Molekulare Prädiktoren für die Rezidivrate von kolorektalen
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Aus der Medizinischen Klinik im Knappschaftskrankenhauses Bochum-Langendreer -Universitätsklinikder Ruhr-Universität Bochum Direktor: Prof. Dr. med. W. Schmiegel Molekulare Prädiktoren für die Rezidivrate von kolorektalen Adenomen Eine immunhistochemische Untersuchung von ß-Catenin, Cox-2 und p53 bezüglich der Rezidivwahrscheinlichkeit von kolorektalen Adenomen Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Linda Brand aus Münster 2010 Dekan: Prof. Dr. med. Gert Muhr 1. Referentin: PD Dr. A. Reinacher-Schick Koreferent: Prof. Dr. A. Tannapfel Tag der mündlichen Prüfung: 09.11.2010 Abstract Brand Linda Titel: Molekulare Prädiktoren für die Rezidivrate von kolorektalen Adenomen Problem: Jährlich erkranken in Deutschland etwa 70.000 Menschen an einem kolorektalen Karzinom. Damit stellt es die zweithäufigste krebsbedingte Todesursache dar. Besonders fortgeschrittene Adenome, also solche, die größer als 1cm sind, hochgradige intraepitheliale Neoplasien oder villöse Anteile aufweisen, haben ein deutlich erhöhtes Entartungsrisiko. Die Koloskopie hat einen hohen Stellenwert in der Früherkennung von Adenomen und Karzinomen, doch aufgrund häufiger Kontrolluntersuchungen bei Adenomträgern wird ein enormer Teil der Untersuchungsressourcen beansprucht. Da die bisher bekannten klinischen und histologischen Parameter eine Aussage zur Rezidivwahrscheinlichkeit nur unzureichend zulassen, ergibt sich die Frage, ob sich Prädiktoren wie p53, ß-Catenin oder Cox2 für ein Adenomrezidiv von fortgeschrittenen Adenomen finden lassen. Methode: Von 109 Patienten, die an einer Chemopräventionsstudie - der 5-ASA Polyp Prevention Study (GAPPS) (Schmiegel, DDW 2005) - teilgenommen haben, wurde das am weitesten fortgeschrittene Adenom immunhistochemisch mit Antikörpern gegen p53, ß-Catenin und Cox2 untersucht. Vor allem von Patienten mit drei oder mehr Adenomen lagen vollständige Datensätze vor. Die Färbeeigenschaften wurden semiquantitativ ausgewertet. (Intensität, Lokalisation, Anteil). Die klinische und histologischen Parameter sowie die Rezidivrate nach 3 Jahren mit den Färbeeigenschaften korreliert. Ergebnisse: Die untersuchten Adenome stammen von 78 männlichen und 31 weiblichen Patienten, die im Durchschnitt 61,4 Jahre alt waren. Im Mittel wurden 2,39 Adenome pro Patient gefunden. Eine nukleäre Überexpression für p53 in über 50 Prozent der Zellen des Adenoms fand sich in 45 Prozent der Fälle. Für ß-Catenin konnte eine nukleäre Lokalisation (>4%) in 48,6 Prozent der Adenome nachgewiesen werden. Ein verstärke Anfärbung mit Cox2 konnte in 47,7 Prozent des untersuchten Materials beoachtet werden. Es bestand eine signifikante Korrelation zwischen der Anzahl Adenome und der Rezidivhäufigkeit (p=0,003). Weiterhin zeigte sich für die Adenome mit gehäuft p53 positiver nukleärer Färbung ein signifikant häufigeres Auftreten von Rezidiven (p= 0,00). Für die Auswertung der ß-Catenin Färbung ergaben sich folgende signifikante Ergebnisse: Ein Rezidiv tratt gehäuft in der Gruppe mit nukleärer Färbung auf. In dieser Gruppe hatten 39 (65,0%) nach drei Jahren erneut ein Adenom wohingegen 21 (35 %) kein Rezidiv aufwiesen (p=0,002). In der Gruppe mit der stärkeren zytoplasmatischen Anfärbung für Cox2 wurden signifikant mehr Rezidive in der Nachuntersuchung gefunden: 35 (67,3 %) Patienten mit erneutem Adenom im Vergleich zu 17 (32,7%) der Patienten ohne Adenomnachweis (p=0,001). In der Multivariatanalyse für alle drei untersuchten Färbeparameter ergab sich eine Spezifität von 94,6 Prozent bei drei positiven Parametern mit einer Sensitiviät von 43,4 Prozent. Der positive prädiktive Wert beträgt 63,8 Prozent, der negative prädiktive Wert 88,5 Prozent. Diskussion: In diesem Kollektiv von untersuchten fortgeschrittenen Adenomen, korrelieren die Expression bestimmter Tumorsuppressorproteine und Onkoproteine hochsignifikant mit der Rezidivhäufigkeit der Adenome. Möglicherweise könnten die Parameter ß-Catenin, p53 und COX-2 zukünftige eine zusätzliche Entscheidungshilfe in der Nachsorge von fortgeschrittenen kolorektalen Adenomen darstellen. Eine prospektive Validierung dieser Parameter, um den besten Zeitpunkt für eine Nachsorgekoloskopie festlegen zu können, erscheint sinnvoll. INHALTSVERZEICHNIS 1 Einleitung ........................................................................................... 14 1.1 Das kolorektale Karzinom .................................................................... 14 1.1.1 Inzidenz und Prävalenz ........................................................... 14 1.1.2 Risikofaktoren ......................................................................... 14 1.1.3 Einteilung des kolorektalen Karzinoms ................................... 14 1.2 Molekulare Grundlagen der Adenom-Karzinom-Sequenz ................... 15 1.3 Die Rolle des Wnt/beta-Catenin-Signalwegs bei der Entstehung des kolorektalen Karzinoms ................................................................. 18 1.4 Die Rolle der Cyclooxygenase-2 in der Tumorentstehung................... 20 1.5 Die Rolle von p53 in der Tumorentstehung ......................................... 20 1.6 Expression von ß-Catenin, Cox-2 und p53 in normaler Schleimhaut und in Adenomen ............................................................ 21 1.7 1.6.1 ß-Catenin ................................................................................ 21 1.6.2 Cox-2 ...................................................................................... 22 1.6.3 P53.......................................................................................... 22 Die Histopathologie des Kolonadenoms und seine Bedeutung für die Entstehung des Kolonkarzinoms .............................................. 22 1.7.1 Histologie ................................................................................ 23 1.7.2 Größe ...................................................................................... 23 1.7.3 Anzahl ..................................................................................... 23 1.7.4 Lokalisation ............................................................................. 23 1.7.5 Einteilung der Adenome in verschiedene Risikogruppen ........ 24 1.8 Weitere Risikofakoren für ein Adenomrezidiv ...................................... 24 1.9 Chemoprävention und GAPP-Studie ................................................... 25 1.10 Die Rolle von Vorsorgekoloskopien für die Prävention des kolorektalen Karzinoms ....................................................................... 25 1.11 Kriterien für die Durchführung der Vorsorgekoloskopien in Deutschland ......................................................................................... 26 4 1.12 Wirtschaftliche Folgen des derzeitigen Polypenmanagements in Deutschland – Unnötige Rekoloskopie gilt es zu vermeiden ............... 27 1.13 Etablierte Risikofaktoren für Adenomrezidive ...................................... 28 2 Ziel der Arbeit..................................................................................... 29 3 Material und Methoden ...................................................................... 30 3.1 Materialien ........................................................................................... 30 3.2 3.1.1 Herkunft der Polypen – GAPP-Studie ..................................... 30 3.1.2 Gewebeproben ....................................................................... 31 3.1.3 Antikörper................................................................................ 31 3.1.4 Puffer und Lösungen ............................................................... 32 3.1.5 Farbstoffe ................................................................................ 32 3.1.6 Verbrauchsmaterialien ............................................................ 33 3.1.7 Geräte ..................................................................................... 33 3.1.8 Computerprogramme .............................................................. 34 Methoden............................................................................................. 34 3.2.1 Ethikkommisson ...................................................................... 34 3.2.2 Materialbeschaffung ................................................................ 34 3.2.3 Patientenauswahl für die Gewebeuntersuchung ..................... 34 3.2.4 Mikrotomie .............................................................................. 34 3.2.5 Histologische Färbung ............................................................ 35 3.2.6 Auswahl der Adenome für die Berechnung der Rezidivwahrscheinlichkeit ....................................................... 36 3.2.7 Immunhistochemische Färbung .............................................. 36 3.2.8 Bewertung der Färbeeigenschaften ........................................ 39 3.2.9 Statistische Methoden ............................................................. 42 4 Ergebnisse ......................................................................................... 47 4.1 Materialsichtung................................................................................... 47 4.2 Klassifikation der Adenome ................................................................. 47 4.3 Charakteristika des untersuchten Patientenkollektivs .......................... 47 4.4 Charakteristika der untersuchten Adenome ......................................... 48 5 4.5 Zusammenhang zwischen dem Färbeverhalten der untersuchten Adenome und ihren Eigenschaften ................................ 49 4.6 4.5.1 ß-Catenin-Färbung .................................................................. 49 4.5.2 Cox-2-Färbung ........................................................................ 51 4.5.3 p53-Färbung ........................................................................... 52 Demographische, klinische und pathologische Parameter mit Bezug zur Rezidivhäufigkeit - Etablierte Rezidivmarker ...................... 53 4.7 4.6.1 Alter......................................................................................... 53 4.6.2 Geschlecht .............................................................................. 53 4.6.3 Medikation............................................................................... 54 4.6.4 Morphologie der Adenome ...................................................... 54 4.6.5 Anzahl der Adenome............................................................... 54 Zusammenhang zwischen der ß-Catenin-Expression und der Art des Adenoms ................................................................................. 55 4.8 Zusammenhang zwischen der Cox-2-Expression un der Art des Adenoms ............................................................................................. 57 4.9 Zusammenhang zwischen der p53-Expression und der Art des Adenoms ............................................................................................. 59 4.10 Zusammenfassung für ß-Catenin, Cox-2 und p53 in Bezug zur Art des Adenoms ................................................................................. 61 4.11 Zusammenhang zwischen Rezidivhäufigkeit und ßCateninexpression ............................................................................... 61 4.12 Zusammenhang zwischen Rezidivhäufigkeit und Cox-2 Expression ........................................................................................... 63 4.13 Zusammenhang zwischen Rezidivhäufigkeit und p53 Expression ........................................................................................... 65 4.14 Zusammenfassung der Färbeeigenschaften in Bezug zur Rezidivhäufigkeit.................................................................................. 67 5 Diskussion ......................................................................................... 69 5.1 Ausgewähltes Patientenkollektiv und Studienmaterial ......................... 69 5.2 Medikation ........................................................................................... 71 6 5.3 Die Bedeutung der unterschiedliche Gruppeneinteilungen für ßCatenin und p53 .................................................................................. 71 5.4 Bewertung der Ergebnisse bezüglich eines Zusammenhanges zwischen Rezidivhäufigkeit und Färbeverhalten von ß-Catenin, p53 und Cox-2 ..................................................................................... 72 5.5 5.4.1 ß-Catenin ................................................................................ 72 5.4.2 Cox-2 ...................................................................................... 72 5.4.3 p53 .......................................................................................... 72 5.4.4 Multivariate Betrachtung aller drei Parameter ......................... 73 Ein Vergleich zwischen konventionellen Adenomcharakteristika und den neuen Parametern ................................................................. 73 5.6 Qualität der untersuchten Parameter ß-Catenin, Cox-2 und p53 bezüglicher ihrer Relevanz .................................................................. 74 5.7 Die Bedeutung der Ergebnisse für einen möglichen klinischen Alltag der Kolonkarzinomvorsorge ....................................................... 74 5.8 Mögliche gesundheitsökonomische Vorteile ........................................ 75 5.9 Ausblick ............................................................................................... 76 6 Zusammenfassung ............................................................................ 77 Literaturverzeichnis ....................................................................................... 78 Danksagung .................................................................................................... 86 Lebenslauf ...................................................................................................... 87 7 Abkürzungsverzeichnis 5-ASA 5-Aminosalicylsäure ACF aberrante Kryptenfoci AK Antikörper APC Adenomatous Polyposis Coli Bcl-2 B-cell lymphoma-2 Cox-2 Cyclooxygenase 2 DCC Deleted in Colorectal Cancer DPC4 Deleted in Pancreatic Cancer 4 EDTA Ethylendiamintetraacetat FAP Familiäre Adenomatosis Polyposis FGF Fibroblast Growth Factor GAPPS German 5-ASA Polyp Prevention Study GSK Glykogen Synthase Kinase GTP Guanosintriphosphat HGIEN Hochgradige Intraepitheliale Neoplasie HMG 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl HNPCC Hereditäres nicht polypöses kolorektales Karzinom IGF Insulin like Growth Factor KRK Kolorektales Karzinom LDLR Low-Density Lipoprotein Receptor LEF Lymphoid Encance Factor LRP LDLR-Related Protein LSAB Labelled-Streptavidin-Biotin NGF Nerve Growth Factor NGIEN Niedriggradige intraepitheliale Neoplasie NSAR Nicht Steroidale Antirheumatika p Wahrscheinlichkeit für einen Zufallsbefund / Irrtumswahrscheinlichkeit ROC Receiver Operating Characteristic (Analysis) TBS TCF Binding Site TCF T-Cell transcription Factor TGF Transforming Growth Factor 8 TNM T: Tumor; N: Nodes (Lymphknoten); M: Metastasen Wnt Zusammensetzung aus Wg für wingless und Int1 9 Tabellenverzeichnis Tabelle 1: TNM-Klassifikation für das KRK....................................................... 15 Tabelle 2: Verwendete primäre Antikörper ....................................................... 31 Tabelle 3: Verwendete sekundäre Antikörper................................................... 32 Tabelle 4: Puffer und Lösungen ....................................................................... 32 Tabelle 5: Verwendete Farbstoffe .................................................................... 32 Tabelle 6: Verwendete Verbrauchsmaterialien ................................................. 33 Tabelle 7: Verwendete Geräte.......................................................................... 33 Tabelle 8: Verwendete Computerprogramme................................................... 34 Tabelle 9: Berechnung für Gruppeneinteilung ß-Catenin ................................. 40 Tabelle 10: Adenomhäufigkeiten ...................................................................... 48 Tabelle 11: Histologische Klassifikation der Adenome ..................................... 