Tierärztliche Hochschule Hannover Einfluss des Insulin-like Growth Factor Systems auf die endokrinologische Antwort nach einer experimentell induzierten Inflammation des Uterus INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae ( Dr. med. vet. ) vorgelegt von Lars Holzhausen Hannover Hannover 2012 Wissenschaftliche Betreuung: Univ. Prof. Dr. med. vet. Heinrich Bollwein Klink für Rinder 1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. med. vet. Heinrich Bollwein Klink für Rinder 2. Gutachter: Apl. Prof. Dr. med. vet. Hans-Joachim Schuberth Arbeitsgruppe Immunologie Tag der mündlichen Prüfung: 20. November 2012 Gefördert durch Pfizer Animal Health Meiner Familie Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung............................................................................................................. 1 2 Literatur ............................................................................................................... 3 2.1 Transitperiode................................................................................................. 3 2.1.1 Definition .................................................................................................. 3 2.1.2 Metabolische Veränderungen .................................................................. 3 2.1.3 Endokrinologie ......................................................................................... 4 2.2 Somatotrope Achse ........................................................................................ 7 2.2.1 Wachstumshormon .................................................................................. 7 2.2.2 Wachstumshormon Rezeptor................................................................... 8 2.2.3 Insulin-like Growth Factor System ........................................................... 9 2.2.4 Besonderheiten der Hochleistungskuh .................................................. 11 2.3 Produktionserkrankungen ............................................................................. 13 2.3.1 Ketose .................................................................................................... 13 2.3.2 Labmagenverlagerung ........................................................................... 14 2.3.3 Leberverfettung ...................................................................................... 15 2.3.4 Nachgeburtsverhaltung .......................................................................... 15 2.3.5 Metritis, Endometritis ............................................................................. 16 2.4 Angeborene Immunantwort .......................................................................... 17 2.4.1 Definition ................................................................................................ 17 2.4.2 Besonderheiten der angeborenen Immunantwort in der Transitperiode 19 2.5 Immun-endokrine Netzwerke ........................................................................ 20 3 Material und Methode ....................................................................................... 23 3.1 Tiere ............................................................................................................. 23 3.2 Versuchsaufbau............................................................................................ 23 3.2.1 Antepartaler Zeitraum ............................................................................ 24 3.2.2 Postpartaler Zeitraum ........................................................................... 24 3.3 Antepartaler Zeitraum ................................................................................... 28 3.3.1 Auswahlkriterien der Versuchstiere........................................................ 28 3.3.2 Einstallung ............................................................................................. 28 3.3.3 Blutprobennahme vor der Geburt........................................................... 29 3.4 Geburtsüberwachung ................................................................................... 29 3.5 Postpartaler Zeitraum ................................................................................... 30 3.5.1 Bakterielle Untersuchung ....................................................................... 30 3.5.2 Durchführung des LPS-Versuchs........................................................... 30 3.6 Laboranalysen .............................................................................................. 31 3.6.1 IGF-I ....................................................................................................... 31 3.6.2 Wachstumshormon ................................................................................ 32 3.6.3 Cortisol ................................................................................................... 33 3.6.4 Adrenocorticotropes Hormon ................................................................. 33 3.6.5 Thyroxin und Trijodthyronin.................................................................... 34 3.6.6 Insulin .................................................................................................... 34 3.6.7 17β-Östradiol ......................................................................................... 34 3.6.8 Progesteron ........................................................................................... 35 3.6.9 13,14-dihydro-15-keto-PGF2α ............................................................... 35 3.6.10 Freie Fettsäuren.................................................................................... 36 3.6.11 Lipopolysaccharide ............................................................................... 36 3.7 Histologie ...................................................................................................... 36 3.8 Statistik ......................................................................................................... 37 4 Ergebnisse ......................................................................................................... 39 4.1 Tiere ............................................................................................................. 39 4.2 Antepartaler Zeitraum ................................................................................... 39 4.2.1 IGF-I ....................................................................................................... 40 4.2.2 Wachstumshormon ................................................................................ 42 4.2.3 Schilddrüsenhormone ............................................................................ 43 4.2.4 Cortisol ................................................................................................... 45 4.2.5 Progesteron ........................................................................................... 46 4.2.6 17β-Östradiol ......................................................................................... 47 4.2.7 13,14-dihydro-15-keto-PGF2α ............................................................... 48 4.2.8 Insulin .................................................................................................... 49 4.2.9 Freie Fettsäuren..................................................................................... 50 4.3 Geburt .......................................................................................................... 51 4.4 Postpartaler Zeitraum ................................................................................... 51 4.4.1 Bakterielle Untersuchung ....................................................................... 51 4.4.2 LPS-Versuch .......................................................................................... 52 4.5 Histologie ...................................................................................................... 63 4.5.1 Übersichtsfärbung .................................................................................. 63 4.5.2 Immunhistochemie ................................................................................. 64 5 Diskussion ......................................................................................................... 67 5.1 Tiere ............................................................................................................. 68 5.2 Antepartaler Zeitraum ................................................................................... 69 5.2.1 Somatotrope Achse ............................................................................... 71 5.2.2 Schilddrüsenhormone ............................................................................ 73 5.2.3 Cortisol ................................................................................................... 74 5.2.4 Reproduktionshormone .......................................................................... 76 5.2.5 Insulin und FFS ...................................................................................... 76 5.3 Bakterielle Untersuchung ............................................................................. 78 5.4 LPS-Versuch ................................................................................................ 79 5.4.1 Somatotrope Achse ............................................................................... 81 5.4.2 Schilddrüsenhormone ............................................................................ 82 5.4.3 Reproduktionshormone .......................................................................... 83 5.4.4 Cortisol und ACTH ................................................................................. 85 5.4.5 Lipopolysaccharide ................................................................................ 86 5.5 Histologie ...................................................................................................... 87 5.6 Schlussfolgerungen ...................................................................................... 89 6 Zusammenfassung ........................................................................................... 90 7 Summary............................................................................................................ 93 8 Literatur ............................................................................................................. 94 9 Anhang ............................................................................................................. 110 9.1 Wachstumshormon..................................................................................... 110 9.2 PGFM ......................................................................................................... 111 9.3 LPS............................................................................................................. 111 9.4 Färbeprotokoll der Histologischen Schnitte ................................................ 112 9.5 Rezepte ...................................................................................................... 113 10 Tabellenanhang ............................................................................................. 116 Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen Neben den allgemein üblichen Abkürzungen wurden folgende spezielle Kurzformen verwendet: Abb. Abbildung ACTH Adrenocorticotropes Hormon ALB Albumin ALS Acid labile subunit a.p. ante partum AST Aspartat-Aminotransferase BCS Body Condition Score CK Creatininkinase cpm counts per minute DNA Desoxyribonukleinsäure EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ELISA Enzym linked Immunosorbant Assay E2 17β-Östradiol FFS Freie Fettsäuren GAP Glutaraldehydprobe GAS interferon-gamma-activated sites GB Gesamt Bilirubin GGT γ-Glutamyltransferase GH Wachstumshormon (Growth Hormone) GHIH Wachstumshormon inhibiting Hormone GHR Wachstumshormon-Rezeptor GHRH Wachstumshormon releasing Hormone GLDH Glutamatdehydrogenase HE Hämatoxylin Eosin HSD1/HSD2 11β-Hydroxysteroiddehydrogenase Typ 1 / 2 HST Harnstoff IGF Insulinähnlicher Wachstumsfaktor IGFBP IGF-Bindungsproteine IGF-IR IGF-I Rezeptor IL Interleukin IRMA Immunradiometrischer Assay Jak2 Janus Kinase 2 ln Natürlicher Logarithmus LPS Lipopolysaccharid min Minuten mRNA messenger Ribonukleinsäure NaCl Natriumchlorid NTIS Nicht Thyreodales Erkrankungssyndrom (Non Thyroidal Illness Syndrome) P Irrtumswahrscheinlichkeit PAMP Pathogen-assozierte molekulare Struktur (Pathogen Associated Molecular Pattern) PBS Phosphat gepufferte Saline p. insem. post inseminationem PG Prostaglandin PGFM Prostaglandin F2α Metabolit p.p. post partum P4 Progesteron RIA Radioimmunoassay STAT Signal Transducer and Activator of Transcription Tab. Tabelle TH1/TH2 T-Helferzellen Typ1/Typ2 TLR Toll-like Rezeptor TNF Tumor Nekrose Faktor TSH Thyroidea Stimulierendes Hormon T3 Trijodthyronin T4 Thyroxin V. Vena VLDL Very Low Density Lipoprotein 5’D 5’Deiodinase 1 Einleitung Als Transitperiode der Milchkühe wird die Zeit um die Abkalbung beschrieben, die mit einer erhöhten Krankheitsinzidenz einhergeht (1, 2). Unter anderem führen bakterielle Infektionen des Uterus in der ersten Woche post partum (p.p.) zu Metritiden und Endometritiden und haben darüber hinaus auch negative Einflüsse auf das weitere Zyklusgeschehen (3). Die finanziellen Einbußen, die uterine Krankheiten allein in der Europäischen Union durch Behandlung, aber auch Milchverluste und Unfruchtbarkeit pro Jahr bedingen, werden von Sheldon et al. (4) auf etwa 1,4 Milliarden Euro geschätzt. Eine bakterielle Besiedelung des Uterus im Anschluss an die Geburt ist nach Ansicht letztgenannter Autoren bei 80 bis 100% der Tiere nachweisbar, allerdings entwickelt nur gut ein Drittel der Tiere klinische Erkrankungen des Uterus. Damit aus einer zunächst harmlosen bakteriellen Kontamination keine Infektion entsteht, sind vor allem lokale Abwehrmechanismen im Uterus gefordert (5). Dabei wird eine Inflammation des Uterus von einer komplexen hormonellen Regulation begleitet, die auch die Somatotrope Achse mit einschließt (6). Diese Achse beschreibt das hypophysär ausgeschüttete Wachstumshormon (Growth Hormone; GH) und in der Leber gebildete Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren (Insulin-like Growth Factors; IGF). Peripartal kommt es bei Hochleistungsmilchkühen zu einer Entkopplung der Somatotropen Achse, denn durch eine Verminderung der Wachstumshormonrezeptoren (Growth Hormone Receptor, GHR) in der Leber vor der Geburt kommt es zu einer Reduktion der IGF-I-Blutkonzentration. Gleichzeitig steigen die GH- Konzentrationen durch das fehlende negative Feedback von IGF-I an der Hypophyse an (7). Es ist zwar bekannt, dass die Hormone der Somatotropen Achse einen Einfluss auf die Immunantwort haben (8, 9), allerdings weiß man wenig über deren Funktion und Einfluss auf die uterine Immunität während der Transitperiode von Milchkühen. In Vorarbeiten konnte gezeigt werden, dass trotz vergleichbarer IGF-I-Konzentrationen um den Geburtszeitpunkt niedrige IGF-I-Konzentrationen vier bis sechs Wochen vor der Geburt auf ein erhöhtes Risiko für postpartale Erkrankungen hindeuten (10). Die Hormone der Somatotropen Achse beeinflussen dabei nicht nur direkt die Inflammation, sondern haben auch über andere endokrine Achsen wie die Schilddrüsenhormonachse einen möglichen Einfluss (6). Die verschiedenen hormo1 nellen Regelkreise nehmen Einfluss auf eine Inflammation, aber umgekehrt beeinflusst auch eine Inflammation die verschiedenen hormonellen Regelmechanismen. Es wird hierbei von einem immunendokrinen Netzwerk gesprochen (6). Die Effektivität der Immunantwort wird von diesem immunendokrinen Netzwerk beeinflusst (6). Viele Regelkreise innerhalb dieses Systems sind allerdings sehr komplex und es gibt zu dieser Thematik bisher nur wenige Informationen in Bezug auf die peripartale Hochleistungsmilchkuh. Aus diesem Grund soll in der vorliegenden Arbeit der Einfluss des Insulin-like Growth Factor Systems auf die endokrinologische Antwort nach einer experimentell induzierten Inflammation des Uterus untersucht werden. Es werden dazu folgende Hypothesen überprüft: - Niedrige IGF-I-Werte vier bis sechs Wochen ante partum (a.p.) führen aufgrund des fehlenden negativen Feedbacks zu einer erhöhten GH-Serumkonzentration um den Geburtszeitpunkt. - Tiere mit unterschiedlich hohen IGF-I-Konzentrationen a.p. zeigen in verschiedenen Geweben Unterschiede in den Wachstumshormon-Rezeptoren. - Ein uteriner inflammatorischer Reiz post partum hat unterschiedliche Auswirkungen auf den Hormonhaushalt bei Tiere mit unterschiedlichen IGF-I-Konzentrationen 4 bis 6 Wochen vor der Geburt. 