische Parameter von Karpfen im Verlauf
einer Infektion mit Trypanoplasma borreli
56
Abb. 4.6.A-C: Hämatologische Parameter von Karpfen im Verlauf einer Infektion
mit Trypanoplasma borreli
57
Abb. 4.7.A-D: Klinisch-chemische Parameter im Plasma von Karpfen im Verlauf
einer Infektion mit Trypanoplasma borreli
60
Abb. 4.8.A-E: Klinisch-chemische Parameter im Plasma von Karpfen im Verlauf
Abb. 4.9:
einer Infektion mit Trypanoplasma borreli
61
Glucoseverbrauch durch Trypanoplasma borreli
63
Abb. 4.10.A-F: Klinisch-chemische Parameter im Urin von Karpfen im Verlauf
einer Infektion mit Trypanoplasma borreli
66
Abb. 4.11.A-E: Klinisch-chemische Parameter im Urin von Karpfen im Verlauf
einer Infektion mit Trypanoplasma borreli
Abb. 4.12:
67
Urin/Plasma-Quotienten von Osmolalität und Elektrolyten bei Karpfen
im Verlauf einer T. borreli-Infektion
71
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
AP
=
Alkalische Phosphatase
Ery.
=
Erythrozyt
Fa.
=
Firma
GGT =
Gamma-Glutamyl-Transferase
GFR =
Glomeruläre Filtrationsrate
g
=
Gramm
h
=
hour (Stunde)
i. m.
=
intra musculär
l
=
Liter
MCH =
Mittlere corpusculäre Hämoglobinkonzentration
MCV =
Mittleres corpusculäres Volumen
ml
Milliliter
=
µmol =
Mikromol
mmol =
Millimol
mOsm =
Milliosmol
OP
=
Operation
pg
=
Pikogramm
P
=
Plasma
PBS
=
phosphat buffered saline (phosphatgepufferte Salzlösung)
PE
=
Polyethylen
p.i.
=
post infectionem
SPF
=
spezifisch-pathogen-frei
T
=
Tera (1012)
T.
=
Trypanoplasma
U
=
Urin
U/l
=
International units per litre (Internationale Einheiten pro Liter)
u.
=
und
v.a.
=
vor allem
Einleitung
1 EINLEITUNG
Der Flagellat Trypanoplasma borreli parasitiert im Blut von Karpfen und anderen europäischen
Cypriniden und ist bei Zuchtkarpfen weit verbreitet. Als Folge der als „Schlaffsucht“ beschriebenen
Infektion sind hochgradig befallene Fische apathisch, hängen leicht gekrümmt an der Oberfläche und
versterben nach einigen Tagen (SCHÄPERCLAUS 1990, KÖRTING 2000). Im Labor können
Fische durch Inokulation bestimmter Flagellatenzahlen infiziert werden. Nach Injektion der
Trypanoplasmen steigt die Parasitenzahl im Blut rasch an und empfängliche Fische sterben etwa 3-4
Wochen später. Die Infektion läßt sich durch Bestimmen der Flagellatenzahlen eindeutig
charakterisieren, und somit können beobachtete pathologische Veränderungen mit dem
Infektionsgrad und dem Infektionsverlauf korreliert werden (STEINHAGEN et al. 1989, LOM u.
DYKOVÁ 1992).
In vorangegangenen Arbeiten ergab sich, daß neben Apathie, Ascites und Anämie die auffälligsten
Veränderungen in Niere und Milz in Form von Splenomegalie und Nierenschwellung zu beobachten
waren (NERESHEIMER 1912, OLLENSCHLÄGER 1975, REICHENBACH-KLINKE 1980,
BUNNAJIRAKUL 1998). In der Niere wurde im Verlauf der Infektion die Struktur der Tubuli
durch Infiltration von Entzündungszellen und Trypanoplasmen zerstört (BUNNAJIRAKUL 1998,
RUDAT 1999).
Untersuchungen zur Morphologie der Tubulusepithelzellen im exkretorischen Nierengewebe
infizierter Karpfen zeigten im Elektronenmikroskop Schädigungen der Zellstruktur im distalen
Tubulus ab dem Tag 7 post infectionem (p.i.) und im proximalen Tubulus ab dem Tag 14 p.i. In den
Epithelzellenzellen der Tubuli waren vor allem vakuoläre Degenerationen der Mitochondrien zu
beobachten, die folgend zu Zellnekrosen führten (RUDAT 1999).
Die Hauptaufgabe des exkretorischen Teiles der Niere ist bei Fischen eine volumenregulatorische;
Stickstoff wird zum größten Teil über die Kiemen abgegeben (HICKMANN u. TRUMP 1969).
Um im Süßwasser den osmotischen Wassereinstrom auszugleichen, produzieren Fische große
Urinmengen bei minimaler tubulärer Wasserresorption, so daß stark verdünnter Urin abgegeben wird
(EVANS 1993).
Die im Verlauf der Infektion mit T. borreli beobachtete interstitielle Nephritis verursachte eine
Atrophie des exkretorischen Gewebes, und es wurde daher vermutet, daß diese Schäden zu einer
Störung der Osmoregulation bei den infizierten Fischen führten. Eine mögliche Dysregulation des
Ionenhaushalts der infizierten Fische konnte für die auftetenden Todesfälle mitverantwortlich gemacht
9
Einleitung
werden (BUNNAJIRAKUL 1998, RUDAT 1999). Obwohl Nierenschäden im Verlauf zahlreicher
Erkrankungen bei Fischen auftreten, fehlen funktionelle Arbeiten zu diesem Thema.
In dieser Arbeit wurden die Auswirkungen der parasitär bedingten Nephritis auf den Ionenhaushalt
und auf die Osmoregulation der Fische durch Messungen im Blut und im Urin untersucht. In einem
Infektionsversuch wurden Karpfen eines hochempfänglichen Stammes mit dem Parasiten
Trypanoplasma borreli infiziert. Mit fortschreitender Entwicklung der Parasitämie wurde in
wöchentlichen
Intervallen
bei
infizierten
Karpfen
und
bei
Kontrolltieren
durch
Urinblasendauerkatheter Urin aufgefangen und außerdem Blut entnommen.
Um zudem den Verlauf der Parasitämie und die Folgen auf das rote Blutbild dieser Fische zu
beobachten, wurden Parasitenzahlen und hämatologische Parameter bestimmt. Parallel wurden
anhand von histologischen Proben morphologische Veränderungen im Nierengewebe sowie das
Ausmaß der Schäden dokumentiert und mit den physiologischen Daten verglichen.
Die Ergebnisse der physiologischen Untersuchungen in Blut, Plasma und Urin wurden mit den
histopathologischen Befunden verglichen.
10
Literaturübersicht
2 LITERATURÜBERSICHT
2.1
Die Anatomie der Karpfenniere
Die Niere der Knochenfische erstreckt sich retroperitoneal als paariges Organ ventral entlang der
Wirbelsäule am dorsalen Rand der Leibeshöhle (BOND 1979; ROBERTS 1989). Sie liegt
sattelförmig zwischen cranialem und caudalem Anteil der Schwimmblase und weist in ihrer
Morphologie eine große Vielfalt auf (HICKMAN u. TRUMP 1969, SAKAI 1985).
Die Niere der Teleosteer läßt sich in eine craniale Kopfniere und eine caudale Rumpfniere einteilen.
Die Kopfniere (Pronephros) besteht größtenteils aus hämatopetischem Gewebe und gleicht
funktionell dem roten Knochenmark der Säugetiere; der mittlere und caudale Abschnitt der
Rumpfniere (Mesonephros) übernimmt harnexkretorische und osmoregulatorische Aufgaben
(AMLACHER 1992, ROBERTS 1989).
Die Niere des Karpfens (Cyprinus carpio) zeigt, ähnlich wie Leber, Milz und Gonaden, keine feste
äußere Gestalt. Durch Wechselbeziehungen zu anderen Leibeshöhlenorganen, jahreszeitliche oder
altersmäßige Veränderungen kann die Niere nach REICHLE (1959) unter Beibehaltung typischer
Grundzüge in ihrer äußeren Gestalt individuelle Unterschiede aufweisen. Die Farbe der Nieren
variiert bei verschiedenen Fischarten von dunkelrot über hell- und dunkelbraun zu schwarz.
Obwohl die Niere ontogenetisch aus einer paarigen Struktur ensteht, variiert die adulte Form
artspezifisch von zwei getrennten parallelen Organen über verschiedene Formen der Fusion bis zur
kompletten Verschmelzung, wie sie bei Salmoniden gefunden wird (ROBERTS 1989). Bei
Cypriniden können Kopf- und Rumpfniere makroskopisch deutlich unterschieden werden; der
mittlere und hintere Abschnitt der Rumpfniere sind verschmolzen (OGAWA 1961).
Bei jungen Karpfen ist der craniale Teil der Rumpfniere im Verhältnis zu den beiden anderen
Abschnitten aufgrund der engen Raumverhältnisse zwischen Schwimmblasenwand und Wirbelsäule
am schwächsten ausgebildet. Dicht beiderseits der Wirbelsäule wird das Nierengewebe in die
Zwischenwirbelräume gedrückt (REICHLE 1959). Der mittlere paarige Hauptteil der Rumpfniere,
der die Hauptmasse der Niere ausmacht, ist in der Mittellinie verbunden. Die dreiecksförmigen
Lappen liegen dorsolateral der Schwimmblase auf. Der caudale Teil ist deutlich gegen den mittleren
abgesetzt und besteht aus einem unpaaren Streifen. In die Ventralfläche ist die Caudalvene
eingebettet. An den beiden Lateralflächen liegen die Harnleiter (Wolffsche Gänge), die sich kurz vor
der Mündung in die Harnblase an der Ventralseite vereinigen (SAKAI 1985). Die beschriebenen
Verhältnisse können insbesondere bei der Entwicklung der Geschlechtsorgane starken
11
Literaturübersicht
Formumbildungen unterliegen. Davon ist vor allem der caudale Abschnitt betroffen, der dann deutlich
zur Seite verdrängt und stark reduziert wird (REICHLE 1959).
Der produzierte Urin wird aus den Tubuli zunächst über ein Verzweigungssystem von Sammelröhren,
die dann in die beiden sekundären Harnleiter münden, abgeleitet. Die Harnblase stellt lediglich eine
Ausweitung der Harnleiter dar und ist mit der Harnblase der höheren Wirbeltiere nicht zu
homologisieren (STOSKOPF 1993). Über einen als Urethra bezeichneten sehr kurzen
Ausführungsgang mündet die Harnblase zusammen mit dem Gonodukt unmittelbar hinter dem After
nach außen.
2.2
Histologie des Mesonephros der Karpfen
Im Gegensatz zur Säugetierniere läßt die Fischniere keine Segmentierung in Nierenrinde und
Nierenmark erkennen. Die Nephrone sind in ein ausgedehntes interstitielles Gewebe mit vorwiegend
hämatopoetischer Funktion eingebettet (HENTSCHEL 1977). In allen Strukturen der Niere,
besonders um die Nierenkörperchen herum, ist hämatopoetisches Gewebe zu finden (SAKAI
1985). Somit hat die Nachniere neben ihrer Funktion als exkretorisches und osmoregulatorisches
Organ eine der Kopfniere vergleichbare Funktion als lymphoides Organ.
Bis auf wenige Ausnahmen hat die Kopfniere bei den Fischen ihre exkretorische Funktion verloren
und weist keine Tubuli mehr auf, deshalb soll hier nur auf die Rumpfniere der Karpfen eingegangen
werden.
Die funktionell-histologische Baueinheit der exkretorischen Niere ist das Nephron (ROMER u.
PARSONS 1983). Aufgrund histologischer Beobachtungen läßt sich das Nephron in verschiedene
Abschnitte einteilen: Das Nierenkörperchen (Corpusculum renale) besteht aus dem Glomerulum und
der Bowmanschen Kapsel. Daran schließt sich das Tubulussystem an. Das Nephron eines typischen
Süßwasserknochenfisches umfasst Glomerulum, Halsabschnitt, Proximales Segment 1 und 2, ein
intermediäres Segment, ein distales Segment und ein Sammelrohrsystem (HICKMAN u. TRUMP
1969). Das Karpfennephron weist alle diese Abschnitte auf. Fische haben im Gegensatz zur
Säugetierniere keine Henlesche Schleife (LEHMANN 1991, STOSKOPF 1993).
Mikroskopisch zeigt sich bei Cypriniden ein gut vaskularisiertes Glomerulum, ein bewimperter Hals,
zwei deutlich abgesetzte proximale Segmente, wovon eines durch einen prominenten Bürstensaum
und das zweite durch zahlreiche Mitochondrien, aber einen weniger entwickelten Bürstensaum
charkterisiert ist. Das intermediäre Segment ist eng bewimpert (ROBERTS 1989). Süßwasserfische
haben
funktionsbedingt
(hohe Wasserausscheidung) mehr und größere Glomerula als
12
Literaturübersicht
Salzwasserfische (hohe Wasserretention), die zum Teil aglomeruläre Nieren haben (HARDER 1975,
STOSPOPF 1993). Fischglomerula sind in ihrer Struktur mit denen der Säugetiere vergleichbar; das
Kapillarknäuel jedoch besteht nur aus einer einzigen, sich nicht aufteilenden Kapillarschlinge
(MACHNER 1986). Karpfenglomerula messen im Mittel 40µm im Durchmesser (REICHLE 1957).
Der sich an das Glomerulum anschließende Hals des Tubulus ist kurz und hat beim Karpfen einen
kleinen Durchmesser von 2,0-3,2 µm, seine basophilen Epithelzellen haben eine kuboidale
Morphologie.
Der proximale Tubulus der Karpfenniere ist länger, seine eosinophilen Epithelzellen sind
hochprismatisch, und die Kerne liegen zentral. Der Durchmesser des proximalen Tubulus beträgt
beim Karpfen 6,5-12 µm (ENDO u. KIMURA 1982). Das intermediäre Segment hat
hochprismatische und schwach eosinophile Zellen. Der Durchmesser des Lumens liegt zwischen 2,5
und 5,0 µm. Bei dem Zwischenstück des Tubulussystems handelt es sich um einen spezialisierten
Abschnitt vom Segment 2 des proximalen Tubulus. Es ist vor allem bei Cypriniden gut ausgebildet,
fehlt aber vielen Fischen (TAKASHIMA u. HIBIYA 1995).
Der distale Tubulus ist sehr lang und groß, die epithelialen Zellen sind schwach eosinophil und
flachprismatisch, die Zellkerne liegen basal (STOSKOPF 1993). Die Durchmesser sind groß (6,926,5 µm) und werden Richtung Sammelrohr noch größer (ENDO u. KIMURA 1982). Weder der
distale Tubulus noch die Sammelrohre zeigen einen Bürstensaum. Bei Nephronen von marinen
Fischen fehlt der distale Tubulus gänzlich.
Beim Karpfen ist lichtmikroskopisch keine deutliche Grenze zwischen distalem Tubulus und
Sammelrohr festzustellen. Die Höhe des Epithels und des Lumens nehmen im Verlauf des
Sammelrohres zu (17,0-36,8 µm), und das Epithel ist am Ende mehrreihig (REICHLE 1957). Der
paarig angelegte Harnleiter beginnt im cranialen Teil der Rumpfniere, und auch sein Durchmesser
nimmt in craniocaudaler Richtung kontinuierlich zu (MACHNER 1986).
Anders als beim Säuger scheint mit dem Körperwachstum der Fische eine Vergrößerung der Niere
durch Neubildung von Nierenkanälchen möglich zu sein (HENTSCHEL u. MEYER 1980).
Durch histochemische Studien konnten Enzymaktivitäten in der Niere von Fischen histologisch
sichtbar gemacht werden. Die Alkalische Phosphatase kann als Leitenzym des Bürstensaums im
proximalen Tubulus angesehen werden (HACKERT-KORDE 1977, HENTSCHEL u. MEYER
1980). Die Na/K-ATPase ist vor allem in den Abschnitten des Nephrons mit dem größten
Lumendurchmesser zu finden. Hier wird eine aktive Resorption von Natrium durch langsameren
Urinfluß verstärkt betrieben. Die größte Aktivität aerober Enzyme (Malat-, Isocitrat-, u. NADH–
13
Literaturübersicht
Dehydrogenase) konzentriert sich auf den distalen Tubulus und die Sammelrohre. Dort ist auch die
β-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase lokalisiert. Diese Tatsache weist daraufhin, daß hier Fettsäuren
und Ketone als Hauptenergiequelle für den Citratzyklus und die oxidative Phosphorylierung genutzt
werden können. Die daraus resultierende Energie kann dann wiederum für den aktiven Transport
von Natrium aus dem Harn in die Epithelzelle genutzt werden. Das Aktivitätsmaximum der
anaeroben, glykolytischen Enzyme (Hexokinase, Aldolase u. Glucose-6-Phosphatase) befindet sich
in Tubulusabschnitten mit Bürstensaum (ENDO u. KIMURA 1982).
2.3
Osmo- und Ionenregulation der Süßwasserteleosteer
Im Süßwasser ist die Umwelt der Fische im Vergleich zur Körperflüssigkeit hypoosmotisch und das
Plasma der Teleosteer ist daher hyperosmotisch im Vergleich zum Süßwasser. Das Süßwasser neigt
dazu, entlang des osmotischen Gradienten über die Kiemen und permeable Oberflächen des Pharynx
in die Körperflüssigkeit einzudringen (ROBERTS 1989, EVANS 1993). Zusätzlich besteht ein
Konzentrationsgradient, der die Diffusion von Salzen über die permeablen Oberflächen begünstigt
(BONE u. MARSHALL 1985). Das bedeutet für Süßwasserfische die Gefahr einer ständigen
Volumenzunahme und eines Salzverlustes, während Salzwasserfische möglichen Volumenverlusten
und Salzzunahmen gegensteuern müssen.
Abb. 2.1: Merkmale der Osmoregulation bei Süßwasserfischen (nach WEDEMEYER 1996)
14
Literaturübersicht
Dieses osmotische Problem der Süßwasserfische wird durch die Niere, die große Volumina
verdünnten, hypotonen Urins produziert, kompensiert. Daher ist die glomeruläre Filtration von
großer Bedeutung (ROBERTS 1989). Es wird in der Niere Urin produziert, der sehr niedrige
Natrium- und Chloridkonzentrationen aufweist und dann im Vergleich zum Blutplasma weniger als
10% an osmotisch wirksamen Substanzen enthält (EVANS 1993). Der trotz des stark verdünnten
Urins noch bestehende Ionenverlust, es gehen zusätzlich noch Ionen passiv über die Kiemen
verloren, wird durch die aktive Aufnahme von Natrium und Chlorid über die Kiemen und durch die
Absorption aus der Nahrung über die Darmwand im Gleichgewicht gehalten (ROBERTS 1989).
Der Hauptweg der Stickstoffexkretion bei Teleosteern führt über die Kiemen, vor allem in Form von
Ammoniak und Harnstoff. So kann Natrium dort im Austausch gegen Ammoniak und zusätzlich auch
gegen Wasserstoffkationen aufgenommen werden (BONE u. MARSHALL 1985).
Die Osmoregulation unterliegt hauptsächlich der endokrinen Kontrolle durch Hormone der hinteren
Hypophyse und der Nebenniere. Prolaktinähnliche Hormone regulieren den Natriumabfluß über die
Kiemen, beeinflussen aber auch die Niere und die Blasenwand. Corticoide modifizieren ebenfalls den
Ionentransport und die Permeabiltätsmerkmale verschiedener Gewebe. Auf diese Weise können
zahlreiche endokrine Veränderungen in Verbindung mit der sexuellen Reife sekundär die Ionen- und
Osmoregulation beeinflussen (ROBERTS 1989).
2.4
Osmoregulatorische und exkretorische Funktion der Niere des Karpfens
Die Nieren der Süßwasserteleosteer konservieren in erster Linie im Glomerulum aus dem Blut
filtrierte Elektrolyte, gleichzeitig enstehen große Urinmengen um den osmotischen Wassereinstrom
auszugleichen. Dafür benötigen sie einen hocheffektiven Reabsorptionsmechanismus für monovalente
Ionen in Verbindung mit einer minimalen tubulären Permeabilität für filtriertes Wasser (HICKMANN
u. TRUMP 1969). Der recht hohen glomerulären Filtrationsrate (GFR) bei Süßwasserteleosteern
folgt ein nur wenig geringerer Urinfluß (EVANS 1993). So wurde bei Untersuchungen beim Karpfen
ein Urinfluß von ca. 8 ml in einer Stunde pro kg Körpergewicht gemessen (KAKUTA et al. 1986).
Für den Urinfluß von Teleosteern in Süßwasser sind allerdings stets große Schwankungen
beschrieben worden (HICKMANN u. TRUMP 1969). KAUNE (1980) fand beim Giebel einen
erhöhten
Urinfluß
bei
isotoner
Volumenexpansion
und
konnte
damit
deutlich
die
volumenregulatorische Funktion der Niere nachweisen. Große simultane Veränderungen in der GFR
15
Literaturübersicht
und der Urinproduktion finden bei normalen Fischen ohne eine Änderung der Urinkonzentration
statt. Es scheint, daß der wechselnde Einsatz von Glomerula unter veränderlichen Bedingungen eine
bedeutende Rolle bei der Nierentätigkeit spielt. Messungen der GFR bei Forellennephronen haben
gezeigt, daß im Süßwasser 45% aller Nephrone filtern, im Meerwasser jedoch nur 5%; diese
Fähigkeit wird glomeruläre Intermittenz genannt (HENTSCHEL et al. 1978, ELGER 1982). Die
Fähigkeit zur Reduzierung der GFR ist eine außerordentlich effektive Regulationsmöglichkeit zum
Beispiel bei steigender Salinität des Wassers und kann in einer Atrophie von Glomerula enden
(HICKMANN u. TRUMP 1969, ELGER u. HENTSCHEL 1981).
Die im Tubulus stattfindenden Transportprozesse und -orte (Abb. 2.2) sind zum Teil noch
hypothetisch und ergeben sich aus dem Vergleich mit homologen Strukturen anderer Vertebraten
(HENTSCHEL u. MEYER 1980). Studien haben gezeigt, daß das Epithel des proximalen Tubulus
bei Süßwasserteleosteern NaCl in den Urin sezerniert, möglicherweise über Na/Cl-Cotransport, und
so osmotisch Wasser nachzieht (EVANS 1993). Zweiwertige Ionen werden im proximalen Tubulus,
insbesondere Calcium, gegen ihren Konzentrationsgradienten aus dem Ultrafiltrat reabsorbiert, so
daß ihre Konzentration im Urin sehr gering sind.
Der distale Tubulus ist undurchlässig für Wasser. Gleichzeitig erfolgt hier eine Reabsorption von
Natrium und Chlorid, woraus ein stark verdünnter Urin resultiert. Da der distale Tubulus bei allen im
Süßwasser lebenden Fischen vorhanden ist, aber bei fast allen stenohyalinen Salzwasserfischen fehlt,
unterstützt dies die Annahme, daß der distale Tubulus und die Sammelrohre für die Urinverdünnung
notwendig sind (HICKMANN u. TRUMP 1969).
Anhand der Morphologie und der Histochemie kann für die Zellen des distalen Tubulus auf ein
Potential für aktiven Ionentransport geschlossen werden. In Zellen des distalen Tubulus und der
Sammelrohre konnte eine hohe Aktivität der Na/K-ATPase, die für den aktiven Transport von
Natrium an Membranen zuständig ist, nachgewiesen werden (HENTSCHEL u. MEYER 1980).
Eine hohe Aktivität von Mitochondrien und oxidativen Enzymen im distalen Tubulus unterstützt den
stark energieverbrauchenden aktiven Transport (HENTSCHEL u. ELGER 1987). Hier wird
Natrium aktiv reabsorbiert, Chlorid strömt passiv nach. Die Feinstruktur der Epithelzellen des
distalen Tubulus der Fischniere weist Gemeinsamkeiten mit den Ionozyten („Chloridzellen“) auf, die
in der Kieme für die Salzaufnahme verantwortlich gemacht werden (HENTSCHEL 1978).
Zusätzlich wird der starken Schleimauskleidung der Sammelrohre und Harnleiter bei
Süßwasserfischen eine Bedeutung beim Natriumrücktransport zugesprochen, zum Beispiel in einer
Anlagerung von Kationen an die Polyanionen des Mucus (HENTSCHEL u. MEYER 1980). Bei
16
Literaturübersicht
Untersuchungen an Giebeln ergab sich eine gleichmäßige Verteilung von Becherzellen in allen
Harnleiterabschnitten (HENTSCHEL et al. 1978).
Abb. 2.2: Funktionsschema der Giebelniere nach HICKMANN u. TRUMP (1969) und
HENTSCHEL et al. (1978)
17
Literaturübersicht
Für die endgültige Zusammensetzung des Urins wird eine aktive Rolle der Harnblase diskutiert, die
eine Ausweitung der Vereinigung der Harnleiter darstellt und daher mit der Harnblase der Säugetiere
aufgrund der embryologischen Entwicklung nicht vergleichbar ist (BONE u. MARSHALL 1985).
Untersuchungen bei Regenbogenforellen (Oncorhynchus mykiss) zeigten, daß in der Blase die
Ionenreabsorption bei gleichzeitiger Impermeabilität für Wasser recht hoch ist. Die Blase hat also bei
diesen Fischen eine wesentliche Bedeutung bei der Kontrolle des Salzverlustes über den Urin
(EVANS 1993). Die Blasen von Karpfen erwiesen sich bei Volumenmessungen als sehr klein, ihr
Fassungsvermögen lag bei 1,5-2,0 ml pro kg Körpergewicht (KAKUTA et al. 1986). In Studien zu
verschiedenen Fischurinblasen konnte bei der Blasenmembran der Karpfen keine Durchlässigkeit für
Wasser, und nur eine sehr geringe Permeabilität für Natrium und Chlorid festgestellt werden
(HIRANO et al. 1973).
2.5
Physiologische Urinzusammensetzung bei Karpfen
Zur Urinzusammensetzung bei Karpfen liegen nur wenige Studien vor; recht detailliert wurden Teile
der physiologischen Urinzusammensetzung im Vergleich zum Plasma und deren Verläufe über 3 Tage
verweilende Blasenkatheter von KAKUTA et al. (1986) gemessen. In dieser Studie an ca. 200 g
schweren, bei 29°C Wassertemperatur gehaltenen Karpfen ergab sich eine Urinosmolarität von
ungefähr einem Zehntel der Plasmaosmolarität, im Mittel von 248,4 auf 29,4 mOsm/l. Es wurde
deutlich, daß die Urinverhältnisse in den stündlich vorgenommenen Messungen nicht konstant waren.
Das Urinvolumen schwankte in diesen Proben recht weit, während die Osmolarität und der pH-Wert
im Urin keine signifikanten Unterschiede aufwiesen, so daß keine Korrelation zwischen diesen 3
Parametern vorlag. Bei den untersuchten Elektrolyten machte Natrium mit ca. 70-80% Anteil an der
gesamten Kationenkonzentration den größten Teil aus. Diese Befunde stimmen weitgehend mit den
an Süßwassergiebeln gewonnenen überein (HENTSCHEL et al. 1978).