49 Tabelle 12: Zusammenfassende Einteilung der Adenome ............................... 49 Tabelle 13: Verteilung ß-Catenin zytoplasmatische Färbung (Gruppe II) ......... 50 Tabelle 14: Verteilung ß-Catenin starke zytoplasmatische und nukleäre Färbung .................................................................................... 50 Tabelle 15: Verteilung Gruppe II Cox-2-Färbung.............................................. 52 Tabelle 16: Verteilung p53 unter 50 Prozent Färbung (Gruppe II).................... 53 Tabelle 17: Verteilung p53 über 50 Prozent nukleäre Färbung (Gruppe III) ..... 53 Tabelle 18: Anzahl der Adenome bei der ersten Untersuchung und Rezidivhäufigkeit....................................................................... 55 10 Tabelle 19: Zusammenfassung der einzelnen Parameter und ihr Bezug zur Rezidivhäufigkeit................................................................. 55 Tabelle 20: Zusammenfassung des Färbeverhaltens aller drei Parameter in Bezug zum villösen Anteil eines Adenoms ........................... 61 Tabelle 21: Zusammenfassung des Färbeverhalten aller drei Parameter in Bezug zur Größe des Adenoms................................................ 61 Tabelle 22: ß-Catenin Färbung und Rezidivhäufigkeit (3 Gruppen) ................. 62 Tabelle 23: ß-Catenin Färbung und Rezidivhäufigkeit (2 Gruppen) ................. 62 Tabelle 24: Rezidivhäufigkeit und Cox-2 Expression ....................................... 63 Tabelle 25: Cox-2 Sensitivität und Spezifität .................................................... 64 Tabelle 26: p53 Expression und Rezidivhäufigkeit ........................................... 65 Tabelle 27: Grenzwert p53 bei 40 Prozent und Rezidivwahrscheinlichkeit ...... 66 Tabelle 28: Sensitivität und Spezifität für p53................................................... 66 Tabelle 29: Zusammenfassung der Färbeeigenschaften in Bezug zur Rezidivhäufigkeit....................................................................... 67 Tabelle 30: Multivariate Betrachtung der Parameter in Bezug zur Rezidivhäufigkeit....................................................................... 68 11 Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Die klassische Adenom-Karzinom-Sequenz ................................ 16 Abbildung 2: Wnt-Signalweg ............................................................................ 19 Abbildung 3: Verteilung des Probenmaterials aus dem Patientenkollektiv ....... 30 Abbildung 4: LSAB-Methode ............................................................................ 38 Abbildung 5: ß-Cateninfärbung......................................................................... 40 Abbildung 6: Cox-2-Färbung ............................................................................ 41 Abbildung 7: p53-Färbung ................................................................................ 42 Abbildung 8: Häufigkeitsverteilung ß-Catenin 2 Gruppen ................................. 50 Abbildung 9: Häufigkeitsverteilung Produkt Cox-2 ........................................... 51 Abbildung 10: Verteilung nukleäre Färbung p53 .............................................. 52 Abbildung 11: Zusammenhang zwischen fortgeschrittenen Adenomen und Färbeeigenschaften mit ß-Catenin............................................ 56 Abbildung 12: Zusammenhang zwischen Größe und Färbeeigenschaften mit ß-Catenin ............................................................................ 57 Abbildung 13: Zusammenhang zwischen ß-Catenin Färbung und villösem Anteil der Adenome .................................................................. 57 Abbildung 14: Zusammenhang zwischen Cox-2-Expression und einem fortgeschrittenem Adenom ........................................................ 58 Abbildung 15: Zusammenhang zwischen Cox-2-Expression und der Größe des Adenoms ............................................................................ 58 Abbildung 16: Zusammenhang zwischen Cox-2-Expression und dem villösem Anteil des Adenoms .................................................... 58 12 Abbildung 17: Zusammenhang zwischen p53-Expression und einem fortgeschrittenen Adenomen ..................................................... 59 Abbildung 18: Zusammenhang zwischen p53-Expression und Größe des Adenoms .................................................................................. 60 Abbildung 19: Zusammenhang zwischen p53-Expression und villösen Anteilen des Adenoms .............................................................. 60 Abbildung 20: Zusammenhang zwischen Rezidivhäufigkeit und Cox-2Expression ................................................................................ 63 Abbildung 21: ROC-Kurve für Cox-2-Färbung .................................................. 64 Abbildung 22: ROC-Kurve p53-Färbung .......................................................... 67 Abbildung 23: Rezidivhäufigkeit bezüglich der drei Parameter ß-Catenin, Cox-2 und p53 .......................................................................... 68 13 1 Einleitung 1.1 Das kolorektale Karzinom 1.1.1 Inzidenz und Prävalenz Das kolorektale Karzinom (KRK) gehört in Deutschland zu den häufigsten Krebserkrankungen. Bei Männern liegt es bei der Inzidenz an dritter Stelle aller bösartigen Tumore nach dem Prostata- und dem Bronchialkarzinom, bei Frauen nach dem Mammakarzinom an zweiter Stelle. Für beide Geschlechter ist es die zweithäufigste krebsbedingte Todesursache. Im Jahr 2004 erkrankten ca. 72.000 Menschen in Deutschland an einem kolorektalen Karzinom [65]. Das Erkrankungsalter liegt bei Männern im Mittel bei 69 Jahren und bei Frauen bei 75 Jahren. Die Fünfjahresüberlebensrate liegt derzeit bei ca. 56 Prozent [7], wobei sie am stärksten durch das Tumorstadium bei Diagnosestellung beeinflusst wird [22]. 1.1.2 Risikofaktoren In über 75 Prozent der Fälle tritt das KRK sporadisch auf. Bei etwa 15 bis 20 Prozent findet sich eine familiäre Häufung ohne nachweisbare genetische Veränderung. Darüber hinaus bestehen einerseits genetische Prädispositionen wie die familiäre adenomatöse Polyposis (FAP) und das hereditäre nicht polypöse kolorektale Karzinom (HNPCC). Als weitere Risikofaktoren konnten die chronisch entzündlichen Darmerkrankungen wie die Colitis ulcerosa gefunden werden. Nicht zu vernachlässigen ist außerdem der Lebensstil, denn Übergewicht, mangelnde Bewegung, häufiger Verzehr von rotem Fleisch und eine ballaststoffarme Ernährung, sowie Rauchen und übermäßiger Alkoholkonsum gehen mit einem erhöhten KRK-Risiko einher [7]. 1.1.3 Einteilung des kolorektalen Karzinoms Bei einem Großteil der kolorektalen Karzinome handelt es sich um Adenokarzinome unterschieden (>95%). werden: Außerdem können Siegelringzellkarzinom weitere, (1%), seltenere Typen adenosquamöses Karzinom, kleinzelliges Karzinom und undifferenziertes Karzinom. Sie lassen sich weiterhin in gut differenziert (G1), mäßig differenziert (G2), schlecht (G3) und undifferenziert (G4) einteilen. 60 Prozent der kolorektalen Karzinome 14 befinden sich im Rektum und im Kolon sigmoideum. Für das KRK gilt folgende TNM-Klassifikation [19]: Tabelle 1: TNM-Klassifikation für das KRK T1 Infiltration der Tela submucosa T2 Infiltration der Tunica muscularis T3 Infiltration der Subserosa oder in nicht peritonialisiertes perikolisches/perirektales Gewebe T4 Infiltration von Nachbarorganen oder des Peritoneums viscerale N1 Metastasen in ein bis drei perikolischen (perirektalen) Lymphknoten N2 Metastasen in mehr als drei perikolischen (perirektalen) Lymphknoten N3 Metastasen entlang eines benannten Gefäßstamms und/oder apikale Lymphknotenmetastasen M1 Fernmetastasen (meist Leber und Lymphknoten gefolgt von Peritoneum, Lunge, seltener Skelett, Nebennieren oder Gehirn) Die Prognose hängt weitgehend von der Tumorausbreitung zum Zeitpunkt der Diagnose ab, denn je nach Ausdehnung des Primärtumors sind Metastasen mehr oder weniger wahrscheinlich. So finden sich im Stadium T1 in nur vier Prozent der Fälle Metastasen, im Stadium T2 in 12 Prozent und im Stadium T3 in 60 Prozent. Bei den hämatogen entstandenen Metastasen lassen sich am häufigsten Lebermetastasen nachweisen, da das Kolon im Abflussgebiet der V. porta liegt. Symptome und klinische Zeichen des kolorektalen Karzinoms sind okkulte und manifeste Blutbeimengungen im Stuhl, eine damit verbundene Anämie oder ein Wechsel von Obstipation und Diarrhoe mit teils erheblichem Gewichtsverlust. Als tumorbedingte Komplikationen ergeben sich ein Subileus bis hin zum kompletten Ileus, massive Blutungen und eine Peritonitis aufgrund von Perforationen. 1.2 Molekulare Grundlagen der Adenom-Karzinom-Sequenz Seit über 30 Jahren weiß man, dass der größte Teil der KRKs aus adenomatösen Polypen hervorgeht [51]. Histopathologisch sind die Veränderungen von der normalen Darmschleimhaut zum Karzinom zuerst als dysplastische aberrante Kryptenfoci (ACF), dann als kleine bzw. große 15 Adenome und schließlich als Karzinom sichtbar. Dieser Ablauf wird als Adenom-Karzinom-Sequenz bezeichnet. Genetisch geht man in diesem Modell davon aus, dass sich zuerst Mutationen im Adenomatous Polyposis Coli (APC)Gen ereignen, weil diese schon in sehr kleinen Adenomen von nur 0,5 cm Durchmesser gefunden werden konnten und die Häufigkeit von APCMutationen von ganz frühen Adenomen bis hin zu Karzinomen gleichmäßig bei ca. 60 Prozent liegt [62]. Ebenfalls sehr früh in der Karzinogenese treten K-ras Mutationen auf, die auch schon in einem hohen Maß in ACFs nachgewiesen werden können [63]. Schließlich kommen p53 Mutationen in späteren Adenomen zum Zeitpunkt des Übergangs von benignem zu malignem Wachstum hinzu [6]. Schon in frühen Studien konnte gezeigt werden, dass in über 70 Prozent der malignen Karzinome im Kolon Chromosom 18q verloren geht [18, 30, 76]. Auf diesem langen Arm des Chromosomens 18 liegen die Tumorsupressorgene Deleted in Colorectal Cancer (DCC), Smad2 und Smad4 [18, 23]. APC, ß-Catenin Cox-2/ p53 DCC/Smad2/Smad4 K-ras Normale Dyspl. ACF, Fortgeschrittenes Epithelzelle frühes Adenom Adenom Karzinom Metastase Abbildung 1: Die klassische Adenom-Karzinom-Sequenz (modifiziert nach:[18]) Dem APC-Gen kommt eine entscheidende Rolle in der Karzinogenese, vor allem in der Tumorinitiierung zu. Deshalb wurde es auch als „gate keeper“ Gen bezeichnet [31, 52]. Anhand hereditärer Erkrankungen wie der FAP, bei der hunderte von Adenomen im Darm auftreten, konnten wichtige Hinweise zur Entstehung eines KRKs auf molekularer Ebene gefunden werden. Bei Patienten mit FAP wies man Keimbahnmutationen im APC-Tumorsuppressorgen auf Chromosom 5q21 nach, die ursächlich für die Entwicklung der Erkrankung sind [54]. Aber auch in sporadischen KRKs wurden in über 80 Prozent der Fälle Mutationen im APC-Gen nachgewiesen [46]. Funktionell führen APC Mutationen zu einer Stabilisierung und Akkumulation von ß-Catenin, das als Onkogen gilt [49]. ß-Catenin besitzt sowohl eine Rolle 16 als Zell-Zell-Adhäsionprotein als auch als Mediator innerhalb des Wnt/ßCatenin-Signalwegs. Das akkumulierte ß-Catenin transloziert in den Nukleus, wo es Zielgene anschalten kann, die zum Beispiel über eine Steigerung der Proliferation zur Karzinomentstehung beitragen (z.B. c-myc, Cyclin D1) [59]. Weitere Zielgene des Signalwegs sind zum Beispiel Cyclin D1, c-myc und Fibronectin und außerdem die Cyclooxygenase-2 (Cox-2), die eine hohe Bedeutung für die Bildung von pro- und antiinflammatorischen Substanzen und auch für die Entstehung des KRK hat (s.u.). Ein weiteres Tumorsuppressorgen, das in der Kolonkarzinogenese eine entscheidede Rolle spielt, ist p53. Baker et al. konnten zeigen, dass die Wildtypform von p53 das Zellwachstum von Kolonkarzinomzellen in Zellkulturen verhindert. Dies kann als ein Hinweis gesehen werden, dass p53 eine wichtige Aufgabe am Übergang von benignem zu malignem Zellwachstum hat [5]. In vielen menschlichen Tumoren konnten p53 Mutationen gefunden werden: z. B. in Mammakarzinomen in 42,5 Prozent der Fälle, in Nierenzellkarzinomen in 33 Prozent der Fälle und nicht zuletzt in kolerektalen Karzinomen in 62 Prozent der Fälle [48, 61, 64]. Die Fähigkeit zu metastasieren, scheint schließlich durch Mutationen in Smad4 begünstigt zu werden, da in einem Drittel der metastasierten KRKs Smad4 Mutationen gefunden werden konnten, die zu einem Verlust des Protein führen [43]. Smad4, das zuerst als DPC4 (Deleted in Pancreatic Cancer 4) im Pankreaskarzinom entdeckt wurde [23], ist Bestandteil des Transforming Growth Factor beta (TGF-ß)-Signalwegs, der verschiedene biologische Prozesse wie Zellproliferation, Differenzierung, Migration und Apoptose kontrolliert [41]. Ein anderer wichtiger Prozess in der Karzinogenese scheint über die Insulin-like growth factors (IGF) I und II vermittelt zu werden. Sie werden als Mitogene angesehen, die an die Zelloberfläche des IGF-Rezeptors binden und so das Zellwachstum und sogar das Absiedeln von Metastasen fördern [34, 37]. Auch in kolorektalen Karzinomen konnten spezifische IGF-Rezeptoren nachgewiesen werden [60]. Ein weiterer Hinweis auf die Bedeutung von IGF in der Karzinogenese konnte durch die Beobachtung von Patienten mit Akromegalie 17 gefunden werden, da diese Patienten erhöhte IGF-Spiegel aufweisen. Für diese Patienten wurde ein erhöhtes Risiko für kolorektale Adenome und Karzinome nachgewiesen [26]. Dass die einzelnen hier beschriebenen Signalkaskaden und deren Mutationen nicht unabhängig von einander ablaufen und zu bewerten sind, sondern Teil eines Signalnetzwerkes sind, verdeutlicht u.a. die Arbeit von Muñoz et al., die zeigen konnten, dass Mäuse die sowohl heterozygot für APC-Mutationen und homozygot für eine Mutation im TGF-ß-Rezeptor waren, deutlich mehr Adenokarzinome aufwiesen, als solche mit intaktem TGFBR2 [50]. Dieses Ergebnis verdeutlicht, dass die Karzinomentstehung durch viele Ereignisse geprägt ist, die teilweise abhängig oder unabhängig voneinander in der Zelle auftreten. Außerdem können zwischen den einzelnen Mutationsereignissen in sporadischen Neoplasien mehrere Jahre liegen, so dass die Entwicklung von einem Adenom zu einem Karzinom in der Regel 10 bis 15 Jahre dauert. 1.3 Die Rolle des Wnt/beta-Catenin-Signalwegs bei der Entstehung des kolorektalen Karzinoms Wnt ist ein Signalprotein, dass an den Rezeptor Frizzled bindet [8] und an CoRezeptoren aus der LRP-Familie (LDLR-related protein) an der Zelloberfläche [73]. Die Aktivierung dieses Rezeptors führt zur Phosphorylierung von Dishevelled-Protein [33, 82]. Das phosphorylierte Dishevelled wirkt wiederum inhibierend auf einen Proteinkomplex (bestehend aus Glycogen Synthase Kinase (GSK)-3ß, APC und dem Protein Axin), der normalerweise β-Catenin abbaut. Dieser Proteinkomplex liegt intakt in Zellen vor, in denen gerade kein Wnt-Signal wirkt [24]. Dort verhindert dann auch Axin als negativer Regulator, dass GSK-3ß ß-Catenin phosphoryliert [25] und so der Ubiquitinierung und dem Abbau zugeführt wird [1]. Da nun bei vorliegendem Wnt-Signal die Degradation von β-Catenin inhibiert ist, sammelt sich dieses im Zytoplasma an, transloziert in den Zellkern und bildet einen Komplex mit T Cell transaktivation Factor (TCF), was die Transkription von Wnt-Zielgenen wie c-myc, Cyclin D1, PPAR und Cox-2 aktiviert. 18 Fz: Frizzled Rezeptor Dsh: Dishevelled Protein Fz Wnt GSK-3: Glycogen Synthase Kinase Dsh Axin APC Gsk-3 Phospho- ß-Catenin ryliert WNT-Zielgene: c-myc, ß-Catenin Cyclin D1, PPAR, Cox-2 TCF Abbildung 2: Wnt-Signalweg modifiziert nach [36] Eine TCF Binding Site (TBS) konnte auch in der Promotorregion von Cox-2 gefunden werden. Durch eine Akkumulation von ß-Catenin kann es so zu einer Hochregulation der Cox-2 Expression kommen. Allerdings ist für diesen Mechanismus eine gleichzeitige Mutation in K-ras erforderlich [3]. ß-Catenin Mutationen können in vielen menschlichen Tumoren gefunden werden. Sie sind relativ spezifisch und befinden sich in den aminoterminalen Regionen [58]. Im Normalfall werden diese Regionen phosphoryliert und sind dadurch für den Abbau über den Ubiquitin-Proteasom-Komplex markiert [1]. Morin et al. konnten für das kolorektale Karzinom zeigen, dass es durch Mutationen im ß-Catenin Gen zu einer stärkeren Stabilität von ß-Catenin kommt, wenn sich diese Veränderungen in dem für die Phosphorylierung wichtigen Bereich befinden [47]. Aus diesem Grund kommt es zu einer Ansammlung von ß-Catenin im Zytoplasma und Zellkern. Häufiger jedoch führen die oben bereits beschriebenen Mutationen im APC-Gen zu einer mangelnden Phosphorylierung und folglich zu einer Anhäufung von ß-Catenin. Zusammenfassend bewirkt die beschriebene Aktivierung des Wnt-Siganlwegs den ß-Cateninanstieg [58]. Die nukleäre Lokalisation von ß-Catenin hat eine besondere Bedeutung für die Aktivierung von Zielgenen und zeigt eine Zunahme des Gesamtproteins an [13]. Dieses Phänomen kann man sich 19 zunutze machen, um mit spezifischen Antikörpern die erhöhte Menge an ßCatenin nachzuweisen. 