Einfluss - Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

Tierärztliche Hochschule Hannover
Einfluss des Insulin-like Growth Factor Systems
auf die endokrinologische Antwort nach einer
experimentell induzierten Inflammation des Uterus
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae ( Dr. med. vet. )
vorgelegt von
Lars Holzhausen
Hannover
Hannover 2012
Wissenschaftliche Betreuung:
Univ. Prof. Dr. med. vet. Heinrich Bollwein
Klink für Rinder
1. Gutachter:
Univ. Prof. Dr. med. vet. Heinrich Bollwein
Klink für Rinder
2. Gutachter:
Apl. Prof. Dr. med. vet. Hans-Joachim Schuberth
Arbeitsgruppe Immunologie
Tag der mündlichen Prüfung:
20. November 2012
Gefördert durch Pfizer Animal Health
Meiner Familie
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung............................................................................................................. 1
2 Literatur ............................................................................................................... 3
2.1 Transitperiode................................................................................................. 3
2.1.1 Definition .................................................................................................. 3
2.1.2 Metabolische Veränderungen .................................................................. 3
2.1.3 Endokrinologie ......................................................................................... 4
2.2 Somatotrope Achse ........................................................................................ 7
2.2.1 Wachstumshormon .................................................................................. 7
2.2.2 Wachstumshormon Rezeptor................................................................... 8
2.2.3 Insulin-like Growth Factor System ........................................................... 9
2.2.4 Besonderheiten der Hochleistungskuh .................................................. 11
2.3 Produktionserkrankungen ............................................................................. 13
2.3.1 Ketose .................................................................................................... 13
2.3.2 Labmagenverlagerung ........................................................................... 14
2.3.3 Leberverfettung ...................................................................................... 15
2.3.4 Nachgeburtsverhaltung .......................................................................... 15
2.3.5 Metritis, Endometritis ............................................................................. 16
2.4 Angeborene Immunantwort .......................................................................... 17
2.4.1 Definition ................................................................................................ 17
2.4.2 Besonderheiten der angeborenen Immunantwort in der Transitperiode 19
2.5 Immun-endokrine Netzwerke ........................................................................ 20
3 Material und Methode ....................................................................................... 23
3.1 Tiere ............................................................................................................. 23
3.2 Versuchsaufbau............................................................................................ 23
3.2.1 Antepartaler Zeitraum ............................................................................ 24
3.2.2 Postpartaler Zeitraum ........................................................................... 24
3.3 Antepartaler Zeitraum ................................................................................... 28
3.3.1 Auswahlkriterien der Versuchstiere........................................................ 28
3.3.2 Einstallung ............................................................................................. 28
3.3.3 Blutprobennahme vor der Geburt........................................................... 29
3.4 Geburtsüberwachung ................................................................................... 29
3.5 Postpartaler Zeitraum ................................................................................... 30
3.5.1 Bakterielle Untersuchung ....................................................................... 30
3.5.2 Durchführung des LPS-Versuchs........................................................... 30
3.6 Laboranalysen .............................................................................................. 31
3.6.1 IGF-I ....................................................................................................... 31
3.6.2 Wachstumshormon ................................................................................ 32
3.6.3 Cortisol ................................................................................................... 33
3.6.4 Adrenocorticotropes Hormon ................................................................. 33
3.6.5 Thyroxin und Trijodthyronin.................................................................... 34
3.6.6 Insulin .................................................................................................... 34
3.6.7 17β-Östradiol ......................................................................................... 34
3.6.8 Progesteron ........................................................................................... 35
3.6.9 13,14-dihydro-15-keto-PGF2α ............................................................... 35
3.6.10 Freie Fettsäuren.................................................................................... 36
3.6.11 Lipopolysaccharide ............................................................................... 36
3.7 Histologie ...................................................................................................... 36
3.8 Statistik ......................................................................................................... 37
4 Ergebnisse ......................................................................................................... 39
4.1 Tiere ............................................................................................................. 39
4.2 Antepartaler Zeitraum ................................................................................... 39
4.2.1 IGF-I ....................................................................................................... 40
4.2.2 Wachstumshormon ................................................................................ 42
4.2.3 Schilddrüsenhormone ............................................................................ 43
4.2.4 Cortisol ................................................................................................... 45
4.2.5 Progesteron ........................................................................................... 46
4.2.6 17β-Östradiol ......................................................................................... 47
4.2.7 13,14-dihydro-15-keto-PGF2α ............................................................... 48
4.2.8 Insulin .................................................................................................... 49
4.2.9 Freie Fettsäuren..................................................................................... 50
4.3 Geburt .......................................................................................................... 51
4.4 Postpartaler Zeitraum ................................................................................... 51
4.4.1 Bakterielle Untersuchung ....................................................................... 51
4.4.2 LPS-Versuch .......................................................................................... 52
4.5 Histologie ...................................................................................................... 63
4.5.1 Übersichtsfärbung .................................................................................. 63
4.5.2 Immunhistochemie ................................................................................. 64
5 Diskussion ......................................................................................................... 67
5.1 Tiere ............................................................................................................. 68
5.2 Antepartaler Zeitraum ................................................................................... 69
5.2.1 Somatotrope Achse ............................................................................... 71
5.2.2 Schilddrüsenhormone ............................................................................ 73
5.2.3 Cortisol ................................................................................................... 74
5.2.4 Reproduktionshormone .......................................................................... 76
5.2.5 Insulin und FFS ...................................................................................... 76
5.3 Bakterielle Untersuchung ............................................................................. 78
5.4 LPS-Versuch ................................................................................................ 79
5.4.1 Somatotrope Achse ............................................................................... 81
5.4.2 Schilddrüsenhormone ............................................................................ 82
5.4.3 Reproduktionshormone .......................................................................... 83
5.4.4 Cortisol und ACTH ................................................................................. 85
5.4.5 Lipopolysaccharide ................................................................................ 86
5.5 Histologie ...................................................................................................... 87
5.6 Schlussfolgerungen ...................................................................................... 89
6 Zusammenfassung ........................................................................................... 90
7 Summary............................................................................................................ 93
8 Literatur ............................................................................................................. 94
9 Anhang ............................................................................................................. 110
9.1 Wachstumshormon..................................................................................... 110
9.2 PGFM ......................................................................................................... 111
9.3 LPS............................................................................................................. 111
9.4 Färbeprotokoll der Histologischen Schnitte ................................................ 112
9.5 Rezepte ...................................................................................................... 113
10 Tabellenanhang ............................................................................................. 116
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
Neben den allgemein üblichen Abkürzungen wurden folgende spezielle Kurzformen
verwendet:
Abb.
Abbildung
ACTH
Adrenocorticotropes Hormon
ALB
Albumin
ALS
Acid labile subunit
a.p.
ante partum
AST
Aspartat-Aminotransferase
BCS
Body Condition Score
CK
Creatininkinase
cpm
counts per minute
DNA
Desoxyribonukleinsäure
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
ELISA
Enzym linked Immunosorbant Assay
E2
17β-Östradiol
FFS
Freie Fettsäuren
GAP
Glutaraldehydprobe
GAS
interferon-gamma-activated sites
GB
Gesamt Bilirubin
GGT
γ-Glutamyltransferase
GH
Wachstumshormon (Growth Hormone)
GHIH
Wachstumshormon inhibiting Hormone
GHR
Wachstumshormon-Rezeptor
GHRH
Wachstumshormon releasing Hormone
GLDH
Glutamatdehydrogenase
HE
Hämatoxylin Eosin
HSD1/HSD2
11β-Hydroxysteroiddehydrogenase Typ 1 / 2
HST
Harnstoff
IGF
Insulinähnlicher Wachstumsfaktor
IGFBP
IGF-Bindungsproteine
IGF-IR
IGF-I Rezeptor
IL
Interleukin
IRMA
Immunradiometrischer Assay
Jak2
Janus Kinase 2
ln
Natürlicher Logarithmus
LPS
Lipopolysaccharid
min
Minuten
mRNA
messenger Ribonukleinsäure
NaCl
Natriumchlorid
NTIS
Nicht Thyreodales Erkrankungssyndrom
(Non Thyroidal Illness Syndrome)
P
Irrtumswahrscheinlichkeit
PAMP
Pathogen-assozierte molekulare Struktur
(Pathogen Associated Molecular Pattern)
PBS
Phosphat gepufferte Saline
p. insem.
post inseminationem
PG
Prostaglandin
PGFM
Prostaglandin F2α Metabolit
p.p.
post partum
P4
Progesteron
RIA
Radioimmunoassay
STAT
Signal Transducer and Activator of
Transcription
Tab.
Tabelle
TH1/TH2
T-Helferzellen Typ1/Typ2
TLR
Toll-like Rezeptor
TNF
Tumor Nekrose Faktor
TSH
Thyroidea Stimulierendes Hormon
T3
Trijodthyronin
T4
Thyroxin
V.
Vena
VLDL
Very Low Density Lipoprotein
5’D
5’Deiodinase
1 Einleitung
Als Transitperiode der Milchkühe wird die Zeit um die Abkalbung beschrieben, die mit
einer erhöhten Krankheitsinzidenz einhergeht (1, 2). Unter anderem führen bakterielle Infektionen des Uterus in der ersten Woche post partum (p.p.) zu Metritiden
und Endometritiden und haben darüber hinaus auch negative Einflüsse auf das
weitere Zyklusgeschehen (3). Die finanziellen Einbußen, die uterine Krankheiten
allein in der Europäischen Union durch Behandlung, aber auch Milchverluste und
Unfruchtbarkeit pro Jahr bedingen, werden von Sheldon et al. (4) auf etwa 1,4
Milliarden Euro geschätzt.
Eine bakterielle Besiedelung des Uterus im Anschluss an die Geburt ist nach Ansicht
letztgenannter Autoren bei 80 bis 100% der Tiere nachweisbar, allerdings entwickelt
nur gut ein Drittel der Tiere klinische Erkrankungen des Uterus. Damit aus einer
zunächst harmlosen bakteriellen Kontamination keine Infektion entsteht, sind vor
allem lokale Abwehrmechanismen im Uterus gefordert (5). Dabei wird eine
Inflammation des Uterus von einer komplexen hormonellen Regulation begleitet, die
auch die Somatotrope Achse mit einschließt (6). Diese Achse beschreibt das
hypophysär ausgeschüttete Wachstumshormon (Growth Hormone; GH) und in der
Leber gebildete Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren (Insulin-like Growth Factors;
IGF). Peripartal kommt es bei Hochleistungsmilchkühen zu einer Entkopplung der
Somatotropen Achse, denn durch eine Verminderung der Wachstumshormonrezeptoren (Growth Hormone Receptor, GHR) in der Leber vor der Geburt kommt es zu
einer
Reduktion
der
IGF-I-Blutkonzentration.
Gleichzeitig
steigen
die
GH-
Konzentrationen durch das fehlende negative Feedback von IGF-I an der Hypophyse
an (7). Es ist zwar bekannt, dass die Hormone der Somatotropen Achse einen
Einfluss auf die Immunantwort haben (8, 9), allerdings weiß man wenig über deren
Funktion und Einfluss auf die uterine Immunität während der Transitperiode von
Milchkühen.
In Vorarbeiten konnte gezeigt werden, dass trotz vergleichbarer IGF-I-Konzentrationen um den Geburtszeitpunkt niedrige IGF-I-Konzentrationen vier bis sechs
Wochen vor der Geburt auf ein erhöhtes Risiko für postpartale Erkrankungen hindeuten (10). Die Hormone der Somatotropen Achse beeinflussen dabei nicht nur
direkt die Inflammation, sondern haben auch über andere endokrine Achsen wie die
Schilddrüsenhormonachse einen möglichen Einfluss (6). Die verschiedenen hormo1
nellen Regelkreise nehmen Einfluss auf eine Inflammation, aber umgekehrt beeinflusst auch eine Inflammation die verschiedenen hormonellen Regelmechanismen.
Es wird hierbei von einem immunendokrinen Netzwerk gesprochen (6). Die Effektivität der Immunantwort wird von diesem immunendokrinen Netzwerk beeinflusst (6).
Viele Regelkreise innerhalb dieses Systems sind allerdings sehr komplex und es gibt
zu dieser Thematik bisher nur wenige Informationen in Bezug auf die peripartale
Hochleistungsmilchkuh. Aus diesem Grund soll in der vorliegenden Arbeit der
Einfluss des Insulin-like Growth Factor Systems auf die endokrinologische Antwort
nach einer experimentell induzierten Inflammation des Uterus untersucht werden. Es
werden dazu folgende Hypothesen überprüft:
-
Niedrige IGF-I-Werte vier bis sechs Wochen ante partum (a.p.) führen aufgrund des fehlenden negativen Feedbacks zu einer erhöhten GH-Serumkonzentration um den Geburtszeitpunkt.
-
Tiere mit unterschiedlich hohen IGF-I-Konzentrationen a.p. zeigen in verschiedenen Geweben Unterschiede in den Wachstumshormon-Rezeptoren.
-
Ein uteriner inflammatorischer Reiz post partum hat unterschiedliche Auswirkungen auf den Hormonhaushalt bei Tiere mit unterschiedlichen IGF-I-Konzentrationen 4 bis 6 Wochen vor der Geburt.
2
2 Literatur
2.1 Transitperiode
2.1.1 Definition
Die Transitperiode der Milchkühe definiert Grummer (11) als Zeitintervall von drei
Wochen vor bis drei Wochen nach der Geburt. Dieser Zeitraum ist in der Literatur für
den englischen Begriff „Transition Period“ weithin anerkannt (1, 12). Allerdings bestehen auch zeitlich kürzere Definitionen, die nur die letzten ein bis zwei Wochen der
Trächtigkeit und die ersten zwei Wochen der Laktation mit einschließen. Hierbei wird
allerdings betont, dass das zeitliche Intervall für die gesundheitlich besonders
anfällige Phase der Milchkühe noch bis zum Zeitpunkt der höchsten Milchleistung in
der fünften Woche p.p. anhält (13, 14). Wenngleich die Definition des Zeitraumes
variiert, besteht Einigkeit darüber, dass in dieser Zeit die höchste Inzidenz von
Krankheiten bei Milchkühen zu beobachten ist (1, 11, 13). Diese Krankheiten werden
als Produktionserkrankungen bezeichnet (1) und sind im Folgenden genauer beschrieben.
2.1.2 Metabolische Veränderungen
Hochleistungsmilchkühe sind als „Metabolische Athleten“ bezeichnet worden (15)
und gerade die Transitperiode stellt eine Zeit enormer metabolischer Anpassungen
dar. Diese Anpassungen sind vor allem nötig, um dem erhöhten Energiebedarf
während der späten Trächtigkeit und der beginnenden Laktation gerecht zu werden
(11). In den letzten drei Wochen der Trächtigkeit beobachtet man eine Reduzierung
der Futteraufnahme der Tiere, die in der letzten Trächtigkeitswoche um bis zu 30%
im Vergleich zur Mitte der Trächtigkeit sinkt (16). Eine Erklärung für diesen Rückgang
bei gleichzeitig hohem Energiebedarf bietet zum Teil die Tatsache, dass der Pansen
durch die Größenzunahme des Uterus eingeengt und so seine Aufnahmekapazität
eingeschränkt wird (16). Allerdings müssen nach Bertics et al. (16) auch weitere
Faktoren, die die Autoren nicht näher beschreiben, in Betracht gezogen werden, da
bei erzwungener gleichbleibender Futtermenge bis zur Geburt eine Depression der
Futteraufnahme nach der Geburt nicht vermieden wird. Zusätzlich ist der
Energieverbrauch des Muttertieres durch die benötigte Energie für das Wachstum
3
des Fetus zum Ende der Trächtigkeit erhöht (17, 18). Deshalb gelangt der Körper der
Milchkuh bereits vor der Geburt in eine katabole Stoffwechsellage, die mit einer
negativen Energiebilanz einhergeht (17, 18). Diese hält auch über die Geburt hinaus
an. Nach Bauman et al. (19) und Grummer (11) ist der Höhepunkt der negativen Energiebilanz in der ersten Woche der Laktation zu beobachten.
Eine große Bedeutung innerhalb dieser Anpassungsreaktionen an eine katabole
Stoffwechsellage hat der Fettstoffwechsel. Freie Fettsäuren (FFS) werden aus Adipozyten freigesetzt und stehen als Energielieferanten in der Leber zur Verfügung (19,
20). Fütterungsunabhängig steigen die Konzentrationen der FFS im Blut in den
letzten drei Wochen vor der Geburt stetig an (11). Für den Abbau der FFS und der
damit einhergehenden Bereitstellung von Lipoproteinen ist besonders die Leber zuständig (21). Näheres dazu ist im Kapitel 2.3.3 „Leberverfettung“ beschrieben.
Neben dem Fettstoffwechsel ist auch der Glukosestoffwechsel bei der Anpassung an
eine negative Energiebilanz von entscheidender Bedeutung. Die Leber synthetisiert
85% der im Körper verbrauchten Glukose (1). Sowohl die späte Trächtigkeit als auch
die beginnende Laktation erfordern eine erhöhte Produktion von Glukose, worauf die
Leber mit einer erhöhten Aufnahme von endogenen glukoplastischen Substanzen,
wie beispielsweise Aminosäuren und Glycerol reagiert (18). Nach Bell et al. (22)
führen abnehmende Insulinkonzentrationen in den letzten beiden Wochen vor der
Geburt zu einer Hemmung der Proteinsynthese und einer Erhöhung der Proteolyse,
um dem erhöhten Verbrauch an Aminosäuren in der einsetzenden Laktogenese gerecht zu werden.
Diese oben beschriebenen Anpassungsreaktionen im Lipid-, Kohlenhydrat- und
Proteinstoffwechsel müssen bei Milchkühen adäquat reguliert werden, um die Energie für den Fetus und die einsetzende Milchproduktion bereitzustellen. Reguliert
werden diese Anpassungen vornehmlich endokrinologisch (1). Die Endokrinologie
der Transitperiode wird im Folgenden näher erläutert.
2.1.3 Endokrinologie
Die komplexe endokrinologische Regulation in der Transitperiode ist sowohl an den
peripheren Hormonkonzentrationen, als auch den Rezeptorexpressionen, und an
Veränderungen nachgeschalteter Signaltransduktionswege zu erkennen (18, 23).
4
In diesem Zusammenhang ist bei der Milchkuh der Somatotropen Achse eine
besondere Bedeutung zuzuschreiben. Diesem endokrinen Regelkreis ist dementsprechend ein eigenes Kapitel gewidmet (siehe 2.2 Somatotrope Achse).
Die metabolische Adaptation spiegelt sich auch in den Änderungen der Konzentrationen der Schilddrüsenhormone Thyroxin (T4) und Trijodthyronin (T3) wider. Die
Schilddrüsenhormone haben Einfluss auf den Energiehaushalt, da sie vor allem den
energetischen Grundumsatz des Körpers regulieren (24). Die T4- und T3-Konzentrationen sinken während der letzten Wochen vor der Geburt ab und steigen während
der Laktation wieder auf die Ausgangswerte von der Mitte der Trächtigkeit an (11).
Dabei sind die T4-Konzentrationen und die Milchleistung zu Beginn der Laktation
negativ korreliert (25). Parallel dazu sinken nach Pezzi et al. (25) die 5’Deiodinasen
(5’D) in der Leber ab. Diese Enzyme spalten ein Jodatom vom T 4 (auch Tetrajodthyronin genannt) ab, wodurch Trijodthyronin, die aktive Form der Schilddrüsenhormone entsteht. Durch die verminderte hepatische Deiodinase-Aktivität während
der Geburt kommt es zu einem Abfall der T3-Konzentration im Blut. Dagegen steigt
die Aktivität der 5’D in der Milchdrüse zum Geburtszeitpunkt an und korreliert positiv
mit der Milchleistung, wobei auch höhere T3-Konzentrationen im Gewebe der
Milchdrüse und im Kolostrum nachweisbar sind (25).
Aceves et al. (26) bringen Änderungen der Schilddrüsenparameter mit dem Krankheitsbild des sogenannten Euthyreoten Krankheitssyndroms in Verbindung und
führen dies auf den hohen Energieverbrauch der Milchdrüse und der damit
einhergehenden negativen Energiebilanz und der hohen metabolischen Belastung
zurück. Es kommt dabei zu einem Absinken der Thyroxinkonzentration und damit zu
einem verminderten Grundumsatz des Körpers (26). Wie der Name „Euthyreotes
Krankheitssyndrom“ besagt, sind solche Veränderungen sonst bei Krankheiten
unterschiedlicher Genese zu beobachten (26).
Cortisol wird sowohl in der Nebenniere des Fetus als auch des Muttertieres gebildet
und als Stresshormon angesehen. Darüber hinaus spielt es eine wichtige Rolle im
Rahmen hormoneller Veränderungen vor der Geburt (27). Die Freisetzung von Cortisol induziert in den Eihäuten die Bildung des Enzyms 17α-Hydroxylase. Dieses
Enzym bewirkt die Konversion von Progesteron zu Östrogenen (27). Weiterhin induziert fetal gebildetes Cortisol die Synthese von Prostaglandinen, vor allem von Prostaglandin (PG)F2α. Dieses führt zu einer Luteolyse und dadurch zum Absinken der
5
weiter unten beschriebenen Progesteronkonzentrationen und anschließend zu Kontraktionen der glatten Uterusmuskulatur (27). Während der dadurch ausgelösten
Geburt sind die Cortisolkonzentrationen des Muttertieres, bedingt durch die Anstrengungen während der Geburt, hoch (28, 29).
Progesteron ist für die Aufrechterhaltung der Gravidität von entscheidender Bedeutung (24). Es wird im Corpus luteum und zum geringen Teil auch in der Plazenta und
Nebenniere gebildet (30, 31). Stabenfeld et al. (32) beschreiben ein Absinken der
Progesteronplasmakonzentration ab dem Tag 250 der Trächtigkeit von durchschnittlich 7 auf 4 ng/ml in der Woche vor der Geburt, wobei die individuelle Schwankungsbreite relativ hoch sei, und ein schnelles Absinken ca. 24 h vor der Geburt auf
einen Wert um 1 ng/ml, bedingt durch die Luteolyse. Der Rückgang ein bis vier
Wochen ante partum hängt mit der bereits oben beschriebenen durch Cortisol
induzierten Synthese des Enzyms 17α-Hydroxylase zusammen, das eine erhöhte
Produktion von Östrogenen durch Umsetzung des Progesterons bedingt (31, 33, 34).
Gegen Ende der Trächtigkeit steigen die Konzentrationen von vornehmlich 17βÖstradiol (E2), aber auch Östron und Östriol stark an (35). Der Hauptsyntheseort dieser Hormone ist die Plazenta. Östrogene induzieren geburtsvorbereitend eine erhöhte Anzahl an Oxytocinrezeptoren am Uterus, ein verstärktes Wachstum des Myometriums und eine vermehrte Bildung von Actomyosin, wodurch sich die Kontraktilität
des Uterus erhöht (27). Zusammen mit Relaxin bewirken Östrogene auch eine Aufweichung der Zervix und des Geburtskanals und stimulieren die Freisetzung von
PGF2α aus dem Endometrium (27). Direkt nach der Geburt kommt es innerhalb eines
Tages zu einem Absinken der Östrogenplasmakonzentrationen auf ein Basalniveau
(27, 36). Sie bleiben bis zur Bildung eines ersten dominanten Follikel um den 10. Tag
post partum niedrig (37).
Prostaglandin F2α ist nicht nur für die Kontraktionen während der Geburt, sondern
auch für die anschließende Uterusinvolution von Bedeutung. Zu früh sinkende Konzentrationen von PGF2α sind mit einer verzögerten Uterusinvolution in Zusammenhang gebracht worden, weshalb PGF2α als ein bedeutender Faktor während der
peripartalen Phase angesehen wird (27).
Das endokrine Pankreas synthetisiert unter anderem die beiden Peptidhormone Insulin und Glukagon, welche beide, neben Catecholaminen und Cortisol, wichtige Regulatoren des Blutzuckerspiegels sind (24). Dabei führt Insulin zu einer Senkung des
6
Blutzuckerspiegels durch Aufnahme von Glukose in Körperzellen. Glukagon dagegen
führt zu einer Freisetzung von Glukose aus Zellen in die Blutbahn (24). Die Glukosekonzentration im Blutplasma fällt in der Woche nach der Geburt deutlich ab (38), wohingegen die Insulinkonzentration bereits in den letzten beiden Wochen vor der
Geburt absinkt. Letztere bleibt dann in den ersten drei Wochen nach der Geburt auf
einem niedrigen Level (39) und erreicht erst ca. 30 Tage p.p. wieder die Ausgangskonzentration, die vier Wochen vor der Geburt gemessen wurden (40). Genau entgegengesetzt dazu steigen die zum Insulin antagonistisch wirkenden Glukagonplasmawerte an und sinken anschließend wieder ab (38). Die niedrigen Insulinwerte
führen zu einer vermehrten Aufnahme der Glukose durch die nicht insulinabhängigen
Glukosetransporter der Zellen der Milchdrüse. Die Insulinkonzentrationen sind mit
der Milchleistung negativ korreliert. Niedrige Insulinkonzentrationen werden deshalb
auch als ein Grund für hohe Milchleistungen angesehen (41).
2.2 Somatotrope Achse
Die Somatotrope Achse hat einen bedeutenden Einfluss auf das fetale und postnatale Wachstum des Organismus. Das Wachstumshormon wurde in diesem
Zusammenhang bereits 1921 von Evans und Long (42) nachgewiesen und erhielt
aufgrund dieser Funktion auch seinen Namen. Erst später erkannte man, dass GH
nicht nur direkt, sondern auch über Serumfaktoren wirkt (43). Einige dieser
Serumfaktoren wurden von Rinderknecht und Humbel (44) als Insulin-ähnliche
Wachstumsfaktoren beschrieben.
Die klassischen Elemente der Somatotropen Achse umschließen das Wachstumshormon, das Wachstumshormon Bindungsprotein, den Wachstumshormonrezeptor,
die Insulin-like Growth Factors I und II, sechs IGF Bindungsproteine (IGFBP) und
weitere IGF ähnliche Bindungsproteine (45).
2.2.1 Wachstumshormon
Das im Hypophysenvorderlappen gebildete GH gehört zur Gruppe der Peptidhormone, besteht aus 191 Aminosäuren und wird mit einer pulsatilen, circadianen Rhythmik in den Blutkreislauf abgegeben (45). Im menschlichen Fetus kann GH bereits
in der 6. Woche der Schwangerschaft nachgewiesen werden und besitzt einen
7
großen Einfluss auf das Längenwachstum (45). Die pulsatile Ausschüttung des GH
wird mit geschlechtsspezifischen Unterschieden durch zwei Neuropeptide gesteuert.
Diese Neuropeptide sind das Growth Hormone Releasing Hormone (GHRH) und das
Growth Hormone Inhibitor Hormone (GHIH). Beide werden im Hypothalamus gebildet
und in den Blutkreislauf abgegeben (46).
Die Regulation der Ausschüttung dieser beiden Neuropeptide erfolgt zum einen
durch ein negatives Feedback auf den Hypothalamus durch das Wachstumshormon
selbst, wodurch die GHRH-Ausschüttung gesenkt und gleichzeitig die Sekretion von
GHIH gefördert wird (47). Des Weiteren sind auch andere Hormone beschrieben, die
einen Einfluss auf die hypothalamische GHRH- und GHIH-Ausschüttung und somit
auch auf das hypophysäre GH-Ausschüttungsmuster haben. Dazu gehören das in
der Leber gebildete IGF-I, sowie die gastrointestinalen Peptide Ghrelin, Leptin und
Insulin (45). Neben dem Feedback auf den Hypothalamus kommt es aber auch zu
einem direkten Feedback auf die Hypophyse, wodurch die GH-Ausschüttung gesenkt
werden kann. Dabei besitzen IGF-I und Insulin die größte Bedeutung (48).
Aus der Hypophyse wird GH in den Blutkreislauf abgegeben und an das GH-Bindungsprotein gebunden. In vivo konnte von Renaville et al. (49) gezeigt werden, dass
das Bindungsprotein die Halbwertszeit verlängert und eine stärkere Wirkung des GH
an seinem Rezeptor bedingt.
Neben dem Längenwachstum beeinflusst GH auch den Stoffwechsel (50). Die Wirkung von GH auf bestimmte Zielgewebe wie Fett, Muskulatur oder auch Leber ist dabei direkt oder wird indirekt durch IGF-I und IGF-II vermittelt. Einen direkten Effekt
hat GH beispielsweise auf die Adipozyten. Es wirkt lipolytisch und ein GH-Mangel
führt bei Mäusen zu einem vermehrten Fettgehalt des Körpers (51). In der Leber
kommt es durch GH zu einer vermehrten Glukoneogenese. Indirekt bewirkt es aber
durch die Bildung von IGF-I eine vermehrte Aufnahme von Glukose aus der Blutbahn
in die Gewebe. Wachstumshormon und IGF-I sind somit zum Teil Antagonisten und
die Regulation auf Zellebene ist komplex gesteuert (50).
2.2.2 Wachstumshormon Rezeptor
Die Wirkung von GH wird über GHR in der Zellmembran vermittelt (52). GHR ist ein
transmembranes Glycoprotein, dessen mRNA Expression und dessen Protein in der
Leber die höchsten Konzentrationen besitzen. Aber auch in Fettgewebe, Muskel und
8
Niere wurden hohe Konzentrationen des GHR nachgewiesen (53). Die Wirkung von
Wachstumshormon an seinem Rezeptor wird intrazellulär über die Janus Kinase 2
(Jak2) vermittelt, die mit dem intrazellulären Teil des Rezeptors assoziiert ist. Die
Bindung von GH veranlasst eine Konformationsänderung des Rezeptors, der die
Jak2 aktiviert. Das intrazelluläre Signaltransduktionsprotein Jak2 phosphoryliert in
Folge das DNA Bindungsprotein „signal transducer and activator of transcription 5b“
(STAT5b). Zwei phosphorylierte STAT5b bilden zusammen ein Dimer, das im Zellkern an spezifische DNA Sequenzen, sogenannte „interferon-gamma-activated sites“
(GAS), bindet. Diese GAS Elemente befinden sich in den Promotern der GH-abhängigen Gene, wie beispielsweise dem IGF-I-Gen, die dadurch die Transkription
dieser Gene erhöhen (23).
Es sind drei verschiedene GHR mRNA Transkripte beim Rind beschrieben: GHR 1A,
1B und 1C (52). Lucy et al. (54) konnten die GHR 1A mRNA beim Rind nur in der Leber nachweisen. Weiterhin konnte diese Arbeitsgruppe (55) zeigen, dass die Bindung
von GH auf mikrosomalen Membranen homogenisierter Hepatozyten um den Geburtszeitpunkt beim Rind deutlich verringert ist. Das auf den Hepatozyten gebundene
GH korreliert mit der Transkription der GHR 1A mRNA, nicht aber mit der Transkription der gesamten mRNA der GHR 1A, 1B und 1C. Die Autoren machen deshalb
GHR 1A für das Absinken der IGF-I-Konzentrationen vor der Geburt verantwortlich
(55).
2.2.3 Insulin-like Growth Factor System
In der Literatur wird übereinstimmend dem IGF-I im Metabolismus, aber auch bei
Funktionen der Immunantwort und der Regeneration und Differenzierung von Geweben eine besonders wichtige Bedeutung zugesprochen (6, 8, 56). Bereits namentlich wird bei Insulin-like Growth Factor auf eine strukturelle Homologie zum Insulin