Die Natriumkonzentration und die Osmolarität im Urin zeigten bei den von KAKUTA et al. (1986)
untersuchten Karpfen im Verlauf von 3 Tagen signifikant korrelierte Veränderungen. Andererseits lag
aber kein Zusammenhang zwischen Urinfluß und Natriumkonzentration vor. Veränderungen des
Urinflusses gingen ohne wesentliche Konzentrationsveränderungen von Natrium im Urin einher. Die
Elektrolyte Kalium, Calcium und Magnesium schwankten in ihren Konzentrationen nur gering. Direkt
nach der Katheterisierung konnte ein initialer Anstieg der Magnesiumkonzentration beobachtet
werden.
18
Literaturübersicht
Ammonium wurde von KAKUTA et al. (1986) in recht hohen Konzentrationen im Urin
nachgewiesen, obwohl diese Stickstoffverbindung hauptsächlich über die Kiemen abgegeben wird.
In einer späteren Untersuchung (KAKUTA et al. 1992) wurden dann wesentlich geringere
Ammoniumkonzentrationen im Urin gemessen; Angaben zum Urin-pH fehlen dort. Aus
Untersuchungsergebnissen beim Giebel (Carassius auratus gibelio B.) wurde eine pH–abhängige
renale Ammoniumausscheidung ersichtlich. Bei saurem Urin war die Ammoniumausscheidung
deutlich erhöht (KAUNE 1980). In saurem Urin bildet sich aus Ammoniak das schwer diffusible
Ammonium, und für Ammoniak bleibt so ein Konzentrationsgradient zum Tubuluslumen bestehen,
was eine erhöhte Ausscheidungsrate der Giebel von Ammonium erklären konnte.
Untersuchungen zur Nierenfunktion mit Hilfe von Clearancetechniken zeigten, daß bei Giebeln für
Phosphat sowohl ein resorbierender als auch ein sezernierender Mechanismus im Nephron existieren
muß (KAUNE 1980). Bei Infusion von Phosphat resultierten hohe tubulärer Ausscheidungsraten.
Das Ausmaß der aktiven Phophatsekretion bewies eine große regulatorische Funktion der Niere und
zeigte, daß die Giebelniere eine wichtige Rolle bei der Regulation des Phosphatspiegels im Plasma
spielt. Da die Giebel mit einer induzierten renalen Phospatsekretion einen niedrigeren pH-Wert im
Urin aufwiesen, vermutete KAUNE (1980) außerdem eine Beteiligung von Phosphat an der
Säureausscheidung.
In einer Studie zu Urinverhältnissen bei Karpfen (KAKUTA et al. 1986) konnte in allen Urinproben
Proteine gefunden werden, allerdings wiesen die Proteinspiegel eine große Variabilität auf, ohne daß
sich eine Periodizität beobachten ließ. Insgesamt wurden sehr niedrige Konzentrationen von
Proteinen im Urin gefunden, so machte der Anteil im Urin 0,12 - 0,3% des im Karpfenplasma
gemessenen aus (KAKUTA et al. 1986, KAKUTA et al. 1992).
Für
nephrologische
Untersuchungen
empfehlen
KAKUTA
et
al.
(1986)
eine
Dauerblasenkatheterisierung und Urinsammlung in 6-Stunden-Intervallen beim Karpfen, um einerseits
zur Analyse ausreichende Urinmengen zu erhalten und andererseits Veränderungen in
Urinzusammmensetzungen erkennen zu können (KAKUTA et al. 1986).
19
Literaturübersicht
Tabelle: 2.1: Übersicht über ionale Zusammensetzung von Urin und Plasma, sowie Urinfluß bei
gesunden Cypriniden
KAKUTA et al. (1986)
KAKUTA et al. (1992)
KAUNE (1980)
Karpfen 200 g,
Karpfen 300-400 g,
Giebel 60-170 g,
29°C
16°C
22-24°C
Urin
Urinfluß
(ml/kg/h)
Plasma
8,37
± 1,57
248,4
pH-Wert
Natrium
(mOsm)
(mmol/l)
Kalium
(mmol/l)
Calcium
(mmol/l)
Magnesium
Plasma
3,86
± 1,01
258
± 11,2
7,23
± 0,06
n.b.
n.b.
n.b.
6,86
± 7,17
n.b.
12,05
.± 0,68
119,2
4,8
± 0,84
120,8
1,93
± 0,5
133,7
1,40
± 0,28
5,16
3,28
± 0,68
3,73
± 0,59
± 0,28
2,84
n.b.
n.b.
n.b.
n.b.
1,97
± 0,09
1,44
0,27
± 0,11
± 3,4
0,8
± 0,31
± 1,37
3,18
0,32
± 0,13
± 0,19
1,42
± 0,29
Phosphor
n.b.
n.b.
0,19
± 0,08
0,13
± 0,07
(mmol/l)
107,1
± 17,7
25,0
8,8
± 3,7
± 1,1
± 9,31
3,2
15
± 1,4
262
± 8,1
(mmol/l)
(mg/l)
Urin
11
± 1,5
0,12
± 0,03
Ammonium
Plasma
3,4
± 0,5
29,4
± 1,2
Osmolalität
Urin
± 4,7
± 1,4
± 0,6
0,64
± 0,2
1,68
± 0,38
2,0
± 0,47
18,4
±2,7
± 0,09
6,68
± 0,56
n.b.: nicht bestimmt
Durch die Ausschüttung von Stresshormonen nach einer Katheterisierung kann bei Fischen eine
Labordiurese beobachtet werden. Bei Regenbogenforellen allerdings sind Urinfluß und
Urinzusammensetzung 12 bis 24 Stunden nach einem Eingriff wieder weitgehend normal, und das zur
Betäubung verwendete Tricain wird in dieser Zeit ebenfalls ausgeschieden. Auch bei Giebeln sind
20
Literaturübersicht
Veränderungen in diesem Zeitraum weitgehend kompensiert, auch wenn noch eine geringe Oligurie
verzeichnet werden konnte (KAUNE 1980).
2.6
Ausgewählte chemische und hämatologische Parameter im Karpfenblut
Allgemein ist bei Fischen eine große Variationsbreite von zellulären und chemischen Parametern im
Blut festzustellen. Die in der Literatur angegebenen Messwerte für Karpfen sind deshalb nur als
Orientierungshilfen zu werten (s. Tab. 2.2, 2.3 u. 2.4). DOMBROWSKI (1953) stellte bereits im
morphologischen Blutbild von Karpfen große individuelle Schwankungen fest, und BÖTTCHER
(1998) fand in Untersuchungen von klinisch-chemischen Parametern bei Labor- und Teichkarpfen
weitgehende Abhängigkeiten von Jahreszeit, Temperatur, Fütterung und Körpergröße.
Die Osmolalität im Fischplasma wird zum größten Teil durch die Konzentrationen der Ionen Natrium
und Chlorid bestimmt, die über 75% der Osmolalität ausmachen. In geringerem Maße sind Kalium,
Calcium, Magnesium, Phosphate, Sulfate und „non-protein-nitrogen“-Verbindungen, insbesondere
Harnstoff, an der Gesamt-Osmolalität beteiligt (EVANS 1993). Die große Breite an Einflüssen, auf
die die Osmolalität empfindlich reagiert, lassen sich neben circadianen Schwankungen in drei
Kategorien
einteilen.
Diese
sind
Salinitätsveränderungen
des
umgebenden
Wassers,
Verunreinigungen des Wassers, die die Kiemenfunktion beeinträchtigen und stressbedingte MuskelLaktatacidose,
die
eine
erhöhte
intrazelluläre
Osmolalität
zur
Folge
hat.
Um
das
Konzentrationsgefälle auszugleichen, erfolgt ein Einstrom von Wasser aus dem Extra- in den
Intrazellularraum, erhöht sich die Plasmakonzentration von Natrium und Chlorid und damit die
Osmolalität des Plasmas. Bei Streß, der länger als 30 Minuten anhält, tritt die Wirkung einer
chronischen Erhöhung des Catecholaminspiegels in den Vordergrund. Die Ionen- und
Elektrolytflüsse in Kiemen und Nieren werden dann so beeinflusst, daß es bei Süßwasserfischen zu
einem Natriumchlorid-Verlust kommt (MCDONALD u. MILLIGAN 1992). Außerdem können
verschiedene Erkrankungen die Plasma-Osmolalität beeinflussen, zum Beispiel führen Schädigungen
der Barrieren zur Außenwelt wie Haut und Darmschranke bei Süßwasserfischen zum verstärkten
Wassereinstrom und damit zu einer Erniedrigung der Plasmaosmolalität (STOSKOPF 1993). Auch
die Temperatur des Wassers hat Einfluß auf die Osmolalität. So stellte BÖTTCHER (1998) bei
15°C Wassertemperatur höhere Plasma-Osmolalitäten fest als bei 20°C gehaltenen Karpfen.
21
Literaturübersicht
Weniger als 2% des Gesamtkörperanteils an Kalium ist extrazellulär vorhanden. Als Folge haben
zum Beispiel Veränderungen der Kiemenpermeabilität wenig Auswirkung auf den Plasmaspiegel,
weil jeder Ein- oder Ausstrom durch einen Transfer von Kalium in das oder aus dem intrazellulärem
Kompartiment aufgefangen wird. Umstände, die eine intrazelluläre Azidose verursachen, können
durch Freisetzung aus Muskelzellen einen starken Kaliumanstieg im Plasma bewirken. Aufgrund des
hohen Kaliumspiegels in Erythrozyten kann auch eine Hämolyse einen Anstieg der
Kaliumkonzentrationen im Plasma verursachen (MCDONALD u. MILLIGAN 1992).
Calcium ist sowohl bei Süß- als auch bei Salzwasserfischen eng reguliert (MCDONALD u.
MILLIGAN
1992).
Selbst
bei
starkem
Stress
unter
Hypoxie
steigen
die
Plasmacalciumkonzentrationen von Karpfen nicht (KAKUTA et al. 1992). Eine Fraktion des
Gesamtcalciumgehaltes des Fischplasmas ist stets an Proteine gebunden. Die gebundene CalciumFraktion liegt bei männlichen und nicht geschlechtsreifen weiblichen Süßwasserfischen bei etwa 3048%. Trotz des bei der Vitellogenese erfolgenden massiven Anstiegs des Proteinspiegels im Plasma
und damit auch des Gesamtcalciumgehaltes, bleibt der Anteil an freiem Calcium im Plasma konstant
(MCDONALD u. MILLIGAN 1992).
Die Magnesiumspiegel im Plasma der Süßwasserfische sind allgemein etwas niedriger als die
Calciumspiegel, aber ähnlich eng reguliert wie diese. Bei Hypoxie allerdings war ein deutlicher
Anstieg im Karpfenplasma und folgend eine erhöhte renale Magnesiumexkretion zu vermerken
(KAKUTA at al. 1992). Etwa 25% des Magnesiums ist bei Regenbogenforellen an Plasmaproteine
gebunden (MCDONALD u. MILLIGAN 1992).
Für die Verteilung der vasalen und extravasalen Anteile der extrazellulären Flüssigkeit tragen die
Plasma-Proteine bei Säugetieren eine große Verantwortung und spielen so eine wichtige Rolle als
Träger des kolloidosmotischen Drucks und als Puffersubstanzen (BICKHARDT 1992). Die
Gesamtproteine des Plasmas der Knochenfische setzen sich zusammen aus Albuminen,
Immunglobulinen, Gerinnungsproteinen, Calcium-bindenden Proteinen, Metall-bindenden Proteinen,
Lipoproteinen und hormonbindenden Proteinen. Veränderungen des Gesamtproteingehaltes kommen
beim Fisch hauptsächlich durch Wechsel im Plasmavolumen zustande. Ein Anstieg der
Gesamtproteinkonzentration kann durch Verschiebungen der extrazellulären Flüssigkeit in den
intrazellulären Raum begründet sein, ein Abfall durch eine Hydratation des Plasmas (MCDONALD
u. MILLIGAN 1992). Bei Untersuchungen an adulten, in einem Warmwasserkreislauf gehaltenen
Karpfen stellte HILGE (1980) fest, daß der Plasmaproteingehalt über einen Zeitraum von 14
Monaten kaum schwankte. BÖTTCHER (1998) fand allerdings bei untersuchten Laborkarpfen
einen deutlichen Abfall des Gesamtproteinspiegels und der Osmolalität im Juli. Außerdem stiegen die
22
Literaturübersicht
Gesamtproteinkonzentrationen im Plasma bei Teich- und Laborfischen mit zunehmendem Alter an.
Zudem beeinflußten Futtergaben vor der Probennahme den Proteingehalt im Plasma, so waren bei
nüchternen Laborkarpfen höhere Gesamtproteingehalte zu beobachten als bei Fischen, die vor der
Probennahme gefüttert worden waren (BÖTTCHER 1998).
Für den Energiestoffwechsel ist Glucose das obligate Substrat. Homöostase der PlasmaGlucosekonzentration ist deshalb Voraussetzung ungestörter Lebensfunktionen (BICKHARDT
1992). Da der Blutglucosespiegel von der Intensität des Energiewechsels abhängt, ist der mittlere
Blutglucosespiegel bei gleichwarmen Tieren höher als bei wechselwarmen Tieren (URICH 1990).
Der Blutglucosespiegel bei Fischen variiert innerhalb der Arten; schwimmaktive Fischarten weisen
höhere Werte auf als träge Arten. Auch innerhalb einer Fischart können erhebliche Schwankungen
des Blutglucosespiegels auftreten, was auf Unterschiede in Ernährung, Alter, Größe und
insbesondere Reproduktionsstatus zurückzuführen ist (MCDONALD u. MILLIGAN 1992). So
wurde bei Vergleichsmessungen im Blutplasma von Teichkarpfen eine deutliche Saisonalität mit
Höchstwerten im Juli und außerdem niedrigere Spiegel bei ungefütterten als bei gefütterten Karpfen
festgestellt (BÖTTCHER 1998). Aufgrund der zentralen Bedeutung von Glucose wird jedoch eine
bestimmte Blutglucosekonzentration aufrechterhalten (SCHÄPERCLAUS u. LUKOWICZ 1998).
Untersuchungen ergaben allerdings, daß die Regulationsfähigkeit von Fischen bezüglich Insulin
unzureichend und daher ihr Blutglucosemetabolismus vermindert ist, vergleichbar mit dem von
Diabetikern bei Säugern (HEPHER 1988).
Der Blutglucosespiegel von Fischen gilt als ein sensitiver Indikator für Streß. Durch catecholaminerge
Stimulation wird Glycogen aus der Leber mobilisiert und eine relative Hyperglycämie
unterschliedlichen Ausmaßes und Dauer resultiert (HILGE 1980, MCDONALD u. MILLIGAN
1992). Bei Karpfen verursachte Streß unter Hypoxie eine Verdopplung des Blutglucosespiegels von
2,6 mmol/l auf 5,9 mmol/l (KAKUTA 1992). Auch Parasitenbefall kann die Glucosekonzentration
im Plasma von Fischen beeinflussen. Im Plasma von Regenbogenforellen mit einem Langzeitbefall
von Protocephalus neglectus war der Glucosegehalt, im Vergleich zu Cestoden-freien Forellen,
signifikant erniedrigt (ENGELHARDT et al. 1990).
Für die Ernährung und das Wachstum von Haemoflagellaten, wie Trypanoplasmen, ist die exogene
Glucosezufuhr von großer Bedeutung (MEHLHORN 1988). Dem Blut des Wirtsorganismus wird
durch die Flagellaten bevorzugt dieses Substrat entzogen (CHENG 1986) und bei starker
Parasitämie besteht damit die Gefahr eines Energiemangels für den Wirt.
23
Literaturübersicht
Die Alkalische Phosphatase wird bei Säugetieren, wie andere lysosomale Enzyme, bei
pathologischem Zellstoffwechsel vermehrt synthetisiert und zugleich ins Blut abgegeben
(BICKHARDT 1992). Phosphatasen sind Enzyme, die Phosphorester hydrolytisch spalten und
anorganisches Phosphat bilden. Bei Karpfen, wie auch bei Regenbogenforellen, sind die weitaus
höchsten Aktivitäten der AP in den Nieren zu finden, so daß hier die AP als Leitenzym der Niere
bezeichnet werden kann und bei Nierenschäden eine Erhöhung zu erwarten ist (HACKERTKORDE 1977, HENTSCHEL u. MEYER 1980, SCHEINERT u. HOFFMANN 1987). Bei
Regenbogenforellen werden erhebliche Schwankungen der AP-Aktivität bei unterschiedlichen
Wassertemperaturen und Ernährungszuständen festgestellt (MCDONALD u. MILLIGAN 1992).
Bei Laborkarpfen beobachtete BÖTTCHER (1998) eine positive Korrelation der Wachstumsphase
der Fische mit der AP-Aktivität im Plasma. Die Autorin schloß weiterhin aus ihren Untersuchungen
auf eine diagnostische Eignung des Plasmaenzyms AP bei Berücksichtigung saisonaler und
temperaturabhängiger Einflüsse.
Tabelle 2.2: Osmolalität und Elektrolytkonzentrationen im Blut gesunder Karpfen
REFERENZ
FUCHS U. ALBERS
KAKUTA ET AL.
OESTERREICH
(1988)
(1992)
(1996)
(PLASMA)
(PLASMA)
(SERUM)
Osmolalität (mOsm)
274
258
278-332
Natrium (mmol/l)
133
120,8
139,0-152,0
Kalium (mmol/l)
3,3
3,2
0,2-1,8
Calcium (mmol/l)
1,8
2,84
n.b.
Magnesium (mmol/l)
1,5
0,64
n.b.
Phosphor (mmol/l)
0,4
1,68
n.b.
Angaben als Mittelwerte oder als Minimum und Maximum der Mittelwerte verschiedener Untersuchungsgruppen
n.b.: nicht bestimmt
24
Literaturübersicht
Tabelle 2.3: Gesamtprotein-, Glucosekonzentrationen und AP-Aktivitäten im Blut gesunder
Karpfen
REFERENZ:
HILGE
BÖTTCHER
AMLACHER
OESTERREICH
(1980)
(1998)
(1992)
(1996)
(PLASMA)
(PLASMA)
(SERUM)
(SERUM)
Proteine (g/l)
30,9-40,8
21,3-37,6
34,7-40,8
23-38
Glucose (mmol/l)
3,55-5,33
3,44-14,54
2,22-4,44
n.b.
n.b.
21-223
n.b.
n.b.
AP (U/l)
Angaben als Mittelwerte oder als Minimum und Maximum der Mittelwerte verschiedener Untersuchungsgruppen
n.b.: nicht bestimmt
Auch bei Untersuchungen zur Hämatologie von Karpfen stellte sich heraus, daß die Parameter von
Erythrozytenzahl, Hämatokrit und Hämaglobin von Karpfen starken individuellen Schwankungen
unterliegen (HAMERS 1994). Diese hämatologischen Parameter erwiesen sich als von zahlreichen
Faktoren beeinflusst, wie Ernährungs- und Fütterungzustand, Alter und Geschlecht (AMLACHER
1992). Allen Fischen fehlt das bei Säugern für die Hämatopoese zuständige rote Knochenmark.
Seine Aufgabe wird in erster Linie von Thymus, Niere, Milz und Darm übernommen. Hierbei ist die
Kopfniere als Hauptblutbildungsstätte zu bezeichnen (ELLIS 1989).
Tabelle 2.4: Hämatologische Parameter gesunder Karpfen
REFERENZ
HAMERS
KAKUTA
HILGE
(1994)
(1992)
(1980)
Erythrozyten (1012/l)
1,56
1,27
1,48-1,71
Hkt (l/l)
0,31
0,31
0,33-0,45
Hb (g/l)
81
81
87-109
MCV (µm³)
199,7
243
211-291,8
MCH (pg)
52,8
64
55,6-76,6
MCHC (g/l)
266
260
233-292
Angaben als Mittelwerte oder als Minimum und Maximum der Mittelwerte verschiedener Untersuchungsgruppen
25
Literaturübersicht
2.7
Pathophysiologische Beobachtungen bei Nephritiden
Da in der Literatur wenig Angaben zu funktionellen Beobachtungen bei Nierenerkrankungen von
Süßwasserfischen vorhanden sind, wird im folgenden Abschnitt zunächst auf die bei Säugetieren
bekannten pathophysiologischen Veränderungen im Laufe von Nephritiden eingegangen.
2.7.1 Auswirkung von Nephritiden bei Säugetieren
Bei Säugetieren tritt eine sekundäre interstitielle Nephritis unterschiedlicher Pathogenese meist
herdförmig auf, bei umfangreichem Nephronenverlust kann sie zur chronischen Niereninsuffizienz
führen. Eine primäre interstitielle Nephritis zeigt meist ein diffuses Auftreten und führt ebenfalls zu
einer Niereninsuffizienz. Mit zunehmendem Nephronenverlust durch entzündlich-proliferative
Nephropathien oder auch toxischer Tubulonephrosen steigen nach BICKHARDT (1992) infolge
Autoregulation die Filtrationsleistung und der Harnfluß in den intakten Nephronen. Jedoch können
die tubulären Prozesse dieser Nephrone nicht entsprechend gesteigert werden. Es kommt zu
reduzierter Kalium- und Wasserstoffsekretion und zu reduzierter Natrium- und Wasserreabsorption.
So folgen daraus zunächst eine Polyurie, Hyperkaliämie, Hyponatriämie, renale Acidose und
Senkung der Urinosmolarität.
Erst wenn mehr als 50% der Nephrone zerstört sind, geht die GFR so stark zurück, daß die
harnpflichtigen Produkte des Protein-Katabolismus retiniert werden. Dies ist das Stadium der
beginnenden Urämie, die Spiegel von Creatinin und Harnstoff im Plasma steigen. Bei
Nephronenverlust von über 70% können sich unzureichende Filtration und unzureichende
Reabsorption hinsichtlich der Wasser- und Natrium- Ausscheidung die Waage halten. Dadurch
werden
der
Urinfluß
und
die
Plasmanatrium-Konzentration
unter
Umständen normal
(Pseudonormurie), während aber die Retention harnpflichtiger Substanzen wie Creatinin, Harnstoff,
Ammonium, Amine und von Kalium, Protonen und schließlich Natrium weiter zunimmt. Die
Osmolarität des Plasmas steigt. Erst bei einer GFR unter 10% stellt sich eine Oligo-Anurie ein, die
schließlich unter schweren Urämiesymptomen zum Tod führt (BICKHARDT 1992, DAVID et al.
1995).
Bei schwerer akuter oder terminaler chronischer Niereninsuffizienz ist außerdem der
Serumphosphatspiegel erhöht, er ist ein Maß für die verbleibende funktionierende Nierenmasse.
Zusätzlich besteht eine Tendenz zur Hypocalcämie, Hypokaliämie und zu einer metabolischen
Azidose (DAVID et al. 1995).
26
Literaturübersicht
Die Messung der Aktivitäten des Enzyms Gamma-Glutamyl-Transferase (GGT) im Urin hat sich bei
Säugetieren als ein sensitiver Indikator für das Maß zerstörter Tubuli herausgestellt. Das Enzym ist
normalerweise in Epithelzellen des proximalen Tubulus nachzuweisen und wird aufgrund seiner
Molekülgröße nicht über die Glomerula filtriert (GRAUER u. LANE 1995).
Ein weiterer Befund bei Tubulonephrosen kann eine Hämaturie sein, die dann durch erhöhte
Hämoglobingehalte im Urin meßbar wird (SUTER 1994). Bei chronischer Niereninsuffizienz ist
häufig eine nichtregenerative, zumeist normochrome, normozytäre Anämie festzustellen; diese ist
unter anderem bedingt durch einen Rückgang der Erythropoetinproduktion in der Niere (DAVID et
al. 1995).
Im Gegensatz zum Säugetier führt bei Süßwasserfischen der Hauptweg der Stickstoffexkretion nicht
über die Nieren, sondern über die Kiemen, und zwar hauptsächlich in Form von Ammoniak (BONE
u. MARSHALL 1985). Bei Verdacht auf eine Niereninsuffizienz ist also nicht eine Erhöhung der
Konzentration von Stickstoffderivaten zu beobachten, in erster Linie sind Veränderungen der
Ionenverhätnisse im Plasma und Urin zu erwarten.
2.7.2 Urinzusammensetzung bei Fischen unter pathologischen Bedingungen
Untersuchungen zur Nierenfunktion der Regenbogenforelle von ELGER et al. (1986) während der
akuten Phase einer viralen hämorrhagischen Septikämie ergaben bei den erkrankten Fischen eine
reduzierte GFR von 5,2 auf 3,08 ml/h/kg im Mittel, und damit korreliert eine Senkung des
Urinflusses von 2,51 auf 1,63 ml/kg Körpergewicht/h. Die Osmolarität des Urins war bei den
erkrankten Forellen im Mittel von 29,3 auf 45,2 mOsm/l erhöht, die Plasmaosmolarität blieb
unverändert. Gleichzeitig war die Netto-Reabsorption von Na, K, Ca reduziert und im Urin stiegen
die Konzentrationen an Na, Ca und Mg an. Die renalen Exkretionsraten von Na, K, Ca, Mg, und
Protein sanken. Trotz der Oligurie blieb die Osmolare Clearence der Niere stabil. Als Grund für den
Abfall der GFR wurde eine Veränderung der glomerulären Hämodynamik diskutiert. Diese renale
Antwort scheint den Autoren vergleichbar mit den Veränderungen der Nierenfunktion von
Süßwasserteleosteern in Anpassung an ein hypertones Medium.
Obwohl der Spiegel von Plasmaproteinen bei den erkrankten Fischen um 28% sank, stieg der
Proteinspiegel im Urin kaum. Die Hypoproteinämie war also nicht die Folge einer Proteinurie, so daß
extrarenale Ursachen wie vermehrte kapillare Proteinpermeabilität oder eine reduzierte
Leberfunktion vermutet wurden (ELGER et al. 1986).
27
Literaturübersicht
Studien zur renalen Funktion bei Karpfen unter hypoxischen Bedingungen zeigten ebenso deutlich
Veränderungen der im Urin gemessenen Parameter (KAKUTA et al. 1992). In der Phase einer
starken Hypoxie, in der die Fische nicht mehr in der Lage waren, ihre Schwimmhaltung
auszubalancieren und auf der Seite lagen, war der Urinfluß drastisch reduziert von im Mittel 3,4 auf
0,1 ml/kg/h. Die Urinosmolarität stieg von 11 auf 15 mOsm/l, und die Konzentrationen aller im Urin
gemessenen Elektrolyte war im Vergleich zu den Kontrolltieren erhöht. Der Proteingehalt im Urin
blieb unverändert. Es wurde diskutiert, daß durch die Hypoxie der renale Blutfluß verringert wurde,
also eine renale Ischämie vorlag und dies der Grund für eine verminderte GFR war. Die Autoren
vermuteten, daß durch die Hypoxie ein erhöhter Spiegel an Katecholaminen ausgelöst wurde, der
eine Vasokonstriktion der afferenten Arteriolen in der Niere induzierte. Der daraus folgende erhöhte
Gefäßwiderstand in den afferenten Arteriolen der Niere wurde als Ursache der Ischämien diskutiert.