1.4 Die Rolle der Cyclooxygenase-2 in der Tumorentstehung Da die Cyclooxygenase-2-Genexpression in über 80 Prozent der kolorektalen Karzinome erhöht ist, kann von einer erheblichen Bedeutung dieses Gens für die Karzinogenese ausgegangen werden [15]. Cox-2 hat eine zentrale Stellung in der Bildung von pro- und antiinflammatorisch wirkenden Substanzen. Zuerst ensteht mit Hilfe der Phospholipase A2 Arachidonsäure aus Membranphospholipiden. Cox-2 und Peroxidase fördern die Bildung von Prostaglandin H2, aus dem im nächsten Schritt durch die Enzyme Prostaglandin- Substanzen entstehen: und Thromboxansynthase die fünf folgenden Prostaglandin D2, Prostaglandin E2, Prostaglandin F2alpha, Prostaglandin I2 and Thromboxan A2 [78]. Chronische Entzündungen spielen eine bedeutende Rolle in der Entstehung von Tumoren und die Überexpression von Cox-2 als einzelner Mediator kann so zur Tumorentstehung betragen. Die zentrale Bedeutung der Cox-2 in der Kolonkarzinogenes wurde ferner in einem Mausmodell untersucht. Dort führte sowohl die pharmakologische als auch die genetische Hemmung der Cox-2 zu einer Reduktion der Kolonkarzinome [57]. Diesen Effekt macht man sich auch klinisch zu Nutze. So konnte in zahlreichen klinischen Studien nachgewiesen werden, dass die regelmäßige Einnahme von Cox-Hemmern, wie zum Beispiel Azytylsalizylsäure, die Inzidenz von Kolonadenomen und Karzinomen gesenkt werden kann [71, 74]. Um randomisierte, kontrollierte und doppelblind erhobene Daten zu erlangen, wurde in Deutschland die German 5-ASA Polyp Prevention Study (GAPPS) durchgeführt, in der die Patienten jeweils 5-Aminosalizylsäure (5-ASA) oder ein Placebo über den Zeitraum von drei Jahren erhielten. Vor allem Patienten mit erhöhtem Adenomrezidivrisiko profitierten im Trend von der 5-ASA-Gabe [69]. 1.5 Die Rolle von p53 in der Tumorentstehung Das Tumorsuppressorgen p53 spielt für die Kontrolle des Zellzykluses und die Einleitung der Apoptose eine bedeutende Rolle. In gesunden Zellen liegt p53 nur in sehr geringen Mengen vor, die immunhistochemisch kaum nachweisbar 20 sind. Wirkt aber Stress auf die Zelle ein, zum Beispiel in Form von Hypoxie, Hitzeschock oder Gammastrahlen und kommt es in der Folge zu Schäden in der Zellintegrität, steigt die p53 Konzentration [21, 29, 56]. Dann kann p53 den cyclinabhängigen Kinase-Inhibitor p21 induzieren, der schließlich zu einem Zellzyklusarrest in der G1-Phase führt [14]. Hier entscheidet sich, ob der Schaden in der Zelle repariert werden kann und die Zelle wieder in den Zellzyklus eintritt. Der intrinsische Weg der Apoptose kann unter anderem durch p53 mit beeinflusst werden und führt über verschieden Faktoren zum programmierten Zelltod [45, 44]. Bei einer Vielzahl von menschlichen Tumoren kommen Mutationen im p53 Gen vor [72]. In einer Studie von Morrin et al wurde in 62 Prozent der untersuchten Karzinome eine p53-Überexpression festgestellt [48] und in kolorektalen Adenomen konnte eine Überexpression in 28 Prozent gefunden werden [28]. Durch diese Veränderungen wird ein Tumorwachstum stark begünstigt, da eine wichtige Kontrolle im Zellzyklus und auch ein möglicher Weg der Apoptoseeinleitung wegfallen. 1.6 Expression von ß-Catenin, Cox-2 und p53 in normaler Schleimhaut und in Adenomen In immunhistochemischen Untersuchungen kann unterschiedliches Expressionsverhalten für ß-Catenin, Cox-2 und p53 nachgewiesen werden. Über diesen Weg lassen sich indirekt Aussagen zur Aktivität des Signalwegs machen. 1.6.1 ß-Catenin In normaler Schleimhaut kann nach immunhistochemischer Bearbeitung mit monoklonalen Maus-Anti-ß-Catenin-Antikörpern membranständige Färbung nachgewiesen werden. In Adenomen kann in der Mehrzahl der Fälle eine zytoplasmatische Färbung, ein Rückgang der membranständigen Färbung und eine Anfärbung des Zellkerns beobachtet werden [75]. In Adenokarzinomen fanden Takahashi et al. außerdem eine nukleäre, beziehungsweise membranständige Färbung [73]. Diese Ergebnisse weisen auf die bereits oben erwähnte Aktivierung des Wnt/beta-Catenin Signalwegs hin. 21 1.6.2 Cox-2 Eine signifikante Zunahme der Färbeintensität für Cox-2 konnte bei Kolonadenomen im Vergleich zu normaler Mukosa nachgewiesen werden. Außerdem zeigten größere Adenome und solche mit hochgradiger Dysplasie stärkere Anfärbbarkeit. Sheehan et al. konnten zeigen, dass bei den von ihnen untersuchten Proben neun von zehn hyperplastischen Polypen keine Cox-2Expression aufwiesen [42, 70]. Auch in 92 Prozent der von Elder et al. untersuchten Karzinome konnte eine erhöhte Cox-2 Expression nachgewiesen werden. Weiterhin decken sich die Aussagen dieser Gruppe zu Adenomen und Cox-2-Expression mit den bereits oben erwähnten [17]. 1.6.3 P53 In einer Untersuchung von Saleh et al. konnte gezeigt werden, dass 37 Prozent der Adenome und 65 Prozent der Karzinome p53 exprimierten, außerdem eine p53 Expression häufiger in Adenomen mit hochgradiger Dysplasie vorkommt [68]. In normaler Darmmukosa konnte keine p53-Expression nachgewiesen werden [9]. Auch diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass p53 wie oben bereits erwähnt, als Marker für eine Störung in der Apoptose betrachtet werden kann. 1.7 Die Histopathologie des Kolonadenoms und seine Bedeutung für die Entstehung des Kolonkarzinoms Fast jeder Darmkrebs entsteht auf dem Boden von Adenomen. Durch eine Entfernung von Adenomen im Rahmen einer Koloskopie kann eine Krebserkrankung verhindert werden. Patienten mit Adenomen, insbesondere mit fortgeschrittenen Adenomen, haben ein erhöhtes Risiko für das Auftreten weiterer Adenome und sollten in bestimmten Abständen erneut koloskopiert werden. Der optimale Zeitpunkt für die Kontrollkoloskopien ist nicht geklärt. Aus diesen Gründen ist zu klären, ob die entfernten Adenome selbst Aufschluss über die Rezidivwahrscheinlichkeit geben können. Deshalb wurden die Adenome in den letzten Jahren sehr genau histopathologisch klassifiziert und auf ihre Vorhersagekraft für ein Rezidiv untersucht. 22 1.7.1 Histologie Kolonadenome lassen sich in tubuläre, tubulovillöse und villöse Adenome einteilen. Dabei machen die tubulären Adenome 75 Prozent der gesamten Adenome aus, 20 Prozent entfallen auf die tubulovillösen Adenome und nur bei fünf Prozent handelt es sich um rein villöse Adenome. Tubulovillöse oder villöse Adenome gehen mit einem höheren Karzinomrisiko als tubuläre Adenome und gehäuft mit Rezidivadenomen einher [83]. Des Weiteren intraepitheliale werden Adenome Neoplasien eingeteilt, in hochgradige wobei und niedriggradige hochgradige intraepitheliale Neoplasien (HGIEN) häufig mit Adenomen über einen Zentimeter und villösen Bestandteilen assoziiert sind. Eine HGIEN kann als wichtiger Prädiktor für das erneute Auftreten von fortgeschrittenen Adenomen gesehen werden [83]. 1.7.2 Größe Seit längerem ist bekannt, dass die Größe der Adenome einen entscheidenden prognostischen Wert für das Auftreten von Rezidiven und damit auch für die Entstehung eines KRKs hat. So haben Patienten mit einem Adenom größer als einem Zentimeter ein ca. 50 Prozent höheres Risiko für ein Rezidiv verglichen mit Patienten mit einem Adenom kleiner als 0,5 Zentimeter [40]. 1.7.3 Anzahl Die Anzahl der bei Koloskopien gefundenen Adenome kann ebenfalls als prognostischer Parameter für das Auftreten von Rezidiven gesehen werden. Winawer et al. konnten in ihrer National Polyp Study zeigen, dass die Anzahl der Adenome signifikant (p<0.001) mit dem erneuten Fund von Adenomen in der Nachsorgekoloskopie korreliert [81]. Neuere Studien die sich zum Teil auch mit anderen Fragestellungen befassen, aber die Rekurrenzrate miterfasst haben, konnten diese Aussage bestätigen [10, 27]. 1.7.4 Lokalisation Kolonadenome können wie auch Karzinome in jedem Teil des Dickdarms auftreten, allerdings findet man sie zu 80 Prozent im linken Abschnitt des Darms [16]. Mit steigendem Lebensalter findet man eine Zunahme der Adenome auf der rechten Seite des Darms (Zökum bis Kolon transversum), die aus einer überproportionalen Zunahme der absoluten Anzahl der Adenome auf 23 dem proximalen Abschnitt des Darms resultiert [20]. In der Wheat Bran Fiber (WBF) Studie von Martinez et al. wiesen nach, dass vor allem mit proximal gelegenen Adenomen ein erhöhtes Risiko für ein Rezidiv einhergeht [40]. Die hier beschriebenen Parameter Anzahl, Größe, villöser Anteil und HGIEN können eine gewisse Aussage über die Wahrscheinlichkeit eines kolorektalen Adenomrezidivs machen. Die Untersuchung, welchem dieser Paramter die größte Bedeutung zukommt, ist dadurch erschwert, dass die einzelnen Kriterien oft gleichzeitig in einem Adenom vorkommen. In der Multivariatanalyse der National Polyp Study wurde gefunden, dass Größe und villöse Histologie die stärkste Aussagekraft bezüglich des Adenomrezidivrisikos haben [55], in anderen Studien scheint aber die Anzahl der wichtigste Paramter zu sein. Auch die proximale Lokalisation scheint eine gewisse Bedeutung zu haben (s.o.), aber für eine valide Aussage diesbezüglich fehlen noch weitere Studien [79]. 1.7.5 Einteilung der Adenome in verschiedene Risikogruppen Da die Charakteristika hohe Anzahl gefundener Adenome, Größe über ein Zentimeter, HGIEN und villöser Anteil mit einem erhöhten Rezidivrisiko einhergehen, scheint es bei den Vorsorgekoloskopien sinnvoll, die Adenome in bestimmte Gruppen einzuteilen, um dann den Zeitpunkt der erneuten Koloskopie anhand dieser Kriterien festlegen zu können. In die Low-Risk-Gruppe werden Patienten mit weniger als drei Adenomen eingeteilt, die außerdem alle nicht größer als ein Zentimeter sein dürfen. Weiterhin dürfen es nur tubuläre Adenome ohne HGIEN sein. Um in die High-Risk-Kategorie zu fallen, müssen bei einem Patienten drei oder mehr Adenome jeglicher Größe gefunden werden, mindestens ein Adenom größer als ein Zentimeter sein, eine villöse Histologie aufweisen oder es muss eine HGIEN vorliegen. Liegt eines der Kriterien vor handelt es sich um ein fortgeschrittens Adenom. [79]. 1.8 Weitere Risikofakoren für ein Adenomrezidiv Auch das Lebensalter und das Geschlecht scheinen Bedeutung für das Wiederauftreten eines kolorektalen Adenoms zu haben. So konnten Martinez et al. zeigen, dass höheres Alter und männliches Geschlecht mit einen signifikant höheren Rezidivrisiko einhergehen [39]. 24 1.9 Chemoprävention und GAPP-Studie Wie bereits erwähnt scheinen NSARs einen präventiven Effekt auf die Entstehung des kolorektalen Karzinoms auszuüben. Um diesen Zusammenhang auch klinisch an einem größeren Kollektiv kontrolliert zu überprüfen, wurde 1996 mit der German 5-ASA Polyp Prevention Study (GAPPS) begonnen. Es handelt sich dabei um eine doppelblinde, multizentrische und placebokontrollierte Studie. Ziel war, den Effekt von 5Aminosalizylsäure (5-ASA) auf die Rezidivhäufigkeit von Patienten mit sporadischem KRK zu untersuchen. Dazu wurde den Patienten entweder drei Jahre lang jeden Tag 1g 5-ASA oder ein Placebo verabreicht. Zu Beginn und nach einem Beoachtungszeitraum von drei Jahren wurde bei den Studienteilnehmern der GAPP-Studie eine Koloskopie durchgeführt. Dieses unter strengen Studienbedinungen kontrollierte homogene Patientenkollektiv bietet ideale Voraussetzungen für eine Analyse von Biomarkern, da durch die Randomisation die statistische Verzerrung (Bias) der Patientenselektion minimiert wird. 1.10 Die Rolle von Vorsorgekoloskopien für die Prävention des kolorektalen Karzinoms Die Entfernung der kolorektalen Adenome als Vorläuferläsionen, insbesondere solcher, die als fortgeschrittene Adenome klassifiziert werden, reduziert das Risiko für kolorektale Karzinome deutlich. So konnten Winawer et al. zeigen, dass in ihrer National Poly Study die Inzidenz des kolorektalen Karzinoms nach Koloskopien mit Adenomentfernung signifikant um 75-90 Prozent geringer war, als es ohne Intervention zu erwarten gewesen wäre [80]. Auch in neueren Studien konnte gezeigt werden, dass das Auftreten von fortgeschrittenen Neoplasien signifikant niedrieger ist, wenn in den letzten zehn Jahren eine Koloskopie erfolgt ist [12]. Laut der S3-Leitlinien Kolorektales Karzinom stellt die komplette Koloskopie das Standardverfahren für die Vorsorge dar [67]. Der Vorteil der Koloskopie ist, dass neben einer hohen Sensitivität für Polypen und Karzinome in der Koloskopie verdächtige Befunde direkt entfernt und histopathologisch untersucht werden können [66]. In einer Studie, die das Auftreten von Neoplasien (einfache Adenome bis hin zum Karzinom) für das Jahr 2006 in der bayrischen Bevölkerung untersucht hat, konnten bei 25,95 25 Prozent der Patienten Neubildungen nachgewiesen werden. Dies verdeutlicht noch einmal die Größenordnung und die immense Bedeutung, die die Koloskopien in der Prävention inzwischen einnehmen [38]. 1.11 Kriterien für die Durchführung der Vorsorgekoloskopien in Deutschland Eine primäre Prävention zielt darauf ab, dass Krankheiten erst gar nicht entstehen. So scheint Darmkrebs, wie bereits oben erwähnt, durch die Ernährung und beeinflussbar zu andere sein. Lebensstilfaktoren Unter zu einem Sekundärprävention gewissen versteht man Grad die Früherkennung von Krankheiten. Die Koloskopie ermöglicht durch die Entfernung kolorektaler Adenome eine primäre Krebsprävention. Solche Vorsorgekoloskopien werden seit 2002 durch die gesetzlichen Versicherungsträger für Personen ab 55 Jahren erstattet. Bei unauffälligem Befund wird eine zweite Koloskopie nach 10 Jahren erstattet. Hintergrund ist die Tatsache, dass sich ein kolorektales Karzinom selten vor Ablauf von zehn Jahren entwickelt. Werden neoplastische Polypen (Adenome) gefunden, wird ein differenzierteres Vorgehen notwendig. Für Patienten mit ein bis zwei Adenomen und einer Größe von weniger als einem Zentimeter, bei denen sich keine HGIEN zeigt, wird eine Kontrollkoloskopie nach fünf Jahren empfohlen. Diese Patienten werden in die „Low Risk“ Kategorie eingestuft. Sollten sich drei bis zehn Adenome finden, ein Adenom größer als ein Zentimeter oder villöse Anteile im histologischen Befund nachweisbar sein, ist eine erneute Untersuchung nach drei Jahren nötig. Eine Nachsorge nach diesem Zeitraum ist ebenfalls notwendig, wenn in der entnommenen Probe hochgradige intraepitheliale Neoplasien gefunden wurden. Bei mehr als zehn gefundenen Adenomen sollte das Kontrollintervall individuell anhand von Kriterien wie einer positiven Familienanamnese und Komorbiditäten festgesetzt werden, in jedem Fall aber kürzer als drei Jahre sein [67]. Zusammenfassend lässt sich also sagen, dass grade die Bedeutung der fortgeschrittenen Adenome, deren Eigenschaften wie beschrieben Anlass für eine frühe Rekoloskopie geben, sorgfälltig entfernt und untersucht werden müssen. 26 1.12 Wirtschaftliche Folgen des derzeitigen Polypenmanagements in Deutschland – Unnötige Rekoloskopie gilt es zu vermeiden 1,2 Millionen Versicherte hatten das Angebot der Vorsorgekoloskopien bis 2004 angenommen. Das entspricht einem Anteil von 5,6 Prozent der Männer und 6,8 Prozent der Frauen bei den Berechtigten im Alter von 55 bis 74 Jahren. Im Jahr 2004 wurden in Deutschland 638.000 Vorsorgekoloskopien durchgeführt [77]. Falls der Trend anhält und die Berechtigten in den nächsten Jahren in ähnlicher Weise an der Vorsorgemaßnahme teilnehmen, lässt sich hochrechnen, dass nach Ablauf der ersten zehn Jahre nach Einführung dieser Screeningmaßnahme bis zu 30% der im Jahr 2002 im Alter zwischen 55 und 74 Jahren alten Männer und Frauen teilgenommen haben werden [2]. Bei Kosten von derzeit etwa 200 Euro pro durchgeführter Vorsorgekoloskopie ist diese Maßnahme mit nicht unerheblichen Kosten verbunden. Vergleicht man Vorsorgekoloskopien und das Abwarten auf erste Symptome eines Karzinoms, erweisen sich die Koloskopien aber als kosteneffektiv im Vergleich zur sehr viel teureren Tumortherapie. Je nach dem ob davon ausgegangen wird, dass die Wahrscheinlichkeit nach einer Koloskopie an Krebs zu erkranken um 95 Prozent, 75 Prozent, oder nur um 50 Prozent sinkt, lägen die vermiedenen Behandlungskosten pro 10.000 Einwohner zwischen 11,3 Millionen Euro und 21,5 Millionen Euro [53]. Im Rahmen der durchgeführten Vorsorgekoloskopien werden in etwa 30% Adenome gefunden. Die bei den Adenomträgern erforderlichen Nachsorgekoloskopien binden eine nicht unerhebliche Koloskopiekapazität und sind mit zusätzlichen Kosten verbunden. So werden in den USA etwa 25% aller Koloskopien bei über 50-jährigen zur Nachsorge nach Polypektomien durchgeführt [35]. Es ist daher entscheidend, erforderliche Nachsorgekoloskopien auf ein Mindestmaß zu beschränken. Um etwa 20 Prozent der berechtigten Patienten pro Jahr zu erreichen, müssten etwa 4 Millionen Koloskopien im Jahr durchgeführt werden. Dies könnte zu deutlich längeren Wartezeiten führen, da nur etwa 2000 Ärzte diese Maßnahme durchführen können [4]. Auch aus diesem Grund ist es entscheidend, unnötige Rekoloskopien auf ein Mindestmaß zu beschränken, um weiterhin eine kurzfristige Versorgung für jegliche Form der Koloskopie sicherstellen zu können. 