2 2 Literatur 2.1 Transitperiode 2.1.1 Definition Die Transitperiode der Milchkühe definiert Grummer (11) als Zeitintervall von drei Wochen vor bis drei Wochen nach der Geburt. Dieser Zeitraum ist in der Literatur für den englischen Begriff „Transition Period“ weithin anerkannt (1, 12). Allerdings bestehen auch zeitlich kürzere Definitionen, die nur die letzten ein bis zwei Wochen der Trächtigkeit und die ersten zwei Wochen der Laktation mit einschließen. Hierbei wird allerdings betont, dass das zeitliche Intervall für die gesundheitlich besonders anfällige Phase der Milchkühe noch bis zum Zeitpunkt der höchsten Milchleistung in der fünften Woche p.p. anhält (13, 14). Wenngleich die Definition des Zeitraumes variiert, besteht Einigkeit darüber, dass in dieser Zeit die höchste Inzidenz von Krankheiten bei Milchkühen zu beobachten ist (1, 11, 13). Diese Krankheiten werden als Produktionserkrankungen bezeichnet (1) und sind im Folgenden genauer beschrieben. 2.1.2 Metabolische Veränderungen Hochleistungsmilchkühe sind als „Metabolische Athleten“ bezeichnet worden (15) und gerade die Transitperiode stellt eine Zeit enormer metabolischer Anpassungen dar. Diese Anpassungen sind vor allem nötig, um dem erhöhten Energiebedarf während der späten Trächtigkeit und der beginnenden Laktation gerecht zu werden (11). In den letzten drei Wochen der Trächtigkeit beobachtet man eine Reduzierung der Futteraufnahme der Tiere, die in der letzten Trächtigkeitswoche um bis zu 30% im Vergleich zur Mitte der Trächtigkeit sinkt (16). Eine Erklärung für diesen Rückgang bei gleichzeitig hohem Energiebedarf bietet zum Teil die Tatsache, dass der Pansen durch die Größenzunahme des Uterus eingeengt und so seine Aufnahmekapazität eingeschränkt wird (16). Allerdings müssen nach Bertics et al. (16) auch weitere Faktoren, die die Autoren nicht näher beschreiben, in Betracht gezogen werden, da bei erzwungener gleichbleibender Futtermenge bis zur Geburt eine Depression der Futteraufnahme nach der Geburt nicht vermieden wird. Zusätzlich ist der Energieverbrauch des Muttertieres durch die benötigte Energie für das Wachstum 3 des Fetus zum Ende der Trächtigkeit erhöht (17, 18). Deshalb gelangt der Körper der Milchkuh bereits vor der Geburt in eine katabole Stoffwechsellage, die mit einer negativen Energiebilanz einhergeht (17, 18). Diese hält auch über die Geburt hinaus an. Nach Bauman et al. (19) und Grummer (11) ist der Höhepunkt der negativen Energiebilanz in der ersten Woche der Laktation zu beobachten. Eine große Bedeutung innerhalb dieser Anpassungsreaktionen an eine katabole Stoffwechsellage hat der Fettstoffwechsel. Freie Fettsäuren (FFS) werden aus Adipozyten freigesetzt und stehen als Energielieferanten in der Leber zur Verfügung (19, 20). Fütterungsunabhängig steigen die Konzentrationen der FFS im Blut in den letzten drei Wochen vor der Geburt stetig an (11). Für den Abbau der FFS und der damit einhergehenden Bereitstellung von Lipoproteinen ist besonders die Leber zuständig (21). Näheres dazu ist im Kapitel 2.3.3 „Leberverfettung“ beschrieben. Neben dem Fettstoffwechsel ist auch der Glukosestoffwechsel bei der Anpassung an eine negative Energiebilanz von entscheidender Bedeutung. Die Leber synthetisiert 85% der im Körper verbrauchten Glukose (1). Sowohl die späte Trächtigkeit als auch die beginnende Laktation erfordern eine erhöhte Produktion von Glukose, worauf die Leber mit einer erhöhten Aufnahme von endogenen glukoplastischen Substanzen, wie beispielsweise Aminosäuren und Glycerol reagiert (18). Nach Bell et al. (22) führen abnehmende Insulinkonzentrationen in den letzten beiden Wochen vor der Geburt zu einer Hemmung der Proteinsynthese und einer Erhöhung der Proteolyse, um dem erhöhten Verbrauch an Aminosäuren in der einsetzenden Laktogenese gerecht zu werden. Diese oben beschriebenen Anpassungsreaktionen im Lipid-, Kohlenhydrat- und Proteinstoffwechsel müssen bei Milchkühen adäquat reguliert werden, um die Energie für den Fetus und die einsetzende Milchproduktion bereitzustellen. Reguliert werden diese Anpassungen vornehmlich endokrinologisch (1). Die Endokrinologie der Transitperiode wird im Folgenden näher erläutert. 2.1.3 Endokrinologie Die komplexe endokrinologische Regulation in der Transitperiode ist sowohl an den peripheren Hormonkonzentrationen, als auch den Rezeptorexpressionen, und an Veränderungen nachgeschalteter Signaltransduktionswege zu erkennen (18, 23). 4 In diesem Zusammenhang ist bei der Milchkuh der Somatotropen Achse eine besondere Bedeutung zuzuschreiben. Diesem endokrinen Regelkreis ist dementsprechend ein eigenes Kapitel gewidmet (siehe 2.2 Somatotrope Achse). Die metabolische Adaptation spiegelt sich auch in den Änderungen der Konzentrationen der Schilddrüsenhormone Thyroxin (T4) und Trijodthyronin (T3) wider. Die Schilddrüsenhormone haben Einfluss auf den Energiehaushalt, da sie vor allem den energetischen Grundumsatz des Körpers regulieren (24). Die T4- und T3-Konzentrationen sinken während der letzten Wochen vor der Geburt ab und steigen während der Laktation wieder auf die Ausgangswerte von der Mitte der Trächtigkeit an (11). Dabei sind die T4-Konzentrationen und die Milchleistung zu Beginn der Laktation negativ korreliert (25). Parallel dazu sinken nach Pezzi et al. (25) die 5’Deiodinasen (5’D) in der Leber ab. Diese Enzyme spalten ein Jodatom vom T 4 (auch Tetrajodthyronin genannt) ab, wodurch Trijodthyronin, die aktive Form der Schilddrüsenhormone entsteht. Durch die verminderte hepatische Deiodinase-Aktivität während der Geburt kommt es zu einem Abfall der T3-Konzentration im Blut. Dagegen steigt die Aktivität der 5’D in der Milchdrüse zum Geburtszeitpunkt an und korreliert positiv mit der Milchleistung, wobei auch höhere T3-Konzentrationen im Gewebe der Milchdrüse und im Kolostrum nachweisbar sind (25). Aceves et al. (26) bringen Änderungen der Schilddrüsenparameter mit dem Krankheitsbild des sogenannten Euthyreoten Krankheitssyndroms in Verbindung und führen dies auf den hohen Energieverbrauch der Milchdrüse und der damit einhergehenden negativen Energiebilanz und der hohen metabolischen Belastung zurück. Es kommt dabei zu einem Absinken der Thyroxinkonzentration und damit zu einem verminderten Grundumsatz des Körpers (26). Wie der Name „Euthyreotes Krankheitssyndrom“ besagt, sind solche Veränderungen sonst bei Krankheiten unterschiedlicher Genese zu beobachten (26). Cortisol wird sowohl in der Nebenniere des Fetus als auch des Muttertieres gebildet und als Stresshormon angesehen. Darüber hinaus spielt es eine wichtige Rolle im Rahmen hormoneller Veränderungen vor der Geburt (27). Die Freisetzung von Cortisol induziert in den Eihäuten die Bildung des Enzyms 17α-Hydroxylase. Dieses Enzym bewirkt die Konversion von Progesteron zu Östrogenen (27). Weiterhin induziert fetal gebildetes Cortisol die Synthese von Prostaglandinen, vor allem von Prostaglandin (PG)F2α. Dieses führt zu einer Luteolyse und dadurch zum Absinken der 5 weiter unten beschriebenen Progesteronkonzentrationen und anschließend zu Kontraktionen der glatten Uterusmuskulatur (27). Während der dadurch ausgelösten Geburt sind die Cortisolkonzentrationen des Muttertieres, bedingt durch die Anstrengungen während der Geburt, hoch (28, 29). Progesteron ist für die Aufrechterhaltung der Gravidität von entscheidender Bedeutung (24). Es wird im Corpus luteum und zum geringen Teil auch in der Plazenta und Nebenniere gebildet (30, 31). Stabenfeld et al. (32) beschreiben ein Absinken der Progesteronplasmakonzentration ab dem Tag 250 der Trächtigkeit von durchschnittlich 7 auf 4 ng/ml in der Woche vor der Geburt, wobei die individuelle Schwankungsbreite relativ hoch sei, und ein schnelles Absinken ca. 24 h vor der Geburt auf einen Wert um 1 ng/ml, bedingt durch die Luteolyse. Der Rückgang ein bis vier Wochen ante partum hängt mit der bereits oben beschriebenen durch Cortisol induzierten Synthese des Enzyms 17α-Hydroxylase zusammen, das eine erhöhte Produktion von Östrogenen durch Umsetzung des Progesterons bedingt (31, 33, 34). Gegen Ende der Trächtigkeit steigen die Konzentrationen von vornehmlich 17βÖstradiol (E2), aber auch Östron und Östriol stark an (35). Der Hauptsyntheseort dieser Hormone ist die Plazenta. Östrogene induzieren geburtsvorbereitend eine erhöhte Anzahl an Oxytocinrezeptoren am Uterus, ein verstärktes Wachstum des Myometriums und eine vermehrte Bildung von Actomyosin, wodurch sich die Kontraktilität des Uterus erhöht (27). Zusammen mit Relaxin bewirken Östrogene auch eine Aufweichung der Zervix und des Geburtskanals und stimulieren die Freisetzung von PGF2α aus dem Endometrium (27). Direkt nach der Geburt kommt es innerhalb eines Tages zu einem Absinken der Östrogenplasmakonzentrationen auf ein Basalniveau (27, 36). Sie bleiben bis zur Bildung eines ersten dominanten Follikel um den 10. Tag post partum niedrig (37). Prostaglandin F2α ist nicht nur für die Kontraktionen während der Geburt, sondern auch für die anschließende Uterusinvolution von Bedeutung. Zu früh sinkende Konzentrationen von PGF2α sind mit einer verzögerten Uterusinvolution in Zusammenhang gebracht worden, weshalb PGF2α als ein bedeutender Faktor während der peripartalen Phase angesehen wird (27). Das endokrine Pankreas synthetisiert unter anderem die beiden Peptidhormone Insulin und Glukagon, welche beide, neben Catecholaminen und Cortisol, wichtige Regulatoren des Blutzuckerspiegels sind (24). Dabei führt Insulin zu einer Senkung des 6 Blutzuckerspiegels durch Aufnahme von Glukose in Körperzellen. Glukagon dagegen führt zu einer Freisetzung von Glukose aus Zellen in die Blutbahn (24). Die Glukosekonzentration im Blutplasma fällt in der Woche nach der Geburt deutlich ab (38), wohingegen die Insulinkonzentration bereits in den letzten beiden Wochen vor der Geburt absinkt. Letztere bleibt dann in den ersten drei Wochen nach der Geburt auf einem niedrigen Level (39) und erreicht erst ca. 30 Tage p.p. wieder die Ausgangskonzentration, die vier Wochen vor der Geburt gemessen wurden (40). Genau entgegengesetzt dazu steigen die zum Insulin antagonistisch wirkenden Glukagonplasmawerte an und sinken anschließend wieder ab (38). Die niedrigen Insulinwerte führen zu einer vermehrten Aufnahme der Glukose durch die nicht insulinabhängigen Glukosetransporter der Zellen der Milchdrüse. Die Insulinkonzentrationen sind mit der Milchleistung negativ korreliert. Niedrige Insulinkonzentrationen werden deshalb auch als ein Grund für hohe Milchleistungen angesehen (41). 2.2 Somatotrope Achse Die Somatotrope Achse hat einen bedeutenden Einfluss auf das fetale und postnatale Wachstum des Organismus. Das Wachstumshormon wurde in diesem Zusammenhang bereits 1921 von Evans und Long (42) nachgewiesen und erhielt aufgrund dieser Funktion auch seinen Namen. Erst später erkannte man, dass GH nicht nur direkt, sondern auch über Serumfaktoren wirkt (43). Einige dieser Serumfaktoren wurden von Rinderknecht und Humbel (44) als Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren beschrieben. Die klassischen Elemente der Somatotropen Achse umschließen das Wachstumshormon, das Wachstumshormon Bindungsprotein, den Wachstumshormonrezeptor, die Insulin-like Growth Factors I und II, sechs IGF Bindungsproteine (IGFBP) und weitere IGF ähnliche Bindungsproteine (45). 2.2.1 Wachstumshormon Das im Hypophysenvorderlappen gebildete GH gehört zur Gruppe der Peptidhormone, besteht aus 191 Aminosäuren und wird mit einer pulsatilen, circadianen Rhythmik in den Blutkreislauf abgegeben (45). Im menschlichen Fetus kann GH bereits in der 6. Woche der Schwangerschaft nachgewiesen werden und besitzt einen 7 großen Einfluss auf das Längenwachstum (45). Die pulsatile Ausschüttung des GH wird mit geschlechtsspezifischen Unterschieden durch zwei Neuropeptide gesteuert. Diese Neuropeptide sind das Growth Hormone Releasing Hormone (GHRH) und das Growth Hormone Inhibitor Hormone (GHIH). Beide werden im Hypothalamus gebildet und in den Blutkreislauf abgegeben (46). Die Regulation der Ausschüttung dieser beiden Neuropeptide erfolgt zum einen durch ein negatives Feedback auf den Hypothalamus durch das Wachstumshormon selbst, wodurch die GHRH-Ausschüttung gesenkt und gleichzeitig die Sekretion von GHIH gefördert wird (47). Des Weiteren sind auch andere Hormone beschrieben, die einen Einfluss auf die hypothalamische GHRH- und GHIH-Ausschüttung und somit auch auf das hypophysäre GH-Ausschüttungsmuster haben. Dazu gehören das in der Leber gebildete IGF-I, sowie die gastrointestinalen Peptide Ghrelin, Leptin und Insulin (45). Neben dem Feedback auf den Hypothalamus kommt es aber auch zu einem direkten Feedback auf die Hypophyse, wodurch die GH-Ausschüttung gesenkt werden kann. Dabei besitzen IGF-I und Insulin die größte Bedeutung (48). Aus der Hypophyse wird GH in den Blutkreislauf abgegeben und an das GH-Bindungsprotein gebunden. In vivo konnte von Renaville et al. (49) gezeigt werden, dass das Bindungsprotein die Halbwertszeit verlängert und eine stärkere Wirkung des GH an seinem Rezeptor bedingt. Neben dem Längenwachstum beeinflusst GH auch den Stoffwechsel (50). Die Wirkung von GH auf bestimmte Zielgewebe wie Fett, Muskulatur oder auch Leber ist dabei direkt oder wird indirekt durch IGF-I und IGF-II vermittelt. Einen direkten Effekt hat GH beispielsweise auf die Adipozyten. Es wirkt lipolytisch und ein GH-Mangel führt bei Mäusen zu einem vermehrten Fettgehalt des Körpers (51). In der Leber kommt es durch GH zu einer vermehrten Glukoneogenese. Indirekt bewirkt es aber durch die Bildung von IGF-I eine vermehrte Aufnahme von Glukose aus der Blutbahn in die Gewebe. Wachstumshormon und IGF-I sind somit zum Teil Antagonisten und die Regulation auf Zellebene ist komplex gesteuert (50). 2.2.2 Wachstumshormon Rezeptor Die Wirkung von GH wird über GHR in der Zellmembran vermittelt (52). GHR ist ein transmembranes Glycoprotein, dessen mRNA Expression und dessen Protein in der Leber die höchsten Konzentrationen besitzen. Aber auch in Fettgewebe, Muskel und 8 Niere wurden hohe Konzentrationen des GHR nachgewiesen (53). Die Wirkung von Wachstumshormon an seinem Rezeptor wird intrazellulär über die Janus Kinase 2 (Jak2) vermittelt, die mit dem intrazellulären Teil des Rezeptors assoziiert ist. Die Bindung von GH veranlasst eine Konformationsänderung des Rezeptors, der die Jak2 aktiviert. Das intrazelluläre Signaltransduktionsprotein Jak2 phosphoryliert in Folge das DNA Bindungsprotein „signal transducer and activator of transcription 5b“ (STAT5b). Zwei phosphorylierte STAT5b bilden zusammen ein Dimer, das im Zellkern an spezifische DNA Sequenzen, sogenannte „interferon-gamma-activated sites“ (GAS), bindet. Diese GAS Elemente befinden sich in den Promotern der GH-abhängigen Gene, wie beispielsweise dem IGF-I-Gen, die dadurch die Transkription dieser Gene erhöhen (23). Es sind drei verschiedene GHR mRNA Transkripte beim Rind beschrieben: GHR 1A, 1B und 1C (52). Lucy et al. (54) konnten die GHR 1A mRNA beim Rind nur in der Leber nachweisen. Weiterhin konnte diese Arbeitsgruppe (55) zeigen, dass die Bindung von GH auf mikrosomalen Membranen homogenisierter Hepatozyten um den Geburtszeitpunkt beim Rind deutlich verringert ist. Das auf den Hepatozyten gebundene GH korreliert mit der Transkription der GHR 1A mRNA, nicht aber mit der Transkription der gesamten mRNA der GHR 1A, 1B und 1C. Die Autoren machen deshalb GHR 1A für das Absinken der IGF-I-Konzentrationen vor der Geburt verantwortlich (55). 