Urinflußraten bei Forellen zeigten abhängig von der Dosis an Streßhormonen allerdings
unterschiedliche Veränderungen (HEATH 1995). Unter sehr hohen Dosen an Adrenalin wiesen
Forellen eine Druckdiurese und eine Erhöhung der GFR auf, während andere vasokonstriktorische
Hormone wie Oxytocin und Angiotensin in geringen Dosen einen antidiuretischen Effekt bei Forellen
entwickelten (ELGER 1982).
28
Literaturübersicht
2.8
Trypanoplasma borreli
2.8.1 Biologie und Entwicklung
Trypanoplasmen sind Parasiten des Blutgefäßsystems und werden als Hämoflagellaten bezeichnet.
Schon 1841 wurden Blutflagellaten der Fische, Trypanosomen oder wahrscheinlicher
Trypanoplasmen, von Valentin im Blut von Forellen beobachtet. Trypanoplasma borreli wurde
dann 1901 von LAVERAN und MESNIL beschrieben, die den Gattungsnamen Trypanoplasma für
cryptobiide Hämoflagellaten mit 2 Geißeln festlegten. In der Systematik der Protozoa wird die
Gattung Trypanoplasma zu dem Stamm der Sarcomastigophora (Unterstamm Mastigophora, Klasse
Zoomastigophorea) in die Ordnung Kinetoplastida, Familie Bodonidae, eingeordnet. WOO (1987)
stellt die Gattung Trypanoplasma zur Gattung Cryptobia. Fischtrypanoplasmen und -trypanosomen
ähneln entsprechenden Formen der Warmblüter (KÖRTING 2000).
Trypanoplasma borreli ist ein Blutparasit bei Karpfen und Schleien und dringt nicht in Zellen ein
(LOM 1979). Trypanoplasmen erscheinen pleomorph und ändern ihre Gestalt mit der Bewegung
sehr viel stärker als Trypanosomen. T. borreli ist ca. 17-26 µm lang, 2,5-5 µm breit und besitzt
zwei Geißeln, die aus der Geißeltasche am Vorderende der Zelle entspringen. Die längere,
rückläufige Geißel verläuft an der linken Seite und begrenzt die undulierende Membran. Ein einzelner
großer, länglicher Kinetoplast befindet sich am Vorderende, wo das punktförmige Ende dem
Geißelkinetosom gegenüberliegt (WOO 1987, KRUSE et al. 1989). Der Kinetoplast besteht aus
einem Netzwerk aus DNA-Fasern, die im Gegensatz zu Trypanosomen nicht in Mini- und
Maxikreise organisiert sind. Dem Kinetoplasten gegenüber liegt der runde Zellkern. Bei
Blutstromformen ist die Membran von einer dicken Außenschicht überzogen (LOM u. DYKOVÁ
1992).
Während des Entwicklungszyklus werden keine unterschiedlichen Entwicklungsstadien gefunden. Es
werden lediglich einige Veränderungen in der Form, abhängig vom Grad der Parasitämie, beobachtet
(KRUSE et al. 1989). Zu Beginn der Parasitämie, bei 20°C Wassertemperatur, am Tag 8 p.i. sind
kleine schlanke Formen von T. borreli vorherrschend. An Tag 13 p.i., während der exponentiellen
Wachstumsphase, sind noch kleinere Formen zu beobachten, und im Laufe des Überganges zur
chronischen Phase nimmt die Breite der Flagellaten zu. In der chronischen Phase der Infektion
schließt sich ein Längenwachstum an. Die Position des Kinetoplasten verändert sich im Laufe der
Infektion nicht wesentlich (KRUSE u. STEINHAGEN 1988, KRUSE et al. 1989).
29
Literaturübersicht
Zur Längsteilung runden sich die Trypanoplasmen ab, es werden Geißeln, Kinetoplast und Zellkern
verdoppelt und anschließend erfolgt die Teilung im Endwirt (KRUSE et al. 1991).
Trypanoplasmen unterscheiden sich von den ektoparasitischen Cryptobien insofern grundlegend, als
sie zur Übertragung einen Vektor benötigen. Dieser Vektor ist der mit Trypanoplasmen infizierte
Blutegel Piscicola geometra und Hemiclepis marginata (KEYSSELITZ 1906, WOO u.
POYNTON 1995). Alle im Vormagen des Egels vorhandenen morphologisch unterschiedlichen
Formen sind für den Fisch infektiös, solange bis das Fischblut nach etwa 11 Tagen im Egelvormagen
verdaut ist (LOM 1979, STEINHAGEN et al. 1989).
Experimentell ist es möglich, durch Injektion von infiziertem Blut in die Muskulatur oder in die
Körperhöhle die Infektion an Karpfen auszulösen (LOM 1979, STEINHAGEN et al. 1989). Bei
20°C Wassertemperatur dauert die Phase der Präpatenz bis ca. zum 8. Tag p.i., die sich
anschließende exponentielle Wachstumsphase hat ihren Höhepunkt mit ca. 10³ Parasiten/µl Blut
(0,001 Tera/l Blut) bis 4 Wochen p.i., und es folgt die chronische Phase mit unterschiedlich
zahlreichen Parasiten im Blut. Bis zu vier Monate lang können Parasiten im Blut gefunden werden
(STEINHAGEN et al. 1989). Bei niedrigen Temperaturen ist die Entwicklung der Parasitämie
deutlich verlangsamt. Die für die Entwicklung optimale Temperatur liegt bei 20 °C.
BUNNAJIRAKUL (1998) ermittelte bei T. borreli-Infektionen am Tag 28 p.i. 75.000
Flagellaten/µl Blut (0,075 Tera/l Blut).
Von STEINHAGEN et al. (1989) wurde ein klonierter Stamm von Trypanoplasma borreli
etabliert, in vitro kultiviert (STEINHAGEN et al. 2000) und in zahlreichen Untersuchungen zum
Immunsystem der Fische genutzt.
2.8.2 Auftreten, Bedeutung und Immunität
Trypanoplasma borreli ist ein häufiger Blutparasit von europäischen Cypriniden, tritt aber auch in
Nordamerika auf (MAVOR 1915). In Fischbeständen Europas ist die Infektion weitverbreitet bei
Karpfen (Cyprinus carpio), Schleie (Tinca tinca) und Goldfisch (Carassius auratus). Eine
Infektion von Rotfeder (Scardinius erythropthalamus), Goldorfe (Leuciscus idus), Elritze
(Phoxinus phoxinus) und Plötze (Rutilus rutilus) ist ebenso möglich ( KRUSE et al. 1989, LOM
u. DYKOVÁ 1992).
Die Infektion verursacht äußere Symptome der sogenannten „Schlaffkrankheit” der Karpfen, diese
sind ähnlich denen bei Infektionen mit Trypanosoma carassii (früher: Trypanosoma danilewskyi).
30
Literaturübersicht
(SCHÄPERCLAUS 1990, KÖRTING 2000). Hochgradig befallene Tiere zeigen Apathie,
Lethargie, Exophthalmus, Ascites, verminderte Futteraufnahme und Anämie. Im Endstadium liegen
die Fische am Grund des Gewässers und bewegen sich kaum noch (NERESHEIMER 1912,
OLLENSCHLÄGER
1975,
REICHENBACH-KLINKE
1980,
AMLACHER
1992,
BARCKHAUSEN-KIESECKER 1996). Diese Symptome können auch bei hochgradig infizierten
Fischen zum Teil oder ganz fehlen. Bei Karpfen kommt es zu einer vorübergehenden Parasitämie mit
Anämie und Todesfällen (STEINHAGEN et al. 1989). Die Mortalität war sowohl in Experimenten
bei Karpfen, als auch bei Goldfischen sehr hoch (LOM 1973 u.1979, MILDE 1982, LOM et al.
1986).
Die genetische Abstammung bestimmt die Empfänglichkeit des Karpfens für T. borreli. So starben
bei einer hochempfänglichen Karpfenlinie alle infizierten Fische von Tag 21 p.i. bis Tag 24 p.i. an den
Folgen der Infektion (VAN DEN BROEK 1992, WIEGERTJES et al. 1995).
Karpfen, die eine T. borreli-Infektion überstanden haben, bilden einen Immunschutz, der nach einer
Erstinfektion für etwa ein Jahr besteht (STEINHAGEN 1985). JONES u. WOO (1987)
vermuteten, daß die Erholung von Forellen nach einer Infektion mit T. salmositica auf der Bildung
von schützenden Antikörpern beruht. Bei diesen Tieren konnten sie agglutinierende und
neutralisierende Antikörper im in-vitro-Test nachweisen. JONES et al. (1993) wiesen
Antikörpertiter im Blut von Karpfen mit T. borreli nach. Diese waren um so höher, je höher die
Trypanoplasmenanzahl im Blut war. In der Kopfniere von Karpfen nimmt im Verlauf einer
Trypanoplasmen-Infektion
die
Zahl
an
oberflächenimmunglobulin-tragenden
Zellen
zu
(BARCKHAUSEN-KIESECKER 1996).
Die Produktion von spezifischen Antikörpern ist stark abhängig von der Karpfenlinie und deren
Empfänglichkeit für T. borreli. Denn bei hochempfänglichen Karpfen findet keine Produktion von
spezifischen Antikörpern statt (WIEGERTJES et al. 1995).
Die Resistenz von Karpfen gegenüber T. borreli kann durch Immunsuppressiva aufgehoben werden.
Setzt man mit Trypanoplasmen infizierte Karpfen radioaktiver Strahlung oder Dosen von
Hydrocortison aus, führt dies zu einem starken Anstieg von Parasitämie und Mortalität bei diesen
Tieren (STEINHAGEN et al. 1989 b).
31
Literaturübersicht
2.8.3 Diagnose und Behandlung
Die Diagnose wird anhand der klinischen Symptome und des Nachweises der Trypanoplasmen im
Blut gestellt. Der Nachweis der Blutflagellaten erfolgt in vivo mikroskopisch im Blut und in
Quetschpräparaten der Niere oder der Milz. Die Blutentnahme gelingt mit einer Glaskapillare am
Kiemenbogen, durch Herzpunktion oder Blutentnahme aus den großen caudalen Gefäßen. Die
Flagellaten fallen im Blut durch lebhaft schlängelnde Bewegungen auf. Dabei erscheinen die
Trypanoplasmen größer und plumper als die kleineren, lebhafteren Trypanosomen (NOGA 1995,
KÖRTING 2000). Für den Nachweis der Antikörper gegen T. borreli steht ein ELISA-Test zur
Verfügung (WOO u. POYNTON 1995).
Eine direkte und effektive Bekämpfung der Blutflagellaten ist nicht bekannt. Eine Behandlung sollte
sich auf die Eliminierung der übertragenden Fischegel konzentrieren (KÖRTING 2000).
2.8.4 Pathologie
In pathologischen Untersuchungen infizierter Tiere können bei fortgeschrittener Parasitämie blasse
Haut und Kiemen, Splenomegalie, Ascites, Exophthalmus, Petechien auf Niere, Leber, Milz und
Fettgewebe, sowie granulomatöse Veränderungen an der Niere festgestellt werden (LOM u.
DYKOVÁ 1992, WOO u. POYNTON 1995). Es müssen nicht immer alle Symptome gleichzeitig
vorhanden sein (LOM u. DYKOVÁ 1992).
BUNNAJIRAKUL (1998) beobachtete bei der Sektion von mit Trypanoplasma borreli infizierten
Karpfen ab Tag 18 p.i. blasse Kiemen und Splenomegalie, ab Tag 20 bis 22 p.i. petechiale
Blutungen auf Leber und Niere, und ab Tag 24 war zusätzlich Exophthalmus zu vermerken.
Bei experimentell infizierten Karpfen sinken Hämatokrit und Erythrozytenzahl mit steigender
Parasitämie. Die Anzahl an Leukozyten und unreifen Erythrozyten steigt im Verlauf der Infektion
(STEINHAGEN et al. 1990, BUNNAJIRAKUL 1998). HAMERS (1994) fand zusätzlich einen
absinkenden Hämoglobingehalt und folgerte, daß sich eine hypochrome, hämolytische Anämie
manifestiert. Er vermutete außerdem eine Autophagocytose von Erythrozyten durch aktivierte
Monocyten/Makrophagen. In der Milz von mit T. borreli infizierten Goldfischen wurde eine
steigende Erythrozyten-Phagozytoserate beobachtet (DYKOVÁ und LOM 1979).
32
Literaturübersicht
2.8.5 Allgemeine Pathohistologie
Bei fortgeschrittener Parasitämie erscheint T. borreli auch extravaskulär in mehreren Organen und
phagozytiert in Monozyten und Makrophagen (LOM u. DYKOVÁ 1992).
Bei Goldfischen mit Trypanoplasmen-Infektion wurde bei Gefäßen, die innere Organe versorgen,
eine Endovaskulitis mit starker Hyperplasie der Endothelien beobachtet (DYKOVÁ u. LOM 1979).
Es lagen eine Glomerulitis und Tubulonephrose vor. Die Sinusendothelzellen der Milz waren
geschwollen, die Milzpulpa aktiviert.
Eine Untersuchung über histopathologische Veränderungen an hochempfänglichen Karpfen während
einer Trypanoplasma borreli-Infektion wurde von BUNNAJIRAKUL (1998) durchgeführt. Die
Infektion rief vor allem in hämatopoetischen Organen Gewebeschädigungen hervor. Die schwersten
histopathologischen Veränderungen wurden während des Höhepunktes der Parasitämie entdeckt.
Die erkrankten Karpfen mit sehr hoher Parasitämie zeigten eine Infiltration von Entzündungszellen
und Trypanoplasmen in den glomerulären Kapillaren, in Leber- und Milzsinusoiden und Blutgefäßen
von anderen Organen wie zum Beispiel Kiemen, Herz, Darm und Gehirn. Die beobachtete intensive
Proliferation der mononukleären Zellen in der Niere und der Milz wurde als erfoglose
Abwehrreaktion der Fische gegen die Parasiteninfektion bewertet. Die Fische starben zwischen dem
20. und 28. Tag p.i. an der Infektion. Die schwersten histologischen Veränderungen wurden in der
Niere der infizierten Fische gefunden.
2.8.6 Pathohistologie der Niere
BUNNAJIRAKUL (1998) beobachtete in den glomerulären Kapillaren der Niere eine mäßig starke
Infiltration von Entzündungszellen. Die Anzahl der proliferierenden Leukozyten vermehrte sich mit
steigender Parasitämie im hämatopoetischen Gewebe. Eine Proliferation im Interstitium der
Fischniere wird bei Auseinandersetzung mit einem Erreger häufig beobachtet (MANNING 1994).
Die Proliferation des interstitiellen Nierengewebes bei Infektion mit T. borreli verursachte eine
Atrophie des exkretorischen Gewebes. Das heißt, die beobachtete Glomerulitis und Tubulonephritis
war unter anderem eine Folge dieser Proliferation. Zusätzlich stellte BUNNAJIRAKUL (1998) eine
Zerstörung der Struktur von Tubuli und Glomerula durch die Infiltration von Entzündungszellen und
Trypanoplasmen fest. Als Folge dieser Zerstörung des exkretorischen Nierengewebes wurde eine
Störung der Osmoregulation der infizierten Karpfen vermutet. Die folgende osmotische Belastung der
Fische wurde neben der Anämie verantwortlich gemacht für die Mortalitäten.
33
Literaturübersicht
Bei pathologischen Untersuchungen an Karpfennieren während einer Infektion mit Trypanoplasma
borreli beobachtete auch RUDAT (1999) schon zu Beginn der Parasitämie eine Proliferation des
hämatopoetischen Zwischengewebes, also eine interstitielle Nephritis und als Folge eine
Druckatrophie der Tubuli. Zusätzlich kam es zur massiven Infiltration von Entzündungszellen in die
Tubuli. Allerdings beobachtete die Autorin keine Veränderungen an den Glomerula.
Transmissionselektronenmikroskopisch wurde in den Zellen des distalen Tubulus schon ab Tag 7 p.i.
eine Anschwellung der Mitochondrien verzeichnet. Im Verlaufe der Infektion verstärkten sich diese
Schädigungen, und die Mitochondrien zeigten zerfallenes Matrixmaterial und Verlust ihrer Granula.
Diese Aufweitung der Mitochondrien ließ die Tubulusepithelzellen auch im Lichtmikroskop
„löcherig“ erscheinen, und es lag eine vakuoläre Degeneration dieser Zellen vor (KITT 1982). Im
proximalen Tubulus stellte RUDAT (1999) diese Veränderungen der Tubulusepithelzellen erst
deutlich
später,
nämlich
ab
dem
14.
Tag
p.i.,
fest.
Die
Autorin
deutete
diese
Mitochondrienschwellungen nach CHEVILLE (1976) als einhergehend mit dem Verlust von ATPKonzentration und damit als Anzeichen einer Sauerstoffarmut im Gewebe. Als Grund für eine solche
Sauerstoffarmut wurde von ihr eine eventuelle Hypoxie der Niere vermutet, verursacht durch die
Anämie oder mögliche lokale Ischämien in der Niere, hervorgerufen durch die von
BUNNAJIRAKUL (1998) beobachteten Ansammlungen von Trypanoplasmen und mononukleären
Zellen in den Blutgefäßen.
Die Reabsorptionsprozesse von Elektrolyten im distalen Tubulus sind in hohem Maße
energieabhängig (ENDO und KIMURA 1982). Aufgrund dieser Tatsache wurde von RUDAT
(1999) vermutet, daß durch die beschriebenen Schädigungen die Energieversorgung der Zellen und
damit auch die Resorptionsprozesse der Niere gestört sind und den Fischen Salze über den Urin
verloren gehen. Zusätzlich beobachtete RUDAT (1999) in den Tubuluszellen eine Fragmentierung
des basalen Labyrinths. Da das basale Labyrinth eine entscheidende Rolle als Austauschfläche für
die Reabsorption von Wasser und Elektrolyten spielt (LIEBICH 1990, HENRIKSON 1993), kann
Folge auch dieser Schädigungen eine Störung der Resorptionsprozesse in den Tubuli sein.
Wie von BUNNAJIRAKUL (1998) wurde auch von RUDAT (1999) geschlossen, daß die
Schädigungen in den Tubuli der Niere eine starke Beeinträchtigung der Osmoregulation und des
Ionenhaushalts der infizierten Fische bewirken und somit Grund für den Tod der Tiere sein können.
Um die tatsächlichen Auswirkungen der im Verlauf der T. borreli-Infektion festgestellten histo- und
zytologischen Veränderungen im exkretorischen Nierengewebe auf die Ionenverhältnisse im Urin und
Plasma, also auf die Osmoregulation der Karpfen zu studieren, wurden die in der vorliegenden
Arbeit beschriebenen Untersuchungen unternommen.
34
Material und Methoden
3 MATERIAL UND METHODEN
Um eine parasitär bedingte Veränderung der Exkretion der Niere durch Messungen im Urin und
Plasma nach einer Infektion der Karpfen mit Trypanoplasma borreli beobachten zu können, war
eine experimentelle Infektion der Tiere im Labor und die Implantation von Dauerkathetern in die
Harnblase erforderlich.
3.1
Versuchstiere
Für alle Versuche kamen Spiegelkarpfen (Cyprinus carpio) aus Laborzucht zum Einsatz. Die Fische
entstammen aus der Nachzucht einer Zuchtlinie der Bundesforschungsanstalt für Fischerei in
Ahrensburg. Die Aufzucht der Geschwistertiere erfogte im Fachgebiet für Fischkrankheiten und
Fischhaltung, Hannover. Die Tiere wurden unter SPF-Bedingungen in Glasaquarien in
rezirkulierendem Leitungswasser bei einer Wassertemperatur von 18-22 °C aufgezogen. Gefüttert
wurde mit kommerziellem Alleinfuttermittel für Karpfen („Trouvit“, Fa. Milkivit, Burgheim) einmal
täglich ad libitum. Einen Tag vor Beginn der Implantation der Harnblasenkatheter wurde die
Fütterung eingestellt.
Die für diese Versuche verwendeten Karpfen wogen zwischen 70 und 100 g und waren 9-14
Monate alt. Zwei Wochen vor der Infektion wurden die Fische in mit Außenfiltern versehene 80Liter-Glasaquarien, die in Klimakammern eingerichtet waren, eingesetzt. Dort herrschte eine
gleichbleibende Tageslänge und eine Wassertemperatur von 20 °C.
3.2
Parasiten und Infektion
Bei den verwendeten Parasiten handelt es sich um den Blutflagellaten Trypanoplasma borreli, der
aus natürlich infizierten Karpfen isoliert und dann im Labor kloniert wurde (STEINHAGEN et al.
1989a, KRUSE et al. 1989). Von diesem Klon wurden Trypanoplasmen in flüssigem Stickstoff
aufbewahrt (KRUSE et al. 1989) und nach dem Auftauen erneut in Karpfen inokuliert.
Für die Versuche wurde bereits infizierten Karpfen mit hoher Parasitämie Blut abgenommen, die
Parasiten ausgezählt und das Blut mit PBS so verdünnt, daß in 100 µl Verdünnung 5000
Trypanoplasmen enthalten waren. Den verwendeten Versuchstieren wurde unter Sedation diese 100
µl des verdünnten Blutes intramuskulär appliziert. Den nicht zu infizierenden Kontrollfischen wurde
35
Material und Methoden
unter gleichen Bedingungen 100 µl PBS intramuskulär appliziert. Anschließend wurden sie wieder in
die Glasaquarien in der Klimakammer verbracht.
3.3
Katheterisierung der Urinblase
An den jeweils vorgesehenen Tagen p.i. wurden Karpfen in einer Lösung mit 0,15 g Tricain/l Wasser
(Methansulfonat des Metaaminobenzoeasäureethylesters, Fa. Sigma) betäubt und auf dem
Operationstisch (KLONTZ u. SMITH 1968) in einer V-förmigen Plexiglasschiene in Rückenlage
gebracht. Unter die Kiemendeckel wurde feuchter Zellstoff platziert und der Körper mit feuchtem
Zellstoff bedeckt. Für den Zeitraum des Eingriffes wurde belüftetes und mit 0,75 g Tricain/l
versetztes Wasser über Kiemen und Körper geleitet. Als Katheter diente ein Polyethylenschlauch
(Innendurchmesser: 0,86 mm, Wandstärke: 0,33 mm). Durch Erhitzen über der Flamme eines
Bunsenbrenners wurde am einzuführenden Ende der Katheter trichterförmig erweitert und an den
Seiten mit einer heißen Nadel perforiert (ELGER 1982). Außerdem erhielt der ca. 60 cm lange
Katheter durch Erhitzen einen 90° Winkel nach 1 cm Länge (KAKUTA et al 1986) und nach 5 mm
eine Verdickung durch Umknoten mit Nahtmaterial, die später zusätzlich den Blasenausgang
verschloss.
Die Urinblase mündet beim Karpfen hinter dem After zusammen mit der Genitalöffnung nahezu ohne
Ausbildung einer Harnröhre in einer Urogenitalpapille. Der Katheter wurde im Bereich der
Urogenitalpapille der Karpfen nach einer modifizierten Methode von KAKUTA et al. (1986) fixiert.
Zunächst wurden drei Schlaufen durch eine rund um den Uroporus verlaufende Tabakbeutelnaht
(Polyamide EP 3) gelegt (s. Abb. 3.1). Die präparierte Endung des Katheters wurde durch die
angelegten Schlaufen hindurch ca. 3-4 mm in die Blase eingeführt. Der Katheter wurde dann durch
Anziehen der Nahtendungen und damit der Schlaufen am Uroporus fixiert. Zusätzlich wurde der
Katheter durch ein Knopfheft an der lateralen Körperseite ca. 2 cm über dem Uroporus befestigt.
(s. Abb. 3.1 u. 3.3) Durch vorheriges Befüllen mit sterilem destilliertem Wasser wurde der freie
Abfluß des Katheters geprüft. Dann wurden die Fische einzeln in 12 l Versuchsbecken, die durch
Plexiglasgitter verkleinerbar waren, verbracht. Das Wasser dieser Becken wurde belüftet, und jedes
Becken war an jeweils einen Außenfilter angeschlossen. Um optische Reize für die Versuchsfische zu
minimieren, wurde undurchsichtige Folie an den Seitenwänden der Becken angebracht.
36
Material und Methoden
Abb. 3.1: Uringewinnung bei Karpfen durch Katheterisieren der Urinblase (nach KAKUTA et
al. 1986)
37
Material und Methoden
Abb. 3.2: Karpfen in Rückenlage auf dem OP-Tisch während der Urinblasenkatheterisierung
Abb. 3.3: Ventrale Aufsicht auf Karpfen und Anordnung der Nahtschlaufen zur Befestigung
38
Material und Methoden
3.4
Probensammlung
Der Urin wurde anhand von unter Sedation implantierten Urinblasenkathetern, in Intervallen von 6
Stunden gesammelt. Nach ca. 48 Stunden am Blasendauerkatheter wurden die Fische erneut mit
0,15 g Tricain/l Wasser sediert, Blut entnommen und anschließend per Genickschnitt getötet,
gewogen und die rechte Nachniere entnommen.
Zur Blutentnahme aus der caudalen Hohlvene wurden 2-ml-Einwegspritzen (Henke-Sass Wolf,
Tuttlingen) mit aufgesetzter 0,9 x 40 mm-Einwegkanüle („Erosa“, Fa. Rose, Trier) verwendet. In die
Einwegspritzen wurde je ein Lithium-Heparin-Kügelchen aus einem 1,3 ml-Mikro-Probengefäß LH
(Sarstedt, Nümbrecht) gegeben. Die Entnahme von ca. 2 ml Blut erfolgte aus der caudalen Hohlvene
der Karpfen.
Von diesem Blut wurde ein Teil zur Vollblutanalyse entnommen, und der andere Teil wurde
möglichst zügig in 1,5 ml fassende Reaktionsgefäße (Fa. Roth, Karlsruhe) gegeben und 15 Minuten
bei etwa 600 g in der Zentrifuge „Biofuge A“ mit Mikroliterrotor 1379 (Heraeus, Osterode)
zentrifugiert. Danach wurde das Plasma abpipettiert und nach Messung der Osmolalität in
Mikroprobengefäße gefüllt und bis zur weiteren Untersuchung bei –20°C gelagert.
3.5
Probenanalyse
3.5.1 Osmolalität und pH-Wert
Unmittelbar nach Probenentnahme wurde die Menge des gebildeten Urins, seine Farbe und
eventuelle Beimengungen notiert. Mit einem Kryo-Osmometer (OM 801, Fa. Vogel, Gießen) wurde
die osmotische Konzentration von je 50 µl Urin, Aquarienwasser und Plasma bestimmt. Vor den
Messungen wurde das Gerät mit einer Eichlösung (Eichlösung für Osmometer, 300 mOsm/kKg
H2O, Fa. Vogel, Gießen) kalibriert und der Nullpunkt mit Aqua dest. eingestellt. Die pH-Werte des
Aquarienwassers und des Urins wurden mit einem Digital-pH-Meter („portamess“, Fa. Knick,
Berlin) ermittelt. Zuvor wurde das Gerät mit Eichpufferlösungen (Fa. Bioanalytic GmbH, Freiburg)
kalibriert.