27 Aber auch die bereits erwähnten Kosten, die zwar insgesamt einen volkswirtschaftlichen Nutzen aufweisen, sollten in Anbetracht begrenzter Mittel nicht aus dem Auge verloren werden. Deshalb bietet sich auch aus diesen Gründen eine genauere Hinterfragung der Zeiträume für eine erneute Koloskopie nach Adenomfund an. 1.13 Etablierte Risikofaktoren für Adenomrezidive Anhand der bisher bekannten klinischen Parameter Anzahl, Größe, Histologie und Lokalisation ist es bis jetzt nur unzureichend möglich, eine genauere prognostische Aussage über das Auftreten von Adenomrezidiven zu machen und so die Empfehlungen für Rekoloskopieintervalle individualisierter zu gestalten. Fortgeschritten Adenome, also solche mit einer Größe von über einem Zentimeter, villösem Anteil oder HGIEN müssen entsprechend früher rekoloskopiert werden, weil sie eine höhere Wahrscheinlichkeit für ein Rezidiv aufweisen und mit einem erhöhten Entartungsrisiko einhergegen [11]. Allerdings sind diese Parameter allein nicht ausreichend, um eine genaue Aussage über ein erneutes Auftreten zu machen. Deshalb ist es grade für fortgeschrittene Adenome besonders sinnvoll, die Kriterien für eine Rekoloskopie neu zu definieren. So werden Patienten möglicherweise nach drei Jahren koloskopiert, wenn einer dieser Faktoren positiv vorliegt, doch wäre eine erneute Untersuchung vielleicht erst nach fünf Jahren nötig. 28 2 Ziel der Arbeit Ziel der Arbeit ist es, gewebebasierte Biomarker für Adenomrezidive im Dickdarm zu identifzieren, die es erlauben, das Wiederauftreten von Adenomen besser vorherzusagen als bislang etablierte klinische und histopathologische Parameter und so die Verlaufskoloskopieintervalle individueller für den Patienten zugestalten. Dabei geht es insbesondere um fortgeschrittene Adenome, die für eine höhere Rezidivquote bekannt sind. Für dieses begrenzte Kollektiv scheint eine genauere Voraussage für die Wahrscheinlichkeit Adenomwachstums besonders sinnvoll. eines erneuten So könnte eine Möglichkeit zur individuelleren Nachsorge für den einzelnen Patienten gefunden werden. 29 3 3.1 Material und Methoden Materialien 3.1.1 Herkunft der Polypen – GAPP-Studie Die untersuchten Kolonpolypen stammen aus der bereits oben erwähnten GAPP Studie zur chemopräventiven Wirksamkeit von antiinflammatorischen Substanzen. Die Studie wurde im Zeitraum von 1996 bis 2003 durchgeführt. Im ersten Studienabschnitt wurden 598 Patienten randomisiert. Je nach Anzahl der Adenome wurden die Patienten unterschiedlich stratifiziert: Stratum I: ein bis zwei Adenome; Stratum II: drei oder mehr Adenome. Die Studie wurde nach einer Interimsanalyse für das Stratum I (weniger als 3 Polypen) eingestellt, da sich durch die medikamentöse Behandlung für die Patienten kein Vorteil nachweisen ließ. Auch weitere nicht bekannte Gründe führten teilweise dazu, dass Patienten nicht erneut kolokopiert wurden. Weitere Patienten wurden nicht nach den in der Studie vorgeschriebenen 3 Jahren rekoloskopiert, so dass auch diese Patienten nicht eingeschlossen werden konnten. Für 309 Patienten lag der klinische Verlauf schließlich vor. Allerdings wurde von den beteiligten pathologischen Instituten nur für 122 Patienten Material zur Verfügung gestellt. Weiteres zum genauen Vorgehen im Methodikteil [69]. 598 Patienten Stratum I: 417 Patienten Keine Rekoloskopie: 265 Rekoloskopie zum falschen Zeitpunkt: 7 Stratum II: 181 Patienten Rekoloskopie nach drei Jahren: 145 Kein Material vorhanden: 74 Keine Rekoloskopie: 93 Material vorhanden: 71 Rekoloskopie zum falschen Zeitpunkt: 6 Rekoloskopie nach drei Jahren: 82 Kein Material vorhanden: 43 Material vorhanden: 38 Abbildung 3: Verteilung des Probenmaterials aus dem Patientenkollektiv 30 3.1.2 Gewebeproben Von den pathologischen Instituten der an der GAPP-Studie beteiligten Studienzentren wurden uns 397 Proben aus Kolonschleimhaut von 122 Patienten zur Verfügung gestellt. Die 397 Proben waren zu zwei verschiedenen Untersuchungszeitpunkten gefunden worden: jeweils zum ersten Untersuchungszeitpunkt und etwa drei Jahre nach der ersten Koloskopie. Von diesen 122 Patieten waren aber nur 109 Patienten zum in der Studie vereinbarten Zeitpunkt nach drei Jahren rekoloskopiert worden. Aus diesem Grund fiel das Material der übrigen 13 Patienten aus der weiteren Untersuchung heraus. 3.1.3 Antikörper 3.1.3.1 Primäre Antikörper Tabelle 2: Verwendete primäre Antikörper Artikel Hersteller Monoklonaler Mausantikörper gegen Dako Cytomation; Monoclonal Mouse humanes Beta-Catenin Anti-Human Beta-Catenin; Clone: β-Catenin-1 Immunogen: Rekombinantes Cterminales β-Catenin-GST Fusionsprotein1; Isotyp: IgG1, kappa Code M3539 Monoklonaler Mausantikörper gegen Dako Cytomation; Monoclonal Mouse humanes p53 Anti-Human p53 Protein; Clone DO-7 Code-Nr. M 7001 Monoklonaler Mausantikörper gegen Dako Cytomation; Monoclonal Mouse humane Cyclooxygenase-2 Anti-Human Cox-2 (Cyclooxygenase-2) Clone: CX-2941,2; Immunogen: Synthetisches Peptid, entsprechend der Human-Cox-2 Aminosäuren 5805981,2; Synonyme: Cyclooxygenase2; Isotyp : IgG1, kappa; Code M3617 31 3.1.3.2 Sekundäre Antikörper Tabelle 3: Verwendete sekundäre Antikörper Artikel Hersteller Biotinylierte Ziege-Anti-Maus- und Dako REALTM Biotinylated Secondary Ziege-Anti-Kaninchen- Antibodies (AB2) Immunglobuline; in gepufferter Lösung mit stabilisierendem Protein und Natriumazid 3.1.4 Puffer und Lösungen Tabelle 4: Puffer und Lösungen Artikel Hersteller Alkohollösung Clearingreagens EDTA Puffer 0,8 Eisessig TBS Dako RealTMLevamisole, 501fach Gepufferte Levamisol-Lösung konzentriert 3.1.5 Farbstoffe Tabelle 5: Verwendete Farbstoffe Artikel Hersteller Fast Red (Naphtol AS-MX-Phosphat) Dako REALTM Chromogen Red 1 Fast Red (Naphtol AS-MX-Phosphat) Dako REALTM Chromogen Red 2 Fast Red (Naphtol AS-MX-Phosphat) Dako REALTM Chromogen Red 3 Hämatoxylin nach Mayer In der Apotheke hergestellt Eosin Y In der Apotheke hergestellt 32 3.1.6 Verbrauchsmaterialien Tabelle 6: Verwendete Verbrauchsmaterialien Artikel Hersteller Mikrotom Einwegmesser Feather; Microtome Blade; Stainless Steel; R35 Objekträger Ca. 76x26x1mm; beidseitiger Mattrand; Süsse GmbH; Artikelnr.: M7620 Objekträger für Menzel-Gläser, Super FrostPlus; immunhistochemische Färbung Menzel GmbH CoKG; Artikelnr.: S1800AMN2 Deckgläschen Menzel-Gläser; 24x50mm; Artikelnr.: BB024050A1 Eindeckmittel Microm International GmbH CytosealTMXYL Verdünnungsmedium primär Zymed ZUC025-500 Antikörper Xylol Fa. Alfred Quadflieg GmbH, Gelsenkirchen, Deutschland Dako RealTMStreptavidin Alkaline Strepavidin Lösung Phosphatase (AP) 3.1.7 Geräte Tabelle 7: Verwendete Geräte Artikel Hersteller Schlittenmikrotom Micron HM430 Immunfärbeautomat DakoCytomation Dako Autostainer plus Eindeckapparat Micron CTM6 Wasserbad Typ 1002 GFL (Gesellschaft für Labortechnik), Burgwedel, Deutschland 33 3.1.8 Computerprogramme Tabelle 8: Verwendete Computerprogramme Artikel Hersteller Textverarbeitungsprogramm Microsoft Word Statistische Auswertung SPSS Version 17, 2008 Microsoft Excel 3.2 Methoden 3.2.1 Ethikkommisson Im März 2007 wurde ein Amendment bei der Ethikkommission der RuhrUniversität Bochum eingereicht, um das aus der GAPP-Studie stammende Gewebematerial immunhistochemisch untersuchen zu dürfen. Ein Ethikvotum der Ruhr-Universität für die GAPP-Studie lag zu diesem Zeitpunkt bereits vor. Dabei wurde versichert, dass die erhobenen Ergebnisse anonym behandelt werden und kein Bezug zu dem eigentlichen Patienten hergestellt wird. Diesem Amendment wurde durch die Ethikkommission stattgegeben. 3.2.2 Materialbeschaffung Zur Materialgewinnung wurden die ca. 50 an der Studie beteiligten gastroenterologischen Kliniken und Praxen um ihr Einverständnis gebeten, die von ihnen beauftragten Institute für Pathologie um die Übersendung der in der Studie gewonnen histologischen Proben bitten zu dürfen. Anschließend wurden diese pathologischen Zentren angeschrieben, wobei 20 Einrichtungen das Material zur weiteren Auswertung schickten. 3.2.3 Patientenauswahl für die Gewebeuntersuchung Für eine weitere Untersuchung im Rahmen der Arbeit wurden ausschließlich die 109 Patienten ausgewählt, für die ein lückenloser klinischer Verlauf dokumentiert war. 3.2.4 Mikrotomie Bei der Mikrotomie werden die in Paraffin eingebetteten Adenome in feine Scheiben geschnitten und auf einen Objektträger aufgebracht. Die verwendeten Objekträger wurden zuvor mit einem Bleistift beschriftet. Dabei wurde die 34 Nummer verwendet, die sich auch auf den Paraffinblöcken befand, um eine lückenlose Zuordnung zu gewährleisten. Bevor der Paraffinblock geschnitten wurde, wurde er zuerst auf einer Kühlplatte für ca. 5 Minuten gekühlt. Dies sorgt für eine Verfestigung und Verhärtung des Materials. Anschließend wurde der Block in das Mikrotom, bei dem Einmalklingen verrwendet werden, eingespannt und der Block angeschnitten. Das bedeutet, dass die sich über dem Adenom befindliche Paraffinschicht entfernt wird. Die Oberfläche wurde anschließend mit einem Pinsel vom Paraffin gesäubert. Nach dem Feinschneiden in einer Dicke von 6 m wurde der Schnitt mit der glänzenden, glatten Seite nach unten im Wasserbad (ca. 50°C) gestreckt. Dann wurde der Objektträger ins Wasserbad getaucht und der Schnitt aufgezogen. Anschließend wurde das Präparat im Brutschrank für 10 Minuten bei ca. 100°C getrocknet. 3.2.5 Histologische Färbung 3.2.5.1 Vorbehandlung Das hydrophobe und alkoholunlösliche Paraffin verhindert bzw. erschwert den Zugang der Farbstoffe ins Gewebe. Deshalb muss es vor der Färbung entfernt und der Schnitt in ein wässriges Medium gebracht werden. Als Reagenz zum Entparaffinieren wurde Xylol verwendet, dazu wurden die Objektträger dreimal fünf Minuten mit Clearingreagenz behandelt. Rehydriert wurde mit einer absteigenden Alkoholreihe (100-96-70-50%) bis zum Aqua dest für je fünf Minuten. 3.2.5.2 Hämatoxylin-Eosin-Färbung Der Bestandteil Hämatoxylin bewirkt die bläuliche Kernfärbung, das Eosin färbt Zytoplasma, Bindegewebe und Kollagenfasern rot an. Die Präparate wurden zuerst für 12 Minuten mit Hämatoxylin gefärbt und anschließend mit Leitungswasser gespült. Die Plasmafärbung erfolgte mit 2%igem wässrigem Eosin Y und 1 Tropfen Eisessig für zwei Minuten und anschließender Spülung in Leitungswasser. Schließlich folgt das Entwässern in aufsteigender Alkoholreihe für je fünf Minuten, das Klären mit Xylol, das Eindecken und Belegen mit einem Deckgläschen. 3.2.5.3 Protokoll der Hämatoxylin-Eosin-Färbung 1. Schnitte entparaffinieren 3x5 min 35 2. Hydrieren in absteigender Alkoholreihe bis Aqua dest je 5 min 3. Kernfärbung in Mayers Hämatoxylin 12 min 4. In Leitungswasser spülen 5. In lauwarmen Wasser bläuen 3 min 6. Plasmafärbung in 2% wässrigem Eosin Y + 1 Tropfen 7. Eisessig 2 min 8. In Leitungswasser spülen 9. Entwässern in aufsteigender Alkoholreihe je 1-2 min 10. Klären in Xylol 11. Eindecken mit Deckglas 3.2.6 Auswahl der Adenome für die Berechnung der Rezidivwahrscheinlichkeit Für die Bewertung der immunhistochemischen Färbeeigenschaften hinsichtlich der Auftretenswahrscheinlichkeit eines Rezidivs schien es sinnvoll, nur die Adenome, die bei der ersten klinischen Untersuchung gefunden werden konnten zu berücksichtigen, da diese Proben auch diejenigen sein werden, die bei einem möglichen Einsatz im klinischen Alltag zur Verfügung stehen. Ausgewertet wurden schließlich die Proben von 109 Patienten, da bei diesen zum ersten Untersuchungszeitpunkt entweder tubulöse, tubullovillöse oder villöses Adenome bzw. serrated Adenomas nachgewiesen werden konnten. Da bekannt ist, dass fortgeschrittene Adenome die größte Bedeutung für die Prognose aufweisen [40, 83], wurden aus dem vorhandenen Kollektiv das am weitesten fortgeschrittene Präparat des einzelnen Patienten ausgewählt. Hierbei entschieden sowohl Größe, Grad der intraepithelialen Neoplasie als auch Art des Polypen. 3.2.7 Immunhistochemische Färbung 3.2.7.1 Vorbereitung Es wurde mit der Avidin-Biotin-Komplex Methode gearbeitet. Die Schnitte wurden mit Hilfe von Xylol entparaffiniert. Die Entparaffinierung wurde 20 Minuten lang durchgeführt, anschließend folgte wieder die Rehydrierung in einer absteigenden Alkoholreihe bis zum Aqua dest. Wichtig war, dass die Schnitte im entparaffinisiertem Zustand nicht mehr antrockneten. Dann wurde die endogene Peroxidase in 0,5% H2O2/Methanol durch eine Einwirkzeit von zehn Minuten blockiert. 36 3.2.7.2 Antigen-Demaskierung Unter Maskierung des Antigens versteht man, dass der primäre Antikörper (AK) aufgrund der fixationsbedingten Veränderung der Proteinstruktur oder der Zellmembran nicht an das eigentliche Epitop binden kann. Durch die Demaskierung werden Membranen und Vernetzungen aufgebrochen und es kommt zu einer Permeabilitätssteigerung. Für diesen Vorgang wurde ein Ethylendiamintetraacetat (EDTA) Puffer ph 0,8 verwendet und die Objekträger mit den Präparaten im Wasserbad bei 98,5°C für 15 Minuten behandelt. 3.2.7.3 Primärer Antikörper Bei den primären Antikörpern handelte es sich um monoklonale Mausantikörper gegen humanes ß-Catenin, Cox-2 und p53. In einer Versuchsreihe wurden die optimalen Verdünnungsstufen festgelegt. In den weiteren Färbungen wurden entsprechend folgende Verdünnungen verwendet: 1:400 für ß-Catenin, 1:200 für Cox-2 und 1:50 für p53. Als Verdünnungsmittel hierfür wurde Zymed ZUC025-500 verwendet. 3.2.7.4 Sekundärer Antikörper Als Sekundärantikörper wurden biotinylierte Ziege-Anti-Maus- bzw. Ziege-AntiKaninchen-Immunglobuline verwendet, wobei nur die Ziege-Anti-Maus- Immunglobuline eine spezifische Bindung eingingen. Das gut wasserlösliche Biotin ist ein Vitamin, das sich an den Brückenantikörper koppeln lässt und als Rezeptormolekül für Strepavidin dient. 3.2.7.5 Prinzip der LSAB-Methode (Labelled-Streptavidin-Biotin) Bei dieser Technik wird die starke Affinität zwischen Biotin und Streptavidin ausgenutzt. Der Sekundärantikörper ist mehrfach biotinyliert und so lässt sich eine Verbindung zum Streptavidin-Enzymkonjugat-Komplex herstellen, der im dritten Schritt hinzugeführt wird. Mit Hilfe einer chromogenen Substrat-Lösung wird der Primärantikörper sichtbar gemacht. Vorteil dieser Methode ist die einfache Handhabung und eine gute Sensitivität. Die Kreuzreaktion des Biotins mit dem endogenen Biotin stellt einen großen Nachteil dar. 37 Primärer Antikörper Antigen Sekundärer Antikörper Biotin Strepavidin Alkalische Phosphatase Abbildung 4: LSAB-Methode (modifiziert nach:[32]) 3.2.7.6 Chromogen Die alkalische Phosphatase setzt das angebotene Substrat (fast red) durch Hydrolyse um. Die entstandene Substanz verbindet sich mit Chromogen zu einem sichtbaren Azofarbstoff. 3.2.7.7 Gegenfärbung Zur besseren Darstellung der Morphologie werden die Präparate mit dem zum Chromogen kontrastierenden Hämatoxylin nach Mayer für zwei Minuten gegengefärbt. 3.2.7.8 Färbeprotokoll 1. Entparaffinieren in Xylol 3x7 min 2. Rehydrieren über absteigende Alkoholreihe bis 70% Alk. je 5 min 3. Blockieren der endogenen Peroxidase in 0,5% H2Os/Methanol 10 min 4. Antigendemaskierung mit EDTA 15 min 5. In Tris-buffered-saline TBS pH 7,6 spülen 5 min 6. Inkubation mir primärem Antikörper 7. In optimaler Verdünnung 30 min 8. In TBS spülen 5 min 9. Inkubation mit biotinyliertem 38 Sekundär-AK Kaninchen-Anti-Maus 10. In TBS spülen 15 min 5 min 11. Inkubation mit an alkalische Phosphatase konjugiertes Streptavidin 15 min 12. In TBS spülen 5 min 13. Inkubation mit Fast Red-Chromogen Red 10 min 14. In Aqua dest spülen 15. Gegenfärbung mit Hämatoxylin 2 min 16. Entwässern über aufsteigende Alkoholreihe, klären und eindecken 3.2.7.9 Negativ- und Positivkontrollen Als Positivkontrollen wurden Proben von kolorektalen Adenokarzinomen verwendet. In den Negativkontrollen wurde der primäre Antikörper weggelassen, um sicher zu stellen, dass es sich bei der Färbung über den sekundären Antikörper tatsächlich um eine spezifische Reaktion handelt. 