verwiesen, die ca. 50% beträgt (45). Dementsprechend kann IGF-I nicht nur an seinen eigenen Rezeptor, sondern auch an die Rezeptoren der strukturverwandten Hormone Insulin und IGF-II binden. Allerdings ist bei dieser Kreuzreaktivität die Bindungsaffinität von beispielsweise IGF-I am Insulinrezeptor gegenüber Insulin 100-mal
niedriger (8, 45).
9
In der fetalen Phase wird vor allem IGF-II gebildet, wobei IGF-I einen ebenso großen
Einfluss auf das Wachstum hat (57), so dass beim Rind sowohl IGF-I als auch IGF-II
positiv mit dem fetalen Wachstum korrelieren (58). Sowohl im fetalen als auch postnatalen Leben wird die Synthese und Sekretion von IGF-I vor allem durch GH gesteuert. Dabei synthetisiert die Leber den größten Anteil des im Blut zu messenden
IGF-I (ca. 75%). Das restliche im Blut zu messende IGF-I wird unter anderem in der
Muskulatur sowie im Fett- und Nierengewebe gebildet (59). Das gebildete IGF-I kann
sowohl endokrin, als auch parakrin und autokrin wirken (60). Die parakrine Wirkung
beschreibt die Wirkung eines Hormons auf die Nachbarzelle, während man unter
autokriner Wirkung den Einfluss auf dieselbe Zelle, in der das Hormon gebildet
wurde, versteht. Yakar et al. (59) konnten bei Mäusen nachweisen, dass über 2/3
von dem endokrin wirksamen, im Serum zu messenden IGF-I in der Leber synthetisiert werden. Allerdings war ohne dieses in der Leber gebildete IGF-I weder das
Wachstum noch die Reproduktion beeinträchtigt.
Das gebildete IGF-I wird im Blut an Bindungsproteine gebunden: Nur ca. 1% liegt ungebunden, also frei vor. Viele der IGF-I-Aktionen werden durch Bindungsproteine
modifiziert und kontrolliert (8, 45, 61). Der Komplex aus IGF-I, IGFBP-3 und Acid
labile subunit (ALS) bildet den größten Anteil (80 – 95%) an gebundenem IGF-I (62).
Dieser Bindungskomplex, der eine Halbwertzeit von 15 Stunden hat, wird als Pool für
IGF-I angesehen (8). Zusätzlich kommt es zu einer Beeinflussung des IGF-I durch
weitere Bindungsproteine. Ist IGF-I beispielsweise an IGFBP-1 gebunden, so erleichtert dieses Bindungsprotein den Transport von IGF-I durch Membranen (63). Darüber hinaus wurde für IGFBP-2 ein bedeutender Einfluss auf die physiologische Follikelentwicklung gezeigt. Ein Mangel steht in Zusammenhang mit einer zystischen
Entartung von Follikeln (64).
Die weitreichenden Wirkungen von IGF-I auf den Organismus werden durch den
IGF-I-Rezeptor (IGF-IR) vermittelt, der nach Frago et al. (45) in allen Geweben, mit
Ausnahme von Hepatozyten und ausgereiften B-Zellen vorkommt. Im Gegensatz
dazu konnten Gross et al. (65) beim Rind IGF-IR mRNA auch in der Leber nachweisen.
Zu den Wirkungen von IGF-I gehören eine gesteigerte Zellproliferation und Zelldifferenzierung (45). Die beiden Wirkungen konnten auch für heranreifende und sich
entwickelnde Lymphozyten in primären und sekundären lymphoiden Geweben gezeigt werden (8). Der zugrunde liegende Mechanismus der erhöhten Proliferation ist
10
die Beschleunigung des Zellzyklus einschließlich der Mitose (45). Neben der gesteigerten Proliferation ist bei Immunzellen aber auch die Apoptoserate, d.h. der programmierte Zelltod, herabgesetzt (45).
Des Weiteren konnte in vielen Arbeiten gezeigt werden, dass sich die metabolischen
Gegebenheiten auf die systemischen IGF-I-Blutkonzentrationen auswirken (49). Aber
auch umgekehrt sind Beeinflussungen von IGF-I auf den Metabolismus beschrieben.
Liegt beispielsweise eine anabole Stoffwechsellage vor, senkt vom Körper gebildetes
IGF-I systemisch vorhandene Triglyceride, FFS und Ketonkörper und erhöht die
Aminosäureaufnahme in die Muskulatur (66). Weiterhin kann IGF-I durch die insulinähnliche Wirkung die Glukoseaufnahme in die Gewebe erhöhen und die Glukagonund GH-Sekretion senken. Dadurch wirkt es unter anderem auch dem diabetogenem
Effekt des GH entgegen (8).
Während einer katabolen Stoffwechsellage kommt es zu einer Resistenz gegenüber
GH in den Geweben und damit zu einer verminderten IGF-I-Konzentration. Breier
(66) geht davon aus, dass dieser Mechanismus dazu führe, dass freigesetzte Substrate wie z. B. Glukose und freie Fettsäuren vorwiegend für die Homöostase und
nicht für Zellwachstum und Zellproliferation verwendet werden. Ähnliches gilt für den
peripartalen Zeitraum bei Hochleistungsmilchkühen, in dem eine negative Energiebilanz zu einem Abfall der IGF-I-Werte führt. Butler et al. (48) stellen eine Verbindung
zwischen unterernährten Tieren und Tieren am Anfang der Laktation her, da bei
beiden Gruppen niedrige IGF-I-Konzentrationen zu messen sind.
2.2.4 Besonderheiten der Hochleistungskuh
Bei den Rassen Holstein und Guernsey, sprich Rassen mit hoher Milchleistung,
kommt es zu einem Absinken des GHR in der Leber um den Geburtszeitpunkt (67).
Die geringste GHR-Konzentration ist in der Woche nach der Geburt parallel zu einer
niedrigen IGF-I mRNA Transkription und IGF-I-Serumkonzentration gemessen
worden (7).
Bei Rindern, die züchterisch auf Fleischproduktion und nicht auf hohe Milchleistung
selektioniert worden sind, ist dagegen die Änderung der GHR- und IGF-I-Konzentrationen nicht zu beobachten (68). Lucy et al. (50) gehen deshalb davon aus, dass
dieses Absinken von GHR und IGF-I mit der hohen Milchleistung und der damit
11
einhergehenden katabolen Stoffwechselsituation während der Transitperiode in Zusammenhang steht.
Bei Hochleistungsmilchkühen kommt es durch die sinkenden IGF-I-Werte im peripartalen Zeitraum zum Anstieg von GH und damit zu einem in der Literatur als Entkopplung der Somatotropen Achse beschrieben Phänomen (23).
Dadurch, dass eine erhöhte Milchleistung bei Rindern auch durch eine parenterale
Gabe von GH erreicht werden kann (23, 69, 70), schlussfolgern Bell et al. (22) und
Lucy et al. (23), dass die vermehrte Ausschüttung von GH die Bereitstellung von
Substraten zur Milchbildung erhöht. Es kommt zu einem Anstieg von FFS und zu
einer verstärkten Glukoneogenese der Leber (48).
Weiterhin beschreiben Butler et al. (48), dass die Entkopplung der Somatotropen
Achse in direktem Zusammenhang mit sinkenden Insulinkonzentrationen steht. Ihnen
war es möglich, mittels Insulininfusion und damit steigenden Insulinkonzentrationen
in den ersten Wochen nach der Geburt eine Zunahme der GHR 1A mRNA und damit
steigende IGF-I- und sinkende GH-Konzentrationen zu erreichen.
Auch auf das weitere Zyklusgeschehen der Kühe haben IGF-I und GH einen
Einfluss. So ist die IGF-I-Konzentration während der letzten vier Wochen vor Geburt
bei Tieren, die postpartal in den ersten drei Wochen ovulieren, höher als bei anovulatorischen Kühen. Genau entgegengesetzt verhält es sich mit GH (71). Kawashima et
al. (71, 72) konnten zwischen ovulatorischen und anovulatorischen Kühen jedoch
keine Unterschiede hinsichtlich der metabolischen Parameter freie Fettsäuren,
Cholesterol und Glukose feststellen. Daraus schließen die Autoren, dass der IGF-IWert sensitiver zu sein scheint, um metabolische Belastungen darzustellen als beispielsweise freie Fettsäuren. Ähnliche Zusammenhänge konnten Piechotta et al. (10)
aufzeigen. Sie beobachteten bereits vor der Geburt bei Tieren mit Produktionserkrankungen niedrigere IGF-I-Konzentrationen als bei Tieren, die postpartal gesund
blieben. Ihren Ergebnissen zufolge bestand bei Tieren mit IGF-I-Werten um
100 ng/ml zwischen dem 242. bis 250. Tag post inseminationem (p. insem.) ein
höheres Risiko an Produktionserkrankungen zu erkranken, als bei Tieren mit IGF-IWerten über 130 ng/ml.
12
2.3 Produktionserkrankungen
Mulligan und Doherty (1) postulieren, dass häufig die Unfähigkeit einzelner Kühe, die
hohen metabolischen Ansprüche zu erfüllen, die Entstehung von Produktionserkrankungen bedinge. Zu den sogenannten Produktionserkrankungen zählen in der Literatur Ketose, Labmagenverlagerung, Leberverfettung, Hypokalzämie, Nachgeburtsverhaltung, Metritis, Endometritis und Mastitis (73). Diese treten, wie bereits
beschrieben, mit erhöhter Inzidenz in der Transitperiode auf und sind ätiologisch eng
miteinander verbunden (1). Die Pathogenese der Produktionserkrankungen ist
komplex und laut Ingvartsen et al. (2) nicht per se mit einer hohen Milchleistung in
Verbindung zu bringen. So sind beispielsweise Labmagenverlagerungen eher auf die
Futteraufnahme und betriebliche Fütterungsfehler zurückzuführen (2). Hypokalzämien sind ebenso durch Fütterungsfehler bedingt, stehen aber auch mit der Anzahl
der Laktationen in Zusammenhang (74). Eine andere Vermutung von Ingvartsen et
al. (2) ist, dass „hormonelle Gegebenheiten“ eine Immunsuppression bedingen und
es infolgedessen zu einer erhöhten Prävalenz von Erkrankungen komme. So
begünstigen vor allem hohe Progesteronspiegel die Entstehung von bakteriellen
Uteruserkrankungen, wohingegen erhöhte Östrogenwerte die Resistenz der Tiere
gegenüber der Entwicklung von Uteruserkrankungen steigern (75). Die allein durch
uterine Krankheiten entstehenden wirtschaftlichen Schäden in der Europäischen
Union schätzen Sheldon et al. (5) auf jährlich 1,4 Milliarden Euro. Auch unter dem
Aspekt des Tierschutzes sind Krankheiten zu vermeiden und daher Risikofaktoren
bereits im Vorfeld von deren Entstehung zu reduzieren (76). Borghetti et al. (6)
gehen davon aus, dass ein detailliertes Verständnis der Regelmechanismen der
unspezifischen Abwehr und die damit einhergehende mögliche Intervention die
Inzidenz von Krankheiten verringern könnte.
2.3.1 Ketose
Liegt ein Energiemangel vor, so kommt es zur Freisetzung freier Fettsäuren aus dem
Fettgewebe in die Blutbahn. Diese FFS gelangen in die Leber und werden dort zum
großen Teil mittels β-Oxidation zu Acetyl-CoA abgebaut. Das entstehende AcetylCoA wird im Zitratzyklus weiter verstoffwechselt und kann somit als Energieträger
genutzt werden (77). Durch die laktationsbedingte hohe Belastung der Glukoneogenese und der hohen Depotfettmobilisierung kommt es in der Leber zu einer Kon13
kurrenzsituation im Zitratzyklus. Das entstehende Acetyl-CoA wird daher unter Umgehung des Zitratzyklus teilweise zu Acetacetat und weiter zu den Ketonkörpern
β-Hydroxybutyrat und Aceton umgewandelt und von der Leber in den Blutkreislauf
abgegeben (77). In der Peripherie können vor allem Herz, Skelettmuskulatur, Niere,
Milchdrüse und Gastrointestinaltrakt die Ketonkörper verstoffwechseln (78) und damit
zum Teil die benötigte Glucose ersetzen (24). Wenn die Kapazität der Verstoffwechselung der Ketonkörper in der Peripherie überschritten ist, kommt es zur
Ausscheidung dieser über Niere, Milchdrüsen, Haut und Atemluft und bei Überschreitung der Ausscheidungskapazität zu einer Akkumulation im Plasma. Die
erhöhte Konzentration an Ketonkörpern führt zur metabolischen Azidose (24) und
darüber hinaus kann es zu nervalen Beeinträchtigungen kommen, die von einer
Hypomotilität des Magen-Darm-Traktes bis hin zu nervösen Symptomen reichen
können (77).
2.3.2 Labmagenverlagerung
Bei der Labmagenverlagerung handelt es sich um ein multifaktorielles Geschehen,
dessen primäre Ursache bis heute unbekannt ist (79). Von den diagnostizierten Labmagenverlagerungen bei Hochleistungskühen treten bis zu 80% in den ersten vier
Wochen post partum auf. Durch eine Dilatation und eine Ansammlung von Gas aus
dem Labmageninhalt, steigt der Labmagen zwischen der linken oder rechten
Bauchwand und dem Pansen bzw. den anderen inneren Organen auf. Dieses
Geschehen wird durch eine Atonie oder eine bereits bestehende Dilatation des
Labmagens begünstigt, wobei eine Hypomotilität des Gastrointestinaltraktes durch
peripartale Stresszustände, metabolische Imbalancen und andere vorliegende
Erkrankungen die Labmagenverlagerung zu fördern scheinen. Daher ist diese
Produktionserkrankung häufig mit anderen Krankheiten vergesellschaftet (77). Vor
allem sind erhöhte Werte von β-Hydroxybutyrat und FFS sowie niedrige
Kalziumkonzentrationen miteinander in Verbindung gebracht worden (80).
14
2.3.3 Leberverfettung
Als Leberverfettung bezeichnet man die Akkumulation von Triglyzeriden in der Leber,
die zu Beginn der Laktation bei Milchkühen bis zu einem geringen Grad physiologisch ist und zunächst nicht die Leberfunktion beeinträchtigt (21).
Die von der Leber aufgenommenen FFS werden zum einen bei der β-Oxidation zu
Actyl-CoA abgebaut, das anschließend, wie beschrieben, in den Zitratzyklus eingeschleust oder zu Ketonkörpern umgewandelt und in die Blutbahn abgegeben wird.
Zum anderen können die Hepatozyten die FFS zu Triglyceriden umwandeln und als
Very Low Density Lipoproteine (VLDL) in die Blutbahn abgeben (21). Die Kapazitäten
zur Ausschleusung von VLDL und Einschleusung der FFS in die β-Oxidation sind allerdings begrenzt, so dass Triglyceride auch in den Hepatozyten gespeichert werden
können, da die Aufnahme freier Fettsäuren keiner Limitation unterliegt (21). Ab
einem Verhältnis von gespeicherten Triglyceriden zu Glykogen von 2:1 kommt es zur
hepatosteatosebedingten Leberinsuffizienz mit Ketose, verminderter Glukoneogenese und mangelnder Harnstoffbildung und dadurch zum verminderten Abbau von
Ammoniak. Die Akkumulation von Ammoniak im Körper kann zum puerperalen
Leberkoma führen (21, 77). Der Grad der Leberverfettung ist laut Hammon et al. (38)
auch für einen erhöhten Quotienten von Glukagon zu Insulin verantwortlich und
besitzt damit einen großen Einfluss auf den Metabolismus.
2.3.4 Nachgeburtsverhaltung
Der physiologische Zeitraum für den Abgang der Nachgeburt wird bei vielen Autoren
mit 12, teilweise mit bis zu 24 Stunden nach der Geburt angegeben. Kommt es nicht
zu einer Ablösung der Nachgeburt innerhalb dieses Zeitraums, wird von einer Nachgeburtsverhaltung gesprochen (81-83). Bei zwei Drittel der Kühe findet der
Nachgeburtsabgang in den ersten sechs Stunden post partum statt (82). Der Anteil
der spontanen Nachgeburtsverhaltungen der Rinder ohne prädisponierende Faktoren wird von Sheldon et al. (4) mit 2 – 5% angegeben. Die Inzidenz in Herden
beträgt 4 – 12% und wird vor allem von Managementfaktoren wie Hygiene und
geburtshilflichen Maßnahmen beeinflusst (83). Es werden verschiedene Risikofaktoren für die Entstehung von Nachgeburtsverhaltungen beschrieben (82, 83).
Hierzu zählen eine hormonelle Geburtseinleitung, eine verkürzte Graviditätsdauer,
Aborte, Zwillingsträchtigkeiten, Dystokien, Fetotomien, Kaiserschnitte, eine Unter15
versorgung mit Vitamin E und Selen, eine Immunsuppression und infektiöse
Agenzien wie Bovines Virus Diarrhoe Virus (82). Heuwieser et al. (84) konnten
zudem bei Nachgeburtsverhaltungen eine reduzierte Chemotaxis der neutrophilen
Granulozyten nachweisen.
In der Literatur wird übereinstimmend berichtet, dass eine Nachgeburtsverhaltung zu
einer erhöhten Prädisposition für andere Produktionserkrankungen führt und negative Einflüsse sowohl auf die uterine Involution und das weitere Reproduktionsgeschehen hat (82). Die Rast- und Güstzeiten verlängern sich, die Trächtigkeitsrate
nimmt ab und die Anzahl der Besamungen pro Tier zu (82).
2.3.5 Metritis und Endometritis
Eine Metritis tritt in den ersten 21 Tagen nach der Geburt auf und ist nach Sheldon et
al. (5) gekennzeichnet durch eine Vergrößerung des Uterus mit einem flüssigen rotbraunen bis viskösen weißlichen purulenten Ausfluss.
Bei einer bakteriellen Infektion sind die am häufigsten nachgewiesenen Bakterien
Arcanobacterium pyogenes, Fusobacterium necrophorum, Escherichia coli und Prevotella species (5, 85, 86). Nachgeburtsverhaltung, Dystokie, Zwillingsgeburt und
Totgeburt bedingen ein vermehrtes Auftreten von Metritiden (86) und werden nach
Sheldon et al. (5) in drei Grade eingeteilt:
Der Grad 1 beschreibt eine Vergrößerung des Uterus in den ersten 21 Tagen nach
der Geburt mit purulentem Vaginalausfluss ohne eine akute systemische Erkrankung. Beim Grad 2 einer Metritis liegt eine akute systemische Erkrankung vor, die auf
eine Infektion des Uterus mit Bakterien zurückzuführen ist und durch stinkenden, rotbraunen, flüssigen Uterusausfluss sowie Fieber, reduzierte Milchleistung und Abgeschlagenheit gekennzeichnet ist. Bei zusätzlichen Anzeichen einer Toxämie mit Inappetenz und Schocksymptomatik wird die Metritis als Grad 3 gewertet.
Nach Sheldon et al. (4) können bei 80 – 100% der Kühe postpartal Bakterien im
Uterus nachgewiesen werden. Der Anteil der Metritiden liegt bei ca. 40% der Tiere in
der ersten Woche nach der Geburt; bei etwa 15 – 20% der Tiere entwickelt sich daraus eine klinische Endometritis. Weitere 30% der Tiere weisen subklinische Endometritiden auf (4, 5).
Eine Endometritis ist histopathologisch als eine Entzündung des Endometriums definiert, wobei die Entzündungszeichen nicht über das Stratum spongiosum hinaus16
reichen (86). Bei der klinischen Endometritis ist nach mehr als 21 Tagen p.p.
purulenter bzw. nach über 26 Tagen mukopurulenter vaginaler Ausfluss nachweisbar. Dabei liegen allerdings keine Anzeichen einer systemischen Erkrankung vor
(86). Nach Sheldon et al. (5) liegt eine subklinische Endometritis vor, wenn der Anteil
neutrophiler Granulozyten in vom Uterus genommen Zytologieproben über 5,5 – 10%
liegt. Diese Erkrankung führt zu keinen klinischen Symptomen, aber zu einer
niedrigeren Trächtigkeitsrate und zu einem erhöhten Abgangsrisiko bei den betroffenen Tieren (86). Kaufmann et al. (87) stellen einen Zusammenhang zwischen
dem Metabolismus, insbesondere den FFS im Blutplasma am Tag vor der Geburt
und der Häufigkeit des Auftretens von klinischen und subklinischen Endometritiden
fest. Dabei besitzen die FFS zwar eine geringe Sensitivität (35 – 38%), allerdings
eine hohe Spezifität (87 – 89 %) hinsichtlich der Prognostizierbarkeit von klinischen
bzw. subklinischen Endometritiden.
2.4 Angeborene Immunantwort
2.4.1 Definition
Nach Tizard et al. (88) versteht man unter angeborener Immunantwort bereits
vorhandene und schnell reagierende chemische und zelluläre Abwehrmechanismen.
Für die Erregererkennung ist von entscheidender Bedeutung, dass sich diese von
körpereigenen Bestandteilen unterscheiden, d.h. Pathogen-assoziierte molekulare
Strukturen (PAMPs) besitzen. Es gibt Enzyme und Bindungsproteine, die die Zellwände von Erregern zerstören oder für eine schnellere Erkennung und Zerstörung
markieren können und Immunzellen, die PAMPs erkennen. Die Immunzellen lösen
dann eine Entzündung durch die Ausschüttung von Zytokinen und Chemokinen aus.
Dies fördert die gerichtete Aktion gegen Pathogene, so dass es zu einer
Akkumulation von Entzündungszellen im betroffenem Gewebe kommt (88).
Beispiele für PAMPs sind bakterienspezifische, hoch konservierte Proteine und
andere Strukturen. Dazu zählen unter anderem Proteine der Bakterienzellwand oder
Bestandteile der bakteriellen DNA (88). Ein besonders weitverbreitetes dieser
PAMPs ist das Lipopolysaccharid (LPS), eine Zellwandstruktur gram-negativer
Bakterien (88).
17
Rezeptoren zur Erkennung der PAMPs und damit auch von LPS sind u.a. Toll-like
Rezeptoren, die auf verschiedenen Zellen des Immunsystems (88) und auf
epithelialen Zellen, unter anderem des Uterus, nachgewiesen worden sind (89). Die
Aktivierung des TLR4 durch LPS und die damit einhergehende Ausschüttung von
Zytokinen durch Immunzellen können zu einer toxischen Reaktion führen, wodurch
der Name Endotoxin für LPS begründet ist (5, 85, 90).
Dabei vermitteln die Zytokine eine pyrogene Wirkung, erhöhen die kapillare Permeabilität und bedingen dadurch eine erhöhte prokoagulatorische Aktivität der Zellwände. Durch eine zu hohe Stimulation dieser Mechanismen durch die ausgeschütteten
Zytokine kann es bis hin zum Schock durch Volumenmangel und einer disseminierten intravasalen Gerinnung kommen (88, 91). Die Toxizität wird dementsprechend
nicht durch die direkten Wirkungen von LPS auf die Zellen erzielt, sondern durch die
überschießende Freisetzung von Zytokinen aus den Entzündungszellen (88). Dies
zeigten Hoshino et al. (90) bei Mäusen, die den LPS-spezifischen Rezeptor TLR-4
nicht besaßen und dadurch nur eine sehr geringe Reaktion auf LPS zeigten.
Durch die physiologisch ausgelöste Entzündungsreaktion mit Dolor (Schmerz), Tumor (Schwellung), Rubor (Rötung) und Calor (Erwärmung), aber auch durch bakterielle Produkte (z.B. LPS), Faktoren des Komplementsystems, Moleküle beschädigter Zellen und sezernierte Chemokine werden Monozyten, die sich zu Makrophagen
im Gewebe entwickeln, und neutrophile Granulozyten an den Ort der Entzündung
„gelockt“ und aktiviert. Dabei steigt die Zahl der Makrophagen erst Stunden nach
derjenigen der neutrophilen Granulozyten an (9).
Makrophagen schütten Interleukine, inflammatorische Lipide und PGE2, sowie auch
antiinflammatorische Zytokine aus (88, 92). Dazu wird die Aktivität der Makrophagen
durch bakterielle Endotoxine, Östrogene und einfache Lipide gesteigert, wogegen
Steroide wie Cortisol und Progesteron die Makrophagenaktivität hemmen (88).
Immunzellen fördern die Freisetzung von Zytokinen, wie diejenige des Tumor
Nekrose Faktors (TNF)-α, den Proteinkatabolismus in Muskelzellen. Weiterhin bedingt TNF-α eine höhere Verfügbarkeit von Lipiden im Organismus, zum einen durch
eine gesenkte Aufnahme und zum anderen durch eine erhöhte Bereitstellung durch
Adipozyten (88).
Nach Tizard et al. (88) besitzt das angeborene Immunsystem im Gegensatz zu der
erworbenen Immunität keinen „Memory Effekt“ und die Entzündung fällt dadurch auf
einen Entzündungsreiz immer gleich stark aus. Dagegen konnte die Studie von
18
Elsasser et al. (9) zeigten in einer Studie, dass die Immunantwort durch ein
Zusammenspiel mit dem Endokrinium moduliert und kontrolliert werden kann. GH
bewirkte bei Rindern eine deutlich verminderte Cortisol- und TNF-α-Ausschüttung.
Deshalb gehen die Autoren davon aus, dass die Somatotrope Achse gerade in der
frühen Phase der Infektion die ablaufende angeborene Immunantwort und damit die
weitere Pathologie beeinflussen kann. Dem stehen Untersuchungen von Sartin et al.
(93) entgegen, die mit GH einen infektionsbedingten Rückgang der IGF-I-Konzentrationen nicht beeinflussen konnten. Borghetti et al. (6) gehen in ihrem Review
davon aus, dass die Immunantwort durch eine komplexe neuroendokrine homöostatische Antwort moduliert und in ihrer Effektivität beeinflusst werden kann und die
widersprüchlichen Aussagen durch eine zeitlich unterschiedliche Verabreichung von
GH zustande kamen.
2.4.2 Besonderheiten
der
angeborenen
Immunantwort
in
der
Transitperiode
Das endokrine System führt, wie bereits beschrieben, in der Transitperiode zu einer
Stoffwechselumstellung von einer anabolen hin zu einer katabolen Stoffwechselkonstellation. Ingvartsen et al. (2) gehen davon aus, dass es durch diese peripartalen
Veränderungen der Hormone und Metaboliten direkt oder indirekt zu einer Beeinflussung der Immunantwort kommt. Auch Sheldon et al. (4) vertreten die Meinung, dass
unter anderem die Immunabwehr durch die endokrinen Gegebenheiten negativ
beeinflusst werden könnte, auch wenn die genauen Mechanismen weiterhin größtenteils unbekannt seien (4). Sowohl Mehrzad et al. (94) als auch Hoeben et al. (95)
konnten zeigen, dass nach der Geburt die Anzahl neutrophiler Granulozyten im Blut
abnimmt. Viele Autoren gehen deshalb von einer Immunsuppression in dieser Phase
aus (1, 94, 96), wohingegen Sander et al. (97) keine verminderte Phagozytoseleistung der neutrophilen Granulozyten beobachteten konnten.
Nach der Geburt geht die physiologische Involution des Uterus mit einer Nekrose
und dem Ablösen der Karunkeln einher. Diese Vorgänge bieten günstige Voraussetzungen für das Wachstum von aeroben und anaeroben Bakterien im Uteruslumen und
müssen dementsprechend durch uterine Abwehrmechanismen, das heißt lokale Immunitätsmechanismen bekämpft werden (4). Gerade bei Hochleistungsmilchkühen
ist die Inzidenzrate der uterinen Erkrankungen, verglichen mit anderen domestizier19
ten Tierarten, hoch (4). So kommt es bei über 80% der Tiere zu einer nachweisbaren
bakteriellen Besiedelung des Uterus in den ersten zwei Wochen nach der Geburt (5).
Es ist dabei aber klar zwischen einer Besiedelung und einer Infektion zu trennen.
Während bei der Besiedelung lediglich Bakterien nachweisbar sind, kommt es bei
einer uterinen Infektion zur Erkrankung entweder durch Adhärenz an die Mucosa mit
einer Kolonisation und Penetration des Epitheliums oder durch die Ausschüttung von
Toxinen (86). Sheldon et al. (86) postulieren, dass der Übergang von einer Besiedelung zu einer Infektion während der Transitperiode durch die Einwirkungen endokriner Faktoren auf das Immunsystem beeinflusst wird. Bei der Maus wurde gezeigt,
dass in diesem Zusammenhang gerade das Verhältnis von Progesteron und Östrogen eine bedeutende Rolle für die Entzündung des Uterus spielt. Östrogene fördern
und Progesteron hemmt die Entzündung des Uterus und die anschließende Ausheilung (98).
Bei den Rindern wird vor allem Progesteron eine besondere Rolle zugeschrieben, da
gerade während der lutealen Phase die Inzidenz von uterinen Erkrankungen erhöht
ist und die iatrogene Luteolyse eine der effektivsten Behandlungsansätze uteriner
Erkrankungen darstellt (99-101). LeBlanc (15) geht davon aus, dass metabolische
Faktoren, insbesondere eine Ketose und erhöhte FFS, für die Entstehung von
uterinen Erkrankungen wichtig seien.
2.5 Immun-endokrine Netzwerke
In einem Review von Borghetti et al. (6) wird ausführlich beschrieben, dass die
beidseitige Kommunikation zwischen dem Immun- und dem Neuroendokrinen System eine bedeutende Rolle in der metabolischen, produktiven und verhaltenstechnischen Homöostase spielt und dadurch die Effizienz der Immunantwort gegenüber
infektiösen Agenzien und somit die Aufrechterhaltung der Gesundheit beeinflusst.
Bestehende Ungleichgewichte auf hormoneller Ebene können zu einer erhöhten
Empfänglichkeit für Erkrankungen und einem schweren Verlauf infektiöser Erkrankungen führen (102). Die enge Vernetzung von Nerven-, Immun- und Endokrinem
System wird dadurch deutlich, dass zum Teil dieselben Proteine synthetisiert werden
und die verschiedenen Systeme auch auf die gleichen Proteine reagieren können
(6). Im Nervensystem reagiert der Hypothalamus auf höhere IGF-I-Konzentrationen
mit einer erhöhten Ausschüttung von GHIH und einer verminderten GHRH20
Ausschüttung. Aber auch im Cerebellum, Hippocampus und Bulbus olfactorius sind
hohe IGF-I-Konzentrationen nachweisbar (45). Im Immunsystem besitzen fast alle
Zellen einen IGF-I-Rezeptor und in vitro reagieren selbst ausgereifte Leukozyten auf
eine Stimulation mit IGF-I mit einer erhöhten Aktivität beispielsweise bei der
Zytokinproduktion (8).
Nach einer Stimulation mit IGF-I kommt es bei neutrophilen Granulozyten und Makrophagen zu einer Aktivitätssteigerung in Form einer erhöhten Ausschüttung von
Zytokinen und einer erhöhten Bakterienzerstörungskapazität durch reaktive Sauerstoffspezies (6). Ferner wurde bei Mäusen nach Behandlung mit IGF-I und GH eine
vermehrten Ansammlung von Immunzellen bei einer iatrogen erzeugten Peritonitis
beobachtet (8). Speziell GH ist bei Rindern in der Lage, die TNF-α-Ausschüttung auf
einen inflammatorischen Reiz hin zu senken (9). Somit sind in der Literatur viele
Hinweise vorhanden, dass die Immunantwort sowohl auf humoraler als auch
zellulärer Ebene durch GH und IGF-I moduliert wird (6, 8, 103).
Aber nicht nur Hormone regulieren die Immunantwort, sondern GH produzierende
Zellen der Hypophyse reagieren auch auf Produkte der Immunzellen wie beispielsweise das Zytokin Interleukin-1 (IL-1) (104). Bei Rindern ist beschrieben worden,
dass es, vermittelt durch TNF-α, IL-1 und vermutlich PAMPs wie LPS, zur Reduktion
der GH-Ausschüttung kommt (6, 56). Allerdings ist nach Carroll et al. (56) die
Reaktion der Somatotropen Achse auf inflammatorische Zytokine und Produkte bei
verschiedenen Spezies nicht einheitlich. So weisen Schweine und Schafe im Gegensatz zu Rindern während einer Infektion eine Entkopplung der GH-IGF-I-Achse auf,
die mit hohen GH- und niedrigen IGF-I-Konzentrationen einhergeht. Dies geschieht,
wie beschrieben, auch bei Milchkühen in der Transitperiode (23). Bei entzündlichen
Erkrankungen kommt es allerdings nach Whitlock et al. (92) bei Rindern zu einer
Depression der GH-Ausschüttung und nicht zu einer vermehrten Freisetzung.
Der Einfluss von GH auf die Immunantwort wird jedoch kontrovers diskutiert. Zum
einen zeigen GH knock out Mäuse, dass GH nicht für die Aufrechterhaltung der Immunfunktion notwendig ist, zum anderen scheint aber GH die immunsuppressiven
Effekte von Glukokortikoiden in Stresssituationen zu kontrollieren (102, 105).
Vor allem die durch eine GH-Resistenz und Entkopplung der Somatotropen Achse
resultierenden reduzierten IGF-I-Konzentrationen verschieben nach Ansicht verschiedener Autoren (6, 56) die metabolischen und nutritiven Gegebenheiten hin zu
einer Unterstützung der Immunantwort.
21
Nicht nur die Somatotrope Achse ist im Rahmen der immun-endokrinen Netzwerke
zu erwähnen. Auch die Schilddrüse ist in Krankheitsgeschehen involviert und es
kommt bei Säugetieren zu einem in der Literatur als Euthyreotes Krankheitssyndrom
oder auch Nicht-Thyreodales-Erkrankungs-Syndrom (NTIS) beschriebenen Phänomen, bei dem die T4- und T3-Konzentrationen unter den Normalbereich absinken.
Freies T4 und Thyreoidea stimulierendes Hormon (TSH) bleiben dagegen im
Normalbereich (106). Dieses Euthyreote Krankheitssyndrom mit erniedrigten T 4Konzentrationen und normalen TSH-Werten konnte auch in Zusammenhang mit
erhöhten Werten von FFS, der vermehrten Freisetzung von Zytokinen und auch der
exogenen Verabreichung von Glukokortikoiden gezeigt werden. Ob es sich bei dem
Euthyreoten Krankheitssyndrom um einen protektiven Mechanismus oder eine
Störung handelt, wird diskutiert (106).
Borghetti et al. (6) gehen davon aus, dass die bidirektionale Kommunikation über
Zytokine, Hormone, Neurotransmitter und Neuropeptide es ermöglicht, die angeborene Immunantwort zu potenzieren, mögliche überschießende und damit schadhafte
Effekte zu kontrollieren und die Immunantwort unterstützende, metabolische und nutritive Veränderungen zu aktivieren. Dabei betonen sie auch, dass bestehende Ungleichgewichte in den hormonellen Regelmechanismen zu einer erhöhten Infektionsanfälligkeit und einem schwereren Verlauf der Erkrankung führen können. Die Autoren (6) gehen davon aus, dass gerade das Verständnis der Änderungen der
Somatotropen Achse neue Ansätze für eine therapeutische Unterstützung einer effizienteren Immunantwort geben könnte.
22
3 Material und Methode
3.1 Tiere
Die für diesen Versuch verwendeten Tiere waren pluripare schwarzbunte Kühe der
Rasse Holstein Friesian. Die Kühe wurden alle aus dem Großbetrieb der Agrargesellschaft mbH Siedenlangenbeck, Kuhfelde ausgewählt. Auf dem Betrieb wurden
die Tiere in einem Boxenlaufstall gehalten und erhielten eine Totale Mischration
(Tab. 1, 2, 3 und 4 im Tabellenanhang). Der Tierversuch wurde in Absprache mit
dem Tierschutzbeauftragten der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover beim
LAVES Oldenburg genehmigt (Aktenzeichen: 33.9-42502-04-09/1696).
3.2 Versuchsaufbau
Der im Folgenden beschriebene Versuch gliederte sich in zwei Phasen:
Die erste Phase (Antepartaler Zeitraum 3.2.1) begann am Tag der Probenahme
(Auswahlprobe) auf dem Betrieb (240. bis 254. Tag p. insem.) bis hin zu einer in der
Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover stattgefundenen
Spontangeburt. Diesem Versuchsabschnitt lag die Fragestellung zugrunde, ob sich
die Kühe in bestimmten hormonellen und metabolischen Parametern unterscheiden,
die anhand der IGF-I-Konzentrationen in der Auswahlblutprobe selektioniert wurden.
Maximal zwei Tiere wurden gleichzeitig vor dem 266. Tag p. insem. in die Klinik für
Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover gebracht und aufgestallt. Bei
allen Tieren wurde bis zum 266. Tag p. insem. eine Klauenpflege durchgeführt. Ab
dem 263. bis 266. Tag p. insem. wurde täglich morgens zwischen 7.30 und 8.30 Uhr
Blut aus der Vena (V.) coccygea genommen. Die Geburt wurde als Zeitpunkt 0
definiert und die Proben retrospektiv zu diesem Zeitpunkt zugeordnet. Die Probe -1
wurde als die zuletzt genommene Probe an dem der Spontangeburt vorangegangen
Morgen definiert.
In der zweiten Phase des Versuches, der 30 Minuten nach dem spontanen Abgang
der Nachgeburt begann, wurden die beiden ausgesuchten IGF-I-Gruppen hinsichtlich
unterschiedlicher hormoneller und immunologischer Parameter als Reaktionen auf
eine experimentell induzierte uterine Inflammation untersucht. Dieser Versuchsteil
23
bezieht sich auf einen Zeitraum bis 15 Stunden nach der Geburt und wird im
Weiteren als „Postpartaler Zeitraum“ beschrieben (3.2.2; Abb. 1).