39
Material und Methoden
3.5.2 Ammoniumkonzentration
Sofort nach Entnahme der Wasser- und Urinproben wurde ihr Ammoniumgehalt durch
Koloriemetrie in der Berthelot`s Reaktion bestimmt. Hierbei wurde das Universal-Photometer MPM
3000 (Wissenschaftlich-Technische-Werkstätten GmbH, Weilheim) und der Reagenziensatz
„Spektroquant-14752-Ammonium“ (Fa. Merck, Darmstadt) nach Anweisungen der Hersteller
benutzt und die Ergebnisse bei 690 nm Wellenlänge abgelesen. Nach Alkalisierung auf pH 13
reagiert Ammoniak mit Hypochlorid zu Monochloramin, das in einer katalysierten Zweistufenreaktion
mit Thymol ein blaues Indophenol bildet. Der Urin wurde hierfür zuvor 1:10 mit Aqua bidest.
verdünnt und das Meßergebnis dann wieder mit 10 multipliziert.
3.5.3 Bestimmung der Parasitämie und der Eythrozytengesamtzahl
Die Anzahl der Trypanoplasmen im Blut wurde durch Auszählung der Trypanoplasmen in der
Neubauer-Zählkammer ermittelt. Das entnommene Blut wurde unter Heparinzusatz mit 0,85 %iger
phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) 1:100 verdünnt. In acht Großquadraten mit jeweils 16
Kleinquadraten wurden alle Trypanoplasmen unter dem Mikroskop (Fa. Olympus, Modell: BHS)
bei 200-facher Vergrößerung gezählt, die Anzahl durch 2 geteilt und die Trypanoplasmenzahl im
Liter Blut mit Hilfe der entsprechenden Kammerformel errechnet.
Kammerformel für die Berechnung der Tryanoplasmen:
Trypanoplasmengesamtzahl/Liter Blut = X x V x 0,25 x 106
X: die in vier Großquadraten gezählte Anzahl an Trypanoplasmen
V: Verdünnungsfaktor (= 100)
Auf entsprechende Weise wurden die Erythrozyten im Lichtmikroskop in der NeubauerZählkammer bestimmt. Hierfür wurden zweimal fünf Kleinquadrate mit jeweils 16 Kleinstquadraten
ausgezählt, die Anzahl durch 2 geteilt und die Erythrozytenzahl im Liter Blut mit Hilfe folgender
Kammerformel berechnet:
Erythrozytengesamtzahl / l = X x V x 50 x 106
X: die in fünf Kleinquadraten gezählte Anzahl an Erythrozyten
V: Verdünnungsfaktor (= 100)
40
Material und Methoden
3.5.4 Hämatokrit
Es wurde die Mikrohämatokrittechnik angewandt. Direkt aus der mit frisch gewonnenem Blut
gefüllten
Einwegspritze
wurde
Blut
als
Doppelbestimmung
in
heparinisierten
Mikrohämatokritröhrchen aufgenommen und in einer Mikrozentifuge (Fa. Heraeus, Hanau) 10
Minuten bei 13000 U/min zentrifugiert. Danach wurde der Hämatokritwert abgelesen und in l/l
angegeben.
3.5.5 Hämoglobin-Konzentration
Zur Bestimmung der Hämoglobinkonzentration wurde die Cyanmethämoglobin-Methode angewandt.
Mit dem Testset der Firma Sigma-Aldrich (Katalognr. 525-A) wurde durch kolorimetrische
Endpunktbestimmung die Hämoglobinkonzentration im Nativblut durch Extinktionsmessung bei 540
nm Wellenlänge im Photometer bestimmt. Durch Mischung von 20 µl Blut mit 5 ml des Reagenz
„Drabkins Solution“ entsteht nach Hämolyse am Endpunkt Cyanmethämoglobin. Hierfür wurde
zunächst mit Hilfe des Hämoglobinstandards (des Testsets) eine Extinktionskurve für Messungen in
der 10 mm und in der 20 mm Küvette angefertigt. Anhand dieser Kalibrierung konnte die
Hämoglobinkonzentration im Vollblut errechnet werden. Außerdem wurde der Urin auf Hämoglobin
untersucht, indem statt 20 µl 100 µl Probenmaterial dem Reagenz hinzugefügt wurde.
3.5.6 MCV, MCH, MCHC
Das mittlere corpusculäre Volumen des einzelnen Erythrozyten wurde nach der Formel
MCV = Hämatokrit (l/l) x 1000 : Erythrozytenzahl (in Tera/l) ermittelt.
Der
mittlere
Hämoglobingehalt
des
einzelnen
Erythrozyten
wurde
nach
der
Formel
MCH = Hämoglobin (g/l): Erythrozytenzahl (in Tera/l) und die mittlere Hämoglobinkonzentration
nach der Formel MCHC = Hämoglobin (g/l): Hämatokrit (l/l) errechnet.
3.5.7 Kalium und Natrium
Der Kalium- und Natriumgehalt im Plasma, Urin und in den Aquarienwasserproben wurde mit einem
Flammenphotometer (480 Flame Photometer, Fa. Bayer Diagnostics, Fernwald) ermittelt. Hierzu
41
Material und Methoden
wurden die Proben 5 Minuten bei 7000 g zentrifugiert und anschließend jeweils 50 µl in ein
Reaktionsgefäß pipettiert. Nach der Null-Punkt-Einstellung mit Aqua dest. und Kalibrierung mit
standardisierten Proben (140 mml Na/l und 5 mmol K/l) erfolgten die Messungen.
3.5.8 Calcium und Magnesium
Der Calcium-, wie auch der Magnesiumgehalt in den Plasma-, Urin- und Wasserproben wurde
durch kolorimetrische Endpunktbestimmung mit dem Photometer „Uvikon 930“ (Fa. Biotech)
ermittelt. Das Testprinzip (Fa. Roche, Katalognr. 1489216) zur Calciummessung nutzt aus, daß
Calcium mit Kresolphthalein-Komplexon in alkalischer Lösung einen violetten Komplex bildet, der
bei 546 nm Wellenlänge gemessen werden kann. Magnesium bildet mit Calmagit einen Farbkomplex
(Fa. Sigma-Aldrich, Katalognr. 595 A), der ca. 30 Minuten stabil bleibt und bei 520 nm gemessen
werden kann.
3.5.9 Phosphor
Phosphor wurde in den Plasma- und Urinproben gemessen, auch hier wurde die Konzentration
durch kolorimetrische Endpunktbestimmung ermittelt. Der im Plasma als Phosphat vorliegende
anorganische Phosphor bildet mit Natriummolybdat Phosphormolybdat (Fa. Merck, Darmstadt), das
durch Reduktion in Molybdänblau überführt wird. Dieses kann photometrisch bestimmt werden und
dann in den Phosphorgehalt umgerechnet werden. Durch eine Sulfit-Carbonat-Lösung wird Eiweiß in
Lösung gehalten, eine Enteiweißung ist darum überflüssig.
3.5.10 Bilirubin
Soweit die gewonnene Plasmamenge dies zuließ, wurde der Gesamt-Bilirubingehalt nach der
„Jendrassik“-Methode (Fa. Roche, Katalognr. 123919) durch Messung im Photometer „Uvikon
930“ (Fa. Biotech) bestimmt. Hierbei wird Gesamt-Bilirubin in Gegenwart von Coffein mit
diazotierter Sulfanilsäure zu einem Azofarbstoff gekuppelt und dann bei 578 nm Wellenlänge
gemessen.
42
Material und Methoden
3.5.11 Gesamtproteine
Der Gesamtproteingehalt der Plasmaproben wurde mit einem Refraktometer (Atago HandRefraktometer, Fa. Obladen, Hamburg) gemessen. Das Refraktometer wurde mit einer 0,85 %igen,
der Fischphysiologie entsprechenden isotonischen Kochsalzlösung kalibriert und mit Aqua dest. der
Nullpunkt eingestellt. Dann wurden 100 µl Plasma an der Auftragsstelle des Refraktometer abgesetzt
und der Brechungsindex abgelesen. Der Gesamtproteingehalt wurde anschließend berechnet.
3.5.12 Alkalische Phosphatase (AP) und Gamma-Glutamyl-Transferase (GGT)
Die Enzymaktivität der AP im Plasma und im Urin der Karpfen und die Enzymaktivität der GGT im
Urin wurden durch enzymatische Endpunktmethode bei 25°C ermittelt. AP bildet mit
Paranitrophenylphosphat (Fa. Roche, Katalognr. 1087517) und Wasser einen photometrisch
nachweisbaren gelben Farbkomplex (Paranitrophenol und Phosphat). Das Enzym GGT katalysiert
die Reaktion von G-Glutamyl-3-Caboxy-4-Nitroanilid und Glycylglycin zu G-Glutamyl-Glycylglycid
und 3-Carboxy-4-Nitroanilin (Fa. Roche, Katalognr. 1087584). Das Produkt 3-Carboxy-4Nitroanilin ist gelb gefärbt. Die Enzymaktivität wurde über den spezifischen Extinktionskoeffizienten
berechnet.
3.6
Probenbearbeitung für die Lichtmikroskopie
Für die Lichtmikroskopie wurde ein etwa 5 x 5 mm großes Stück der rechten Rumpfniere in
4 %iger, phosphatgepufferter Paraformaldehydlösung für 24 Stunden fixiert. Danach wurde das
überflüssige Fixativ in Weise-Puffer durch mehrmalige Spülungen aus dem Gewebe entfernt und eine
stufenweise Entwässerung der Proben über eine Reihe mit ansteigender Alkoholkonzentration bis
zum 100 %igen Alkohol (je nach Alkoholgehalt ein bis zwei Stunden pro Stufe) angeschlossen. Für
die weitere Bearbeitung wurden die Proben in Glykolmethacrylat (Fa. Heraus Kulzer, Wehrheim)
eingebettet. Hierzu erfolgte eine Präinfiltration und Infiltration der Proben entsprechend den Angaben
des Herstellers. Danach wurden die Gewebeproben in Einbettungsformen gegeben und nach Zugabe
von Einbettflüssigkeit polymerisierten die Proben. Die Kunststoffblöckchen wurden an einem
Mikrotom (Fa. Reichert-Jung, Modell: 1150/Autocat) in 4 µm Dicke geschnitten. Die angefertigten
Schnitte wurden nach Giemsa gefärbt (ROMEIS, 1989). Die GMA-Schnitte wurden mit 100-,
43
Material und Methoden
200-, 400- und 1000-facher Vergrößerung betrachtet. Hierfür wurde ein Lichtmikroskop der Fa.
Olympus (Modell: BHS) benutzt.
3.7
Untersuchung zur Glucoseabsenkung
Um Information über den Verbrauch von Plasmaglucose durch Trypanoplasma borreli zu erhalten,
wurden in einem weiteren Versuch 10 Karpfen von oben genannter Abstammung und Größe durch
Inokulation von 5000 Trypanoplasmen pro Fisch infiziert. Diese Karpfen wurden gemeinsam mit 5
Kontrollkarpfen bei 18-22°C gehalten. Am 14. Tag p.i. und am 21. Tag p.i. wurde diesen Fischen
und den Kontrollfischen unter Sedation Blut entnommen. Ein Teil jeder Blutprobe wurde sofort
zentrifugiert und das abpipettierte Plasma bei –20°C tiefgefroren. Der andere Teil jeder
Einzelblutprobe wurde 2,5 Stunden bei +20°C in einem Brutschrank (Fa. Heraus, Hanau) inkubiert.
Im Anschluß daran wurden auch diese Blutproben zentrifugiert, das Plasma abpipettiert und
gefroren. Im Vollblut wurden außerdem Trypanoplasmen- und Erythrozytenzahlen bestimmt. Die
Inokulation von T. borreli, Blutentnahme, Zentrifugation, Auszählung von Trypanoplasmen- und
Erythrozytenzahlen im Blut erfolgten nach bereits beschriebenen Methoden.
Die Bestimmung der Glucosekonzentration in den Plasmaproben erfolgte mit der „Glucoquant“Methode (Fa. Roche, Katalognr.: 1442457). Hierzu wurden die Proben zunächst mit Perchlorsäure
enteiweißt. Nach Zugeben des Puffers („Glucoquant-1“ und 3% einmolare Natronlauge) wurde die
Extinktion dieses Gemisches am Photometer bei 334 nm Wellenlänge bei 20-25°C abgelesen.
Danach wurde den Küvetten das Enzymgemisch („Glucoquant-2“) hinzugefügt und nach Überführen
der Glucose in Glucose-6-Phosphat die Extinktion der Lösung am Endpunkt erneut bestimmt. Aus
diesen Messungen wurde dann die im Plasma vorhandene Glucosekonzentration berechnet. Die
Bestimmungen erfolgten gegen einen Leerwert. Zuvor wurde mit einer Glucose-Standardlösung
(Chemikalien der Fa. Merck, Darmstadt) kalibriert.
44
Material und Methoden
3.8
Versuchsaufbau
Tabelle 3.1: Schema über Versuchsablauf je Versuchsreihe
Tag 1:
Infektion von 12 Karpfen mit Trypanoplasma borreli
Tage p.i.:
6
Je 4 infizierte u. 9-12
2 Kontrollfische
13
Uhr
anschließend Hälterung in Versuchsbecken und
Urinsammlung über Katheter
20
7
Sedation, Dauerkatheterimplantation,
„
„
10-16
Uhr
14
Urinintervallsammlung und anschließend
Wasserprobenentnahme aus Versuchsbecken
21
8
„
„
10-12
Uhr
15
Sedation, Blutentnahme, Tötung,
Sektion und Entnahme der Nierengewebeprobe
22
Je Versuchsreihe wurden 12 Karpfen mit 5000 Trypanoplasmen per i.m.-Applikation infiziert und
gleichzeitig 6 Kontrollkarpfen die gleiche Injektionsmenge PBS i.m. appliziert. Aus vorangegangenen
Versuchen (BUNNAJIRAKUL 1998) war bekannt, daß sich bei Karpfen mit einer
Trypanoplasmeninfektion die größten Gewebeveränderungen in der Niere befinden. Dort treten im
proximalen und vor allem auch im distalen Tubulus schwere Zellschädigungen auf (RUDAT 1999).
Um Informationen über Auswirkungen dieser Schädigungen auf den Ionenhaushalt der Fische zu
erhalten, sollten Urin-, Blut- und Nierengewebeproben im Verlauf der Parasitämie entnommen
werden.
In drei 80-Liter-Aquarien wurden jeweils 4 durch Inokulation von 5000 Trypanoplasmen mit
Trypanoplasma borreli infizierte und markierte Fische verbracht. Zusätzlich wurden in jedes
Becken zwei Kontrolltiere gesetzt. Die Wassertemperatur betrug 20°C, die Hälterung erfolgte in
Leitungswasser. Die Karpfen wurden einmal täglich gefüttert.
45
Material und Methoden
Die Tiere wurden im Verlauf der Parasitämie zu unterschiedlichen Zeitpunkten (Becken 1 nach 6
Tagen, Becken 2 nach 13 Tagen, Becken 3 nach 20 Tagen der Infektion) entnommen, und es wurde
ihnen unter Betäubung ein Urinblasenkatheter implantiert. Es wurden jeweils 2 Kontrollfische und 4
infizierte Fische katheterisiert. Diese 6 katheterisierten Fische wurden einzeln in spezielle 12-Liter
Plexiglasbecken gesetzt, die zusammen in einer Klimakammer bei 20°C standen. Um ein Ausreißen
der Katheter zu verhindern, waren die Versuchsbecken mit Plexiglasgittern versehen, mit denen der
Bewegungsraum der Fische eingeengt werden konnte. Der produzierte Urin wurde durch die
Katheter in gekühlte sterile Zentrifugenröhrchen (Fa. Corning Incorporated), deren Deckel ein dem
Umfang der PE-Schläuche entsprechendes Loch erhielt, abgeleitet. Die Harnblasenkatheter leiteten
Urin unter leichtem Sog in diese Röhrchen, die unterhalb des Wasserspiegels der Versuchsbecken
aufgestellt waren. Der freie Abfluß des Urins wurde durch Heben der Katheterenden und Rückfluß
des Urins beobachtet. Der Urin der ersten 22-24 Stunden wurde verworfen und danach, also an Tag
7, 14, und 21 p.i., im 6-Stunden-Intervall Urin gesammelt. Vor Beginn des 6-Stunden Intervalls
wurden die Katheter mit je 0,05-0,1 ml sterilem destillierten Wasser gespült. Nach den 6 Stunden
wurden auch Wasserproben der 6 Versuchsbecken genommen.
Osmolalität, pH-Wert und Ammoniumgehalt in Urin und Wasser wurden gleich nach Gewinnung
bestimmt; die Urinmenge und –farbe notiert und der Urin auf Hämoglobin untersucht. Anschließend
wurden die Proben zur weiteren späteren Untersuchung bei –20°C gefroren. Jeweils nach ca. 45
Stunden der Urinsammlung wurden die 4 infizierten und die 2 nichtinfizierten Karpfen unter erneuter
Betäubung gewogen, ihnen Blut abgenommen und nach Tötung die rechte Nachniere entnommen. Im
Blut wurde die Anzahl der Trypanoplasmen und Erythrozyten, der Hämoglobingehalt und der
Hämatokrit bestimmt. Nach Zentrifugation wurde die Osmolalität des Plasmas gemessen und dann
auch dieses eingefroren. Die Gewebeproben der Nieren wurden für die Lichtmikroskopie weiter
bearbeitet. In den später aufgetauten Wasser-, Urin- und Plasmaproben wurden Natrium-, Calcium, Magnesium- und Kaliumgehalte gemessen; in den Urinproben zusätzlich Phosphorgehalt, AP- und
GGT-Aktivität und in den Plasmaproben zusätzlich AP-Aktivität, Phosphor-, Gesamtprotein- und
Gesamtbilirubingehalt.
Sobald während der Urinsammlung der Verdacht bestand, daß Urin-Wasser-Gemische in den
Katheter liefen oder der Katheter auf Dauer verstopfte, wurden die Proben dieser Versuchsfische
nicht gewertet. Es wurden in dieser Studie 4 Versuchsreihen (im Zeitraum von Juni bis Oktober
2000) angelegt, und von 29 Karpfen wurde per Dauerkatheter gewonnener Urin in Kombination mit
Blut, Aquarienwasser und Nierengewebe ausgewertet.
46
Material und Methoden
Zusätzlich wurde von 11 infizierten und 5 nichtinfizierten Karpfen Blut entnommen Die
Glucosekonzentration von sofort abzentrifugiertem, und von nach 2,5 Stunden Inkubation (bei 20°C)
abzentrifugiertem Plasma wurde bestimmt und die Ergebnisse je Karpfen miteinander verglichen.
Außerdem wurden in diesen Blutproben die Trypanoplasmen- und Erythrozytenzahlen ermittelt.
3.9
Statistische Methoden
Die statistischen Analysen wurden mit dem Computerprogramm WinSTAT® (Kulima Co.,
Cambridge, USA) durchgeführt.
Für die statistische Auswertung wurden zunächst alle Messwerte auf Normalverteilung geprüft. Für
die Kontrollgruppe und die Gruppen der Infektionstage 7, 14, und 21 p.i. wurden jeweils Mittelwert
und Median und die Standardabweichung für sämtliche untersuchten Parameter bestimmt.
Alle Messungen wurden mittels Varianzanalyse und multiplen t-Tests nach Tuckey (bei
normalverteilten Messergebnissen) oder ANOVA on ranks und Dunn`s Test (bei nichtnormalverteilten Messergebnissen) ausgewertet. Dabei wurden alle Gruppen der Infektionsstichtage
und die der Kontrollen untereinander verglichen.
Ein p-Wert von < 0,05 wird als signifikant und ein p-Wert von < 0,01 als hochsignifikant bezeichnet.
47
Ergebnisse
4 ERGEBNISSE
Die während der Tage 7, 14, 21 der T. borreli-Infektion jeweils mitkatheterisierten und untersuchten
Kontrollfische werden im Folgenden als Gruppe zusammengefasst. Insgesamt werden von 9
nichtinfizierten und 21 infizierten Karpfen, von denen Urin und gleichzeitig Blut gewonnen werden
konnte,
die
erzielten
Meßergebnisse
verglichen
(Tag
7
p.i.:
n=8,
Tag 14: p.i. n=7, Tag 21: p.i. n=6).
In Vorversuchen überlebten alle nicht infizierten Karpfen die Implantation und die Entnahme der 2
Tage verbliebenen Blasenkatheter und zeigten auch danach gutes Allgemeinbefinden. Die Wunden
der Befestigungshauthefte verheilten innerhalb von ca. 10 Tagen.
In den hier beschriebenen Versuchen war im Anschluß an die Blasendauerkatheterisierung und
Urinsammlung die Tötung der Fische zur ausreichenden Blutgewinnung und zur Entnahme der rechten
Nachniere zwecks histologischer Untersuchung erforderlich.
Alle
mit
Trypanoplasma
borreli
infizierten
Karpfen
zeigten
Anzeichen
einer
Trypanoplasmeninfektion, und zwei Fische starben daran bereits am Tag 21 p.i. in den
Versuchsbecken während der Urinsammlung durch Katheter. Drei unter gleichen Bedingungen
infizierte Fische, die nicht zur Blut- und Urinentnahme dienten, starben zwischen Tag 22 und 24 p.i.
an den Folgen der Trypanoplasma borreli-Infektion.
4.1
Sektion
In den Sektionen waren ab dem 14. Tag p.i. bei den infizierten Karpfen blasse Kiemen und zum Teil
eine vergrößerte Milz festzustellen, während die Kontrollfische unverändert blieben. In
Quetschpräparaten von der Niere wurden im Lichtmikroskop zu diesem Zeitpunkt Trypanoplasmen
beobachtet. Am Tag 21 p.i. fielen bei den infizierten Karpfen, im Unterschied zu den Kontrollfischen,
blaßrosa Kiemen, leichter Exophthalmus, ikterisch gefärbte Haut, und deutlich vergrößerte Milz und
Niere mit jeweils geschwollenen Rändern, auf. Auf den Rumpfnieren der infizierten Karpfen waren
punktförmige weiße Herde und Petechien zu sehen. Die Sektion der mitkatheterisierten
Kontrollfische brachte, bis auf Rötungen der Haut im Bereich der Befestigungshefte, die auch bei den
infizierten, katheterisierten Fische zu beobachten waren, keine von der Norm abweichenden
Befunde. Auch die Bauchhöhlen der Kontrollkarpfen waren unauffällig; ihre Rumpfnieren waren
physiologisch dunkelrot gefärbt und in Größe und Lage ohne besondere Befunde.
48
Ergebnisse
4.2
Lichtmikroskopische Ergebnisse
Die nach Giemsa gefärbten Rumpfnierenpräparate der katheterisierten nichtinfizierten und infizierten
Karpfen wurden lichtmikroskopisch ausgewertet. Die Beobachtungen sind in den Abbildungen 4.1 4.4 dargestellt.
Die Präparate der katheterisierten Kontrollkarpfen entsprachen bei lichtmikroskopischer Berurteilung
den Beobachtungen von REICHLE (1959) zur Rumpfnierenhistologie für gesunde Karpfen. In allen
Präparaten waren Anschnitte von unterschiedlichen Nephronenabschnitten und Nierenkörperchen zu
erkennen, und diese waren umgeben von interstitiellen, hämatopoetischem Gewebe. Die Verteilung
und Größe dieser Struktur entsprachen physiologischen Beobachtungen. Die erfolgte Implantation
von Urinblasenkathetern und das Verweilen über 2 Tage bewirkte keine Veränderungen der
Histologie der Rumpfniere im Vergleich zu anderen gesunden, nicht katheterisierten Laborkarpfen.
Bei allen Nierenpräparaten der katheterisierten mit T. borreli infizierten Karpfen fiel früh eine
Proliferation des interstitiellen, lymphoiden Gewebes auf. Im Laufe der Infektion kamen Infiltration
von Entzündungszellen in die Tubuli und vakuoläre Tubulusdegenerationen hinzu. Am Tag 21 p.i.
waren bei allen Präparaten schwere histopathologische Veränderungen der Nieren zu verzeichnen,
und die Tubuli waren durch das sehr stark proliferierende Zwischengewebe zur Degeneration und
Atrophie gebracht.
Aufbauend auf die von RUDAT (1999) durchgeführten licht- und elektronenmikroskopischen
Untersuchungen der Nierentubuli bei T. borreli-Infektion wurden die lichtmikroskopisch sichtbaren
Defekte des Nierengewebes in ihrem Ausmaß und ihrer Anzahl bestimmt (s. Tab. 4.1). So wurde es
möglich, die Veränderungen in den im Urin und im Blut bestimmten Werten, auch je Fisch, vor dem
Hintergrund des tatsächlichen Ausmaßes der Nierenpathologie zu bewerten. Dieses Vorgehen
gewann insbesondere aufgrund der zum Teil beobachteten großen Schwankungsbreite der
Parasitämie, sowie der Urin- und Plasmawerte an Bedeutung.
49
Ergebnisse
Histologische Befunde des Nierengewebes im Verlauf einer Infektion mit Trypanoplasma
borreli:
Abb. 4.1: Lichtmikroskopische Aufnahme vom Nierengewebe eines Kontrollkarpfen (x100). Das
Nierengewebe war unverändert. Tubuli und Glomerula liegen eingebettet im hämatopoetischen
Zwischengewebe. Die Menge des hämatopoetischen Zwischengewebes entsprach dem Bild von
gesunden Karpfen. Es waren im Mittel 77 Tubuli im Gesichtsfeld (1mm2) festzustellen.
Abb. 4.2: Lichtmikroskopische Aufnahme vom Nierengewebe eines Karpfen Tag 7 p.i. (x100).
Bereits ab diesem Infektionsstadium war eine leichte Zunahme des hämatopoetischen
Zwischengewebes im Vergleich zu den Kontrollkarpfen zu beobachten. Der Anteil der Tubuli im
Gesichtsfeld verringerte sich auf im Mittel 69 pro mm2.
Abb. 4.3: Lichtmikroskopische Aufnahme vom Nierengewebe eines Karpfen Tag 14 p.i. (x100).
Deutlich vermehrt sind degenerierte und atrophierte Tubuli festzustellen; ihr Anteil an der
Gesamttubulizahl machte nun im Mittel 15% aus. Die Menge des hämatopoetischen
Zwischengewebes hatte weiter stark zugenommen.
Abb. 4.4: Lichtmikroskopische Aufnahme vom Nierengewebe eines Karpfen Tag 21 p.i. (x100).
Das hämatopoetische Zwischengewebe nimmt den Großteil des Bildes ein, der Anteil Tubuli im
Gesichtsfeld war auf im Mittel 34 gesunken. Zusätzlich war die Menge an degenerierten und
atrophierten Tubuli auf im Mittel 38% an der Gesamttubulizahl gestiegen.
50
Ergebnisse
51
Ergebnisse
Tabelle 4.1: Lichtmikroskopische Befunde an Nierentubuli bei 29 Karpfen während einer Infektion
mit Trypanoplasma borreli
Anteil der
Anteil der degeunveränderten Tubuli in nerierten und atro%
phierten Tubuli in %
Tubuli pro
Gesichtsfeld
(=1 mm2)
(Mittelwerte) *
(Mittelwerte) #
(Mittelwerte) *
Kontrolltiere
97
3
Kontrolltiere
77
Tag 7 p.i.
90
10
Tag 7 p.i.
69
Tag 14 p.i.
85
15
Tag 14 p.i.
55
Tag 21 p.i.
62
38
Tag 21 p.i.