2.2.3 Insulin-like Growth Factor System In der Literatur wird übereinstimmend dem IGF-I im Metabolismus, aber auch bei Funktionen der Immunantwort und der Regeneration und Differenzierung von Geweben eine besonders wichtige Bedeutung zugesprochen (6, 8, 56). Bereits namentlich wird bei Insulin-like Growth Factor auf eine strukturelle Homologie zum Insulin verwiesen, die ca. 50% beträgt (45). Dementsprechend kann IGF-I nicht nur an seinen eigenen Rezeptor, sondern auch an die Rezeptoren der strukturverwandten Hormone Insulin und IGF-II binden. Allerdings ist bei dieser Kreuzreaktivität die Bindungsaffinität von beispielsweise IGF-I am Insulinrezeptor gegenüber Insulin 100-mal niedriger (8, 45). 9 In der fetalen Phase wird vor allem IGF-II gebildet, wobei IGF-I einen ebenso großen Einfluss auf das Wachstum hat (57), so dass beim Rind sowohl IGF-I als auch IGF-II positiv mit dem fetalen Wachstum korrelieren (58). Sowohl im fetalen als auch postnatalen Leben wird die Synthese und Sekretion von IGF-I vor allem durch GH gesteuert. Dabei synthetisiert die Leber den größten Anteil des im Blut zu messenden IGF-I (ca. 75%). Das restliche im Blut zu messende IGF-I wird unter anderem in der Muskulatur sowie im Fett- und Nierengewebe gebildet (59). Das gebildete IGF-I kann sowohl endokrin, als auch parakrin und autokrin wirken (60). Die parakrine Wirkung beschreibt die Wirkung eines Hormons auf die Nachbarzelle, während man unter autokriner Wirkung den Einfluss auf dieselbe Zelle, in der das Hormon gebildet wurde, versteht. Yakar et al. (59) konnten bei Mäusen nachweisen, dass über 2/3 von dem endokrin wirksamen, im Serum zu messenden IGF-I in der Leber synthetisiert werden. Allerdings war ohne dieses in der Leber gebildete IGF-I weder das Wachstum noch die Reproduktion beeinträchtigt. Das gebildete IGF-I wird im Blut an Bindungsproteine gebunden: Nur ca. 1% liegt ungebunden, also frei vor. Viele der IGF-I-Aktionen werden durch Bindungsproteine modifiziert und kontrolliert (8, 45, 61). Der Komplex aus IGF-I, IGFBP-3 und Acid labile subunit (ALS) bildet den größten Anteil (80 – 95%) an gebundenem IGF-I (62). Dieser Bindungskomplex, der eine Halbwertzeit von 15 Stunden hat, wird als Pool für IGF-I angesehen (8). Zusätzlich kommt es zu einer Beeinflussung des IGF-I durch weitere Bindungsproteine. Ist IGF-I beispielsweise an IGFBP-1 gebunden, so erleichtert dieses Bindungsprotein den Transport von IGF-I durch Membranen (63). Darüber hinaus wurde für IGFBP-2 ein bedeutender Einfluss auf die physiologische Follikelentwicklung gezeigt. Ein Mangel steht in Zusammenhang mit einer zystischen Entartung von Follikeln (64). Die weitreichenden Wirkungen von IGF-I auf den Organismus werden durch den IGF-I-Rezeptor (IGF-IR) vermittelt, der nach Frago et al. (45) in allen Geweben, mit Ausnahme von Hepatozyten und ausgereiften B-Zellen vorkommt. Im Gegensatz dazu konnten Gross et al. (65) beim Rind IGF-IR mRNA auch in der Leber nachweisen. Zu den Wirkungen von IGF-I gehören eine gesteigerte Zellproliferation und Zelldifferenzierung (45). Die beiden Wirkungen konnten auch für heranreifende und sich entwickelnde Lymphozyten in primären und sekundären lymphoiden Geweben gezeigt werden (8). Der zugrunde liegende Mechanismus der erhöhten Proliferation ist 10 die Beschleunigung des Zellzyklus einschließlich der Mitose (45). Neben der gesteigerten Proliferation ist bei Immunzellen aber auch die Apoptoserate, d.h. der programmierte Zelltod, herabgesetzt (45). Des Weiteren konnte in vielen Arbeiten gezeigt werden, dass sich die metabolischen Gegebenheiten auf die systemischen IGF-I-Blutkonzentrationen auswirken (49). Aber auch umgekehrt sind Beeinflussungen von IGF-I auf den Metabolismus beschrieben. Liegt beispielsweise eine anabole Stoffwechsellage vor, senkt vom Körper gebildetes IGF-I systemisch vorhandene Triglyceride, FFS und Ketonkörper und erhöht die Aminosäureaufnahme in die Muskulatur (66). Weiterhin kann IGF-I durch die insulinähnliche Wirkung die Glukoseaufnahme in die Gewebe erhöhen und die Glukagonund GH-Sekretion senken. Dadurch wirkt es unter anderem auch dem diabetogenem Effekt des GH entgegen (8). Während einer katabolen Stoffwechsellage kommt es zu einer Resistenz gegenüber GH in den Geweben und damit zu einer verminderten IGF-I-Konzentration. Breier (66) geht davon aus, dass dieser Mechanismus dazu führe, dass freigesetzte Substrate wie z. B. Glukose und freie Fettsäuren vorwiegend für die Homöostase und nicht für Zellwachstum und Zellproliferation verwendet werden. Ähnliches gilt für den peripartalen Zeitraum bei Hochleistungsmilchkühen, in dem eine negative Energiebilanz zu einem Abfall der IGF-I-Werte führt. Butler et al. (48) stellen eine Verbindung zwischen unterernährten Tieren und Tieren am Anfang der Laktation her, da bei beiden Gruppen niedrige IGF-I-Konzentrationen zu messen sind. 2.2.4 Besonderheiten der Hochleistungskuh Bei den Rassen Holstein und Guernsey, sprich Rassen mit hoher Milchleistung, kommt es zu einem Absinken des GHR in der Leber um den Geburtszeitpunkt (67). Die geringste GHR-Konzentration ist in der Woche nach der Geburt parallel zu einer niedrigen IGF-I mRNA Transkription und IGF-I-Serumkonzentration gemessen worden (7). Bei Rindern, die züchterisch auf Fleischproduktion und nicht auf hohe Milchleistung selektioniert worden sind, ist dagegen die Änderung der GHR- und IGF-I-Konzentrationen nicht zu beobachten (68). Lucy et al. (50) gehen deshalb davon aus, dass dieses Absinken von GHR und IGF-I mit der hohen Milchleistung und der damit 11 einhergehenden katabolen Stoffwechselsituation während der Transitperiode in Zusammenhang steht. Bei Hochleistungsmilchkühen kommt es durch die sinkenden IGF-I-Werte im peripartalen Zeitraum zum Anstieg von GH und damit zu einem in der Literatur als Entkopplung der Somatotropen Achse beschrieben Phänomen (23). Dadurch, dass eine erhöhte Milchleistung bei Rindern auch durch eine parenterale Gabe von GH erreicht werden kann (23, 69, 70), schlussfolgern Bell et al. (22) und Lucy et al. (23), dass die vermehrte Ausschüttung von GH die Bereitstellung von Substraten zur Milchbildung erhöht. Es kommt zu einem Anstieg von FFS und zu einer verstärkten Glukoneogenese der Leber (48). Weiterhin beschreiben Butler et al. (48), dass die Entkopplung der Somatotropen Achse in direktem Zusammenhang mit sinkenden Insulinkonzentrationen steht. Ihnen war es möglich, mittels Insulininfusion und damit steigenden Insulinkonzentrationen in den ersten Wochen nach der Geburt eine Zunahme der GHR 1A mRNA und damit steigende IGF-I- und sinkende GH-Konzentrationen zu erreichen. Auch auf das weitere Zyklusgeschehen der Kühe haben IGF-I und GH einen Einfluss. So ist die IGF-I-Konzentration während der letzten vier Wochen vor Geburt bei Tieren, die postpartal in den ersten drei Wochen ovulieren, höher als bei anovulatorischen Kühen. Genau entgegengesetzt verhält es sich mit GH (71). Kawashima et al. (71, 72) konnten zwischen ovulatorischen und anovulatorischen Kühen jedoch keine Unterschiede hinsichtlich der metabolischen Parameter freie Fettsäuren, Cholesterol und Glukose feststellen. Daraus schließen die Autoren, dass der IGF-IWert sensitiver zu sein scheint, um metabolische Belastungen darzustellen als beispielsweise freie Fettsäuren. Ähnliche Zusammenhänge konnten Piechotta et al. (10) aufzeigen. Sie beobachteten bereits vor der Geburt bei Tieren mit Produktionserkrankungen niedrigere IGF-I-Konzentrationen als bei Tieren, die postpartal gesund blieben. Ihren Ergebnissen zufolge bestand bei Tieren mit IGF-I-Werten um 100 ng/ml zwischen dem 242. bis 250. Tag post inseminationem (p. insem.) ein höheres Risiko an Produktionserkrankungen zu erkranken, als bei Tieren mit IGF-IWerten über 130 ng/ml. 12 2.3 Produktionserkrankungen Mulligan und Doherty (1) postulieren, dass häufig die Unfähigkeit einzelner Kühe, die hohen metabolischen Ansprüche zu erfüllen, die Entstehung von Produktionserkrankungen bedinge. Zu den sogenannten Produktionserkrankungen zählen in der Literatur Ketose, Labmagenverlagerung, Leberverfettung, Hypokalzämie, Nachgeburtsverhaltung, Metritis, Endometritis und Mastitis (73). Diese treten, wie bereits beschrieben, mit erhöhter Inzidenz in der Transitperiode auf und sind ätiologisch eng miteinander verbunden (1). Die Pathogenese der Produktionserkrankungen ist komplex und laut Ingvartsen et al. (2) nicht per se mit einer hohen Milchleistung in Verbindung zu bringen. So sind beispielsweise Labmagenverlagerungen eher auf die Futteraufnahme und betriebliche Fütterungsfehler zurückzuführen (2). Hypokalzämien sind ebenso durch Fütterungsfehler bedingt, stehen aber auch mit der Anzahl der Laktationen in Zusammenhang (74). Eine andere Vermutung von Ingvartsen et al. (2) ist, dass „hormonelle Gegebenheiten“ eine Immunsuppression bedingen und es infolgedessen zu einer erhöhten Prävalenz von Erkrankungen komme. So begünstigen vor allem hohe Progesteronspiegel die Entstehung von bakteriellen Uteruserkrankungen, wohingegen erhöhte Östrogenwerte die Resistenz der Tiere gegenüber der Entwicklung von Uteruserkrankungen steigern (75). Die allein durch uterine Krankheiten entstehenden wirtschaftlichen Schäden in der Europäischen Union schätzen Sheldon et al. (5) auf jährlich 1,4 Milliarden Euro. Auch unter dem Aspekt des Tierschutzes sind Krankheiten zu vermeiden und daher Risikofaktoren bereits im Vorfeld von deren Entstehung zu reduzieren (76). Borghetti et al. (6) gehen davon aus, dass ein detailliertes Verständnis der Regelmechanismen der unspezifischen Abwehr und die damit einhergehende mögliche Intervention die Inzidenz von Krankheiten verringern könnte. 2.3.1 Ketose Liegt ein Energiemangel vor, so kommt es zur Freisetzung freier Fettsäuren aus dem Fettgewebe in die Blutbahn. Diese FFS gelangen in die Leber und werden dort zum großen Teil mittels β-Oxidation zu Acetyl-CoA abgebaut. Das entstehende AcetylCoA wird im Zitratzyklus weiter verstoffwechselt und kann somit als Energieträger genutzt werden (77). Durch die laktationsbedingte hohe Belastung der Glukoneogenese und der hohen Depotfettmobilisierung kommt es in der Leber zu einer Kon13 kurrenzsituation im Zitratzyklus. Das entstehende Acetyl-CoA wird daher unter Umgehung des Zitratzyklus teilweise zu Acetacetat und weiter zu den Ketonkörpern β-Hydroxybutyrat und Aceton umgewandelt und von der Leber in den Blutkreislauf abgegeben (77). In der Peripherie können vor allem Herz, Skelettmuskulatur, Niere, Milchdrüse und Gastrointestinaltrakt die Ketonkörper verstoffwechseln (78) und damit zum Teil die benötigte Glucose ersetzen (24). Wenn die Kapazität der Verstoffwechselung der Ketonkörper in der Peripherie überschritten ist, kommt es zur Ausscheidung dieser über Niere, Milchdrüsen, Haut und Atemluft und bei Überschreitung der Ausscheidungskapazität zu einer Akkumulation im Plasma. Die erhöhte Konzentration an Ketonkörpern führt zur metabolischen Azidose (24) und darüber hinaus kann es zu nervalen Beeinträchtigungen kommen, die von einer Hypomotilität des Magen-Darm-Traktes bis hin zu nervösen Symptomen reichen können (77). 2.3.2 Labmagenverlagerung Bei der Labmagenverlagerung handelt es sich um ein multifaktorielles Geschehen, dessen primäre Ursache bis heute unbekannt ist (79). Von den diagnostizierten Labmagenverlagerungen bei Hochleistungskühen treten bis zu 80% in den ersten vier Wochen post partum auf. Durch eine Dilatation und eine Ansammlung von Gas aus dem Labmageninhalt, steigt der Labmagen zwischen der linken oder rechten Bauchwand und dem Pansen bzw. den anderen inneren Organen auf. Dieses Geschehen wird durch eine Atonie oder eine bereits bestehende Dilatation des Labmagens begünstigt, wobei eine Hypomotilität des Gastrointestinaltraktes durch peripartale Stresszustände, metabolische Imbalancen und andere vorliegende Erkrankungen die Labmagenverlagerung zu fördern scheinen. Daher ist diese Produktionserkrankung häufig mit anderen Krankheiten vergesellschaftet (77). Vor allem sind erhöhte Werte von β-Hydroxybutyrat und FFS sowie niedrige Kalziumkonzentrationen miteinander in Verbindung gebracht worden (80). 14 2.3.3 Leberverfettung Als Leberverfettung bezeichnet man die Akkumulation von Triglyzeriden in der Leber, die zu Beginn der Laktation bei Milchkühen bis zu einem geringen Grad physiologisch ist und zunächst nicht die Leberfunktion beeinträchtigt (21). Die von der Leber aufgenommenen FFS werden zum einen bei der β-Oxidation zu Actyl-CoA abgebaut, das anschließend, wie beschrieben, in den Zitratzyklus eingeschleust oder zu Ketonkörpern umgewandelt und in die Blutbahn abgegeben wird. Zum anderen können die Hepatozyten die FFS zu Triglyceriden umwandeln und als Very Low Density Lipoproteine (VLDL) in die Blutbahn abgeben (21). Die Kapazitäten zur Ausschleusung von VLDL und Einschleusung der FFS in die β-Oxidation sind allerdings begrenzt, so dass Triglyceride auch in den Hepatozyten gespeichert werden können, da die Aufnahme freier Fettsäuren keiner Limitation unterliegt (21). Ab einem Verhältnis von gespeicherten Triglyceriden zu Glykogen von 2:1 kommt es zur hepatosteatosebedingten Leberinsuffizienz mit Ketose, verminderter Glukoneogenese und mangelnder Harnstoffbildung und dadurch zum verminderten Abbau von Ammoniak. Die Akkumulation von Ammoniak im Körper kann zum puerperalen Leberkoma führen (21, 77). Der Grad der Leberverfettung ist laut Hammon et al. (38) auch für einen erhöhten Quotienten von Glukagon zu Insulin verantwortlich und besitzt damit einen großen Einfluss auf den Metabolismus. 2.3.4 Nachgeburtsverhaltung Der physiologische Zeitraum für den Abgang der Nachgeburt wird bei vielen Autoren mit 12, teilweise mit bis zu 24 Stunden nach der Geburt angegeben. Kommt es nicht zu einer Ablösung der Nachgeburt innerhalb dieses Zeitraums, wird von einer Nachgeburtsverhaltung gesprochen (81-83). Bei zwei Drittel der Kühe findet der Nachgeburtsabgang in den ersten sechs Stunden post partum statt (82). Der Anteil der spontanen Nachgeburtsverhaltungen der Rinder ohne prädisponierende Faktoren wird von Sheldon et al. (4) mit 2 – 5% angegeben. Die Inzidenz in Herden beträgt 4 – 12% und wird vor allem von Managementfaktoren wie Hygiene und geburtshilflichen Maßnahmen beeinflusst (83). Es werden verschiedene Risikofaktoren für die Entstehung von Nachgeburtsverhaltungen beschrieben (82, 83). Hierzu zählen eine hormonelle Geburtseinleitung, eine verkürzte Graviditätsdauer, Aborte, Zwillingsträchtigkeiten, Dystokien, Fetotomien, Kaiserschnitte, eine Unter15 versorgung mit Vitamin E und Selen, eine Immunsuppression und infektiöse Agenzien wie Bovines Virus Diarrhoe Virus (82). Heuwieser et al. (84) konnten zudem bei Nachgeburtsverhaltungen eine reduzierte Chemotaxis der neutrophilen Granulozyten nachweisen. In der Literatur wird übereinstimmend berichtet, dass eine Nachgeburtsverhaltung zu einer erhöhten Prädisposition für andere Produktionserkrankungen führt und negative Einflüsse sowohl auf die uterine Involution und das weitere Reproduktionsgeschehen hat (82). Die Rast- und Güstzeiten verlängern sich, die Trächtigkeitsrate nimmt ab und die Anzahl der Besamungen pro Tier zu (82). 