3.2.1 Antepartaler Zeitraum
Die Versuchstiere wurden zwischen dem 240. und 254. Tag p. insem. auf Grundlage
der Betriebsdaten und einer klinischen Untersuchung im Betrieb für die Entnahme
der Auswahlprobe selektioniert.
Die Tiere befanden sich in der zweiten bis vierten Trächtigkeit und in der vorherigen
Laktation wurde eine durchschnittliche Milchleistung von 6000 bis 9500kg erbracht.
Kühe mit einer Milchleistung von über 9.500kg wurden aus betriebswirtschaftlichen
Gründen nicht beprobt.
Die Tiere wurden, wie bereits beschrieben, klinisch untersucht (Habitus, Haltung,
Bewegung, Fellveränderungen, Ekzeme, Bursitiden, palpatorische Euterkontrolle und
Fruchtgegenstoß) und bei mittel- bis hochgradigen pathologischen Befunden, wie
einer Lahmheit vom Grad ≥ 2, nicht beprobt. Zudem wurde darauf geachtet, dass
sich die Tiere einheitlich in Bezug auf den Body Condition Score (BCS) darstellten.
Es wurde eine Blutprobe aus der V. coccygea entnommen und in ein Serumröhrchen
und ein mit EDTA als Antikoagulanz beschichtetes Röhrchen (Sarstedt, Nümbrecht,
Deutschland) gefüllt. Für die Glutaraldehydprobe (GAP) wurden 3 ml Blut in ein mit
Glutardialdehyd und EDTA vorbereitetes Röhrchen (Klinisches Labor, Klinik für
Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Deutschland) gegeben und
alle 30 Sekunden geschwenkt, um eine Koagulation in den ersten drei Minuten beurteilen zu können. Die GAP galt als positiv, wenn eine Koagulation in den ersten
drei Minuten auftrat. Tiere mit einer positiven GAP (≤ 3 Minuten) wurden vom
weiteren Versuch ausgeschlossen.
Die Selektion der Versuchstiere, die in die Klinik für Rinder verbracht wurden,
erfolgte im Weiteren auf Grundlage der am nachfolgenden Tag bestimmten IGF-IKonzentration wie unter 3.3.1. beschrieben.
3.2.2 Postpartaler Zeitraum
Nach dem spontanen Abgang der Nachgeburt wurde der postpartale Entzündungsversuch mit intrauteriner LPS- oder Natrium Chlorid (NaCl)-Infusion durchgeführt
24
(Abb. 1). Hierfür wurde eine 39°C warme LPS-Lösung in den Uterus infundiert. Unmittelbar vor der LPS-Infusion und in 30 minütigen Abständen nach der LPS-Infusion
wurde Blut aus der V. jugularis entnommen. Die Tiere wurden 180 Minuten nach der
LPS-Infusion euthanasiert und Gewebeproben zur Auswertung entnommen. Die Blutproben wurden mit den Zeitpunkten relativ zur Uterusinfusion zum Zeitpunkt 0
Minuten gekennzeichnet.
In den LPS-Versuch wurden lediglich Tiere einbezogen, die bis zum Zeitpunkt der
Spontangeburt klinisch gesund waren und bei denen während der Geburt nur eine
geringgradige Haltungskorrektur und/oder leichte Zughilfe durchgeführt werden
musste. Zudem war Bedingung für die Aufnahme in die Auswertung, dass die
Nachgeburt innerhalb von 12 Stunden nach der Entwicklung des Kalbes ausgestoßen wurde.
Die Tiere, bei denen die Einschlusskriterien zum Versuch nicht erfüllt waren, wurden
als „Kontrolltiere“ zu den Tieren mit einer LPS-Infusion verwendet. In diesem Fall
wurde lediglich geprüft ob sich statistische Unterschiede innerhalb ausgewählter
Blutparameter (IGF-I, GH, Cortisol, Adrenocorticotropes Hormon (ACTH), T 4, T3,
Progesteron (P4), E2, Prostaglandin F2α Metabolit (PGFM) und Insulin) zwischen
Tieren, die eine LPS-Infusion bzw. eine NaCl-Infusion erhielten, bestanden. Weil die
Tiere nicht die Einschlusskriterien für die LPS-Gruppe erfüllten, handelt es sich um
keine tatsächliche Kontrollgruppe und sie werden im Folgenden als NaCl-Gruppe
bezeichnet. Die NaCl-Gruppe erhielt 12 Stunden nach der Geburt einen Liter auf
39°C erwärmte physiologische Natriumchloridlösung (0,9% NaCl, Braun, Melsungen,
Deutschland) nach dem Protokoll des LPS-Versuches in den Uterus infundiert.
Anschließend wurden im gleichen Zeitintervall wie beim LPS-Versuch Blutproben
genommen. Zudem wurde bei allen Tieren des postpartalen Versuches die Körperinnentemperatur, Atem- und Herzfrequenz bestimmt, um bei der späteren Auswertung einen Effekt der LPS-Infusion gegenüber einer NaCl-Infusion beurteilen zu
können. Die Tiere der NaCl-Gruppe wurden nach dem Versuch nicht euthanasiert.
Die IGF-I-, GH-, Cortisol-, P4- und PGFM-Konzentration wurde aus allen genommenen Proben gemessen (Abb. 2). Insulin, E2, T4, T3 und ACTH wurde nur in ausgewählten Proben bestimmt (siehe Abb. 2). In der Auswahlprobe vom Betrieb, der
ersten Blutprobe zwischen dem 263. bis 266. Tag p. insem. und der Blutprobe am
Tag der Geburt wurden die freien Fettsäuren bestimmt.
25
Blutprobenentnahme auf dem Betrieb zwischen den Tagen 240 bis 254 Tag post
inseminationem (p. insem.)
Antepartaler Zeitraum
IGF-I-Bestimmung
>175ng/ml
<125ng/ml
IGF-I niedrige Gruppe (n=10)
IGF-I hohe Gruppe (n=10)
Transport in die Klinik der Stiftung Tierärztliche Hochschule
Hannover zwischen den Tagen 250 bis 265 p. insem.
Tägliche Blutprobenentnahme ab dem 263. bis 266. Tag
p. insem. bis zur Geburt
Geburt
Postpartaler Zeitraum
Geburtshilfe durch
maximal eine Person, Tier
gesund und Abgang der
Nachgeburt innerhalb von
12 Stunden
LPS-Infusion
IGF-I niedrige Gruppe
Blutproben nach 0,
30, 60, 90, 120, 150
und 180 Minuten
Geburtshilfe durch zwei
Personen, Tier vorher
erkrankt oder
Nachgeburtsverhaltung
Geburtshilfe durch
maximal eine Person, Tier
gesund und Abgang der
Nachgeburt innerhalb von
12 Stunden
NaCl-Infusion
LPS-Infusion
IGF-I hohe Gruppe
Blutproben nach 0,
30, 60, 90, 120, 150
und 180 Minuten
Blutproben nach 0,
30, 60, 90, 120, 150
und 180 Minuten
Euthanasie und
Gewebeentnahme
nach 180 Minuten
Euthanasie und
Gewebeentnahme
nach 180 Minuten
Abb. 1: Versuchsablauf während des antepartalen und postpartalen Zeitraums. LPS:
Lipopolysaccharid; IGF-I: Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor; NaCl: Natriumchlorid
26
Antepartaler Zeitraum
Postpartaler Zeitraum
Auswahlblutprobe
IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM, Ins, T4, T3, E2
Tag -17
IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM, Ins, T4, T3, E2
Tag -16
IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM
Tag -15
IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM, Ins, T4, T3, E2
Tag -14
IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM
Tag -13
IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM, Ins, T4, T3, E2
Tag -12
IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM
Tag -11
IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM, Ins, T4, T3, E2
Tag -10
IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM
Tag -9
IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM, Ins, T4, T3, E2
Tag -8
IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM
Tag -7
IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM, Ins, T4, T3, E2
Tag -6
IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM
Tag -5
IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM, Ins, T4, T3, E2
Tag -4
IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM
Tag -3
IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM, Ins, T4, T3, E2
Tag -2
IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM
Tag -1
IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM, Ins, T4, T3, E2
Tag 0 (Geburt)
IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM, Ins
Versuch 0 Min
IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM, Ins, T4, T3, E2
Versuch 30 Min
IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM, ACTH
Versuch 60 Min
IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM, Ins, T4, T3, E2
Versuch 90 Min
IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM
Versuch 120 Min
IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM, Ins, T4, T3, E2
Versuch 150 Min
IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM, ACTH
Versuch 180 Min
IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM, Ins, T4, T3, E2
Abb. 2: Art und zeitliches Schema der Blutprobenanalyse während des antepartalen
und postpartalen Zeitraums. IGF-I: Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor; GH: Wachstumshormon; P4: Progesteron; Cor: Cortisol; PGFM: 13,14-dihydro-15-keto-PGF2α;
Ins: Insulin; T4: Thyroxin; T3: Trijodthyronin; E2: 17β-Östradiol; ACTH: Adrenocorticotropes Hormon
27
3.3 Antepartaler Zeitraum
3.3.1 Auswahlkriterien der Versuchstiere
Im Anschluss an die Probennahmen im Stall wurden die Blutproben bei 2000 x g
zentrifugiert (EBA 20, Hettich, Tuttlingen, Deutschland) und das Serum bzw. Plasma
in ein Eppendorfgefäß überführt, auf Eis gekühlt transportiert und bis zur Analyse bei
-20°C eingefroren. Für die IGF-I-Einteilung wurde im Endokrinologischen Labor die
IGF-I-Konzentration mittels eines für bovines Plasma etablierten kommerziellen
ELISA erfasst (IGF-I ELISA; Beckman Coulter, California, USA; siehe 3.6.1).
Es wurde ein Grenzwert von 131,5 ng/ml angenommen, basierend auf der Arbeit von
Piechotta et al. (10). Anschließend wurden Tiere ausgewählt, deren IGF-IKonzentration möglichst weit vom beschriebenen Grenzwert entfernt lagen und in
eine IGF-I hohe bzw. IGF-I niedrige Gruppe eingeteilt.
Die ausgewählten Tiere wurden zwischen dem 249. bis 265. Tag p. insem. in die
Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover transportiert. In der
Klinik wurden die Versuchstiere in mit Stroh eingestreuten Einzelboxen aufgestallt.
Die Fütterung bestand aus Heu ad libitum, 15 kg Maissilage und 3 kg
Milchleistungsfutter (ForFarmers Bela GmbH, Vechta-Langförden, Deutschland). Alle
Tiere hatten freien Zugang zu Wasser.
3.3.2 Einstallung
Nach dem Transport in die Klinik für Rinder fand eine klinische Allgemeinuntersuchung der Tiere statt und es wurde Blut für eine klinisch-chemische Blutanalyse
entnommen. Im Klinischen Labor der Klinik für Rinder wurden ein rotes und ein
weißes Blutbild erstellt und die folgenden klinisch chemischen Parameter gemessen:
Gesamt Eiweiß, Gesamt Bilirubin (GB), Aspartat-Aminotransferase (AST), γ-Glutamyltransferase (GGT), Glutamatdehydrogenase (GLDH), Creatininkinase (CK),
Cholesterin, Harnstoff (HST), Kreatinin, Albumin (ALB), Calcium, Magnesium, Phosphor, Selen, Natrium, Kalium und Chlorid. Außerdem wurde nach vorheriger Gabe
von Clenbuterol (Planipart®, Boeringer Ingelheim, Deutschland) eine Klauenpflege
durchgeführt und, falls notwendig, erfolgte eine lokale Behandlung einer bestehenden Dermatitis interdigitalis nach Reinigung der betroffenen Stellen mit Animedazon®Spray (AniMedica GmbH; Senden-Bösensell, Deutschland).
28
3.3.3 Blutprobennahme vor der Geburt
Ab dem 263. bis 266. Tag p. insem. wurde täglich eine Blutprobe zwischen 7.30 und
8.30 Uhr aus der Schwanzvene (V. coccygea) entnommen und in ein mit EDTA beschichtetes und ein unbeschichtetes Serumröhrchen (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) gefüllt. Die Proben wurden 30 Minuten (min) bei Raumtemperatur belassen und
anschließend bei 2000 x g für 15 min zentrifugiert. Das gewonnene Serum bzw.
Plasma lagerte bis zur weiteren Bearbeitung bei -20°C.
3.4 Geburtsüberwachung
Zur Geburtszeitbestimmung wurden sowohl klinische als auch labortechnische Parameter genutzt. Klinisch wurden ab dem 266. Tag täglich mindestens drei Mal die
Festigkeit der Beckenbänder, die Entwicklung eines Euterödems und die Schwellung
der Vulva beurteilt. Im Labor wurde täglich die Progesteronkonzentration aus dem
Serum mittels Chemilumineszenz-Immunoassay (Immunlite®, Siemens Diagnostics,
Bad Nauheim, Deutschland) gemessen. Da nach Matsas et al. (107) die Progesteronwerte 12 bis 24 Stunden vor der Geburt unter 2 ng/ml absinken, wurde bei
Unterschreiten dieses Grenzwertes oder bei hochgradiger Erweichung der Beckenbänder die Frequenz der Kontrollen auf mindestens einmal in 2 Stunden erhöht.
Für eine visuelle Kontrolle der Tiere wurde eine Kamera im Stall angebracht und die
Tiere von einem Nebenraum aus beobachtet. Das Bild wurde mit dem Programm
SkypeTM (Skype Limited, Luxemburg) dargestellt.
Am Beginn der Austreibungsphase wurde manuell die Haltung, Stellung und Lage
des Kalbes kontrolliert. Bei gestreckter Haltung, oberer Stellung und Vorderendlage
wurde auf ein sofortiges helfendes Eingreifen verzichtet und der Geburtsverlauf
weiter beobachtet. Bei Haltungsanomalien wurde versucht diese zu korrigieren und
anschließend Geburtshilfe geleistet. Bei einer Hinterendlage wurde Geburtshilfe von
einer Person geleistet. Tiere mit Auszughilfe von mehr als einer Person oder mit
medikamenteller Intervention wurden vom Versuch ausgeschlossen und in die NaClGruppe einbezogen. Direkt nach der Geburt wurden die Kälber in einer separaten
Kälberbox untergebracht und versorgt. Die Kühe wurden im Anschluss an die Geburt
mit einer Eimermelkanlage im Stall gemolken.
29
In einem Untersuchungsstand wurden bei den Kühen 30 Minuten nach Entwicklung
des Kalbes aus der V. jugularis Blut in Lithium-Heparin beschichtete, EDTA beschichtete und Serumröhrchen (Vacutainer®, BD, Franklin Lakes, NJ, USA) entnommen. Die EDTA- und Lithium-Heparin-Röhrchen wurden direkt auf Eis gestellt
und unverzüglich, wie unter 3.3.3 beschrieben, zentrifugiert und gelagert. Das Serum
wurde nach 30 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert und eingefroren.
Prophylaktisch wurde dem Tier 6,84 g Kalzium (entsprechen 150 ml Calcitat S 50®,
aniMedica, Senden-Bösensell, Deutschland) subkutan direkt nach der Geburt appliziert und der Abgang der Nachgeburt im Stall mittels Kameraüberwachung von
einem Nebenraum aus abgewartet.
3.5 Postpartaler Zeitraum
3.5.1 Bakterielle Untersuchung
Nach Abgang der Nachgeburt wurde diese auf Vollständigkeit und physiologischen
Zustand geprüft. Aus dem Uterus wurde 30 Minuten nach Abgang der Nachgeburt
eine Tupferprobe (Uterustupfer für Stuten, Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) nach
Reinigung des äußeren Genitales entnommen. Der sterile Tupfer wurde durch die
Zervix manuell geführt und anschließend aus der Schutzhülle vorgeschoben und das
Corpus uteri beprobt. Der Tupfer wurde in Amies Medium (Heinz Herenz, Hamburg,
Deutschland) bei 4°C gelagert und zur weiteren Untersuchung nach ein bis drei
Tagen in das Diagnostische Labor des Institutes für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover gebracht. Die Proben wurden auf das Vorkommen
von aeroben und anaeroben Bakterien inklusive Anaerobier getestet und die Anzahl
nachgewiesener Keime vom Institut semiquantitativ in gering-, mittel- oder hochgradig
eingestuft.
Die
semiquantitative
Einteilung
fand
nach
subjektiven
Erfahrungswerten der Mitarbeiter des Institutes für Mikrobiologie der Stiftung
Tierärztliche Hochschule Hannover statt.
3.5.2 Durchführung des LPS-Versuchs
Ein Liter einer auf 39°C erwärmten physiologischen NaCl Lösung (Braun, Melsungen, Deutschland) mit 5 mg LPS (E. coli O55:B5, Sigma Aldrich, St. Louis,
Missouri, USA, Endkonzentration 5 µg/ml) wurde mittels eines Infusionsgeräts (LDKS
30
Oversan, Industries Biomedica S.P.A., Gemonio, Italien) in den Uterus infundiert.
Direkt vor und in 30 minütigen Abständen nach der LPS-Infusion wurden Blutentnahmen (s. 3.4 Geburtsüberwachung) und Bestimmungen der rektalen Körperinnentemperatur, Atem- und Herzfrequenz durchgeführt. Die Atemfrequenz wurde durch
Auszählen der Atemzüge und die Herzfrequenz mit Hilfe eines Stethoskops an der
linken Körperseite jeweils über einen Zeitraum von 15 Sekunden bestimmt. Nach 180
Minuten wurden die Kühe mittels intravenöser Injektion von 30.000 mg PentobarbitalNatrium (Release®, WDT, Garbsen, Deutschland) euthanasiert. Die Kühe wurden an
den Hinterbeinen aufgehängt und zwei bis fünf cm kranial des Euteransatzes der
Bauchraum durch einen transversalen Schnitt auf einer Länge von ca. 50 cm eröffnet
und der Uterus kaudal der Zervix abgesetzt und komplett aus dem Bauchraum zur
Beprobung entnommen. Für die Immunhistologie wurde ein Stück von dorsal aus
dem tragenden Horn geschnitten. Anschließend wurden Leber- und Fettgewebe von
der Bauchwand beprobt. Vom Rücken der Kühe wurde auf Höhe des 3.
Lendenwirbels ein Stück aus dem langen Rückenmuskel (Musculus longissimus
dorsi) von dorsal entnommen und von allen Geweben jeweils ein 1 x 1 x 1 cm großes
Stück in Formalin fixiert.
3.6 Laboranalysen
3.6.1 IGF-I
Die IGF-I-Konzentration wurde mittels eines kommerziellen IGF-I ELISA (Active IGF-I
ELISA; Beckman Coulter, CA, USA) bestimmt. Durch eine Proteinfällung mit saurem
Ethanol wurde IGF-I aus den Bindungsproteinen freigesetzt. Nach einer 30 minütigen
Inkubationszeit mit anschließender Zentrifugation (30 Minuten, 4000 x g, Heraeus
Varifuge 3.0R, Kendro, Osterode, Deutschland) wurde der Überstand pH neutralisiert
im Assay eingesetzt und das IGF-I mittels eines ELISA auf Basis des sogenannten
„Sandwich-Prinzips“ bestimmt. Hierzu wurden zu bestimmende Proben, Standardproben und Kontrollen in Kavitäten einer mit einem gegen IGF-I gerichteten Antikörper beschichteten Mikrotiterplatte pipettiert. Ein zweiter mit Meerrettichperoxidase-gekoppelter Antikörper band im Folgenden an IGF-I. Anschließend wurde nach
einem Waschschritt Substrat hinzugegeben und nach erfolgtem Farbumschlag die
Reaktion mit einer Schwefelsäure gestoppt. Die optische Dichte wurde mittels
31
Spectra II (Tecan Group Ltd, Männedorf, Schweiz) bei 450 nm gemessen und mit
dem Programm Magellan Software mit Cubic Spline Mode (Magellan 3.11,
Dortmund, Germany) ausgewertet. Die Konzentration der Proben wurde durch
Vergleich mit einer Standardkurve ermittelt. Der Messbereich lag zwischen 10 und
450 ng/ml mit einer analytischen Sensitivität von 0,03 ng/ml und die Intra- und InterAssay Variationskoeffizienten betrugen 3,5% bzw. 8,5%.
3.6.2 Wachstumshormon
Die GH-Konzentrationen wurden mit einem ELISA, beschrieben von Roh et al. (108)
und Kawashima et al. (71), mit folgenden Modifikation bestimmt (Protokoll siehe
Anhang 9.1 Wachstumshormon):
Zu einer mit Antikörper gegen Kaninchen-Immunglobulin (Physiologie, Technische
Universität München, Weihenstephan, Deutschland) beschichteten 96 Well Mikrotiterplatte (Nunc, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) wurde der
spezifisch gegen ovines GH gerichtete Antikörper (100 µl, 1:20, rabbit anti-oGH-3,
Lot# AFP0802210Rb; National Hormone & Peptide Program (NHPP), NIDDK, and
Dr. Parlow, Torrance, California, USA) pipettiert und für 24 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Der Überstand wurde anschließend dekantiert und 1%
Hühnerserum (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA), verdünnt in Assaypuffer
(100 µl), zu jedem Well hinzugefügt. GH Standard (15 µl; 0,78 – 100 ng/ml, NIDDKbGH, AFP-10325C), verdünnt in Assaypuffer, bzw. die zu untersuchenden Plasmaproben wurden in den Wells für 24 Stunden inkubiert. Nach einem Waschschritt
wurde an Biotin (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) gekoppeltes
GH hinzugefügt und für 3 h bei Raumtemperatur inkubiert. Schließlich wurde
Streptavidin-Peroxidase für 15 Minuten (Steptavidin-POD; Sigma Aldrich, St. Louis,
Missouri, USA) und Substrat für 40 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach dem Stoppen
der Reaktion mit Schwefelsäure wurde die Optische Dichte bei 450 nm mittels
Spectra II (Tecan Group Ltd, Männedorf, Schweiz) gemessen und die Konzentrationen gegen die Standardkurve berechnet (Magellan 3.11, Dortmund, Deutschland).
Die Intra- und Inter-Assay Variationskoeffizienten betrugen 9,8% bzw. 12,6% und der
untere Messbereich lag bei 2 ng/ml.
32
3.6.3 Cortisol
Die Cortisolkonzentrationen wurden mittels Chemilumineszenz-Immunoassay im
Analyseautomaten Immulite® (Siemens Diagnostics, Eschborn, Deutschland) aus
Serumproben bestimmt. Die Messung basierte auf einem kompetitiven Immunoassay. Dabei konkurrierte Cortisol in der zu messenden Probe mit Cortisol, konjugiert
mit alkalischer Phosphatase, um Antikörperbindungsstellen an einer Kugel im Testtube, beschichtet mit polyklonalen Kaninchen-Antikörpern gegen Cortisol. Die alkalische Phosphatase setzte Adamantyl 1,2-dioxetane Arylphosphat durch Abspaltung
einer Phosphatgruppe zu Adamantyldioxtan um, dessen Zerfall eine anhaltende,
messbare Lichtemission bedingte, die zur Cortisolmenge der zu messenden Probe
umgekehrt proportional war. Im Vergleich zu einer Standardkurve wurde anschließend die Konzentration berechnet. Das verwendete Kit für Cortisol hatte die
Katalognummer LKCO1. Der untere Messbereich betrug 2 ng/ml, die analytischen
Sensitivität 2 ng/ml. Die Intra- und Inter-Assay Variationskoeffizienten lagen
zwischen 5,8% und 8,8% bzw. 6,3% und 10,0%.
3.6.4 Adrenocorticotropes Hormon
Die Konzentration des ACTH wurde mittels Chemilumineszenz-Immunoassay im
Analyseautomaten Immulite® (Siemens Diagnostics, Eschborn, Deutschland) aus
Serumproben bestimmt. Das Testprinzip basiert auf einem Sandwich ELISA. Die im
Testtube vorhandene Kugel war mit monoklonalen Maus-Antikörpern gegen ACTH
beschichtet. Die zu messende Probe wurde dazugegeben und ACTH band an die
Antikörper. Im zweiten Schritt wurde ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper,
konjugiert mit alkalischer Phosphatase gegen ACTH, dazugegeben und reagierte mit
dem gebundenen ACTH. Im dritten Schritt setzte die vorhandene alkalische
Phospatase Adamantyl 1,2-dioxetane Arylphosphat durch Abspaltung einer Phosphatgruppe zu Adamantyldioxtan um, dessen Zerfall eine anhaltende, messbare
Lichtemission bedingte. Die Lichtemission war zum ACTH der Probe proportional
und wurde im Vergleich zu einer Standardkurve berechnet. Das verwendete Kit für
ACTH hatte die Katalognummer LKAC1. Der untere Messbereich betrug 5 pg/ml und
die analytische Sensitivität 9 pg/ml. Die Intra- und Inter-Assay Variationskoeffizienten
lagen zwischen 3,1% und 9,6% bzw. 5,1% und 9,4%.
33
3.6.5 Thyroxin und Trijodthyronin
Thyroxin und Trijodthyronin wurden im Blutserum mittels ChemilumineszenzImmunoassay im Analyseautomaten Immulite® (Siemens Diagnostics, Eschborn,
Deutschland) gemessen. Das Prinzip ist ein kompetitiver Immunoassay, wie unter
3.6.3 beschrieben. Die verwendeten Teste hatten die Katalognummern LKCT1 für T4
und LKT31 für T3. Der untere Messbereich betrug für T4 und für T3 0,5 µg/dl bzw. 40
ng/dl. Die analytische Sensitivität lag bei 0,12 µg/dl für T4 bzw. 35 ng/ml für T3. Die
Intra- und Inter-Assay Variationskoeffizienten betrugen für T4 10,8% bzw. 13,8% und
für T3 13,2% bzw. 15,6%.
3.6.6 Insulin
Die Insulinkonzentration im Serum wurde mit einem Immunoradiometrischen Assay
(IRMA; Insuline IRMA KIT, Beckman Coulter, California, USA) bestimmt. Der IRMA
beruht auf dem Sandwich Prinzip. Die Proben sowie die Standardproben und Kontrollen wurden in einem Röhrchen mit an der Wandung festsitzenden monoklonalen
Mausantikörpern gegen Insulin zusammen mit I125-markierten Mausantikörpern gegen Insulin für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Der Überstand wurde
abgesaugt und die counts per minute (cpm) mit einem Gamma-Counter (Perkin
Elmer, Waltham, Massachusetts, USA) gemessen. Die cpm waren proportional zur
Menge des Insulins in der Probe und wurden im Vergleich zu einer Standardkurve
berechnet. Der untere Messbereich lag bei 3 µIU/ml. Die Intra- und Inter-Assay
Variationskoeffizienten betrugen 7,6% bzw. 10,7%.
3.6.7 17β-Östradiol
17β-Östradiol wurde mittels eines Festphasen Radioimmunoassays (RIA) (Coat-acount Estradiol, TKE21, Siemens Diagnostics, Eschborn, Deutschland) aus Serumproben bestimmt. Dafür wurden mit einem Kaninchen-Antikörper gegen E2 beschichtete Röhrchen verwendet. Die zu messende Probe wurde mit 200 µl I125-markiertem
E2 im Röhrchen inkubiert. An der Röhrchenwandung konkurrierte natives E2 mit I125markiertem E2 um Antikörperbindungsstellen. Der Überstand wurde dekantiert und
die cpm gemessen, die umgekehrt proportional zur Konzentration waren. Die Messung fand mit einem Gamma-Counter (Perkin Elmar, Waltham Massachusetts, USA)
34
statt und wurde im Vergleich zu einer Standardkurve berechnet. Der untere Messbereich für E2 betrug 20 pg/ml, die analytische Sensitivität lag bei 8 pg/ml und die
Intra- und Inter-Assay Variationskoeffizienten differierten zwischen 4,0% und 7,0%
bzw. 6,7% und 9,4%.
3.6.8 Progesteron
Die Progesteronkonzentrationen aus dem antepartalen Zeitraum wurden mit dem
Analyseautomaten
Immulite®
(Siemens
Diagnostics,
Eschborn,
Deutschland)
bestimmt, um die Messergebnisse taggleich zu erhalten. Das Messprinzip entspricht
dem unter 3.6.4 für ACTH beschriebenen Verfahren. Die verwendete KIT Nummer
war LKPG1. Der untere Messbereich betrug 0,1 ng/ml mit einer analytischen
Sensitivität von 0,2 ng/ml und Intra- und Inter-Assay Variationskoeffizienten von 6,3%
– 16% bzw. 5,8% – 16%.
Die Progesteronkonzentrationen der Blutprobe Geburt und des postpartalen
Zeitraumes wurden mittels Festphasen RIA (Coat-a-count Progesterone, TKPG1,
Siemens Healthcare Diagnostics, Los Angeles, USA) und mit einem Gamma-Counter
(Perkin Elmer, Waltham Massachusetts, USA) gemessen. Das Messprinzip
entspricht dem unter 3.6.7 für E2 beschriebenen. Der untere Messbereich für
Progesteron lag bei 0,02 ng/ml mit einer analytischen Sensitivität von 0,02 ng/ml. Die
Intra- und Inter-Assay Variationskoeffizienten betrugen 4,0% bzw. 7,6%.
3.6.9 13,14-dihydro-15-keto-PGF2α
Die Konzentration an 13,14-dihydro-15-keto-PGF2α (PGFM) wurde mittels eines
kompetitiven Enzym Immunoassay, beschrieben von Guven et al. (109) und Mishra
et al. (110), bestimmt (Protokoll siehe Anhang 9.2 PGFM). Das PGFM-Meerrettichperoxidase Konjugat und Antiserum wurden von Herrn Prof. Meyer (Physiologie
Weihstephan, Technische Universität München, Freisingen, Deutschland) bezogen.
Für die Standardkurve wurde PGFM von Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)
verwendet. Das benutze Antiserum hatte eine minimale Kreuzreaktion mit den
anderen verwandten Prostaglandinen (PGE2, PGEM, PGA2, PGAM und PGF2α
jeweils <0,01%). Der untere Messbereich betrug 50 pg/ml. Die Intra- und Inter-Assay
Variationskoeffizient lagen bei 3,5% bzw. 11,4%.
35
3.6.10
Freie Fettsäuren
Die FFS wurden mit einem automatisierten Analysegerät für klinische Chemie (ABX
Pentra 400, Horiba, Montpellier, Frankreich) im Klinischen Labor der Klinik für Rinder
bestimmt. Die Messung erfolgt durch eine colorimetrische enzymatische Reaktion mit
den FFS-Konzentrationen (Intra-Assay Variationskoeffizient 6,2%).
3.6.11
Lipopolysaccharide
Für den LPS-Nachweis aus Lithium-Heparin-Plasma der ersten 5 Tiere aus der LPSGruppe wurde der kommerzielle limulus amebocyte lysate endochrome™ Assay
(Charles River, Charleston, USA; Protokoll im Anhang 9.3 LPS) genutzt. Die
Plasmaproben wurden mit LPS-freiem Wasser (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri,
USA) 1:10 verdünnt und für 5 Minuten auf 80°C erhitzt, um negative Einflüsse von
Plasmabestandteilen auf die Agglutinationseigenschaften zu verhindern. Das
bakterielle Endotoxin LPS initiiert eine Aktivierung eines Proenzyms, das in Anwesenheit eines farblosen Substrates die Spaltung eines Chromophors bewirkt und
gelbes para-Nitroanilin freisetzt. Die Färbung wurde bei 405 nm im Photometer
Spectra II (Tecan Group Ltd, Männedorf, Schweiz) gemessen und gegen eine
Standardreihe mit dem Programm Magellan Software mit (Cubic Spline Mode,
Magellan 3.11, Dortmund, Deutschland) ausgewertet. Der untere Messbereich lag
bei 38 pg/ml und die Wiederfindungsrate bei 63%.
3.7 Histologie
Die Gewebeproben wurden nach 48 Stunden Formalinfixierung (Formalin nach Lillie)
für Einbettungskapseln (Leica, Wetzlar, Deutschland) zugeschnitten und anschließend für mindestens drei Stunden in fließendem Leitungswasser gewässert.
Durch einen Einbettautomaten (Leica, Wetzlar, Deutschland) wurden die Proben vorbereitet und anschließend in Paraffin (Leica, Wetzlar, Deutschland) gegossen. Mit
einem Rotationsmikrotom (LEICARM2025, Leica, Wetzlar, Deutschland) wurden
3 µm dicke Schnitte angefertigt und auf Objektträger gebracht. Zur histologischen
Begutachtung wurden von den Geweben Hämatoxylin-Eosin (HE-) Färbungen ange-
36
fertigt (Kurzprotokoll: 15 min Hämatoxylin (Roth, Karlsruhe, Deutschland), 2 Minuten
0,5% Eosin (Roth, Karlsruhe, Deutschland)).
Für die Immunhistologie wurden die Schnitte von 3 µm Dicke auf Histobond Objektträger (Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Deutschland)
gezogen. Die Schnitte wurden nach folgendem Protokoll im Anhang 9.4 Histologie
entparaffiniert und gefärbt. Um eine geeignete Konzentration für den GHR-Antikörper
zu finden, wurde eine Verdünnungsreihe (1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1000)
mit dem Antikörper durchgeführt und mit einer Verdünnung von 1:200 weiter
gearbeitet. Kontrollschnitte wurden mit Mausserum (Millipore, Billerica, Massachusetts, USA) in einer äquivalenten Verdünnung (1:200) überschichtet um Kreuzreaktionen mit dem Mausserum des GHR auszuschließen.
Die Auswertung und Aufnahmen erfolgten am Mikroskop Olympus BX60 (Olympus,
Hamburg, Deutschland) mit einer aufgesetzten Kamera (Olympus XC50, Olympus,
Hamburg, Deutschland).
Die Auswertung der Proben erfolgte in der Leber durch Auszählung der Vakuolen im
HE-Schnitt und des GHR mittels Immunhistologischem semiquantitativem Scoresystem (0-3). Bei diesen Ergebnissen erfolgte eine Auswertung hinsichtlich der
Fragestellung, ob Unterschiede zwischen IGF-I hohen und IGF-I niedrigen Tieren
bestanden.
3.8 Statistik
Die Daten wurden in Excel (Microsoft, Redmond, Washington, USA) gesammelt und
sortiert und die statistische Auswertung wurde mit dem Programm SAS 9.3 (SAS
Institute Inc., Cary North Carolina, USA) durchgeführt. Die Messdaten wurden in die
Zeit bis zur Geburt und den Versuch unterteilt. Die Tiere wurden entsprechend ihrem
IGF-I-Auswahlwert vor der Geburt in die Gruppen IGF-I hoch und IGF-I niedrig
eingeteilt. Ein direkter Vergleich der Gruppen wurde am Tag der Auswahl und mit
den Blutbildern am Tag der Einstallung in die Klinik für Rinder durchgeführt. Bei den
wiederholt gemessenen Daten wurden Zeitpunkte mit weniger als vier Blutproben pro
Gruppe ausgeschlossen (Tag -24 bis -18). Somit befinden sich im Zeitraum bis zur
Geburt die Tage -17 bis 0 mit dem Auswahlwert. Für den Versuch wurden die Tiere
in die Gruppen IGF-I hoch, IGF-I niedrig und NaCl eingeteilt. In diesen Zeitraum
wurden die Proben 0 bis 180 Minuten einbezogen.
37
Alle Werte wurden auf Normalverteilung hin geprüft. Durch Logarithmieren (natürlicher Logarithmus) konnte für die Parameter Insulin und FFS aus den Auswahlproben und für die Parameter HKT, GB und GLDH aus den Blutbildern eine Normalverteilung erreicht werden. Weiterhin ließ sich für Cortisol, ACTH, T 4, E2 und PGFM
im postpartalen Zeitraum durch Logarithmieren (natürlicher Logarithmus) jeweils eine
Normalverteilung erzielen.
Für die Auswahlproben und die Blutproben am Tag der Einstallung wurden alle
Parameter mittels Student‘s T-test verglichen. Eine Normalverteilung durch mathematische Umformung konnte nicht für die Parameter Natrium in den Blutbildern, GH,
Cortisol und E2 bei den Auswahlproben erreicht werden. Bei diesen Werten wurde
ein Wilcoxon Rangsummentest für nicht parametrische Daten zum Vergleich
durchgeführt. Für die mikrobiologischen Ergebnisse wurde für die jeweiligen
Bakterienspezies ein Χ2-Test durchgeführt. Die Tupferproben wurden zum einen
nach den Gruppen IGF-I hoch und IGF-I niedrig vor Geburt und zum anderen nach
einer LPS- und reiner NaCl Applikation eingeteilt.
Für die wiederholten Messungen aus der Zeit vor der Geburt und während des Versuches wurde in SAS 9.3 das Model „PROC MIXED“ mit der Freiheitsgradmethode
nach Satterthwaite gewählt, für nicht parametrische Verteilungen das Model „PROC
MIXED MODEL=MIVQUE0“, ebenfalls mit der Freiheitsgradmethode nach Satterthwaite.
Aus den Strukturmodellen „compound symmetry“ (CS), „first order autoregressive“
(AR(1)), „variance compounds” (VC), „heterogeneous AR(1)” (ARH(1)), „first order
ante dependence” (ANTE(1)), „Toeplitz” (TOEP), „Huynh-Feldt” (HF) und „unstructured” (UN) wurde auf der Basis der „covariance parameters” (PARMS), „Bayesian
information criterion” (BIC) und „Aikaike information criterion” (AIC) das Modell mit
der niedrigsten Abweichung von 0 ausgesucht. Die Grafiken wurden mit dem Programm SigmaPlot for Windows 8.02 (SSI, San Jose, California, USA) aus Schätzwerten mit Standardfehlern des Rechenmodels SAS PROC MIXED erstellt. Der Wert
P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angenommen.
38
4
Ergebnisse
4.1 Tiere
Insgesamt wurden 158 Tiere zwischen den Tagen 240 und Tag 255 p. insem. auf
dem Milchkuhbetrieb Siedenlangenbeck untersucht. Von 151 dieser untersuchten
Tiere wurden Blutproben genommen, eine GAP durchgeführt und die IGF-IKonzentration bestimmt. Bei 26 Tieren war GAP nach 3 Minuten positiv. Bei 32
Tieren wurde eine Lahmheit (≥Grad 2) diagnostiziert. Insgesamt wurden 20 Tiere