34
*
Je Nierenprobe wurden 400 Tubuli ausgewertet
#
Je Nierenprobe wurden 4 Gesichtsfelder (4 x 1 mm2) ausgewertet
Bereits am Tag 7 p.i. der Parasitämie war im Vergleich zu den nicht infizierten Kontrollfischen eine
leichte Proliferation des interstitiellen, lymphoiden Gewebes zu beobachten. Diese Proliferation des
interstitiellen Gewebes der Nachniere setzte sich kontinuierlich bei allen infizierten Karpfen im Laufe
der Parasitämie in starkem Maße fort. So waren von ursprünglich 77 in einem Gesichtsfeld insgesamt
zählbaren Tubuli am 21. Tag p.i. nur noch die Hälfte (34 im Mittel) Tubuli zu sehen. Das interstitielle
Gewebe hatte um etwa das Doppelte zugenommen.
Gleichzeitig nahm der Anteil der aufgrund von Degenerationen oder Atrophien, hervorgerufen durch
Proliferation des Interstitiums, geschädigten Tubuli zunächst nur leicht zu. Ab dem 21. Tag p.i. kam
es dann deutlich mehr zu Degenerationen und Atrophien der Epithelzellen der Tubuli. Der Anteil der
so geschädigten Tubuli stieg am 21. Tag p.i. auf 38%. Außerdem waren am Tag 21 p.i.
Ansammlungen von Trypanoplasma borreli in den Blutgefäßen und zum Teil auch im Interstitium zu
beobachten.
Insgesamt ist festzuhalten, daß alle infizierten Karpfen an den jeweiligen Infektionsstichtagen in ihrer
histologisch zu beobachtenden Nierenpathologie, dem Ausmaß der Proliferation des interstitiellen
Gewebes und in der Art und Anzahl der defekten Tubuli untereinander gute Übereinstimmungen
zeigten.
52
Ergebnisse
4.3
Hämatologische Ergebnisse
Um einerseits den Erfolg der experimentellen Infektion kontrollieren und andererseits die individuellen
Ausmaße der Parasitämie und Folgen auf das Blutbild beobachten zu können, wurden die
Trypanoplasmen und Erythrozyten gezählt und der Hämoglobingehalt bei allen katheterisierten
Karpfen bestimmt.
4.3.1 Infektionsverlauf
Zur Bestimmung der Blutwerte wurde den Karpfen der jeweiligen Stichtage nach der Urinsammlung
Blut aus der caudalen Hohlvene entnommen. Alle mit jeweils 5000 Trypanoplasmen durch i.m.Inokulation infizierte Karpfen entwickelten eine Parasitämie. Im peripheren Blut waren am 7. Tag p.i.
bei einem der untersuchten Fische 375 Trypanoplasmen/µl Blut (0,0004 Tera/l) zu beobachten. Bei
den anderen Karpfen waren am Tag 7 p.i. noch keine Parasiten im peripheren Blut nachzuweisen.
Am 14. Tag p.i. waren bei allen infizierten Fischen Trypanoplasmen zu zählen, im Minimum 1.500
(0,0015 Tera/l) und im Maximum 56.750/µl (0,0568 Tera/l) Blut. Im weiteren Verlauf der Infektion
stieg die Zahl der Parasiten im Blut weiter sehr stark an. Die Werte der wöchentlichen Anstiege
waren jeweils hochsignifikant zueinander. Am 21. Tag p.i. waren im Minimum 26.000 und im
Maximum 335.000 Trypanoplasmen/µl Blut (0,026 und 0,335 Tera/l) feststellbar, der Mittelwert
betrug 154.100/µl Blut. Es war bei den einzelnen infizierten Karpfen zu gleichen
Infektionszeitpunkten eine große individuelle Schwankungsbreite der Trypanoplasmenanzahlen im
Blut zu beobachten (s. Abb. 4.5.A).
4.3.2 Rotes Blutbild
Bei den Kontrolltieren festgestellte Werte des roten Blutbildes stimmten weitgehend mit den Daten
überein, die in vorangegangenen Studien bei gesunden Karpfen dieser Altersgruppe festgestellt
wurden. Auch die beschriebene Variabilität der Parameter spiegelte sich bei den Kontrolltieren
wider. Bei nichtinfizierten Karpfen wurden im Mittel 1,67 Tera Erythrozyten/l gezählt, der
Hämatokrit betrug 0,378 l/l, und der mittlere Hämoglobingehalt betrug 105 g/l. Der daraus
berechenbare mittlere Hämoglobingehalt der einzelnen Erythrozyten (MCH) betrug 64,6 pg, das
mittlere korpuskuläre Volumen der einzelnen Erythrozyten (MCV) 237,1 µm3 und die mittlere
53
Ergebnisse
Hämoglobinkonzentration in g auf 1 Liter Erythrozyten (MCHC) 277 g/l. Mit zunehmender
Parasitämie sanken die zu verzeichnenden Erythrozytenzahlen im Blut der infizierten Fische deutlich.
Am Tag 14 p.i. war die Abnahme der Erythrozyten zunächst noch nicht signifikant, am Tag 21 p.i.
waren die Zahlen dann hochsignifikant erniedrigt. So wiesen die nichtinfizierten Kontrollfische im
Mittel 1,67 Tera Erythrozyten/l Blut auf, die Fische am 21. Tag p.i. im Mittel nur noch 0,73 T/l Blut.
Die infizierten Karpfen entwickelten eine hochgradige Anämie. Auch hier zeigte sich eine starke
Schwankungsbreite von im Maximum 1,1 Tera Erythrozyten/l bis im Minimum nur noch 0,3 Tera
Erythrozyten/l Blut am 21. Tag p.i. (s. Abb. 4.5.B).
Der Hämatokrit der infizierten Fische sank gleichzeitig mit den Erythrozytenzahlen. Die Kontrolltiere
hatten im Mittel einen Hämatokrit von 0,38 l/l, bei infizierten Karpfen sank der Mittelwert am Tag 14
p.i. auf 0,29 l/l und am 21. Tag p.i. auf 0,15 l/l. Die Absenkung der Hämatokritwerte des 21. Tages
war hochsignifikant zu denen des 7. Tages und den Werten der Kontrollfische. Auch bei den
Hämatokritwerten waren am 21. Tag die Werte nicht einheitlich. Ein Karpfen wies noch einen
Hämatokrit von 0,24 l/l auf (s. Abb. 4.5.C). Ein weiterer Karpfen der gleichen Gruppe hatte nur
noch einen Hämatokrit von 0,05 l/l, gleichzeitig eine Erythrozytenzahl von lediglich 0,3 Tera pro l Blut
und damit zu diesem Zeitpunkt mehr Trypanoplasmen (0,35 Tera/l) als Erythrozyten im Blut.
Im Verlauf der Parasitämie sank der Hämoglobingehalt im Liter Blut der infizierten Karpfen
kontinuierlich bereits ab 7. Tag p.i. Am Tag 21 p.i. wurden im Mittel 65 g/l gemessen, während bei
den Kontrolltieren ein Hämoglobingehalt von 104 g/l messbar war (s. Abb. 4.5.D). Die Differenzen
zu den Kontrollen waren jedoch statistisch nicht ganz signifikant (p = 0,052). Der Hämoglobingehalt
sank insgesamt etwas weniger stark als der Hämatokrit der Fische.
Die Berechnungen zum MCH zeigten, daß der mittlere Hämoglobingehalt der einzelnen Erythrozyten
im Verlauf der Parasitämie zunächst stagnierte und dann am Tag 21 p.i. signifikant zu den vorherigen
Stichtagen erhöht war. Der Wert des MCH lag am 14. Tag p.i. noch bei 63,1 pg und am 21. Tag
dann bei 97,4 pg (s. Abb. 4.6.B).
Das mittlere korpuskuläre Volumen der einzelnen Erythrozyten (MCV) sank während der
Parasitämie stetig von im Mittel 237,1 am Tag 7 p.i. auf 196,1 µm3 am Tag 21 p.i. (s. Abb. 4.6.A).
Die mittlere Hämoglobinkonzentration im Liter Erythrozyten (MCHC) stieg an den Stichtagen 7 und
14 erst mäßig, zeigte aber am Tag 21 p.i. dann eine hochsignifikante Erhöhung im Vergleich zu den
vorherigen Untersuchungstagen (s. Abb. 4.6.C)
54
Ergebnisse
Die Ergebnisse zeigen, daß die Karpfen während der Trypanoplasma borreli-Infektion zunächst
eine normochrome mikrozytäre Anämie entwickelten. Am 21. Tag nach der Infektion, kurz vor ihrem
zu erwartenden Sterben, war dann bei ihnen eine hyperchrome, mikrozytäre Anämie festzustellen.
55
Ergebnisse
Anzahl Tryps.*10 12
O,4
0,4
A
Erythrozyten/ Liter Vollblut
Trypanoplasmen/ Liter Vollblut
Anzahl Erys*10 12
O,3
0,3
O,2
0,2
-----
O,1
0,1
O,O
0,0
B
3
-----
-----
-----
Ktr
7
14
2
---------
-----
1
-----
0
Ktr
21
p < 0,01: Ktr - 14, Ktr - 21
7
14
21
p < 0,01: Ktr – 21; p < 0,05: 14 - 21
C
Liter
Liter
Liter// Liter
0,4
160
Hämatokrit
-----
Hämoglobin
140
-----
0,3
g/Liter Vollblut
0,5
D
-----
0,2
-----
0,1
120
-----
100
-----
80
---------
60
40
0,0
Ktr
7
14
20
21
Ktr
p < 0,01: Ktr - 21 p < 0,05: 14 - 21
Tage nach Infektion
7
14
21
p = 0,052: Ktr – 21
Tage nach Infektion
Einzelwert
Einzelwerte
MedianMedian
Standardabweichung der Kontrollkarpfen
Ktr
Kontrollkarpfen
7, 14, 21
Tage nach Infektion
----- -----
Abb. 4.5:
Parasitenzahlen und hämatologische Parameter von Karpfen im Verlauf einer Infektion
mit Trypanoplasma borreli; A: Parasitämieverlauf, B: Anzahl Erythrozyten im Vollblut,
C: Hämatokrit, D: Hämoglobingehalt im Vollblut
signifikante (p < 0,05) und hochsignifikante (p < 0,01) Mittelwertsunterschiede
56
Ergebnisse
350
A
B
150
MCV
125
250
pg
µm3
300
---------
200
100
-----
-----
-----
-----
Ktr
7
14
50
25
Ktr
7
14
21
21
p < 0,05: Ktr – 21
Tage nach Infektion
C
g/l Erythrocyten
g%/
dl Erythrocyten
-----
75
-----
150
50
500
MCH
MCHC
-----
40
400
30
300
-----
-----
Ktr
7
-----
20
200
14
21
Tage
nach Infektion
p < 0,01: Ktr
– 21
Einzelwerte
Einzelwert
Median
----Median
Standardabweichung der Kontrollkarpfen
Ktr
Kontrollkarpfen
7, 14, 21
Tage nach Infektion
-----
Abb. 4.6:
Hämatologische Parameter von Karpfen im Verlauf einer Infektion mit
Trypanoplasma borreli; A: mittleres corpusculäres Volumen pro Erythrozyt (MCV),
B: mittlerer Hämoglobingehalt pro Erythrozyt (MCH), C: mittlere
Hämoglobinkonzentration pro Liter Erythrozyten (MCHC)
signifikante (p < 0,05) und hochsignifikante (p < 0,01) Mittelwertsunterschiede
57
Ergebnisse
4.4
Klinisch-chemische Parameter im Blutplasma
Die bereits beschriebene Variationsbreite von Normalwerten im Karpfenblut spiegelt sich auch in
den im Plasma untersuchten klinisch-chemischen Parametern wider. Darum wird auch hier in erster
Linie ein Vergleich der ermittelten Mittelwerte oder Mediane der Parameter bei infizierten Karpfen
zum Bereich der Standardabweichung der Kontrollgruppe getroffen.
4.4.1 Plasmaosmolalität und -Elektrolyte
Die Osmolalität im Plasma der Kontrollfische betrug im Mittel 280 mOsm/kg H2O. Bei den
infizierten Karpfen 7, 14, und 21 Tage p.i. zeigten sich mit Osmolalitäten von 287, 273 und 277
mOsm/kg kaum Veränderungen zu den Kontrollwerten. Mittelwerte und Mediane der infizierten
Fische blieben im Bereich der Standardabweichung der Kontrollkarpfen (s. Abb. 4.7.A).
Ein vergleichbares Ergebnis ist bei den Natriumkonzentrationen im Plasma festzustellen. Auch hier
lagen die Konzentrationen der Tage 7, 14, 21 p.i. im Mittel bei 140,4, 135,7, 139,3 mmol/l und
fielen nicht aus dem Streubereich der Kontrollfische. Die Einzelwerte wiesen allerdings größere
individuelle Unterschiede auf; so hatte ein Karpfen am Tag 14 p.i. mit 123,5 mmol/l Natrium einen
deutlich niedrigeren Plasmaspiegel als der Durchschnitt der infizierten Fische (s. Abb. 4.7.B).
Die Magnesiumkonzentration der Kontrollfische betrug im Mittel 1,309 mmol/l. Auch dieser Wert
wurde von den infizierten Karpfen nur wenig über- oder unterschritten; die Mittelwerte lagen an den
Stichtagen im Bereich der Standardabweichung der Kontrolltiere. Wobei sich auch hier, wie bei
Natrium, am Tag 14 p.i. größere Streuungen der Einzelwerte der infizierten Karpfen ergaben (s.
Abb. 4.7.C).
Auch die Ergebnisse der Phosphorbestimmungen im Plasma zeigten in den Mittelwerten der
Infektionstage 7, 14, 21 p.i. nur geringgradige Veränderungen, und diese lagen im Streubereich der
Kontrollfische (1,04-2,02 mmol/l). Die Mediane stiegen im Laufe der Infektion innerhalb dieses
Bereiches geringfügig an (s. Abb. 4.8.B).
Die im Plasma der infizierten Karpfen ermittelten Werte der Osmolalität und die Konzentration der
Elektrolyte Natrium, Magnesium und Phospor zeigten trotz gleichzeitig zunehmender Parasitämie und
starken histopathologischen Befunden der Niere eine große Kontinuität zu den Werten der
58
Ergebnisse
mituntersuchten Kontrollkarpfen. Es waren bei diesen Parametern während der Infektion mit T.
borreli keine signifikanten Änderungen im Plasma festzustellen.
Die Kontrollkarpfen hatten im Mittel einen Kaliumspiegel von 0,29 mmol/l im Plasma. Im Verlauf der
Infektion stiegen die Plasmakonzentrationen von Kalium, im Gegensatz zu den anderen Elektrolyten,
massiv an. So zeigte sich ab Tag 14 p.i. mit 0,92 mmol/l im Mittel eine signifikante Erhöhung. Am
Tag 21 p.i. war der Mittelwert mit 3,19 mmol/l dann hochsignifikant erhöht im Vergleich zu den
Werten des 7. Tages p.i. (0,29 mmol/l) und zu denen der Kontrollen (0,28 mmol/l) (s. Abb. 4.8.A).
Auch bei den Calciumkonzentrationen schien sich ein Effekt durch die T. borreli-Infektion
abzuzeichnen. Der Mittelwert der Kontrollkarpfen lag bei 1,66 mmol/l Plasma, die Werte der Tage
7, 14, 21 p.i. stiegen stetig an, und am 21. Tag lag die mittlere Konzentration mit 2,33 mmol/l
außerhalb der Standardabweichung (± 0,55) der Kontrollen. Es ergaben sich jedoch keine
signifikanten Unterschiede (s. Abb. 4.7.D).
Die Karpfen erlitten durch die Trypanoplasma borreli-Infektion eine starke Hyperkaliämie und eine
leichte Hypercalcämie.
4.4.2 Gesamtprotein, -Bilirubin und AP-Aktivität
Die Kontrollfische wiesen einen Gesamtproteingehalt von 34,1 (± 4,3) g/l Plasma auf. Die
Gesamtproteinkonzentrationen der nichtinfizierten Kontrollkarpfen und der infizierten Karpfen
streuten deutlich, doch blieben die Standardabweichungen insgesamt konstant.
Der Mittelwert des Gesamtproteingehaltes der infizierten Karpfen am 21. Tag p.i. war mit 26,4 g/l
um ca. ein Viertel niedriger als bei den anderen Probentagen und bei den Kontrollfischen. Der
Unterschied zu den Proben des 14. Tages p.i. war signifikant. Die Karpfen wiesen am 21. Tag p.i.
eine Hypoproteinämie auf (s. Abb. 4.8.E).
Die Gesamt-Bilirubingehalte im Plasma der infizierten Fische blieben mit 2,9 µmol/l zunächst im
Bereich der Kontrollfische. Am 21. Tag p.i. waren die Gehalte dann mit 7,3 µmol/l im Mittel deutlich
erhöht, und es ergab sich eine Hyperbilirubinämie. Die Differenzen der Mittelwerte der Gruppe des
7. Tages p.i. und der des 21. Tages p.i. waren signifikant (s. Abb. 4.8.D).
59
Ergebnisse
A
B
340
Osmolarität
Osmolalität
Natrium
145
mmol/l
280
-----
140
300
-----
-----
-----
-----
-----
-----
135
-----
130
260
125
240
120
Ktr
7
14
21
Ktr
7
14
21
C
3
D
4
Magnesium
Calcium
3
2
-----
-----
mmol/l
mmol/l
mOsm/ kg
320
150
---------
1
---------
2
-----
-----
1
0
0
Ktr
7
14
Ktr
21
Tage nach Infektion
7
14
21
Tage nach Infektion
Einzelwerte
Einzelwert
Median
----Median
Standardabweichung der Kontrollkarpfen Ktr
Kontrollkarpfen
7, 14, 21
Tage nach Infektion
-----
Abb. 4.7:
Klinisch-chemische Parameter im Plasma von Karpfen im Verlauf einer Infektion mit
Trypanoplasma borreli; A: Osmolalität, B: Natriumkonzentration,
C: Magnesiumkonzentration, D: Calciumkonzentration
signifikante (p<0,05) und hochsignifikante (p<0,01) Mittelwertsunterschiede
60
Ergebnisse
A
B
6
5
Kalium
5
4
-----
mmol/l
mmol/kg
Phosphor
4
3
2
1
3
2
-----
0
-----
-----
Ktr
7
-----
-----
-----
-----
Ktr
7
14
21
1
0
14
21
p < 0,05: Ktr, 7 - 14 p < 0,01: Ktr, 7 - 21
Tage nach Infektion
C
D
14
300
Alkalische Phosphatase
Ak
12
Gesamt-Bilirubin
10
µmol/l
200
-----
150
-----
100
50
8
-----
6
4
-----
-----
-----
-----
Ktr
7
14
2
-----
0
0
Ktr
7
14
21
21
nach Infektion
p < 0,05:Tage
14 - 21
nach Infektion
p < 0,05:Tage
14 - 21
E
50
-----
45
Einzelwerte
Median
Protein
40
g/l
Aktivität [U/i]
250
35
-------------
30
-----
25
----Ktr
7, 14, 21
Abb. 4.8:
20
Einzelwert
15
Median
Standardabweichung der Kontrollkarpfen
Kontrollkarpfen
Tage nach Infektion
Ktr
7
14
21
p < Tage
0,05: 7
- 21Infektion
nach
Klinisch-chemische Parameter im Plasma von Karpfen im Verlauf einer Infektion mit
Trypanoplasma borreli; A: Kaliumkonzentration, B: Phosphorkonzentration,
C: Aktivität der Alkalischen Phosphatase, D: Gesamt-Bilirubinkonzentration,
E: Gesamt-Proteinkonzentration
signifikante (p < 0,05) und hochsignifikante (p < 0,01) Mittelwertsunterschiede
61
Ergebnisse
Die Aktivität der Alkalischen Phosphatase im Plasma lag bei den Kontrollfischen bei 56,9 ± 21,9
U/l. Im Verlauf der Infektion stieg die Aktivität der AP im Plasma deutlich und kontinuierlich an. An
den Infektionstagen 7, 14, 21 zeigte sich bei den Einzelwerten eine große Schwankungsbreite. Am
21. Tag der Infektion war die Aktivität der AP mit 170,2 U/l signifikant gegenüber dem Kontrollwert
erhöht (s. Abb. 4.8.C).
4.4.3 Glucoseverbrauch im Blut durch Trypanoplasma borreli
Von 5 nichtinfizierten Kontrollkarpfen und von 11 mit Trypanoplasma borreli infizierten Karpfen
wurde Blut entnommen. Ein Teil des je Fisch gewonnenen Blutes wurde sofort zentrifugiert, und der
andere Teil wurde 2,5 Stunden bei +20°C inkubiert und erst danach zentrifuguiert. Die
Glucosespiegel vor und nach Inkubation wurden je Fisch verglichen und die Glucoseabsenkung
durch Bildung von Quotienten ermittelt.
In den Blutproben der Kontrollfische zeigte die Inkubation kaum Effekt; eine Absenkung der
Glucosespiegel war nicht oder nur sehr gering zu beobachten. In diesen inkubierten Proben war noch
98-100 % der vor Inkubation festgestellten Glucose vorhanden.
Bei den infizierten Karpfen hingegen war eine sehr deutliche Auswirkung der 2,5-stündigen
Inkubation zu ermitteln. Die Glucosespiegel waren in diesem Zeitraum hochgradig gesunken. Die
Plasmaproben enthielten im Mittel nur noch 61% der Glucose, die vor Inkubation zu messen war; die
Absenkung während der Inkubationszeit betrug somit im Mittel 39%. Diese Absenkung der Glucose
zeigte sich abhängig von der im Blut vorhandenen Trypanoplasmenzahl. So war bei einem Karpfen,
dessen Blut 270.500 Trypanoplasmen/µl (0,271 T/l) enthielt, der Glucosespiegel auf 26% der vor
Inkubation zu messenden Konzentration gesunken, und die Absenkung demnach 74% (s. Abb. 4.9).
62
Ergebnisse
Abb. 4.9: Glucoseverbrauch durch T. borreli. Dargestellt ist das Verhältnis von Glucosegehalt je
Blutprobe nach Isolierung und nach 2,5-h-Inkubation bei 20°C in Abhängigkeit zur in der Blutprobe
enthaltenen Anzahl (1012/l) an T. borreli
4.5
Diagonale: Trendlinie
Klinisch-chemische Parameter im Urin
Der Urin der Karpfen wurde über Blasendauerkatheter gesammelt.
Die Kontrollkarpfen schieden einen ungetrübten, transparenten Urin aus; er war farblos bis sehr
hellgelb und ohne Beimengungen. Bei infizierten Karpfen hatte der Urin ab dem 14. Tag p.i. eine
hellgelbe Farbe; am 21. Tag p.i. war dann bei allen Urinproben eine deutlich gelbe Farbe
festzustellen.
Sedimente konnten in den Urinproben weder bei den Kontrollen, noch bei den infizierten Karpfen
festgestellt werden. Aufgrund des physiologisch sehr verdünnten Fischurins sind dafür wahrscheinlich
größere Mengen Urin nötig, als im Intervallzeitraum gewonnen werden konnten. Der sehr geringe
Überstand enthielt in der Regel weder Zellen, Kristalle, noch Zylinder. Bei zwei Urinproben des 21.
Infektionstages konnten im Überstand Trypanoplasmen beobachtet werden.
63
Ergebnisse
In keiner der Urinproben konnte Hämoglobin nachgewiesen werden; die Infektion verursachte
demnach bei den untersuchten Karpfen keine Hämoglobinurie.
4.5.1 Urinfluß, Urin-pH
Urinfluß und pH-Wert des Urins der Kontrollfische zeigten gute Übereinstimmung mit den in der
Literatur berichteten physiologischen Daten für Karpfen (KAKUTA et al. 1986).
Die je Karpfen produzierte Urinmenge wurde über einen Intervall von 6 Stunden und über 45
Stunden erfaßt. Aus diesen Werten wurde der Urinfluß pro Stunde berechnet. Der Urinfluß wurde
außerdem auf das Körpergewicht der Karpfen bezogen. Bei Kontrollkarpfen betrug der Urinfluß im
Mittel 7,2 ml/kg/h, dabei wiesen die einzelnen Fische recht unterschiedliche Urinflüsse auf. Maximal
wurden 10,5 ml/kg/h und minimal 5,6 ml/kg/h ausgeschieden.
Bei mit T. borreli infizierten Karpfen lag der Urinfluß an den Tagen 7, 14, und 21 p.i. mit 5,8; 6,5
und 7,0 ml/kg/h im Mittel leicht unter dem Wert der Kontrollen, aber auch hier war eine starke
Streuung der Werte zu beobachten (Abb. 4.10.A). Die von infizierten Karpfen ausgeschiedenen
Urinmengen blieben im Verlauf der Infektion innerhalb des Bereiches der Standardabweichung
nichtinfizierter Kontrollfische, und es waren keine signifikanten Veränderungen zu beobachten. Dies
läßt vermuten, daß sich die bei Süßwasserfischen physiologische Polyurie während der Infektion
kaum in Richtung Oligurie veränderte.
Der pH-Wert des Urins betrug bei Kontrollkarpfen im Mittel 7,45; an den Infektionstagen 7, 14,
und 21 zeigten sich mit im Mittel 7,6; 7,6 und 7,3 wenig Veränderungen (Abb 4.10.B). Die Infektion
hatte somit keinen deutlichen Effekt auf den Säuregehalt des Urins erkrankter Karpfen.
4.5.2 Urinosmolalität und –Elektrolyte
Die Osmolalität im Urin betrug bei Kontrollkarpfen im Mittel 28,3 mOsm/kg H20, die
Natriumkonzentration 8,5 mmol/l.
Im Verlauf der Infektion stieg die Osmolalität im Urin an den Tagen 7, 14 und 21 p.i. auf im Mittel
31, 61 und 71 mOsm an und war somit am Tag 21 p.i. 2,5-fach höher als bei den Kontrollen. An
diesem Probentag wies der Urin der infizierten Fische eine äußerst hohe Variationsbreite von 24 –
114 mOsm auf (s. Abb. 4.10.C). Bei den Natriumkonzentrationen im Urin waren gleiche Tendenzen
64
Ergebnisse
zu beobachten. Die Konzentrationen stiegen im Verlauf der Infektion sehr deutlich an (9,0; 24,9;
27,9 mmol/l), und es konnte am Tag 21 p.i. eine im Mittel über 3,5-fach höhere Konzentration als
bei den Kontrollen festgestellt werden (Abb. 4.10.D). Trotz der großen Streuungen der Meßwerte
waren die Erhöhungen der Osmolalität und der Natriumkonzentration an Tag 14 p.i. signifikant und
die an Tag 21 p.i. hochsignifikant im Vergleich zu den nichtinfizierten Fischen.
Die T. borreli-Infektion hatte demnach eine sehr deutliche Auswirkung auf die Osmolalität und die
Natriumkonzentration im Urin der Fische.
Die bei Kontrollfischen geringe Magnesiumkonzentration im Urin von im Mittel 0,04 mmol/l stieg im
Verlauf der Parasitämie massiv, und zeigte am 14. Tag p.i. mit 0,19 mmol/l im Mittel deutlich erhöhte
Werte.
Dieser
Anstieg
war
hochsignifikant.
Am
21.