2.3.5 Metritis und Endometritis Eine Metritis tritt in den ersten 21 Tagen nach der Geburt auf und ist nach Sheldon et al. (5) gekennzeichnet durch eine Vergrößerung des Uterus mit einem flüssigen rotbraunen bis viskösen weißlichen purulenten Ausfluss. Bei einer bakteriellen Infektion sind die am häufigsten nachgewiesenen Bakterien Arcanobacterium pyogenes, Fusobacterium necrophorum, Escherichia coli und Prevotella species (5, 85, 86). Nachgeburtsverhaltung, Dystokie, Zwillingsgeburt und Totgeburt bedingen ein vermehrtes Auftreten von Metritiden (86) und werden nach Sheldon et al. (5) in drei Grade eingeteilt: Der Grad 1 beschreibt eine Vergrößerung des Uterus in den ersten 21 Tagen nach der Geburt mit purulentem Vaginalausfluss ohne eine akute systemische Erkrankung. Beim Grad 2 einer Metritis liegt eine akute systemische Erkrankung vor, die auf eine Infektion des Uterus mit Bakterien zurückzuführen ist und durch stinkenden, rotbraunen, flüssigen Uterusausfluss sowie Fieber, reduzierte Milchleistung und Abgeschlagenheit gekennzeichnet ist. Bei zusätzlichen Anzeichen einer Toxämie mit Inappetenz und Schocksymptomatik wird die Metritis als Grad 3 gewertet. Nach Sheldon et al. (4) können bei 80 – 100% der Kühe postpartal Bakterien im Uterus nachgewiesen werden. Der Anteil der Metritiden liegt bei ca. 40% der Tiere in der ersten Woche nach der Geburt; bei etwa 15 – 20% der Tiere entwickelt sich daraus eine klinische Endometritis. Weitere 30% der Tiere weisen subklinische Endometritiden auf (4, 5). Eine Endometritis ist histopathologisch als eine Entzündung des Endometriums definiert, wobei die Entzündungszeichen nicht über das Stratum spongiosum hinaus16 reichen (86). Bei der klinischen Endometritis ist nach mehr als 21 Tagen p.p. purulenter bzw. nach über 26 Tagen mukopurulenter vaginaler Ausfluss nachweisbar. Dabei liegen allerdings keine Anzeichen einer systemischen Erkrankung vor (86). Nach Sheldon et al. (5) liegt eine subklinische Endometritis vor, wenn der Anteil neutrophiler Granulozyten in vom Uterus genommen Zytologieproben über 5,5 – 10% liegt. Diese Erkrankung führt zu keinen klinischen Symptomen, aber zu einer niedrigeren Trächtigkeitsrate und zu einem erhöhten Abgangsrisiko bei den betroffenen Tieren (86). Kaufmann et al. (87) stellen einen Zusammenhang zwischen dem Metabolismus, insbesondere den FFS im Blutplasma am Tag vor der Geburt und der Häufigkeit des Auftretens von klinischen und subklinischen Endometritiden fest. Dabei besitzen die FFS zwar eine geringe Sensitivität (35 – 38%), allerdings eine hohe Spezifität (87 – 89 %) hinsichtlich der Prognostizierbarkeit von klinischen bzw. subklinischen Endometritiden. 2.4 Angeborene Immunantwort 2.4.1 Definition Nach Tizard et al. (88) versteht man unter angeborener Immunantwort bereits vorhandene und schnell reagierende chemische und zelluläre Abwehrmechanismen. Für die Erregererkennung ist von entscheidender Bedeutung, dass sich diese von körpereigenen Bestandteilen unterscheiden, d.h. Pathogen-assoziierte molekulare Strukturen (PAMPs) besitzen. Es gibt Enzyme und Bindungsproteine, die die Zellwände von Erregern zerstören oder für eine schnellere Erkennung und Zerstörung markieren können und Immunzellen, die PAMPs erkennen. Die Immunzellen lösen dann eine Entzündung durch die Ausschüttung von Zytokinen und Chemokinen aus. Dies fördert die gerichtete Aktion gegen Pathogene, so dass es zu einer Akkumulation von Entzündungszellen im betroffenem Gewebe kommt (88). Beispiele für PAMPs sind bakterienspezifische, hoch konservierte Proteine und andere Strukturen. Dazu zählen unter anderem Proteine der Bakterienzellwand oder Bestandteile der bakteriellen DNA (88). Ein besonders weitverbreitetes dieser PAMPs ist das Lipopolysaccharid (LPS), eine Zellwandstruktur gram-negativer Bakterien (88). 17 Rezeptoren zur Erkennung der PAMPs und damit auch von LPS sind u.a. Toll-like Rezeptoren, die auf verschiedenen Zellen des Immunsystems (88) und auf epithelialen Zellen, unter anderem des Uterus, nachgewiesen worden sind (89). Die Aktivierung des TLR4 durch LPS und die damit einhergehende Ausschüttung von Zytokinen durch Immunzellen können zu einer toxischen Reaktion führen, wodurch der Name Endotoxin für LPS begründet ist (5, 85, 90). Dabei vermitteln die Zytokine eine pyrogene Wirkung, erhöhen die kapillare Permeabilität und bedingen dadurch eine erhöhte prokoagulatorische Aktivität der Zellwände. Durch eine zu hohe Stimulation dieser Mechanismen durch die ausgeschütteten Zytokine kann es bis hin zum Schock durch Volumenmangel und einer disseminierten intravasalen Gerinnung kommen (88, 91). Die Toxizität wird dementsprechend nicht durch die direkten Wirkungen von LPS auf die Zellen erzielt, sondern durch die überschießende Freisetzung von Zytokinen aus den Entzündungszellen (88). Dies zeigten Hoshino et al. (90) bei Mäusen, die den LPS-spezifischen Rezeptor TLR-4 nicht besaßen und dadurch nur eine sehr geringe Reaktion auf LPS zeigten. Durch die physiologisch ausgelöste Entzündungsreaktion mit Dolor (Schmerz), Tumor (Schwellung), Rubor (Rötung) und Calor (Erwärmung), aber auch durch bakterielle Produkte (z.B. LPS), Faktoren des Komplementsystems, Moleküle beschädigter Zellen und sezernierte Chemokine werden Monozyten, die sich zu Makrophagen im Gewebe entwickeln, und neutrophile Granulozyten an den Ort der Entzündung „gelockt“ und aktiviert. Dabei steigt die Zahl der Makrophagen erst Stunden nach derjenigen der neutrophilen Granulozyten an (9). Makrophagen schütten Interleukine, inflammatorische Lipide und PGE2, sowie auch antiinflammatorische Zytokine aus (88, 92). Dazu wird die Aktivität der Makrophagen durch bakterielle Endotoxine, Östrogene und einfache Lipide gesteigert, wogegen Steroide wie Cortisol und Progesteron die Makrophagenaktivität hemmen (88). Immunzellen fördern die Freisetzung von Zytokinen, wie diejenige des Tumor Nekrose Faktors (TNF)-α, den Proteinkatabolismus in Muskelzellen. Weiterhin bedingt TNF-α eine höhere Verfügbarkeit von Lipiden im Organismus, zum einen durch eine gesenkte Aufnahme und zum anderen durch eine erhöhte Bereitstellung durch Adipozyten (88). Nach Tizard et al. (88) besitzt das angeborene Immunsystem im Gegensatz zu der erworbenen Immunität keinen „Memory Effekt“ und die Entzündung fällt dadurch auf einen Entzündungsreiz immer gleich stark aus. Dagegen konnte die Studie von 18 Elsasser et al. (9) zeigten in einer Studie, dass die Immunantwort durch ein Zusammenspiel mit dem Endokrinium moduliert und kontrolliert werden kann. GH bewirkte bei Rindern eine deutlich verminderte Cortisol- und TNF-α-Ausschüttung. Deshalb gehen die Autoren davon aus, dass die Somatotrope Achse gerade in der frühen Phase der Infektion die ablaufende angeborene Immunantwort und damit die weitere Pathologie beeinflussen kann. Dem stehen Untersuchungen von Sartin et al. (93) entgegen, die mit GH einen infektionsbedingten Rückgang der IGF-I-Konzentrationen nicht beeinflussen konnten. Borghetti et al. (6) gehen in ihrem Review davon aus, dass die Immunantwort durch eine komplexe neuroendokrine homöostatische Antwort moduliert und in ihrer Effektivität beeinflusst werden kann und die widersprüchlichen Aussagen durch eine zeitlich unterschiedliche Verabreichung von GH zustande kamen. 2.4.2 Besonderheiten der angeborenen Immunantwort in der Transitperiode Das endokrine System führt, wie bereits beschrieben, in der Transitperiode zu einer Stoffwechselumstellung von einer anabolen hin zu einer katabolen Stoffwechselkonstellation. Ingvartsen et al. (2) gehen davon aus, dass es durch diese peripartalen Veränderungen der Hormone und Metaboliten direkt oder indirekt zu einer Beeinflussung der Immunantwort kommt. Auch Sheldon et al. (4) vertreten die Meinung, dass unter anderem die Immunabwehr durch die endokrinen Gegebenheiten negativ beeinflusst werden könnte, auch wenn die genauen Mechanismen weiterhin größtenteils unbekannt seien (4). Sowohl Mehrzad et al. (94) als auch Hoeben et al. (95) konnten zeigen, dass nach der Geburt die Anzahl neutrophiler Granulozyten im Blut abnimmt. Viele Autoren gehen deshalb von einer Immunsuppression in dieser Phase aus (1, 94, 96), wohingegen Sander et al. (97) keine verminderte Phagozytoseleistung der neutrophilen Granulozyten beobachteten konnten. Nach der Geburt geht die physiologische Involution des Uterus mit einer Nekrose und dem Ablösen der Karunkeln einher. Diese Vorgänge bieten günstige Voraussetzungen für das Wachstum von aeroben und anaeroben Bakterien im Uteruslumen und müssen dementsprechend durch uterine Abwehrmechanismen, das heißt lokale Immunitätsmechanismen bekämpft werden (4). Gerade bei Hochleistungsmilchkühen ist die Inzidenzrate der uterinen Erkrankungen, verglichen mit anderen domestizier19 ten Tierarten, hoch (4). So kommt es bei über 80% der Tiere zu einer nachweisbaren bakteriellen Besiedelung des Uterus in den ersten zwei Wochen nach der Geburt (5). Es ist dabei aber klar zwischen einer Besiedelung und einer Infektion zu trennen. Während bei der Besiedelung lediglich Bakterien nachweisbar sind, kommt es bei einer uterinen Infektion zur Erkrankung entweder durch Adhärenz an die Mucosa mit einer Kolonisation und Penetration des Epitheliums oder durch die Ausschüttung von Toxinen (86). Sheldon et al. (86) postulieren, dass der Übergang von einer Besiedelung zu einer Infektion während der Transitperiode durch die Einwirkungen endokriner Faktoren auf das Immunsystem beeinflusst wird. Bei der Maus wurde gezeigt, dass in diesem Zusammenhang gerade das Verhältnis von Progesteron und Östrogen eine bedeutende Rolle für die Entzündung des Uterus spielt. Östrogene fördern und Progesteron hemmt die Entzündung des Uterus und die anschließende Ausheilung (98). Bei den Rindern wird vor allem Progesteron eine besondere Rolle zugeschrieben, da gerade während der lutealen Phase die Inzidenz von uterinen Erkrankungen erhöht ist und die iatrogene Luteolyse eine der effektivsten Behandlungsansätze uteriner Erkrankungen darstellt (99-101). LeBlanc (15) geht davon aus, dass metabolische Faktoren, insbesondere eine Ketose und erhöhte FFS, für die Entstehung von uterinen Erkrankungen wichtig seien. 2.5 Immun-endokrine Netzwerke In einem Review von Borghetti et al. (6) wird ausführlich beschrieben, dass die beidseitige Kommunikation zwischen dem Immun- und dem Neuroendokrinen System eine bedeutende Rolle in der metabolischen, produktiven und verhaltenstechnischen Homöostase spielt und dadurch die Effizienz der Immunantwort gegenüber infektiösen Agenzien und somit die Aufrechterhaltung der Gesundheit beeinflusst. Bestehende Ungleichgewichte auf hormoneller Ebene können zu einer erhöhten Empfänglichkeit für Erkrankungen und einem schweren Verlauf infektiöser Erkrankungen führen (102). Die enge Vernetzung von Nerven-, Immun- und Endokrinem System wird dadurch deutlich, dass zum Teil dieselben Proteine synthetisiert werden und die verschiedenen Systeme auch auf die gleichen Proteine reagieren können (6). Im Nervensystem reagiert der Hypothalamus auf höhere IGF-I-Konzentrationen mit einer erhöhten Ausschüttung von GHIH und einer verminderten GHRH20 Ausschüttung. Aber auch im Cerebellum, Hippocampus und Bulbus olfactorius sind hohe IGF-I-Konzentrationen nachweisbar (45). Im Immunsystem besitzen fast alle Zellen einen IGF-I-Rezeptor und in vitro reagieren selbst ausgereifte Leukozyten auf eine Stimulation mit IGF-I mit einer erhöhten Aktivität beispielsweise bei der Zytokinproduktion (8). Nach einer Stimulation mit IGF-I kommt es bei neutrophilen Granulozyten und Makrophagen zu einer Aktivitätssteigerung in Form einer erhöhten Ausschüttung von Zytokinen und einer erhöhten Bakterienzerstörungskapazität durch reaktive Sauerstoffspezies (6). Ferner wurde bei Mäusen nach Behandlung mit IGF-I und GH eine vermehrten Ansammlung von Immunzellen bei einer iatrogen erzeugten Peritonitis beobachtet (8). Speziell GH ist bei Rindern in der Lage, die TNF-α-Ausschüttung auf einen inflammatorischen Reiz hin zu senken (9). Somit sind in der Literatur viele Hinweise vorhanden, dass die Immunantwort sowohl auf humoraler als auch zellulärer Ebene durch GH und IGF-I moduliert wird (6, 8, 103). Aber nicht nur Hormone regulieren die Immunantwort, sondern GH produzierende Zellen der Hypophyse reagieren auch auf Produkte der Immunzellen wie beispielsweise das Zytokin Interleukin-1 (IL-1) (104). Bei Rindern ist beschrieben worden, dass es, vermittelt durch TNF-α, IL-1 und vermutlich PAMPs wie LPS, zur Reduktion der GH-Ausschüttung kommt (6, 56). Allerdings ist nach Carroll et al. (56) die Reaktion der Somatotropen Achse auf inflammatorische Zytokine und Produkte bei verschiedenen Spezies nicht einheitlich. So weisen Schweine und Schafe im Gegensatz zu Rindern während einer Infektion eine Entkopplung der GH-IGF-I-Achse auf, die mit hohen GH- und niedrigen IGF-I-Konzentrationen einhergeht. Dies geschieht, wie beschrieben, auch bei Milchkühen in der Transitperiode (23). Bei entzündlichen Erkrankungen kommt es allerdings nach Whitlock et al. (92) bei Rindern zu einer Depression der GH-Ausschüttung und nicht zu einer vermehrten Freisetzung. Der Einfluss von GH auf die Immunantwort wird jedoch kontrovers diskutiert. Zum einen zeigen GH knock out Mäuse, dass GH nicht für die Aufrechterhaltung der Immunfunktion notwendig ist, zum anderen scheint aber GH die immunsuppressiven Effekte von Glukokortikoiden in Stresssituationen zu kontrollieren (102, 105). Vor allem die durch eine GH-Resistenz und Entkopplung der Somatotropen Achse resultierenden reduzierten IGF-I-Konzentrationen verschieben nach Ansicht verschiedener Autoren (6, 56) die metabolischen und nutritiven Gegebenheiten hin zu einer Unterstützung der Immunantwort. 21 Nicht nur die Somatotrope Achse ist im Rahmen der immun-endokrinen Netzwerke zu erwähnen. Auch die Schilddrüse ist in Krankheitsgeschehen involviert und es kommt bei Säugetieren zu einem in der Literatur als Euthyreotes Krankheitssyndrom oder auch Nicht-Thyreodales-Erkrankungs-Syndrom (NTIS) beschriebenen Phänomen, bei dem die T4- und T3-Konzentrationen unter den Normalbereich absinken. Freies T4 und Thyreoidea stimulierendes Hormon (TSH) bleiben dagegen im Normalbereich (106). Dieses Euthyreote Krankheitssyndrom mit erniedrigten T 4Konzentrationen und normalen TSH-Werten konnte auch in Zusammenhang mit erhöhten Werten von FFS, der vermehrten Freisetzung von Zytokinen und auch der exogenen Verabreichung von Glukokortikoiden gezeigt werden. Ob es sich bei dem Euthyreoten Krankheitssyndrom um einen protektiven Mechanismus oder eine Störung handelt, wird diskutiert (106). Borghetti et al. (6) gehen davon aus, dass die bidirektionale Kommunikation über Zytokine, Hormone, Neurotransmitter und Neuropeptide es ermöglicht, die angeborene Immunantwort zu potenzieren, mögliche überschießende und damit schadhafte Effekte zu kontrollieren und die Immunantwort unterstützende, metabolische und nutritive Veränderungen zu aktivieren. Dabei betonen sie auch, dass bestehende Ungleichgewichte in den hormonellen Regelmechanismen zu einer erhöhten Infektionsanfälligkeit und einem schwereren Verlauf der Erkrankung führen können. Die Autoren (6) gehen davon aus, dass gerade das Verständnis der Änderungen der Somatotropen Achse neue Ansätze für eine therapeutische Unterstützung einer effizienteren Immunantwort geben könnte. 22 3 Material und Methode 3.1 Tiere Die für diesen Versuch verwendeten Tiere waren pluripare schwarzbunte Kühe der Rasse Holstein Friesian. Die Kühe wurden alle aus dem Großbetrieb der Agrargesellschaft mbH Siedenlangenbeck, Kuhfelde ausgewählt. Auf dem Betrieb wurden die Tiere in einem Boxenlaufstall gehalten und erhielten eine Totale Mischration (Tab. 1, 2, 3 und 4 im Tabellenanhang). Der Tierversuch wurde in Absprache mit dem Tierschutzbeauftragten der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover beim LAVES Oldenburg genehmigt (Aktenzeichen: 33.9-42502-04-09/1696). 3.2 Versuchsaufbau Der im Folgenden beschriebene Versuch gliederte sich in zwei Phasen: Die erste Phase (Antepartaler Zeitraum 3.2.1) begann am Tag der Probenahme (Auswahlprobe) auf dem Betrieb (240. bis 254. Tag p. insem.) bis hin zu einer in der Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover stattgefundenen Spontangeburt. Diesem Versuchsabschnitt lag die Fragestellung zugrunde, ob sich die Kühe in bestimmten hormonellen und metabolischen Parametern unterscheiden, die anhand der IGF-I-Konzentrationen in der Auswahlblutprobe selektioniert wurden. Maximal zwei Tiere wurden gleichzeitig vor dem 266. Tag p. insem. in die Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover gebracht und aufgestallt. Bei allen Tieren wurde bis zum 266. Tag p. insem. eine Klauenpflege durchgeführt. Ab dem 263. bis 266. Tag p. insem. wurde täglich morgens zwischen 7.30 und 8.30 Uhr Blut aus der Vena (V.) coccygea genommen. Die Geburt wurde als Zeitpunkt 0 definiert und die Proben retrospektiv zu diesem Zeitpunkt zugeordnet. Die Probe -1 wurde als die zuletzt genommene Probe an dem der Spontangeburt vorangegangen Morgen definiert. In der zweiten Phase des Versuches, der 30 Minuten nach dem spontanen Abgang der Nachgeburt begann, wurden die beiden ausgesuchten IGF-I-Gruppen hinsichtlich unterschiedlicher hormoneller und immunologischer Parameter als Reaktionen auf eine experimentell induzierte uterine Inflammation untersucht. Dieser Versuchsteil 23 bezieht sich auf einen Zeitraum bis 15 Stunden nach der Geburt und wird im Weiteren als „Postpartaler Zeitraum“ beschrieben (3.2.2; Abb. 1). 