über den Zeitraum von einem Jahr (Juli 2010 bis Juli 2011) nach Rücksprache mit
dem Betrieb ausgewählt und für das weitere Versuchsprozedere in die Klinik für
Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover verbracht.
4.2 Antepartaler Zeitraum
Es wurden jeweils 10 Tiere für die Gruppen IGF-I hoch und IGF-I niedrig ausgewählt.
Die Blutproben für die Auswahl der Tiere wurden zwischen den Tagen 240 und 254
p. insem. genommen. Der Transport der Tiere in die Klinik für Rinder erfolgte
zwischen den Tagen 249 und 265 p. insem. (Einzeldaten zu den Versuchstieren sind
in Tab. 5 im Tabellenanhang dargestellt).
Die 20 Versuchstiere unterschieden sich zum Zeitpunkt der Auswahl im IGF-I-Wert
(101,1 ± 16,3 ng/ml vs. 208,3 ± 30,8 ng/ml; P < 0,001; Mittelwerte ± SD) und in der
Serumkonzentration der FFS (5,57 ± 0,64 ln µmol/l vs. 5,04 ± 0,35 ln µmol/l; P =
0,032). Die Cortisolkonzentration war tendenziell bei den Kühen mit IGF-I niedrigen
Werten höher (P = 0,095; Tab. 6 im Tabellenanhang). Die folgenden Parameter
unterschieden sich nicht signifikant zwischen den Gruppen: GH, T4, T3, P4, E2, Insulin
und PGFM.
Das durchschnittliche Gewicht, der BCS, die Milchleistung in der vorangegangenen
Laktation und das Alter der Tiere waren ebenfalls bei beiden Gruppen gleich
(P > 0,05; Tab. 7 im Tabellenanhang). Das Tier mit der Nummer 425/11 wurde zehn
Tage nach der Einstallung aufgrund gesteigerter Aggressivität vom Versuch ausgeschlossen und auf den Betrieb zurück gebracht.
Hinsichtlich der klinisch-chemischen Parameter am Tag der Einstallung (Tab. 8 im
Tabellenanhang) ergaben sich folgende Unterschiede: die HST-Konzentration war
bei den Tieren der IGF-I hohen Gruppe höher als bei denen der IGF-I niedrigen
39
Gruppe (5,1 ± 0,9 mmol/l vs. 3,6 ± 0,6 mmol/l; P < 0,001). Weiterhin war die Anzahl
der Leukozyten in der IGF-I hohen Gruppe höher als in der IGF-I niedrigen Gruppe
(11960 ± 1983 /µl vs. 10460 ± 1001 /µl; P = 0,048). Gesamtbilirubin war bei den
Tieren der IGF-I hohen Gruppe niedriger als bei denen der IGF-I niedrigen (3,1 ± 0,8
µmol/l vs. 4,4 ± 1,7 µmol/l; P = 0,034). Tiere der IGF-I hohen Gruppe hatten höhere
Magnesiumkonzentrationen als diejenigen der IGF-I niedrigen Gruppe (1,05 ± 0,10
mmol/l vs. 0,94 ± 0,09 mmol/l; P = 0,025).
4.2.1 IGF-I
Hinsichtlich der IGF-I-Konzentration wurde zum einen geprüft, inwiefern sich die Konzentrationen geordnet nach den Besamungstagen unterschieden. Um zu prüfen, ob
es sich um ein von der Geburt abhängiges Phänomen handelt, wurden die IGF-IKonzentrationen auch retrospektiv zum Tag der Geburt sortiert und ausgewertet.
Die mittlere IGF-I-Konzentration über den gesamten Untersuchungszeitraum in der
IGF-I hohen Gruppe war, geordnet nach den Besamungstagen, für den gesamten
Zeitraum höher als in der IGF-I niedrigen Gruppe (90,4 ± 7,2 ng/ml vs. 55,7 ± 7,8
ng/ml; P = 0,003; Abb. 3a). Es ergaben sich für die einzelnen Tage bis zum 275. Tag
p. insem. signifikant höhere Werte in der IGF-I hohen Gruppe.
Retrospektiv hinsichtlich des Tages der Geburt sortiert, wies die IGF-I hohe Gruppe
über den gesamten Zeitraum ebenfalls höhere mittlere IGF-I-Konzentrationen im
Vergleich zur IGF-I niedrigen Gruppe auf (101,3 ± 6,9 ng/ml vs. 62,1 ± 7,3 ng/ml; P <
0,001; Abb. 3b). Signifikant höhere IGF-I-Konzentrationen der IGF-I hohen Gruppe
waren im Vergleich zur IGF-I niedrigen Gruppe bis zum Tag -6 vor der Geburt zu
verzeichnen.
In beiden Gruppen kam es zu einem Abfall der IGF-I-Konzentration bis zur Geburt,
mit der niedrigsten IGF-I-Konzentration am Tag der Geburt (P < 0,001). Die IGF-IKonzentration sank in der IGF-I hohen im Vergleich zur IGF-I niedrigen Gruppe
stärker ab (Gruppe*Zeit: P < 0,001).
40
a
250
IGF-I hohe Gruppe (n=10)
IGF-I niedrige Gruppe (n=9)
***
IGF-I (ng/ml)
200
150
Gruppe
Zeit
Gruppe*Zeit
**
**
**
**
**
**
**
**
*
100
P = 0,003
P < 0,001
P < 0,001
*
50
26
6
26
7
26
8
26
9
27
0
27
1
27
2
27
3
27
4
27
5
27
6
27
7
27
8
27
9
28
0
28
1
28
2
24
0
-2
54
0
b
Tage p. insem.
250
IGF-I hohe Gruppe (n=10)
IGF-I niedrige Gruppe (n=9)
***
IGF-I (ng/ml)
200
150
**
Gruppe
Zeit
Gruppe*Zeit
**
**
**
***
***
**
**
*
*
100
*
P < 0,001
P < 0,001
P < 0,001
*
50
0
-1
-3
-2
-5
-4
-7
-6
-9
-8
-1
7
-1
6
-1
5
-1
4
-1
3
-1
2
-1
1
-1
0
-4
2
bi
s
-2
6
0
Tage relativ zur Geburt
Abb. 3: (a) Insulin-like Growth Factor-I (IGF-I)-Konzentrationen an den Tagen post
inseminationem (p. insem.) und (b) relativ zum Tag der Geburt (Tag 0) in Gruppen
mit unterschiedlichen IGF-I-Konzentrationen an den Tagen -42 bis -26 (IGF-I hoch
versus IGF-I niedrig). Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen an den
Tagen sind wie folgt gekennzeichnet: * P < 0,05; ** P < 0,01; *** P < 0,001. Die
Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform
im Kästchen dargestellt.
41
4.2.2 Wachstumshormon
Die GH-Konzentration stieg zum Zeitpunkt der Geburt an. Die GH-Konzentrationen
zwischen den beiden IGF-I-Gruppen und auch die zeitlichen Verläufe unterschieden
sich nicht signifikant voneinander (Abb. 4).
30
IGF-I hohe Gruppe (n=10)
IGF-I niedrige Gruppe (n=9)
25
GH (ng/ml)
20
Gruppe
Zeit
Gruppe*Zeit
15
P = 0,920
P < 0,001
P = 0,537
10
5
-4
2
bi
s
0
-1
-3
-2
-5
-4
-7
-6
-9
-8
-1
7
-1
6
-1
5
-1
4
-1
3
-1
2
-1
1
-1
0
-2
6
0
Tage relativ zur Geburt
Abb. 4: Wachstumshormon (Growth Hormone, GH) Konzentrationen relativ zur
Geburt in Gruppen mit unterschiedlichen IGF-I-Konzentrationen an den Tagen -42
bis -26 (IGF-I hoch versus IGF-I niedrig). Die Ergebnisse der statistischen Analyse
mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt.
42
4.2.3 Schilddrüsenhormone
Die mittleren Thyroxinserumkonzentrationen waren in der IGF-I hohen Gruppe im
gesamten Zeitraum höher als in der IGF-I niedrigen Gruppe (3,4 ± 0,1 µg/dl vs. 2,9 ±
0,1 µg/dl; P = 0,005; Abb. 5). Die IGF-I hohe Gruppe hatte gegenüber der IGF-I
niedrigen Gruppe signifikante höhere T4-Konzentrationen an den Tagen -13 bis
Tag -5. In beiden Tiergruppen kam es zu einem Abfall der T4-Konzentration bis zum
Zeitpunkt der Geburt (P < 0,001). Dabei unterschieden sich die Verläufe der Konzentrationen in den beiden IGF-I-Gruppen nicht signifikant voneinander.
Hinsichtlich der T3-Konzentrationen bestanden vor der Geburt keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen. In der IGF-I niedrigen Gruppe war T3 am Tag -15
gegenüber dem Tag der Auswahl (P = 0,001) und dem Tag 0 deutlich niedriger (P =
0,030; Abb. 5). Die T3-Konzentrationen änderten sich dagegen in der IGF-I hohen
Gruppe antepartal nicht (P > 0,05).
Berechnet man allerdings lediglich den Zeitraum, in dem bei allen Werte vorlagen,
entsprechend von Tag -9 bis zum Tag -1, war im Verlauf (Interaktion Gruppe*Zeit)
ein Abfall der T3-Konzentrationen in der IGF-I hohen Gruppe gegenüber einem
Anstieg in der IGF-I niedrigen Gruppe nachweisbar (P = 0,017). Allerdings war über
den gesamten betrachteten Zeitraum von Tag -17 an, kein signifikanter Unterschied
zwischen den IGF-I-Gruppen in den Verläufen vorhanden.
43
5,0
IGF-I hohe Gruppe (n=10)
IGF-I niedrige Gruppe (n=9)
4,5
*
4,0
**
a
T4 (µl/dl)
**
3,5
**
*
3,0
Gruppe
Zeit
Gruppe*Zeit
P = 0,005
P < 0,001
P = 0,186
Gruppe
Zeit
Gruppe*Zeit
P = 0,301
P = 0,033
P = 0,707
2,5
2,0
-1
-3
-5
-7
-9
-1
1
-1
3
-1
5
-1
7
bi
s
-2
6
1,5
-4
2
Tage relativ zur Geburt
150
IGF-I hohe Gruppe (n=10)
IGF-I niedrige Gruppe (n=9)
140
b
T3 (ng/dl)
130
120
110
100
90
-4
2
bi
s
-1
-3
-5
-7
-9
-1
1
-1
3
-1
5
-1
7
-2
6
80
Tage relativ zur Geburt
Abb. 5: (a) Thyroxin- (T4) und (b) Trijodthyronin- (T3) Konzentrationen relativ zum Tag
der Geburt (Tag 0) in Gruppen mit unterschiedlichen IGF-I-Konzentrationen an den
Tagen -42 bis -26 (IGF-I hoch versus IGF-I niedrig). Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen an einem Tag sind wie folgt gekennzeichnet: * P < 0,05;
** P < 0,01. Die Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA
sind in Textform im Kästchen dargestellt.
44
4.2.4 Cortisol
Die Cortisolkonzentration im antepartalen Versuchszeitraum war bei den Tieren der
IGF-I hohen Gruppe niedriger als in der IGF-I niedrigen Gruppe (5,2 ± 0,6 ng/ml vs.
7,4 ± 0,7 ng/ml; P = 0,024). In beiden IGF-I-Gruppen stiegen zum Zeitpunkt der
Geburt die Cortisolkonzentrationen an (Abb. 6), dabei unterschieden sich die
zeitlichen Verläufen (Interaktion Gruppe*Zeit) nicht signifikant voneinander.
25
***
IGF-I hohe Gruppe (n=10)
IGF-I niedrige Gruppe (n=9)
Cortisol (ng/ml)
20
15
Gruppe
Zeit
Gruppe*Zeit
P = 0,024
P < 0,001
P = 0,429
10
5
-4
2
bi
s
0
-1
-3
-2
-5
-4
-7
-6
-9
-8
-1
7
-1
6
-1
5
-1
4
-1
3
-1
2
-1
1
-1
0
-2
6
0
Tage relativ zur Geburt
Abb. 6: Cortisolkonzentrationen relativ zum Tag der Geburt (Tag 0) in Gruppen mit
unterschiedlichen IGF-I-Konzentrationen an den Tagen -42 bis -26 (IGF-I hoch
versus IGF-I niedrig). Signifikante Unterschiede zum vorherigen Tag sind wie folgt
gekennzeichnet: *** P < 0,001. Die Ergebnisse der statistischen Analyse mittels
zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt.
45
4.2.5 Progesteron
Die Progesteronkonzentrationen im antepartalen Zeitraum unterschieden sich zwischen den IGF-I-Gruppen nicht signifikant. Es gab einen Abfall zwischen den Tagen -2 und -1 (P < 0,001).
8
IGF-I hohe Gruppe (n=10)
IGF-I niedrige Gruppe (n=9)
Progesteron (ng/ml)
6
Gruppe
Zeit
Gruppe*Zeit
4
P = 0,526
P < 0,001
P = 0,580
***
2
-4
2
bi
0
-1
-3
-2
-5
-4
-7
-6
-9
-8
-1
7
-1
6
-1
5
-1
4
-1
3
-1
2
-1
1
-1
0
s
-2
6
0
Tage relativ zur Geburt
Abb. 7: Progesteronkonzentrationen relativ zum Tag der Geburt (Tag 0) in Gruppen
mit unterschiedlichen IGF-I-Konzentrationen an den Tagen -42 bis -26 (IGF-I hoch
versus IGF-I niedrig). Signifikante Unterschiede zum vorherigen Tag sind wie folgt
gekennzeichnet: *** P < 0,001. Die Ergebnisse der statistischen Analyse mittels
zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt.
46
4.2.6 17β-Östradiol
Die E2-Konzentrationen stiegen in beiden Versuchsgruppen zwischen der Auswahlprobe und der Geburt an und wiesen die höchste E2-Konzentration am Tag der
Geburt auf (Abb. 8). Dabei sind die E2-Konzentrationen und die zeitlichen Verläufen
bei beiden IGF-I-Gruppen vergleichbar.
1200
IGF-I hohe Gruppe (n=10)
IGF-I niedrige Gruppe (n=9)
1000
E2 (pg/ml)
800
Gruppe
Zeit
Gruppe*Zeit
600
P = 0,148
P < 0,001
P = 0,365
400
200
-4
2
bi
s
-1
-3
-5
-7
-9
-1
1
-1
3
-1
5
-1
7
-2
6
0
Tage relativ zur Geburt
Abb. 8: 17β-Östradiolkonzentrationen (E2) relativ zum Tag der Geburt (Tag 0) in
Gruppen mit unterschiedlichen IGF-I-Konzentrationen an den Tagen -42 bis -26
(IGF-I hoch versus IGF-I niedrig). Die Ergebnisse der statistischen Analyse mittels
zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt.
47
4.2.7 13,14-dihydro-15-keto-PGF2α
Die PGFM-Konzentration stieg vom Tag -2 zum Tag -1 (P = 0,016) und vom Tag -1
zum Tag 0 an (P < 0,001; Abb. 9). Zwischen den beiden ausgewählten IGF-IGruppen und auch innerhalb der zeitlichen Verläufe beider IGF-I-Gruppen waren die
PGFM-Konzentrationen vergleichbar (P > 0,05).
3000
IGF-I hohe Gruppe (n=10)
IGF-I niedrige Gruppe (n=9)
***
2500
PGFM (ng/ml)
2000
Gruppe
Zeit
Gruppe*Zeit
1500
P = 0,818
P < 0,001
P = 0,999
1000
*
500
-4
2
bi
0
-1
-3
-2
-5
-4
-7
-6
-9
-8
-1
7
-1
6
-1
5
-1
4
-1
3
-1
2
-1
1
-1
0
s
-2
6
0
Tage relativ zur Geburt
Abb. 9: Prostaglandin F2α Metabolit (PGFM) relativ zum Tag der Geburt (Tag 0) in
Gruppen mit unterschiedlichen IGF-I-Konzentrationen an den Tagen -42 bis -26
(IGF-I hoch versus IGF-I niedrig). Signifikante Unterschiede zwischen den Tagen
sind wie folgt gekennzeichnet: * P < 0,05; *** P < 0,001. Die Ergebnisse der
statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen
dargestellt.
48
4.2.8 Insulin
Vor der spontanen Geburt (Tag 0) sank die Insulinkonzentration in beiden Gruppen
im Verlauf der Zeit ab (P < 0,001; Abb. 10). Jedoch war kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden IGF-I-Gruppen und innerhalb der zeitlichen Verläufe der
Insulinkonzentrationen erkennbar.
18
IGF-I hohe Gruppe (n=10)
IGF-I niedrige Gruppe (n=9)
16
Insulin (pg/ml)
14
12
10
Gruppe
Zeit
Gruppe*Zeit
8
P = 0,155
P < 0,001
P = 0,111
6
4
2
0
-1
-3
-5
-7
-9
-1
1
-1
3
-1
5
-1
7
bi
s
-2
6
0
-4
2
Tage relativ zur Geburt
Abb. 10: Insulinkonzentrationen relativ zum Tag der Geburt (Tag 0) in Gruppen mit
unterschiedlichen IGF-I-Konzentrationen an den Tagen -42 bis -26 (IGF-I hoch
versus
IGF-I
niedrig).
Die
Ergebnisse
der
statistischen
zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt.
49
Analyse
mittels
4.2.9 Freie Fettsäuren
Die FFS stiegen von der Auswahlprobe (Tag 242 bis 254 p. insem.) über den Tag
der ersten Blutprobe in der Klinik (Tag 263 bis 266 p. insem.) bis hin zur Geburt (Tag
271 bis 288 p. insem.) in beiden IGF-I-Gruppen an (P < 0,001; Abb. 11). Dabei waren
die FFS in der IGF-I hohen Gruppe tendenziell niedriger verglichen mit denen der
IGF-I niedrigen Gruppe (653,3 ± 91,9 µmol/l vs. 903,1 ± 96,8 µmol/l; P = 0,061). In
den zeitlichen Verläufen (Interaktion Gruppe*Zeit) ergaben sich zwischen den beiden
Versuchsgruppen keine signifikanten Unterschiede.
2500
IGF-I hohe Gruppe (n=10)
IGF-I niedrige Gruppe (n=9)
e
FFS (µmol/l)
2000
cd
de
1500
bc
1000
ab
500
a
0
240 - 254
263 - 266
271 - 288
Tag p. insem.
Abb. 11: Konzentrationen der freien Fettsäuren (FFS) in Gruppen mit unterschiedlichen IGF-I-Konzentrationen am Tag der Eingruppierung der Tiere, d.h. an den Tagen 240 – 254 post inseminationem (p. insem.). Der 263. – 266. Tag p. insem. entspricht dem ersten Tag der Blutentnahme in der Klinik für Rinder und der 271. – 288.
Tag p. insem. dem Tag der Geburt; Werte mit verschiedenen Buchstaben
unterscheiden sich (P < 0,05).
50
4.3 Geburt
Bis zur Spontangeburt wurde täglich von 19 Tieren (IGF-I hoch n = 10; IGF-I niedrig
n = 9) Blut abgenommen. Die Geburt ließ sich über die Bestimmung der P4Konzentration mit dem zugrundegelegten Grenzwert von 2 ng/ml bei 15 der 19 Kühe
auf 24 Stunden eingrenzen. Die Kuh 1193/10 hatte keinen deutlichen Rückgang 19
Stunden vor der Geburt (P4 am Tag -1: 3,1 ng/ml). Weiterhin wies die Kuh 46/11
einen P4-Wert von 2,5 ng/ml auf, war aber im Vergleich zum Vortag um 1,8 ng/ml
gesunken. Dagegen besaß die Kuh 174/11 bereits 10 Tage vor der Geburt einen P 4Wert von 1,9 ng/ml und in den folgenden Tagen zwischen 2,1 und 1,3 ng/ml, die P4Konzentration fiel aber am Tag -1 deutlich auf 0,7 ng/ml ab. Die Kuh 175/11 hatte am
Tag -2 bereits einen Wert von 1,9 ng/ml und am darauffolgenden Tag (18 Stunden
vor der Geburt) den nahezu identischen Wert von 1,8 ng/ml.
Geburtshilfe mit einem mittelschweren Auszug (2 Personen) musste lediglich bei
dem Tier 45/11 durchgeführt werden. Aufgrund der verstärkten Manipulation wurde
die Kuh anschließend vom LPS-Versuch ausgeschlossen. Bei den anderen Tieren
wurden maximal durch eine Person Zughilfen bzw. Stellungskorrekturen vorgenommen. Die Geburtsgewichte der Kälber unterschieden sich nicht (P > 0,05) zwischen
den Kühen der IGF-I hohen Gruppe (44,6 ± 6,3 kg; n = 10) und denen der IGF-I
niedrigen Gruppe (47,1 ± 6,2 kg; n = 9). Bei den gesunden Tieren, die eine
intrauterine LPS-Infusion erhielten, waren die Nachgeburten vor der Infusion
vollständig ausgestoßen worden.
4.4 Postpartaler Zeitraum
4.4.1 Bakterielle Untersuchung
Die nach spontanem Abgang der Nachgeburt bzw. nach 12 Stunden genommene
Tupferprobe von den 19 Tieren, bei denen eine Spontangeburt in der Klinik für
Rinder begleitet wurde, wurden bakteriologisch sowohl auf aerobe als auch anaerobe
Bakterien untersucht. Eine detaillierte Auflistung der bakteriellen Untersuchungsergebnisse ist in der Tab. 9 im Tabellenanhang dargestellt. Signifikante Unterschiede
konnten lediglich bei einer Bakterienspezies nachgewiesen werden: In der IGF-I
niedrigen Gruppe war deutlich häufiger der Keim Clostridium perfringens im Uterus
nachweisbar als in der IGF-I hohen Gruppe (0/10 vs. 6/9; P = 0,003).
51
4.4.2 LPS-Versuch
Insgesamt wurden sieben von 19 Tieren vom LPS-Versuch ausgeschlossen. Aus der
IGF-I hohen Gruppe entwickelte ein Tier zwei Tage vor der Geburt eine linksseitige
Labmagenverlagerung, bei einem Tier musste schwere Zughilfe geleistet werden und
zwei Tiere wurden aufgrund einer diagnostizierten Nachgeburtsverhaltung ausgeschlossen. In der Gruppe IGF-I niedrig wurden drei Tiere aufgrund einer diagnostizierten Nachgeburtsverhaltung vom weiteren Versuchsablauf ausgeschlossen.
Daraus ergaben sich pro IGF-I-Gruppe je sechs Tiere im LPS-Versuch und folgende
NaCl-Tiere: IGF-I hoch n = 4 und IGF-I niedrig n = 3.
Bei den gemessenen Puls- und Atemfrequenzen gab es zwischen den Gruppen und
den Zeitpunkten nach LPS- bzw. NaCl-Gabe keine signifikanten Unterschiede (Tab.
10 und 11 im Tabellenanhang). Die Kühe aus der Gruppe IGF-I hoch und NaCl
zeigten zwischen 0 und 180 Minuten einen Anstieg der Körperinnentemperatur von
39,2 ± 0,2°C auf 39,8 ± 0,2°C (P = 0,002) bzw. von 38,8 ± 0,2°C auf 39,2 ± 0,2°C (P
= 0,028). Die Temperatur der Tieren aus der Gruppe IGF-I niedrig stieg tendenziell
von 39,0 ± 0,2°C auf 39,4 ± 0,2°C an (P = 0,056).
Zwischen den Gruppen IGF-I hoch und niedrig bzw. zwischen allen Kühen mit einer
LPS-Infusion und den Kühen der NaCl-Gruppe, sowie hinsichtlich der zeitlich bedingten Änderungen ergaben sich keine Unterschiede (P > 0,05) in der Körpertemperatur (Abb. 12).
52
IGF-I hohe Gruppe (n=6)
IGF-I niedrige Gruppe (n=6)
NaCl Gruppe (n=7)
40,0
Temperatur (°C)
39,8
39,6
Gruppe
Zeit
Gruppe*Zeit
39,4
39,2
P = 0,485
P = 0,003
P = 0,451
39,0
38,8
38,6
38,4
0
30
60
90
120
150
180
Minuten
Abb. 12: Körperinnentemperatur während des Versuches in den Gruppen mit unterschiedlichen IGF-I-Werten an den Tagen 240 – 254 post inseminationem (IGF-I hoch
versus IGF-I niedrig) und der NaCl-Gruppe relativ zum Zeitpunkt der Uterusinfusion
(0) von LPS (IGF-I-Gruppen) bzw. Kochsalzlösung (NaCl). Die Ergebnisse der
statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen
dargestellt.
4.4.2.1 Somatotrope Achse
Die IGF-I- und Wachstumshormonkonzentrationen waren zwischen den Tiergruppen
vergleichbar. Nach LPS-Gabe gab es weder in Abhängigkeit von IGF-I- noch von den
GH-Konzentrationen eine Veränderung. Auch die zeitlich bedingten Änderungen
(Interaktion Gruppe*Zeit) waren bei den verschiedene Tiergruppen gleich (P > 0,05;
Abb. 13).
53
40
IGF-I hohe Gruppe (n=6)
IGF-I niedrige Gruppe (n=6)
NaCl Gruppe (n=7)
35
a
IGF-I (ng/ml)
30
25
20
15
Gruppe
Zeit
Gruppe*Zeit
10
P = 0,954
P = 0,209
P = 0,449
5
0
30
60
90
120
150
180
Minuten
40
IGF-I hohe Gruppe (n=6)
IGF-I niedrige Gruppe (n=6)
NaCl Gruppe (n=7)
35
Gruppe
Zeit
Gruppe*Zeit
P = 0,708
P = 0,148
P = 0,348
b
GH (ng/ml)
30
25
20
15
10
5
0
30
60
90
120
150
180
Minuten
Abb. 13: Konzentrationen des (a) Insulin-like Growth Factors-I (IGF-I) und des (b)
Wachstumshormons (Growth Hormone, GH) während des Versuchs in den Gruppen
mit unterschiedlichen IGF-I-Werten an den Tagen 240 – 254 post inseminationem
(IGF-I hoch versus IGF-I niedrig) und der NaCl-Gruppe relativ zur Infusion der
Uteruslösung (0) mit LPS (IGF-I-Gruppen) bzw. Kochsalzlösung (NaCl). Die
Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform
im Kästchen dargestellt.
54
4.4.2.2 Schilddrüsenhormone
Die T4-Konzentrationen waren zwischen den LPS-Gruppen und der NaCl-Gruppe
vergleichbar. Nach der LPS-Gabe kam es zu keiner signifikanten Veränderung der
T4-Konzentrationen (Abb. 14a).
Bei dem direkten Vergleich der IGF-I-Gruppen ergab sich ein Unterschied hinsichtlich
der zeitlichen Verläufe. Die T4-Konzentrationen stiegen in der IGF-I hohen Gruppe
an, während sie bei den IGF-I niedrigen Tiere abfielen (Interaktion Gruppe*Zeit P =
0,018; nicht dargestellt, entspricht aber der Abb. 14a ohne die NaCl-Gruppe).
Die T3-Konzentrationen waren bei allen drei Gruppen vergleichbar. Die Werte der T3Konzentrationen unterschieden sich auch innerhalb der IGF-I-Gruppen nicht (P >
0,05; Abb. 14b).
55
0,55
IGF-I hohe Gruppe (n=6)
IGF-I niedrige Gruppe (n=6)
NaCl Gruppe (n=7)
0,50
a
ln [T4 (µg/dl)]
0,45
Gruppe
Zeit
Gruppe*Zeit
0,40
P = 0,116
P = 0,931
P = 0,994
0,35
0,30
0,25
0
60
120
180
Minuten
180
Gruppe
Zeit
Gruppe*Zeit
IGF-I hohe Gruppe (n=6)
IGF-I niedrige Gruppe (n=6)
NaCl Gruppe (n=7)
P = 0,618
P = 0,914
P = 0,941
b
T3 (ng/ml)
160
140
120
100
80
0
60
120
180
Minuten
Abb. 14: (a) Logarithmierte Thyroxin- (T4) und (b) Trijodthyronin- (T3) Konzentrationen während des Versuches in den Gruppen mit unterschiedlichen IGF-I-Werten
an den Tagen 240 – 254 post inseminationem (IGF-I hoch versus IGF-I niedrig) und
der NaCl-Gruppe relativ zum Zeitpunkt der uterinen Infusion (0) von LPS (IGF-IGruppen) bzw. Kochsalzlösung (NaCl). Die Ergebnisse der statistischen Analyse
mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt.
56
4.4.2.3 Progesteron
Die Progesteronkonzentration sank zwischen 0 und 180 Minuten nach der uterinen
LPS- bzw. NaCl-Infusion tendenziell ab (P = 0,06; Abb. 15). Sowohl zwischen den
beiden IGF-I-Gruppen, als auch zwischen den LPS-Gruppen und der NaCl-Gruppe
waren keine Unterschiede (P > 0,05) festzustellen. Die zeitlichen Verläufe
(Interaktion Gruppe*Zeit) nach der intrauterinen Infusion waren in allen drei Gruppen
ähnlich (P > 0,05).
0,6
IGF-I hohe Gruppe (n=6)
IGF-I niedrige Gruppe (n=6)
NaCl Gruppe (n=7)
Progesteron (ng/ml)
0,5
0,4
Gruppe
Zeit
Gruppe*Zeit
P = 0,523
P = 0,063
P = 0,849
0,3
0,2
0,1
0
60
120
180
Minuten
Abb. 15: (a) Progesteronkonzentrationen während des Versuches in den Gruppen
mit unterschiedlichen IGF-I-Werten an den Tagen 240 – 254 post inseminationem
(IGF-I hoch versus IGF-I niedrig) und der NaCl-Gruppe relativ zum Zeitpunkt der
intrauterinen Infusion (0) von LPS (IGF-I-Gruppen) bzw. Kochsalzlösung (NaCl). Die
Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform
im Kästchen dargestellt.
57
4.4.2.4 17β-Östradiol
Während des 180 minütigen postpartalen Untersuchungszeitraums kam es zu einem
Absinken der E2-Konzentrationen in allen drei Versuchsgruppen (P < 0,001; Abb.
16). Zwischen den beiden IGF-I-Gruppen sowie zwischen den LPS-Gruppen und der
NaCl-Gruppe bestanden keine Unterschiede (P > 0,05) in den E 2-Konzentrationen.
Die zeitlichen Verläufe (Interaktion Gruppe*Zeit) der E2-Konzentrationen waren bei
den drei Gruppen vergleichbar (P > 0,05).
5,6
IGF-I hohe Gruppe (n=6)
IGF-I niedrige Gruppe (n=6)
NaCl Gruppe (n=7)
5,4
5,2
ln [E2 (pg/ml)]
5,0
Gruppe
Zeit
Gruppe*Zeit
4,8
4,6
P = 0,466
P < 0,001
P = 0,624
4,4
4,2
4,0
3,8
3,6
0
60
120
180
Minuten
Abb. 16: Logarithmierte 17β-Östradiolkonzentrationen (E2) während des Versuches
in den Gruppen mit unterschiedlichen IGF-I-Werten an den Tagen 240 – 254 post
inseminationem (IGF-I hoch versus IGF-I niedrig) und der NaCl-Gruppe relativ zum
Zeitpunkt der intrauterinen Infusion (0) von LPS (IGF-I-Gruppen) bzw. Kochsalzlösung (NaCl). Die Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller
ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt.
58
4.4.2.5 13,14-dihydro-15-keto-PGF2α
In den Gruppen IGF-I hoch und IGF-I niedrig gab es in den ersten 60 Minuten nach
LPS-Gabe einen Anstieg der PGFM-Konzentrationen, während in der NaCl-Gruppe
keine Änderung dieses Hormons zu verzeichnen waren (IGF-I hohe Gruppe: 7,34 ±
0,23 vs. 7,91 ± ,023 ln ng/ml; P = 0,001; IGF-I niedrige Gruppe 7,55 ± 0,23 vs. 8,00 ±
0,23 ln ng/ml; P = 0,011; NaCl-Gruppe 7,57 ± 0,21 vs. 7,74 ± 0,21 ln ng/ml; P > 0,05;
Abb. 17).
8,4
IGF-I hohe Gruppe (n=6)
IGF-I niedrige Gruppe (n=6)
NaCl Gruppe (n=7)
8,2
ln [PGFM (ng/ml)]
8,0
7,8
Gruppe
Zeit
Gruppe*Zeit
7,6
7,4
P = 0,651
P < 0,001
P = 0,175
7,2
7,0
6,8
6,6
0
30
60
90
120
150
180
Minuten
Abb. 17: Logarithmierte Prostaglandin F2α Metaboliten (PGFM) während des Versuches in den Gruppen mit unterschiedlichen IGF-I-Werten an den Tagen 240 – 254
post inseminationem (IGF-I hoch versus IGF-I niedrig) und der NaCl-Gruppe relativ
zum Zeitpunkt der intrauterinen Infusion (0) von LPS (IGF-I-Gruppen) bzw. Kochsalzlösung (NaCl). Die Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller
ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt.
59
4.4.2.6 Cortisol und Adrenocorticotropes Hormon
Hinsichtlich der Cortisolkonzentrationen war im Vergleich der beiden IGF-I-Gruppen,
bei denen LPS infundiert wurde, gegenüber der NaCl-Gruppe kein Unterschied
festzustellen (P > 0,05; Abb.18). Dagegen unterlagen die Cortisolkonzentrationen
innerhalb aller Gruppen zeitlich bedingten Änderungen:
In der IGF-I hohen Gruppe blieben die Cortisolkonzentration in den ersten 150
Minuten nach der Infusion konstant (P > 0,05). Erst 180 Minuten post infusionem war
in dieser Tiergruppe ein Anstieg zu verzeichnen (P = 0,009; Abb. 18). In der IGF-I
niedrigen Gruppe fiel Cortisol in den ersten 30 Minuten nach der intrauterinen
Infusion ab (P = 0,002). Ein signifikanter Anstieg gegenüber dem Zeitpunkt 30
Minuten fand bereits 150 Minuten post infusionem statt (P = 0,005).
In der NaCl-Gruppe änderte sich die Cortisolkonzentration 120 Minuten nach der
uterinen Infusion nicht (P > 0,05) und sank dann ab (P = 0,04).
Die ACTH-Konzentrationen stiegen im zeitlichen Verlauf zwischen den gemessenen
Zeitpunkten 30 und 150 Minuten post infusionem in beiden LPS-Gruppen im
Vergleich zur NaCl-Gruppe an (Tab. 12 im Tabellenanhang; Interaktion Gruppe*Zeit:
P = 0,039). Allerdings waren bei alleiniger Betrachtung der Gruppen und der
Zeitpunkte keine signifikanten Unterschiede der ACTH-Konzentrationen festzustellen.
Die IGF-I hohe Gruppe wies niedrigere Cortisolkonzentrationen auf als die IGF-I
niedrige Gruppe (2,0 ± 0,1 vs. 2,4 ± 0,1 ln (ng/ml); P = 0,032; graphisch nicht dargestellt, entspricht aber der Abb. 18 ohne die NaCl-Gruppe). Ferner war der
Cortisolanstieg in der IGF-I niedrigen Gruppe zwischen 30 und 150 Minuten post
infusionem signifikant (1,88 ± 0,19 vs. 2,62 ± 0,19 ln ng/ml; P = 0,006), nicht aber in
der IGF-I hohen Gruppe (1,77 ± 0,19 vs. 1,97 ± 0,19 ln ng/ml; P = 0,457). Die
Cortisolkonzentrationen zeigten in beiden IGF-I-Gruppen während des 180-minütigen
Untersuchungszeitraum die gleichen Änderungen (P > 0,05).
60
3,2
IGF-I hohe Gruppe (n=6)
IGF-I niedrige Gruppe (n=6)
NaCl Gruppe (n=7)
3,0
ln [Cortisol (ng/ml)]
2,8
2,6
2,4
Gruppe
Zeit
Gruppe*Zeit
2,2
P = 0,043
P = 0,007
P = 0,053
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
0
30
60
90
120
150
180
Minuten
Abb. 18: Logarithmische Cortisolkonzentrationen während des Versuches in den
Gruppen mit unterschiedlichen IGF-I-Werten an den Tagen 240 – 254 post
inseminationem (IGF-I hoch versus IGF-I niedrig) und der NaCl-Gruppe relativ zum
Zeitpunkt der intrauterinen Infusion (0) von LPS (IGF-I-Gruppen) bzw. Kochsalzlösung (NaCl). Die Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller
ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt.
61
4.4.2.7 Insulin
Bei den Insulinkonzentrationen findet ein tendenzieller Anstieg zwischen den Zeitpunkten 120 und 180 Minuten statt (Abb. 19). Nach den Gruppen aufgeteilt, kommt
es in der IGF-I niedrigen Gruppe zu einem Anstieg von 13,9 ± 2,9 auf 20,2 ± 4,0
pg/ml (P = 0,003). In der IGF-I hohen Gruppe ist lediglich ein Anstieg von 8,37 ± 2,90
auf 11,89 ± 3,98 pg/ml zu beobachten (P = 0,076). In der NaCl-Gruppe kam es zu
keiner Änderung der Insulinkonzentration.
35
IGF-I hohe Gruppe (n=6)
IGF-I niedrige Gruppe (n=6)
NaCl Gruppe (n=7)
30
Insulin (pg/ml)
25
20
Gruppe
Zeit
Gruppe*Zeit
15
P = 0,218
P = 0,052
P = 0,161
10
5
0
0
60
120
180
Minuten
Abb. 19: Insulinkonzentrationen während des LPS-Versuches in den Gruppen mit
unterschiedlichen IGF-I-Werten an den Tagen 240 – 254 post inseminationem (IGF-I
hoch versus IGF-I niedrig) und der NaCl-Gruppe relativ zum Zeitpunkt der
intrauterinen Infusion (0) von LPS (IGF-I-Gruppen) bzw. Kochsalzlösung (NaCl). Die
Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform
im Kästchen dargestellt.
62
4.4.2.8 Lipopolysaccharide
Bei den ersten 5 Tieren, denen LPS intrauterin infundiert worden war, konnte kein
LPS im Blut nachgewiesen werden. Die weiteren Tiere wurden aus finanziellen
Aspekten und aufgrund einer Literaturangabe (85), die einen Nachweis von LPS mit
dem angegebenen Test unwahrscheinlich erschienen ließen, nicht weiter untersucht.
4.5 Histologie
4.5.1 Übersichtsfärbung
Die lichtmikroskopische Betrachtung der Endometriumproben in der Übersichtsfärbung mit HE ergab, dass im dorsalen Teil des graviden Uterushorns bei allen
Präparaten mehr oder weniger das Oberflächenepithel in weiten Teilen vom Endometrium abgelöst und zum Teil auch nicht mehr vorhanden war. Weiterhin waren in
den Blutgefäßen des uterinen Gewebes und im Endometrium vermehrt polymorphkernige Zellen zu erkennen. Myometrium und Perimetrium stellten sich gewebetypisch dar. Zwischen den beiden IGF-I-Gruppen waren morphologisch keine
Unterschiede sichtbar.
Im Lebergewebe konnte eine Vakuolisierung der Hepatozyten bei insgesamt 10 der
12 Tiere nachgewiesen werden, wobei kein Unterschied (P > 0,05) in der Häufigkeit
des Vorkommens zwischen den Gruppen mit hohen und niedrigen IGF-I-Konzentrationen bestand. Bei jeder Gruppe waren je 5 von 6 Tieren davon betroffen. Je 2
der 6 Tiere jeder IGF-I-Gruppe zeigten eine hochgradige Vakuolisierung der Leber
mit Vakuolen größer 10 µm Durchmesser.
Im Fettgewebe der Bauchwand war bei allen Präparaten die „Siegelring“ Morphologie
der Adipozyten erhalten. Neben den Adipozyten waren auch Blutgefäße erkennbar.
Unterschiede in Abhängigkeit von der Zugehörigkeit zu den verschiedenen IGF-IGruppen war nicht sichtbar.
Die Muskelzellen des Musculus longissimus dorsi waren bei allen Präparaten gewebetypisch gefärbt. Weiterhin waren in den Schnitten zum Teil Adipozyten und Binde63
gewebe zwischen den Muskelzellen erkennbar. Ein Unterschied zwischen den IGF-IGruppen war in der HE-Färbung nicht feststellbar.
4.5.2 Immunhistochemie
Der GHR war im Uterus-, Leber- und Fettgewebe sowie in der Muskulatur nachweisbar. Sowohl die semiquantitative Auswertung der Färbung als auch die Betrachtung
der qualitativen Strukturspezifität der Färbung erbrachte zwischen den beiden IGF-IGruppen keine Unterschiede.
Im Uterusgewebe wurde der GHR bei den Präparaten im Zytoplasma des Oberflächenepithels des Endometriums, im Zytoplasma der Uterindrüsen und im Zytoplasma der Tela muscularis nachgewiesen (Abb. 20a). Weiterhin war eine positive
Reaktion im Zytoplasma der polymorphkernigen Zellen zu erkennen, die sich in den
Blutgefäßen und im Endometrium befanden (Abb. 21). Zwischen den Tiergruppen
waren qualitativ keine Unterschiede zu sehen.
In der Leber färbten sich immunhistologisch das Zytoplasma der Hepatozyten und
das Zytoplasma der Gallengangszellen mit dem GHR Antikörper bei allen Präparaten
an (Abb. 20b). Allerdings zeigte hier auch die Kontrolle (polyklonales Mausserum)
eine positive Reaktion an den Gallengängen, was auf eine unspezifische Reaktion in
den Gallengängen schließen lässt. Zwischen den beiden Tiergruppen konnte kein
qualitativer Unterschied festgestellt werden.
Im Fettgewebe konnte der GHR im Zytoplasma der Endothelzellen aller Präparate
nachgewiesen werden. Im Zytoplasma und der Zellmembran von Adipozyten war
keine Färbung erkennbar (Abb. 20c). Ein qualitativer Unterschied zwischen den
beiden IGF-I-Gruppen war nicht zu sehen.
Im Musculus longissimus dorsi waren im Zytoplasma bei allen Präparaten in regelmäßigen Abständen von ca. 2 µm gefärbte und ungefärbte Bereiche zu sehen. Die
Ausrichtung erfolgte gleichmäßig über den gesamten Schnitt, wobei sich die einzelnen Muskelzellen in der Intensität unterschieden (Abb. 20d). Ein qualitativer
Unterschied zwischen beiden IGF-I-Gruppen wurde nicht festgestellt.
64
a
b
*
*
+
+
#
c
d
Abb. 20: Lichtmikroskopische Aufnahme der Growth Hormone Rezeptor Färbungen:
a) tragendes Horn des Uterus dorsal (Vergrößerung 1:200), mit positiv gefärbtem
Oberflächenepithel (*), Schlauchdrüsen (+) und Muskelzellen (#). Im Endometrium
sind vermehrt gefärbte polymorphkernigen Entzündungzellen (). b) Lebergewebe
(1:200), mit positiv gefärbten Hepatozyten (*). Zentolobulär sind Vakuolen mit einem
Durchmesser von etwa 10 µm (). c) Fettgewebe der Bauchwand (1:200). Eine Färbung ist in den Zellen der Blutgefäßwandungen erkennbar (). d) Musculus longissimus dorsi (1:400). Im Zytoplasma der Muskelzellen kommt es zu einer Querstreifung
mit regelmäßigen Abständen von ca. 2µm (). Die Querstreifung ist gleichmäßig
über den gesamten Schnitt ausgerichtet.
65
Abb. 21: Lichtmikroskopische Aufnahme eines Blutgefäßes im Endometrium (1:600
Ölimmersion) des GHR gefärbten Uterusgewebes. Im Gefäßlumen und im angrenzenden Gewebe sind vermehrt positiv gefärbte polymorphkernige Zellen () erkennbar.
66
5 Diskussion
Die Transitperiode der Milchkuh stellt eine Zeit mit erhöhter Krankheitsinzidenz dar
(1, 2). Daher ist bereits in der Vergangenheit versucht worden, geeignete Parameter,