Tag
p.i.
hingegen
war
die
Magnesiumkonzentration nicht mehr signifikant gegenüber den Kontrolltieren erhöht und betrug dann
im Mittel 0,12 mmol/l (Abb. 4.10.E).
Im Urin der Kontrollkarpfen wurden im Mittel 0,83 mmol Calcium pro Liter Urin gemessen. Diese
Konzentration wurde im Verlauf der Infektion mit Trypanoplasma borreli nur gering überschritten
und stieg am Tag 21 p.i. auf im Mittel 1,0 mmol/l. Gegenüber den Kontrollfischen waren keine
signifikanten Veränderungen zu beobachten (Abb. 4.10.F).
Die Kaliumgehalte im Urin stiegen ab dem 14. Tag p.i. mäßig und waren am 21. Tag p.i. mit 1,8
mmol/l im Mittel verdoppelt im Vergleich zum Mittel der Kontrollkarpfen (0,7 mmol/l). Auch hier
sind individuelle Streuungen zu berücksichtigen und es ergaben sich daher keine signifikanten
Unterschiede (Abb. 4.11.A).
Die Phosphorgehalte in den Urinproben zeigten eine leichte Zunahme bei fortschreitender
Parasitämie. Die Werte waren jedoch insgesamt sehr niedrig. So betrug der Median der Kontrollen
0,01 mmol/l und der Median am Tag 21 p.i. 0,13 mmol/l. Statistisch ergaben sich auch hier keine
signifikanten Unterschiede (Abb. 4.11.B).
65
Ergebnisse
A
14
9
Urinfluß
B
Urin pH
12
8
-----
pH-Wert
ml/ kg/ h
10
-----
6
-----
-----
4
8
-----
---------
-----
7
2
6
0
Ktr
7
14
Ktr
21
7
14
21
C
D
60
140
Osmolalität
100
40
80
-----
60
-----
-----
30
-----
20
-----
40
20
Natrium
50
mmol/l
mOsm/kg
120
10
---------
-----
0
0
Ktr
7
p < 0,05: Ktr – 14
14
Ktr
21
p < 0,01: Ktr- 21
7
p < 0,05: Ktr – 14
14
21
p < 0,01: Ktr- 21
E
F
3,0
0,6
0,5
0,4
2,0
0,3
0,2
0,1
Calcium
2,5
mmol/l
mmol/l
mmol
Magnesium
-----
1,0
---------
0,0
1,5
-----
-----
-----
-----
0,5
-----
0,0
Ktr
7
14
Ktr
21
p < 0,01: Ktr – 14; 7 - 14
Tage nach Infektion
----Ktr
7, 14, 21
7
14
21
Tage nach Infektion
Einzelwert
Median
Standardabweichung der Kontrollkarpfen
Kontrollkarpfen
Tage nach Infektion
Abb. 4.10: Klinisch-chemische Parameter im Urin von Karpfen im Verlauf einer Infektion mit
Trypanoplasma borreli; A: Urinfluß, B: pH-Wert des Urins, C: Osmolalität,
D: Natriumkonzentration, E: Magnesiumkonzentration, F: Calciumkonzentration
signifikante (p < 0,05) und hochsignifikante (p < 0,01) Mittelwertsunterschiede
66
Ergebnisse
A
6
5
B
0,5
Kalium
mmol/l
4
mmol/l
Phosphor
0,4
3
2
-----
1
-----
-----
7
0,2
0,1
-----
0,0
0
Ktr
0,3
14
21
---------
-----
Ktr
7
14
-----
21
C
D
50
Aktivität [U/l]
40
16
Alkalische Phosphatase
14
Ammonium
12
mg/l
30
20
10
8
-----
-----
6
-----
4
10
-----
---------
-----
2
-----
0
0
Ktr
7
14
21
95% Perzentil der Kontrollkarpfen
Tage nach Infektion
Ktr
7
14
21
Tage nach Infektion
E
7
Aktivität [U/l]
6
Gamma-Glutamyl-Transferase
5
-----
4
3
-----
2
-----
-----
7
14
1
0
Ktr
----Ktr
7, 14, 21
21
TageEinzelwert
nach Infektion
Median
Standardabweichung der Kontrollkarpfen
Kontrollkarpfen
Tage nach Infektion
Abb. 4.11: Klinisch-chemische Parameter im Urin von Karpfen im Verlauf einer Infektion mit
Trypanoplasma borreli; A: Kaliumkonzentration, B: Phosphorkonzentration,
C: Aktivität der Alkalischen Phosphatase, D: Ammoniumkonzentration, E: Aktivität der
Gamma-Glutamyl-Transferase
signifikante (p < 0,05) und hochsignifikante (p < 0,01) Mittelwertsunterschiede
67
Ergebnisse
4.5.3 AP, GGT, Ammonium
Im Urin nichtinfizierter Karpfen wurde eine Aktivität der Alkalischen Phosphatase von im Mittel 8,3
U/l, maximal 29 U/l und minimal 2 U/l, gemessen. In dieser Spannbreite bewegten sich auch die APAktivitäten im Laufe der Infektion; die Mittelwerte schwankten um den Mittelwert der
Kontrollfische. Statistisch waren keine Signifikanzen festzustellen. Es zeigte sich in der Höhe der
gemessenen AP-Aktivitäten im Urin kein Effekt der Trypanoplasma borreli-Infektion (Abb.
4.11.C).
Im Karpfenurin war eine Aktivität der Gamma-Glutamyl-Transferase messbar. Sie lag bei den
Kontrollfischen zwischen 1,3 und 4,3 U/l; der Mittelwert der Kontrollgruppe betrug 2,46 U/l. Dieser
Mittelwert der Aktivität der GGT zeigte sich auch bei den infizierten Karpfen 7 und 14 Tage p.i. Am
21. Tag p.i. war er dann im Mittel um das ca. 1,5-fache (3,73 U/l) höher als bei den Kontrollfischen.
Der Median der Messwerte lag an diesem Probentag außerhalb der Standardabweichung der
Kontrollen. Statistisch ergaben sich jedoch keine signifikanten Unterschiede (Abb. 4.11.E).
Der Ammoniumgehalt lag im Urin der Kontrollfische zwischen 4,2 und 12,0 mg/l, bei einem
Mittelwert von 8,0 mg/l. Bei infizierten Karpfen lagen die mittleren Ammoniumgehalte im Urin etwas
unter dem bei Kontrollkarpfen; die Abweichungen sind jedoch nicht signifikant. Es ist also
keineswegs eine erhöhte Stickstoffelimination in Form einer gesteigerten Ammonium-Ausscheidung
durch die Nieren zu beobachten (Abb. 4.11.D).
68
Ergebnisse
4.6
Urin-Plasma-Verhältnisse der Elektrolyte
Um Hinweise über Veränderungen in der Elektrolytausscheidung der Niere im Vergleich zu den im
Plasma gefundenen Werten zu erhalten, wurden die für Urin und Plasma an den jeweiligen Stichtagen
ermittelten Meßwerte in Beziehung gesetzt und dargestellt.
Tabelle 4.2: Urin/Plasma-Quotienten (U/P Ratio) von Osmolalität und Elektrolyten bei Karpfen
während einer Trypanoplasma borreli-Infektion.
Kontrollkarpfen
Tag 7 p.i.
Tag 14 p.i.
Tag 21 p.i.
Osmolalität
0,101
0,109
0,223
0,256
Natrium
0,061
0,065
0,183
0,200
Kalium
2,502
6,356
1,040
0,570
Calcium
0,502
0,422
0,423
0,438
Magnesium
0,032
0,032
0,144
0,093
Phosphor
0,031
0,023
0,121
0,071
In die Berechnung der Quotienten gingen die Mittelwerte für die jeweiligen Stichtage ein.
Die nichtinfizierten Kontrollkarpfen produzierten einen zum Plasma mit 280 mOsm/kg H20 im Mittel
stark hypotonen Urin (28 mOsm im Mittel), der somit nur noch 10% der vormals im Plasma
osmotisch wirksamen Anteile enthielt (U/P Ratio: 0,1) (Tab. 4.2; 4.3 u. Abb. 4.12).
Die Osmolalität des Plasmas der infizierten Karpfen blieb unverändert, aber die Osmolalität des
Urins stieg stark und enthielt am Tag 21 p.i. 25% der osmotisch wirksamen Anteile des Plasmas.
Der Urin war dann weitaus weniger hypoton zum Plasma als bei den Kontrollkarpfen.
Da die Osmolalität zum größten Teil durch die Natriumkonzentration bestimmt wird, zeigte sich auch
bei den Verhältnissen von Natrium im Plasma und im Urin eine sehr ähnliche Entwicklung. Die UrinNatriumkonzentration machte bei den Kontrollfischen 6% der Plasma-Natriumkonzentration aus. Die
hochsignifikante Erhöhung im Urin führte dann am 21. Tag p.i. dazu, daß im Urin noch 20% des
Plasma-Natriums enthalten waren.
69
Ergebnisse
Das Verhältnis von Calcium im Urin und Plasma blieb im Laufe der Infektion nahezu unverändert;
der Anteil von Calcium im Urin machte 42-50% der Plasma-Konzentration aus. Die zuvor
beschriebenen leichten Erhöhungen von Calcium im Plasma und im Urin verliefen somit annähernd
parallel.
Bei Kalium waren hingegen deutliche Änderungen der U/P-Verhältnisse zu beobachten. Bei den
Kontrollen war der Gehalt von Kalium im Urin 2,5-fach höher als im Plasma (U zu P: 0,7 mmol/l zu
0,28 mmol/l). Am 21. Tag p.i. hatte sich dieses Verhältnis, trotz mäßiger Zunahme der Konzentration
im Urin, vollständig geändert. Eine hochsignifikante Zunahme der Kaliumkonzentration im Plasma
führte zu einem Anteil von nur noch 57 % der Urin-Kaliumkonzentration zu der im Plasma (U zu P:
1,82 mmol/l zu 3,19 mmol/l).
Der Magnesiumanteil im Urin machte bei den Kontrollen 3,2 % von dem im Plasma enthaltenen aus
(U zu P: 0,04 mmol/l zu 1,30 mmol/l). Die Infektion führte dazu, daß am 14. Tag p.i. der Anteil im
Urin auf 14 % der im Plasma zu diesem Zeitpunkt vorhandenen Magnesiumkonzentration stieg (U zu
P: 0,19 mmol/l zu 1,35 mmol/l). Die Konzentrationen im Plasma blieben jedoch im Laufe der
Infektion weitgehend stabil.
Ähnliche Änderungen zeigten sich bei den Phosphorgehalten in Urin und Plasma. Im Urin der
Kontrollen war 3,1 % der Phosphorkonzentration im Plasma enthalten. Am 14. Tag stieg dieser
Anteil auf 12,1 % und sank am 21. Tag wieder auf 7,1 %. Diese Veränderungen beruhten
hauptsächlich auf Änderungen im Urin, aber wie zuvor schon beschrieben, ergaben sich bei den
Urin-Phosphorkonzentrationen keine signifikanten Differenzen im Verlauf der Infektion.
70
Ergebnisse
Abb.4.12: Urin/Plasma-Quotienten von Osmolalität und Elektrolyten bei Karpfen im Verlauf einer
T.-borreli-Infektion
71
Ergebnisse
4.7
Tabellarischer Überblick über Veränderungen in Urin und Blut
Tab.4.3: Klinisch-chemische und hämatologische Parameter von Spiegelkarpfen unter akuter T.
borreli-Infektion
URIN
pH-Wert
Osmolalität [mOsm]
Natrium [mmol/l]
Kalium [mmol/l]
Calcium [mmol/l]
Magnesium [mmol/l]
Phosphor [mmol/l]
Ammonium [mg/l]
AP [U/l]
GGT [U/l]
Urinfluß [ml/kg/h]
Nicht infizierte Karpfen
7,45 ± 0,32
28,25 ± 8,61
8,50 ± 3,70
0,70 ± 0,67
0,83 ± 0,47
0,04 ± 0,03
0,05 ± 0,06
8,09 ± 2,93
8,31 ± 9,51
2,46 ± 1,33
7,16 ± 2,43
PLASMA
Osmolalität [mOsm]
Natrium [mmol/l]
Kalium [mmol/l]
Calcium [mmol/l]
Magnesium [mmol/l]
Phosphor [mmol/l]
Protein [g/l]
AP [U/l]
Bilirubin-gesamt [µmol/l]
Nicht infizierte Karpfen
280,0 ± 11,93
138,56 ± 3,51
0,28 ± 0,09
1,66 ± 0,60
1,30 ± 0,20
1,53 ± 0,49
34,06 ± 4,29
56,88 ± 21,92
2,93 ± 0,25
BLUT
T.borreli *1012/ l
Erythrozyten *1012/ l
Hämatokrit l/l
Hämoglobin [g/l]
MCV [µm3]
MCH [pg]
MCHC [g/l Ery.]
Nicht infizierte Karpfen
0
1,67 ± 0,40
0,379 ± 0,0279
104,7 ± 25,8
237,14 ± 47,65
64,63 ± 18,49
276,7 ± 69,9
T. borreli-Infektion Tag 21 p.i.
7,30 ± 0,36
71,71 ± 38,18 **
27,92 ± 20,07 **
1,82 ± 1,43
1,02 ± 0,31
0,11 ± 0,06
0,12 ± 0,09
6,78 ± 4,04
6,00 ± 2,24
3,73 ± 1,75
7,10 ± 1,17
T. borreli-Infektion Tag 21 p.i.
277,60 ± 6,84
139,30 ± 3,15
3,19 ± 1,61 **
2,33 ± 0,50
1,15 ± 0,13
1,62 ± 0,39
26,38 ± 4,10
170,20 ± 74,65 *
7,39 ± 3,77
T. borreli-Infe ktion Tag 21 p.i.
0,1541 ± 0,1148 **
0,73 ± 0,30 **
0,148 ±0,073 **
66,0 ± 18,2 #
196,14 ± 28,65
97,35 ± 24,42 *
511,4 ± 184,1 *
Angegeben sind Mittelwerte und Standardabweichungen.
* : Signifikante (p < 0,05) und **: hochsignifikante (p < 0,01) Differenzen,
# : Signifikanz: p = 0,052
(
: Mg: Kontrollen – Tag 14 p.i.: hochsignifikante Differenz)
72
Ergebnisse
4.8
Chemische Parameter in den Wasserproben
Da Süßwasserfische in der Lage sind, über Kiemen und Darm Elektrolyte aus dem Wasser
aufzunehmen und über die Kiemen auch Stickstoffderivate hauptsächlich in Form von Ammonium
abzugeben, erschien es notwendig, diese Parameter auch im Wasser zu bestimmen. So konnte
überprüft werden, ob für alle untersuchten Fische in diesen Wasserparametern vergleichbare
Umweltbedingungen vorlagen. Außerdem konnte anhand der Messungen kontrolliert werden, ob
sich in den Sammelbehältern und Blasenkathetern Urin oder Aquariumwasser befand.
Jeweils nach Abschluß der Urinsammlung wurden Wasserproben der einzeln in den Versuchsbecken
gehälterten Karpfen genommen.
In den gemessenen Parametern pH-Wert, Osmolalität, Calcium, Magnesium, Natrium, Kalium und
Ammonium zeigte sich im Vergleich der Versuchsbecken der unterschiedlichen Infektionstage und zu
den Versuchsbecken der Kontrollkarpfen weitgehende Übereinstimmung.
Somit kann davon ausgegangen werden, daß die im Laufe der Infektion zu beobachtenden Effekte
im Urin nicht durch unterschiedliche Wasserbedingungen hervorgerufen wurden.
Tab. 4.4: Wasserparameter in den Versuchsbecken während der Urinblasenkatheterisierung
pH-Wert
7,4-7,6
Osmol.
Calcium
Magnesium
Natrium
Kalium
Ammonium
(mOsm/kg)
(mmol/l)
(mmol/l)
(mmol/l)
(mmol/l)
(mg/l)
11,6-12,0
2,04-2,36
0,23-0,34
0,7-0,94
0,06-0,11
<0,13-0,36
Angaben als Minima und Maxima der Mittelwerte der Kontrollkarpfen und jeweils der Tage 7, 14,
und 21 p.i.
73
Diskussion
5 DISKUSSION
5.1
Methodik
Um eine Veränderung der renalen Exkretion bei einer parasitär bedingten interstitiellen Nephritis
beobachten zu können, wurde die Methode der Urinblasendauerkatheterisierung gewählt. Zur
Uringewinnung bei Fischen besteht auch die Möglichkeit, betäubte Fische oder frischgetötete Fische
durch Palpation der Abdominalregion die Blase zu entleeren und so Urin zu gewinnen (BLACK
2000). Da Karpfen eine sehr kleine Urinblase besitzen, 200 g schwere Karpfen im Maximum 0,4 ml
(KAKUTA et al. 1986), erschien diese Methode nicht geeignet, um bei Karpfen ausreichende
Urinmengen zur Analyse zu sammeln. Auch wird durch eine einmalige Blasenentleerung die sich im
Laufe von Stunden zum Teil verändernde Nierenexkretion nicht erfasst (KAKUTA et al. 1986). Eine
weitere Möglichkeit der Urinsammlung am lebenden Fisch besteht in der Installation eines Katheters
in den Ureter (HICKMAN u. TRUMP 1969, ELGER 1982, BLACK 2000), jedoch wird bei
diesem Vorgehen nicht berücksichtigt, daß in der Urinblase die Endzusammensetzung des Urins noch
verändert wird.
Aufgrund der immensen Variabilität der Anatomie des Urogenitaltraktes verschiedener Fischarten
müssen Katheter stets speziell der Fischart und -größe angepasst werden (BLACK 2000). In
Vorversuchen wurde die optimale Formgebung, Größe und Befestigung der Katheter für die
verwendeten Laborkarpfen von 70-100 g Körpergewicht erarbeitet. Die bereits erwähnte kleine
Harnblase der Karpfen führte dazu, daß der Katheter nur maximal 0,5 cm in die Blase eingeführt
werden konnte. Es bestand daher die Gefahr, daß sich bei starken Aktivitäten des Fisches der
Katheter etwas lockert und statt Urin Wasser aufgefangen würde. Da die Karpfen sich in den
Versuchsbecken vorwiegend ruhig verhielten, kam es selten zu diesem Problem. Zusätzlich wurde
am Katheter die eingeführte Länge markiert, um ein eventuelles Lösen aus der Befestigung feststellen
zu können. Um eine Vermischung des Urins mit Wasser zu erkennen, wurde außerdem die
Osmolalität von Urin und Wasser überprüft; zweifelhafte Proben wurden verworfen.
Generell muß aufgrund der Urogenitalanatomie der Karpfen, das Ovidukt führt in das caudale Ende
der Harnblase, die Geschlechtsreife der Tiere bei Urinsammlungen durch Blasenkatheter
berücksichtigt werden. So ergab sich bei Vorversuchen an bereits geschlechtsreifen, nicht infizierten
Karpfen eine vor allem in Natrium und Osmolalität hochgradig veränderte Urinzusammensetzung.
Diese Werte lagen dann, vermutlich durch abgehende Gonadensekrete, zum Teil um das Fünffache
höher als die von juvenilen Karpfen. Auch können die zahlreichen endokrinen Veränderungen in
74
Diskussion
Verbindung mit der Geschlechtsreife die Ionen- und Osmoregulation der Fische beeinflussen
(ROBERTS 1989). Daher erschien es unter der Fragestellung der Beurteilung der Osmoregulation
unter einer Nephritis nicht sinnvoll, hier Werte von geschlechtsreifen Karpfen in die Ergebnisse
miteinfließen zu lassen. Zusätzlich ist zum Zeitpunkt der Laichreife mit Verstopfungen des
Katheteranfangs durch Sperma oder Eier zu rechnen.
Der Urin der ersten 22 Stunden wurde verworfen, um die durch den Streß der Katheterimplantation
häufig zu beobachtendende Labordiurese und folgende Veränderungen der Urinproduktion zu
berücksichtigen. In früheren Arbeiten (KAUNE 1980, ELGER 1982, ELGER et al. 1986,
KAKUTA et al. 1986, KAKUTA et al. 1992) wurde deutlich, daß zumeist erst nach diesem
Vorlaufzeitraum annähernd physiologische Urinflüsse zu beobachten waren. Weitere Auswirkungen
von Streß, wie durch Hältern in speziellen Versuchsbecken während der Urinsammlung, auf Urin und
Blutzusammensetzung können nicht völlig ausgeschlossen werden. Da aber stets parallel mit den
infizierten Fischen auch nicht infizierte Fische unter gleichen Bedingungen katheterisiert und untersucht
wurden und die Ergebnisse sich auf Vergleiche dieser Gruppen untereinander beziehen, kann
angenommen werden, daß gefundene Veränderungen trotz Stresseinwirkung Einflüsse der
Trypanoplasma borreli-Infektion widerspiegeln.
5.2
Histologie, Parasitämie und Hämatologie
Histologie:
Die Nierenpräparate der katheterisierten Kontrollfische wichen in ihrer Histologie nicht von der
Norm für gesunde Karpfen ab. Die angewandte Methode zur Katheterisierung der Urinblase führte
zu keinen Gewebeänderungen der Niere. Es kann demnach davon ausgegangen werden, daß die
histopathologischen Reaktionen in den Nieren der infizierten Fische allein durch die Trypanoplasma
borreli-Infektion hervorgerufen wurden.
Die bei den infizierten Karpfen festgestellten histopathologischen Veränderungen des Nierengewebes
stimmten mit Beobachtungen vorangegangener Arbeiten überein (BUNNAJIRAKUL 1998,
RUDAT 1999).
In der vorliegenden Arbeit entwickelten alle infizierten Karpfen, im Verlauf der Infektion mit
Trypanoplasma borreli stark zunehmend, eine massive Proliferation des hämatopoetischen
Zwischengewebes, sowie Tubulusdegenerationen und –atrophien. Diese Veränderungen können als
interstitielle Nephritis angespochen werden (RUDAT 1999).
75
Diskussion
Um einen Überblick über das tatsächliche Ausmaß der Tubulizerstörung und die Anzahl an
verbleibenden gesunden Nephronen zu erlangen, wurden diese in den Präparaten der vorliegenden
Studie ausgezählt. Dabei war festzustellen, daß zum einen die Anzahl der defekten Tubuli,
insbesondere ab Tag 14 p.i., deutlich zunahm und zusätzlich die Proliferation des Gewebes dazu
führte, daß weitaus weniger Tubuli pro Gesichtsfeld existierten. Insgesamt kann aber aufgrund der
Auszählungen angenommen werden, daß am Tag 21 p.i. noch im Mittel 40-50 % der Tubuli
histologisch intakt und somit auch in ihrer Funktion nicht beeinträchtigt waren. Demnach war rund
40-50 %
des
exkretorischen
Nierengewebes
noch
in
der
Lage,
exkretorische
und
osmoregulatorische Funktion zu übernehmen.
Außerdem war bei der Auszählung der Schädigungen eine weitgehende Einheitlichkeit der infizierten
Fische innerhalb der Probennahmetage im Laufe der Infektion zu beobachten. Diese gute
Übereinstimmung der Nierenhistologie der untersuchten Karpfen im Verlauf der Infektion ist
bemerkenswert. Denn in der Höhe der Parasitämie, den folgenden Veränderungen im roten Blutbild
und bei den Auswirkungen auf die Urinzusammensetzung besonders am Tag 21 p.i. waren große
individuelle Unterschiede zu verzeichnen.
Parasitämie:
Alle mit Trypanoplasma borreli infizierte Karpfen entwickelten individuell unterschiedlich starke
Parasitämien; dabei waren am Tag 21 p.i. aber mit 26.000 bis 335.000 Trypanoplasmen im µl Blut
(0,0260 bis 0,3350 Tera Trypanoplasmen/l) insgesamt sehr hohe Flagellatenzahlen zu verzeichnen.
Die eingesetzten Laborkarpfen erwiesen sich als hochempfänglich für eine Infektion mit T. borreli.
Zusätzlich infizierte Karpfen, die zuvor nicht katheterisiert wurden, starben zwischen dem 21. und
dem 24. Tag p.i. Die Untersuchung der Fische bis zum 21. Tag p.i. umschreibt demnach den
Infektionszeitraum bis kurz vor den zu erwartenden Todeszeitpunkt.
Hämatologie:
Wie in vorangegangen Untersuchungen zu Trypanoplasma borreli-Infektionen beim Karpfen
(STEINHAGEN et al. 1990, HAMERS 1994, BUNNAJIRAKUL 1998) zeigte sich auch im
Blutbild der hier untersuchten Karpfen mit Zunahme der Parasitämie, insbesondere am
Untersuchungstag 21 p.i., eine hochgradige Anämie. Da der Hämoglobingehalt im Laufe der
Parasitämie weniger stark sank als der Hämatokrit, war bei den Karpfen am 21. Tag der Infektion
eine hyperchrome, mikrozytäre Anämie festzustellen. Diese Anämieform unterscheidet sich von der,
die HAMERS (1994) bei mit Trypanoplasma borreli infizierten Karpfen beobachtete. Er stellte am
Höhepunkt der Parasitämie eine normochrome, normocytäre Anämie fest. Allerdings verwendete er
76
Diskussion
eine für die Trypanoplasmen offensichtlich weniger empfindliche Karpfenlinie. Denn die
Parasitenzahlen waren trotz vergleichbarer Inokulation deutlich weniger hoch; das Maximum wurde
erst am 33. Tag p.i. erreicht und lag bei 8000 Parasiten/µl Blut (0,008 T/l); die Tiere regenerierten,
und es manifestierte sich dann eine mikrozytäre, hypochrome Anämie.
Die durch Trypanoplasma borreli hervorgerufene Anämie ist in der Regel regenerativ, denn
vorangegangene Studien zeigten, daß im Laufe der Infektion ein Anstieg der Retikulozyten zu
verzeichnen ist (STEINHAGEN et al. 1990). Daher ist auch ein Auslösen der Anämie durch die
Niereninsuffizienz selbst, die beim Säugetier bei chronischem Verlauf durch den Rückgang der
Erythropoetin-Produktion verursacht wird und dann nichtregenerativ ist (DAVID et al. 1995), bei
diesen Karpfen auszuschließen.
Bei Trypanosomeninfektionen bei Säugetieren wird eine Hämolyse der Erythrozyten durch Lysine
der Parasiten und verstärkte Autophagocytose durch stimulierte Monocyten/Makrophagen
beobachtet.
Untersuchungen
bei
Regenbogenforellen
zeigten,
daß
im
Verlauf
von
Trypanoplasmeninfektionen bei Fischen die zu beobachtenden Anämien auf ähnlichen Mechanismen
wie bei Säugetieren beruhen (THOMAS u. WOO 1988).
Auch die in dieser Untersuchung beobachtete deutliche Bilirubinämie und die gleichzeitige Absenkung
des Hämatokrits sind Anzeichen einer hämolytischen Anämie. Eine Hämodilution, z. B. durch
Absinken des intravaskulären kolloid-osmotischen Druckes, ist als Mitursache der Anämie nicht
auszuschließen, denn die Karpfen entwickelten am Tag 21 p.i. eine Hypoproteinämie.