3.2.8 Bewertung der Färbeeigenschaften Für die weitere Auswertung wurden alle bisher erhobenen Eigenschaften der Adenome nach einzelnen Patienten geordnet in das Computerprogramm SPSS übertragen. Alle folgenden Berechnungen wurden dann in SPSS durchgeführt. 3.2.8.1 ß-Catenin Als indirekter Nachweis einer Wnt/ß-Catenin Signalwegaktivierung kann eine erhöhte ß-Cateninkonzentration in Zytoplasma als verstärkte zytoplasmatische Expression und eine nukleäre Färbung als Hinweis für Signalaktiviät im Kern gesehen werden [13, 58]. Die Intensität der Färbung sowie deren Lokalisation wurden in zwei unterschiedliche Abstufungsgrade eingeteilt. In Grad I beschränkte sich die schwache Färbung hauptsächlich auf die Zellmembran, in Grad II ließ sich hauptsächlich eine zytoplasmatische Färbung nachweisen. Die prozentualen Anteile der Färbung am Gesamtadenom wurden ebenfalls erhoben. Schließlich wurde der prozentuale Anteil der Zellen geschätzt, deren Zellkern stark angefärbt war. 39 Für die Berechnungen wurden drei Gruppen gebildet, um die Färbeintensität für ß-Catenin zu klassifizieren. Zuerst wurden die Färbeeigenschaften der Zellkerne betrachtet. Da gerade im Bereich von einigen wenigen Prozentpunkten mögliche Färbefehler besonders ins Gewicht fallen würden, schien es sinnvoll, nur darüber zu entscheiden, ob überhaupt eine nukleäre Färbung zu finden wäre oder nicht. Aus Gründen zu geringer Spezifität wurden Färbungen unter fünf Prozent mit einem negativen Ergebnis gleichgesetzt. So ergaben sich drei Gruppen: Die erste (I) umfasst Adenome mit membranständiger Färbung (entspricht der Färbung normaler Darmschleimhaut), Gruppe II solche mit zytoplasmatischer Färbung ohne nennenswerte Kernfärbung und Gruppe III enthält nur Adenome mit zytoplasmatischer Färbung, sowie einer nukleären Färbung mit einem Anteil am Gesamtadenom über 4 Prozent. Tabelle 9: Berechnung für Gruppeneinteilung ß-Catenin Intensität der Färbung und Lokalisation Kernfärbung Gruppe ja (2) / nein (1) I 1 I II 1 II II 2 III Membranständige Färbung (I) Zytoplasmatische Färbung plus Starke zytoplamatische Färbung mit nukleäre Färbung 4% (II) Kernfärbung (III) Abbildung 5: ß-Cateninfärbung 3.2.8.2 Cox-2 Eine signifikante Zunahme der Färbungsintensität für Cox-2 konnte bei Kolonadenomen im Vergleich zu normaler Mukosa nachgewiesen werden [17]. Für die Auswertung der Cox-2 Färbung wurde die Intensität der zytoplasmatischen Färbung in drei Kategorien eingeteilt. Erstens gar keine 40 Anfärbung (0), zweitens leichte bis mittlere Anfärbung (1), sowie drittens starke zytoplasmatische Anfärbung (2). Außerdem wird der Anteil der am Gesamtadenom gefärbten Teile in Prozent angegeben. Aus diesen beiden Werten wurde für jedes Adenom ein Faktor berechnet, der sich aus dem Anteil der Färbung, multipliziert mit der Intensität, ergab und noch einmal durch 100 dividiert wurde. Aus diesen Ergebnissen wurden zwei Gruppen gebildet. Die erste Gruppe umfasst alle Werte von 0 bis 0,09, da sich in dieser Gruppe nur solche Präparate befinden, die entweder gar keine oder eine Färbung unter 10 Prozent vom Gesamtadenom aufweisen, was als wenig spezifisch angesehen werden muss. Der Gruppe II wurden alle übrigen Werte zugeteilt. Trotzdem konnten, wie unten deutlich sichtbar, Unterschiede in der Stärke der Anfärbung erkennbar werden. Keine Färbung (I) Schwache zytoplasmatische Starke zytoplamatische Färbung (II) Färbung (II) Abbildung 6: Cox-2-Färbung 3.2.8.3 p53 37 Prozent der Adenome und 65 Prozent der Karzinome expremierten p53 [68]. Für die Auswertung der Färbung mit Antikörpern gegen p53 wurde die nukleäre Färbung der Adenomzellen berücksichtigt. Dabei wurde festgestellt, welcher prozentuale Anteil des Gesamtadenoms eine Kernfärbung aufwies. In den Adenomen zeigten sich immer wieder Bereiche, die in Gruppen angeordnet waren und eine starke nukleäre Färbung aufwiesen, in Nachbarschaft zu solchen Zellkernen, die gar nicht angefärbt waren. 41 Keine Färbung (I) Ein Teil der Nuklei gefärbt, anderer Intensive nukleäre Teil nicht (II) Färbung (III) Abbildung 7: p53-Färbung Um auch hier Gruppen bilden zu können, die in einem späteren routinemäßigen Einsatz von Bedeutung sind, wurden die Präparate folgendermaßen sortiert: keine Kernfärbung; Kernfärbung mit einen Anteil am Gesamtadenom bis 49 Prozent; alle Adenome in denen 50 Prozent und mehr der Zellkerne gefärbt sind. Eine andere Möglichkeit der Auswertung ergibt sich, wenn man die p53 Färbung in nur zwei Kategorien einteilt: normal (negativ) oder überexprimiert (pathologisch). 3.2.9 Statistische Methoden 3.2.9.1 Zuordnung der Eigenschaften für jedes Adenom Mit der Software von SPSS wurde eine Tabelle angelegt, in der jedem der untersuchten Adenome eine Zeile zugeordnet wurde. In den Spalten tauchten dann folgende Parameter auf: - Allgemeine Kriterien wie das Alter, Geschlecht der Patienten und Medikation. - Kriterien zu den Adenomen: Anzahl bei erster und zweiter Untersuchung, Stratum 1 oder 2. Histologische Kriterien wie Größe kleiner oder größer 1 cm, Art des Adenoms (tubulös, tubulovillös, villös oder serrated Adenoma), Grad der intraepithelialen Neoplasie. - In den weiteren Spalten befanden sich die Eigenschaften, die sich bei den spezifischen Antikörperfärbungen mit ß-Catenin, Cox-2 und p53 ergeben haben. Dabei wurde allen Eigenschaften ein Zahlenwert zugeordnet, mit dem schließlich die Berechnungen durchgeführt werden konnten. 42 3.2.9.2 Berechnungen zur Charakterisierung des Patientenkollektivs und der Adenome Die folgenden Berechnungen wurden mit den Funktionen des Programms SPSS durchgeführt: Um die Fragestellung zu klären, ob es ein Adenomrezidiv gab, wurden die Patienten in solche mit und ohne Adenomrezidiv eingeteilt. Ebenfalls wurde auf diese Weise aus den einzelnen Adenomcharakteristika Größe, villöser Anteil und Grad der intraepithelialen Neoplasie der Paramter Fortgeschrittenes Adenom ja oder nein gebildet. Anschließend wurden die Häufigkeiten der einzelnen Adenome wie tubulär, tubulovillös, villös, serratiert, hyperplastisch und normale Schleimhaut bestimmt, außerdem die Häufigkeiten von niedriggradigen intraepithalialen Neoplasien (NGIEN) und HGIEN und wie viele Patienten ein Placebo oder die echte Medikation erhalten hatten. Auf diesem Wege konnte ebenfalls die Anzahl der weiblichen und männlichen Patienten bestimmt werden. Weiterhin wurde das Durschnittsalter, sowie das Alter des ältesten und jüngsten Patienten bestimmt. Auch die durchschnittliche sowie die maximale Anzahl der Adenome wurden ermittelt. Für alle genannten Parameter wurde außerdem der prozentuale Anteil der Merkmalsausprägung ermittelt. Die Häufigkeit eines Adenomrezidivs und die gleichzeitige Betrachtung, ob es sich dabei um ein fortgeschrittenes Adenom handelt, ließ sich über die Funktion Kreuztabellen in SPSS ermitteln. Um die einzelnen Adenome noch genauer zu klassifieren, wurde die Möglichkeit mit den Kreuztabellen auch für die Betrachtung mehrerer histologischer Kritererien zueinander angewendet, wie etwa Grad der intraepithelialen Neoplasie in Bezug zur Art des Adenoms. 3.2.9.3 Darstellung eines Zusammenhanges zwischen den klinischen der einzelnen Parametern und dem Färbeverhalten mit SPSS Zuerst wurden die verschiedenen Häufigkeiten Anfärbbarkeitsgruppen von ß-Catenin, Cox-2 und p52 bestimmt. Über den Weg der Kreuztabellen konnten die Parameter Größe, villöser Anteil und Grad der Dysplasie in ihrer Häufigkeitsverteilung im Vergleich zu den Häufigkeiten der 43 unterschiedlichen Anfärbbarkeitsgruppen von ß-Catenin, Cox-2 und p53 betrachtet werden. Ob ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen dem Färbeverhalten und den histologischen Kriterien besteht, konnte über den Chiquadrattest berechnet werden. 3.2.9.4 Chiquadrattest Der Chiquadrattest dient dazu, die Häufigkeit eines Merkmals in zwei stochastisch unabhängigen Gruppen zu vergleichen und zugleich die Frage nach der Signifikanz des Testes zu beantworten. In der Medizin wird ein Vergleich zwischen beiden Stichproben meistens dann als wesentlich anerkannt, wenn die Wahrscheinlichkeit (p) für einen Zufallsbefund kleiner oder gleich fünf Prozent ist. Diese Anforderung wurde auch in der vorliegenden Arbeit berücksichtigt. Der Test wurde mit dem Programm SPSS durchgeführt. 3.2.9.5 Korrelationsberechnung zwischen Rezidivhäufigkeit, demographischen, klinischen und pathologischen Parametern und dem Färbeverhalten mit SPSS Wie im vorangegangen Abschnitt erwähnt, lässt sich die dort beschriebene Vorgehensweise auch anwenden, um eine mögliche Korrelation zwischen Rezidivhäufigkeit, demographischen, klinischen und pathologischen Parametern und dem Färbeverhalten darzustellen. Berechnet wurde außerdem das Odds Ratio/Quotenverhältnis, das ein Maß dafür ist, um wie viel größer die Chance zu erkranken in der Gruppe mit Risikofaktor ist, verglichen mit der Gruppe ohne Risikofaktor. In der folgenden Tabelle wird die Struktur der Berechnung noch einmal deutlich. Die Berechnung der Odds Ratio erfolgt nach folgender Formel: Odds Ratio Anzahl der richtig Positiven Anzahl der falsch Positiven Anzahl der falsch Negativen Anzahl der richtig Negativen 44 (1) Dabei ergeben sich Werte zwischen eins und unendlich. Für jeden Wert größer 1 ist das Risiko erneut ein Rezidiv aufzuweisen größer als in der Gruppe ohne Risikofaktor. 3.2.9.6 ROC-Kurven für Cox-2 und p53 Bei der Betrachtung von ROC-Kurven geht man davon aus, dass es für eine bestimmte Erkrankung bei einem Test einen Grenzwert gibt. Ab diesem Wert ist der Test als positiv (Rezidiv zu erwarten) bzw. negativ (kein Rezidiv zu erwarten) zu betrachten. Zur Berechnung der ROC-Kurve muss man theoretisch für jeden beliebigen Grenzwert Sensitivität und Spezifität über die Vier-Felder-Tafel berechnen. In die ROC-Kurven werden dann die Wertepaare von Spezifität und Sensitivität aufgetragen. Hierbei ist zu beachten, dass die Spezifität als 1-Spezifität aufgetragen wird. Ein Test weist Trennschärfe auf, wenn sich die Kurve signifikant von der Diagonalen (links unten rechts oben) unterscheidet. Je größer also der Abstand der Kurve von der Diagonalen, desto besser ist der Test. Ein Maß für die Güte des Tests ist die Fläche unter der Kurve. Sie kann Werte zwischen 0,5 und 1 annehmen, wobei ein höherer Wert eine bessere Güte anzeigt. Die Berechnungen übernahm das Programm SPSS. So wurden die Sensitivität und Spezifität für einzelne Prozentwerte der Cox-2 gefärbten Zellen und p53 positiven nukleären Färbung ermittelt und in einer Tabelle und einem Diagramm dagestellt. 3.2.9.7 Multivariate Betrachtung aller drei Parameter Zur Betrachtung aller drei Merkmale gleichzeitig und dem Bezug zur Rezidivhäufigkeit mussten zuerst, die Endvariablen in Variablen mit Null oder Eins umgewandelt werden. Mit diesem neuen Paramter konnte dann wieder über die Funktion Kreuztabellen ein Zusammenhang zwischen Rezidivhäufigkeit und dem Vorkomme mindestens einer positiven Variablen berechnet werden. Bei der gleichzeitigen Betrachtung aller drei Färbeeigenschaften scheint es sinnvoll, auch die Sensitivität und Spezifität dieser neuen Parameter in die Beurteilung mit einzubeziehen. Dabei bedeutet die Sensitivität (auch Richtigpositiv-Rate) den Anteil der richtig positiv erkannten Sachverhalte (in diesem Fall mindestens ein Parameter 45 positiv) an der Gesamtheit der in Wirklichkeit positiven Sachverhalte (Rezidiv gefunden) an. Die Spezifität (auch Richtignegativ-Rate) bezeichnet die Wahrscheinlichkeit, einen tatsächlich negativen Sachverhalt auch durch ein negatives Testergebnis zu erkennen. Der positive prädiktive Wert eines statistischen Tests gibt die Wahrscheinlichkeit an, dass ein positives Test-Ergebnis auch tatsächlich auf einem positiven Ergebnis beruht. Analog dazu bezeichnet der negative prädiktive Wert die Wahrscheinlichkeit, dass bei einem negativen Testergebnis kein Rezidiv auftreten wird. Sensitivität, Spezifität, positiver und negativer prädiktiver Wert können mit folgenden Formeln bestimmt werden: Sensitivität Anzahl der richtig Positiven Anzahl der Patienten, die ein Rezidiv bekamen Spezifität (2) Anzahl der richtig Negativen Anzahl der Patienten, die nicht erkranken werden Spezifität werden Anzahl der richtig Negativen Anzahl der Patienten, die kein Rezidiv bekamen Spezifität Positiver prädiktiver Wert prädiktiver Wert Anzahl der richtig Negativen Anzahl der Patienten, die nicht erkranken werden werden Anzahl der richtig Positiven Anzahl der richtig Positiven + Anzahl der falsch Positiven Spezifität Negativer (3) (4) Anzahl der richtig Negativen Anzahl der Patienten, die nicht erkranken werden werden Anzahl der richtig Negativen Anzahl der richtig Negativen + Anzahl der falsch Negativen Spezifität Anzahl der richtig Negativen Anzahl der Patienten, die nicht erkranken werden werden 46 (5) 4 4.1 Ergebnisse Materialsichtung Die in Paraffin eingebetteten Proben waren von wenigen Ausnahmen abgesehen in gutem Zustand. Es wurde koloskopisch gewonnenes Material für 109 Patienten bereitgestellt. Insgesamt waren es 370 unterschiedliche Gewebeproben aus der Darmschleimhaut. Davon waren 260 Proben aus der ersten Koloskopie und 110 Proben aus der drei Jahre später nachfolgenden. Bei einigen Patienten fanden sich mehrere Adenome, allerdings waren auch teilweise Präparate mit gesunder Schleimhaut dabei, sowie hyperplastische Polypen. 4.2 Klassifikation der Adenome Die Präparate wurden zuerst bezüglich ihrer histologischen Merkmale klassifiziert. Dabei zeigte sich, dass sowohl Material von gesunder Schleimhaut, wie auch verschiedene Neoplasien vorhanden waren. Es fanden sich insgesamt 136 tubuläre, 121 tubulovillöse und ein villöses Adenom mit NGIEN. Außerdem sechs tubulovillöse und ein tubuläres Adenom mit HGIEN. Zudem konnten sieben serratierte Adenome, 55 hyperplastische Polypen, und 19 Proben mit normaler Schleimhaut identifiziert werden. Bei den untersuchten Gewebeproben wurde ausschließlich der Adenomanteil, der auf dem Objektträger abgebildet war, für die Auswertung berücksichtigt. Für die Größe der Adenome konnte nur eine Einteilung in größer oder kleiner als 10 mm vorgenommen werden. In die abschließende Auswertung wurden nur solche Adenome miteinbezogen, die in der ersten Untersuchung gefunden worden waren, weil im klinischen Alltag von einer Ausgangssitutation auf die Rezidivwahrscheinlichkeit geschlossen werden soll. Dann wurde von den 260 Proben aus der ersten Koloskopie von jedem Patienten ein Adenom ausgewählt, aufgrund des höchsten Rezidivrisikos und der höchsten Relevanz für die o.g. Fragestellung stets das am weitesten fortgeschrittene Adenom. 4.3 Charakteristika des untersuchten Patientenkollektivs Die in die abschließenden Berechnungen eingehenden Adenome stammen von 78 männlichen und 31 weiblichen Patienten. Das Durchschnittsalter betrug 61,1 47 Jahre, wobei der jüngste Patient 32 Jahre alt war und der älteste 77 Jahre. Im Durchschnitt konnten 2,39 Adenome pro Patient gefunden werden, dabei schwankte aber die Anzahl für den einzelnen Patienten sehr stark, mit Werten zwischen 1 und 12 Adenomen pro Patient. Am häufigsten konnten allerdings mit 43,1 Prozent ein Adenom pro Patient, mit 22,0 Prozent zwei Adenome und mit 15,6 Prozent drei Adenome pro Patient nachgewiesen werden. In der zweiten Koloskopie nach drei Jahren konnten im Durchschnitt 1,23 Adenome pro Patient detektiert werden. Dabei fanden sich bei 21 (37,5%) der Rezidivpatienten ein Adenom, bei 15 (26,8%) zwei Adenome und bei 9 (16,1%) Patienten drei Adenome. Tabelle 10: Adenomhäufigkeiten Kein 1 Adenom 2 Adenome Maximal Adenom Anzahl der Adenome bei 0 (0,0%) Durchschnitt pro Patient: 47 (43,1%) 24 (22,1%) der ersten Untersuchung 12 Adenome 2,39 1 (0,9%) Anzahl der Adenome nach 53 drei Jahren (48,6%) 21 (19,3%) 15 (13,8%) 8 Adenome 1,23 1 (0,9%) In der Nachuntersuchung nach 3 Jahren zeigten 56 Patienten (51,4%) ein Adenomrezidiv, bei 53 Patienten konnte kein erneutes Polypenwachstum festgestellt werden. Bei den 56 Patienten mit Adenomrezidiv war bei 51 (91,1%) in der initialen Koloskopie ein fortgeschrittenes Adenom diagnostiziert worden, von den 53 Patienten ohne Rezidiv wiesen in der Erstuntersuchung 44 (83,0%) ein fortgeschrittenes Adenom auf. 51 der untersuchten Patienten (46,8%) hatten über den Zeitraum von 3 Jahren eine Placebomedikation erhalten, die restlichen 58 Patienten waren mit 5-ASA behandelt worden. 