wie zum Beispiel freie Fettsäuren und Haptoglobin, zur frühzeitigen Erkennung von
Krankheiten zu finden (10, 111). Ein möglicher weiterer Parameter scheint das in der
Leber gebildete IGF-I zu sein, welches von Piechotta et al. (10) vorgeschlagen und in
der vorliegenden Arbeit als Grundlage zur Selektion von graviden pluriparen Kühen
verwendet wurde. Letztgenannte Autoren stellten fest, dass bei Tieren mit Produktionserkrankungen die IGF-I-Konzentrationen 4 bis 6 Wochen vor der Geburt niedriger waren als bei Kühen, die während der Transitperiode gesund blieben. Einen
Unterschied der IGF-I-Konzentrationen beobachteten auch Kawashima et al. (71). In
ihrer Studie hatten Kühen mit antepartal hohen IGF-I-Konzentrationen, deutlich früher nach der Geburt ovuliert als Kühe mit niedrigen IGF-I-Konzentrationen. Untersuchungen von Piechotta et al. (112) zeigten, dass sich Tiere, die nach den IGF-IKonzentrationen zwischen den Tagen 244 bis 250 p. insem. ausgewählt und in eine
hohe und niedrige IGF-I-Gruppe eingeteilt wurden, bis zum 275. Tag p. insem. in den
IGF-I-Konzentrationen unterschieden. Zu diesem Zeitpunkt wurde ein Kaiserschnitt
durchgeführt, so dass Daten in Bezug auf den natürlichen Geburtszeitpunkt fehlen. In
der vorliegenden Arbeit wurden deshalb Proben bis zum Eintritt einer Spontangeburt
genommen, um die Hypothese zu prüfen, dass auch nach dem 275 Tag p. insem.
noch Unterschiede in den IGF-I- und in den GH-Konzentrationen bestehen.
Das Immunsystem und die metabolische Dysadaptation gelten als wichtige Auslöser
für Produktionserkrankungen (1, 2). Allerdings ist nicht bekannt, ob die Somatotrope
Achse auch Einfluss auf andere endokrine Gegebenheiten der Milchkühe hat und dadurch die unterschiedlichen Erkrankungsinzidenzen zustande kommen könnten. In
diesem Zusammenhang sind gerade uterine Erkrankungen von Bedeutung, da sie
sowohl bei uni- als auch bei pluriparen Milchkühen besonders häufig auftreten (4).
Die vorliegende Studie sollte deshalb weiterhin zeigen, ob zwischen Tieren, die vor
der Geburt auf Grundlage unterschiedlicher IGF-I-Konzentrationen ausgewählt
worden sind, ein Unterschied in der Änderung ausgewählter Parameter auf einen
lokalen Entzündungsreiz im Uterus nach der Geburt besteht. Dabei sollte auch
untersucht werden, ob sich die endokrinen Gegebenheiten vor der Geburt zwischen
den Tieren mit niedrigen und hohen IGF-I-Spiegeln unterscheiden.
67
5.1 Tiere
In der vorliegenden Arbeit wurden die Tiere eines Betriebes auf Grundlage einer
einzigen Bestimmung der IGF-I-Konzentration im Blut zwischen den Tagen 240 bis
254 p. insem. ausgewählt. Nach Piechotta et al. (10) liegt der mittlere IGF-I-Wert zwischen den Tagen 242 bis 248 p. insem. bei 131,5 ng/ml. Die Tiere wurden deshalb
so ausgewählt, dass sich ihre IGF-I-Konzentration deutlich von dem mittleren Wert
von 131,5 ng/ml unterschieden. Tiere der in dieser Arbeit beschriebenen IGF-I
niedrigen Gruppe wiesen IGF-I-Werte von ≤ 125 ng/ml und Tiere der IGF-I hohen
Gruppe IGF-I-Werte von ≥ 175 ng/ml auf.
Da in der vorliegenden Arbeit vorwiegend auf Unterschiede im endokrinen System
geachtet werden sollte, wurden ausschließlich pluripare Tiere gleichen Alters, vergleichbarer Milchleistung und ähnlichem BCS für den Versuch ausgewählt. Dadurch
sollten andere Einflüsse so gering wie möglich gehalten werden, da es bekannt ist,
dass das Alter einen Einfluss auf die IGF-I-Konzentrationen hat: In der Pubertät haben die Rinder die höchsten IGF-I-Konzentrationen. Diese sinken anschließend bis
zum Alter von 5 Jahren ab. Vor allem Färsen weisen demnach im Vergleich zu pluriparen Kühen höhere IGF-I-Konzentrationen auf (113). In der vorliegenden Arbeit
wurden Tiere mit einer eher niedrigen Milchleistung während der vorherigen Laktation gewählt. Dies erfolgte vor allem aus betriebswirtschaftlichen Gründen, da der
Betrieb bei der Auswahl vor allem Tiere mit einer geringen Milchleistung für den
Versuch abgegeben hat. Da die Milchleistung in anderen Studien keinen Einfluss auf
die Inzidenz uteriner Erkrankungen (2) und die IGF-I-Konzentrationen (114, 115)
hatte, dürfte diese Selektion die untersuchten Parameter nicht beeinflusst haben.
Hoedemaker et al. (116) konnten zeigen, dass Kühe mit einem präpartal beurteilten
BCS von unter 3 häufiger an Lahmheiten, Nachgeburtsverhaltungen und Dystokien
litten. Dagegen zeigten Tiere mit einem BCS von über 3,5 eine deutliche Zunahme
an metabolischen Entgleisungen (117). Um den Einfluss der Körperkondition auf die
eigenen Versuchsergebnisse auszuschließen, wurde daher bei der Selektion der Tiere darauf geachtet, dass der BCS inter-individuell nicht stark differierte.
Ein Nachteil der vorliegenden Versuchsdurchführung war, dass die Tiere nach der
Selektion vom Betrieb zur Klinik über 3 Stunden transportiert werden mussten. Dies
führt zu einer Stressbelastung der Tiere und kann sich damit auf die endokrinologischen Parameter auswirken (118, 119). Da allerdings alle Versuchstiere transportiert
wurden und den Tiere mit Ausnahme einer Kuh vor der Entnahme der ersten Blut68
probe eine Eingewöhnungszeit von mindestens 3 Tagen in der Klinik für Rinder gewährt wurde, dürften die Auswirkungen auf das hormonelle Geschehen vermutlich
relativ gering und bei den Tieren mit niedrigen und hohen IGF-I-Spiegeln vergleichbar gewesen sein.
Angestrebt wurde zunächst eine Gruppengröße von jeweils 10 Tieren. Da einige Tiere aufgrund von Erkrankungen von den Auswertungen ausgeschlossen werden
mussten, blieben jeweils 6 Tiere in den beiden IGF-I-Gruppen, denen postpartal LPS
infundiert wurde, übrig. Auffällig war der relativ hohe Anteil an Nachgeburtsverhaltungen in dieser Arbeit (n=5). Dieser lag nach 12 Stunden mit 26,3% höher als in der
Literatur beschrieben (2 bis 12% nach 12 Stunden) (4, 83). Allerdings ist darauf
hinzuweisen, dass bei 4 der 5 Tiere die Nachgeburt innerhalb von 24 Stunden
ausgestoßen wurde und teilweise in der Literatur von einer Nachgeburtsverhaltung
erst dann gesprochen wird, wenn die Plazenta später als 24 Stunden nach der
Entwicklung des Kalbes abgeht (82). Würde man die letztgenannte Definition auch
für
die
vorliegende
Arbeit
heranziehen,
dann
wäre
die
Inzidenz
der
Nachgeburtsverhaltungen in der vorliegenden Studie mit 5,3% nicht erhöht.
Unabhängig davon ist nicht auszuschließen, dass die im Rahmen der Studie
erforderlichen Untersuchungen um den Geburtszeitpunkt dazu beigetragen haben
könnten, dass die Nachgeburt verzögert abging, da Stress als ein Faktor für Nachgeburtsverhaltungen gilt (120).
Da die fünf Tiere, die an einer Nachgeburtsverhaltung litten, gleichmäßig über beide
IGF-I-Gruppen
verteilt
waren,
bestand
kein
offensichtlicher Zusammenhang
zwischen der Inzidenz dieser Erkrankung und den IGF-I-Konzentrationen.
5.2 Antepartaler Zeitraum
In der vorliegenden Arbeit unterschieden sich die Tiere bei der Untersuchung am Tag
der Einstallung in die Klinik, d.h. zwischen den Tagen 249 bis 265 p. insem. nicht nur
hinsichtlich des IGF-I-Spiegels, sondern auch bezüglich der klinisch-chemischen
Parameter HST, GB, Leukozyten und Magnesium.
Hohe Harnstoffkonzentrationen in Zusammenhang mit höheren IGF-I-Werten haben
bereits Zulu et al. (121) und Hoedemaker et al. (122) beschrieben. Eine höhere HSTKonzentration spricht für mehr verfügbares Protein (123), so dass die IGF-I hohen
Tiere eine höhere Proteinversorgung gehabt haben könnten. Ein Zusammenhang
69
zwischen niedrigeren HST-Konzentrationen und vermehrt auftretenden Krankheiten
wurde von Kaufmann et al. (87) festgestellt. Allerdings sind die HST-Konzentrationen
bei den letztgenannten Autoren erst nach der Geburt und nicht wie in der vorliegenden Arbeit vor der Geburt bestimmt worden. Ob sich HST ebenfalls als Marker für
Produktionserkrankungen zwischen den Tagen 240 bis 254 p. insem. ähnlich dem
IGF-I eignet, müsste durch weitere Studien geklärt werden.
Gesamt-Bilirubin ist ein Indikator für die Leberbelastung (124). Da IGF-I niedrige Tiere in der vorliegenden Studie höhere Bilirubinwerte aufwiesen, könnte dies, wie bei
McSherry et al. (124) beschrieben, auf eine erhöhte Leberbelastung bei diesen
Tieren hindeuten. Diese Annahme wird zusätzlich durch die erhöhten FFSKonzentrationen bei diesen Tieren gestützt, die zu einer Leberbelastung führen
können (21).
Aus Studien mit Mäusen weiß man, dass bei höheren IGF-I-Konzentrationen mehr
Leukozyten bei einer anschließenden mit E. coli erzeugten Peritonitis nachzuweisen
sind (125). Hoedemaker et al. (122) beobachteten bei Rindern keinen Zusammenhang zwischen der Zahl neutrophiler Granulozyten und den IGF-I-Konzentrationen.
Dagegen konnten Sander et al. (97) eine moderate negative Korrelation zwischen
IGF-I und der Phagozytoseleistung neutrophiler Granulozyten in der Transitperiode
nachweisen. Dabei war die Gesamtleukozytenzahl nach der Geburt negativ mit IGF-I
korreliert. Allerdings ist nach Auffassung der Autoren in Betracht zu ziehen, dass
durch die Entkopplung der Somatotropen Achse niedrigere IGF-I-Konzentrationen
eine vermehrte GH-Sekretion bedingen könnten und sich zu dieser Zeit eine
besondere Situation darstellt. Die höheren GH-Konzentrationen könnten sich positiv
auf die neutrophilen Granulozyten auswirken. Interessanterweise waren in der
vorliegenden Studie vermehrt Leukozyten in der IGF-I hohen Gruppe nachzuweisen.
Dieser Unterschied war allerdings bereits vor der Geburt zu sehen, wo noch keine
Entkopplung der Somatotropen Achse vorgelegen hat. Es ist denkbar, dass es durch
den Transport in die Klinik für Rinder zu einer vermehrten Freisetzung von
Leukozyten aus dem Knochenmark kam. Bei allen Tieren lagen die Leukozytenzahlen im oberen Referenzbereich, ohne dass klinisch eine Entzündung nachgewiesen werden konnte. Dies könnte darauf hindeuten, dass die IGF-I hohen Tiere
vermehrt Leukozyten in einer Stresssituation freisetzen können. Für eine genaue
Interpretation dieses Ergebnisses sind allerdings weitere Untersuchungen notwendig,
70
da für den Transport und die ersten Tage in der Klinik Daten aufgrund des
Versuchsdesigns fehlen.
5.2.1 Somatotrope Achse
In der vorliegenden Arbeit wurde antepartal das Wachstumshormon und IGF-I als
Bestandteil der Somatotropen Achse quantitativ im Plasma bestimmt. In beiden IGFI-Gruppen sanken die IGF-I-Konzentrationen zur Geburt hin vergleichbar ab. Dieses
Ergebnis deckt sich mit einer Beobachtung von Cavestany et al. (126), in deren
Studie führte eine erhöhte Energieversorgung zu höheren praepartalen IGF-IWerten, wohingegen die IGF-I-Spiegel bis zur Geburt abfielen und sich unmittelbar
peripartal gegenüber einer Kontrollgruppe ohne erhöhte Energieversorgung nicht
mehr unterschieden.
Das Absinken der IGF-I-Konzentration wird der verminderten Transkription des GHR
1A in der Leber zugeschrieben (7). Dadurch kommt es zu einer verminderten
Expression des GHR an der Hepatozytenoberfläche und dadurch zu einer geringen
Stimulation der IGF-I-Synthese durch GH. Möglich ist ein stärkeres Absinken des
GHR 1A in der IGF-I hohen Gruppe, was aber in der vorliegenden Arbeit aufgrund
fehlender mRNA Analysen des GHR 1A nicht überprüft werden konnte. Allerdings
sind auch, ähnlich wie beim Menschen, sinkende IGFBP-3 im Blut durch eine
verstärkte Proteasenaktivität als Ursache für einen deutlichen praepartalen IGF-I
Abfall denkbar (127). Durch einen verstärkten Abbau von IGFBP-3 in der IGF-I
hohen Gruppe wären die stärker sinkenden IGF-I-Konzentrationen zu erklären,
allerdings fehlt in dieser Arbeit hierzu eine quantitative Bestimmung des IGFBP-3.
Es konnte in dieser Arbeit aber gezeigt werden, dass sich Tiere, die durch eine
einmalige Blutprobe hinsichtlich ihrer IGF-I-Konzentration selektiert wurden, in
diesem Parameter auch bis zum 275. Tag p. insem. signifikant voneinander unterschieden. Dies Ergebnis geht mit der Beobachtung von Piechotta et al. (112) einher,
die unterschiedliche IGF-I-Werte bis zum Kaiserschnitt am 275. Tag p. insem. gemessen haben. Offen blieb bei der Studie von Piechotta et al. (112), ob durch die
Einteilung in Abhängigkeit vom IGF-I-Spiegel möglicherweise Tiere selektiert wurden,
die sich unterschiedlich weit von der Spontangeburt weg befanden und sich der
Parameter IGF-I deshalb unterschied. Es ist bekannt, dass die IGF-I-Konzentration
mit der Annäherung an den Geburtszeitpunkt absinkt (7). In der hier beschriebenen
71
Arbeit konnten die Proben retrospektiv nach dem Zeitpunkt der Spontangeburt
geordnet werden. Die Tiere wiesen sowohl bis zum 275. Tag p. insem. als auch bis
zum 6. Tag vor der Geburt unterschiedliche IGF-I-Werte auf. Somit scheint bis zum
275. Tag p. insem. eine Einteilung in IGF-I hohe und niedrige Tiere möglich zu sein.
Die Differenz der IGF-I-Konzentrationen zwischen den Tiergruppen wurde wesentlich
geringer je näher die Proben zum 275. Tag liegen und ab dem 276. Tag war kein
Unterschied mehr feststellbar.
Unabhängig von der Einteilung in die Gruppen mit hohen und niedrigen IGF-IWerten, war in der hier vorliegenden Studie ein deutlicher Anstieg der Wachstumshormonkonzentrationen ab dem 4. Tag vor der Geburt erkennbar. Dieses Ergebnis
ist mit den Aussagen anderer Studien vergleichbar (7, 71). Die beiden IGF-I-Gruppen
wiesen ferner während des gesamten getesteten Zeitraums vergleichbare GHKonzentrationen auf.
Betrachtet man den endokrinologischen Regelkreis, dann hätte man eigentlich vermutet, dass die IGF-I niedrige Gruppe zum Zeitpunkt der Auswahl (240. bis 254. Tag
p. insem.) höhere GH-Konzentrationen besitzt, da IGF-I zu einem negativen
Feedback hinsichtlich der hypophysären GH-Ausschüttung führt. Diese Hypothese
wurde in der vorliegenden Arbeit nicht bestätigt. Zugrunde liegende Ursachen
können sein, dass die GH-Ausschüttung einer circadianen, individuellen Rhythmik
unterliegt und somit über den Tag bzw. die Nacht verschiedene Konzentrationen
messbar sind (45). Die maximale GH-Ausschüttung erfolgt nachts und es ist nicht
auszuschließen, dass in dieser Zeit die IGF-I niedrigeren Tiere vermehrt GH vor
allem durch eine höhere Frequenz ausschütten (45). Weiterhin ist zu beachten, dass
vor allem das freie IGF-I für das negative Feedback der GH-Ausschüttung in der
Hypophyse von Bedeutung ist (128). In der vorliegenden Arbeit ist allerdings
ausschließlich Gesamt-IGF-I, also das an alle sieben Bindungsproteine gebundene
IGF-I, gemessen worden. Inwieweit sich in der vorliegenden Arbeit die freien IGF-IKonzentrationen von den gemessenen Gesamt-IGF-I-Konzentrationen unterschieden
haben, ist nicht bekannt. Es ist aber durchaus möglich, dass die IGF-I hohen und
niedrigen Gruppen ähnliche Konzentrationen an freiem IGF-I hatten und dies dazu
geführt hat, dass sich die GH-Konzentrationen nicht unterschieden.
Eine andere mögliche Erklärung für die vergleichbaren GH-Konzentrationen bei beiden IGF-I-Gruppen vor der Geburt könnte die geringe analytische Sensitivität des
72
GH-Tests sein, der somit geringe GH-Unterschiede nicht ausreichend angezeigt
haben könnte.
Auffällig ist weiterhin, dass sich die IGF-I-Konzentrationen der Tiere zur Geburt hin
anglichen. Die stärker abfallenden IGF-I-Konzentrationen der IGF-I hohen Gruppe
führten aber zu keinem vermehrten Anstieg der GH-Konzentrationen im Vergleich zur
IGF-I niedrigen Gruppe. Nach Kawashima et al. (71) ist davon auszugehen, dass die
IGF-I niedrigen Tiere höhere GH-Konzentrationen postpartal entwickeln. Zu beachten
ist, dass andere Faktoren, wie z.B. Insulin, Leptin und Glukose neben dem IGF-I
einen bedeutenden Einfluss auf die GH-Sekretion haben (45, 128). Eine unterschiedliche Entwicklung der Insulinkonzentrationen in beiden IGF-I-Gruppen könnte auch
zu einer unterschiedlichen GH-Ausschüttung führen, allerdings wären hierfür Untersuchungen an einer größeren Tiergruppe notwendig.
5.2.2 Schilddrüsenhormone
Bereits Elsasser et al. (129) wiesen auf einen engen Zusammenhang zwischen der
Somatotropen Achse und der Schilddrüsenachse hin. Beispielsweise ist Thyreotropin
Releasing Hormon (TRH) bei Rindern in der Lage, sowohl die TSH- als auch die GHAusschüttung zu stimulieren.
In der vorliegenden Arbeit sanken die T4-Konzentrationen vor der Geburt deutlich ab.
Dieser T4-Abfall stimmt mit Beschreibungen in der Literatur überein (26, 130) und
wird von Aceves et al. (26) zum einen mit der metabolischen Belastung, zum
anderen aber auch mit einem erhöhten Verbrauch an Schilddrüsenhormonen durch
den Fetus und durch die beginnende Laktation in Zusammenhang gebracht. Gleiches gilt für die Entwicklung der T3-Konzentrationen im Serum, die sich nach Literaturangaben parallel zu den T4-Konzentrationen ändern und ebenfalls absinken (130).
Hierbei spielt die Energieversorgung eine entscheidende Bedeutung für den Schilddrüsenhormonstoffwechsel: Bei einer höheren Energieversorgung zeigen Kühe 14
Tage vor der Geburt höhere T4- und T3-Konzentrationen als Tiere mit einer
minderwertigeren Energieversorgung (130).
Ähnlich verhält es sich auch mit IGF-I und der Energieversorgung (131), so dass
höhere IGF-I-Konzentrationen hier als ein Indikator für eine bessere Energieverwertung stehen könnten und dieser Umstand auch die unterschiedliche Entwicklung
73
der Schilddrüsenhormone bedingen könnte. Leider konnte in der eigenen Studie die
Energie- oder Futteraufnahme der Tiere nicht gemessen werden und somit über den
Einfluss an dieser Stelle nur spekuliert werden.
Das T3 wird in peripheren Körperzellen und auch in der Leber durch die Abspaltung
eines Jodatoms vom Thyroxin durch die 5’Deiodinase gebildet. Die unterschiedliche
Entwicklung der T3-Konzentrationen bei Tieren mit unterschiedlichen IGF-I-Konzentrationen wurde mit einer verminderten 5’Deiodinase Aktivität in der Leber in Zusammenhang gebracht. Die Aktivität war bei den IGF-I hohen Tieren signifikant höher
(112). Die Beobachtung der sinkenden T3-Konzentrationen bei fallenden IGF-IKonzentrationen ist auch bereits beim Menschen beschrieben worden (132) und
kann anhand der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit auch für das Rind bestätigt
werden.
Sowohl die T3- als auch die IGF-I-Konzentrationen scheinen eine unterschiedliche
metabolische Adaptation an den erhöhten Energieverbrauch der Milchkuh zu zeigen.
Es liegen Studien vor, in denen Kühe mit T 3 behandelt wurden und dies zu niedrigen
IGF-I-Konzentrationen führte (133). Hier stellt sich nun die Frage, inwieweit die
Schilddrüse auf Unterschiede in der Somatotropen Achse reagiert oder ob die Unterschiede im T3 ursächlich für Differenzen in den IGF-I-Konzentrationen sind. Vermutet
wird, dass höhere T3-Konzentrationen durch einen erhöhten Katabolismus eine erhöhte GH-Resistenz auslösen und niedrigere IGF-I-Konzentrationen bedingen. Diesem Mechanismus kann mit einer anabolen Behandlung entgegen gewirkt werden
(133). In der vorliegenden Arbeit würden also eher die IGF-I-Konzentrationen die
Schilddrüsenwerte bedingen als umgekehrt. Ein solcher kausaler Zusammenhang
kann aber durch das Versuchsdesign der vorliegenden Arbeit nicht bestätigt werden,
sondern müsste in weiteren Tierexperimenten oder in vitro nachgestellt werden.
5.2.3 Cortisol
Das Nebennierenrindenhormon Cortisol ist auf der einen Seite als das typische
Stresshormon bekannt, initiiert aber auf der anderen Seite bei Rindern auch die
Geburt
durch
das
Heranreifen
der
fetalen
Nebennierenrindenachse
(27).
Dementsprechend sind zur Geburt hin erhöhte Cortisolkonzentrationen beim
Muttertier zu erwarten. Desweiteren ist auch der Geburtsvorgang an sich mit Stress
für das Tier verbunden und führt ebenfalls zu erhöhten peripheren Cortisolkon74
zentrationen (27, 111). Darüber hinaus kann es auch allein beim Umgang mit den
Tieren zu einer stressinduzierten Cortisolausschüttung kommen, die tierindividuell
und abhängig vom Umgang mit den Tieren unterschiedlich hoch sein kann (111).
Rhoads et al. (134) sind der Ansicht, dass Stress, der mit einer erhöhten Cortisolkonzentration einhergeht, auch einen Einfluss auf die Somatotrope Achse hat.
Die Autoren fanden heraus, dass die erhöhten Cortisolkonzentrationen zu verminderten GH- und IGF-I-Konzentrationen führen. Diese Beobachtungen würden auch
mit den Ergebnissen der vorliegenden Studie einhergehen, da die IGF-I niedrigen
Tiere eine höhere Cortisolkonzentration aufwiesen. Allerdings lässt sich ein kausaler
Zusammenhang in dieser Studie nicht nachweisen.
Umgekehrt ist beim Menschen bekannt, dass sich GH und IGF-I auf die Cortisolbildung auswirken können. Dieses Phänomen wird vor allem durch die Enzyme 11βHydroxysteroiddehydrogenase Typ 1 und Typ 2 (HSD1 bzw. HSD2) vermittelt. Eine
verminderte GH- und IGF-I-Konzentration verringert die HSD2 und es kommt zu
einer erhöhten Cortisolkonzentration durch eine verminderte Deaktivierung des Cortisols zu Cortison (135). Dabei können die Cortisolkonzentrationen im physiologischen Bereich liegen, allerdings zeigt sich ein verschobenes Verhältnis von Cortisol
zu Cortison zugunsten des Cortisols (135).
In der vorliegenden Arbeit war bei beiden Tiergruppen der in der Literatur (27, 136)
beschriebene Anstieg der Cortisolkonzentrationen zur Geburt hin zu beobachten und
vergleichbar. Allerdings war aber über den gesamten antepartalen Zeitraum eine
erhöhte Cortisolkonzentration bei der IGF-I niedrigen Gruppe messbar. Dies könnte,
wie oben bereits beschrieben, entweder zu einer niedrigeren IGF-I-Konzentration
führen oder durch eine verminderte HSD2-Aktivität bedingt sein. Diese Gegebenheiten wären ein interessanter Ansatzpunkt für weitere Untersuchung dieses endokrinen Netzwerkes.
Auf der anderen Seite könnte auch die erhöhte Cortisolkonzentration zu einer niedrigeren IGF-I-Konzentration geführt haben. Ausgelöst durch Cortisol kann es zu einer
GH-Resistenz der Leber kommen und damit zu verminderter IGF-I-Ausschüttung (6).
Es kann aber auch die GH-Sekretion durch Cortisol vermindert sein (134). Welcher
der auslösende Faktor für die Unterschiede in der Cortisolkonzentration war, ist in
der vorliegenden Arbeit nicht näher untersucht worden.
75
Bemerkenswert ist aber, dass Cortisol für den Verlauf einer Infektion eine entscheidende Rolle spielt, da die Anfälligkeit für mikrobiologische Infektionen durch
erhöhte Cortisolkonzentrationen zunimmt (137).
Dies wäre eine mögliche Erklärung für eine von Piechotta et al. (10) beschriebene
erhöhte Krankheitsanfälligkeit für IGF-I niedrige Tiere, allerdings kann darüber in der
hier beschriebenen Arbeit nur spekuliert werden. Diese Hypothese müsste in
weiteren Studien überprüft werden.
5.2.4 Reproduktionshormone
Die zeitlichen Verläufe der Reproduktionshormone Progesteron, 17β-Östradiol und
PGFM entsprachen den Beschreibungen in der Literatur. Progesteron sank zur
Geburt ab, E2 stieg im letzten Drittel der Trächtigkeit an und PGFM nahm zur Geburt
hin zu, um die Austreibung der Frucht zu unterstützen (27, 32). In der vorliegenden
Arbeit waren zwischen den beiden IGF-I Tiergruppen keine Unterschiede in den P4-,
E2- und PGFM-Konzentrationen zu erkennen.
Durch die erhöhten Cortisolkonzentrationen wäre eine vermehrte Aktivierung des
Enzyms 17α-Hydroxylase mit einer höheren Östrogenkonzentration und einer niedrigeren Progesteronkonzentration bei den IGF-I niedrigen Tieren zu erwarten gewesen
(31, 33, 34). Da allerdings gerade bei den E2-Konzentrationen hohe tierindividuelle
Unterschiede festzustellen sind, müsste zur Prüfung dieser Fragestellung eine
größere Gruppe geprüft werden (138).
5.2.5 Insulin und FFS
In der vorliegenden Arbeit wurde ein Rückgang der Insulinkonzentrationen in der
letzten Woche vor der Geburt in beiden Gruppen beobachtet. Dies stimmt mit den
Untersuchungen von Bell et al. (22) überein, die ebenfalls einen Abfall der Insulinkonzentration zur Geburt hin beschreiben. Durch die enge, auch strukturelle Vernetzung, von Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren und Insulin hätte man niedrigere Insulinwerte bei der IGF-I niedrigen Gruppe erwarten können. Dieser Zusammenhang
wurde von Cavestany et al. (126) schon bei Tiergruppen mit unterschiedlichen Fütterungsregimen und damit einhergehenden unterschiedlichen IGF-I-Konzentrationen
beobachtet.
76
In der eigenen Arbeit waren allerdings die Insulinkonzentrationen bei den verschiedenen Tiergruppen vergleichbar. Ein möglicher Grund dafür könnte sein, dass Insulin
eine wesentlich geringere Halbwertzeit als IGF-I besitzt und schnell auf metabolische
Gegebenheiten reagiert, so dass es zu erheblichen Schwankungen im Verlauf eines
Tages kommt (24).
Das Absinken der Insulinkonzentrationen zur Geburt hin wurde bei Hochleistungsmilchkühen mit einer Bereitstellung der Nährstoffe für das insulinunabhängige Euter
beschrieben, da mit einer verminderten Insulinkonzentration weniger Glukose in die
insulinabhängigen Organe, wie Muskulatur und Fettgewebe aufgenommen wird
(139). Der Abfall der Insulinkonzentrationen entspricht demnach dem aus der Literatur erwarteten Verlauf dieses metabolischen Hormons.
Zum Zeitpunkt der Tierauswahl auf dem Betrieb (240 bis 254 Tage p. insem.) waren
die FFS-Konzentrationen bei Tieren mit niedrigen IGF-I-Konzentrationen höher als
bei Tieren mit hohen IGF-I-Konzentrationen.
Diese Signifikanz konnte zu diesem Zeitpunkt in vorangegangenen Studien nicht
beobachtet werden (112). Dieses Ergebnis zeigt, dass sich die IGF-I niedrigen Tiere
bereits in einer Phase mit erhöhter Energiebereitstellung durch Lipolyse befanden.
Dabei scheint allerdings im Vergleich mit anderen Arbeiten, eine Nutzung der FFSKonzentration zu diesem Zeitpunkt nicht möglich, da keine Zusammenhänge beobachtet wurden (10, 71).
Über den 266. Tag p. insem. bis zur Geburt war die FFS-Konzentration in der IGF-I
niedrigeren Gruppe erhöht. In der Arbeit von Piechotta et al. (10) war die Zahl der
Kühe mit klinischer Ketose in der IGF-I niedrigen Gruppe höher. Da IGF-I ähnlich wie
Insulin auf die Adipozyten wirkt und eine vermehrte Aufnahme lipogener Stoffe aus
der Blutbahn in die Adipozyten bewirkt, könnte die höhere IGF-I-Spiegel auch die
FFS-Konzentrationen beeinflussen (45). Höhere IGF-I-Werte würden somit für eine
vermehrte Aufnahme von freien Fettsäuren in die Adipozyten sprechen und damit
niedrigere FFS-Konzentrationen erklären.
In der von Huzzey et al. (111) durchgeführten Studie konnte ein Zusammenhang zwischen höheren FFS vor der Geburt und dem vermehrtem Auftreten von Krankheiten
in den ersten 30 Tagen der anschließenden Laktation beobachtet werden.
Die Beobachtung, dass sich in der IGF-I niedrigen Gruppe vermehrt Tiere mit hohen
FFS-Konzentrationen befinden, würde also dafür sprechen, dass es zu vermehrten
77
Krankheiten in der Gruppe in den ersten 30 Tagen der Laktation kommen würde.
Dies konnte aufgrund des Versuchsaufbaus in der vorliegenden Studie nicht
nachverfolgt werden, deutete sich aber in anderen Untersuchungen an (10).
Zur Geburt hin kommt es zu einer katabolen Stoffwechsellage der Milchkuh (140). Da
eine höhere negative Energiebilanz höhere FFS-Konzentrationen im Blut bedingt
(65), könnte in der vorliegenden Arbeit eine stärkere negative Energiebilanz bei der
IGF-I niedrigen Gruppe vorgelegen haben.
Bei den Rassen mit hoher Milchleistung ist auch eine Insulinresistenz der Gewebe
beschrieben. Diese Insulinresistenz führt zu einem vermehrten Transport von Glukose in die Milchdrüse über den insulinunabhängigen Glukosetransporter (140).
Durch eine verstärkte Insulinresistenz kommt es neben erhöhten Glukose- und Insulinkonzentrationen auch zu erhöhten FFS-Konzentrationen (141). Ob tatsächlich
eine erhöhte Insulinresistenz bei der IGF-I niedrigen Gruppe vorgelegen hat, lässt
sich in dieser Arbeit nicht klären. Für eine solche Aussage fehlen die Informationen
zu den Glukosekonzentrationen und darüber hinaus zum sicheren Nachweis einer
Insulinresistenz ein Glukosetoleranztest, der in der vorliegenden Studie nicht
durchgeführt wurde (141).
5.3 Bakterielle Untersuchung
Ähnlich wie von Sheldon et al. (142) beschrieben, zeigten die Ergebnisse der Uterustupferproben aus der eigenen Studie, dass die Uteri aller Tiere bakteriologisch mit
unterschiedlichen aeroben und anaeroben Bakterien kontaminiert waren. Auffällig
war allerdings in der hier vorliegenden Studie der deutlich höhere Anteil von IGF-I
niedrigen Tieren, bei denen Clostridium perfringens nachgewiesen werden konnte.
Clostridium spp. wurden auch von Dohmen et al. (85) im Uterus nachgewiesen und
deren Vorkommen war positiv mit der Kontamination durch Escherichia coli korreliert.
Die Autoren (85) zeigten in ihrer Veröffentlichung den Zusammenhang zwischen
einer erhöhten Inzidenz von Nachgeburtsverhaltungen und der bakteriellen
Belastung, unter anderem mit Clostridien. In der vorliegenden Arbeit waren allerdings
bei den Tieren mit einer Nachgeburtsverhaltung nur die drei IGF-I niedrigen Tiere,
nicht aber die beiden IGF-I hohen Tiere von einer Kontamination durch Clostridien
betroffen. Dazu waren aber auch bei drei weiteren IGF-I niedrigen Tieren, die keine
Nachgeburtsverhaltung zeigten, in den Uterustupferproben Clostridien nachweisbar.
78
Weiterhin war auffällig, dass obligat anaerobe Keime nur in der IGF-I niedrigen
Gruppe vorhanden waren. Möglicherweise wirkt sich IGF-I vor der Geburt auf das
Uterusmilieu aus und die Höhe des IGF-I-Wertes zeigt ein bestimmtes Uterusmilieu
als Indikator an. Das IGF-I stimuliert das Wachstum von vaskulären glatten Muskelzellen und bedingt gleichzeitig eine erhöhte Bereitstellung von reaktiven Sauerstoffspezies (143). Dies könnte bei den IGF-I hohen Tieren für eine verbesserte Diffusion
des Uterusgewebes sorgen und dadurch einen höheren Sauerstoffpartialdruck
bedingen, der der Besiedelung mit anaeroben Keimen entgegenwirken könnte. Die
vermehrte Besiedelung der IGF-I niedrigen Tiere mit Clostridien würde auch für eine
quantitativ höhere Belastung mit Escherichia coli und LPS sprechen (85). In der
vorliegenden Arbeit fehlt die quantitative Bestimmung der Bakterien und der LPSKonzentration, sowohl direkt als auch über einen längeren Zeitraum post partum. Es
könnte eine erhöhte Belastung des Uterus mit Escherichia coli und LPS bei den IGF-I
niedrigen Tieren in den ersten Stunden post partum vorgelegen haben. Die höheren
LPS-Konzentrationen im Uterus bedingen nach den Untersuchungen von Dohmen et
al. (85) vermehrt Endometritiden. Dazu zeigten Sheldon et al. (142), dass eine
höhere bakterielle Belastung sich negativ auf die Follikelentwicklung auswirkt und
dadurch auch auf die Fertilität. Allerdings zeigten Sheldon et al. (142) auch, dass das
bakterielle Milieu im postpartalen Zeitraum individuell unterschiedlich zeitlich
bedingten Veränderungen unterliegt.
Die eigenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass IGF-I niedrige Tiere eher an uterinen Infektionen erkranken. Um dies abzuklären sind aber weitere Untersuchungen
erforderlich, die idealerweise an einer größeren Tiergruppe untersucht werden
sollten.
5.4 LPS-Versuch
Die zugrundeliegende Hypothese des LPS-Versuches bestand darin, dass sich
Tiere, die sich zwischen den Tagen 240 bis 254 p. insem. in der IGF-I-Konzentration
unterscheiden, auch unterschiedlich auf einen Entzündungsreiz reagieren.
Elsasser et al. (9) stellten bei Rindern, die GH injiziert bekamen, fest, dass sowohl
TNF-α als auch Cortisol nach einem mit LPS induzierten Entzündungsreiz geringer
waren. Dieses deutet darauf hin, dass die Somatotrope Achse das Entzündungsgeschehen bereits in einer frühen Phase der Immunantwort beeinflussen könnte (6).
79
Allerdings war bisher nicht bekannt, ob dieses auch für eine hormonelle Antwort auf
einen inflammatorischen Reiz um den Zeitpunkt der Geburt gilt, da es zu diesem
Zeitpunkt zu steigenden GH-Konzentrationen kommt (71). Dazu wurden in der
vorliegenden Arbeit die Tiere der IGF-I hohen und IGF-I niedrigen Gruppen während
des LPS-Versuches hinsichtlich der Änderungen endokriner Parameter miteinander
verglichen.
Für den Versuch wurde eine „Kontrollgruppe“ aus den Tieren gebildet, die aus der
LPS-Gruppe aufgrund von Krankheiten und erschwerten Geburten ausgeschlossen
wurden. In dieser Gruppe wurde den Tieren 12 Stunden nach der Geburt intrauterin
physiologische NaCl-Lösung infundiert. Zu dem Zeitpunkt war die Diagnose einer
Nachgeburtsverhaltung gestellt und die betroffenen Tiere aus dem LPS-Versuch
genommen worden. Dies geschah vor allem aus der Überlegung heraus, dass zu
diesem
Zeitpunkt
eine
wahrscheinliche
bakterielle
Besiedelung
und
damit
einhergehende LPS-Kontamination, am größten waren und dieser Einfluss gezielt mit
der LPS-Infusion verglichen werden sollte. Der unterschiedliche Gesundheitsstatus
ist bei dieser „Kontrollgruppe“ ein großer Nachteil und wurde bei der Auswertung der