3.2.1 Antepartaler Zeitraum Die Versuchstiere wurden zwischen dem 240. und 254. Tag p. insem. auf Grundlage der Betriebsdaten und einer klinischen Untersuchung im Betrieb für die Entnahme der Auswahlprobe selektioniert. Die Tiere befanden sich in der zweiten bis vierten Trächtigkeit und in der vorherigen Laktation wurde eine durchschnittliche Milchleistung von 6000 bis 9500kg erbracht. Kühe mit einer Milchleistung von über 9.500kg wurden aus betriebswirtschaftlichen Gründen nicht beprobt. Die Tiere wurden, wie bereits beschrieben, klinisch untersucht (Habitus, Haltung, Bewegung, Fellveränderungen, Ekzeme, Bursitiden, palpatorische Euterkontrolle und Fruchtgegenstoß) und bei mittel- bis hochgradigen pathologischen Befunden, wie einer Lahmheit vom Grad ≥ 2, nicht beprobt. Zudem wurde darauf geachtet, dass sich die Tiere einheitlich in Bezug auf den Body Condition Score (BCS) darstellten. Es wurde eine Blutprobe aus der V. coccygea entnommen und in ein Serumröhrchen und ein mit EDTA als Antikoagulanz beschichtetes Röhrchen (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) gefüllt. Für die Glutaraldehydprobe (GAP) wurden 3 ml Blut in ein mit Glutardialdehyd und EDTA vorbereitetes Röhrchen (Klinisches Labor, Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, Deutschland) gegeben und alle 30 Sekunden geschwenkt, um eine Koagulation in den ersten drei Minuten beurteilen zu können. Die GAP galt als positiv, wenn eine Koagulation in den ersten drei Minuten auftrat. Tiere mit einer positiven GAP (≤ 3 Minuten) wurden vom weiteren Versuch ausgeschlossen. Die Selektion der Versuchstiere, die in die Klinik für Rinder verbracht wurden, erfolgte im Weiteren auf Grundlage der am nachfolgenden Tag bestimmten IGF-IKonzentration wie unter 3.3.1. beschrieben. 3.2.2 Postpartaler Zeitraum Nach dem spontanen Abgang der Nachgeburt wurde der postpartale Entzündungsversuch mit intrauteriner LPS- oder Natrium Chlorid (NaCl)-Infusion durchgeführt 24 (Abb. 1). Hierfür wurde eine 39°C warme LPS-Lösung in den Uterus infundiert. Unmittelbar vor der LPS-Infusion und in 30 minütigen Abständen nach der LPS-Infusion wurde Blut aus der V. jugularis entnommen. Die Tiere wurden 180 Minuten nach der LPS-Infusion euthanasiert und Gewebeproben zur Auswertung entnommen. Die Blutproben wurden mit den Zeitpunkten relativ zur Uterusinfusion zum Zeitpunkt 0 Minuten gekennzeichnet. In den LPS-Versuch wurden lediglich Tiere einbezogen, die bis zum Zeitpunkt der Spontangeburt klinisch gesund waren und bei denen während der Geburt nur eine geringgradige Haltungskorrektur und/oder leichte Zughilfe durchgeführt werden musste. Zudem war Bedingung für die Aufnahme in die Auswertung, dass die Nachgeburt innerhalb von 12 Stunden nach der Entwicklung des Kalbes ausgestoßen wurde. Die Tiere, bei denen die Einschlusskriterien zum Versuch nicht erfüllt waren, wurden als „Kontrolltiere“ zu den Tieren mit einer LPS-Infusion verwendet. In diesem Fall wurde lediglich geprüft ob sich statistische Unterschiede innerhalb ausgewählter Blutparameter (IGF-I, GH, Cortisol, Adrenocorticotropes Hormon (ACTH), T 4, T3, Progesteron (P4), E2, Prostaglandin F2α Metabolit (PGFM) und Insulin) zwischen Tieren, die eine LPS-Infusion bzw. eine NaCl-Infusion erhielten, bestanden. Weil die Tiere nicht die Einschlusskriterien für die LPS-Gruppe erfüllten, handelt es sich um keine tatsächliche Kontrollgruppe und sie werden im Folgenden als NaCl-Gruppe bezeichnet. Die NaCl-Gruppe erhielt 12 Stunden nach der Geburt einen Liter auf 39°C erwärmte physiologische Natriumchloridlösung (0,9% NaCl, Braun, Melsungen, Deutschland) nach dem Protokoll des LPS-Versuches in den Uterus infundiert. Anschließend wurden im gleichen Zeitintervall wie beim LPS-Versuch Blutproben genommen. Zudem wurde bei allen Tieren des postpartalen Versuches die Körperinnentemperatur, Atem- und Herzfrequenz bestimmt, um bei der späteren Auswertung einen Effekt der LPS-Infusion gegenüber einer NaCl-Infusion beurteilen zu können. Die Tiere der NaCl-Gruppe wurden nach dem Versuch nicht euthanasiert. Die IGF-I-, GH-, Cortisol-, P4- und PGFM-Konzentration wurde aus allen genommenen Proben gemessen (Abb. 2). Insulin, E2, T4, T3 und ACTH wurde nur in ausgewählten Proben bestimmt (siehe Abb. 2). In der Auswahlprobe vom Betrieb, der ersten Blutprobe zwischen dem 263. bis 266. Tag p. insem. und der Blutprobe am Tag der Geburt wurden die freien Fettsäuren bestimmt. 25 Blutprobenentnahme auf dem Betrieb zwischen den Tagen 240 bis 254 Tag post inseminationem (p. insem.) Antepartaler Zeitraum IGF-I-Bestimmung >175ng/ml <125ng/ml IGF-I niedrige Gruppe (n=10) IGF-I hohe Gruppe (n=10) Transport in die Klinik der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover zwischen den Tagen 250 bis 265 p. insem. Tägliche Blutprobenentnahme ab dem 263. bis 266. Tag p. insem. bis zur Geburt Geburt Postpartaler Zeitraum Geburtshilfe durch maximal eine Person, Tier gesund und Abgang der Nachgeburt innerhalb von 12 Stunden LPS-Infusion IGF-I niedrige Gruppe Blutproben nach 0, 30, 60, 90, 120, 150 und 180 Minuten Geburtshilfe durch zwei Personen, Tier vorher erkrankt oder Nachgeburtsverhaltung Geburtshilfe durch maximal eine Person, Tier gesund und Abgang der Nachgeburt innerhalb von 12 Stunden NaCl-Infusion LPS-Infusion IGF-I hohe Gruppe Blutproben nach 0, 30, 60, 90, 120, 150 und 180 Minuten Blutproben nach 0, 30, 60, 90, 120, 150 und 180 Minuten Euthanasie und Gewebeentnahme nach 180 Minuten Euthanasie und Gewebeentnahme nach 180 Minuten Abb. 1: Versuchsablauf während des antepartalen und postpartalen Zeitraums. LPS: Lipopolysaccharid; IGF-I: Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor; NaCl: Natriumchlorid 26 Antepartaler Zeitraum Postpartaler Zeitraum Auswahlblutprobe IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM, Ins, T4, T3, E2 Tag -17 IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM, Ins, T4, T3, E2 Tag -16 IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM Tag -15 IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM, Ins, T4, T3, E2 Tag -14 IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM Tag -13 IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM, Ins, T4, T3, E2 Tag -12 IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM Tag -11 IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM, Ins, T4, T3, E2 Tag -10 IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM Tag -9 IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM, Ins, T4, T3, E2 Tag -8 IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM Tag -7 IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM, Ins, T4, T3, E2 Tag -6 IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM Tag -5 IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM, Ins, T4, T3, E2 Tag -4 IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM Tag -3 IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM, Ins, T4, T3, E2 Tag -2 IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM Tag -1 IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM, Ins, T4, T3, E2 Tag 0 (Geburt) IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM, Ins Versuch 0 Min IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM, Ins, T4, T3, E2 Versuch 30 Min IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM, ACTH Versuch 60 Min IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM, Ins, T4, T3, E2 Versuch 90 Min IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM Versuch 120 Min IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM, Ins, T4, T3, E2 Versuch 150 Min IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM, ACTH Versuch 180 Min IGF-I, GH, P4, Cor, PGFM, Ins, T4, T3, E2 Abb. 2: Art und zeitliches Schema der Blutprobenanalyse während des antepartalen und postpartalen Zeitraums. IGF-I: Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor; GH: Wachstumshormon; P4: Progesteron; Cor: Cortisol; PGFM: 13,14-dihydro-15-keto-PGF2α; Ins: Insulin; T4: Thyroxin; T3: Trijodthyronin; E2: 17β-Östradiol; ACTH: Adrenocorticotropes Hormon 27 3.3 Antepartaler Zeitraum 3.3.1 Auswahlkriterien der Versuchstiere Im Anschluss an die Probennahmen im Stall wurden die Blutproben bei 2000 x g zentrifugiert (EBA 20, Hettich, Tuttlingen, Deutschland) und das Serum bzw. Plasma in ein Eppendorfgefäß überführt, auf Eis gekühlt transportiert und bis zur Analyse bei -20°C eingefroren. Für die IGF-I-Einteilung wurde im Endokrinologischen Labor die IGF-I-Konzentration mittels eines für bovines Plasma etablierten kommerziellen ELISA erfasst (IGF-I ELISA; Beckman Coulter, California, USA; siehe 3.6.1). Es wurde ein Grenzwert von 131,5 ng/ml angenommen, basierend auf der Arbeit von Piechotta et al. (10). Anschließend wurden Tiere ausgewählt, deren IGF-IKonzentration möglichst weit vom beschriebenen Grenzwert entfernt lagen und in eine IGF-I hohe bzw. IGF-I niedrige Gruppe eingeteilt. Die ausgewählten Tiere wurden zwischen dem 249. bis 265. Tag p. insem. in die Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover transportiert. In der Klinik wurden die Versuchstiere in mit Stroh eingestreuten Einzelboxen aufgestallt. Die Fütterung bestand aus Heu ad libitum, 15 kg Maissilage und 3 kg Milchleistungsfutter (ForFarmers Bela GmbH, Vechta-Langförden, Deutschland). Alle Tiere hatten freien Zugang zu Wasser. 3.3.2 Einstallung Nach dem Transport in die Klinik für Rinder fand eine klinische Allgemeinuntersuchung der Tiere statt und es wurde Blut für eine klinisch-chemische Blutanalyse entnommen. Im Klinischen Labor der Klinik für Rinder wurden ein rotes und ein weißes Blutbild erstellt und die folgenden klinisch chemischen Parameter gemessen: Gesamt Eiweiß, Gesamt Bilirubin (GB), Aspartat-Aminotransferase (AST), γ-Glutamyltransferase (GGT), Glutamatdehydrogenase (GLDH), Creatininkinase (CK), Cholesterin, Harnstoff (HST), Kreatinin, Albumin (ALB), Calcium, Magnesium, Phosphor, Selen, Natrium, Kalium und Chlorid. Außerdem wurde nach vorheriger Gabe von Clenbuterol (Planipart®, Boeringer Ingelheim, Deutschland) eine Klauenpflege durchgeführt und, falls notwendig, erfolgte eine lokale Behandlung einer bestehenden Dermatitis interdigitalis nach Reinigung der betroffenen Stellen mit Animedazon®Spray (AniMedica GmbH; Senden-Bösensell, Deutschland). 28 3.3.3 Blutprobennahme vor der Geburt Ab dem 263. bis 266. Tag p. insem. wurde täglich eine Blutprobe zwischen 7.30 und 8.30 Uhr aus der Schwanzvene (V. coccygea) entnommen und in ein mit EDTA beschichtetes und ein unbeschichtetes Serumröhrchen (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) gefüllt. Die Proben wurden 30 Minuten (min) bei Raumtemperatur belassen und anschließend bei 2000 x g für 15 min zentrifugiert. Das gewonnene Serum bzw. Plasma lagerte bis zur weiteren Bearbeitung bei -20°C. 3.4 Geburtsüberwachung Zur Geburtszeitbestimmung wurden sowohl klinische als auch labortechnische Parameter genutzt. Klinisch wurden ab dem 266. Tag täglich mindestens drei Mal die Festigkeit der Beckenbänder, die Entwicklung eines Euterödems und die Schwellung der Vulva beurteilt. Im Labor wurde täglich die Progesteronkonzentration aus dem Serum mittels Chemilumineszenz-Immunoassay (Immunlite®, Siemens Diagnostics, Bad Nauheim, Deutschland) gemessen. Da nach Matsas et al. (107) die Progesteronwerte 12 bis 24 Stunden vor der Geburt unter 2 ng/ml absinken, wurde bei Unterschreiten dieses Grenzwertes oder bei hochgradiger Erweichung der Beckenbänder die Frequenz der Kontrollen auf mindestens einmal in 2 Stunden erhöht. Für eine visuelle Kontrolle der Tiere wurde eine Kamera im Stall angebracht und die Tiere von einem Nebenraum aus beobachtet. Das Bild wurde mit dem Programm SkypeTM (Skype Limited, Luxemburg) dargestellt. Am Beginn der Austreibungsphase wurde manuell die Haltung, Stellung und Lage des Kalbes kontrolliert. Bei gestreckter Haltung, oberer Stellung und Vorderendlage wurde auf ein sofortiges helfendes Eingreifen verzichtet und der Geburtsverlauf weiter beobachtet. Bei Haltungsanomalien wurde versucht diese zu korrigieren und anschließend Geburtshilfe geleistet. Bei einer Hinterendlage wurde Geburtshilfe von einer Person geleistet. Tiere mit Auszughilfe von mehr als einer Person oder mit medikamenteller Intervention wurden vom Versuch ausgeschlossen und in die NaClGruppe einbezogen. Direkt nach der Geburt wurden die Kälber in einer separaten Kälberbox untergebracht und versorgt. Die Kühe wurden im Anschluss an die Geburt mit einer Eimermelkanlage im Stall gemolken. 29 In einem Untersuchungsstand wurden bei den Kühen 30 Minuten nach Entwicklung des Kalbes aus der V. jugularis Blut in Lithium-Heparin beschichtete, EDTA beschichtete und Serumröhrchen (Vacutainer®, BD, Franklin Lakes, NJ, USA) entnommen. Die EDTA- und Lithium-Heparin-Röhrchen wurden direkt auf Eis gestellt und unverzüglich, wie unter 3.3.3 beschrieben, zentrifugiert und gelagert. Das Serum wurde nach 30 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert und eingefroren. Prophylaktisch wurde dem Tier 6,84 g Kalzium (entsprechen 150 ml Calcitat S 50®, aniMedica, Senden-Bösensell, Deutschland) subkutan direkt nach der Geburt appliziert und der Abgang der Nachgeburt im Stall mittels Kameraüberwachung von einem Nebenraum aus abgewartet. 3.5 Postpartaler Zeitraum 3.5.1 Bakterielle Untersuchung Nach Abgang der Nachgeburt wurde diese auf Vollständigkeit und physiologischen Zustand geprüft. Aus dem Uterus wurde 30 Minuten nach Abgang der Nachgeburt eine Tupferprobe (Uterustupfer für Stuten, Minitüb, Tiefenbach, Deutschland) nach Reinigung des äußeren Genitales entnommen. Der sterile Tupfer wurde durch die Zervix manuell geführt und anschließend aus der Schutzhülle vorgeschoben und das Corpus uteri beprobt. Der Tupfer wurde in Amies Medium (Heinz Herenz, Hamburg, Deutschland) bei 4°C gelagert und zur weiteren Untersuchung nach ein bis drei Tagen in das Diagnostische Labor des Institutes für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover gebracht. Die Proben wurden auf das Vorkommen von aeroben und anaeroben Bakterien inklusive Anaerobier getestet und die Anzahl nachgewiesener Keime vom Institut semiquantitativ in gering-, mittel- oder hochgradig eingestuft. Die semiquantitative Einteilung fand nach subjektiven Erfahrungswerten der Mitarbeiter des Institutes für Mikrobiologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover statt. 3.5.2 Durchführung des LPS-Versuchs Ein Liter einer auf 39°C erwärmten physiologischen NaCl Lösung (Braun, Melsungen, Deutschland) mit 5 mg LPS (E. coli O55:B5, Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA, Endkonzentration 5 µg/ml) wurde mittels eines Infusionsgeräts (LDKS 30 Oversan, Industries Biomedica S.P.A., Gemonio, Italien) in den Uterus infundiert. Direkt vor und in 30 minütigen Abständen nach der LPS-Infusion wurden Blutentnahmen (s. 3.4 Geburtsüberwachung) und Bestimmungen der rektalen Körperinnentemperatur, Atem- und Herzfrequenz durchgeführt. Die Atemfrequenz wurde durch Auszählen der Atemzüge und die Herzfrequenz mit Hilfe eines Stethoskops an der linken Körperseite jeweils über einen Zeitraum von 15 Sekunden bestimmt. Nach 180 Minuten wurden die Kühe mittels intravenöser Injektion von 30.000 mg PentobarbitalNatrium (Release®, WDT, Garbsen, Deutschland) euthanasiert. Die Kühe wurden an den Hinterbeinen aufgehängt und zwei bis fünf cm kranial des Euteransatzes der Bauchraum durch einen transversalen Schnitt auf einer Länge von ca. 50 cm eröffnet und der Uterus kaudal der Zervix abgesetzt und komplett aus dem Bauchraum zur Beprobung entnommen. Für die Immunhistologie wurde ein Stück von dorsal aus dem tragenden Horn geschnitten. Anschließend wurden Leber- und Fettgewebe von der Bauchwand beprobt. Vom Rücken der Kühe wurde auf Höhe des 3. Lendenwirbels ein Stück aus dem langen Rückenmuskel (Musculus longissimus dorsi) von dorsal entnommen und von allen Geweben jeweils ein 1 x 1 x 1 cm großes Stück in Formalin fixiert. 