4.4 Charakteristika der untersuchten Adenome In dem Kollektiv, dessen Daten in die abschließenden Berechnungen einflossen, fanden sich 28 tubuläre Adenome, ein rein villöses Adenom und 78 tubulovillöse Adenome, außerdem zeigten zwei Adenome ein serratiertes Aussehen. 48 Tabelle 11: Histologische Klassifikation der Adenome Häufigkeit Prozent Tubuläre Adenome 28 25,7 Villöse Adenome 1 0,9 Tubulovillöse Adenome 78 71,6 Serratierte Adenome 2 1,8 Gesamt 109 100,0 Insgesamt 102 Adenome zeigten eine niedriggradige intraepitheliale Neoplasie und bei sieben Adenomen fand sich eine hochgradige intraepitheliale Neoplasie. 87 (79,8%) der Adenome waren größer oder gleich 10 mm groß, 22 (20,2%) kleiner als 10mm. Anhand der Parameter Größe über 10 mm, villöser Anteil und HGIEN konnten 95 (87,2%) fortgeschrittene Adenome und 14 (12,8%) nicht fortgeschrittene Adenome klassifiziert werden. Tabelle 12: Zusammenfassende Einteilung der Adenome Grad der intraepithelialen Neoplasie Größe Villöser Anteil Fortgeschrittenes Adenom 4.5 102 (93,6%) 7 (6,4%) NGIEN HGIEN 22 (20,2%) 87 (79,8%) <10mm >10mm 30 (27,5%) 79 (72,5%) nein ja 14 (12,8%) 95 (87,2%) nein ja Zusammenhang zwischen dem Färbeverhalten der untersuchten Adenome und ihren Eigenschaften 4.5.1 ß-Catenin-Färbung Von den insgesamt 109 untersuchten Adenomen wiesen 15 (13,8%) lediglich eine membranständige Färbung (Gruppe I) auf. Es handelte sich dabei um zehn tubuläre (7<10mm, 3>10mm) und fünf tubulovillöse (1<10mm, 4>10mm) Adenome, die alle eine niedriggradige intraepitheliale Neoplasie aufwiesen. Eine zytoplasmatische Färbung ohne wesentliche Kernfärbung (Gruppe II) zeigten 34 (31,2%) Neoplasien, wobei es sieben tubuläre, 26 tubulovillöse, und 1 villöses Adenome mit NHGIEN waren. Bei einem der tubulovillösen Adenome ließ sich eine hochgradige intraepitheliale Neoplasie nachweisen. 49 Tabelle 13: Verteilung ß-Catenin zytoplasmatische Färbung (Gruppe II) < 10mm >10mm Tubuläre Adenome 4 3 Tubulovillöse Adenome 4 Villöse Adenome 0 22 (21 NGIEN, 1 HGIEN) 1 zehn der Adenome mit starker zytoplasmatischer Färbung und nukleärer Färbung über 4 Prozent (Gruppe III) wiesen nur tubuläre Anteile auf, 42 von ihnen waren tubulovillöse Adenome und ein Adenom war serratiert. Von den 53 Adenomen dieser Gruppen fand sich in sechs Fällen eine hochgradige intraepitheliale Neoplasie, die übrigen wiesen eine NGIEN auf. Tabelle 14: Verteilung ß-Catenin starke zytoplasmatische und nukleäre Färbung (Gruppe III) Tubuläre Adenome Tubulovillöse Adenome Villöse Adenome < 10mm >10mm 3 7 (6 NGIEN, 1HGIEN) 3 39 (34 NGIEN, 5 HGIEN) 0 1 Zur Vereinfachung der Auswertung wurden die bisherigen Gruppen 1 und 2 zu einer Gruppe zusammengefasst und der Gruppe III gegenübergestellt. Man nimmt an, dass nur nukleäres ß-Catenin zu einer Aktivierung des WntSignalwegs mit transkriptionelller Aktivität führt. Für diese Einteilung ergeben sich folgende Werte: Abbildung 8: Häufigkeitsverteilung ß-Catenin 2 Gruppen 50 4.5.2 Cox-2-Färbung Es ergibt sich folgende Häufigkeitsverteilung: 40 I II H Ä 30 U F I G 20 K E I T 10 0 ,00 ,01 ,02 ,03 ,04 ,05 ,08 ,10 ,12 ,13 ,15 ,20 ,25 ,26 ,30 ,35 ,40 ,45 ,50 ,60 ,70 ,85 1,00 1,20 1,30 Intensität der Färbung mal Prozentanteil Abbildung 9: Häufigkeitsverteilung Produkt Cox-2 Für die im Abschnitt 3.2.7.2 definierten Gruppen ergaben sich folgende Ergebnisse. Die erste Gruppe (0-0,09), deren Adenome entweder keine oder eine Anfärbung von unter 10 Prozent der Zellen aufwiesen, befanden sich 57 (52,3%) Proben. Von ihnen fanden sich bei 21 (13<10mm, 8>10mm) nur tubuläre Anteile, 35 (4<10mm, 31>10mm) waren tubulovillöse Adenome und eins war ein serratiertes Adenom. Zwei der tubulovillösen Adenome wiesen eine hochgradige intraepitheliale Neoplasie auf. In die zweite Gruppe (>0,09) wurden alle 52 (47,7%) anderen Adenome eingeteilt, die eine Färbung von über 10 Prozent des Gesamtadenoms aufwiesen. Hier fanden sich sieben tubuläre, 33 tubulovillöse Adenome, ein villöses und ein serratiertes Adenom, die bis auf ein tubuläres und vier tubulovillöse Adenome alle größer oder gleich 10mm waren. Dabei wiesen ein tubuläres und vier tubulovillöse Adenome eine HGIEN auf. 51 Tabelle 15: Verteilung Gruppe II Cox-2-Färbung < 10mm >10mm 6 Tubuläre Adenome 1 Tubulovillöse Adenome 4 Villöse Adenome 0 1 Serratierte Adenome 0 1 (5NGIEN,1HGIEN) 39 (35NGIEN), 4 HGIEN) 4.5.3 p53-Färbung Nach der in Abschnitt 3.2.7.3 definierten Gruppeneinteilung ergab sich für p53 unter Berücksichtigung des nukleären Färbeverhaltens folgende Verteilung: I II III Abbildung 10: Verteilung nukleäre Färbung p53 Im Durchschnitt wiesen 42,0 Prozent der Zellkerne eine Färbung auf. Bildet man drei Gruppen, wie oben bereits erwähnt, ergibt sich folgende Verteilung: Gruppe I: Keine Reaktion mit dem verwendeten p53 AK zeigten zehn (9,2%) der Adenome. Dabei handelte es sich um sieben (5<10mm, 2 >10mm) tubuläre und 3 (1<10mm, 2>10mm) tubulovillöse Adenome. In der Gruppe II, deren Zellkerne zu unter 50 Prozent gefärbt waren, befanden sich 49 (45%) Adenome, insgesamt neun (5<10mm, 4>10mm) tubuläre, 39 (3<10mm, 36>10mm) tubulovillöse und ein serratiertes Adenom. Von den tubulovillösen wies ein Adenom eine HGIEN auf. 52 Tabelle 16: Verteilung p53 unter 50 Prozent Färbung (Gruppe II) < 10mm >10mm Tubuläre Adenome 5 4 Tubulovillöse Adenome 3 Serratierte Adenome 0 36 (35 NGIEN), 1 HGIEN) 1 Eine positive Expression von p53 in über 50 Prozent der Zellkerne (Gruppe III) zeigten 50 (45,9%) der Adenome. Es fanden sich 12 (4<10mm, 8>10mm) tubuläre und 36 (4<10mm, 32>10mm) tubulovillöse Adenome und sowohl ein villöses wie auch ein serratiertes Adenom mit NGIEN. Ein tubuläres und fünf tubulovillöse Adenome wiesen eine HGIEN auf. Tabelle 17: Verteilung p53 über 50 Prozent nukleäre Färbung (Gruppe III) < 10mm 4.6 >10mm 8 Tubuläre Adenome 4 Tubulovillöse Adenome 4 Villöse Adenome 0 1 serratierte Adenome 0 1 (7 NHGIEN, 1HGIEN) 32 (27 NGIEN), 5 HGIEN) Demographische, klinische und pathologische Parameter mit Bezug zur Rezidivhäufigkeit - Etablierte Rezidivmarker 4.6.1 Alter Die Patienten, die ein erneutes Adenomwachstum aufwiesen, waren im Durchschnitt 61,4 Jahre, wohingegen die Patienten, die kein Rezidiv bekamen, im Durchschnitt 60,9 Jahre alt waren. 4.6.2 Geschlecht Ein Trend, für einen Zusammenhang zwischen Rezidivhäufigkeit und dem Geschlecht der Patienten besteht, kann in dieser Untersuchung festgestellt werden, da 36 (46,2%) männliche und 17 (54,8%) weibliche Patienten keine erneuten Adenome bekamen, wohingegen 42 männliche und 14 weibliche Personen ein erneutes Polypenwachstum zeigten (p=0,413). 53 4.6.3 Medikation Da die untersuchten Proben von Patienten stammen, die an der GAPP-Studie teilgenommen hatten, wurde etwa der Hälfe von ihnen im Untersuchungszeitraum eine Medikation mit 5-ASA verabreicht. Von den 51 Patienten, die ein Placebopräparat erhielten, zeigten 23 (45,1%) erneutes Adenomwachstum, bei der 5-ASA Gruppe waren es 33 (56,9%) von insgesamt 58 Patienten. Es konnte demnach kein Zusammenhang mit einem weniger häufigen Auftreten eines Rezidivs für die mit 5-ASA behandelten Patienten nachgewiesen werden (p=0,219). 4.6.4 Morphologie der Adenome Bei den Adenomen, die kleiner als 10mm waren, fand sich bei zwölf Patienten ein Rezidiv (45,5%), bei zehn (54,5%) von ihnen nicht. In der Kategorie 10mm und mehr, wiesen 46 Patienten einRezidiv auf, bei den 41 übrigen fanden sich nach drei Jahren keine erneuten Adenome. Hier ergibt sich ein p-Wert von 0,534. Von den 30 Adenomträgern ohne villösen Anteil im Adenom, wurde bei 16 (= 53,3%) ein Rezidiv detektiert und 14 Patienten (46,7 %) zeigten kein erneutes Adenomwachstum. Bei den 79 Patienten mit villösem Anteil im Adenom, wurde in 40 Fällen (50,6%) ein Adenom nachgewiesen, die übrigen 39 Fälle (49,4 %) zeigten kein Rezidiv. Von den 94 Adenomträgern mit fortgeschrittenen Adenomen zeigte sich bei 50 (53,2%) ein Adenomrezidiv, bei den übrigen 44 (46,8 %) konnte kein erneutes Adenomwachstum festgestellt werden. Es konnte folglich für die Adenomgröße (p=0,534) die Unterscheidung in villöser Anteil ja oder nein (p=0,801) und die Einteilung in fortgeschrittene und nicht fortgeschrittene Adenome (p=0,222) kein signifikanter Zusammenhang mit einem Adenomrezidiv festgestellt werden. 4.6.5 Anzahl der Adenome Die Anzahl der Adenome, die bei der ersten Untersuchung gefunden wurden, korreliert mit dem Wiederauftreten eines Adenoms bei der zweiten Untersuchung nach drei Jahren. Für diese Berechnung waren zwei Gruppen gebildet worden. In der einen befinden sich alle Patienten mit einem oder zwei Adenomen, in der anderen mit drei oder mehr Adenomen. Es zeigt sich, dass 54 nur bei 29 (40,8%) der 71 Patienten mit bis zu zwei Adenomen ein erneutes Adenom nachgewiesen wurde, während 27 (71,1%) der 38 Patienten mit drei oder mehr Adenomen ein Rezidiv bekamen. Dieser Zusammenhang war hoch signifikant (p=0,003). Tabelle 18: Anzahl der Adenome bei der ersten Untersuchung und Rezidivhäufigkeit Bis zu 2 Adenome 3 oder mehr Adenome Gesamt Anzahl der Patienten ohne Rezidiv 42 11 53 Anzahl der Patienten mit Rezidiv 29 27 56 Gesamt 71 38 109 Tabelle 19: Zusammenfassung der einzelnen Parameter und ihr Bezug zur Rezidivhäufigkeit Kein Rezidiv Rezidiv nach 3 Jahren PWerte Alter 60,9 Jahre 61,4 Jahre --- Geschlecht 36 (46,2%) männliche/ 17 42 (53,8%) männliche/ 0,413 (54,8%) weibliche 14 (45,2%) weibliche 28 (61,4%) Placebo 23 (39,6%) Placebo/ 25 (44,1%) 5-ASA 33 (56,9%) 5-ASA 10 (45,5%) < 10mm 12 (54,5%) < 10mm 41 (47,1%) > 10mm 46 (52,9%) > 10mm 14 (46,7%) nein 16 (53,3%) nein 39 (49,4%) ja 40 (50,6%) ja Fortgeschrittenes 9 (64,3%) nein 5 (35,7%) nein Adenom 44 (46,8%) ja 50 (53,4%) ja Anzahl 42 (59,2%) < 3 Adenome 29 (40,8%) < 3 Adenome 11 (28,9%) 3 Adenome 27 (71,1%) 3 Adenome Medikation Größe Villöser Anteil 4.7 0,219 0,534 0,801 0,222 0,003 Zusammenhang zwischen der ß-Catenin-Expression und der Art des Adenoms Die folgenden Ergebnisse gehen von einer Einteilung der ß- Cateninfärbeeigenschaften in drei Gruppen aus. So besteht ein Zusammenhang mit einem p-Wert von < 0,001 zwischen dem Färbeverhalten und der Eigenschaft, ob es sich um ein fortgeschrittenes Adenom handelt oder nicht. So zeigen acht der fortgeschrittenen Adenome und 55 sieben der einfachen Adenome membranständige Färbung (Gruppe I), 30 der fortgeschrittenen und vier der einfachen Adenome zytoplasmatische Färbung ohne nennenswerte Kernfärbung (Gruppe II) und bei 57 der fortgeschrittenen Adenome fand sich membranständige Färbung und ebenfalls nukleäre Färbung, wohingegen nur drei einfache Adenome diese Färbeeigenschaften aufwiesen. (Gruppe III). 60 50 membranständige Färbung zytoplasmatische Färbung; 4 % Kernfärbung 40 zytoplasmatische Färbung; Kernfärbung > 4 % 30 p < 0,001 20 10 0 kein advanced adenoma fortgeschrittene Adenome Abbildung 11: Zusammenhang zwischen fortgeschrittenen Adenomen und Färbeeigenschaften mit ß-Catenin Im Folgenden werden die Variablen wie „villöser Anteil“, „Größe“ und „Grad der Dysplasie“ einzeln betrachtet, da sie ja die Grundlage für die Einteilung in fortgeschrittene und einfache Adenome darstellen. Eine signifikante Korrelation mit einem p=0,001 besteht ebenfalls zwischen der Größe der Adenome und dem Färbeverhalten. 87 der Adenome sind größer als oder gleich 10mm groß, 22 sind kleiner. Von den großen weisen im Verhältnis deutlich mehr 54 (60,1%) eine nukleäre Färbung auf (Gruppe III) als die kleineren Adenome, dort sind es nur 6 (27,3%). Bei 26 (29,8%) der großen Adenome zeigt sich eine zytoplasmatische Färbung (Gruppe II), acht (36,4%) der kleinen Adenome zeigen dieses Verhalten ebenfalls. In der Gruppe I (membranständige Färbung) befinden sich sieben (8,0%) große und acht (36,4%) kleine Adenome. 56 60 50 Membranständige Färbung 40 Zytoplasmatische Färbung; 4 % Kernfärbung 30 Zytoplasmatische Färbung; > 4% Kernfärbung 20 p=0,001 10 0 10 mm < 10 mm Abbildung 12: Zusammenhang zwischen Größe und Färbeeigenschaften mit ß-Catenin Bewertet man ausschließlich, ob in einem Adenom ein villöser Anteil vorhanden ist oder nicht, zeigt sich, dass in Gruppe I (membranständige Färbung) fünf (6,3%) Adenome einen villösen Anteil aufweisen und zehn (33,3%) von ihnen nicht. In der zweiten Gruppe befinden sich 27 (34,2%) Adenome mit und sieben (23,4) ohne villösen Anteil, in der dritten Gruppe sind es 47 (59,5%) villöse und 13 (43,3%) nicht villöse Adenome. Insgesamt findet sich in 79 Adenomen ein villöser Anteil. Das bedeutet im Chiquadrattest ein p=0,001. 50 Membranständige Färbung 40 30 Zytoplasmatische Färbung; 4% Kernfärbung Zytoplasmatische Färbung, > 4% Kerenfärbung p=0,001 20 10 0 Keine villösen Anteile Villöse Anteile Abbildung 13: Zusammenhang zwischen ß-Catenin Färbung und villösem Anteil der Adenome 4.8 Zusammenhang zwischen der Cox-2-Expression un der Art des Adenoms Mit einem p=0,001 im Chiquadrattest ergab sich ebenfalls ein signifikanter Zusammenhang zwischen der Cox-2-Expression und der Frage, ob es sich um ein fortgeschrittenes Adenom handelt oder nicht. So weist nur ein (7,1%) einfaches Adenom eine erhöhte Anfärbung mit Cox-2 auf (Gruppe II), wohingegen 13 (92,9%) Adenome keine bzw. eine sehr schwache Cox-2 Anfärbbarkeit zeigen (Gruppe I). Von den 95 fortgeschrittenen Adenomen lassen sich 44 (46,3%) Gruppe I zuweisen und 55 (53,7%) Gruppe II. 57 60 < 10% des Adenoms gefärbt 10% des Adenoms gefärbt 50 40 p=0,001 30 20 10 0 Einfache Adenome Fortgeschrittene Adenome Abbildung 14: Zusammenhang zwischen Cox-2-Expression und einem fortgeschrittenem Adenom Betrachtet man ausschließlich die Größe der Adenome in Bezug zu ihrer Cox-2Expression, so zeigt sich, dass 17, der 22 Adenome die kleiner als 10 mm sind, in die Gruppe I fallen und fünf in die Gruppe II. Von den großen Adenomen passen 40 in Gruppe I und 47 in Gruppe II. Es ergibt sich in diesem Fall ein pWert von 0,009. 50 < 10% des Adenoms gefärbt 40 10% des 30 gefärbt Adenoms p=0,009 20 10 0 10 mm < 10 mm Abbildung 15: Zusammenhang zwischen Cox-2-Expression und der Größe des Adenoms Auch bei der Einteilung der Adenome in solche mit einem villösem Anteil und solche mit nichtvillösem Anteil zeigt sich ein Zusammenhang mit dem Cox-2Färbeverhalten mit einem p=0,007. So befinden sich von den Adenomen ohne villösen Anteil 22 (73,3%) in Gruppe I und acht (26,7%) in Gruppe II. Von den insgesamt 79 Adenomen mit villösen Anteil sind es in Gruppe I 35 (44,3%) und in Gruppe II 44 (55,7%). 50 < 10% des Adenoms gefärbt 10% des Adenoms 40 30 gefärbt p=0,007 20 10 0 Keine villösen Anteile Vllöse Anteile Abbildung 16: Zusammenhang zwischen Cox-2-Expression und dem villösem Anteil des Adenoms 58 4.9 Zusammenhang zwischen der p53-Expression und der Art des Adenoms Es besteht ein Zusammenhang (p=0,001) zwischen der Häufigkeit der p53 positiven Zellkerne und der Frage, ob es sich bei dem untersuchten Präparat um ein fortgeschrittenes Adenom handelt oder nicht. Insgesamt waren 95 der untersuchten Adenome als fortgeschritten einzustufen. Nur fünf (5,3%) der fortgeschrittenen Adenome wiesen keine nukleäre Färbung auf. Bei 44 (46,3%) der Adenome konnte eine Färbung bis 49 Prozent gefunden werden und bei 46 (48,4 %) Adenomen lag eine stärkere Anfärbung über 50 Prozent vor. Die 14 einfachen Adenome stellen eine so kleine Anzahl da, dass sich hier eine weitere Aufschlüsselung als wenig aussagekräftig darstellt. 50 keine Färbung 40 49 % > 50 % 30 P= 0,001 20 10 0 einfache Adenome fortgeschrittene Adenome Abbildung 17: Zusammenhang zwischen p53-Expression und einem fortgeschrittenen Adenomen Als ein Punkt der das Adenom in die Kategorie „fortgeschritten“ eingliedert, gilt die Größe. Auch in dieser Untergruppe fällt auf, dass Adenome, die größer oder gleich 10mm sind, eher eine stärkere p53 positive Färbung aufweisen als die kleineren. So wiesen nur vier (4,6%) von 87 Adenome, die größer als 10mm waren keine Färbung auf, während es in der anderen Gruppe sechs (27,3%) von 22 waren. In der Gruppe mit 50 Prozent und mehr Kernfärbung waren es 42 (48,3%) Adenome im Vergleich zu acht (36,4%) Adenomen, die kleiner als 10mm waren. Der Chiquadrattest ergab hier ein p=0,004. 