einzelnen Hormone kritisch begutachtet, um Fehlinterpretationen zu vermeiden.
Vor allem der LPS-Einfluss auf endokrine Parameter sollte gegen eine Gruppe von
Tieren berechnet werden, die keine intrauterine Infusion mit LPS bekamen. Es ist
allerdings davon auszugehen, dass bei allen Tieren bereits LPS durch eine Besiedelung mit Bakterien im Uterus vorhanden war. Dazu kommt, dass in der Studie von
Dohmen et al. (85) besonders Kühe mit Nachgeburtsverhaltungen eine höhere Belastung mit LPS aufwiesen, so dass die höchste Kontamination in der „Kontrollgruppe“
zu vermuten war.
Sowohl die Hormonkonzentrationen als auch die vitalen Funktionen zwischen der
NaCl-Gruppe und den beiden IGF-I-Gruppen (IGF-I hoch und IGF-I niedrig) war zum
Zeitpunkt 0 Minuten vergleichbar. Folglich sind die nachfolgenden Ergebnisse der
LPS-Gruppe mit denen der NaCl-Gruppe als „Kontrolle“ verglichen worden.
Die NaCl-Gruppe setzte sich aus IGF-I hohen und IGF-I niedrigen Tieren zum Zeitpunkt der Auswahl (Tag 240 bis 254 p. insem.) zusammen. Dieses hat zur Folge,
dass eine Vergleichbarkeit zwischen den einzelnen IGF-I-Gruppen (IGF-I hoch bzw.
IGF-I niedrig) und der NaCl-Gruppe nur bedingt gegeben ist und in den Auswertungen auch berücksichtigt wurde.
80
5.4.1 Somatotrope Achse
In dieser Arbeit waren zwischen den Tiergruppen trotz der vorherigen Einteilung
nach dem Parameter IGF-I keine Unterschiede in den IGF-I- und GH-Konzentrationen während des LPS-Versuches nachweisbar.
Whitlock et al. (92) stellten fest, dass beim Schaf die IGF-I-Konzentrationen durch
eine intravenöse Gabe von LPS absinken. Dabei scheint der Mechanismus in einer
Resistenz des GHR begründet zu liegen, da auch eine GH-Gabe keinen IGF-IKonzentrationsanstieg bewirkte. Der genaue Mechanismus wird von Whitlock et al.
(92) in der verminderten Phosphorylierung des intrazellulären Signalproteins JAK-2
durch eine stärkere Nitrifizierung der JAK-2 angenommen. Damit ist der Signalweg in
der Zelle weniger effektiv und bewirkt eine geringere Transkription der IGF-I mRNA.
Weiterhin lässt LPS die Pulsatilität von GH bei Schafen ansteigen (92). Whitlock et
al. (92) nehmen diese Mechanismen auch für andere Wiederkäuer an. Die Autoren
gehen aufgrund ähnlicher Studien an Ratten, die vergleichend zu den Rindern mit
einer verminderten GH-Ausschüttung nach einer LPS-Applikation reagierten, davon
aus, dass die Hemmung der GH-Sekretion bei Rindern auch eher indirekt durch
Zytokine, als direkt durch LPS beeinflusst wird. In diesem Zusammenhang werden
aber neben Zytokinen wie TNF-α auch Steroidhormone wie Cortisol diskutiert, die die
Ausschüttung von GH sowohl direkt als auch durch die erhöhte Sekretion von GHIH
hemmen könnten (92).
In der vorliegenden Arbeit mag ein Grund dafür, dass weder Änderungen in der
IGF-I- noch der GH-Konzentration gefunden worden sind, der kurze Untersuchungszeitraum von drei Stunden nach der LPS-Infusion sein. In anderen Arbeiten traten
nach einer intravenösen Verabreichung Unterschiede beim GH erst nach 4 Stunden
deutlich hervor (92). Ursächlich hierfür könnte sein, dass die Bildung von GH von
GHRH und GHIH abhängig ist und IGF-I wiederum von GH (45). Die Synthese und
Freisetzung dieser Hormonkaskade scheint länger als drei Stunden in Anspruch
nehmen.
Eine Besonderheit von Milchkühen ist, dass es um den Geburtszeitpunkt bereits zu
einer GH-Resistenz kommt, was vor allem durch das Absinken der GHR 1A mRNA in
der Leber hervorgerufen wird (55). Diese GH-Resistenz ist auch in der vorliegenden
Arbeit indirekt durch steigende GH-Konzentrationen und sinkende IGF-I-Konzentrationen vor der Geburt zu sehen. Dadurch scheint es möglich, dass das Absinken der
IGF-I-Konzentrationen nicht weiter stattfinden kann, da der Mechanismus der GH81
Resistenz schon ausgeschöpft ist und durch LPS nicht weiter verstärkt wird. Um eine
Aussage über die GH-Resistenz in der Leber treffen zu können, wäre die
Untersuchung der mRNA des GHR1A und der gesamten GHR mRNA während des
Versuches und darüber hinaus von Interesse. Solche Studien wurden nicht
durchgeführt.
5.4.2 Schilddrüsenhormone
Bei Erkrankungen kommt es zu einer Entkopplung der Schilddrüsenachse mit erniedrigten Thyroxin- und Trijodthyroninkonzentrationen ohne einen Anstieg der TSHWerte (106). Darüber hinaus ist bei Mensch und Pferd sogar eine diagnostische Einschätzung von Erkrankungen anhand der Schwere des NTIS möglich. Je niedriger
die T4-Konzentrationen sind, desto schlechter ist die Prognose (144, 145).
Beim Rind wurde ein Absinken der Schilddrüsenhormone nach intravenöser LPSApplikation bereits von Kahl et al. (146) und Waggoner et al. (147) beobachtet. Dagegen konnten Husier et al. (148) keine Änderungen der Schilddrüsenhormone nach
LPS-Applikation bei der Milchkuh feststellen.
Die Hypothese in der vorliegenden Arbeit war, dass es zu einer Senkung der T 4Konzentrationen in beiden IGF-I-Gruppen nach intrauteriner Applikation von LPS
kommt. Ein Abfall der T4-Konzentration konnte interessanterweise aber nur in der
IGF-I niedrigen Gruppe bestätigt werden. In der IGF-I hohen Gruppe dagegen stiegen die T4-Konzentrationen entgegen den ursprünglichen Erwartungen sogar an.
Das Absinken der T4-Werte in der IGF-I niedrigen Gruppe gegenüber der IGF-I hohen Gruppe könnte für die Entwicklung eines NTIS sprechen. Je stärker ein NTIS
ausgeprägt ist, desto niedriger sind die T4-Konzentrationen, bei gleichbleibenden
TSH-Werten. Zur genaueren Beurteilungen des Schilddrüsenstoffwechsels wäre
dementsprechend die zusätzliche Messung von TSH notwendig, was in der vorliegenden Arbeit aber nicht Gegenstand der Untersuchung war (106). Die Bedeutung
des NTIS ist noch nicht vollständig geklärt (26). Eine These besagt, dass es sich um
einen protektiven Mechanismus handelt, der einen verringerten Verbrauch von
Energiereserven durch einen verringerten Grundumsatz bedingt (106). Eine andere
These ist, dass es sich um eine Fehladaption durch eine zu hohe Verstoffwechselung der Schilddrüsenhormone in der Peripherie kommt (106). Beide Thesen
nehmen Bezug auf den Metabolismus. Somit kann geschlussfolgert werden, dass die
82
Entwicklung der Schilddrüsenhormonkonzentrationen in der vorliegenden Arbeit bei
den beiden IGF-I-Gruppen auf eine unterschiedliche Adaptation des Metabolismus
auf den Entzündungsreiz zurückzuführen ist. Die IGF-I niedrige Gruppe reagiert mit
einer Reduzierung des Grundumsatzes, wohingegen die IGF-I hohe Gruppe den
Grundumsatz erhöht (106). Ergänzend kam es in der IGF-I hohen Gruppe zu einem
signifikanten Anstieg der Körpertemperatur, wohingegen die IGF-I niedrige Gruppe
nur einen tendenziellen Anstieg zeigte, was durch eine höhere Aktivität der
Körperzellen bedingt sein könnte (149).
Durch einen NTIS ist bei Mensch und Pferd eine prognostische Einschätzung einer
Krankheit möglich (144, 145). Je stärker der NTIS ausgeprägt ist, desto schlechter ist
die Prognose. Übertragen auf diese Studie würde die Prognose für die IGF-I niedrige
Gruppe schlechter zu stellen sein.
Für die Klärung dieser Hypothese sind aber weitere Studien erforderlich. Die
Hypothese wird aber auch dadurch gestützt, dass Tiere mit niedrigen IGF-IKonzentrationen eher zu postpartalen Krankheiten neigen (10).
5.4.3 Reproduktionshormone
Die Auswirkungen einer intravenösen bzw. intrauterinen LPS-Applikation auf die Progesteron- und PGFM-Konzentrationen sind bereits von Gilbert et al. (150) bei
zyklischen Kühen beschrieben worden. Gilbert und Kollegen wählten Probenabstände von vier Stunden nach einer LPS-Infusion und zeigten einen Anstieg der
P4-Konzentrationen nach intravenöser Gabe von LPS, allerdings keinen P 4-Anstieg
bei der intrauterinen LPS-Gabe. Diesen Unterschied führen Richards et al. (151) auf
die vermehrten Aktivität der Nebenniere nach intravenöser Gabe von LPS zurück, da
die Nebenniere neben Cortisol auch P4 produzieren kann. Die Ergebnisse dieser
Arbeit zeigen, dass sich die P4-Konzentrationen nicht zwischen den IGF-I-Gruppen
unterscheiden. Mit Blick auf die erhöhten Cortisolkonzentrationen der IGF-I niedrigen
Tiere, wäre bei diesen Tieren eine erhöhte P4-Konzentration denkbar gewesen, diese
Vermutung ließ sich allerdings nicht bestätigen. Weiterhin kann die vermehrte
Bildung von P4 in der Nebenniere durch den noch stattfindenden Abbau der P4Konzentrationen aus der Trächtigkeit überlagert worden sein, denn es ist auch
denkbar, dass das P4 aus der Nebenniere in der Leber schnell abgebaut wurde (27).
83
Unter Einfluss von LPS kommt es zu einer verminderten Produktion von Östrogenen
durch Granulosazellen (152). Auf der anderen Seite bewirkt nach einer Studie von
Kahl et al. (153) eine Behandlung mit Östrogenen eine erhöhte Blutkonzentration von
TNF-α nach einem Entzündungsreiz mit LPS. In der vorliegenden Arbeit waren weder Unterschiede hinsichtlich der E2-Konzentrationen zwischen den IGF-I-Gruppen
erkennbar, noch ließ sich durch die LPS-Gabe ein Abfall der E2-Konzentrationen
nachweisen. Die Beeinflussung von Granulosazellen scheint so kurz post partum
eher von untergeordneter Rolle zu sein, da der Sexualzyklus noch nicht wieder
begonnen hat (27, 154). Somit sind die Ergebnisse aus Studien an zyklischen Tieren
nicht mit den hier so kurz nach der Geburt gewonnenen Daten zu vergleichen. Der
Einfluss von E2 auf die Entzündung ist in dieser Studie durch fehlende Entzündungsparameter, wie TNF-α und Interleukine nicht detailliert zu verfolgen. Durch die
vergleichbaren E2-Konzentrationen beider IGF-I-Gruppen liegt die Vermutung nahe,
dass mögliche Auswirkungen von E2 auf die Zytokinausschüttung und die Entzündungsreaktion in beiden Gruppen ähnlich waren.
Die PGFM-Konzentrationen waren bei den Rindern aus der Studie von Gilbert et al.
(150) vier Stunden nach einer intravenösen Gabe von LPS erhöht, nach der
intrauterinen Applikation blieb sie jedoch unverändert. In der vorliegenden Arbeit war
ein Anstieg der PGFM-Konzentrationen in den beiden LPS-Gruppen nach 60
Minuten feststellbar. Bereits nach 120 Minuten wurden jedoch wieder die
Ausgangswerte erreicht. Gilbert et al. (150) gingen davon aus, dass eine uterine
LPS-Applikation keinen Einfluss auf die PGFM-Konzentrationen hat. Im Gegensatz
dazu zeigen aber die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass die PGFMKonzentrationen auch nach einer uterinen LPS-Infusion kurzfristig ansteigen. Eine
Ursache hinsichtlich dieser unterschiedlichen Ergebnisse könnte sein, dass bei
Gilbert et al. (150) einerseits zyklische Tiere untersucht wurden, die gänzlich andere
Entzündungsantworten zeigen und anderseits die Zeitpunkte der Blutprobengewinnungen mit vier Stunden viel weiter auseinander lagen als in der vorliegenden
Studie. Die Vermutung, dass eine vermehrte Manipulation des Uterus zu einem
Konzentrationsanstieg von PGFM geführt haben könnte, wird durch die NaCl-Gruppe
entkräftet, in der ein Anstieg nach 60 Minuten ausblieb.
84
5.4.4 Cortisol und ACTH
Der Zusammenhang zwischen der Somatotropen Achse und Cortisol ist im Kapitel
5.2.3 bereits beschrieben worden. Bei einer Entzündung wird beim Menschen durch
die inflammatorischen Zytokine, wie beispielsweise TNF-α und IL 1β, die HSD1
vermehrt synthetisiert. Dieses Enzym bewirkt eine vermehrte Synthese von Cortisol
aus Cortison. Hierdurch wird einer überschießenden bzw. lang anhaltenden Entzündungsreaktion mit der Bildung von Cortisol endogen entgegengewirkt (155). Beim
Rind führt eine durch LPS hervorgerufene Entzündung ebenfalls zur Bildung von
TNF-α, ACTH und Cortisol (9, 156). Bei einer experimentellen Entzündung mit LPS
führt eine Behandlung mit GH bei Rindern zu verringerten TNF-α- und Cortisolkonzentrationen im Plasma (9). Ob es sich dabei um denselben Mechanismus wie
beim Menschen handelt, ist anzunehmen, da auch Rinder HSD1 und HSD2 synthetisieren (157).
In der vorliegenden Arbeit war bei den IGF-I niedrigen Tieren eine höhere Cortisolkonzentration nach dem Entzündungsreiz durch LPS gegenüber den IGF-I hohen
Tieren zu beobachten. Ob dieses Phänomen auch mit erhöhten TNF-α-Konzentrationen bei der IGF-I niedrigen Gruppe, vergleichbar der Studie von Elsasser et al.
(9) einhergeht, wurde in dieser Arbeit nicht untersucht.
Ein Anstieg der ACTH-Konzentration im Gegensatz zur NaCl-Gruppe war in beiden
IGF-I-Gruppen zu beobachten und scheint mit der uterinen LPS-Infusion zusammen
zuhängen. Dieser Zusammenhang ist vermutlich vergleichbar mit einem ACTH-Anstieg bei intravenöser LPS-Gabe, der in der Literatur beim Rind beschrieben ist
(156).
Die Cortisolkonzentrationen stiegen in der IGF-I niedrigen Gruppe zwischen 30 und
150 Minuten nach der LPS-Infusion an. Ein solcher Anstieg war bei der IGF-I hohen
Gruppe nicht zu beobachten. Leider ist der Zeitpunkt 180 Minuten nach LPS-Gabe
für die Cortisolmessung nicht aussagekräftig, da aufgrund des Versuchsaufbaus die
Tiere vor der Probe 180 Minuten an einen anderen Ort gebracht wurden und ein
stressinduzierter Cortisolanstieg hier nicht auszuschließen war (158).
Für die vermehrte Bildung von Cortisol bei den IGF-I niedrigen Tieren gibt es verschiedene Vermutungen, die mit der Somatotropen Achse zusammenhängen könnten:
85
Zum einen könnte die vermehrte Bildung von ACTH in der IGF-I niedrigen Gruppe
dazu geführt haben, dass Cortisol höher war. Allerdings waren in der vorliegenden
Arbeit keine erhöhten ACTH-Konzentrationen nachweisbar. Die Versuchsgruppe war
aber auch relativ klein und dies könnte die Ursache dafür sein, dass ein statistisch
nicht nachweisbarer ACTH-Unterschied zwischen den Gruppen zu unterschiedlichen
Cortisolunterschieden führte.
Weiterhin könnte sich die ACTH-Rezeptordichte an der Nebenniere zwischen den
Tiergruppen unterschieden haben. Denkbar wäre, dass die IGF-I niedrigen Tiere
mehr ACTH-Rezeptoren exprimieren und es somit zu einer vermehrten Freisetzung
von Cortisol durch ACTH kam, obwohl die peripheren ACTH-Konzentrationen
vergleichbar waren (159).
Auch könnte die vermehrte Bildung von HSD1 in der IGF-I niedrigen Gruppe durch
antepartal niedrigere IGF-I-Werte eine erhöhte Cortisolkonzentration bedingt bzw.
eine erhöhte HSD2 bei den IGF-I hohen Tieren eine höhere Inaktivierung des Cortisol bewirkt haben (155). Da aber weder die ACTH-Rezeptoren der Nebenniere noch
die beiden Enzyme HSD1 und HSD2 untersucht worden sind, lassen sich zu diesem
Unterschied nur Vermutungen anstellen.
Im Laufe einer Erkrankung nimmt Cortisol beispielsweise Einfluss auf die Lymphozyten; es kommt zu einer Verschiebung der zellulären T-Helferzellen Typ 1 (TH1)
vermittelten Antwort zu einer humoralen T-Helferzellen Typ 2 (TH2) Antwort (160).
Die T-Helferzellen sind an der lokale Immunantwort auch des Uterus zusammen mit
den Antigen präsentierenden Zellen und T- und B-Zellen beteiligt (161). Inwiefern die
Subpopulationen der T-Helferzellen sich zwischen den IGF-I-Gruppen unterscheiden
und dadurch die Entwicklung einer Metritis oder Endometritis beeinflusst wird, ließ
sich nicht abschließend klären. Dafür wären weitere Untersuchungen notwendig.
5.4.5 Lipopolysaccharide
In der vorliegenden Arbeit konnten keine Lipopolysaccharide im Blut der Versuchstiere nachgewiesen werden. Dohmen et al. (85) erhielten vergleichbare Ergebnisse
bei Versuchen mit Kühen, die eine hohe uterine Kontamination mit Bakterien
aufwiesen und damit auch nachweislich LPS im Uterus, aber nicht in der Blutbahn.
Dohmen et al. (85) gehen deshalb davon aus, dass LPS entweder nicht aus dem
86
Uterus aufgenommen wird oder durch IgG-Anti-LPS-Antikörper gebunden und/oder
durch weitere Mechanismen entfernt wird. Eine Entzündungsreaktion ohne die Anwesenheit von LPS in der Blutbahn kann durch die LPS bindenden Rezeptoren auf den
Endometriumszellen erklärt werden, die zu einer Ausschüttung von Zytokinen führen,
die ihrerseits wiederum die Entzündungsantwort endokrin über den Hypothalamus
und die Hypophyse zu beeinflussen vermögen (162).
5.5 Histologie
In der Hämatoxylin-Eosin-Färbung histologischer Schnitte vom Uterus, der Leber,
dem Muskelgewebe und dem Fettgewebe waren zwischen beiden IGF-I-Gruppen
keine qualitativen morphologischen Unterschiede erkennbar. Auffällig war aber im
Uterus, besonders im Endometrium, die hohe Zahl an Entzündungszellen. Um
welche Immunzellen es sich handelt ist nicht abschließend zu klären, da eine
Spezialfärbung nicht durchgeführt wurde. Aufgrund der Morphologie liegt aber die
Vermutung nahe, dass es sich um neutrophile Granulozyten handelt. Auch
hinsichtlich dieser Immunzellen waren in der Färbung keine Unterschiede zwischen
den IGF-I-Gruppen zu erkennen. Ob die vermehrte Zahl der Leukozyten auf das
infundierte LPS zurückzuführen ist oder im Allgemeinen mit der Geburt mit einer
bakteriellen Kontamination des Uterus in Zusammenhang steht, ist hier nicht zu
klären, da eine Kontrollgruppe für die Histologie fehlte. Allerdings ist zu vermuten,
dass die LPS-Infusion ursächlich für einen hohen Leukozytenanteil, vor allem im
Endometrium des Uterus, verantwortlich ist. LPS bedingt eine Zytokinausschüttung
im Uterus und es kommt somit zu einem Anlocken der Leukozyten (88, 162). Somit
ist ein massenhaftes Auftreten neutrophiler Granulozyten im Uterus nicht überraschend.
Sowohl Kawashima et al. (72) als auch die vorliegenden Arbeit zeigten, dass Tiere
mit niedrigem IGF-I-Konzentrationen einen erhöhten Blutgehalt an FFS haben. In der
Literatur wird eine erhöhte FFS-Konzentration auch mit einem erhöhten Lipidgehalt
der Leber korreliert (38, 163) und es kommt zu einer Speicherung des Fettes in
Vakuolen der Leber (164). Diese Beobachtungen waren Grund für die Hypothese,
dass IGF-I niedrigere Tiere deutlich mehr Lipid-Vakuolen in der Leber aufweisen
könnten, verglichen mit IGF-I hohen Tieren. Diese Hypothese konnte durch Auszählen der Vakuolen im histologischen Schnitt der Leber allerdings in der eigenen
87
Arbeit nicht bestätigt werden. Durch den unterschiedlichen Gehalt an FFS im Blut der
beiden IGF-I-Gruppen wäre eine objektive Auswertung des Gesamt Lipidgehalt der
Leber notwendig gewesen, um mögliche Unterschiede darstellen zu können.
Die Expression des Wachstumshormonrezeptors im Uterus decken sich mit den
Beschreibungen von Kölle et al. (165). Der GHR war immunhistologisch im
Endometrium in den uterinen Drüsen und in den Wänden der Arterien nachweisbar.
In der vorliegenden Arbeit sind allerdings vermehrt Immunzellen darstellbar gewesen, die GHR positiv gefärbt sind. Diese, wie bereits bei der HE-Färbung beschrieben, wahrscheinlichen neutrophilen Granulozyten befinden sich vornehmlich im
Endometrium. Dieser Umstand könnte mit der Chemotaxis ausgelöst durch LPS
zusammenhängen (88). Der GHR ist in verschieden Publikationen auf Immunzellen
nachgewiesen worden und auch um den Geburtszeitpunkt sind bei den Milchkühe
morphologisch die GHR auf den Immunzellen nachweisbar. Über deren Funktionstüchtigkeit kann an dieser Stelle keine Aussage getroffen werden. Der positive
Nachweis von GHR auf dem neutrophilen Granulozyten untermauert die von
Borghetti et al. (6) vermuteten engen Regulationsmechanismen zwischen der zum
Teil lokalen Hormonfreisetzung und den Immunzellen.
Im Zytoplasma der Hepatozyten der Leber war ebenfalls eine deutliche GHR-Färbung zu beobachten. Dies geht einher mit den Beobachtungen von Kobayashi et al.
(52), die zwar einen Rückgang des GHR zum Zeitpunkt der Geburt, aber kein
vollständiges Verschwinden in der Leber nachweisen konnten. Die immunhistochemische Darstellung des GHR in den Gallengänge ist in dieser Arbeit nicht
endgültig zu bewerten, da eine positive Färbung auch mit dem Kontrollserum erfolgte
und nicht weiter bearbeitet worden ist.
Der Rückgang der IGF-I-Konzentration wurde mit einer verminderten Expression des
GHR 1A in Zusammenhang gebracht (55). In der vorliegenden Arbeit wurde
allerdings nur der qualitative Nachweis des GHR erbracht. Dabei zeigten sich
zwischen den IGF-I-Gruppen keine Unterschiede. Dieses Ergebnis steht im Einklang
mit dem in der Literatur beschriebenen (55). Zum Zeitpunkt der Geburt unterschieden
sich die IGF-I-Werte nicht mehr zwischen den Tiergruppen und eine positive
Korrelation des GHR mit den IGF-I-Konzentrationen wurde gezeigt (55). Hierbei
konnte aber auch gezeigt werden, dass in der Verteilung des GHR in den
88
verschiedenen Arealen kein qualitativer Unterschied bestand. Es ist anhand des
vorliegenden immunhistologischen Nachweises keine Aussage über die Funktionsfähigkeit des GHRs zu machen, da mittlerweile Untersuchungen gezeigt haben, dass
der intrazelluläre Übertragungsweg verändert sein könnte und somit die Funktion der
GHR eingeschränkt ist, obwohl das Protein immunhistochemisch noch auf den
Hepatozyten nachweisbar ist (166).
Im Fettgewebe war keine Färbung des GHR erkennbar. Von Lucy et al. (54) ist der
GHR allerdings auf den Fettzellen nachgewiesen worden. Es lässt sich leider nicht
ausschließen, dass es in der eigenen Arbeit zu einem Auslösen der GHR aus den
Fettzellen während der Präparation kam.
5.6 Schlussfolgerungen
Mit einer einzelnen Bestimmung des Parameters IGF-I war eine Einteilung in zwei
Tiergruppen möglich, die sich auch noch bis kurz vor die Geburt in ihren IGF-IKonzentrationen unterschieden. Dabei blieben die GH-Konzentrationen entgegen der
anfänglichen Hypothese aber vergleichbar. Zusätzlich zeigten das metabolisch aktive
Hormon T4 und der metabolische Parameter FFS an, dass die IGF-I niedrige Gruppe
offenbar einer höheren metabolischen Belastung unterlag als die IGF-I hohe Gruppe.
Diese Entwicklung könnte sich bereits zum Zeitpunkt der Geburt auf das Uterusmilieu ausgewirkt haben, dass mit einer stärkeren Besiedelung durch anaerobe
Bakterienarten in der IGF-I niedrigen Gruppe korrelierte.
Die Entwicklung während der Frühphase einer postpartal induzierten uterinen
Entzündung zeigte, dass die beiden Tiergruppen unterschiedliche hormonelle
Änderungen aufwiesen. Hierbei fielen vor allem die metabolisch aktiven T 4-Konzentrationen und die Cortisolkonzentrationen auf, die sich zwischen den beiden IGF-IGruppen unterschiedlich entwickelten. Die unterschiedlichen endokrinen Gegebenheiten lassen Aufgrund der Auswirkungen auf Immunzellen eine unterschiedliche
Wirkung auf Erreger vermuten. Eine Bewertung des IGF-I-Wertes vor der Geburt
könnte somit helfen, immunologisch gefährdetere Tiere bereits im Vorfeld zu erkennen und gegebenenfalls bei Krankheitserscheinungen zu intervenieren. Im Vorhandensein des GHR in den verschiedenen Geweben konnte mit den hier verwendeten
Methoden entgegen der Hypothese keine Unterschiede festgestellt werden.
89
6 Zusammenfassung
Lars Holzhausen
„Einfluss des Insulin-like Growth Factor Systems
auf die endokrinologische Antwort nach einer
experimentell induzierten Inflammation des Uterus“
Milchkühe mit einer niedrigen Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor I (IGF-I)Konzentration vier bis sechs Wochen vor der Geburt zeigen eine höhere Krankheitsinzidenz als Tiere mit hohen IGF-I-Werten. Die Wachstumshormon (GH)-IGF-I-Achse
interagiert mit dem Immunsystem und anderen endokrinen Achsen.
In der vorliegenden Arbeit wurde geprüft, welchen Einfluss unterschiedliche IGF-IKonzentrationen bei Rindern zwischen dem 240. bis 254. Tag post inseminationem
(p. insem.) auf die endokrinologische Entwicklung während der Spätträchtigkeit
haben. Desweiteren sollte nach der Geburt die endokrinologische Reaktion auf einen
Entzündungsreiz im Uterus untersucht werden.
Für die Untersuchung wurde zunächst gesunden pluriparen Holstein Friesian Kühen
zwischen dem 240. bis 254. Tag p. insem. jeweils eine Blutprobe entnommen, um
die periphere IGF-I-Konzentration zu bestimmen. Anhand der Blutwerte wurden daraufhin jeweils zehn Tiere mit hohen (>175 ng/ml) und zehn mit niedrigen
(<125 ng/ml) IGF-I-Konzentrationen ausgewählt und vor dem 266. Tag p. insem in
die Klinik für Rinder überführt. Ein IGF-I niedriges Tier wurde aufgrund hoher
Aggressivität aus dem Versuch ausgeschlossen, so dass letztlich mit Gruppen von
10 IGF-I hohen und 9 IGF-I niedrigen Tieren gearbeitet wurde. Allen Tieren wurde
vom 266. Tag p. insem. bis zur Spontangeburt täglich Blut entnommen.
Die Kühe, die bis zur Spontangeburt klinisch gesund waren und eine physiologische
Geburt sowie einen normalen Nachgeburtsabgang (< 12 Stunden; h) zeigten, wurden
im weiteren Verlauf der Studie für einen postpartalen Entzündungsversuch verwendet. Hierzu erfolgte eine intrauterine Infusion von 1000 ml Lipopolysaccharid
(LPS) Lösung (E. coli O55:B5, Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA,
Endkonzentration 5 µg/ml, IGF-I hoch n=6 und IGF-I niedrig n=6) 30 Minuten nach
Abgang der Nachgeburt.
90
Die Tiere, die den Kriterien nicht entsprachen, wurden als Kontrolltiere (n=7) genutzt,
d.h. an ihnen wurden die Änderungen endokriner Parameter ohne iatrogen induzierten Entzündungsreiz (12 h p.p.; 1000 ml physiologische Kochsalzlösung intrauterin) untersucht.
Bei allen Tieren wurde zehn Minuten vor der Infusion eine Tupferprobe aus dem
Uterus entnommen, die auf den mikrobiellen Keimgehalt hin untersucht wurde. Des
Weiteren wurden jeweils einmal vor und sechs Mal nach der Infusion im Abstand von
jeweils 30 Minuten Blutproben aus der Vena jugularis entnommen. Nach 180 Minuten wurden die LPS-Versuchstiere euthanasiert und Gewebeproben aus Uterus,
Leber, Muskulatur und Fettgewebe entnommen.
Anhand der Blutproben wurden die Konzentrationen von IGF-I, GH, Cortisol,
Prostaglandin F2α Metabolit, Trijodthyronin, Thyroxin (T4), Insulin, freien Fettsäuren
(FFS) und dem adrenocorticotropen Hormon bestimmt.
In den Gewebeproben wurde die Expression des Wachstumshormonrezeptors
immunhistologisch
ermittelt.
Eine
semiquantitative
Analyse
der
Rezeptor
Expressionsstärke wurde in Leberproben durchgeführt.
Bis zum 275. Tag p. insem. unterschied (P < 0,05) sich die IGF-I-Konzentrationen im
Blut der beiden Gruppen. Jedoch fiel zur Geburt hin die IGF-I-Konzentration in der
IGF-I hohen Gruppe stärker ab als in der IGF-I niedrigen Gruppe (P < 0,05). Die
Wachstumshormonkonzentrationen blieben hingegen bei beiden Gruppen vergleichbar (P > 0,05). Zudem wiesen die IGF-I niedrigen Tiere während des präpartalen
Zeitraums niedrigere T4-Konzentrationen, sowie höhere FFS- und Cortisolkonzentration als die IGF-I hohen Tiere auf (P < 0,05).
Zum Zeitpunkt des LPS-Versuches enthielten die Tupferproben der IGF-I niedrigen
Tiere signifikant häufiger Clostridien als diejenigen der Tiere mit hohen IGF-I-Konzentrationen. Die intrauterine Infusion von LPS führte bei den sechs Tieren der IGF-I
niedrigen Gruppe zu einem Abfall der T4-Konzentrationen. Im Gegensatz dazu kam
es bei den sechs IGF-I hohen Tieren zu einem Anstieg (P < 0,05). Des Weiteren
waren die Cortisolkonzentrationen der IGF-I niedrigen Tiere höher (P < 0,05) als die
der IGF-I hohen Tiere und nur bei den IGF-I niedrigen Tieren war zudem
150 Minuten post infusionem ein Anstieg der Cortisolkonzentrationen zu verzeichnen
(P < 0,05). Histologisch waren zwischen den beiden IGF-I-Gruppen keine Unterschiede zu erkennen. Der Wachstumshormonrezeptor war immunhistologisch in
91
allen untersuchten Geweben nachweisbar. Eine unterschiedliche Expressionsstärke
war nicht erkennbar.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen Unterschiede in der hormonellen Konstellation
und der Reaktion auf einen Entzündungsreiz im Uterus zwischen den IGF-I-Gruppen.
Dieses könnte mit einer erhöhten Krankheitsanfälligkeit der IGF-I niedrigen Tiere aus
anderen Publikationen korrelieren. Die endokrinen Unterschiede könnten sich unterschiedlich auf die Immunzellen auswirken.
92
7 Summary
Lars Holzhausen
“Influence of the Insulin-like Growth Factor system
on the endocrinological answer after an
experimentally induced inflammation of the uterus”
Dairy cattle with low Insulin-like Growth Factor I (IGF-I) concentrations four to six
weeks before parturition show a higher incidence of production diseases in comparison to animals with high IGF-I levels at this time. The Growth Hormone
(GH)-IGF-I axis interacts with the immune system and other endocrine axes.
This present work analysed the influence of different IGF-I concentrations of cattle
between the days 240 to 254 post inseminationem (p. insem.) on the endocrine
systems during late pregnancy. Furthermore, endocrine changes after an intrauterine
inflammatory insult after parturition were investigated.
Blood samples were taken from healthy pluriparous Holstein Friesian cows between
days 240 and 254 p. insem. to determine peripheral IGF-I concentrations. Ten
animals with high (>175 ng/ml) and ten with low (<125 ng/ml) IGF-I concentrations
were selected for further studies. The cows were transported to the Clinic for Cattle
before day 266 p. insem. One IGF-I low animal was excluded from the experiment
before day 266 due to severe aggressiveness. Blood samples were taken daily from
the remaining ten IGF-I high and nine IGF-I low animals until birth occurred spontaneously.
For a postpartal inflammatory challenge the following essential factors were defined:
clinical healthiness until birth, a physiological parturition, and an expulsion of the
placenta within 12 hours after birth. Thirty minutes after the release of the placenta
an intrauterine infusion was performed with 1000 ml Lipopolysaccharide (LPS)
solution (E. coli O55:B5, Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA, concentration 5
µg/ml, IGF-I high and IGF-I low cows each n = 6). Cows, which did not fulfill the
present criteria, were used as a control group (n = 7). Endocrine parameters were
examined without an iatrogenic inflammatory insult (12 h p.p.; 1000 ml physiological
sodium chloride solution intrauterine).
93
A swap sample was taken from every cow 10 minutes before the infusion and
examined for microbiological contamination. Furthermore, a blood sample from the
vena jugularis was withdrawn before and six times after the infusion in 30 minutes
intervals. After 180 minutes the LPS group was sacrificed and tissue samples were
taken from uterus, liver, muscle, and fat.
The parameters IGF-I, GH, Cortisol, Prostaglandin F2α metabolite, Trijodthyronin,
thyroxin (T4), Insulin, Non-Esterified Fatty Acids (NEFA), and Adrenocorticotropic
hormone were determined in blood. The tissue samples were examined for the
expression of the GH receptor. The liver was additionally semi-quantitatively
analyzed for the expression amount of the GH receptor.
Until day 275 p. insem. the IGF-I concentrations between the groups were different
(P < 0.05). The IGF-I concentration of the IGF-I high group showed a more distinct
decline compared to the IGF-I low group (P < 0.05). In contrast the GH concentrations remained constant in both groups of animals (P > 0.05). Furthermore, during
the time period before parturition the IGF-I low group showed lower T4 concentrations
as well as higher cortisol and higher NEFA concentrations than the IGF-I high group
(P < 0.05).
Immediately before the LPS infusion the swap samples of the IGF-I low animals
contained significantly more Clostridium species compared to the IGF-I high animals.
The intrauterine infusion of LPS led to a decline of T 4 in the six IGF-I low cows and to
rise of T4 in the six IGF-I high animals (P < 0.05). Cortisol concentrations of the IGF-I
low animals were higher (P < 0.05) compared to the IGF-I high group and after 150
minutes an increase (P < 0.05) could be noticed only in the IGF-I low group. There
were no histological differences (P ≥ 0.05) between the two IGF-I groups. The GH
receptor was detectable via immune histology in all examined tissues. A difference in
the expression amount of the liver was not seen.
The results of this work show differences in the endocrine constellation and the
reaction on an inflammatory insult in the uterus between the IGF-I groups. This might
correlate to a higher risk of production diseases in the IGF-I low group out of other
publications. This endocrine differences could influence immune cells differently.
94
8 Literatur
1.
Mulligan FJ, Doherty ML. Production diseases of the transition cow. Vet J.
2008 Apr;176(1):3-9.
2.
Ingvartsen KL, Dewhurst RJ, Friggens NC. On the relationship between
lactational performance and health: is it yield or metabolic imbalance that cause
production diseases in dairy cattle? A position paper. Livestock Production Science.
2003 Oct;83(2-3):277-308.
3.
Sheldon IM, Dobson H. Postpartum uterine health in cattle. Anim Reprod Sci.
2004 Jul;82-83:295-306.
4.
Sheldon IM, Williams EJ, Miller AN, Nash DM, Herath S. Uterine diseases in
cattle after parturition. Vet J. 2008 Apr;176(1):115-21.
5.