Neben einer relativen Hypoproteinämie durch Hydratation, gegen die die unveränderte
Plasmaosmolalität spricht, ist als ein möglicher Grund für die erniedrigten Gesamtproteingehalte des
Plasmas ein eventueller renaler Verlust über geschädigte Glomerula zu bedenken. In licht-und
elektronenmikroskopischen Nierenuntersuchungen bei mit Trypanoplasma borreli infizierten
Karpfen wurden von RUDAT (1999) allerdings keine Schädigungen der Glomerula beobachtet.
Auch in den Nierenpräparaten dieser Untersuchung konnten lichtmikroskopisch keine Schädigungen
der Glomerula beobachtet werden. Jedoch können beim Säugetier auch durch tubuläre
Reabsorptionsstörungen glomerulär filtrierte niedermolekulare Proteine über den Endharn verloren
gehen (BICKHARDT 1992). In der vorliegenden Studie konnten mit den beschriebenen Methoden
keine Proteinfraktionen im üblicherweise sehr dünnen Urin bestimmt werden.
77
Diskussion
5.3
Urin und Plasma
Urin:
Die durch die Trypanoplasmen-Infektion hervorgerufene interstitielle Nephritis hatte sehr deutliche
Effekte auf die Urinzusammensetzung der Fische.
Der physiologisch stark hypotone Urin der Süßwasserteleosteer enthielt bei den Kontrollkarpfen nur
noch 10% der Osmolalität des Plasmas, und somit waren die nicht infizierten Fische gut in der Lage,
Salzverluste im Süßwasser zu vermeiden.
Die interstitielle Nephritis hatte zur Folge, daß der Anteil der osmotisch wirksamen Substanzen im
Urin auf rund 25% der im Plasma enthaltenen stieg. Es gingen den Karpfen also am Ende der
Infektion sehr viel mehr osmotisch wirksame Substanzen über die Niere verloren, als dies bei
gesunden Karpfen der Fall war. Den Haupteil der osmotisch wirksamen Substanzen im Plasma und
im Urin macht Natrium aus (BONE u. MARSHALL 1985). Bei Untersuchungen von KAKUTA et
al. (1986) im Karpfenurin korrelierten Natriumkonzentration und Urinosmolalität signifikant. Auch
bei den hier untersuchten Urinproben war eine nahezu parallele Entwicklung dieser beiden Parameter
zu beobachten. Die Exkretion von Natrium über die Niere stieg durch die Nephritis stark, und die
Karpfen verloren im Maximum über das Sechsfache an Natrium über die Niere, als dies bei nicht
infizierten Karpfen der Fall war. Die nierenpathologischen Untersuchungen von RUDAT (1999) an
mit Trypanoplasma borreli infizierten Karpfen ergaben Degenerationen der Epithelzellen des
distalen Tubulus ab dem 7. Tag p.i. Die nun beobachtete steigende Natriumexkretion ab Tag 7 p.i.
steht gut im Einklang mit diesen histologischen Ergebnissen. Es kann aufgrund der hier erzielten
Ergebnisse im Urin geschlossen werden, daß die von RUDAT (1999) im Elektronenmikroskop
beobachteten Mitochondrienschäden im distalen Tubulus die dort vor allem stattfindende
energieintensive Natriumreabsorption stark behinderten, und dies der Grund für die so deutlich
vermehrte Natriumausscheidung über den Urin war.
Erstaunlich sind hierbei die Natriumwerte im Urin einzelner Karpfen am 21. Tag p.i., die trotz hoher
Parasitämie und starken histologischen Nierenveränderungen, nahezu im Normbereich lagen. Die
Regulationsfähigkeit der Niere bei Tubulidefekten scheint individuell recht unterschiedlich zu sein.
Die insbesondere am 14. Tag p.i. hochsignifikant ansteigende Magnesiumkonzentration im Urin
zeigte eine erhöhte renale Exkretion dieses zweiwertigen Ions. Der Verlust von Magnesium über die
Niere war im Vergleich gegenüber gesunden Karpfen zu diesem Zeitpunkt um das Fünffache erhöht.
Auch diese Beobachtung steht in Übereinstimmung mit den von RUDAT (1999) ab Tag 14 p.i.
festgestellten Schädigungen des proximalen Tubulusepithels. Hier erfolgt die Rückresorption
78
Diskussion
zweiwertiger Ionen, wie Magnesium, aus dem Primärharn, die demnach bei geschwächtem Epithel
gestört ist.
Nicht ganz auszuschließen ist eine Beteiligung von freigesetztem Magnesium aus lysierten
Erythrozyten am Anstieg der Magnesiumkonzentration im Urin (KRAFT 1989). Da jedoch das
Ausmaß der Anämie bis zum 21. Tag p.i. stark ansteigt, wäre im Fall einer solchen Beteiligung auch
ein Anstieg der Magnesiumexkretion bis zu diesem Zeitpunkt zu erwarten.
Bei beginnender Niereninsuffizienz ist bei Säugern häufig eine Polyurie zu beobachten (DAVID et al.
1995). Da Süßwasserfische bereits physiologisch eine Polyurie aufweisen, wird dieser Effekt nicht
messbar. Die Urinflüsse der infizierten Tiere verringerten sich nur sehr gering und es zeigte sich somit
ebenso keine, vom Säugetier bei hochgradiger Niereninsuffizienz bekannte, Oligo- oder Anurie.
Andererseits ist denkbar, daß sich diese beiden Effekte, durch sich in unterschiedlichen
Defektstadien befindliche Nephrone noch aufhoben und die Karpfen sich in einem PseudonormurieStadium befanden.
Bei Regenbogenforellen in der akuten Phase einer viralen hämorrhagischen Septikämie wurde,
aufgrund der reduzierten GFR und Urinflüsse, eine Veränderung der glomerulären Hämodynamik im
Sinne einer Hypoxie diskutiert (ELGER et al. 1986). Auch bei in Hypoxie befindlichen Karpfen
wurde ein Sistieren der Urinflüsse beobachtet (KAKUTA et al. 1992). Die nahezu unveränderten
Urinflüsse der mit T. borreli infizierten Karpfen dieser Untersuchung, lassen daher eine Hypoxie der
gesamten Niere als Folge der Infektion in den Hintergrund treten. Als Folge der im Blutbild
festgestellten Anämie in Verbindung mit der Ansammlung von Flagellaten auch in den Blutgefäßen
der Niere, ist allerdings nicht auszuschließen, daß in der Niere lokale Ischämien vorlagen. Der durch
solche Ischämien in der Niere dann zu erwartende Urinflußverlust, könnte durch eine noch
ausreichende Zahl an intakten Nephronen aufgefangen worden sein.
Die unveränderten Urinmengen in Kombination mit den hohen Urinnatriumgehalten lassen die
Vermutung zu, daß die Natrium-Chlorid-Sekretion und der dadurch stattfindende, für
Süßwasserfische essentielle Wassernachzug ins Lumen des proximalen Tubulus trotz Nephritis
insgesamt noch ausreichend funktionierte. Diese Schlussfolgerung wird durch histo-pathologische
Untersuchungen gestützt, die zeigten, daß die Defekte der proximalen Tubuluszellen, im Gegensatz zu
denen im distalen Tubulus, erst allmählich im Verlauf der Infektion zunahmen (RUDAT 1999). Diese
später und insgesamt etwas weniger ausgeprägten Zellschädigungen im proximalen Tubulus, in
Verbindung mit den im Urin kaum angestiegenen Calciumwerten lassen vermuten, daß dort
stattfindende Reabsorptionsvorgänge für dieses zweiwertige Ion noch weitgehend funktionierten.
79
Diskussion
Die Aktivität des Enzyms Alkalische Phosphatase erhöhte sich im Urin trotz der fortschreitenden
Tubulischädigungen im Mittel nicht wesentlich. Es liegen bisher keine weiteren Angaben über
Messungen von AP im Urin von Fischen mit Nephropathien vor, doch wären aufgrund der in
Karpfennieren enorm hohen AP-Aktivität (SCHEINERT u. HOFFMANN 1987) und der
Ansiedlung des Enzyms vor allem im proximalen Bürstensaum (HENTSCHEL u. MEYER 1980)
eine Erhöhung der Aktivitäten im Urin zu vermuten gewesen. So erscheint das Enzym, auch aufgrund
der bei den Messungen im Plasma auftretenden hohen Streuung, zur Diagnostik von Nierenschäden
bei Karpfen nicht sehr geeignet.
Die Aktivität der GGT im Urin hingegen erhöhte sich im Laufe der interstitiellen Nephritis im Mittel
um 50%, so daß angenommen werden kann, daß sich dieses Enzym beim Karpfen, ähnlich wie beim
Säugetier, als empfindlicher Indikator von Tubulusschäden eignet. Da in der Literatur Angaben über
dieses Enzym bei Fischen fehlen, wären hier vertiefende Studien vielversprechend.
Plasma:
Die im Urin der infizierten Karpfen zu beobachtenden starken renalen Verluste von osmotisch
aktiven Substanzen, hierbei insbesondere Natrium, könnten dazu führen, daß diese Substanzen im
Plasma der Fische daraufhin fehlten, so daß eine Hypoosmolalität und eine Hyponatriämie entstehen
könnten. So beobachteten BARHAM et al. (1980) bei Regenbogenforellen, deren Nieren durch
Bakterien (Aeromonas spp. u. Streptococcus spp.) angegriffen waren, eine Hyponatriämie und
diskutierten einen Funktionsverlust der Niere.
Unsere Untersuchungen der Osmolalität und des Natriumgehaltes im Plasma der mit
Trypanoplasma borreli infizierten Karpfen zeigen deutlich, daß die renalen Verluste durch die
verminderte Reabsorption von Natrium nicht zu einer Veränderung der Natriumkonzentrationen im
Plasma führten. Ebenso zeigten auch die renalen Verluste von Magnesium keinen Effekt auf die
Magnesiumgehalte im Plasma der infizierten Karpfen. Die Osmoregulation der mit T. borreli
infizierten Karpfen erwies sich in diesen Punkten also trotz Entstehung einer interstitiellen Nephritis
kaum beeinträchtigt.
Grund hierfür kann sein, daß die pathologischen Veränderungen in ihrem Ausmaß nicht ausreichten,
um eine Entgleisung des Ionenhaushalts der Karpfen zu verursachen oder daß die Dauer der
Infektion und damit der Nephritis von ca. 3 Wochen nicht ausreichte, um solch eine Entgleisung
hervorzurufen. Dieses Ergebnis ist insbesondere vor dem Hintergrund des osmotischen Problems von
Süßwasserfischen, den ständigen Salzverlust und Wassereinstrom in den Körper durch die
80
Diskussion
Produktion von großen Mengen stark verdünnten Urins kompensieren zu müssen, sehr
bemerkenswert.
Da Fische zur Kompensation von Salzverlusten, neben der verstärkten Retention in der Niere,
zusätzlich auch Salze über Kiemen und Intestinaltrakt aufnehmen können (EVANS 1993), ist es
wahrscheinlich, daß diese Strukturen die durch die Tubulidefekte herabgesetzte renale
Osmoregulation der Fische auffangen konnten. Es ist zusätzlich denkbar, daß während der durch
Trypanoplasmen hervorgerufenen Nephritis die osmoregulatorische Funktion der Niere, von noch
nicht pathologisch veränderten Nephronen aufrechterhalten wurde. Bei Säugetieren sind die Nieren
in der Regel in der Lage, einen Verlust von 50% der Nephrone ohne starke Einbuße ihrer
exkretorischen Funktion auszugleichen (DAVID et al 1995). Unsere Untersuchungen lassen
vermuten, daß Fische ähnlich flexibel reagieren können.
Bei Fischen spielt der wechselnde Einsatz von Nephronen unter veränderlichen Bedingungen, wie
Wanderung von Süßwasser ins Meer von euryhyalinen Arten, eine große Rolle. Messungen der
GFR in einzelnen Forellennephronen zeigten, daß im Süßwasser 45% aller Nephronen filtern und im
Meerwasser jedoch nur 5% (BONE u. MARSHALL 1985). Diese Werte unterstreichen die
enorme Flexibilität und Anpassungsfähigkeit von Fischnieren im Allgemeinen, die auch in den
vorliegenden Untersuchungen festgestellt werden konnte.
Diese generell hohe Anpassungsfähigkeit scheint jedoch bei Karpfen größeren individuellen
Unterschieden zu unterliegen. So war zum Beispiel bei einem infizierten Karpfen bereits am Tag 14.
p.i. ein über dem Mittelwert dieses Untersuchungstages liegender Natriumverlust über die Niere, von
32,0 mmol/l zu im Mittel 24,8 mmol/l, im Urin festzustellen. Im Plasma dieses Karpfen manifestierte
sich gleichzeitig eine deutliche Hyponatriämie von 123,5 mmol Natrium/l zu im Mittel 135,7 mmol/l.
Bei der Mehrzahl der infizierten Karpfen waren die Nieren trotz durchgehend deutlicher
histopathologischer
Befunde
noch
teilweise
zur
Regulation
ihrer
Sekretions-
und
Reabsorptionsmechanismen im proximalen Tubulus in der Lage. Diese Vermutung wird durch die
Calciumgehalte in Urin und Plasma unterstützt. Das Verhältnis zwischen Urin- und
Plasmakonzentration
dieses
Ions
blieb
während
der
Infektion
stets
konstant.
Die
Plasmakonzentrationen stiegen im Laufe der Infektion mäßig und daraufhin wurde die renale
Exkretion von Calcium hochreguliert. Ein Hinweis auf eine verminderte renale Regulationsfähigkeit ist
die leichte Erhöhung der Plasmacalciumkonzentrationen im Laufe der Infektion.
Auch die renale Exkretion von Kalium konnte nicht mit der rapiden Erhöhung im Plasma
schritthalten, denn der Plasmakaliumgehalt war am Tag 21 p.i. hochsignifikant verändert. Dieser
81
Diskussion
starke Anstieg bei den mit Trypanoplasma borreli infizierten Karpfen ist wohl auf die durch die
Blutflagellaten hervorgerufene Hämolyse von Erythrozyten zurückzuführen. Durch eine Hämolyse
wird Kalium aus den Erythrozyten freigesetzt, und auf diese Weise erhöht sich der Plasmaspiegel
dieses Ions (MCDONALD u. MILLIGAN 1992). Somit wäre eine Erhöhung des Kaliumspiegels
unter einer hämolytischen Anämie auch bei unverändertem Nierengewebe zu erwarten.
Glucoseverbrauch durch T. borreli:
Die 2,5-stündige Inkubation der Blutproben von Karpfen, die zuvor mit T. borreli infiziert wurden,
rief eine enorme Absenkung der Glucosekonzentration im Vergleich zu den Messungen im sofort
nach Blutentnahme zentrifugierten und gefrorenen Proben hervor. Die parallele Inkubation von
Blutproben von nicht infizierten, unter gleichen Bedingungen gehaltenen, Kontrollkarpfen provozierte
nahezu keine Glucoseabsenkung in den Proben. Demzufolge kann davon ausgegangen werden, daß
die in den Blutproben infizierter Karpfen zahlreich vorhandenen Trypanoplasmen während der
Inkubationsdauer Glucose aus dem Karpfenblut für eigene Stoffwechselvorgänge verbrauchten.
Denn für die Haemoflagellaten ist Glucose aus dem Blut des Wirtes von zentraler Bedeutung
(MEHLHORN 1988). Der Verbrauch während der Inkubation stieg tendenziell mit der Menge der
im Blut festgestellten Trypanoplasmen. Auch für den Energiestoffwechsel der Fische hat Glucose
essentielle Bedeutung. Karpfen mit hohen Zahlen von zusätzlich Glucose verbrauchenden
Trypanoplasmen waren vermutlich schnell einem Energiemangel ausgesetzt.
Da Fische bereits im Ruhestoffwechsel ca. 50% ihrer Energie für die Atmung benötigen (NELLEN
1983), wird der Energiehaushalt der infizierten Karpfen durch den aus der hochgradigen Anämie
enstehenden Sauerstoffmangel, und darauf folgenden Anpassungsmachanismen, zusätzlich extrem
belastet. Solche Anpassungsmechanismen an Sauerstoffmangel können auch bei klinisch gesunden
Fischen in einem durch Energiemangel hervorgerufenen Tod resultieren (SCHÄPERCLAUS 1990).
Zusätzlich stehen bei energetisch belasteten Fischen Prozesse der Respiration und der
Aufrechterhaltung der osmotischen Balance in energetischer Konkurrenz (SCHRECKENBACH u.
SPANGENBERG 1987). Es ist somit anzunehmen, daß bei den infizierten Karpfen am Ende der
Infektion ein drastischer Energiemangel vorlag.
82
Diskussion
Schlussbetrachtung
Die pathologischen Veränderungen des exkretorischen Nierengewebes während der Infektion mit
dem Blutparasiten Trypanoplasma borelli in Form von Mitochondrienschwellung und daraus
folgender vakuolärer Degeneration im distalen Tubulus ab Tag 7 p.i. und im proximalen Tubulus ab
Tag 14 p.i. (RUDAT 1999) resultierten in einer gestörten Funktion der Nieren.
Bereits ab Tag 7 p.i. war eine verminderte tubuläre Natriumreabsorption zu verzeichnen und die
Karpfen erlitten folgend in starken Maß zunehmende Natriumverluste über den Urin. Die Ursache
hierfür lag mit hoher Wahrscheinlichkeit in den ab Tag 7 p.i. verzeichneten vakuolären
Degenerationen der Epithelzellen des distalen Tubulus (RUDAT 1999), der Ort des aktiven und
damit sehr energieaufwendigen Natriumrücktransportes ist.
Zusätzlich zeigten die infizierten Karpfen am Tag 14 p.i. mit dem Anstieg der
Magnesiumkonzentration im Urin eine stark gestörte tubuläre Reabsorption von Magnesium.
Magnesium wird im proximalen Tubulus reabsorbiert, wo ebenfalls ab Tag 14 p.i. Schäden der
Zellstruktur auftraten (RUDAT 1999). Somit kann davon ausgegangen werden, daß die
Tubulizelldefekte dazu führten, daß die Zellen in ihrer Funktion gestört waren und dies die Ursache
für die erhöhte renale Magnesiumexkretion war. In diesen Punkten konnte durch die vorliegende
Studie eine Verbindung von der pathologisch beobachteten interstitiellen Nephritis zu einer
beeinträchtigten Nierenfunktion geschaffen werden.
Die beobachtete Funktionsstörung der Nieren zeigte jedoch keine Auswirkung auf die
Plasmaosmolalität. Da in der Literatur Angaben zur Urinzusammensetzung unter nierenpathologischen
Zuständen bei Süßwasserfischen fehlen, können hier Ausmaß und Art der Veränderungen nicht mit
solchen verglichen werden. Es kann aber angenommen werden, daß die renalen Verluste an Natrium
und Magnesium durch Aufnahme über die Kiemen ausgeglichen wurden. Die Osmoregulation der
Karpfen war somit über den Zeitraum der Infektion insgesamt noch intakt. Es ist zu vermuten, daß
sowohl die Natriumaufnahme über die Kiemen, als auch gesund gebliebene Nephrone die
Osmolalität des Plasmas stabil halten konnten. Als Grund für die durch die Infektion mit
Trypanoplasma borreli hervorgerufenen Mortalitäten ist daher eine Entgleisung des Ionenhaushaltes
weitgehend auszuschließen.
Als Ursache für den Tod der Karpfen als Folge der Infektion mit Trypanoplasma borelli tritt somit
die Hämolytische Anämie mit Hämatokritwerten, von im Minimum nur 5%, in den Vordergrund. Die
daraus
folgenden
Probleme
in
der
Sauerstoffversorgung,
83
deren
energieintensiven
Diskussion
Anpassungsmechanismen,
die
energetisch
aufwendigen
Regulationsmechanismen
in
der
Osmoregulation und die Blutglucose verbrauchenden Trypanoplasmen führten vermutlich zu einem
Zusammenbrechen des Energiehaushaltes der Karpfen.
84
Zusammenfassung
6 ZUSAMMENFASSUNG
Um die Auswirkungen einer parasitär bedingten Nephritis auf Parameter in Urin und Blut von
Spiegelkarpfen beobachten zu können, wurden Laborkarpfen jeweils 5000 Trypanoplasma borreli
i.m. inokuliert und so eine Infektion mit dem Blutflagellaten hervorgerufen. In vorangegangenen
Untersuchungen zeigte sich, daß T. borreli-Infektionen bei Karpfen Anämien und schwere
Veränderungen der Niere hervorrufen, die sich in Form einer interstitiellen Nephritis darstellen. Bei
für die Infektion mit diesem Blutparasiten empfänglichen Karpfenlinien führt die Erkrankung zum
Tod. Die Hauptaufgabe des exkretorischen Teiles der Fischniere besteht in der Volumenregulation
und Salzretention. Die Niere hat somit wichtigen Anteil an der Osmoregulation. Im Süßwasser
produzieren Fische große Mengen stark verdünnten Urins und gleichen so Salzverluste und den
osmotischen Wassereinstrom aus.
Um die Osmoregulationsfähigkeit und die Hämatologie im Verlauf der Infektion beobachten zu
können, wurde jeweils an den Tagen 7, 14 und 21 p.i. der Urin der infizierten Karpfen und parallel
der von nichtinfizierten Kontrollkarpfen über zuvor installierte Blasendauerkatheter gesammelt. Nach
erfolgter Urinsammlung wurde den Karpfen Blut und nach Sektion die rechte Nachniere entnommen.
Im Blut der Karpfen wurden Parasiten-, Erythrozytenzahlen, Hämatokrit und der Hämoglobingehalt
an den Tagen 7, 14, und 21 p.i. bestimmt. Neben der Osmolalität und den Elektrolyten Natrium,
Kalium, Calcium, Magnesium und Phosphor wurde im Plasma zusätzlich der Protein-, der
Bilirubingehalt und die Aktivität der Alkalischen Phosphatase bestimmt. Auffällig abweichende
Befunde im Blut waren neben der hochgradigen Parasitämie und Anämie eine Hyperbilirubinämie,
Hyperkaliämie und Hypoproteinämie. Im Urin wurde zusätzlich zur Osmolalität und den Elektrolyten
der Urinfluß, pH-Wert, Ammoniumgehalt, und die Aktivität der Enzyme Alkalische Phosphatase und
Gamma-Glutamyl-Transferase bestimmt. Im Verlauf der Infektion waren deutliche Veränderungen im
Urin vor allem bei Osmolalität, Natrium-, Magnesiumkonzentration und GGT-Aktivität festzustellen.
In der Histologie der Nieren der mit Trypanoplasma borreli infizierten Karpfen zeigte sich, im
Verlauf
der
Infektion
verstärkend,
eine
massive
Proliferation
des
hämatopoetischen
Zwischengewebes, sowie sehr zahlreiche Tubulusdegenerationen und -atrophien. Die Auszählungen
der histologisch intakten Tubuli und der Tubuli pro Gesichtsfeld ergaben, daß am 21. Tag der
Infektion, am Höhepunkt der Parasitämie etwa 50-60% des exkretorischen Gewebes pathologisch
verändert und somit andererseits etwa 40-50% der Nephrone noch intakt waren.
Im Urin zeigten sich vor allem eine massiv erhöhte Osmolalität und ebenso stark erhöhte Gehalte an
Natrium. Zusätzlich war eine deutliche Erhöhung des Magnesiumgehaltes im Urin zu verzeichnen. Die
85
Zusammenfassung
Defekte der Epithelzellen im distalen Tubulus verursachten somit einen hochgradigen renalen Verlust
an Natrium durch eine verminderte Fähigkeit zur energieintensiven Natriumreabsorption in diesem
Tubulusabschnitt. Die später im Verlauf der Infektion auftretenden Zelldefekte im proximalen Tubulus
führten zur Verringerung der dort stattfindenden Magnesiumreabsorption. Die Infektion zeigte jedoch
kaum Einfluß auf die stündlichen Urinflüsse der Karpfen. Vermutlich befanden sich die Karpfen in
einem Stadium der Pseudonormurie, und die Filtrationsleistung der defekten Nephrone konnte von
noch in ausreichender Menge vorhandenen intakten Nephronen übernommen werden.
Trotz der enormen renalen Verluste an Natrium und Magnesium, bei gleichzeitig hochgradiger
Parasitämie und histopathologischen Nierenbefunden, zeigten sich bei der Mehrheit der Karpfen die
Osmolalität, Natrium- und Magnesiumspiegel des Plasmas stabil. Die osmotische Belastung durch
die renalen Ionenverluste wurde offensichtlich von Kiemen, Darm und durch unveränderte
Nierenanteile aufgefangen und so die Osmolalität des Plasmas noch weitgehend kontrolliert.
Im Blut der Karpfen war eine mit der Höhe der Parasitämie zunehmende hochgradige hämolytische
Anämie festzustellen. Diese regenerative Anämie war zunächst normochrom, mikrozytär und am
Ende der Infektion hyperchrom, mikrozytär. Aufgrund der Ergebnisse zur Osmoregulation der
Karpfen muß für den Tod der Fische am Ende der Infektion vordergründig die hochgradige Anämie
und die damit verbundene Sauerstoffarmut in Kombination mit einem hochgradigen Energiemangel
verantwortlich gemacht werden. Dieser Energiemangel wurde zusätzlich durch die energieintensive
Regelung der osmotischen Stabilität über die Kiemen und durch die stark Glucose verbrauchenden
Trypanoplasmen verstärkt.
86
Summary
7 SUMMARY
Claudia Meyer:
Effects of a parasite induced nephritis on clinical-chemical parameters in blood and urine of
common carp (Cyprinus carpio L.)
In order to observe the effects of a parasite-induced nephritis on parameters of urine and blood of
common carp, fishes were inoculated with 5000 Trypanoplasma borreli per fish by intra muscular
injection. This induced an infection with the blood flagellate.
In previous investigations it was observed that the infection of carp with T. borreli caused anaemia
and an interstitial nephritis. This pathology lead to death of carp from a parasites susceptible line. A
major task of the excretory part of the fish kidney is volume regulation and salt retention. Thus the
kidney has to perform an important part of piscine osmoregulation. In fresh water fishes are
producing large quantities of highly diluted urine to compensate salt losses and osmotic water influx.
In order to monitor the capacity of osmoregulation in carp under T. borreli–infection, urine and
blood samples were collected at the days 7, 14 and 21 post infectionem (p.i.). The urine was
collected by means of a continuos catheter of the urinary bladder. In addition to infected carp, urine
and blood samples were taken from uninfected carp as well. After collecting urine and blood, the
right part of the body kidney was removed and fixed for histology. The urinary determined
parameters were osmolality, electrolytes, pH, ammonia level, activity of the enzymes alkaline
phosphatase and gamma-glutamyl-transferase as well as urine flow.
In blood samples the number of parasites and erythrocytes were determined, haematocrit and
haemoglobin concentration were measured. In addition, osmolality, concentration of the electrolytes
sodium, potassium, calcium, magnesium and phosphorus, total protein concentration and bilirubine,
and activity of alkaline phosphatase were determined in plasma.
In histological preparations of kidney from Trypanoplasma borreli infected carp, substantial
proliferation of the haematopoetic renal interstitial tissue was observed as well as a prominent
degeneration of renal tubules, which finally became atrophic. At day 21 p.i. 50-60% of the
excretorial tissue showed pathological changes and thus 40-50% of the nephrons were still intact.