3.6 Laboranalysen 3.6.1 IGF-I Die IGF-I-Konzentration wurde mittels eines kommerziellen IGF-I ELISA (Active IGF-I ELISA; Beckman Coulter, CA, USA) bestimmt. Durch eine Proteinfällung mit saurem Ethanol wurde IGF-I aus den Bindungsproteinen freigesetzt. Nach einer 30 minütigen Inkubationszeit mit anschließender Zentrifugation (30 Minuten, 4000 x g, Heraeus Varifuge 3.0R, Kendro, Osterode, Deutschland) wurde der Überstand pH neutralisiert im Assay eingesetzt und das IGF-I mittels eines ELISA auf Basis des sogenannten „Sandwich-Prinzips“ bestimmt. Hierzu wurden zu bestimmende Proben, Standardproben und Kontrollen in Kavitäten einer mit einem gegen IGF-I gerichteten Antikörper beschichteten Mikrotiterplatte pipettiert. Ein zweiter mit Meerrettichperoxidase-gekoppelter Antikörper band im Folgenden an IGF-I. Anschließend wurde nach einem Waschschritt Substrat hinzugegeben und nach erfolgtem Farbumschlag die Reaktion mit einer Schwefelsäure gestoppt. Die optische Dichte wurde mittels 31 Spectra II (Tecan Group Ltd, Männedorf, Schweiz) bei 450 nm gemessen und mit dem Programm Magellan Software mit Cubic Spline Mode (Magellan 3.11, Dortmund, Germany) ausgewertet. Die Konzentration der Proben wurde durch Vergleich mit einer Standardkurve ermittelt. Der Messbereich lag zwischen 10 und 450 ng/ml mit einer analytischen Sensitivität von 0,03 ng/ml und die Intra- und InterAssay Variationskoeffizienten betrugen 3,5% bzw. 8,5%. 3.6.2 Wachstumshormon Die GH-Konzentrationen wurden mit einem ELISA, beschrieben von Roh et al. (108) und Kawashima et al. (71), mit folgenden Modifikation bestimmt (Protokoll siehe Anhang 9.1 Wachstumshormon): Zu einer mit Antikörper gegen Kaninchen-Immunglobulin (Physiologie, Technische Universität München, Weihenstephan, Deutschland) beschichteten 96 Well Mikrotiterplatte (Nunc, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) wurde der spezifisch gegen ovines GH gerichtete Antikörper (100 µl, 1:20, rabbit anti-oGH-3, Lot# AFP0802210Rb; National Hormone & Peptide Program (NHPP), NIDDK, and Dr. Parlow, Torrance, California, USA) pipettiert und für 24 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Der Überstand wurde anschließend dekantiert und 1% Hühnerserum (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA), verdünnt in Assaypuffer (100 µl), zu jedem Well hinzugefügt. GH Standard (15 µl; 0,78 – 100 ng/ml, NIDDKbGH, AFP-10325C), verdünnt in Assaypuffer, bzw. die zu untersuchenden Plasmaproben wurden in den Wells für 24 Stunden inkubiert. Nach einem Waschschritt wurde an Biotin (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) gekoppeltes GH hinzugefügt und für 3 h bei Raumtemperatur inkubiert. Schließlich wurde Streptavidin-Peroxidase für 15 Minuten (Steptavidin-POD; Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) und Substrat für 40 Minuten bei 37°C inkubiert. Nach dem Stoppen der Reaktion mit Schwefelsäure wurde die Optische Dichte bei 450 nm mittels Spectra II (Tecan Group Ltd, Männedorf, Schweiz) gemessen und die Konzentrationen gegen die Standardkurve berechnet (Magellan 3.11, Dortmund, Deutschland). Die Intra- und Inter-Assay Variationskoeffizienten betrugen 9,8% bzw. 12,6% und der untere Messbereich lag bei 2 ng/ml. 32 3.6.3 Cortisol Die Cortisolkonzentrationen wurden mittels Chemilumineszenz-Immunoassay im Analyseautomaten Immulite® (Siemens Diagnostics, Eschborn, Deutschland) aus Serumproben bestimmt. Die Messung basierte auf einem kompetitiven Immunoassay. Dabei konkurrierte Cortisol in der zu messenden Probe mit Cortisol, konjugiert mit alkalischer Phosphatase, um Antikörperbindungsstellen an einer Kugel im Testtube, beschichtet mit polyklonalen Kaninchen-Antikörpern gegen Cortisol. Die alkalische Phosphatase setzte Adamantyl 1,2-dioxetane Arylphosphat durch Abspaltung einer Phosphatgruppe zu Adamantyldioxtan um, dessen Zerfall eine anhaltende, messbare Lichtemission bedingte, die zur Cortisolmenge der zu messenden Probe umgekehrt proportional war. Im Vergleich zu einer Standardkurve wurde anschließend die Konzentration berechnet. Das verwendete Kit für Cortisol hatte die Katalognummer LKCO1. Der untere Messbereich betrug 2 ng/ml, die analytischen Sensitivität 2 ng/ml. Die Intra- und Inter-Assay Variationskoeffizienten lagen zwischen 5,8% und 8,8% bzw. 6,3% und 10,0%. 3.6.4 Adrenocorticotropes Hormon Die Konzentration des ACTH wurde mittels Chemilumineszenz-Immunoassay im Analyseautomaten Immulite® (Siemens Diagnostics, Eschborn, Deutschland) aus Serumproben bestimmt. Das Testprinzip basiert auf einem Sandwich ELISA. Die im Testtube vorhandene Kugel war mit monoklonalen Maus-Antikörpern gegen ACTH beschichtet. Die zu messende Probe wurde dazugegeben und ACTH band an die Antikörper. Im zweiten Schritt wurde ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper, konjugiert mit alkalischer Phosphatase gegen ACTH, dazugegeben und reagierte mit dem gebundenen ACTH. Im dritten Schritt setzte die vorhandene alkalische Phospatase Adamantyl 1,2-dioxetane Arylphosphat durch Abspaltung einer Phosphatgruppe zu Adamantyldioxtan um, dessen Zerfall eine anhaltende, messbare Lichtemission bedingte. Die Lichtemission war zum ACTH der Probe proportional und wurde im Vergleich zu einer Standardkurve berechnet. Das verwendete Kit für ACTH hatte die Katalognummer LKAC1. Der untere Messbereich betrug 5 pg/ml und die analytische Sensitivität 9 pg/ml. Die Intra- und Inter-Assay Variationskoeffizienten lagen zwischen 3,1% und 9,6% bzw. 5,1% und 9,4%. 33 3.6.5 Thyroxin und Trijodthyronin Thyroxin und Trijodthyronin wurden im Blutserum mittels ChemilumineszenzImmunoassay im Analyseautomaten Immulite® (Siemens Diagnostics, Eschborn, Deutschland) gemessen. Das Prinzip ist ein kompetitiver Immunoassay, wie unter 3.6.3 beschrieben. Die verwendeten Teste hatten die Katalognummern LKCT1 für T4 und LKT31 für T3. Der untere Messbereich betrug für T4 und für T3 0,5 µg/dl bzw. 40 ng/dl. Die analytische Sensitivität lag bei 0,12 µg/dl für T4 bzw. 35 ng/ml für T3. Die Intra- und Inter-Assay Variationskoeffizienten betrugen für T4 10,8% bzw. 13,8% und für T3 13,2% bzw. 15,6%. 3.6.6 Insulin Die Insulinkonzentration im Serum wurde mit einem Immunoradiometrischen Assay (IRMA; Insuline IRMA KIT, Beckman Coulter, California, USA) bestimmt. Der IRMA beruht auf dem Sandwich Prinzip. Die Proben sowie die Standardproben und Kontrollen wurden in einem Röhrchen mit an der Wandung festsitzenden monoklonalen Mausantikörpern gegen Insulin zusammen mit I125-markierten Mausantikörpern gegen Insulin für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Der Überstand wurde abgesaugt und die counts per minute (cpm) mit einem Gamma-Counter (Perkin Elmer, Waltham, Massachusetts, USA) gemessen. Die cpm waren proportional zur Menge des Insulins in der Probe und wurden im Vergleich zu einer Standardkurve berechnet. Der untere Messbereich lag bei 3 µIU/ml. Die Intra- und Inter-Assay Variationskoeffizienten betrugen 7,6% bzw. 10,7%. 3.6.7 17β-Östradiol 17β-Östradiol wurde mittels eines Festphasen Radioimmunoassays (RIA) (Coat-acount Estradiol, TKE21, Siemens Diagnostics, Eschborn, Deutschland) aus Serumproben bestimmt. Dafür wurden mit einem Kaninchen-Antikörper gegen E2 beschichtete Röhrchen verwendet. Die zu messende Probe wurde mit 200 µl I125-markiertem E2 im Röhrchen inkubiert. An der Röhrchenwandung konkurrierte natives E2 mit I125markiertem E2 um Antikörperbindungsstellen. Der Überstand wurde dekantiert und die cpm gemessen, die umgekehrt proportional zur Konzentration waren. Die Messung fand mit einem Gamma-Counter (Perkin Elmar, Waltham Massachusetts, USA) 34 statt und wurde im Vergleich zu einer Standardkurve berechnet. Der untere Messbereich für E2 betrug 20 pg/ml, die analytische Sensitivität lag bei 8 pg/ml und die Intra- und Inter-Assay Variationskoeffizienten differierten zwischen 4,0% und 7,0% bzw. 6,7% und 9,4%. 3.6.8 Progesteron Die Progesteronkonzentrationen aus dem antepartalen Zeitraum wurden mit dem Analyseautomaten Immulite® (Siemens Diagnostics, Eschborn, Deutschland) bestimmt, um die Messergebnisse taggleich zu erhalten. Das Messprinzip entspricht dem unter 3.6.4 für ACTH beschriebenen Verfahren. Die verwendete KIT Nummer war LKPG1. Der untere Messbereich betrug 0,1 ng/ml mit einer analytischen Sensitivität von 0,2 ng/ml und Intra- und Inter-Assay Variationskoeffizienten von 6,3% – 16% bzw. 5,8% – 16%. Die Progesteronkonzentrationen der Blutprobe Geburt und des postpartalen Zeitraumes wurden mittels Festphasen RIA (Coat-a-count Progesterone, TKPG1, Siemens Healthcare Diagnostics, Los Angeles, USA) und mit einem Gamma-Counter (Perkin Elmer, Waltham Massachusetts, USA) gemessen. Das Messprinzip entspricht dem unter 3.6.7 für E2 beschriebenen. Der untere Messbereich für Progesteron lag bei 0,02 ng/ml mit einer analytischen Sensitivität von 0,02 ng/ml. Die Intra- und Inter-Assay Variationskoeffizienten betrugen 4,0% bzw. 7,6%. 3.6.9 13,14-dihydro-15-keto-PGF2α Die Konzentration an 13,14-dihydro-15-keto-PGF2α (PGFM) wurde mittels eines kompetitiven Enzym Immunoassay, beschrieben von Guven et al. (109) und Mishra et al. (110), bestimmt (Protokoll siehe Anhang 9.2 PGFM). Das PGFM-Meerrettichperoxidase Konjugat und Antiserum wurden von Herrn Prof. Meyer (Physiologie Weihstephan, Technische Universität München, Freisingen, Deutschland) bezogen. Für die Standardkurve wurde PGFM von Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) verwendet. Das benutze Antiserum hatte eine minimale Kreuzreaktion mit den anderen verwandten Prostaglandinen (PGE2, PGEM, PGA2, PGAM und PGF2α jeweils <0,01%). Der untere Messbereich betrug 50 pg/ml. Die Intra- und Inter-Assay Variationskoeffizient lagen bei 3,5% bzw. 11,4%. 35 3.6.10 Freie Fettsäuren Die FFS wurden mit einem automatisierten Analysegerät für klinische Chemie (ABX Pentra 400, Horiba, Montpellier, Frankreich) im Klinischen Labor der Klinik für Rinder bestimmt. Die Messung erfolgt durch eine colorimetrische enzymatische Reaktion mit den FFS-Konzentrationen (Intra-Assay Variationskoeffizient 6,2%). 3.6.11 Lipopolysaccharide Für den LPS-Nachweis aus Lithium-Heparin-Plasma der ersten 5 Tiere aus der LPSGruppe wurde der kommerzielle limulus amebocyte lysate endochrome™ Assay (Charles River, Charleston, USA; Protokoll im Anhang 9.3 LPS) genutzt. Die Plasmaproben wurden mit LPS-freiem Wasser (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) 1:10 verdünnt und für 5 Minuten auf 80°C erhitzt, um negative Einflüsse von Plasmabestandteilen auf die Agglutinationseigenschaften zu verhindern. Das bakterielle Endotoxin LPS initiiert eine Aktivierung eines Proenzyms, das in Anwesenheit eines farblosen Substrates die Spaltung eines Chromophors bewirkt und gelbes para-Nitroanilin freisetzt. Die Färbung wurde bei 405 nm im Photometer Spectra II (Tecan Group Ltd, Männedorf, Schweiz) gemessen und gegen eine Standardreihe mit dem Programm Magellan Software mit (Cubic Spline Mode, Magellan 3.11, Dortmund, Deutschland) ausgewertet. Der untere Messbereich lag bei 38 pg/ml und die Wiederfindungsrate bei 63%. 3.7 Histologie Die Gewebeproben wurden nach 48 Stunden Formalinfixierung (Formalin nach Lillie) für Einbettungskapseln (Leica, Wetzlar, Deutschland) zugeschnitten und anschließend für mindestens drei Stunden in fließendem Leitungswasser gewässert. Durch einen Einbettautomaten (Leica, Wetzlar, Deutschland) wurden die Proben vorbereitet und anschließend in Paraffin (Leica, Wetzlar, Deutschland) gegossen. Mit einem Rotationsmikrotom (LEICARM2025, Leica, Wetzlar, Deutschland) wurden 3 µm dicke Schnitte angefertigt und auf Objektträger gebracht. Zur histologischen Begutachtung wurden von den Geweben Hämatoxylin-Eosin (HE-) Färbungen ange- 36 fertigt (Kurzprotokoll: 15 min Hämatoxylin (Roth, Karlsruhe, Deutschland), 2 Minuten 0,5% Eosin (Roth, Karlsruhe, Deutschland)). Für die Immunhistologie wurden die Schnitte von 3 µm Dicke auf Histobond Objektträger (Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Deutschland) gezogen. Die Schnitte wurden nach folgendem Protokoll im Anhang 9.4 Histologie entparaffiniert und gefärbt. Um eine geeignete Konzentration für den GHR-Antikörper zu finden, wurde eine Verdünnungsreihe (1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1000) mit dem Antikörper durchgeführt und mit einer Verdünnung von 1:200 weiter gearbeitet. Kontrollschnitte wurden mit Mausserum (Millipore, Billerica, Massachusetts, USA) in einer äquivalenten Verdünnung (1:200) überschichtet um Kreuzreaktionen mit dem Mausserum des GHR auszuschließen. Die Auswertung und Aufnahmen erfolgten am Mikroskop Olympus BX60 (Olympus, Hamburg, Deutschland) mit einer aufgesetzten Kamera (Olympus XC50, Olympus, Hamburg, Deutschland). Die Auswertung der Proben erfolgte in der Leber durch Auszählung der Vakuolen im HE-Schnitt und des GHR mittels Immunhistologischem semiquantitativem Scoresystem (0-3). Bei diesen Ergebnissen erfolgte eine Auswertung hinsichtlich der Fragestellung, ob Unterschiede zwischen IGF-I hohen und IGF-I niedrigen Tieren bestanden. 3.8 Statistik Die Daten wurden in Excel (Microsoft, Redmond, Washington, USA) gesammelt und sortiert und die statistische Auswertung wurde mit dem Programm SAS 9.3 (SAS Institute Inc., Cary North Carolina, USA) durchgeführt. Die Messdaten wurden in die Zeit bis zur Geburt und den Versuch unterteilt. Die Tiere wurden entsprechend ihrem IGF-I-Auswahlwert vor der Geburt in die Gruppen IGF-I hoch und IGF-I niedrig eingeteilt. Ein direkter Vergleich der Gruppen wurde am Tag der Auswahl und mit den Blutbildern am Tag der Einstallung in die Klinik für Rinder durchgeführt. Bei den wiederholt gemessenen Daten wurden Zeitpunkte mit weniger als vier Blutproben pro Gruppe ausgeschlossen (Tag -24 bis -18). Somit befinden sich im Zeitraum bis zur Geburt die Tage -17 bis 0 mit dem Auswahlwert. Für den Versuch wurden die Tiere in die Gruppen IGF-I hoch, IGF-I niedrig und NaCl eingeteilt. In diesen Zeitraum wurden die Proben 0 bis 180 Minuten einbezogen. 37 Alle Werte wurden auf Normalverteilung hin geprüft. Durch Logarithmieren (natürlicher Logarithmus) konnte für die Parameter Insulin und FFS aus den Auswahlproben und für die Parameter HKT, GB und GLDH aus den Blutbildern eine Normalverteilung erreicht werden. Weiterhin ließ sich für Cortisol, ACTH, T 4, E2 und PGFM im postpartalen Zeitraum durch Logarithmieren (natürlicher Logarithmus) jeweils eine Normalverteilung erzielen. Für die Auswahlproben und die Blutproben am Tag der Einstallung wurden alle Parameter mittels Student‘s T-test verglichen. Eine Normalverteilung durch mathematische Umformung konnte nicht für die Parameter Natrium in den Blutbildern, GH, Cortisol und E2 bei den Auswahlproben erreicht werden. Bei diesen Werten wurde ein Wilcoxon Rangsummentest für nicht parametrische Daten zum Vergleich durchgeführt. Für die mikrobiologischen Ergebnisse wurde für die jeweiligen Bakterienspezies ein Χ2-Test durchgeführt. Die Tupferproben wurden zum einen nach den Gruppen IGF-I hoch und IGF-I niedrig vor Geburt und zum anderen nach einer LPS- und reiner NaCl Applikation eingeteilt. Für die wiederholten Messungen aus der Zeit vor der Geburt und während des Versuches wurde in SAS 9.3 das Model „PROC MIXED“ mit der Freiheitsgradmethode nach Satterthwaite gewählt, für nicht parametrische Verteilungen das Model „PROC MIXED MODEL=MIVQUE0“, ebenfalls mit der Freiheitsgradmethode nach Satterthwaite. Aus den Strukturmodellen „compound symmetry“ (CS), „first order autoregressive“ (AR(1)), „variance compounds” (VC), „heterogeneous AR(1)” (ARH(1)), „first order ante dependence” (ANTE(1)), „Toeplitz” (TOEP), „Huynh-Feldt” (HF) und „unstructured” (UN) wurde auf der Basis der „covariance parameters” (PARMS), „Bayesian information criterion” (BIC) und „Aikaike information criterion” (AIC) das Modell mit der niedrigsten Abweichung von 0 ausgesucht. Die Grafiken wurden mit dem Programm SigmaPlot for Windows 8.02 (SSI, San Jose, California, USA) aus Schätzwerten mit Standardfehlern des Rechenmodels SAS PROC MIXED erstellt. Der Wert P < 0,05 wurde als statistisch signifikant angenommen. 38 4 Ergebnisse 4.1 Tiere Insgesamt wurden 158 Tiere zwischen den Tagen 240 und Tag 255 p. insem. auf dem Milchkuhbetrieb Siedenlangenbeck untersucht. Von 151 dieser untersuchten Tiere wurden Blutproben genommen, eine GAP durchgeführt und die IGF-IKonzentration bestimmt. Bei 26 Tieren war GAP nach 3 Minuten positiv. Bei 32 Tieren wurde eine Lahmheit (≥Grad 2) diagnostiziert. Insgesamt wurden 20 Tiere über den Zeitraum von einem Jahr (Juli 2010 bis Juli 2011) nach Rücksprache mit dem Betrieb ausgewählt und für das weitere Versuchsprozedere in die Klinik für Rinder der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover verbracht. 