Sheldon IM, Cronin J, Goetze L, Donofrio G, Schuberth HJ. Defining
postpartum uterine disease and the mechanisms of infection and immunity in the
female reproductive tract in cattle. Biol Reprod. 2009 Dec;81(6):1025-32.
6.
Borghetti P, Saleri R, Mocchegiani E, Corradi A, Martelli P. Infection, immunity
and the neuroendocrine response. Vet Immunol Immunopathol. 2009 Aug 15;130(34):141-62.
7.
Radcliff RP, McCormack BL, Crooker BA, Lucy MC. Plasma hormones and
expression of growth hormone receptor and insulin-like growth factor-I mRNA in
hepatic tissue of periparturient dairy cows. J Dairy Sci. 2003 Dec;86(12):3920-6.
8.
Heemskerk VH, Daemen MA, Buurman WA. Insulin-like growth factor-1 (IGF-
1) and growth hormone (GH) in immunity and inflammation. Cytokine Growth Factor
Rev. 1999 Mar;10(1):5-14.
9.
Elsasser TH, Fayer R, Rumsey TS, Hartnell GF. Recombinant bovine
somatotropin blunts plasma tumor necrosis factor-alpha, cortisol, and thromboxaneB2 responses to endotoxin in vivo. Endocrinology. 1994 Mar;134(3):1082-8.
10.
al.
Piechotta M, Sander AK, Kastelic JP, Wilde R, Heppelmann M, Rudolphi B, et
Short
communication:
Prepartum
plasma
insulin-like
growth
factor-I
concentrations based on day of insemination are lower in cows developing
postpartum diseases. Journal of Dairy Science. 2012;95(3):1-4.
11.
Grummer RR. Impact of changes in organic nutrient metabolism on feeding
the transition dairy cow. J Anim Sci. 1995 Sep;73(9):2820-33.
95
12.
Drackley JK. ADSA Foundation Scholar Award. Biology of dairy cows during
the transition period: the final frontier? J Dairy Sci. 1999 Nov;82(11):2259-73.
13.
Jouany JP. Optimizing rumen functions in the close-up transition period and
early lactation to drive dry matter intake and energy balance in cows. Anim Reprod
Sci. 2006 Dec;96(3-4):250-64.
14.
Grant RJ, Albright JL. Feeding behavior and management factors during the
transition period in dairy cattle. J Anim Sci. 1995 Sep;73(9):2791-803.
15.
LeBlanc S. Monitoring metabolic health of dairy cattle in the transition period. J
Reprod Dev. 2010 Jan;56 Suppl:S29-35.
16.
Bertics SJ, Grummer RR, Cadorniga-Valino C, Stoddard EE. Effect of
prepartum dry matter intake on liver triglyceride concentration and early lactation. J
Dairy Sci. 1992 Jul;75(7):1914-22.
17.
Moe PW, Tyrrell HF. Metabolizable energy requirements of pregnant dairy
cows. J Dairy Sci. 1972 Apr;55(4):480-3.
18.
Bell AW. Regulation of organic nutrient metabolism during transition from late
pregnancy to early lactation. J Anim Sci. 1995 Sep;73(9):2804-19.
19.
Bauman DE, Currie WB. Partitioning of nutrients during pregnancy and
lactation: a review of mechanisms involving homeostasis and homeorhesis. J Dairy
Sci. 1980 Sep;63(9):1514-29.
20.
Chilliard Y, Sauvant D, Hervieu J, Dorleans M, Morandfehr P. Lipoprotein-
Lipase Activity and Composition of Omental Adipose-Tissue as Related to LipidMetabolism of Goat in Late Pregnancy and Early Lactation. Annales De Biologie
Animale Biochimie Biophysique. 1977;17(6):1021-33.
21.
Vernon RG. Lipid metabolism during lactation: a review of adipose tissue-liver
interactions and the development of fatty liver. J Dairy Res. 2005 Nov;72(4):460-9.
22.
Bell AW, Burhans WS, Overton TR. Protein nutrition in late pregnancy,
maternal protein reserves and lactation performance in dairy cows. Proc Nutr Soc.
2000 Feb;59(1):119-26.
23.
Lucy MC, Jiang H, Kobayashi Y. Changes in the Somatotrophic Axis
Associated with the Initiation of Lactation. J Dairy Sci. 2001 29.8.2000;84(E.
Suppl.):E113 - E9.
24.
von Engelhardt W, Breves G. Physiologie der Haustiere. 2 ed. Stuttgart: Enke;
2005.
96
25.
Pezzi C, Accorsi PA, Vigo D, Govoni N, Gaiani R. 5'-deiodinase activity and
circulating thyronines in lactating cows. J Dairy Sci. 2003 Jan;86(1):152-8.
26.
Aceves C, Ruiz A, Romero C, Valverde C. Homeorhesis during early lactation.
Euthyroid sick-like syndrome in lactating cows. Acta Endocrinol (Copenh). 1985
Dec;110(4):505-9.
27.
Kindahl H, Kornmatitsuk B, Gustafsson H. The cow in endocrine focus before
and after calving. Reprod Domest Anim. 2004 Aug;39(4):217-21.
28.
Eissa HM, el-Belely MS. Sequential changes in plasma progesterone, total
oestrogens and corticosteroids in the cow throughout pregnancy and around
parturition. Br Vet J. 1990 Jan-Feb;146(1):24-9.
29.
Patel OV, Takahashi T, Takenouchi N, Hirako M, Sasaki N, Domeki I.
Peripheral cortisol levels throughout gestation in the cow: effect of stage of gestation
and foetal number. Br Vet J. 1996 Jul;152(4):425-32.
30.
Chew BP, Erb RE, Fessler JF, Callahan CJ, Malven PV. Effects of
ovariectomy
during
pregnancy
and
of
prematurely
induced
parturition
on
progesterone, estrogens, and calving traits. J Dairy Sci. 1979 Apr;62(4):557-66.
31.
Hoffmann B, Schuler G. The bovine placenta; a source and target of steroid
hormones: observations during the second half of gestation. Domest Anim
Endocrinol. 2002 Jul;23(1-2):309-20.
32.
Stabenfeldt GH, Osburn BI, Ewing LL. Peripheral plasma progesterone levels
in the cow during pregnancy and parturition. Am J Physiol. 1970 Feb;218(2):571-5.
33.
Konigsson K, Kask K, Gustafsson H, Kindahl H, Parvizi N. 15-ketodihydro-
PGF2 alpha, progesterone and cortisol profiles in heifers after induction of parturition
by injection of dexamethasone. Acta Vet Scand. 2001;42(1):151-9.
34.
Flint APF, Ricketts AP, Craig VA. Control of Placental Steroid-Synthesis at
Parturition in Domestic-Animals. Animal Reproduction Science. 1979;2(1-3):239-51.
35.
Edqvist LE, Kindahl H, Stabenfeldt G. Release of prostaglandin F 2alpha
during the bovine peripartal period. Prostaglandins. 1978 Jul;16(1):111-9.
36.
Robinson R, Anastassiadis PA, Common RH. Estrone concentrations in the
peripheral blood of pregnant cows. II. Values around parturition. J Dairy Sci. 1971
Dec;54(12):1832-9.
37.
Sheldon IM, Noakes DE, Dobson H. Effect of the regressing corpus luteum of
pregnancy on ovarian folliculogenesis after parturition in cattle. Biol Reprod. 2002
Feb;66(2):266-71.
97
38.
Hammon HM, Sturmer G, Schneider F, Tuchscherer A, Blum H, Engelhard T,
et al. Performance and metabolic and endocrine changes with emphasis on glucose
metabolism in high-yielding dairy cows with high and low fat content in liver after
calving. J Dairy Sci. 2009 Apr;92(4):1554-66.
39.
Rhoads RP, Kim JW, Leury BJ, Baumgard LH, Segoale N, Frank SJ, et al.
Insulin increases the abundance of the growth hormone receptor in liver and adipose
tissue of periparturient dairy cows. J Nutr. 2004 May;134(5):1020-7.
40.
Meikle A, Kulcsar M, Chilliard Y, Febel H, Delavaud C, Cavestany D, et al.
Effects of parity and body condition at parturition on endocrine and reproductive
parameters of the cow. Reproduction. 2004 Jun;127(6):727-37.
41.
Bonczek RR, W. YC, Wheaton JE, Miller KP. Responses of Somatotropin,
Insulin, Prolactin, and Thyroxine to Selectionfo Milk Yield in Holsteins. J Dairy Sci.
1988;71:2470 - 9.
42.
Evans HM, Long JA. The effect of the anterior lobe of the hypophysis
administered intraperitoneally upon growth and maturity and estrous cycles of the rat.
Anat Record. 1921;21:62 - 3.
43.
Salmon WD, Jr., Daughaday WH. A hormonally controlled serum factor which
stimulates sulfate incorporation by cartilage in vitro. J Lab Clin Med. 1957
Jun;49(6):825-36.
44.
Rinderknecht E, Humbel RE. The amino acid sequence of human insulin-like
growth factor I and its structural homology with proinsulin. J Biol Chem. 1978 Apr
25;253(8):2769-76.
45.
Frago LM, Chowen JA. Basic physiology of the growth hormone/insulin-like
growth factor axis. Adv Exp Med Biol. 2005;567:1-25.
46.
Jansson JO, Eden S, Isaksson O. Sexual dimorphism in the control of growth
hormone secretion. Endocr Rev. 1985 Spring;6(2):128-50.
47.
Zeitler P, Vician L, Chowen-Breed JA, Argente J, Tannenbaum GS, Clifton
DK, et al. Regulation of somatostatin and growth hormone-releasing hormone gene
expression in the rat brain. Metabolism. 1990 Sep;39(9 Suppl 2):46-9.
48.
Butler ST, Marr AL, Pelton SH, Radcliff RP, Lucy MC, Butler WR. Insulin
restores GH responsiveness during lactation-induced negative energy balance in
dairy cattle: effects on expression of IGF-I and GH receptor 1A. J Endocrinol. 2003
Feb;176(2):205-17.
98
49.
Renaville R, Hammadi M, Portetelle D. Role of the somatotropic axis in the
mammalian metabolism. Domest Anim Endocrinol. 2002 Jul;23(1-2):351-60.
50.
Lucy MC. Functional differences in the growth hormone and insulin-like growth
factor axis in cattle and pigs: implications for post-partum nutrition and reproduction.
Reprod Domest Anim. 2008 Jul;43 Suppl 2:31-9.
51.
Berryman DE, List EO, Sackmann-Sala L, Lubbers E, Munn R, Kopchick JJ.
Growth hormone and adipose tissue: beyond the adipocyte. Growth Horm IGF Res.
2011 Jun;21(3):113-23.
52.
Kobayashi Y, Boyd CK, Bracken CJ, Lamberson WR, Keisler DH, Lucy MC.
Reduced growth hormone receptor (GHR) messenger ribonucleic acid in liver of
periparturient cattle is caused by a specific down-regulation of GHR 1A that is
associated with decreased insulin-like growth factor I. Endocrinology. 1999
Sep;140(9):3947-54.
53.
Ballesteros M, Leung KC, Ross RJ, Iismaa TP, Ho KK. Distribution and
abundance of messenger ribonucleic acid for growth hormone receptor isoforms in
human tissues. J Clin Endocrinol Metab. 2000 Aug;85(8):2865-71.
54.
Lucy MC, Boyd CK, Koenigsfeld AT, Okamura CS. Expression of somatotropin
receptor messenger ribonucleic acid in bovine tissues. J Dairy Sci. 1998
Jul;81(7):1889-95.
55.
Radcliff RP, McCormack BL, Crooker BA, Lucy MC. Growth hormone (GH)
binding and expression of GH receptor 1A mRNA in hepatic tissue of periparturient
dairy cows. J Dairy Sci. 2003 Dec;86(12):3933-40.
56.
Carroll JA. Bidirectional communication: growth and immunity in domestic
livestock. J Anim Sci. 2008 Apr;86(14 Suppl):E126-37.
57.
Lassarre C, Hardouin S, Daffos F, Forestier F, Frankenne F, Binoux M. Serum
insulin-like growth factors and insulin-like growth factor binding proteins in the human
fetus. Relationships with growth in normal subjects and in subjects with intrauterine
growth retardation. Pediatr Res. 1991 Mar;29(3):219-25.
58.
Holland MD, Hossner KL, Williams SE, Wallace CR, Niswender GD, Odde KG.
Serum concentrations of insulin-like growth factors and placental lactogen during
gestation in cattle. I. Fetal profiles. Domest Anim Endocrinol. 1997 Jul;14(4):231-9.
59.
Yakar S, Liu JL, Stannard B, Butler A, Accili D, Sauer B, et al. Normal growth
and development in the absence of hepatic insulin-like growth factor I. Proc Natl
Acad Sci U S A. 1999 Jun 22;96(13):7324-9.
99
60.
D'Ercole AJ, Stiles AD, Underwood LE. Tissue concentrations of somatomedin
C: further evidence for multiple sites of synthesis and paracrine or autocrine
mechanisms of action. Proc Natl Acad Sci U S A. 1984 Feb;81(3):935-9.
61.
Hwa V, Oh Y, Rosenfeld RG. The insulin-like growth factor-binding protein
(IGFBP) superfamily. Endocr Rev. 1999 Dec;20(6):761-87.
62.
Baxter RC. Insulin-like growth factor binding proteins as glucoregulators.
Metabolism. 1995 Oct;44(10 Suppl 4):12-7.
63.
Firth SM, Baxter RC. Cellular actions of the insulin-like growth factor binding
proteins. Endocr Rev. 2002 Dec;23(6):824-54.
64.
Rodriguez FM, Salvetti NR, Panzani CG, Barbeito CG, Ortega HH, Rey F.
Influence of insulin-like growth factor-binding proteins-2 and -3 in the pathogenesis of
cystic ovarian disease in cattle. Anim Reprod Sci. 2011 Oct;128(1-4):1-10.
65.
Gross J, van Dorland HA, Schwarz FJ, Bruckmaier RM. Endocrine changes
and liver mRNA abundance of somatotropic axis and insulin system constituents
during negative energy balance at different stages of lactation in dairy cows. J Dairy
Sci. 2011 Jul;94(7):3484-94.
66.
Breier BH. Regulation of protein and energy metabolism by the somatotropic
axis. Domest Anim Endocrinol. 1999 Oct;17(2-3):209-18.
67.
Okamura CS, Bader JF, Keisler DH, Lucy MC. Short communication: Growth
hormone receptor expression in two dairy breeds during the periparturient period. J
Dairy Sci. 2009 Jun;92(6):2706-10.
68.
Jiang H, Lucy MC, Crooker BA, Beal WE. Expression of growth hormone
receptor 1A mRNA is decreased in dairy cows but not in beef cows at parturition. J
Dairy Sci. 2005 Apr;88(4):1370-7.
69.
Dahl GE, Chapin LT, Allen MS, Moseley WM, Tucker HA. Comparison of
somatotropin and growth hormone-releasing factor on milk yield, serum hormones,
and energy status. J Dairy Sci. 1991 Oct;74(10):3421-8.
70.
Bauman DE, Vernon RG. Effects of exogenous bovine somatotropin on
lactation. Annu Rev Nutr. 1993;13:437-61.
71.
Kawashima C, Fukihara S, Maeda M, Kaneko E, Montoya CA, Matsui M, et al.
Relationship between metabolic hormones and ovulation of dominant follicle during
the first follicular wave post-partum in high-producing dairy cows. Reproduction. 2007
Jan;133(1):155-63.
100
72.
Kawashima C, Sakaguchi M, Suzuki T, Sasamoto Y, Takahashi Y, Matsui M,
et al. Metabolic profiles in ovulatory and anovulatory primiparous dairy cows during
the first follicular wave postpartum. J Reprod Dev. 2007 Feb;53(1):113-20.
73.
Kelton DF, Lissemore KD, Martin RE. Recommendations for recording and
calculating the incidence of selected clinical diseases of dairy cattle. J Dairy Sci.
1998 Sep;81(9):2502-9.
74.
DeGaris PJ, Lean IJ. Milk fever in dairy cows: a review of pathophysiology and
control principles. Vet J. 2008 Apr;176(1):58-69.
75.
Herath S, Dobson H, Bryant CE, Sheldon IM. Use of the cow as a large animal
model of uterine infection and immunity. Journal of Reproductive Immunology. 2006
Feb;69(1):13-22.
76.
Tierschutzleitlinie für die Milchkuhhaltung, (2007).
77.
Dirksen G, Gründer H-D, Stöber M. Innere Medizin und Chirurgie des Rindes.
5. ed: Parey, Stuttgart; 2006.
78.
Drackley JK, Overton TR, Douglas GN. Adaptations of Glucose and Long-
Chain Fatty Acid Metabolism in Liver of Dairy Cows During the Periperturient Period.
J Dairy Sci(E Suppl). 2001;84:E100 - E12.
79.
Doll K, Sickinger M, Seeger T. New aspects in the pathogenesis of abomasal
displacement. Vet J. 2009 Aug;181(2):90-6.
80.
Seifi HA, Leblanc SJ, Leslie KE, Duffield TF. Metabolic predictors of post-
partum disease and culling risk in dairy cattle. Vet J. 2011 May;188(2):216-20.
81.
Kankofer M, Albera E, Feldman M, Gundling N, Hoedemaker M. Comparison
of antioxidative/oxidative profiles in blood plasma of cows with and without retained
fetal placental membranes. Theriogenology. 2010 Nov;74(8):1385-95.
82.
Beagley JC, Whitman KJ, Baptiste KE, Scherzer J. Physiology and treatment
of retained fetal membranes in cattle. J Vet Intern Med. 2010 Mar-Apr;24(2):261-8.
83.
Drillich M, Pfutzner A, Sabin HJ, Sabin M, Heuwieser W. Comparison of two
protocols for the treatment of retained fetal membranes in dairy cattle.
Theriogenology. 2003 Feb;59(3-4):951-60.
84.
Heuwieser W, Grunert E. SIGNIFICANCE OF CHEMOTACTIC ACTIVITY
FOR PLACENTAL EXPULSION IN CATTLE. Theriogenology. 1987 Jun;27(6):90712.
85.
Dohmen MJ, Joop K, Sturk A, Bols PE, Lohuis JA. Relationship between intra-
uterine bacterial contamination, endotoxin levels and the development of
101
endometritis in postpartum cows with dystocia or retained placenta. Theriogenology.
2000 Oct 15;54(7):1019-32.
86.
Sheldon IM, Lewis GS, LeBlanc S, Gilbert RO. Defining postpartum uterine
disease in cattle. Theriogenology. 2006 May;65(8):1516-30.
87.
Kaufmann TB, Drillich M, Tenhagen BA, Heuwieser W. Correlations between
periparturient serum concentrations of non-esterified fatty acids, beta-hydroxybutyric
acid, bilirubin, and urea and the occurrence of clinical and subclinical postpartum
bovine endometritis. BMC Vet Res. 2010;6:47.
88.
Tizard IR. Veterinary Immunology: An Introduction. 7. ed. Philadelphia,
Pennsylvania: Saunders; 2004.
89.
Herath S, Fischer DP, Werling D, Williams EJ, Lilly ST, Dobson H, et al.
Expression and function of Toll-like receptor 4 in the endometrial cells of the uterus.
Endocrinology. 2006 Jan;147(1):562-70.
90.
edge:
Hoshino K, Takeuchi O, Kawai T, Sanjo H, Ogawa T, Takeda Y, et al. Cutting
Toll-like
receptor
4
(TLR4)-deficient
mice
are
hyporesponsive
to
lipopolysaccharide: evidence for TLR4 as the Lps gene product. J Immunol. 1999 Apr
1;162(7):3749-52.
91.
Bertok L. Endotoxins and endocrine system. Domest Anim Endocrinol. 1998
Sep;15(5):305-8.
92.
Whitlock BK, Daniel JA, Wilborn RR, Elsasser TH, Carroll JA, Sartin JL.
Comparative aspects of the endotoxin- and cytokine-induced endocrine cascade
influencing neuroendocrine control of growth and reproduction in farm animals.
Reprod Domest Anim. 2008 Jul;43 Suppl 2:317-23.
93.
Sartin JL, Elsasser TH, Gunter DR, McMahon CD. Endocrine modulation of
physiological responses to catabolic disease. Domest Anim Endocrinol. 1998
Sep;15(5):423-9.
94.
Mehrzad J, Duchateau L, Pyorala S, Burvenich C. Blood and milk neutrophil
chemiluminescence and viability in primiparous and pluriparous dairy cows during
late pregnancy, around parturition and early lactation. J Dairy Sci. 2002
Dec;85(12):3268-76.
95.
Hoeben D, Monfardini E, Opsomer G, Burvenich C, Dosogne H, De Kruif A, et
al. Chemiluminescence of bovine polymorphonuclear leucocytes during the
periparturient period and relation with metabolic markers and bovine pregnancyassociated glycoprotein. J Dairy Res. 2000 May;67(2):249-59.
102
96.
Mallard BA, Dekkers JC, Ireland MJ, Leslie KE, Sharif S, Vankampen CL, et
al. Alteration in immune responsiveness during the peripartum period and its
ramification on dairy cow and calf health. J Dairy Sci. 1998 Feb;81(2):585-95.
97.
Sander AK, Piechotta M, Schlamberger G, Bollwein H, Kaske M, Sipka A, et
al. Ex vivo phagocytic overall performance of neutrophilic granulocytes and the
relation to plasma insulin-like growth factor-I concentrations in dairy cows during the
transition period. J Dairy Sci. 2011 Apr;94(4):1762-71.
98.
Tibbetts TA, Conneely OM, O'Malley BW. Progesterone via its receptor
antagonizes the pro-inflammatory activity of estrogen in the mouse uterus. Biol
Reprod. 1999 May;60(5):1158-65.
99.
Heuwieser W, Tenhagen BA, Tischer M, Luhr J, Blum H. Effect of three
programmes for the treatment of endometritis on the reproductive performance of a
dairy herd. Vet Rec. 2000 Mar 18;146(12):338-41.
100. LeBlanc SJ, Duffield TF, Leslie KE, Bateman KG, Keefe GP, Walton JS, et al.
The effect of treatment of clinical endometritis on reproductive performance in dairy
cows. J Dairy Sci. 2002 Sep;85(9):2237-49.
101. Sheldon IM, Noakes DE. Comparison of three treatments for bovine
endometritis. Vet Rec. 1998 May 23;142(21):575-9.
102. Eskandari F, Webster JI, Sternberg EM. Neural immune pathways and their
connection to inflammatory diseases. Arthritis Res Ther. 2003;5(6):251-65.
103. Dorshkind K, Horseman ND. The roles of prolactin, growth hormone, insulinlike growth factor-I, and thyroid hormones in lymphocyte development and function:
insights from genetic models of hormone and hormone receptor deficiency. Endocr
Rev. 2000 Jun;21(3):292-312.
104. French RA, Zachary JF, Dantzer R, Frawley LS, Chizzonite R, Parnet P, et al.
Dual expression of p80 type I and p68 type II interleukin-I receptors on anterior
pituitary cells synthesizing growth hormone. Endocrinology. 1996 Sep;137(9):402736.
105. Kelley KW, Weigent DA, Kooijman R. Protein hormones and immunity. Brain
Behav Immun. 2007 May;21(4):384-92.
106. Economidou F, Douka E, Tzanela M, Nanas S, Kotanidou A. Thyroid function
during critical illness. Hormones (Athens). 2011 Apr-Jun;10(2):117-24.
103
107. Matsas DJ, Nebel RL, Pelzer KD. Evaluation of an on-farm blood
progesterone test for predicting the day of parturition in cattle. Theriogenology. 1992
Apr;37(4):859-68.
108. Roh SG, Matsunaga N, Miyamoto A, Hidaka S, Hidari H. Competitive enzyme
immunoassay for bovine growth hormone. Endocr J. 1997 Feb;44(1):195-8.
109. Guven B, Ozsar S. Set up an enzymeimmunoassay for PGFM and its release
during estrus cycle in the Angora goat. . World Congress on Animal Production.
[Abstract]. 1993:289
110. Mishra
DP,
Meyer
HH,
Prakash
BS.
Validation
of
a
sensitive
enzymeimmunoassay for 13,14-dihydro-15-keto-PGF2alpha in buffalo plasma and its
application for reproductive health status monitoring. Anim Reprod Sci. 2003 Sep
15;78(1-2):33-46.
111. Huzzey JM, Nydam DV, Grant RJ, Overton TR. Associations of prepartum
plasma cortisol, haptoglobin, fecal cortisol metabolites, and nonesterified fatty acids
with postpartum health status in Holstein dairy cows. J Dairy Sci. 2011
Dec;94(12):5878-89.
112. Piechotta M, Kedves K, Hoeflich A, Wilkening S, Wrenzycki C, Bollwein H.
Differences in hepatic gene expression of insulin-like growth factor binding protein
and liver deiodinase 1 in late pregnant dairy cows with different total IGF-I plasma
concentrations. 7th International Congress on Farm Animal Endocrinology; 24. - 26.
August 2011; Bern, Switzerland: Universität Bern; 2011. p. 30-1.
113. Velazquez MA, Spicer LJ, Wathes DC. The role of endocrine insulin-like
growth factor-I (IGF-I) in female bovine reproduction. Domest Anim Endocrinol. 2008
Nov;35(4):325-42.
114. Weber WJ, Wallace CR, Hansen LB, Chester-Jones H, Crooker BA. Effects of
genetic selection for milk yield on somatotropin, insulin-like growth factor-I, and
placental lactogen in Holstein cows. J Dairy Sci. 2007 Jul;90(7):3314-25.
115. Bonakdar E, Rahmani HR, Edriss MA, Sayed Tabatabaei BE. IGF-I gene
polymorphism, but not its blood concentration, is associated with milk fat and protein
in Holstein dairy cows. Genet Mol Res. 2010;9(3):1726-34.
116. Hoedemaker M, Prange D, Gundelach Y. Body condition change ante- and
postpartum, health and reproductive performance in German Holstein cows. Reprod
Domest Anim. 2009 Apr;44(2):167-73.
104
117. Roche JR, Friggens NC, Kay JK, Fisher MW, Stafford KJ, Berry DP. Invited
review: Body condition score and its association with dairy cow productivity, health,
and welfare. J Dairy Sci. 2009 Dec;92(12):5769-801.
118. Knights M, Smith GW. Decreased ACTH secretion during prolonged
transportation stress is associated with reduced pituitary responsiveness to tropic
hormone stimulation in cattle. Domest Anim Endocrinol. 2007 Nov;33(4):442-50.
119. Nanda AS, Dobson H, Ward WR. Relationship between an increase in plasma
cortisol during transport-induced stress and failure of oestradiol to induce a
luteinising hormone surge in dairy cows. Res Vet Sci. 1990 Jul;49(1):25-8.
120. Wischral A, Verreschi IT, Lima SB, Hayashi LF, Barnabe RC. Pre-parturition
profile of steroids and prostaglandin in cows with or without foetal membrane
retention. Anim Reprod Sci. 2001 Sep 15;67(3-4):181-8.
121. Zulu VC, Sawamukai Y, Nakada K, Kida K, Moriyoshi M. Relationship among
insulin-like growth factor-I, blood metabolites and postpartum ovarian function in
dairy cows. J Vet Med Sci. 2002 Oct;64(10):879-85.
122. Hoedemaker M, Prange D, Zerbe H, Frank J, Daxenberger A, Meyer HH.
Peripartal propylene glycol supplementation and metabolism, animal health, fertility,
and production in dairy cows. J Dairy Sci. 2004 Jul;87(7):2136-45.
123. Waggoner JW, Loest CA, Turner JL, Mathis CP, Hallford DM. Effects of
dietary protein and bacterial lipopolysaccharide infusion on nitrogen metabolism and
hormonal responses of growing beef steers. J Anim Sci. 2009 Nov;87(11):3656-68.
124. McSherry BJ, Lumsden JH, Valli VE, Baird JD. Hyperbilirubinemia in sick
cattle. Can J Comp Med. 1984 Jul;48(3):237-40.
125. Inoue T, Saito H, Fukushima R, Inaba T, Lin MT, Fukatsu K, et al. Growth
hormone and insulinlike growth factor I enhance host defense in a murine sepsis
model. Arch Surg. 1995 Oct;130(10):1115-22.
126. Cavestany D, Kulcsar M, Crespi D, Chilliard Y, La Manna A, Balogh O, et al.
Effect of prepartum energetic supplementation on productive and reproductive
characteristics, and metabolic and hormonal profiles in dairy cows under grazing
conditions. Reprod Domest Anim. 2009 Aug;44(4):663-71.
127. Suikkari AM, Baxter RC. Insulin-like growth factor-binding protein-3 is
functionally normal in
pregnancy serum. J Clin
Jan;74(1):177-83.
105
Endocrinol Metab. 1992
128. Frystyk J. Free insulin-like growth factors -- measurements and relationships
to growth hormone secretion and glucose homeostasis. Growth Horm IGF Res. 2004
Oct;14(5):337-75.
129. Elsasser TH, Rumsey TS, Norton SA. Relationships between the thyroid and
somatotropic axes in steers. I: Effects of propylthiouracil-induced hypothyroidism on
growth hormone, thyroid stimulating hormone and insulin-like growth factor I. Domest
Anim Endocrinol. 1992 Oct;9(4):261-71.
130. Pethes G, Bokori J,
Rudas P,
Frenyo
VL,
Fekete S. Thyroxine,
triiodothyronine, reverse-triiodothyronine, and other physiological characteristics of
periparturient cows fed restricted energy. J Dairy Sci. 1985 May;68(5):1148-54.
131. McGuire MA, Vicini JL, Bauman DE, Veenhuizen JJ. Insulin-like growth factors
and binding proteins in ruminants and their nutritional regulation. J Anim Sci. 1992
Sep;70(9):2901-10.
132. Smyczynska J, Stawerska R, Lewinski A, Hilczer M. Do IGF-I concentrations
better reflect growth hormone (GH) action in children with short stature than the
results of GH stimulating tests? Evidence from the simultaneous assessment of
thyroid function. Thyroid Res. 2011;4(1):6.
133. Elsasser TH, Rumsey TS, Kahl S. Relationships between the thyroid and
somatotropic axes in steers. II: Effects of thyroid status on plasma concentrations of
insulin-like growth factor I (IGF-I) and the IGF-I response to growth hormone. Domest
Anim Endocrinol. 1993 Apr;10(2):71-85.
134. Rhoads ML, Rhoads RP, VanBaale MJ, Collier RJ, Sanders SR, Weber WJ, et
al. Effects of heat stress and plane of nutrition on lactating Holstein cows: I.
Production, metabolism, and aspects of circulating somatotropin. J Dairy Sci. 2009
May;92(5):1986-97.
135. Stewart PM, Toogood AA, Tomlinson JW. Growth hormone, insulin-like growth
factor-I and the cortisol-cortisone shuttle. Horm Res. 2001;56 Suppl 1:1-6.
136. Hydbring E, Madej A, MacDonald E, Drugge-Boholm G, Berglund B, Olsson K.
Hormonal changes during parturition in heifers and goats are related to the phases
and severity of labour. J Endocrinol. 1999 Jan;160(1):75-85.
137. Hulbert LE, Carroll JA, Burdick NC, Randel RD, Brown MS, Ballou MA. Innate
immune responses of temperamental and calm cattle after transportation. Vet
Immunol Immunopathol. 2011 Sep 15;143(1-2):66-74.
106
138. Shah KD, Nakao T, Kubota H, Maeda T. Peripartum changes in plasma
estrone sulfate and estradiol-17beta profiles associated with and without the
retention of fetal membranes in holstein-friesian cattle. J Reprod Dev. 2007
Apr;53(2):279-88.
139. Hayirli A. The role of exogenous insulin in the complex of hepatic lipidosis and
ketosis associated with insulin resistance phenomenon in postpartum dairy cattle.
Vet Res Commun. 2006 Oct;30(7):749-74.
140. Chagas LM, Lucy MC, Back PJ, Blache D, Lee JM, Gore PJ, et al. Insulin
resistance in divergent strains of Holstein-Friesian dairy cows offered fresh pasture
and increasing amounts of concentrate in early lactation. J Dairy Sci. 2009
Jan;92(1):216-22.
141. Holtenius P, Holtenius K. A model to estimate insulin sensitivity in dairy cows.
Acta Vet Scand. 2007;49:29.
142. Sheldon IM, Noakes DE, Rycroft AN, Pfeiffer DU, Dobson H. Influence of
uterine bacterial contamination after parturition on ovarian dominant follicle selection
and follicle growth and function in cattle. Reproduction. 2002 Jun;123(6):837-45.
143. Meng D, Lv DD, Fang J. Insulin-like growth factor-I induces reactive oxygen
species production and cell migration through Nox4 and Rac1 in vascular smooth
muscle cells. Cardiovasc Res. 2008 Nov 1;80(2):299-308.
144. Economidou F, Douka E, Tzanela M, Nanas S, Kotanidou A. Thyroid function
during critical illness. Hormones (Athens). Apr-Jun;10(2):117-24.
145. Himler M, Hurcombe SD, Griffin A, Barsnick RJ, Rathgeber RA, Macgillivray
KC, et al. Presumptive nonthyroidal illness syndrome in critically ill foals. Equine Vet
J. 2012 Feb;44 Suppl 41:43-7.
146. Kahl S, Elsasser TH, Blum JW. Effect of endotoxin challenge on hepatic 5'deiodinase activity in cattle. Domest Anim Endocrinol. 2000 Jan;18(1):133-43.
147. Waggoner JW, Loest CA, Mathis CP, Hallford DM, Petersen MK. Effects of
rumen-protected methionine supplementation and bacterial lipopolysaccharide
infusion on nitrogen metabolism and hormonal responses of growing beef steers. J
Anim Sci. 2009 Feb;87(2):681-92.
148. Husier BR, Blum JW. Metabolic and endocrine changes in response to
endotoxin administration with or without oral arginine supplementation. J Dairy Sci.
2002 Aug;85(8):1927-35.
107
149. Cageao LF, Mignone IR, Ricci CR, Brignone CC, Brignone JA, Zaninovich AA.
Effects of thyroid hormones on mitochondrial oxygen consumption in brown adipose
tissue and heart from cold-exposed hypothyroid rats. Acta Endocrinol (Copenh).
1992 Jul;127(1):72-5.
150. Gilbert RO, Bosu WT, Peter AT. The effect of Escherichia coli endotoxin on
luteal function in Holstein heifers. Theriogenology. 1990 Mar;33(3):645-51.
151. Richards RG, Almond GW. Lipopolysaccharide-induced increases in porcine
serum cortisol and progesterone concentrations are not mediated solely by
prostaglandin F2 alpha. Inflammation. 1994 Apr;18(2):203-14.
152. Williams EJ, Sibley K, Miller AN, Lane EA, Fishwick J, Nash DM, et al. The
effect of Escherichia coli lipopolysaccharide and tumour necrosis factor alpha on
ovarian function. Am J Reprod Immunol. 2008 Nov;60(5):462-73.
153. Kahl S, Elsasser TH, Li CJ. Modeling the effects of estradiol and progesterone
on the acute phase proinflammatory axis: variability in tumor necrosis factor-alpha,
nitric oxide, and xanthine oxidase responses to endotoxin challenge in steers.
Domest Anim Endocrinol. 2011 May;40(4):213-21.
154. Sheldon IM. The postpartum uterus. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 2004
Nov;20(3):569-91.
155. Escher G, Galli I, Vishwanath BS, Frey BM, Frey FJ. Tumor necrosis factor
alpha and interleukin 1beta enhance the cortisone/cortisol shuttle. J Exp Med. 1997
Jul 21;186(2):189-98.
156. Qahwash
IM,
Cassar
CA,
Radcliff
RP,
Smith
GW.
Bacterial
lipopolysaccharide-induced coordinate downregulation of arginine vasopressin
receptor V3 and corticotropin-releasing factor receptor 1 messenger ribonucleic acids
in the anterior pituitary of endotoxemic steers. Endocrine. 2002 Jun;18(1):13-20.
157. Thurston
LM,
Abayasekara
DR,
Michael
AE.
11beta-Hydroxysteroid
dehydrogenase expression and activities in bovine granulosa cells and corpora lutea
implicate corticosteroids in bovine ovarian physiology. J Endocrinol. 2007
May;193(2):299-310.
158. Carroll JA, McArthur NH, Welsh TH, Jr. In vitro and in vivo temporal aspects of
ACTH secretion: stimulatory actions of corticotropin-releasing hormone and
vasopressin in cattle. J Vet Med A Physiol Pathol Clin Med. 2007 Feb;54(1):7-14.
159. Le Roy C, Li JY, Stocco DM, Langlois D, Saez JM. Regulation by
adrenocorticotropin (ACTH), angiotensin II, transforming growth factor-beta, and
108
insulin-like growth factor I of bovine adrenal cell steroidogenic capacity and
expression of ACTH receptor, steroidogenic acute regulatory protein, cytochrome
P450c17,
and
3beta-hydroxysteroid
dehydrogenase.
Endocrinology.
2000
May;141(5):1599-607.
160. Liberman AC, Refojo D, Druker J, Toscano M, Rein T, Holsboer F, et al. The
activated glucocorticoid receptor inhibits the transcription factor T-bet by direct
protein-protein interaction. FASEB J. 2007 Apr;21(4):1177-88.
161. Bondurant RH. Inflammation in the bovine female reproductive tract. J Anim
Sci. 1999;77 Suppl 2:101-10.
162. Sheldon IM, Roberts MH. Toll-like receptor 4 mediates the response of
epithelial and stromal cells to lipopolysaccharide in the endometrium. PLoS One.
2010;5(9):e12906.
163. Rukkwamsuk T, Geelen MJ, Kruip TA, Wensing T. Interrelation of fatty acid
composition in adipose tissue, serum, and liver of dairy cows during the development
of fatty liver postpartum. J Dairy Sci. 2000 Jan;83(1):52-9.
164. McGavin MD, Zachary JF. Pathologic Basis of Veterinary Disease. 4. ed. St.
Louis, Missouri: Mosby Elsevier; 2007.
165. Kolle S, Sinowatz F, Boie G, Lincoln D, Waters MJ. Differential expression of
the growth hormone receptor and its transcript in bovine uterus and placenta. Mol
Cell Endocrinol. 1997 Aug 8;131(2):127-36.
166. Davey HW, Xie T, McLachlan MJ, Wilkins RJ, Waxman DJ, Grattan DR.
STAT5b is required for GH-induced liver IGF-I gene expression. Endocrinology. 2001
Sep;142(9):3836-41.
109
9 Anhang
9.1 ELISA zum Nachweis von Wachstumshormon