59 50 Keine Färbung 49 % 40 50 % 30 P=0,004 20 10 0 10 mm < 10 mm Abbildung 18: Zusammenhang zwischen p53-Expression und Größe des Adenoms Ein anderer Punkt ist die Einteilung der Adenome in solche mit villösem Anteil und solche ohne. Hier lässt sich ebenfalls ein Zusammenhang zwischen der Stärke der p53 positiven nukleären Färbung und der Kategorie villöser Anteil herstellen. So wiesen 3 (3,8%) der 79 Adenome, in denen ein villöser Anteil zu finden war, keine Anfärbung mit p53 auf, 39 (49,4%) von ihnen eine Anfärbung von unter 49 Prozent der Zellkerne und 37 (46,8%) eine Anfärbung der Zellkerne in 50 Prozent der Fälle und mehr. Zusammen mit den 30 Adenomen, die keinen villösen Anteil aufweisen, ergibt sich ein p=0,006. 40 Keine Färbung 49 % 30 > 50 % p=0,006 20 10 5 Keine villösen Anteile Villöse Anteile Abbildung 19: Zusammenhang zwischen p53-Expression und villösen Anteilen des Adenoms 60 4.10 Zusammenfassung für ß-Catenin, Cox-2 und p53 in Bezug zur Art des Adenoms Zusammenfassend ergeben sich für ß-Catenin, Cox-2 und p53 folgende Werte: 60 kein villöser Anteil 50 villöser Anteil 40 30 20 10 0 ß-Catenin ≤ 4% ß-Catenin > 4% Cox-2 < 10 % Kernfärbung Kernfärbung des Adenoms gefärbt Cox-2 ≥ 10 % des Adenoms gefärbt p53 < 40 % der Zellkerne gefärbt p53 ≥ 40 der Zellkerne gefärbt Tabelle 20: Zusammenfassung des Färbeverhaltens aller drei Parameter in Bezug zum villösen Anteil eines Adenoms 60 Adenom < 10 mm 50 Adenom ≥ 10 mm 40 30 20 10 0 ß-Catenin ? 4% Kernfärbung ß-Catenin > 4% Kernfärbung Cox-2 < 10 % des Adenoms gefärbt ?10 % Cox-2 des Adenoms gefärbt p53 < 40 % der Zellkerne gefärbt p53 ? 40 der Zellkerne gefärbt Tabelle 21: Zusammenfassung des Färbeverhalten aller drei Parameter in Bezug zur Größe des Adenoms 4.11 Zusammenhang zwischen Rezidivhäufigkeit und ß-Cateninexpression Eine erhöhte ß-Catenin-Konzentration in den Zellen der Adenome geht mit einer erhöhten Rezidivhäufigkeit einher. So hatten in der Gruppe mit ausschließlich membranständiger Färbung acht (53,3%) von 15 Patienten ein Rezidiv, in der zweiten Gruppe mit hauptsächlich zytoplasmatischer Färbung fanden sich neun (26,5%) Rezidive von insgesamt 34 Patienten und in Gruppe 61 III traten bei 39 (65,0%) Patienten erneut Adenome auf. In der Kreuztabelle ergeben sich signifikante Ergebnisse mit einem p=0,002 im Chiquadrattest für diese Gruppeneinteilung. Tabelle 22: ß-Catenin Färbung und Rezidivhäufigkeit (3 Gruppen) Membranständige Färbung (I) Anzahl der Patienten ohne Rezidiv Anzahl der Patienten mit Rezidiv Zytoplasmatische Zytoplasmatische Färbung, nukleäre Färbung 4% (II) Färbung plus nukleäre Färbung > 4% (III) 7 (46,7%) 25 (73,5%) 21 (35,0%) 8 (53,3%) 9 (26,5%) 39 (65,0%) 15 34 60 Gesamtanzahl der Patienten Gesamt 53 (48,6%) 56 (51,4%) 109 Prozentangaben in Klammern beziehen sich auf die Gruppe Nach der differenzierten Betrachtung von ß-Catenin in drei Gruppen wurde für die Rezidivwahrscheinlichkeit auch eine Einteilung in zwei Gruppen vorgenommen. Auch diese Einteilung zeigt signifikante Ergebnisse mit einem p=0,002 im Chiquadrattest. Dabei hatten in der ersten Gruppe, in der ß-Catenin ausschließlich im Zytoplasma vorkommt, 17 (34,7%) von 49 Patienten ein Rezidiv, in der zweiten Gruppe waren es 39 (65,0%) von 60 Patienten. Die Odds ratio lag für diese Gruppeneinteilung bei 3,49. Für diese Gruppeneinteilung ergibt sich eine Sensitivität von 69,6 Prozent und eine Spezifität von 60,4 Prozent. Tabelle 23: ß-Catenin Färbung und Rezidivhäufigkeit (2 Gruppen) Zytoplasmatische Zytoplasmatische Färbung; nukleäre Färbung; nukleäre Färbung 4% Färbung > 4% Anzahl der Patienten ohne Rezidiv Gesamt 32 (65,3%) 21 (35,0%) 53 17 (34,7%) 39 (65,0%) 56 49 60 109 Anzahl der Patienten mit Rezidiv Gesamtanzahl der Patienten Prozentangaben in Klammern beziehen sich auf die Gruppe 62 4.12 Zusammenhang zwischen Rezidivhäufigkeit und Cox-2 Expression Ein deutlicher Zusammenhang zwischen Rezidivhäufigkeit und der Stärke der Cox-2 Expression konnte bei einem p-Wert von 0,001 und einer Odds ratio von 3,53 gezeigt werden. In Gruppe I bekamen 17 (32,7%) der 57 Patienten dieser Gruppe ein Rezidiv, bei den übrigen 36 (63,2%) Patienten konnte kein erneutes Adenomwachstum festgestellt werden. Die Adenome dieser Gruppe wiesen gar keine oder eine Färbung der Zellen in unter 10 Prozent der Fälle auf. Von den 52 Patienten in der Gruppe II, deren Adenome eine Anfärbung von über 10 Prozent der Zellen zeigten, bekamen 36 (67,3%) erneut ein Adenom und 21 (36,8%) der Patienten zeigten kein Rezidiv. Gruppe I Gruppe II p=0,001 OR: 3,53 Patienten ohne Rezidiv Patienten mit Rezidiv Abbildung 20: Zusammenhang zwischen Rezidivhäufigkeit und Cox-2-Expression Tabelle 24: Rezidivhäufigkeit und Cox-2 Expression 0,0-0,09 (I); keine Färbung, bzw. < 10% 0,1-5 (II); Cox-2 gefärbt Gesamt Anzahl der Patienten ohne Rezidiv 36 (63,2%) 17 (32,7%) 53 21 (36,8%) 35 (67,3%) 56 57 52 109 Anzahl der Patienten mit Rezidiv Gesamtanzahl der Patienten Prozentangaben in Klammern beziehen sich auf die Gruppe Wie in Kapitel 3.2.8.6 beschrieben, kann man den prozentualen Anteil der gefärbten Zellen betrachten und dann jeden dieser Werte einzeln in Korrelation zur Rezidivhäufigkeit setzen. So gibt es für die verschiedenen Anteile von gefärbten Zellen je einen Wert für Sensitivität und Spezifität. Daraus kann dann 63 ein Grenzwert festgelegt werden. Ab diesem Punkt wird das Auftreten eines Rezidivs höchst wahrscheinlich. Tabelle 25: Cox-2 Sensitivität und Spezifität Prozentualer Anteil der Sensitivität Spezifität 0,5 78,6 43,4 1,5 76,8 43,4 2,5 75,0 47,2 3,5 71,4 50,9 4,5 69,6 50,9 6,5 64,3 64,2 9,0 62,5 67,9 11,0 55,4 75,5 12,5 55,4 77,4 14,0 53,6 77,4 17,5 42,9 81,1 22,5 30,4 88,7 25,5 28,6 88,7 28,0 26,8 88,7 32,5 19,6 90,6 37,5 14,3 92,5 42,5 12,5 94,3 47,5 12,5 96,2 55,0 7,1 98,1 62,0 5,4 0 67,5 3,6 0 77,5 1,8 0 86,0 0 0 gefärbten Zellen Angaben in Prozent In der ROC-Kurve wird der Anteil der richtig positiven Befunde (Sensitivität) gegen den Anteil falsch positiver Befunde (100 minus Spezifität) aufgetragen. Es ergibt sich für Cox-2 eine Fläche von 0,672 unter der Kurve. Bezugsdiagonale ROC-Kurve Abbildung 21: ROC-Kurve für Cox-2-Färbung 64 4.13 Zusammenhang zwischen Rezidivhäufigkeit und p53 Expression Im Durchschnitt wiesen die Patienten ohne Adenomrezidiv eine geringere nukleäre Färbung der Adenomzellen auf als die Patienten, bei denen erneut eine Neoplasie nachgewiesen werden konnte. So betrug die nukleäre Färbung bei Adenomträgern ohne Rezidiv im Durchschnitt 29,1 Prozent, in der anderen Gruppe waren es 54,2 Prozent. Mit der Einteilung in drei Gruppen ergaben sich folgende signifikante Ergebnisse, die zeigen, dass eine erhöhte p53 Konzentration in den Adenomzellen mit einer erhöhten Wahrscheinlichkeit für ein Rezidiv einhergeht. Der Chiquadrattest ergab hier ein p=0,00. In der Gruppe mit einer nukleären Färbung von p53 in 50 Prozent der Zellen oder mehr zeigten 80 Prozent (40 von 50) der Patienten ein Rezidiv. Tabelle 26: p53 Expression und Rezidivhäufigkeit keine Färbung Färbung bis 49 Prozent Färbung ab 50 Prozent Gesamt Anzahl der Patienten ohne Rezidiv 7 (70,0%) 36 (73,5%) 10 (20,0%) 53 Anzahl der Patienten mit Rezidiv 3 (30,0%) 13 (26,5%) 40 (80,0%) 56 50 109 Gesamt 10 49 Prozentangaben in Klammern beziehen sich auf die Gruppe Für nukleäre Färbung mit p53 ist es aber auch möglich, einen einzigen Grenzwert festzulegen und so nur zwei Gruppen zu bilden. Dies erscheint für die klinische Routine als praktikabler. So ergeben sich folgende signifikante Ergebnisse (p<0,001) bei einer Einteilung der p53 Färbung in Adenome in unter 40 Prozent gefärbter Zellkerne und in über 40 Prozent. Den Grenzwert bei 40 Prozent festzulegen scheint sinnvoll, weil sich so eine besonders hohe Trennschäfe ergibt. Kein Rezidiv bekamen 35 (79,5%) der 44 Patienten, deren Adenome unter 40 Prozent gefärbte Zellkerne aufwiesen und 18 (27,7%) der 65 Patienten mit über 40 Prozent positiver nukleärer Färbung. Nur neun (20,5%) der Patienten mit nukleärer Färbung unter 40 Prozent bekamen ein Adenomrezidiv, im Gegensatz dazu 47 (72,3%) der Patienten mit Färbung von über 40 Prozent der Zellkerne. Die Odds ratio liegt bei dieser Gruppeneinteilung bei 10,15. 65 Tabelle 27: Grenzwert p53 bei 40 Prozent und Rezidivwahrscheinlichkeit 0-40 % p53 > 40 % p53 positive Zellkerne positive Zellkerne Anzahl der Patienten ohne Rezidiv Gesamt 35(79,5%) 18 (27,7%) 53 9 (20,5%) 47(72,3%) 56 44 65 109 Anzahl der Patienten mit Rezidiv Gesamtanzahl der Patienten p<0,001, OR: 10,15 Prozentangaben in Klammern beziehen sich auf die Gruppe Um einen Grenzwert festzulegen, ist es interessant die Sensitivität und Spezifität, die bei den jeweiligen Prozentwerten für das Wiederauftreten eines Adenoms gelten, als Anhaltspunkt zu sehen. Tabelle 28: Sensitivität und Spezifität für p53 Anteil der p53 positiv gefärbten Zellkerne 3,5 Sensitivität Spezifität 94,6 7,68 7,5 94,6 15,1 9,0 94,6 20,8 12,5 94,6 26,4 17,5 92,9 30,2 22,5 89,3 45,3 27,5 83,9 56,6 32,5 83,9 60,4 37,5 83,9 66,0 42,5 73,2 73,6 47,5 71,4 81,1 51,0 60,7 86,8 56,0 58,9 86,8 62,5 37,5 88,7 67,5 32,1 90,6 72,5 17,9 98,1 77,5 12,5 98,1 82,5 0,36 100 86,0 0,0 100 Angaben in Prozent Würde man den Grenzwert jetzt zum Beispiel bei 40 Prozent positiver p53 Färbung der Zellkerne des Adenoms setzen, ergäbe sich eine Sensitivität von ca. 83,4 Prozent das heißt etwa 83 von 100 Patienten, die tatsächlich ein Rezidiv bekommen, würden mit dieser Methode erfasst werden. Die Spezifität läge in diesem Fall bei 66,0 Prozent, was bedeutet, dass etwa 34 Prozent der 66 Patienten fälschlicher Weise in die Kategorie hohes Rezidivrisiko eingestuft würden. In der ROC-Kurve wird der Anteil der richtig positiven Befunde (Sensitivität) gegen den Anteil falsch positiver Befunde (1 minus Spezifität) aufgetragen. Es ergibt sich für p53 eine Fläche von 0,791 unter der Kurve. S E 1,0 N S 0,8 I T 0,6 I V Fläche unter 0,4 der Kurve: 0,79 I T 0,2 Ä T 0,0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1 - SPEZIFITÄT Abbildung 22: ROC-Kurve p53-Färbung 4.14 Zusammenfassung der Färbeeigenschaften in Bezug zur Rezidivhäufigkeit Werden alle drei untersuchten Färbeparameter nur in zwei Gruppen eingeteilt, so dass endweder ein positives oder negatives, also ein möglicherweise als pathologisch beziehungsweise nicht als pathologisch zu betrachtendes Ergebnis vorliegt, ergibt sich folgende Tabelle: Für ß-Catenin wird eine positive nukleäre Färbung als möglicherweise pathologisch angesehen, für Cox-2 gilt dies, wenn mehr als 10 Prozent der Zellen gefärbt sind und bei p53 kann eine Färbung von über 40 Prozent der Zellkerne als möglicher Grenzwert betrachtet werden. Tabelle 29: Zusammenfassung der Färbeeigenschaften in Bezug zur Rezidivhäufigkeit Je Aufteilung Kein Rezidiv in 2 Rezidiv pWerte Gruppen ß-Catenin Cox-2 P53 32 (65,3%) 21 (35,0%) 36 (63,2%) 21 (36,8%) 35 (79,5%) 9 (20,5%) nukleäre Färbung 4% nukleäre Färbung > 4% < 10% der Zellen gefärbt 10% der Zellen gefärbt < 40% der Zellkerne gefärbt/ 40% der Zellkerne gefärbt 67 17 (34,7%) 39 (65,0%) 17 (32,7%) 35 (67,3%) 18 (27,7%) 47 (72,3%) nukleäre Färbung 4% nukleäre Färbung > 4% < 10% der Zellen gefärbt 10% der Zellen gefärbt < 40% der Zellkerne gefärbt/ 40% der Zellkerne gefärbt 0,002 0,001 0,000 Betrachtet man in einer Multivariatanalyse alle drei untersuchten Färbeparameter (ß-Catenin, Cox-2 und p 53) gemeinsam, ergibt sich, dass von den 53 Patienten, die kein Rezidiv bekamen, 23 keinen der untersuchten Parameter positiv aufwiesen. In der Gruppe der Patienten mit Rezidiv zeigten 53 von 56 zumindest einen positiven Befund. Nur drei von diesen Patienten wiesen keinen der untersuchten Parameter als positiv auf. Aus diesen Werten ergibt sich eine Sensitivität von 94,6 Prozent bei drei positiven Parametern mit einer Spezifität von 43,4 Prozent. Der positive prädiktive Wert beträgt 63,8 Prozent, der negative prädiktive Wert 88,5 Prozent. Außerdem ergibt sich ein p<0,001. Tabelle 30: Multivariate Betrachtung der Parameter in Bezug zur Rezidivhäufigkeit Kein Rezidiv Kein positiver Parameter 1-3 positive Parameter Gesamt Rezidiv nach drei Jahren 23 (43,4% Spezifität) 3 53 30 (94,6% Sensitivität) 53 56 26 83 109 Kein positiver Parameter 1-3 positive Parameter Patienten mit Rezidiv Patienten ohne Rezidiv Abbildung 23: Rezidivhäufigkeit bezüglich der drei Parameter ß-Catenin, Cox-2 und p53 68 5 Diskussion Ziel der Arbeit war es besonders für fortgeschrittene Adenome,geeignete Parameter zu indentifizieren, die ein Adenomrezidiv besser vorhersagen als etablierte Marker. Dabei konnten die Färbungen für ß-Catenin, Cox-2 und p53 ein Adenomrezidiv signifikant vorhersagen. Die Kombination der drei Marker ergab einen positiven prädiktiven Wert von 63,8 Prozent und einen negativen prädiktiven Wert von 88,5 Prozent. diskussionswürde Punkte: Zum Im Einzelnen ergaben sich folgende ausgewählten Patientenkollektiv und Studienmaterial, der Medikation, der Qualität der untersuchten Parameter, der unterschiedlichen Gruppeneinteilungen für ß-Catenin und p53, dem Zusammenhang zwischen Rezidivhäufigkeit und Färbeverhalten der einzelnen Parameter, der Vergleich zwischen konventionellen Adenomcharakteristika und den neuen Parametern, die Bedeutung der Ergebnisse für den klinischen Alltag und mögliche Gesundheitsökonomische Vorteile. 5.1 Ausgewähltes Patientenkollektiv und Studienmaterial Die in der GAPP-Studie vorgebene Stratifizierung der Adenome in solche von unter bzw. über drei Adenomen zu übernehmen schien sinnvoll, da in vielen Studien zur Charakterisierung von Adenomen eben diese Einteilung verwendet wurde und Rezidive bei drei oder mehr Adenomen signifikant häufiger sind [81]. Das Material der GAPP-Studie eignet sich besonders, da es aus einer gut kontrollierten und randomisierten Untersuchung stammt. Dies wird heutzutage für Biomarkerstudien gefordert, da so die statistische Verzerrung (bias) minimiert wird. Das für diese Studie ausgewählte Subkollektiv, welches vor allem Adenome mit fortgeschrittener Histologie einschließt, erscheint für diese Fragestellung klinisch relevant, da fortgeschrittene Adenome am häufigsten rezidivieren und eine für diese Adenome individualisierte, spezifischere Nachsorgeempfehlung den größten klinischen und sozioökonomischen Effekt hätte. Betrachtet man bekannte klinische Marker für Rezidive, so korreliert in unserem Kollektiv vor allem der Marker Wiederauftretenswahrscheinlichkeit Anzahl eines der neuen Adenome Adenoms. mit Dieser der in multivariaten Analysen gefundene Marker Anzahl der Adenome gilt bislang als stärkster Parameter für Adenomrezidive, was darauf hinweist, dass unsere 69 Untersuchung als repräsentativ auch für ein größeres Kollektiv angesehen werden kann. Für weitere bislang etablierte Rezidivparameter wie Alter, Geschlecht, Größe oder Histologie konnte eine solche Korrelation in unserem Kollektiv nur eingeschränkt bestätigt werden, auch da nur eine begrenzte Zahl von Patienten zur Verfügung stand. Der Anteil der weiblichen Patienten war mit insgesamt nur 28,4 Prozent gering. Dies allein kann das Ergebnis beeinflussen. Bezüglich des Alters als Risikofaktor für Adenomrezidive war in unserem Kollektiv kein Unterschied zwischen älteren und jüngeren Patienten zu verzeichnen. Patienten, die kein Rezidiv bekamen, waren im Durchschnitt 60,9 Jahre alt, das Alter der Patienten mit Rezidiv betrug im Durchschnitt 61,4 Jahre. Die durchschnittliche Altersdifferenz zwischen den beiden Gruppen betrug also nur ein halbes Jahr. Für die Parameter Größe und villöser Anteil konnte in anderen Studien ebenfalls ein Zusammenhang zwischen Rezidivhäufigkeit und diesen Charakteristika gefunden werden. [40, 81] Für die in der vorliegenden Untersuchung ausgewerteten Adenome konnte dieser Zusammenhang nicht hergestellt werden. Bezüglich der Größe wurde in der oben erwähnten Studie von Martinez et al. als Grenzwert Adenome größer beziehungsweise kleiner als 5mm unterschieden. Dies könnte möglicherweise die Abweichung der beiden Ergebnisse erklären. Ferner ist vor allem die Zahl der Patienten unserer Studie limitiert. Bei den ausgewählten Adenomen handelt es sich fast ausschließlich um fortgeschrittene Adenome. Die gefundenen Ergebnisse beziehen sich folglich auf diese Untergruppe. Dies ist in der Beurteilung der klinischen Relevanz der Ergebnisse zu berücksichtigen. Zwar handelt es sich in diesem Fall um eine Untergruppe der Adenome, doch sind es gerade die fortgeschrittenen Adenome, von denen ein höheres Entartungspotential und Rezidivrisiko ausgeht. [83] Aus diesem Grund ist besonders diese Untergruppe von Relevanz, wenngleich die Ergebnisse natürlich nicht auf die gesamte Gruppe der Adenome ohne Ausnahme übertragen werden können. In fortgeschrittenen Adenomen liegt mindestens eines der Kriterien villöser Anteil, Größe ≥ 1cm oder HGIEN vor, die wie erwähnt mit höherem Malignitäts- und Rezidivrisiko einhergehen. In der vorliegenden Arbeit konnte ein Trend bezüglich der Rezidivwahrscheinlichkeit und dem Vorliegen eines fortgeschrittenen Adenoms 70 gefunden werden. Dabei handelt es sich allerdings nicht um ein signifikantes Ergebnis. Jedoch waren, nur wenige Adenome dieser Studie ohne fortgeschrittene Pathologie. Insgesamt konnten die Ergebnisse der Literatur bezüglich Rezidivrisiko und Beschaffenheit der Adenome nur im Trend bestätigt werden, jedoch war das hier untersuchte Kollektiv vermutlich zu klein, um die Daten aus großen Erhebungen vollständig zu bestätigen. Auch wurden in der vorliegenden Untersuchung fortgeschrittene Neoplasien selektioniert, was eine Verzerrung beinhalten könnte. Möglich wäre jedoch auch, dass diese klinischen und histopathologischen Parameter insgesamt zu herausragende Aussagekraft bezüglich der ungenau sind, um eine Rezidivwahrscheinlichkeit beanspruchen zu können. 