4.2 Antepartaler Zeitraum Es wurden jeweils 10 Tiere für die Gruppen IGF-I hoch und IGF-I niedrig ausgewählt. Die Blutproben für die Auswahl der Tiere wurden zwischen den Tagen 240 und 254 p. insem. genommen. Der Transport der Tiere in die Klinik für Rinder erfolgte zwischen den Tagen 249 und 265 p. insem. (Einzeldaten zu den Versuchstieren sind in Tab. 5 im Tabellenanhang dargestellt). Die 20 Versuchstiere unterschieden sich zum Zeitpunkt der Auswahl im IGF-I-Wert (101,1 ± 16,3 ng/ml vs. 208,3 ± 30,8 ng/ml; P < 0,001; Mittelwerte ± SD) und in der Serumkonzentration der FFS (5,57 ± 0,64 ln µmol/l vs. 5,04 ± 0,35 ln µmol/l; P = 0,032). Die Cortisolkonzentration war tendenziell bei den Kühen mit IGF-I niedrigen Werten höher (P = 0,095; Tab. 6 im Tabellenanhang). Die folgenden Parameter unterschieden sich nicht signifikant zwischen den Gruppen: GH, T4, T3, P4, E2, Insulin und PGFM. Das durchschnittliche Gewicht, der BCS, die Milchleistung in der vorangegangenen Laktation und das Alter der Tiere waren ebenfalls bei beiden Gruppen gleich (P > 0,05; Tab. 7 im Tabellenanhang). Das Tier mit der Nummer 425/11 wurde zehn Tage nach der Einstallung aufgrund gesteigerter Aggressivität vom Versuch ausgeschlossen und auf den Betrieb zurück gebracht. Hinsichtlich der klinisch-chemischen Parameter am Tag der Einstallung (Tab. 8 im Tabellenanhang) ergaben sich folgende Unterschiede: die HST-Konzentration war bei den Tieren der IGF-I hohen Gruppe höher als bei denen der IGF-I niedrigen 39 Gruppe (5,1 ± 0,9 mmol/l vs. 3,6 ± 0,6 mmol/l; P < 0,001). Weiterhin war die Anzahl der Leukozyten in der IGF-I hohen Gruppe höher als in der IGF-I niedrigen Gruppe (11960 ± 1983 /µl vs. 10460 ± 1001 /µl; P = 0,048). Gesamtbilirubin war bei den Tieren der IGF-I hohen Gruppe niedriger als bei denen der IGF-I niedrigen (3,1 ± 0,8 µmol/l vs. 4,4 ± 1,7 µmol/l; P = 0,034). Tiere der IGF-I hohen Gruppe hatten höhere Magnesiumkonzentrationen als diejenigen der IGF-I niedrigen Gruppe (1,05 ± 0,10 mmol/l vs. 0,94 ± 0,09 mmol/l; P = 0,025). 4.2.1 IGF-I Hinsichtlich der IGF-I-Konzentration wurde zum einen geprüft, inwiefern sich die Konzentrationen geordnet nach den Besamungstagen unterschieden. Um zu prüfen, ob es sich um ein von der Geburt abhängiges Phänomen handelt, wurden die IGF-IKonzentrationen auch retrospektiv zum Tag der Geburt sortiert und ausgewertet. Die mittlere IGF-I-Konzentration über den gesamten Untersuchungszeitraum in der IGF-I hohen Gruppe war, geordnet nach den Besamungstagen, für den gesamten Zeitraum höher als in der IGF-I niedrigen Gruppe (90,4 ± 7,2 ng/ml vs. 55,7 ± 7,8 ng/ml; P = 0,003; Abb. 3a). Es ergaben sich für die einzelnen Tage bis zum 275. Tag p. insem. signifikant höhere Werte in der IGF-I hohen Gruppe. Retrospektiv hinsichtlich des Tages der Geburt sortiert, wies die IGF-I hohe Gruppe über den gesamten Zeitraum ebenfalls höhere mittlere IGF-I-Konzentrationen im Vergleich zur IGF-I niedrigen Gruppe auf (101,3 ± 6,9 ng/ml vs. 62,1 ± 7,3 ng/ml; P < 0,001; Abb. 3b). Signifikant höhere IGF-I-Konzentrationen der IGF-I hohen Gruppe waren im Vergleich zur IGF-I niedrigen Gruppe bis zum Tag -6 vor der Geburt zu verzeichnen. In beiden Gruppen kam es zu einem Abfall der IGF-I-Konzentration bis zur Geburt, mit der niedrigsten IGF-I-Konzentration am Tag der Geburt (P < 0,001). Die IGF-IKonzentration sank in der IGF-I hohen im Vergleich zur IGF-I niedrigen Gruppe stärker ab (Gruppe*Zeit: P < 0,001). 40 a 250 IGF-I hohe Gruppe (n=10) IGF-I niedrige Gruppe (n=9) *** IGF-I (ng/ml) 200 150 Gruppe Zeit Gruppe*Zeit ** ** ** ** ** ** ** ** * 100 P = 0,003 P < 0,001 P < 0,001 * 50 26 6 26 7 26 8 26 9 27 0 27 1 27 2 27 3 27 4 27 5 27 6 27 7 27 8 27 9 28 0 28 1 28 2 24 0 -2 54 0 b Tage p. insem. 250 IGF-I hohe Gruppe (n=10) IGF-I niedrige Gruppe (n=9) *** IGF-I (ng/ml) 200 150 ** Gruppe Zeit Gruppe*Zeit ** ** ** *** *** ** ** * * 100 * P < 0,001 P < 0,001 P < 0,001 * 50 0 -1 -3 -2 -5 -4 -7 -6 -9 -8 -1 7 -1 6 -1 5 -1 4 -1 3 -1 2 -1 1 -1 0 -4 2 bi s -2 6 0 Tage relativ zur Geburt Abb. 3: (a) Insulin-like Growth Factor-I (IGF-I)-Konzentrationen an den Tagen post inseminationem (p. insem.) und (b) relativ zum Tag der Geburt (Tag 0) in Gruppen mit unterschiedlichen IGF-I-Konzentrationen an den Tagen -42 bis -26 (IGF-I hoch versus IGF-I niedrig). Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen an den Tagen sind wie folgt gekennzeichnet: * P < 0,05; ** P < 0,01; *** P < 0,001. Die Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt. 41 4.2.2 Wachstumshormon Die GH-Konzentration stieg zum Zeitpunkt der Geburt an. Die GH-Konzentrationen zwischen den beiden IGF-I-Gruppen und auch die zeitlichen Verläufe unterschieden sich nicht signifikant voneinander (Abb. 4). 30 IGF-I hohe Gruppe (n=10) IGF-I niedrige Gruppe (n=9) 25 GH (ng/ml) 20 Gruppe Zeit Gruppe*Zeit 15 P = 0,920 P < 0,001 P = 0,537 10 5 -4 2 bi s 0 -1 -3 -2 -5 -4 -7 -6 -9 -8 -1 7 -1 6 -1 5 -1 4 -1 3 -1 2 -1 1 -1 0 -2 6 0 Tage relativ zur Geburt Abb. 4: Wachstumshormon (Growth Hormone, GH) Konzentrationen relativ zur Geburt in Gruppen mit unterschiedlichen IGF-I-Konzentrationen an den Tagen -42 bis -26 (IGF-I hoch versus IGF-I niedrig). Die Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt. 42 4.2.3 Schilddrüsenhormone Die mittleren Thyroxinserumkonzentrationen waren in der IGF-I hohen Gruppe im gesamten Zeitraum höher als in der IGF-I niedrigen Gruppe (3,4 ± 0,1 µg/dl vs. 2,9 ± 0,1 µg/dl; P = 0,005; Abb. 5). Die IGF-I hohe Gruppe hatte gegenüber der IGF-I niedrigen Gruppe signifikante höhere T4-Konzentrationen an den Tagen -13 bis Tag -5. In beiden Tiergruppen kam es zu einem Abfall der T4-Konzentration bis zum Zeitpunkt der Geburt (P < 0,001). Dabei unterschieden sich die Verläufe der Konzentrationen in den beiden IGF-I-Gruppen nicht signifikant voneinander. Hinsichtlich der T3-Konzentrationen bestanden vor der Geburt keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen. In der IGF-I niedrigen Gruppe war T3 am Tag -15 gegenüber dem Tag der Auswahl (P = 0,001) und dem Tag 0 deutlich niedriger (P = 0,030; Abb. 5). Die T3-Konzentrationen änderten sich dagegen in der IGF-I hohen Gruppe antepartal nicht (P > 0,05). Berechnet man allerdings lediglich den Zeitraum, in dem bei allen Werte vorlagen, entsprechend von Tag -9 bis zum Tag -1, war im Verlauf (Interaktion Gruppe*Zeit) ein Abfall der T3-Konzentrationen in der IGF-I hohen Gruppe gegenüber einem Anstieg in der IGF-I niedrigen Gruppe nachweisbar (P = 0,017). Allerdings war über den gesamten betrachteten Zeitraum von Tag -17 an, kein signifikanter Unterschied zwischen den IGF-I-Gruppen in den Verläufen vorhanden. 43 5,0 IGF-I hohe Gruppe (n=10) IGF-I niedrige Gruppe (n=9) 4,5 * 4,0 ** a T4 (µl/dl) ** 3,5 ** * 3,0 Gruppe Zeit Gruppe*Zeit P = 0,005 P < 0,001 P = 0,186 Gruppe Zeit Gruppe*Zeit P = 0,301 P = 0,033 P = 0,707 2,5 2,0 -1 -3 -5 -7 -9 -1 1 -1 3 -1 5 -1 7 bi s -2 6 1,5 -4 2 Tage relativ zur Geburt 150 IGF-I hohe Gruppe (n=10) IGF-I niedrige Gruppe (n=9) 140 b T3 (ng/dl) 130 120 110 100 90 -4 2 bi s -1 -3 -5 -7 -9 -1 1 -1 3 -1 5 -1 7 -2 6 80 Tage relativ zur Geburt Abb. 5: (a) Thyroxin- (T4) und (b) Trijodthyronin- (T3) Konzentrationen relativ zum Tag der Geburt (Tag 0) in Gruppen mit unterschiedlichen IGF-I-Konzentrationen an den Tagen -42 bis -26 (IGF-I hoch versus IGF-I niedrig). Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen an einem Tag sind wie folgt gekennzeichnet: * P < 0,05; ** P < 0,01. Die Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt. 44 4.2.4 Cortisol Die Cortisolkonzentration im antepartalen Versuchszeitraum war bei den Tieren der IGF-I hohen Gruppe niedriger als in der IGF-I niedrigen Gruppe (5,2 ± 0,6 ng/ml vs. 7,4 ± 0,7 ng/ml; P = 0,024). In beiden IGF-I-Gruppen stiegen zum Zeitpunkt der Geburt die Cortisolkonzentrationen an (Abb. 6), dabei unterschieden sich die zeitlichen Verläufen (Interaktion Gruppe*Zeit) nicht signifikant voneinander. 25 *** IGF-I hohe Gruppe (n=10) IGF-I niedrige Gruppe (n=9) Cortisol (ng/ml) 20 15 Gruppe Zeit Gruppe*Zeit P = 0,024 P < 0,001 P = 0,429 10 5 -4 2 bi s 0 -1 -3 -2 -5 -4 -7 -6 -9 -8 -1 7 -1 6 -1 5 -1 4 -1 3 -1 2 -1 1 -1 0 -2 6 0 Tage relativ zur Geburt Abb. 6: Cortisolkonzentrationen relativ zum Tag der Geburt (Tag 0) in Gruppen mit unterschiedlichen IGF-I-Konzentrationen an den Tagen -42 bis -26 (IGF-I hoch versus IGF-I niedrig). Signifikante Unterschiede zum vorherigen Tag sind wie folgt gekennzeichnet: *** P < 0,001. Die Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt. 45 4.2.5 Progesteron Die Progesteronkonzentrationen im antepartalen Zeitraum unterschieden sich zwischen den IGF-I-Gruppen nicht signifikant. Es gab einen Abfall zwischen den Tagen -2 und -1 (P < 0,001). 8 IGF-I hohe Gruppe (n=10) IGF-I niedrige Gruppe (n=9) Progesteron (ng/ml) 6 Gruppe Zeit Gruppe*Zeit 4 P = 0,526 P < 0,001 P = 0,580 *** 2 -4 2 bi 0 -1 -3 -2 -5 -4 -7 -6 -9 -8 -1 7 -1 6 -1 5 -1 4 -1 3 -1 2 -1 1 -1 0 s -2 6 0 Tage relativ zur Geburt Abb. 7: Progesteronkonzentrationen relativ zum Tag der Geburt (Tag 0) in Gruppen mit unterschiedlichen IGF-I-Konzentrationen an den Tagen -42 bis -26 (IGF-I hoch versus IGF-I niedrig). Signifikante Unterschiede zum vorherigen Tag sind wie folgt gekennzeichnet: *** P < 0,001. Die Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt. 46 4.2.6 17β-Östradiol Die E2-Konzentrationen stiegen in beiden Versuchsgruppen zwischen der Auswahlprobe und der Geburt an und wiesen die höchste E2-Konzentration am Tag der Geburt auf (Abb. 8). Dabei sind die E2-Konzentrationen und die zeitlichen Verläufen bei beiden IGF-I-Gruppen vergleichbar. 1200 IGF-I hohe Gruppe (n=10) IGF-I niedrige Gruppe (n=9) 1000 E2 (pg/ml) 800 Gruppe Zeit Gruppe*Zeit 600 P = 0,148 P < 0,001 P = 0,365 400 200 -4 2 bi s -1 -3 -5 -7 -9 -1 1 -1 3 -1 5 -1 7 -2 6 0 Tage relativ zur Geburt Abb. 8: 17β-Östradiolkonzentrationen (E2) relativ zum Tag der Geburt (Tag 0) in Gruppen mit unterschiedlichen IGF-I-Konzentrationen an den Tagen -42 bis -26 (IGF-I hoch versus IGF-I niedrig). Die Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt. 47 4.2.7 13,14-dihydro-15-keto-PGF2α Die PGFM-Konzentration stieg vom Tag -2 zum Tag -1 (P = 0,016) und vom Tag -1 zum Tag 0 an (P < 0,001; Abb. 9). Zwischen den beiden ausgewählten IGF-IGruppen und auch innerhalb der zeitlichen Verläufe beider IGF-I-Gruppen waren die PGFM-Konzentrationen vergleichbar (P > 0,05). 3000 IGF-I hohe Gruppe (n=10) IGF-I niedrige Gruppe (n=9) *** 2500 PGFM (ng/ml) 2000 Gruppe Zeit Gruppe*Zeit 1500 P = 0,818 P < 0,001 P = 0,999 1000 * 500 -4 2 bi 0 -1 -3 -2 -5 -4 -7 -6 -9 -8 -1 7 -1 6 -1 5 -1 4 -1 3 -1 2 -1 1 -1 0 s -2 6 0 Tage relativ zur Geburt Abb. 9: Prostaglandin F2α Metabolit (PGFM) relativ zum Tag der Geburt (Tag 0) in Gruppen mit unterschiedlichen IGF-I-Konzentrationen an den Tagen -42 bis -26 (IGF-I hoch versus IGF-I niedrig). Signifikante Unterschiede zwischen den Tagen sind wie folgt gekennzeichnet: * P < 0,05; *** P < 0,001. Die Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt. 48 4.2.8 Insulin Vor der spontanen Geburt (Tag 0) sank die Insulinkonzentration in beiden Gruppen im Verlauf der Zeit ab (P < 0,001; Abb. 10). Jedoch war kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden IGF-I-Gruppen und innerhalb der zeitlichen Verläufe der Insulinkonzentrationen erkennbar. 18 IGF-I hohe Gruppe (n=10) IGF-I niedrige Gruppe (n=9) 16 Insulin (pg/ml) 14 12 10 Gruppe Zeit Gruppe*Zeit 8 P = 0,155 P < 0,001 P = 0,111 6 4 2 0 -1 -3 -5 -7 -9 -1 1 -1 3 -1 5 -1 7 bi s -2 6 0 -4 2 Tage relativ zur Geburt Abb. 10: Insulinkonzentrationen relativ zum Tag der Geburt (Tag 0) in Gruppen mit unterschiedlichen IGF-I-Konzentrationen an den Tagen -42 bis -26 (IGF-I hoch versus IGF-I niedrig). Die Ergebnisse der statistischen zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt. 49 Analyse mittels 4.2.9 Freie Fettsäuren Die FFS stiegen von der Auswahlprobe (Tag 242 bis 254 p. insem.) über den Tag der ersten Blutprobe in der Klinik (Tag 263 bis 266 p. insem.) bis hin zur Geburt (Tag 271 bis 288 p. insem.) in beiden IGF-I-Gruppen an (P < 0,001; Abb. 11). Dabei waren die FFS in der IGF-I hohen Gruppe tendenziell niedriger verglichen mit denen der IGF-I niedrigen Gruppe (653,3 ± 91,9 µmol/l vs. 903,1 ± 96,8 µmol/l; P = 0,061). In den zeitlichen Verläufen (Interaktion Gruppe*Zeit) ergaben sich zwischen den beiden Versuchsgruppen keine signifikanten Unterschiede. 2500 IGF-I hohe Gruppe (n=10) IGF-I niedrige Gruppe (n=9) e FFS (µmol/l) 2000 cd de 1500 bc 1000 ab 500 a 0 240 - 254 263 - 266 271 - 288 Tag p. insem. Abb. 11: Konzentrationen der freien Fettsäuren (FFS) in Gruppen mit unterschiedlichen IGF-I-Konzentrationen am Tag der Eingruppierung der Tiere, d.h. an den Tagen 240 – 254 post inseminationem (p. insem.). Der 263. – 266. Tag p. insem. entspricht dem ersten Tag der Blutentnahme in der Klinik für Rinder und der 271. – 288. Tag p. insem. dem Tag der Geburt; Werte mit verschiedenen Buchstaben unterscheiden sich (P < 0,05). 50 4.3 Geburt Bis zur Spontangeburt wurde täglich von 19 Tieren (IGF-I hoch n = 10; IGF-I niedrig n = 9) Blut abgenommen. Die Geburt ließ sich über die Bestimmung der P4Konzentration mit dem zugrundegelegten Grenzwert von 2 ng/ml bei 15 der 19 Kühe auf 24 Stunden eingrenzen. Die Kuh 1193/10 hatte keinen deutlichen Rückgang 19 Stunden vor der Geburt (P4 am Tag -1: 3,1 ng/ml). Weiterhin wies die Kuh 46/11 einen P4-Wert von 2,5 ng/ml auf, war aber im Vergleich zum Vortag um 1,8 ng/ml gesunken. Dagegen besaß die Kuh 174/11 bereits 10 Tage vor der Geburt einen P 4Wert von 1,9 ng/ml und in den folgenden Tagen zwischen 2,1 und 1,3 ng/ml, die P4Konzentration fiel aber am Tag -1 deutlich auf 0,7 ng/ml ab. Die Kuh 175/11 hatte am Tag -2 bereits einen Wert von 1,9 ng/ml und am darauffolgenden Tag (18 Stunden vor der Geburt) den nahezu identischen Wert von 1,8 ng/ml. Geburtshilfe mit einem mittelschweren Auszug (2 Personen) musste lediglich bei dem Tier 45/11 durchgeführt werden. Aufgrund der verstärkten Manipulation wurde die Kuh anschließend vom LPS-Versuch ausgeschlossen. Bei den anderen Tieren wurden maximal durch eine Person Zughilfen bzw. Stellungskorrekturen vorgenommen. Die Geburtsgewichte der Kälber unterschieden sich nicht (P > 0,05) zwischen den Kühen der IGF-I hohen Gruppe (44,6 ± 6,3 kg; n = 10) und denen der IGF-I niedrigen Gruppe (47,1 ± 6,2 kg; n = 9). Bei den gesunden Tieren, die eine intrauterine LPS-Infusion erhielten, waren die Nachgeburten vor der Infusion vollständig ausgestoßen worden. 4.4 Postpartaler Zeitraum 4.4.1 Bakterielle Untersuchung Die nach spontanem Abgang der Nachgeburt bzw. nach 12 Stunden genommene Tupferprobe von den 19 Tieren, bei denen eine Spontangeburt in der Klinik für Rinder begleitet wurde, wurden bakteriologisch sowohl auf aerobe als auch anaerobe Bakterien untersucht. Eine detaillierte Auflistung der bakteriellen Untersuchungsergebnisse ist in der Tab. 9 im Tabellenanhang dargestellt. Signifikante Unterschiede konnten lediglich bei einer Bakterienspezies nachgewiesen werden: In der IGF-I niedrigen Gruppe war deutlich häufiger der Keim Clostridium perfringens im Uterus nachweisbar als in der IGF-I hohen Gruppe (0/10 vs. 6/9; P = 0,003). 51 4.4.2 LPS-Versuch Insgesamt wurden sieben von 19 Tieren vom LPS-Versuch ausgeschlossen. Aus der IGF-I hohen Gruppe entwickelte ein Tier zwei Tage vor der Geburt eine linksseitige Labmagenverlagerung, bei einem Tier musste schwere Zughilfe geleistet werden und zwei Tiere wurden aufgrund einer diagnostizierten Nachgeburtsverhaltung ausgeschlossen. In der Gruppe IGF-I niedrig wurden drei Tiere aufgrund einer diagnostizierten Nachgeburtsverhaltung vom weiteren Versuchsablauf ausgeschlossen. Daraus ergaben sich pro IGF-I-Gruppe je sechs Tiere im LPS-Versuch und folgende NaCl-Tiere: IGF-I hoch n = 4 und IGF-I niedrig n = 3. Bei den gemessenen Puls- und Atemfrequenzen gab es zwischen den Gruppen und den Zeitpunkten nach LPS- bzw. NaCl-Gabe keine signifikanten Unterschiede (Tab. 10 und 11 im Tabellenanhang). Die Kühe aus der Gruppe IGF-I hoch und NaCl zeigten zwischen 0 und 180 Minuten einen Anstieg der Körperinnentemperatur von 39,2 ± 0,2°C auf 39,8 ± 0,2°C (P = 0,002) bzw. von 38,8 ± 0,2°C auf 39,2 ± 0,2°C (P = 0,028). Die Temperatur der Tieren aus der Gruppe IGF-I niedrig stieg tendenziell von 39,0 ± 0,2°C auf 39,4 ± 0,2°C an (P = 0,056). Zwischen den Gruppen IGF-I hoch und niedrig bzw. zwischen allen Kühen mit einer LPS-Infusion und den Kühen der NaCl-Gruppe, sowie hinsichtlich der zeitlich bedingten Änderungen ergaben sich keine Unterschiede (P > 0,05) in der Körpertemperatur (Abb. 12). 