Mikrotiterplatte (Nunc, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts,
USA) mit Ziege Anti-Kaninchen beschichtet (Physiologie, Technische
Universität München, Weihenstephan, Deutschland) bei Raumtemperatur 2x
mit 300µl Waschpuffer (siehe 9.5 Rezepte) waschen

100µl GH-AK (rabbit anti-oGH-3, Lot# AFP0802210Rb; National Hormone &
Peptide Program (NHPP), NIDDK, und Dr. Parlow, Torrance, California, USA;
1:250.000 in Assaypuffer (siehe 9.5 Rezepte) verdünnt) pro Well

24 h bei Raumtemperatur inkubieren

4x waschen mit Waschpuffer

15µl Probe bzw. Standard

100µl 1% Hühner-Serum (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) in
Assaypuffer pro Well

24 h Raumtemperatur

3x waschen mit Waschpuffer

100µl Biotinmarkiertes GH 1:200.000 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,
Deutschland) mit Assaypuffer verdünnt pro Well

3h Raumtemperatur und anschließend abkippen

100µl SAP-solution pro Well (Steptavidin-POD; Sigma Aldrich, St. Louis,
Missouri, USA; 1:125 in Assaypuffer verdünnt)

15 min Raumtemperatur

4x waschen mit Waschpuffer

150µl Substratlösung (siehe 9.5 Rezepte)

40 min 37°C

Stoppen der Reaktion mit 50µl 2M Schwefelsäure (Sigma Aldrich, St. Louis,
Missouri, USA)

Messung bei 450 nm Wellenlänge (Spectra II; Tecan Group Ltd, Männedorf,
Schweiz)
110
9.2 ELISA zum Nachweis von PGFM

Mikrotiterplatte (Nunc, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts,
USA) mit Ziege anti-Kaninchen beschichtet (Physiologie, Technische
Universität München, Weihenstephan, Deutschland) bei Raumtemperatur 2x
mit 300µl Waschpuffer (siehe 9.5 Rezepte) waschen

20µl/well Standard (PGFM; Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA; 50 bis
2000 pg/ml) bzw. Probe

100µl/well Antikörper (Anti-PGFM in Assaypuffer, siehe 9.5 Rezepte, 1:20.000
verdünnt)

Über Nacht bei 4°C auf Schüttler inkubieren

3x mit 300µl/well Waschlösung waschen

100µl/well Enzym in Assaypuffer (1:30.000)

4x mit 300µl/well Waschlösung waschen

150 µl/well Substrat für 20 min bei 25°C

Stoppen der Reaktion mit 50 µl/well 2M Schwefelsäure (Sigma Aldrich, St.
Louis, Missouri, USA)

Optische Dichte messen bei 450 nm (Spectra II; Tecan Group Ltd, Männedorf,
Schweiz)
9.3 Verfahren zum Nachweis von LPS

Plasmaproben 1:10 in LPS freiem H2O (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri,
USA) verdünnen

5 min 80°C

100µl/Well Probe 37°C

100µl/Well Chromo-LAL (Charles River, Charleston, USA)

15 min bei 37°C

Messung der OD bei 405 nm
111
9.4 Färbeprotokoll der Histologischen Schnitte
Entparaffinisierung von Paraffinschnitten

2 x 10 min Xylol

2 min Isopropanol

2 min 100% Ethanol

30 min 80% Ethanol mit 0,6% Wasserstoffperoxid

2 min 70% Ethanol

3 x 5 min PBS
Behandlung mit TRIS/EDTA Puffer

10 min 96-99°C TRIS/EDTA Puffer pH 9 (unten beschrieben)

15 min Abkühlen

3 x 5 min PBS
Blocken

20 min 100 µl/Schnitt Ziegenserum 1:5 in PBS in feuchter Kammer bei RT
Antikörper

Über Nacht bei 4°C 60µl/Schnitt mit Antikörper IgG GHR Mouse (mAb 263;
Abcam, Cambridge, UK) 1:200 in PBS mit 1% Bovinem Serum Albumin
(Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) in feuchter Kammer

3 x 5 min PBS
Detektion (EnVison Mouse DAKO, Hamburg, Deutschland)

45 min 80µl/Schnitt Polymer HRP Lösung in feuchter Kammer bei
Raumtemperatur (im KIT enthalten)

3 x 5 min PBS

5 min Diaminobenzidine DAB (im KIT enthalten) in feuchter Kammer

5 min PBS

10 min fließendes Leitungswasser
Gegenfärbung

2 Sekunden Hämalaun nach Delafield (Anatomisches Institut, Tierärztliche
Hochschule Hannover)

15 min fließendes Leitungswasser
Dehydration + Eindecken
112

3 min 70% Ethanol

3 min 80% Ethanol

3 min 100% Ethanol

3 min Isopropanol

2 x 5 min Xylol

Eindecken mit EuKitt
9.5 Rezepte
Coatingpuffer

15 mmol/l Natrumcarbonat-10-Hydrat (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri,
USA)

34,87 mmol/l Natriumhydrogencarbonat (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri,
USA)

H2O Bidest
Assaypuffer

40 mmol/l Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat (Sigma Aldrich, St. Louis,
Missouri, USA)

145,5 mmol/l Natriumchlorid (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA)

0,1% Bovines Serumalbumin (Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg,
Deutschland)

H2O Bidest
Waschlösung

0,05% Polyoxyethylensorbitanmonooleat Tween 80 (AppliChem, Darmstadt,
Deutschland)

H2O Bidest
Substratlösung A

1 g Wasserstoffperoxid Harnstoff in 10ml H2O bidest lösen
113

18 g Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat (Sigma Aldrich, St. Louis,
Missouri, USA)

9,416 g Zitronensäure (Riedel-de-Haen, Seelze, Deutschland)

100 µl Kathon CG (Röhm und Haas, Michigan, USA)

Ad 1000 ml H2O Bidest
Substratlösung B
Teil 1

0,5 g 3,3´,5,5´-Tetramethylbenzidin (AppliChem, Darmstadt, Deutschland)

Lösen in 40 ml Dimethylsulfoxid (min. 99,5%; Sigma Aldrich, St. Louis,
Missouri, USA)
Teil 2

9,416 g Zitronensäure (Riedel-de-Haen, Seelze, Deutschland)

Ad 960 ml H2O Bidest
Teil 1 und 2 mischen (pH Wert 2,4)
Substratlösung

Substratlösung A

Substratlösung B
TRIS/EDTA Puffer

10 mmol/l TRIS (Sigma Aldrich)

1 mmol/l EDTA (Sigma Aldrich)

pH 9 mit NaOH einstellen
PBS

40 g NaCl (Sigma Aldrich)

7,8 g NaH2PO4 (AppliChem, Darmstadt, Deutschland)

In 5 l Aqua dest.

pH 7,2 mit 1M NaOH
114
Formalin nach Lillie

6,5 g Na2HPO4 (wasserfrei) (Sigma Aldrich)

4,0 g NaH2PO4 x H2O (AppliChem)

ad 900 ml H2O

100 ml Formaldehyd 36 – 40% (Sigma Aldrich)
115
10 Tabellenanhang
Tab. 1: Futterzusammensetzung des Betriebes Agrargesellschaft Siedenlangenbeck,
Kuhfelde/Wöpel von dem die Versuchstiere ausgewählt wurden
Trockenmasse
Frischmasse Trockenmasse
[g/kg
[kg]
[kg]
Frischmasse]
1
Min. PANTO R 66
Mineralfutter 0,12
0,114
950
Sojaextraktionsschrot1 44er Kraftfutter
0,75
0,66
880
Rotschwingel, Stroh
Grobfutter
4
3,44
860
Roggenstroh
Grobfutter
1,5
1,29
860
Maissilage 10
Grobfutter
4,5
1,373
305
Grünland, III/10
Grobfutter
21
4,515
215
Ration Gesamt
31,87
11,392
357
Bezeichnung
Futterart
1
Kraft und Mineralfutter: Hamburger Leistungsfutter, Hamburg Deutschland
Tab. 2: Mineralstoffzusammensetzung der Futterration des Betriebes Agrargesellschaft Siedenlangenbeck, Kuhfelde/Wöpel von dem die Versuchstiere ausgewählt
wurden
Mineralstoff
[g/kg
Trockenmasse]
Calcium
Phosphor
Magnesium
Natrium
Kalium
Chlor
Schwefel
7,5
4,26
3,07
2,05
9,56
3,92
1,45
116
Tab. 3: Analysedaten der Futtermittel des Betriebes Agrargesellschaft Siedenlangenbeck, Kuhfelde/Wöpel von dem die Versuchstiere
ausgewählt wurden
Bezeichnung
Min. PANTO R 66
Sojaextraktionsschrot
44er
Rotschwingel, Stroh
Roggenstroh
Maissilage 10
Grünland, III/10
Ration Gesamt
Rohasche
[g/kg T]
1000
Org.
Masse
[g/kg T]
0
Rohprotein
[g/kg T]
Rohfett
[g/kg T]
Rohfaser
[g/kg T]
NfE
Stärke
[g/kg T] [g/kg T]
beständi
Zucker
ge XS
[g/kg T]
[g/kg T]
0
KohlenXZ+uXS
hydrate
[g/kg T]
[g/kg T]
0
0
Nutzbares
Rohprotein
[g/kg T]
67
933
510
15
67
341
69
0
108
177
408
315
69
58
45
125
96
931
942
955
875
904
59
37
108
160
128
18
13
26
33
24
392
472
182
236
291
462
420
639
446
461
0
0
225
1
32
0
0
56
0
7
8
50
1
14
0
8
219
2
38
854
892
821
682
752
90
74
138
138
125
T: Trockenmasse; NfE: Stickstofffreie Extrudatstoffe; XS: Stärke; XZ: Zucker
Tab. 4: Ruminale Stickstoffbilanz, Umsetzbare Energie, Netto Energie für die Laktation und Strukturwert der Ration des Betriebes
Agrargesellschaft Siedenlangenbeck, Kuhfelde/Wöpel von dem die Versuchstiere ausgewählt wurden
Bezeichnung
Ruminale Stickstoffbilanz Umsetzbare Energie Netto Energie Laktation
Strukturwert je kg Trockenmasse
[g/kg T]
[MJ/kg T]
[MJ/kg T]
Min. PANTO R 66
Sojaextraktionsschrot 44er
Rotschwingel, Stroh
Roggenstroh
Maissilage 10
Grünland, III/10
Ration Gesamt
0
31,2
-5
-5,9
-4,8
3,5
0,4
13,78
6,82
6
10,84
8,14
8,08
8,65
3,77
3,25
6,55
4,67
4,65
T: Trockensubstanz; MJ: Mega Joule
117
100
100
60
65
74,51
Tab. 5: Kliniknummern der in die Studie aufgenommenen Tiere mit der Einteilung
entsprechend den Werten (≤125 ng/ml IGF-I niedrig und ≥175 ng/ml IGF-I hoch) für
Insulin-like growth Factor-I (IGF-I), Einstallungs- und Geburtsdatum mit den Tagen
post inseminationem (p.insem.):
Tier-
IGF-I-Gruppe
Tag der
Tag der
Tag der Geburt
nummer
(IGF-I Konzentration
Auswahl
Einstallung
(Tag p.insem.)
am Tag der Auswahl)
(Tag p.insem.)
(Tag p.insem.)
IGF-I hoch (183)
07.07.2010
21.07.2010
02.08.2010
(251)
(265)
(277)
07.07.2010
21.07.2010
10.08.2010
(246)
(260)
(280)
05.08.2010
17.08.2010
12.09.2010
(245)
(257)
(283)
05.08.2010
17.08.2010
16.09.2010
(242)
(254)
(284)
13.09.2010
22.09.2010
12.10.2010
(254)
(263)
(283)
13.09.2010
22.09.2010
15.10.2010
(250)
(260)
(282)
14.10.2010
27.10.2010
15.11.2010
(250)
(263)
(282)
14.10.2010
27.10.2010
23.11.2010
(243)
(256)
(283)
03.01.2011
12.01.2011
06.02.2011
(252)
(261)
(286)
03.01.2011
12.01.2011
05.02.2011
(243)
(252)
(276)
27.01.2011
10.02.2011
02.03.2011
(248)
(262)
(282)
09.02.2011
10.02.2011
15.03.2011
(248)
(249)
(282)
02.03.2011
09.03.2011
12.04.2011
(242)
(249)
(283)
804/10
803/10
918/10
917/10
1056/10
1057/10
1192/10
1193/10
45/11
46/11
174/11
175/11
302/11
IGF-I hoch (223)
IGF-I niedrig (83)
IGF-I niedrig (83)
IGF-I hoch (214)
IGF-I hoch (225)
IGF-I hoch (223)
IGF-I hoch (176)
IGF-I hoch (184)
IGF-I hoch (277)
IGF-I niedrig (105)
IGF-I hoch (187)
IGF-I hoch (191)
118
Tab. 5 Fortsetzung
425/11
IGF-I niedrig (125)
479/11
480/11
622/11
623/11
825/11
826/11
IGF-I niedrig (122)
IGF-I niedrig (114)
IGF-I niedrig (94)
IGF-I niedrig (97)
IGF-I niedrig (108)
IGF-I niedrig (80)
22.03.2011
05.04.2011
(242)
(256)
14.04.2011
20.04.2011
11.05.2011
(251)
(257)
(278)
14.04.2011
20.04.2011
22.05.2011
(250)
(256)
(288)
02.05.2011
19.05.2011
02.06.2011
(243)
(260)
(274)
02.05.2011
19.05.2011
06.06.2011
(240)
(257)
(275)
27.06.2011
12.07.2011
30.07.2011
(245)
(260)
(278)
27.06.2011
12.07.2011
26.07.2011
(242)
(257)
(271)
119
Tab. 6: Deskriptive Statistik der Wert IGF-I, Wachstumshormon, Cortisol, Thyroxin,
Trijodthyronin, 17β-Östradiol, Insulin, Progesteron und freie Fettsäuren der Gruppen
IGF-I hoch (≥175 ng/ml; h) und IGF-I niedrig (≤125 ng/ml; n) am Tag der Auswahl
zwischen Tag 240 bis 254 post inseminationem
Variabel
Mittelwert
***
IGF-I
Median
Maximum
Minimum
Standard-
Unteres
Oberes
abweichung
Quartil
Quartil
h
208,3
202,6
277,1
176,1
30,8
183,6
223,2
n
101,1
101,0
125,0
80,0
16,3
83,1
114,0
Wachstums-
h
5,6
4,3
15,6
3,3
3,7
3,6
5,5
hormon
n
6,2
4,3
21,4
2,0
5,8
3,2
6,2
Cortisol
h
4,3
2,8
13,9
2,0
3,8
2,0
4,2
n
8,5
6,6
25,2
2,0
7,3
2,8
11,9
h
4,6
4,6
5,2
3,7
0,5
4,3
4,8
n
4,5
4,5
5,5
3,5
0,6
4,2
4,8
h
116,2
121,0
185,0
59,1
31,7
99,1
124,0
n
134,2
138,0
172,0
81,0
30,6
117,0
155,0
h
31,0
27,6
52,8
24,0
9,3
24,1
34,7
n
40,0
33,2
96,6
24,0
21,6
26,5
44,0
h
14,3
11,6
24,6
5,6
5,9
9,5
18,6
n
11,8
10,1
23,1
6,4
4,9
8,9
13,7
h
6,4
6,5
9,3
3,9
1,5
5,4
7,2
n
7,4
7,8
10,5
4,3
1,8
6,0
8,4
h
163
158,5
254
100,0
56,4
111,0
199,0
n
318,6
233,0
789,0
96,4
221,6
181,0
379,0
Thyroxin
Trijodthyronin
17β-Östradiol
Insulin
Progesteron
Freie
Fettsäuren
*
Unterschiede zwischen den beiden Gruppen sind folgendermaßen dargestellt:
* P<0,05; *** P<0,001
120
Tab. 7: Parameter der Gruppen IGF-I hoch und IGF-I niedrig (≥175 ng/ml bzw. ≤125
ng/ml am Tag der Auswahl zwischen Tag 240 bis 254 post inseminationem) zum
Zeitpunkt der Einstallung (Tag 249 bis 265 post inseminationem)
IGF-I hoch n=10
IGF-I niedrig n=10
607 ± 65
661 ± 65
Body Condition Score
3,47 ± 0,15
3,55 ± 0,33
Milchleistung der
7045 ± 607
7743 ± 1265
1
1-3
3,3 ± 0,2
3,8 ± 0,7
Gewicht (kg)
vorangegangenen
Laktation (kg/305d)
Anzahl vorheriger
Laktationen
Alter (Jahre)
121
Tab. 8: Klinisch chemische Parameter der Gruppen IGF-I hoch und IGF-I niedrig
(≥175 ng/ml bzw. ≤125 ng/ml am Tag der Auswahl zwischen Tag 240 bis 254 post
inseminationem) am Tag der Einstallung (Tag 249 bis 265 post inseminationem) in
die Klinik für Rinder
Parameter (Einheit)
IGF-I hoch
IGF-I niedrig
11960 ± 1982,8
10460 ± 1001,3*
Erythrozyten *106 (/µl)
6,9 ± 0,9
6,4 ± 0,7
Hämoglobin (g/dl)
11,4 ± 1,5
11,1 ± 1,0
Hämatokrit (%)
36,7 ± 4,9
35,8 ± 3,0
Gesamt Eiweiß (g/l)
86,7 ± 7,8
82,3 ± 4,6
Gesamtbilirubin (µmol/l)
3,1 ± 0,8
4,4 ± 1,7*
Aspartat-Amino-Transferase (U/l)
79,3 ± 20,8
74,7 ± 22,0
γ-Glutamyl-Transferase (U/l)
34,0 ± 8,8
27,4 ± 9,0
Glutamat-Dehydrogenase (U/l)
17,9 ± 16,1
9,5 ± 4,5
Cholesterin (mmol/l)
3,3 ± 0,8
3,1 ± 0,7
Harnstoff (mmol/l)
5,1 ± 0,9
3,6 ± 0,6***
Kreatinin (µmol/l)
102,4 ± 15,8
98,3 ± 11,4
Albumin (g/l)
34,8 ± 2,1
34,7 ± 2,5
Kalzium (mmol/l)
2,3 ± 0,1
2,3 ± 0,1
Magnesium (mmol/l)
1,0 ± 0,1
0,9 ± 0,1*
Phosphor (mmol/l)
1,6 ± 0,3
1,5 ± 0,2
Selen (µg/l)
111,3 ± 11,2
118,2 ± 27,8
Natrium (mmol/l)
141,7 ± 4,1
141,7 ± 3,5
Kalium (mmol/l)
4,2 ± 0,3
4,2 ± 0,3
Chlorid (mmol/l)
100,0 ± 1,8
99,3 ± 2,3
Leukozyten (/µl)
Unterschiede zwischen den beiden Gruppen sind folgendermaßen dargestellt:
*P<0,05; ** P<0,01; *** P<0,001
122
Tab. 9: Tupferprobenergebnisse des Uterus der einzelnen Versuchstiere der Gruppen IGF-I hoch (h) und IGF-I niedrig (n; ≥175 ng/ml bzw. ≤125 ng/ml am Tag
der Auswahl zwischen Tag 240 bis 254 post inseminationem) 30 Minuten nach der Geburt mit semiquantitativer Einteilung des Keimgehalts der nachgewiesenen
Bakterienspezies.
IGF-I-Gruppe
h
h
h
h
h
h
n
n
n
n
n
n
hk
hk
hk
hk
nk
nk
nk
1056
1057
1192
1193
46
302
917
174
479
480
622
826
804
803
45
175
918
623
825
Acinetobacter species
0
0
0
0
0
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Aerococcus species
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
alpha-hämolysierende Streptokokken
0
2
1
0
1
1
0
3
2
1
2
0
0
1
1
2
0
0
0
Gramnegative Anaerobier
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
anhämolys. Streptokopkken
1
1
0
0
0
0
0
0
2
0
0
0
0
0
1
0
3
3
0
Bacillus species
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
1
Burkholderia cepacia
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Citrobacter species
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Clostridium perfringens
0
0
0
0
0
0
0
1
3
0
0
3
0
0
0
0
3
3
3
Enterobacter aerogenes
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
Enterobacter cloacae
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
3
0
0
0
0
0
0
3
Enterokokken species
0
1
0
0
0
0
0
1
0
0
0
1
2
0
0
1
0
0
3
Escherichia coli
0
1
1
0
0
1
1
3
0
1
2
2
3
0
1
2
3
3
3
Klebsiella oxytoca
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Koagulase negative Staphylokokken
1
0
0
0
1
0
0
0
0
1
0
1
0
0
1
0
1
0
0
Mannheimia varigena
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Pantoea agglomerans
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Proteus species
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
1
0
Pseudomonas species
0
0
0
1
0
0
0
0
0
1
2
0
0
0
0
0
0
0
0
Kuhnummer
h: IGF-I hoch
n: IGF-I niedrig
hk: IGF-I hoch NaCl Tier
nk: IGF-I niedrig NaCl Tier
0: nicht nachgewiesen
2: mittelgradig nachgewiesen
1: geringgradig nachgewiesen 3: hochgradig nachgewiesen
123
Tab. 10: Atemfrequenz der Gruppen IGF-I hoch und IGF-I niedrig (≥175 ng/ml bzw.
≤125 ng/ml am Tag der Auswahl zwischen dem 240 bis 254 Tag post
inseminationem) und der NaCl-Gruppe ohne LPS während des Versuches.
IGF-I hoch
IGF-I niedrig
NaCl-Gruppe
0 min
30 min
60 min
90 min
120 min 150 min 180 min
(1/min)
(1/min)
(1/min)
(1/min)
(1/min)
(1/min)
(1/min)
30,7 ±
32,0 ±
28,0 ±
29,3 ±
31,3 ±
28,0 ±
33,3 ±
9,0
9,5
6,7
4,1
5,9
6,7
9,0
33,3 ±
33,3 ±
32,7 ±
33,3 ±
33,3 ±
36,0 ±
36,0 ±
10,9
15,1
12,5
14,0
13,1
17,5
17,9
33,6 ±
40,0 ±
33,7 ±
38,9 ±
36,0 ±
39,3 ±
40,7 ±
13,1
15,6
12,4
12,6
9,2
14,4
15,7
Tab. 11: Pulsfrequenz der Gruppen IGF-I hoch und IGF-I niedrig (≥175 ng/ml bzw.
≤125 ng/ml am Tag der Auswahl zwischen dem 240 bis 254 Tag post
inseminationem) und der NaCl-Gruppe ohne LPS während des Versuches.
IGF-I hoch
IGF-I niedrig
NaCl-Gruppe
0 min
30 min
60 min
90 min
120 min 150 min 180 min
(1/min)
(1/min)
(1/min)
(1/min)
(1/min)
(1/min)
(1/min)
96,0 ±
98,4 ±
92,7 ±
89,3 ±
92,0 ±
92,7 ±
100,0 ±
11,3
4,6
6,9
7,4
10,4
10,3
10,4
100,7 ±
100,0 ±
102,0 ±
100,0 ±
94,7 ±
99,3 ±
103,3 ±
8,2
16,6
17,7
18,4
13,5
14,4
15,5
93,6 ±
96,7 ±
94,7 ±
94,7 ±
93,3 ±
92,7 ±
93,3 ±
9,2
12,2
9,7
10,3
6,0
8,5
10,6
124
Tab. 12: Die ACTH-Konzentrationen der einzelnen Tiere nach 30 und 150 Minuten
nach der Infusion mit LPS (IGF-I; ≥175 ng/ml hoch und IGF-I niedrig ≤125 ng/ml am
Tag der Auswahl zwischen dem 240 bis 254 Tag post inseminationem) bzw. NaClLösung
Tiernummer
30 Minuten
150 Minuten
IGF-I hohe Gruppe
1056/10
10,3
13,5
1057/10
6,4
12,0
1192/10
6,6
9,9
1193/10
65,3
58,8
46/11
8,6
7,5
302/11
10,6
17,4
IGF-I niedrige Gruppe
917/10
11,0
19,2
174/11
10,5
6,6
479/11
15,4
18,8
480/11
22,6
23,4
622/11
20,3
42,2
826/11
27,4
39,4
804/10
19,3
16,4
803/10
39,7
31,7
918/10
18,0
20,3
45/11
12,2
13,8
175/11
11,2
6,8
623/11
18,5
13,9
825/11
30,9
19,1
NaCl-Gruppe
125
Danksagung
Mein Dank geht an Herrn Prof. Dr. Heinrich Bollwein für die umfangreiche Betreuung
der Dissertation.
Ein riesiges Dankeschön geht an Dr. Marion Piechotta für die umfassende Betreuung
und Unterstützung während der gesamten Arbeitszeit.
Weiterhin danke ich Lara Górriz Martín für die Unterstützung mit den Versuchstieren
und der Hilfe bei der Auswahl in Wöpel.
Für die Hilfe bei den Versuchstieren danke ich auch Dr. Maike Heppelmann, Dr.
Anja Sipka, Dr. Anna Düvel, Hanna Lütkehus, Sarah Fuchs und Constanze Frank.
Auch dem Labor der Endokrinologie ein Herzliches Dankeschön, Martina
Baumgarten, Angela Jordan und Katrin Koslowski waren immer eine große Hilfe im
Umgang mit meinen Proben.
Auch all den Tierärzten, Bremsern und Tierpflegern in der Klinik meinen Dank, die
immer ein wachsames Auge auf die Versuchstiere hatten und mir viel geholfen
haben. Ohne euch wären meine Nächte noch schlafloser gewesen.
Bei der Hilfe und Auswertung der Histologie im Anatomischen Institut bedanke ich
mich herzlichst bei Frau Prof. Dr. Christiane Pfarrer, Marion Gähle und Doris Walter.
Auch für die Mitarbeit der Agrargesellschaft Siedenlangenbeck und das Bereitstellen
der Tiere möchte ich mich bei Herrn Christian Schmidt und seinem Mitarbeiter Jörg
Kaissuhn bedanken.
Für die tatkräftige Unterstützung der statistischen Auswertung danke ich Marcello
Antonio Gil Araujo.
Nicht zuletzt gilt mein Dank auch meiner Familie und all den Freunden, die mich
während der gesamten Zeit unterstützt, mir ihre Zeit geopfert und an mich geglaubt
haben.
126