5.2 Medikation Die Patienten, von denen das untersuchte Material stammt, hatten im Verlauf von drei Jahren je eine Medikation mit 5-ASA beziehungsweise Placebo erhalten. Da sich bei den ausgewählten 109 Patienten kein Unterschied in der Rezidivhäufigkeit und der verabreichten Medikation zeigte, kann von einer geringen Relevanz für die vorliegende Untersuchung ausgegangen werden. So scheint die Medikation wenig bis keinen Einfluss auf die Ergebnisse zu haben. Tatsächlich hat sich auch im Gesamtkollektiv der GAPP-Studie kein signifikanter Effekt der Studienmedikation 5-ASA auf die Rezidivhäufigkeit der Adenome gezeigt. 5.3 Die Bedeutung der unterschiedliche Gruppeneinteilungen für ß-Catenin und p53 Die Berechnungen für ß-Catenin und p53 wurden ausführlich für eine Gruppeneinteilung in drei Gruppen durchgeführt. Diese differenzierte Betrachtung lieferte Ergebnisse bezüglich der Färbeeigenschaften und der Adenomcharakteristika. Auch zeigte sich dass, bei dieser Einteilung ein signifikanter Zusammenhang zwischen ß-Catenin- bzw. p53-Expression und der Rezidivhäufigkeit bestand. Die anschließende Einteilung der Adenome in zwei Gruppen wurde aufgrund der klinisch besseren Praktikabilität vorgenommen. So zeigte sich, dass wenn das Augenmerk vor allem auf den Anteil der stark angefärbten Zellkerne gelegt wird, ebenfalls ein signifikantes 71 Ergebnis mit einem p<0.002 für ß-Catenin und einem p=0.000 für p53 hinsichtlich einen Zusammenenhang mit einem Adenomrezidiv gefunden werden kann. Dies erscheint auch tumorbiologisch sinnvoll, da zum Beispiel das transkriptionell aktive ß-Catenin nur im Zellkern gefunden wird. Diese Einteilung in nur zwei Ergebnisse (negativ/positiv) ermöglicht auch den Vergleich mit den anderen bisher bekannten, aber auch den drei neuen Parametern und erlaubt erst die multivariate Betrachtungsweise aller drei Parameter. 5.4 Bewertung der Ergebnisse bezüglich eines Zusammenhanges zwischen Rezidivhäufigkeit und Färbeverhalten von ß-Catenin, p53 und Cox-2 5.4.1 ß-Catenin Bei der Betrachtung bezüglich ß-Catenin-Expression und Rezidivwahrscheinlichkeit ergeben sich signifikante Ergebnisse, die einen Zusammenhang belegen. Aus diesem Grund scheint es sinnvoll, diesen Parameter in größeren Kollektiven weiter zu untersuchen. 5.4.2 Cox-2 Zur Festlegung eines möglichen Grenzwertes für potentiell wegweisende Ergebnisse bedient man sich wie in Kapitel 3.2.8.6 beschrieben, der ROCKurven. Um für Cox-2 eine möglichst hohe Sensitivität zu erreichen, ist es sinnvoll den Grenzwert im Bereich von gar keiner Färbung bis hin zu ganz wenig angefärbten Adenomen zu setzen. So ergibt sich bis zu einen Anteil von 2,5 Prozent der Zellen des Adenoms an die der Cox-2 spezifische Antikörper bindet, eine Sensitivität von 75 Prozent, bei einer relativ geringen Spezifität von 47,2 Prozent. Dieser Grenzwert bei etwa 2-3 Prozent der Zellen, die eine Färbung aufweisen, deckt sich in etwa mit den auf etwas anderem Wege berechneten Daten aus der Einteilung der Cox-2-Färbung in zwei Gruppen. So bildet er einen sinnvollen Cut-Off-Wert für eine höhere Wahrscheinlichkeit, ein Rezidiv zu entwickeln. 5.4.3 p53 Ebenso wie mit Cox-2 wurde zur Festlegung eines möglichen Grenzwertes mit dem Marker p53 verfahren. Setzt man den Grenzwert bei 40 Prozent Zellkernfärbung, ergibt sich eine gute Sensitivität von 83,4 Prozent, mit einer 72 Spezifität von 66,0 Prozent. Für p53 ergibt sich in der ROC-Kurve eine große Fläche unter der Kurve von 0,791. Diese Zahl ist eine Maßzahl für die Güte eines Tests. Insgesamt scheint aufgrund dieser Werte p53 der beste Einzelparameter unter den untersuchten drei Gewebemarkern zu sein. 5.4.4 Multivariate Betrachtung aller drei Parameter Zusammenfassend kann man festhalten, dass vor allem die Untersuchung aller drei Parameter gleichzeitig die besten Ergebnisse mit der höchsten Sensitivität von 94,6 Prozent und einer Spezifität von 43,4 Prozent ergibt. Aus diesem Grund wäre es im Falle einer möglichen klinischen Etablierung dieser Methode ratsam, alle drei immunhistochemischen Färbungen anzuwenden. 5.5 Ein Vergleich zwischen konventionellen Adenomcharakteristika und den neuen Parametern Parameter wie Anzahl der Adenome, Größe und villöser Anteil gehen bekanntermaßen mit einer höheren Rezidivwahrscheinlichkeit einher. Aus diesem Grund wurden die Empfehlungen für eine Nachsorge nach einer Polypektomie an diese Parameter angepasst. [67] Für sie gibt es Daten, die einen Zusammenhang zwischen dem Auftreten eines Adenomrezidivs und der Morphologie des primär gefundenen Adenoms belegen. So ergibt sich bei dem Parameter Anzahl für drei oder mehr Adenome ein signifikanter Zusammenhang mit einem p<0,001 und einer Odds Ratio von 6,9 für das Auftreten eines Rezidivs, wenn diese Befundkonstellation in der ersten Koloskopie vorlag. Diese Daten gelten für fortgeschrittene Adenome. [81] In einer Studie von Martinez et al. konnte auch für villöse Anteile ein Zusammenhang zur Rezidivwahrscheinlichkeit mit einer Odds Ratio von 1,28 hergestellt werden. Ebenfalls mit einer Odds Ration von 2,27 für Adenome zwischen 10-19mm bzw. von 2,99 von Adenomen mit einer Größe über 20mm ergab sich ein signifikant höheres Risiko für große Adenome ein Rezidiv zu entwickeln. [39] Vergleicht man die einzelnen von uns in dieser Arbeit untersuchten Parameter mit den bereits bekannten, ergeben sich für alle drei Färbungen signigfikante Ergebnisse mit folgenden Odds ratios: ß-Catenin: 3,49; Cox-2: 3,53; p53: 10,15. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Wahrscheinlichkeit bei nukleärer Expression von ß-Catenin und positiver Cox-2 Expression etwa 3,5 Mal größer 73 für ein Rezidiv ist. Diese Werte liegen in etwa in der Größenordnung der Parameter villöser Anteil und Größe, oder sind sogar etwas höher. Lediglich die Anzahl der Adenome scheint ein noch stärkerer Parameter für die Rezidivwahrscheinlichkeit zu sein. Die Untersuchung der p53 Expression könnte diese Aussagekraft allerdings noch übertreffen. Betrachtet man alle drei hier untersuchten Parameter ß-Catenin, Cox-2 und p53 in einer multivariaten Analyse, ergibt sich ein p=0,000 und eine deutliche höher Odds ratio von 15,63 als von bereits bekannten Parametern. 5.6 Qualität der untersuchten Parameter ß-Catenin, Cox-2 und p53 bezüglicher ihrer Relevanz Erwartungsgemäß ergab sich ein deutlicher Zusammenhang zwischen der Ausprägung des Färbeverhaltens der untersuchten Marker und den histopathologischen Merkmalen der Adenome. So weisen insbesondere solche Adenome, die eine Größe von über 10 mm oder villöse Anteile besitzen, eine deutlich stärkere Anfärbung mit ß-Catenin, Cox-2 und p53 auf. Unterscheidet man bei der Auswertung der neuen Marker nur zwischen zwei Gruppen, zeigt sich das besonders die Kombination aus allen drei Parametern den bisher bekannten Klassifikationsmerkmalen für Adenome deutlich überlegen ist. Besonders wenn keine Färbung positiv ausfällt, kann mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit davon ausgegangen werden, dass in den nächsten drei Jahren kein Adenomrezidiv auftritt. So kann möglicherweise eine Rekoloskopie statt nach drei Jahren, erst nach fünf Jahren erfolgen. 5.7 Die Bedeutung der Ergebnisse für einen möglichen klinischen Alltag der Kolonkarzinomvorsorge Insgesamt ist bei der hier vorliegenden Untersuchung zu beachten, dass es sich um eine relativ kleine Patientenzahl von 109 Personen handelt. Aus diesem Grund ist eine direkte Übertragung in den klinischen Alltag nur eingeschränkt möglich. Allerdings kann diese Untersuchung als Ausgangspunkt für weitere Studien betrachtet werden, die eine Etablierung in der Routinediagnostik möglich machen könnte. Ginge man davon aus, dass sich die vorliegenden Ergebnisse in einer großen, mulitizentrischen Studie bestätigen würden, könnte die immunhistochemische Färbung von ß-Catenin, Cox-2 und p53 eine mögliche weitere Option darstellen, um zusätzlich zu den 74 bereits bekannten Parametern eine validere Aussage zur Rezidivhäufigkeit innerhalb von drei Jahren nach einer Koloskopie treffen zu können. Vor allem wenn alle drei Parameter gleichzeitig betrachtet werden und dabei mindestens einer der Werte positiv ausfällt, kann mit einer Sensitivität von 94, 6 Prozent von einem Rezidiv augegangen werden. Dieser hohe Wert bei der Sensitivität bedeutet, dass die Patienten, die tatsächlich ein Rezidiv bekommen werden, auch mit einer Wahrscheinlichkeit von fast 95 Prozent erfasst würden. Dies ist für eine Screeninguntersuchung ein entscheidender Punkt. Dabei ist allerdings die relativ geringe Spezifität von 43,4 Prozent zu beachten. Dies würde zur Folge haben, dass noch recht viele Patienten rekoloskopiert wüden, bei denen kein Rezidiv aufträte. Zeigt das untersuchte Adenom keine Anfärbung bei allen drei untersuchten Parametern, kann mit einer Wahrscheinlichkeit von 90,0 Prozent davon ausgegangen werden, dass kein Rezidiv auftritt. Dieser Wert zusammen mit den bekannten histologischen Parametern könnte die Entscheidung erleichtern, ob möglicherweise eine Rekoloskopie erst in fünf oder mehr Jahren sinnvoll ist. Der Vorteil für den einzelnen Patienten, den eine spätere Rekoloskopie mit sich bringt, sollte ebenfalls nicht außer Acht gelassen werden, da noch immer als invasiv zu betrachten ist und für den Patienten auch selten mit Komplikationen einhergehen kann. 5.8 Mögliche gesundheitsökonomische Vorteile Wie oben bereits erwähnt übersteigen die Kosten für eine effektive Tumorbehandlung die Kosten für Vorsorgekoloskopien bei weitem und eine effektive Vorsorge ist ohne Zweifel sinnvoll. Trotzdem entstehen durch die präventiven Untersuchungen enorme Kosten für das Gesundheitssystem, die mit der Häufigkeit der Wiederholung der Untersuchung steigen. Aus diesem Grund könnten die hier untersuchten Parameter, sollte sich ihre Effektivität in weiteren klinischen Studien bestätigen, zu einer Kostenreduktion betragen, in dem die Zeiträume gestreckt würden. Mögliche Engpässe und lange Wartezeiten, die durch eine starke Auslastung der koloskopisch tätigen Ärzte entstehen könnten, würden durch eine Nachuntersuchungen ebenfalls vermieden werden. 75 geringere Anzahl von 5.9 Ausblick Um die neuen Rezidivmarker im klinischen Alltag zu etablieren, böte sich eine Studie an in die Patienten aufgenommen würden, deren Adenome als fortgeschritten klassifiziert werden. Diese Adenome könnten dann zusetztlich immunhistochemisch gegen ß-Catenin, Cox-2 und p53 gefärbt werden. Patienten die dann tatsächlich keine Anfärbung durch diese drei Parameter aufwiesen, könnten dann zum Vergleich zwei Gruppen randonmisiert werden. Die einen würden nach drei Jahren erneut koloskopiert, die anderen erst nach fünf Jahren. 76 6 Zusammenfassung Der Ausgangspunkt dieser Arbeit war die Frage, ob sich ß-Catenin, Cox-2 und p53 als gewebebasierte Biomarker für Adenomrezidive im Dickdarm eignen und dabei helfen, die Wiederauftretenswahrscheinlichkeit von Adenomen besser vorherzusagen zu können, als bislang etablierte klinische und histopathologische Parameter. Dabei ging es insbesondere um fortgeschrittene Adenome, die für eine hohe Rezidivquote bekannt sind. Für die genannten Biomarker konnte eine Korrelation zwischen der Intensität und Lokalisation der Anfärbung und der Rezidivwahrscheinlichkeit gefunden werden. So zeigte sich für die Adenome mit gehäuft p53 positiver nukleärer Färbung ein signifikant häufigeres Auftreten von Rezidiven (p<0,00). Für die Auswertung der ß-Catenin Färbung ergaben sich ebenfalls signifikante Ergebnisse. Es trat ein Rezidiv gehäuft in der Gruppe mit nukleärer Färbung auf, in dieser Gruppe hatten 39 (65,0%) nach drei Jahren erneut ein Adenom (p=0,002). In der Gruppe mit der stärkeren zytoplasmatischen Anfärbung für Cox2 wurden ebenfalls signifikant mehr Rezidive in der Nachuntersuchung gefunden. So bekamen 67,3 Prozent der Patienten ein erneutes Adenom (p=0,001). Betrachtet man alle drei Parameter gleichzeitig, ergibt sich eine besonders hohe Sensitivität von 94,6 Prozent und einer Spezifität von 43,4 Prozent für die Vorhersagekraft für ein Rezidiv, wenn mindestens 1 Parameter positiv ist. Es wäre also im Falle einer möglichen klinischen Etablierung dieser Methode ratsam, alle drei immunhistochemischen Färbungen anzuwenden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass in diesem klinisch gut charakterisierten und homogenen Kollektiv von untersuchten fortgeschrittenen Adenomen, die Expression bestimmter Tumorsuppressorproteine und Onkoproteine hochsignifikant mit der Rezidivhäufigkeit der Adenome korreliert. Möglicherweise könnten die Parameter ß-Catenin, p53 und COX-2 zukünftig eine zusätzliche Entscheidungshilfe in der Nachsorge von fortgeschrittenen kolorektalen Adenomen darstellen. Eine prospektive Validierung dieser Parameter, um den besten Zeitpunkt für eine Nachsorgekoloskopie festlegen zu können, erscheint deshalb sinnvoll. 77 Literaturverzeichnis [1] Aberle, H., Bauer, A., Stappert, J., Kispert, A., Kemler, R. (1997). Betacatenin is a target for the ubiquitin-proteasome pathway. EMBO J. 16 (13), 3797-3804 [2] Altenhofen, L., Brenner, G., Heringer, M., Blaschy, S., Fischer, M., Pilgermann, I., Lang, A., Lichtner, F., Folle, J., Fleck, J. (2008). 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Ich danke Wibke Ziebarth für die verlässliche Zusammenarbeit und Johanna Munding für ihre Einführung in die histologische Beurteilung der Präparate sowie ihre Unterstützung bei allen pathologischen Belangen. Ich danke Frau Prof. Dr. A. Tannapfel dafür, dass ich uneingeschränkt in ihrem Institut arbeiten konnte. Außerdem danke ich den Mitarbeitern des Instituts für Pathologie der Ruhr-Universität Bochum für ihre Unterstützung. Weiterhin möchte ich mich für die Unterstützung und konstruktive Kritik durch Herrn Dr. C. Pox bedanken. Mein Dank gebührt zudem Herrn Dr. K. Schulmann für die Hilfe bei der statistischen Auswertung. Nicht zuletzt danke ich allen pathologischen Instituten für ihre Bereitstellung der Materialien und Daten, ohne die diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre. Schließlich danke ich meinen Eltern für ihre fortwährende Unterstützung, die mir die Kraft und die Ausdauer gegeben hat, diese Arbeit zu beenden. Lebenslauf Linda Brand Geburtsdatum/Geburtsort: 12.11.1983 in Münster Staatsangehörigkeit: deutsch Schule: 1990- 1994 Paul-Gerhardt-Grundschule in Dülmen 1994- 2003 Clemens-Brentano-Gymnasium in Dülmen mit Abschluss der allgemeinen Hochschulreife Studium: 2003 bis 2005: Studium der Humanmedizin an der Ruhr- Universität- Bochum (Regelstudiengang) 2005 bis 2008 Studium der Humanmedizin Modellstudiengang Ruhr-Universität Bochum; 2008 bis 2009 Praktisches Jahr: Chirurgie: University College Hospital Galway, Irland Innere Medizin: Knappschaftskrankenhaus Bochum Langendreer Wahltertial: Abteilung für Psychosomatische Medizin und Psychotherapie, LWL Klinik Dortmund, November 2009 Zweites Staatsexamen Humanmedizin Seit Februar 2010 Assistenzärztin in den Medizinischen Kliniken der Christophorus-Kliniken GmbH, Standort Franz-Hospital Dülmen