In urine samples, the osmolality, the content of the sodium and magnesium were increasing strongly
with the development of the parasitaemia. This renal losses might be related to the defects of
87
Summary
epithelial cells in the distal tubules which result in a decreased energy-intensive absorption of sodium
in this part of the tubules. During the development of the infection cell defects are arising in the
proximal tubules as well, which might lead to a decreasing ability of magnesium reabsorption. The
infection showed no influence on the hourly urine flows of the fishes. This might reflect a stage of
pseudonormuria where the filtration rates of defective nephrons were compensated by still intact
nephrons which appear to exist in sufficient quantity.
Despite the enormous losses of sodium and magnesium most of the infected carp kept the plasma
level of osmolality, sodium and magnesium constant. Renal losses of ions were considered to be
compensated by ion uptake at the gills, intestine and by unchanged parts of the kidney. Our data
indicate that carp are able to control plasma osmolality to a large extent.
In the blood of infected carp a high-grade of haemolytic anaemia was found to increase with
parasitaemia. This regenerative anaemia initially was a normochromic, microcytic type, and at the end
of the infection a hyperchromic, microcytic type of anaemia.
It is considered that the extensive anaemia, which results in an oxygen shortage in combination with a
high energy demand for osmoregulatory processes as well as parasite nutrition might be responsible
for mortalities of infected fishes at the end of the infection.
88
Literaturverzeichnis
8 LITERATURVERZEICHNIS
AMLACHER, E (1957):
Der Blutzucker normaler und an Infektiöser Bauchwassersucht erkrankter Karpfen (K 2).
Arch. Fischerwiss. 8, 12-31
AMLACHER, E. (1992):
Taschenbuch der Fischkrankheiten – Grundlagen der Fischpathologie, 6. Aufl..
Verlag Gustav- Fischer, Jena – Stuttgart
BARHAM, W.T., G.L. SMIT u. H.J. SCHOONBEE (1980):
The haematological assessment of bacterial infektion in rainbow trout, Salmo gairdneri Richardson.
J, Fish. Biol. 1, 275-281
BARCKHAUSEN – KIESECKER, I. (1996):
Untersuchungen lymphoider Organe von Karpfen (Cyprinus carpio) im Verlauf parasitärer
Infektionen.
Hannover, Tierärztliche Hochschule, Diss.
BICKHARDT, K. (1992):
Kompendium der Allgemeinen Inneren Medizin und Pathophysiologie für Tierärzte.
Verlag Paul Parey, Berlin und Hamburg
BLACK, M.C. (2000):
Collection of body fluids.
In: G.K. OSTRANDER (ed.): The laboratory fish.
Acadamic Press, London und San Diego, 513-527
BLÜM, V., J. CASADO, J. LEHMANN u. E. MEHRING (1988):
Harnorgane.
In: LANDESANSTALT FÜR FISCHEREI NORDRHEIN-WESTPHALEN (Hrsg.): Farbatlas
der Histologie der Regenbogenforelle.
Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York
BÖTTCHER, K. (1998):
Untersuchungen zu klinisch-chemischen Parametern im Blutplasma von Karpfen (Cyprinus carpio).
Hannover, Tierärztliche Hochschule, Diss
89
Literaturverzeichnis
BOND, C. E. (1979):
Biology of fishes.
Saunders College Publishing, Philadelphia
BONE, Q. u. N.B. MARSHALL, übersetzt von M. NIEHAUS-OSTERLOH (1985):
Biologie der Fische.
Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, New York
BONE, Q., N.B. MARSHALL, J.H.S. BLAXTER (1995):
Biology of fishes, second edition.
Backie Acadamic u. Professional, Glasgow
BUNNAJIRAKUL, S. (1998):
Histopathological observation on the common carp (Cyprinus carpio) infected with the blood
flagellate Trypanoplasma borreli.
Hannover, Tierärztliche Hochschule, Diss.
CHENG, T.C. (1986):
General parasitology, second ed.
Academic Press, Orlando, USA
CHEVILLE, N. F. (1976):
Cell pathology.
Iowa State University Press, Ames
DAVID, J.P., C.A. OSBORNE, J.W. BARTGES, K.M. JAMES, J.A. CHURCHILL (1995):
Chronic renal failure.
In: ETTINGER, S.J. u. E.C. FELDMAN: Textbook of veterinary internal medicine, 4th ed.
W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1734-1759
DOMBROWSKI, H. (1953):
Untersuchungen über das Blut des Karpfens (Cyprinus carpio L.) und einiger anderer
Süßwasserfischarten.
Biol. Zentralbl. 72, 182-195
DYKOVÁ, I. u. J. LOM (1979):
Histopathological changes in Trypanosoma danilewskyi Laveran & Mesnil, 1904 and
Trypanoplasma borreli Laveran & Mesnil, 1902 infections of goldfish, Carassius auratus (L.).
J. Fish Dis., 2, 381-390
90
Literaturverzeichnis
ENGELHARDT, A., C. MIRLE u. K.-G. THIEMANN (1990):
Biochemische Untersuchungen an mit Protocephalus neglectus (Cestoda, Proteocephalidae)
befallenen Regenbogenforellen Oncorhynchus mykiss.
Mh. Vet.-Med. 46, 23-27
EDWARDS, J. G. (1935):
The epithelium of the renal tubule in bony fish.
Anat. Rec. 63, 262-278
ELGER, B. (1982):
Über die Auswirkungen von Salzwasseradaption und Adrenalin auf die renale Ausscheidung von
Wasser und Elektrolyten der Regenbogenforelle, Salmo gaidneri Richardson.
Universtät Hannover, Diplomarbeit im Fach Biologie
ELGER, B., M. NEUKIRCH u. H. HENTSCHEL (1986):
The kidney of rainbow trout, Salmo gaidneri Richardson, in the acute phase of viral haemorrhagic
septicaemia: in vivo experiments on the renal excretion of fluid, electrolytes and protein.
J. Fish Dis. 9, 381-392
ELGER, M. u. H. HENTSCHEL (1981):
The glomerulus of a stenohaline fresh-water teleost, Carassius auratus gibelio, adapted to saline
water.
Cell Tissue Res. 220, 73-85
ELGER, M. u. H. HENTSCHEL (1986):
Cell junctions in the renal tubule of a fresh-water teleost, Salmo gaidneri Richardson
Cell Tissue Res. 244: 395-401
ELGER, M., H. HENTSCHEL, M. DAWSON u. J. L. RENFRO (2000):
Urinary tract.
In: G.K. OSTRANDER: The laboratory fish.
Academic Press, London
ELLIS, A. E. (1989):
The immunology of teleosts.
In: R. J. ROBERTS (Hrsg.): Fish Pathology, second edition.
Baillière Tindall, London, 135-154
91
Literaturverzeichnis
ENDO, M. u. M. KIMURA (1982):
Histological and enzyme histochemical studies on the nephrons of the freshwater fishes, Cyprinus
carpio and Carassius auratus.
J. of Morphology 173, 29-33
EVANS, D. H. (1993):
Osmotic and ionic regulations.
In: EVANS, D. H. (ed.): The physiology of fishes.
CRC Press, Boca Raton, Florida, 315-341
FERGUSON, H. W. (1989):
Systemic pathology of fish. A text and atlas of comparative tissue responses in diseases of teleosts.
Iowa State University Press, Ames
FUCHS, D. A. u. C. ALBERS (1988):
Effect of adrenaline and blood gas conditions on red cell volume and intraerythrocytoc electrolytes in
the carp, Cyprinus carpio.
J. Ep. Biol. 137, 457-477
GRAUER, G. F. u. I. F. LANE (1995):
Acute renal failure.
In: ETTINGER, S. J. u. E. C. FELDMAN: Textbook of veterinary internal medicine, 4th ed.
W. B. Saunders Company, Philadelphia 1720-1733
HACKERT-KORDE, K. (1977):
Histochemische Untersuchungen an der Fischniere.
Anat. Anz. 142, 86-89
HAJDÚ, E. u. I. MATSKÁSI (1984):
In vitro cultivation of Trypanoplasma strains isolated from pike and leech.
Acta Vet. Hungarica 32, 79-81
HAMERS, R. (1994):
Untersuchungen zur Hämatologie und Immunologie des Karpfens (Cyprinus carpio L.) bei
Infektionen durch Blutflagellaten.
Bochum, Fakultät für Biologie, Diss.
HARDER, W. (1975):
Anatomy of Fishes.
Schweizerbart`sche Verlagsbuchhandlung, Stuttgart
92
Literaturverzeichnis
HEATH, A. G. (1995):
Water pollution and fish physiology, second ed.
CRC Press, Boca Raton, Florida
HENRIKSON, C. (1993):
Urinary system.
In: HELLMANN, H. D.: Textbook of veterinary histology, 4th edition.
Lea and Febiger, Philadelphia
HENTSCHEL, H., C. JANNKE, R. KAUNE, M. ELGER (1978):
Untersuchungen über Mucosubstanzen im Harnapparat des Giebels in Verbindung mit Experimenten
zur renalen Osmo- und Ionenregulation.
Verh. Dtsch. Zool. Ges. 71, 283
HENTSCHEL, H. u. R. KAUNE (1977):
Die Niere des Giebels, Carassius auratus gibelio (Bloch, 1782), Transport der Tubuli in vitro.
Zool. Jb. Physiol. 81, 407-421
HENTSCHEL, H. u. M. ELGER (1987):
The distal nephron in the kidney of fishes.
Advances in Anatomy Embryology and Cell Biology Vol. 108
Springer-Verlag, Berlin
HENTSCHEL, H. u. W. MEYER (1980):
Phosphatasen und oxydative Enzyme in der Niere des Giebels (Carassius auratus gibelio Bloch),
mit besonderer Berücksichtigung der Adaptation an Brackwasser.
Z. mikrosk.-anat. Forsch., Leipzig 94, 217-240
HEPHER, B. (1988):
Nutrition of pond fishes.
Cambridge University Press, Cambridge
HICKMAN, C. P. u. B. F. TRUMP (1969):
The kidney.
In: HOAR, W. S. u. D. J. RANDALL (ed.): Fish physiology.
Academic Press, New York, Vol. 1, 91-239
93
Literaturverzeichnis
HILGE, V. (1980):
Longterm observation on blood parameters of adult mirror carp (Cyprinius carpio L.) held in a close
warm water system.
Arch. Fischereiwiss. 31, 41-50
HIRANO, T., D. W. JOHNSON, H. A. BERN u. S. UTIDA (1973):
Studies on water and ion movements in the isolated urinary bladder of selected freshwater, marine
and euryhaline teleosts.
Comp. Biochem. Physiol. 45A, 529-540
JONES, S. R. M., M. PALMEN u. W. B. VAN MUISWINKEL (1993):
Effects of inoculum route and dose on the immune response of common carp, Cyprinus carpio to
the blood parasite, Trypanoplasma borreli.
Vet. Immunol. Immunopathol. 36, 369-378
JONES, S. R. M. u. P. T. K. WOO (1987):
The immune response of rainbow trout, Salmo gairdneri Richardson, to the haemoflagellate,
Cryptobia salmositica Katz, 1951.
J. Fish Dis. 10, 395-402
KAKUTA, I., K. NANBA, K. UEMATSU u. K. MURACHI (1986):
Diurnal variation of urine properties of carp Cyprinus carpio.
Bull. Jap. Soc. Sci. Fish. 53, 2079-2089
KAKUTA, I., K. NAMBA, K. UEMATSU u. S. MURACHI (1992):
Effects of hypoxia on renal function in carp, Cyprinus carpio.
Comp. Biochem. Physiol. 101A, 769-774
KAUNE, R. (1980):
Untersuchungen zur Nierenfunktion und deren Beeinflussung durch Phlorizin, Etacrynsäure und
Acetazolamid an einem stenohalinen Süßwasserteleosteer (Carassius auratus gibelio Bloch) mit
Hilfe von Clearancetechniken.
Hannover, Fakultät für Mathematik und Naturwissenschaften der Universität, Diss.
KEYSSELITZ, G. (1906):
Generations- und Wirtswechsel von Trypanoplasma borreli Laveran & Mesnil.
Arch. Protistenkd. 7, 1-74
94
Literaturverzeichnis
KITT, T. (1982):
Lehrbuch der Allgemeinen Pathologie für Tierärzte und Studierende der Tiermedizin, 9. Auflage
Enke-Verlag, Stuttgart
KLONTZ, G. W. u. L. S. SMITH (1968):
Methods of using fish as biological research subjects.
In: GAY, W.I.: Methods of animal experimentation Vol. 3.
Academic Press, New York.
KÖRTING, W. (2000):
Parasitosen der Süßwassernutzfische.
In: ROMMEL, M., J. ECKERT, E. KUTZER, W. KÖRTING u. T. SCHNIEDER, begründet von
BOCH, J. u. R. SUPPERER: Veterinärmedizinische Parasitologie, 5. Aufl.
Verlag Paul Parey, Berlin, 801-854
KRAFT, H. (1989) unter Mitarbeit von D. SCHILLINGER:
Klinische Labormethoden der Veterinärmedizin bei Haussäugetieren, 3. Aufl.
F. Enke Verlag, Stuttgart
KRUSE, P. u. D. STEINHAGEN (1988):
Morphogenese von Trypanoplasma borreli Laveran & Mesnil, 1901 (Mastigophora:
Kinetoplastida) in Cyprinus carpio L..
Verh. Dtsch. Zool. Ges. 81, 274
KRUSE, P., D. STEINHAGEN, W. KÖRTING u. K. T. FRIEDHOFF (1989):
Morphometrics and redescription of Trypanoplasma borreli Laveran & Mesnil, 1901
(Mastigophora, Kinetoplastida) from experimentally infected common carp (Cyprinus carpio L.).
J. Protozool. 36 (4), 408-411
KRUSE, P., D. STEINHAGEN u. W. KÖRTING (1991):
The division process of Trypanoplasma borreli Laveran & Mesnil 1901 (Mastigophora,
Kinetoplastida) in experimentally infected common carp (Cyprinus carpio L.).
Arch. Protistenkd 140, 349-352
LAVERAN, A. u. F. MESNIL (1901):
Sur les flagllés à membran ondulate des poissons (genre Trypanosoma Gruby et Trypanoplasma n.
gen.).
C. R. Hebdo. Acad. Sci. 133, 670-675
95
Literaturverzeichnis
LEHMANN, J. (1991):
Der Körperbau der wichtigsten mitteleuropäischen Süßwasserfische – Ein Leitfaden 2. Aufl.
Landesanstalt für Fischerei Nordrhein-Westfalen, Kirchhundem-Albaum
LIEBICH, H.-G. (1990):
Funktionelle Histologie – Farbatlas und Kurzlehrbuch der mikroskopischen Anatomie der
Haussäugetiere.
Verlag Schattauer, Stuttgart - New York
LOM, J. (1973):
Experimental infections of goldfish with blood flagellates.
Prog. Protozool., Proc. Int. Cong. Protozool. 4th, Abstract 255
LOM, J. (1979):
Biology of the trypanosomes and trypanoplasms of fish.
In: W. H. R. Lumsden u. D. A. Evans (eds.): Biology of the Kinetoplastida.
Academic Press, London, 270-328
LOM, J. u. I. DYKOVÁ (1992):
Protozoan parasites of fishes.
Developments in Aquaculture and Fisheries Science Vol. 26, 53-64
Elsevier, Amsterdam, London
LOM, J., I. DYKOVÁ u. B. MACHÁCKOVÁ (1986):
Experimental evidence of pathogenicity of Trypanoplasma borreli and Trypanosoma danilewsky
for carp fingerling.
Bull. Eur. Ass. Fish Pathol. 6, 87-88
MC DONALD, D. G. u. C. L. MILLIGAN (1992):
Chemical properties of the blood.
In: HOAR, W. S., D. J. RANDALL u. A. P. FARRELL (Hrsg.):
Fish physiology, Part B, The cardiovascular system.
Academic Press, San Diego, USA
MACHNER, H.-U. (1986):
Licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen an der Niere der Goldorfe (Leuciscus idus,
L.).
Tierärztliche Fakultät der Universität München, Dissertation
96
Literaturverzeichnis
MANNING, M. J. (1994):
Fishes.
In: R. J. TURNER (ed.): Immumology – A Comparative Approach.
John Wiley & Sons Ltd. Chichester, London, 69-100
MATSÁKI, I. u. E. HAJDÚ (1990):
Electron microscopy studies on in vitro stages of Trypanoplasma borreli Laveran & Mesnil, 1901.
Parasit. Hung. 23, 5-12
MAVOR, J. W. (1915):
On the occurence of a trypanoplasm, probably Trypanoplasma borreli Laveran et Mesnil, in the
blood of the common sucker, Catostomus commersonil.
J. Parasit. 2 (1), 1-7
MEHLHORN (1988):
Parasitology in Focus.
Springer Verlag, Berlin
MILDE, K. (1982):
Licht- und elektronenmikroskopische Untersuchungen an Entwicklungsstadien von Trypanoplasma
borreli Laveran & Mesnil in Süsswasserfischen und im Überträgeregel Piscicola geometra L..
Düsseldorf, Univ., Math.-nat. Fak., Diss
MOSIMANN, W. u. T. KOHLER (1990):
Zytologie, Histologie und mikroskopische Anatomie der Haussäugetiere.
Verlag Paul Parey, Berlin, Hamburg
NELLEN, W. (1983):
Fischzucht im Meer und in Teichen.
Umschau 3, 91-95
NERESHEIMER, E. (1912):
Die Gattung der Trypanoplasma.
In: VON PROWAZEK, S. (Hrsg.): Handbuch der pathogenen Protozoen, Bd. 1.
Leipzig, S. 101-117
NOGA, E. J. (1995):
Fish Disease.
Verlag Mosby, St. Louis
97
Literaturverzeichnis
OESTERREICH, B. (1996):
Goussia carpelli-Kokzidiose des Karpfens – Hämatologische Untersuchungen -.
Hannover, Tierärztliche Hochschule, Diss.
OGAWA, M. (1961):
Comparative study of the external shape of the teleostean kidney with relation to phylogeny.
Sci. Rept. Tokyo Kyoiku Daigaku B 10, 61-68
OLLENSCHLÄGER, B. (1975):
Blutparasiten bei Nutzfischen und ihre Übertragung.
Tierarzt. Prax. 3, 99-107
PECKOVÁ, H. u. J. LOM (1990):
Growth, morphology and division of flagellates of the genus Trypanoplasma (Protozoa,
Kinetoplastida) in vitro.
Parasitol. Res. 76, 553-558
PLEHN, M. (1924):
Die Niere: Parasiten der Niere, Amöbeninfektion.
In: Praktikum der Fischkrankheiten
Schweizerbart`sche Verlagsbuchhandlung, Stuttgart, 421-424
REICHENBACH – KLINKE, H.-H. (1980):
Krankheiten und Schädigungen der Fische 2. Aufl.
Verlag Gustav - Fischer, Stuttgart, New York
REICHLE, G. (1959):
Die makroskopische und mikroskopische Anatomie der Niere des Karpfens (Cyprinus carpio).
Zeitschr. für Fischerei u. deren Hilfswissenschaften 8, 295-350
ROBERTS, R. J. (1989):
Fish pathology, second edition.
Bailliere Tindall, London
ROBERTS, R. J. u. H. J. SCHLOTFELDT (1985):
Grundlagen der Fischpathologie.
Verlag Parey, Berlin, Hamburg
98
Literaturverzeichnis
ROMEIS, B. (1989):
Mikroskopische Technik, 17. Aufl..
Verlag Urban und Schwarzenberg, München
ROMER, A. S. u. T. S. PARSONS (1983):
Vergleichende Anatomie der Wirbeltiere, 5. Aufl..
Verlag Paul Parey, Berlin, Hamburg
SAKAI, T. (1985):
The structure of the kidney from the freshwater teleost Carassius auratus.
Anat. Embryol. 171, 31-39
SCHÄPERCLAUS, W. (1990):
Fischkrankheiten, 5. Aufl..
Akademie –Verlag, Berlin
SCHÄPERCLAUS, W u. M. LUKOWICZ (Hrsg.) (1998):
Lehrbuch der Teichwirtschaft, 4. Auflage.
Pareys Buchverlag, Berlin
SCHMIDT-NIELSEN, K. (1990):
Animal physiology: adaption and environment, 4th ed.
Cambridge University Press
SCHULZ, D. (1976):
Beitrag zur Kenntnis der postmortalen Veränderungen und der anatomisch-histologischen Struktur
einiger Organe der Karpfen.
Zenralblatt für Veterinärmedizin Reihe A 23(1), 54-84
SCHRECKENBACH, K. u. R. SPANGENBERG (1987):
Die Leistungs- und Belastungsfähigkeit von Karpfen (Cyprinus carpio) in Abhängigkeit von ihrer
energetischen Ernährung.
Fortschr. Fischereiwiss. 5/6, 49-67
SCHEINERT, P. u. R. HOFFMANN (1987):
Qualitative und quantitative Verteilung von sieben Enzymen in Organen der Regenbogenforelle
(Salmo gaidneri R.) und des Karpfens (Cyprinus carpio).
J. Vet. Med. A, 34, 339-334
99
Literaturverzeichnis
SMITH, A. M., N. A. WIVEL u. M. POTTER (1979):
Plasmacytopoesis in the pronephros of carp (Cyprinus carpio).
Anat. Rec. 167, 351-370
STEINHAGEN, D. (1985):
Untersuchungen zum Infektionsverlauf von Trypanoplasma borreli Laveran & Mesnil, 1901 im
Karpfen Cyprinus carpio L., 1758 und die Auswirkungen der Infektion auf den Wirtsorganismus.
Hannover, Univ., Fachber. Biologie, Diss.
STEINHAGEN, D. u. P. KRUSE (1988):
Temperatureinfluß auf das Parasit-Wirt-Verhältnis von Trypanoplasma borreli Laveran & Mesnil,
1901 und Cyprinus carpio.
Verh. Dtsch. Zool. Ges. 81, 276-277
STEINHAGEN, D., P. KRUSE u. W. KÖRTING (1989 a):
The parasitemia of cloned Trypanoplasma borreli Laveran & Mesnil, 1901 in laboratory infected
carp (Cyprinus carpio).
J. Parasitol. 75, 685-689
STEINHAGEN, D., P. KRUSE u. W. KÖRTING (1989 b):
Effects of immunosuppressive agents on common carp infected with the haemoflagellate
Trypanoplasma borreli.
Dis. Aquat. Org. 7, 67-69
STEINHAGEN, D., P. KRUSE u. W. KÖRTING (1990):
Some haematological observations on carp, Cyprinus carpio L., experimentally infected with
Trypanoplasma borreli Laveran & Mesnil, 1901 (Protozoa: Kinetoplastida).
J. Fish Dis. 13, 157-162
STOSKOPF, M. K. (1993):
Fish Medicine.
WB. Saunders Comp., Philadelphia, London
SUTER, P. F. (1994):
Harnapparat
In: NIEMAND, H.G.u. P.S. SUTER (Hrsg.):
Praktikum der Hundeklinik, 4. Aufl..
Blackwell Wissenschafts-Verlag, Berlin, 569-598
100
Literaturverzeichnis
TAKASHIMA, F. u. T. HIBIYA (1995):
An Atlas of Fish Histology, 2nd ed.
Kodansha Ltd., Tokyo
THOMAS, P. T., u. P. T. K. WOO (1989):
Cryptobia salmositica: an in vitro and in vivo study on the mechanismen of anaemia in infected
rainbow trout, Salmo gaidneri R..
J. Fish Dis. 11, 425-431
TRAUTWEIN, G. (1991):
Harnorgane.
In: SCHULZ, L.-C. (Hrsg.): Pathologie der Haustiere, Teil I: Organveränderungen, 1. Aufl.
Gustav Fischer Verlag, Jena, 517-575
URICH, K. (1990):
Vergleichende Biochemie der Tiere.
Fischer Verlag, Stuttgart, New York
VALENTIN, G. (1841):
Ueber ein Entozoon im Blute von Salmo fario.
Arch. Anat. Physiol. 5, 435-436
VAN DEN BROEK, A. (1992):
How does carp counter a hemoflagellate infection? Immunological observations on the host/parasite
model.
Studienarbeit, Department of Experimental Animal Morphology and Cell Biology, Agricultural
University Wageningen, The Netherlands
VON SANDERSLEBEN, J. (1989):
Harnorgane.
In: VON SANDERSLEBEN, J., K. DÄMMERICH u. E. DAHME (Hrsg.): Pathologische
Histologie der Haustiere.
Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, New York, 204-232
WEDEMEYER, G.A. (1996):
Physiology of fish in intensive cultur systems.
International Thomson Publishing, Florence (KY)
101
Literaturverzeichnis
WEISS, E. (1988):
Harnorgane.
In: DAHME, E. u. E. WEISS (Hrsg.): Grundriß der speziellen pathologischen Anatomie der
Haustiere, 4. Aufl..
Enke, Stuttgart, 236-269
WIEGERTJES, G. F., A. GROENEVELD u. W. B. VAN MUISWINKEL (1995):
Genetic variation in susceptibility to Trypanoplasma borreli infection in common carp (Cyprinus
carpio L.).
Vet. Immunol. Immunopath. 47, 153-161
WOO, P. T. K. (1981):
Acquired immunity against Trypanosoma danilewskyi in goldfish Carassius auratus.
Parasitology 83, 343-346
WOO, P. T. K. (1987):
Cryptobia and cryptobiosis in fishes.
Adv. Parasitol. 26, 199-239
WOO, P. T. K. and S. L. POYNTON (1995):
Diplomonadida, Kinetoplastida and Amoebida (Phylum Sarcomastigophora).
In: P. T. K. WOO (ed.): Fish Diseases and Disorders Vol. 1.
CAB INTERNATIONAL, Wallingford, 27-96
102
Danksagung
Zum Abschluß möchte ich allen danken, die mich bei der Anfertigung dieser Arbeit
unterstützt haben.
Herrn Prof. Dr. W. Körting möchte ich meinen Dank für die Überlassung des Themas und die
freundschaftliche Betreuung während der Anfertigung der Arbeit aussprechen.
Herrn Prof. Dr. D. Steinhagen gilt mein ganz besonderer Dank für die stets gewährte Hilfe
und geduldige Diskussionsbereitschaft, sowie wertvollen wissenschaftlichen Anregungen und
geleisteten Korrekturarbeiten.
Herrn Prof. Dr. M. Ganter danke ich sehr für die Ermöglichung der klinisch-chemischen
Analysen in der Klinik für kleine Klauentiere und für die engagierte Beratung bei der
Interpretation der Befunde.
Mein herzlicher Dank gilt auch Frau B. Schwert für die Durchführung von Analysen in Urin-,
Plasma- und Wasserproben und die Anregungen sowie Auskünfte zur Labormethodik.
Vielmals danken möchte ich auch Frau B. Luckhardt sowie Frau M. Borchardt, die mir bei
der Bearbeitung der histologischen Proben halfen.
Den Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Fachgebietes für Fischkrankheiten und
Fischhaltung danke ich für das freundschaftliche Arbeitsklima, für die immer vorhandene
Bereitschaft zum Zuhören und Rat geben und für die Unterstützung bei der Versorgung der
Versuchskarpfen.
Meinen Freunden, meiner Familie und besonders H. Hillmann-Apmann möchte ich für
Verständnis,
moralische
Unterstützung,
Korrekturtätigkeiten
und
Hilfe
in
Computerangelegenheiten sehr danken.