52 IGF-I hohe Gruppe (n=6) IGF-I niedrige Gruppe (n=6) NaCl Gruppe (n=7) 40,0 Temperatur (°C) 39,8 39,6 Gruppe Zeit Gruppe*Zeit 39,4 39,2 P = 0,485 P = 0,003 P = 0,451 39,0 38,8 38,6 38,4 0 30 60 90 120 150 180 Minuten Abb. 12: Körperinnentemperatur während des Versuches in den Gruppen mit unterschiedlichen IGF-I-Werten an den Tagen 240 – 254 post inseminationem (IGF-I hoch versus IGF-I niedrig) und der NaCl-Gruppe relativ zum Zeitpunkt der Uterusinfusion (0) von LPS (IGF-I-Gruppen) bzw. Kochsalzlösung (NaCl). Die Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt. 4.4.2.1 Somatotrope Achse Die IGF-I- und Wachstumshormonkonzentrationen waren zwischen den Tiergruppen vergleichbar. Nach LPS-Gabe gab es weder in Abhängigkeit von IGF-I- noch von den GH-Konzentrationen eine Veränderung. Auch die zeitlich bedingten Änderungen (Interaktion Gruppe*Zeit) waren bei den verschiedene Tiergruppen gleich (P > 0,05; Abb. 13). 53 40 IGF-I hohe Gruppe (n=6) IGF-I niedrige Gruppe (n=6) NaCl Gruppe (n=7) 35 a IGF-I (ng/ml) 30 25 20 15 Gruppe Zeit Gruppe*Zeit 10 P = 0,954 P = 0,209 P = 0,449 5 0 30 60 90 120 150 180 Minuten 40 IGF-I hohe Gruppe (n=6) IGF-I niedrige Gruppe (n=6) NaCl Gruppe (n=7) 35 Gruppe Zeit Gruppe*Zeit P = 0,708 P = 0,148 P = 0,348 b GH (ng/ml) 30 25 20 15 10 5 0 30 60 90 120 150 180 Minuten Abb. 13: Konzentrationen des (a) Insulin-like Growth Factors-I (IGF-I) und des (b) Wachstumshormons (Growth Hormone, GH) während des Versuchs in den Gruppen mit unterschiedlichen IGF-I-Werten an den Tagen 240 – 254 post inseminationem (IGF-I hoch versus IGF-I niedrig) und der NaCl-Gruppe relativ zur Infusion der Uteruslösung (0) mit LPS (IGF-I-Gruppen) bzw. Kochsalzlösung (NaCl). Die Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt. 54 4.4.2.2 Schilddrüsenhormone Die T4-Konzentrationen waren zwischen den LPS-Gruppen und der NaCl-Gruppe vergleichbar. Nach der LPS-Gabe kam es zu keiner signifikanten Veränderung der T4-Konzentrationen (Abb. 14a). Bei dem direkten Vergleich der IGF-I-Gruppen ergab sich ein Unterschied hinsichtlich der zeitlichen Verläufe. Die T4-Konzentrationen stiegen in der IGF-I hohen Gruppe an, während sie bei den IGF-I niedrigen Tiere abfielen (Interaktion Gruppe*Zeit P = 0,018; nicht dargestellt, entspricht aber der Abb. 14a ohne die NaCl-Gruppe). Die T3-Konzentrationen waren bei allen drei Gruppen vergleichbar. Die Werte der T3Konzentrationen unterschieden sich auch innerhalb der IGF-I-Gruppen nicht (P > 0,05; Abb. 14b). 55 0,55 IGF-I hohe Gruppe (n=6) IGF-I niedrige Gruppe (n=6) NaCl Gruppe (n=7) 0,50 a ln [T4 (µg/dl)] 0,45 Gruppe Zeit Gruppe*Zeit 0,40 P = 0,116 P = 0,931 P = 0,994 0,35 0,30 0,25 0 60 120 180 Minuten 180 Gruppe Zeit Gruppe*Zeit IGF-I hohe Gruppe (n=6) IGF-I niedrige Gruppe (n=6) NaCl Gruppe (n=7) P = 0,618 P = 0,914 P = 0,941 b T3 (ng/ml) 160 140 120 100 80 0 60 120 180 Minuten Abb. 14: (a) Logarithmierte Thyroxin- (T4) und (b) Trijodthyronin- (T3) Konzentrationen während des Versuches in den Gruppen mit unterschiedlichen IGF-I-Werten an den Tagen 240 – 254 post inseminationem (IGF-I hoch versus IGF-I niedrig) und der NaCl-Gruppe relativ zum Zeitpunkt der uterinen Infusion (0) von LPS (IGF-IGruppen) bzw. Kochsalzlösung (NaCl). Die Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt. 56 4.4.2.3 Progesteron Die Progesteronkonzentration sank zwischen 0 und 180 Minuten nach der uterinen LPS- bzw. NaCl-Infusion tendenziell ab (P = 0,06; Abb. 15). Sowohl zwischen den beiden IGF-I-Gruppen, als auch zwischen den LPS-Gruppen und der NaCl-Gruppe waren keine Unterschiede (P > 0,05) festzustellen. Die zeitlichen Verläufe (Interaktion Gruppe*Zeit) nach der intrauterinen Infusion waren in allen drei Gruppen ähnlich (P > 0,05). 0,6 IGF-I hohe Gruppe (n=6) IGF-I niedrige Gruppe (n=6) NaCl Gruppe (n=7) Progesteron (ng/ml) 0,5 0,4 Gruppe Zeit Gruppe*Zeit P = 0,523 P = 0,063 P = 0,849 0,3 0,2 0,1 0 60 120 180 Minuten Abb. 15: (a) Progesteronkonzentrationen während des Versuches in den Gruppen mit unterschiedlichen IGF-I-Werten an den Tagen 240 – 254 post inseminationem (IGF-I hoch versus IGF-I niedrig) und der NaCl-Gruppe relativ zum Zeitpunkt der intrauterinen Infusion (0) von LPS (IGF-I-Gruppen) bzw. Kochsalzlösung (NaCl). Die Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt. 57 4.4.2.4 17β-Östradiol Während des 180 minütigen postpartalen Untersuchungszeitraums kam es zu einem Absinken der E2-Konzentrationen in allen drei Versuchsgruppen (P < 0,001; Abb. 16). Zwischen den beiden IGF-I-Gruppen sowie zwischen den LPS-Gruppen und der NaCl-Gruppe bestanden keine Unterschiede (P > 0,05) in den E 2-Konzentrationen. Die zeitlichen Verläufe (Interaktion Gruppe*Zeit) der E2-Konzentrationen waren bei den drei Gruppen vergleichbar (P > 0,05). 5,6 IGF-I hohe Gruppe (n=6) IGF-I niedrige Gruppe (n=6) NaCl Gruppe (n=7) 5,4 5,2 ln [E2 (pg/ml)] 5,0 Gruppe Zeit Gruppe*Zeit 4,8 4,6 P = 0,466 P < 0,001 P = 0,624 4,4 4,2 4,0 3,8 3,6 0 60 120 180 Minuten Abb. 16: Logarithmierte 17β-Östradiolkonzentrationen (E2) während des Versuches in den Gruppen mit unterschiedlichen IGF-I-Werten an den Tagen 240 – 254 post inseminationem (IGF-I hoch versus IGF-I niedrig) und der NaCl-Gruppe relativ zum Zeitpunkt der intrauterinen Infusion (0) von LPS (IGF-I-Gruppen) bzw. Kochsalzlösung (NaCl). Die Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt. 58 4.4.2.5 13,14-dihydro-15-keto-PGF2α In den Gruppen IGF-I hoch und IGF-I niedrig gab es in den ersten 60 Minuten nach LPS-Gabe einen Anstieg der PGFM-Konzentrationen, während in der NaCl-Gruppe keine Änderung dieses Hormons zu verzeichnen waren (IGF-I hohe Gruppe: 7,34 ± 0,23 vs. 7,91 ± ,023 ln ng/ml; P = 0,001; IGF-I niedrige Gruppe 7,55 ± 0,23 vs. 8,00 ± 0,23 ln ng/ml; P = 0,011; NaCl-Gruppe 7,57 ± 0,21 vs. 7,74 ± 0,21 ln ng/ml; P > 0,05; Abb. 17). 8,4 IGF-I hohe Gruppe (n=6) IGF-I niedrige Gruppe (n=6) NaCl Gruppe (n=7) 8,2 ln [PGFM (ng/ml)] 8,0 7,8 Gruppe Zeit Gruppe*Zeit 7,6 7,4 P = 0,651 P < 0,001 P = 0,175 7,2 7,0 6,8 6,6 0 30 60 90 120 150 180 Minuten Abb. 17: Logarithmierte Prostaglandin F2α Metaboliten (PGFM) während des Versuches in den Gruppen mit unterschiedlichen IGF-I-Werten an den Tagen 240 – 254 post inseminationem (IGF-I hoch versus IGF-I niedrig) und der NaCl-Gruppe relativ zum Zeitpunkt der intrauterinen Infusion (0) von LPS (IGF-I-Gruppen) bzw. Kochsalzlösung (NaCl). Die Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt. 59 4.4.2.6 Cortisol und Adrenocorticotropes Hormon Hinsichtlich der Cortisolkonzentrationen war im Vergleich der beiden IGF-I-Gruppen, bei denen LPS infundiert wurde, gegenüber der NaCl-Gruppe kein Unterschied festzustellen (P > 0,05; Abb.18). Dagegen unterlagen die Cortisolkonzentrationen innerhalb aller Gruppen zeitlich bedingten Änderungen: In der IGF-I hohen Gruppe blieben die Cortisolkonzentration in den ersten 150 Minuten nach der Infusion konstant (P > 0,05). Erst 180 Minuten post infusionem war in dieser Tiergruppe ein Anstieg zu verzeichnen (P = 0,009; Abb. 18). In der IGF-I niedrigen Gruppe fiel Cortisol in den ersten 30 Minuten nach der intrauterinen Infusion ab (P = 0,002). Ein signifikanter Anstieg gegenüber dem Zeitpunkt 30 Minuten fand bereits 150 Minuten post infusionem statt (P = 0,005). In der NaCl-Gruppe änderte sich die Cortisolkonzentration 120 Minuten nach der uterinen Infusion nicht (P > 0,05) und sank dann ab (P = 0,04). Die ACTH-Konzentrationen stiegen im zeitlichen Verlauf zwischen den gemessenen Zeitpunkten 30 und 150 Minuten post infusionem in beiden LPS-Gruppen im Vergleich zur NaCl-Gruppe an (Tab. 12 im Tabellenanhang; Interaktion Gruppe*Zeit: P = 0,039). Allerdings waren bei alleiniger Betrachtung der Gruppen und der Zeitpunkte keine signifikanten Unterschiede der ACTH-Konzentrationen festzustellen. Die IGF-I hohe Gruppe wies niedrigere Cortisolkonzentrationen auf als die IGF-I niedrige Gruppe (2,0 ± 0,1 vs. 2,4 ± 0,1 ln (ng/ml); P = 0,032; graphisch nicht dargestellt, entspricht aber der Abb. 18 ohne die NaCl-Gruppe). Ferner war der Cortisolanstieg in der IGF-I niedrigen Gruppe zwischen 30 und 150 Minuten post infusionem signifikant (1,88 ± 0,19 vs. 2,62 ± 0,19 ln ng/ml; P = 0,006), nicht aber in der IGF-I hohen Gruppe (1,77 ± 0,19 vs. 1,97 ± 0,19 ln ng/ml; P = 0,457). Die Cortisolkonzentrationen zeigten in beiden IGF-I-Gruppen während des 180-minütigen Untersuchungszeitraum die gleichen Änderungen (P > 0,05). 60 3,2 IGF-I hohe Gruppe (n=6) IGF-I niedrige Gruppe (n=6) NaCl Gruppe (n=7) 3,0 ln [Cortisol (ng/ml)] 2,8 2,6 2,4 Gruppe Zeit Gruppe*Zeit 2,2 P = 0,043 P = 0,007 P = 0,053 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 0 30 60 90 120 150 180 Minuten Abb. 18: Logarithmische Cortisolkonzentrationen während des Versuches in den Gruppen mit unterschiedlichen IGF-I-Werten an den Tagen 240 – 254 post inseminationem (IGF-I hoch versus IGF-I niedrig) und der NaCl-Gruppe relativ zum Zeitpunkt der intrauterinen Infusion (0) von LPS (IGF-I-Gruppen) bzw. Kochsalzlösung (NaCl). Die Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt. 61 4.4.2.7 Insulin Bei den Insulinkonzentrationen findet ein tendenzieller Anstieg zwischen den Zeitpunkten 120 und 180 Minuten statt (Abb. 19). Nach den Gruppen aufgeteilt, kommt es in der IGF-I niedrigen Gruppe zu einem Anstieg von 13,9 ± 2,9 auf 20,2 ± 4,0 pg/ml (P = 0,003). In der IGF-I hohen Gruppe ist lediglich ein Anstieg von 8,37 ± 2,90 auf 11,89 ± 3,98 pg/ml zu beobachten (P = 0,076). In der NaCl-Gruppe kam es zu keiner Änderung der Insulinkonzentration. 35 IGF-I hohe Gruppe (n=6) IGF-I niedrige Gruppe (n=6) NaCl Gruppe (n=7) 30 Insulin (pg/ml) 25 20 Gruppe Zeit Gruppe*Zeit 15 P = 0,218 P = 0,052 P = 0,161 10 5 0 0 60 120 180 Minuten Abb. 19: Insulinkonzentrationen während des LPS-Versuches in den Gruppen mit unterschiedlichen IGF-I-Werten an den Tagen 240 – 254 post inseminationem (IGF-I hoch versus IGF-I niedrig) und der NaCl-Gruppe relativ zum Zeitpunkt der intrauterinen Infusion (0) von LPS (IGF-I-Gruppen) bzw. Kochsalzlösung (NaCl). Die Ergebnisse der statistischen Analyse mittels zweifaktorieller ANOVA sind in Textform im Kästchen dargestellt. 62 4.4.2.8 Lipopolysaccharide Bei den ersten 5 Tieren, denen LPS intrauterin infundiert worden war, konnte kein LPS im Blut nachgewiesen werden. Die weiteren Tiere wurden aus finanziellen Aspekten und aufgrund einer Literaturangabe (85), die einen Nachweis von LPS mit dem angegebenen Test unwahrscheinlich erschienen ließen, nicht weiter untersucht. 4.5 Histologie 4.5.1 Übersichtsfärbung Die lichtmikroskopische Betrachtung der Endometriumproben in der Übersichtsfärbung mit HE ergab, dass im dorsalen Teil des graviden Uterushorns bei allen Präparaten mehr oder weniger das Oberflächenepithel in weiten Teilen vom Endometrium abgelöst und zum Teil auch nicht mehr vorhanden war. Weiterhin waren in den Blutgefäßen des uterinen Gewebes und im Endometrium vermehrt polymorphkernige Zellen zu erkennen. Myometrium und Perimetrium stellten sich gewebetypisch dar. Zwischen den beiden IGF-I-Gruppen waren morphologisch keine Unterschiede sichtbar. Im Lebergewebe konnte eine Vakuolisierung der Hepatozyten bei insgesamt 10 der 12 Tiere nachgewiesen werden, wobei kein Unterschied (P > 0,05) in der Häufigkeit des Vorkommens zwischen den Gruppen mit hohen und niedrigen IGF-I-Konzentrationen bestand. Bei jeder Gruppe waren je 5 von 6 Tieren davon betroffen. Je 2 der 6 Tiere jeder IGF-I-Gruppe zeigten eine hochgradige Vakuolisierung der Leber mit Vakuolen größer 10 µm Durchmesser. Im Fettgewebe der Bauchwand war bei allen Präparaten die „Siegelring“ Morphologie der Adipozyten erhalten. Neben den Adipozyten waren auch Blutgefäße erkennbar. Unterschiede in Abhängigkeit von der Zugehörigkeit zu den verschiedenen IGF-IGruppen war nicht sichtbar. Die Muskelzellen des Musculus longissimus dorsi waren bei allen Präparaten gewebetypisch gefärbt. Weiterhin waren in den Schnitten zum Teil Adipozyten und Binde63 gewebe zwischen den Muskelzellen erkennbar. Ein Unterschied zwischen den IGF-IGruppen war in der HE-Färbung nicht feststellbar. 4.5.2 Immunhistochemie Der GHR war im Uterus-, Leber- und Fettgewebe sowie in der Muskulatur nachweisbar. Sowohl die semiquantitative Auswertung der Färbung als auch die Betrachtung der qualitativen Strukturspezifität der Färbung erbrachte zwischen den beiden IGF-IGruppen keine Unterschiede. Im Uterusgewebe wurde der GHR bei den Präparaten im Zytoplasma des Oberflächenepithels des Endometriums, im Zytoplasma der Uterindrüsen und im Zytoplasma der Tela muscularis nachgewiesen (Abb. 20a). Weiterhin war eine positive Reaktion im Zytoplasma der polymorphkernigen Zellen zu erkennen, die sich in den Blutgefäßen und im Endometrium befanden (Abb. 21). Zwischen den Tiergruppen waren qualitativ keine Unterschiede zu sehen. In der Leber färbten sich immunhistologisch das Zytoplasma der Hepatozyten und das Zytoplasma der Gallengangszellen mit dem GHR Antikörper bei allen Präparaten an (Abb. 20b). Allerdings zeigte hier auch die Kontrolle (polyklonales Mausserum) eine positive Reaktion an den Gallengängen, was auf eine unspezifische Reaktion in den Gallengängen schließen lässt. Zwischen den beiden Tiergruppen konnte kein qualitativer Unterschied festgestellt werden. Im Fettgewebe konnte der GHR im Zytoplasma der Endothelzellen aller Präparate nachgewiesen werden. Im Zytoplasma und der Zellmembran von Adipozyten war keine Färbung erkennbar (Abb. 20c). Ein qualitativer Unterschied zwischen den beiden IGF-I-Gruppen war nicht zu sehen. Im Musculus longissimus dorsi waren im Zytoplasma bei allen Präparaten in regelmäßigen Abständen von ca. 2 µm gefärbte und ungefärbte Bereiche zu sehen. Die Ausrichtung erfolgte gleichmäßig über den gesamten Schnitt, wobei sich die einzelnen Muskelzellen in der Intensität unterschieden (Abb. 20d). Ein qualitativer Unterschied zwischen beiden IGF-I-Gruppen wurde nicht festgestellt. 64 a b * * + + # c d Abb. 20: Lichtmikroskopische Aufnahme der Growth Hormone Rezeptor Färbungen: a) tragendes Horn des Uterus dorsal (Vergrößerung 1:200), mit positiv gefärbtem Oberflächenepithel (*), Schlauchdrüsen (+) und Muskelzellen (#). Im Endometrium sind vermehrt gefärbte polymorphkernigen Entzündungzellen (). b) Lebergewebe (1:200), mit positiv gefärbten Hepatozyten (*). Zentolobulär sind Vakuolen mit einem Durchmesser von etwa 10 µm (). c) Fettgewebe der Bauchwand (1:200). Eine Färbung ist in den Zellen der Blutgefäßwandungen erkennbar (). d) Musculus longissimus dorsi (1:400). Im Zytoplasma der Muskelzellen kommt es zu einer Querstreifung mit regelmäßigen Abständen von ca. 2µm (). Die Querstreifung ist gleichmäßig über den gesamten Schnitt ausgerichtet. 65 Abb. 21: Lichtmikroskopische Aufnahme eines Blutgefäßes im Endometrium (1:600 Ölimmersion) des GHR gefärbten Uterusgewebes. Im Gefäßlumen und im angrenzenden Gewebe sind vermehrt positiv gefärbte polymorphkernige Zellen () erkennbar. 66 5 Diskussion Die Transitperiode der Milchkuh stellt eine Zeit mit erhöhter Krankheitsinzidenz dar (1, 2). Daher ist bereits in der Vergangenheit versucht worden, geeignete Parameter, wie zum Beispiel freie Fettsäuren und Haptoglobin, zur frühzeitigen Erkennung von Krankheiten zu finden (10, 111). Ein möglicher weiterer Parameter scheint das in der Leber gebildete IGF-I zu sein, welches von Piechotta et al. (10) vorgeschlagen und in der vorliegenden Arbeit als Grundlage zur Selektion von graviden pluriparen Kühen verwendet wurde. Letztgenannte Autoren stellten fest, dass bei Tieren mit Produktionserkrankungen die IGF-I-Konzentrationen 4 bis 6 Wochen vor der Geburt niedriger waren als bei Kühen, die während der Transitperiode gesund blieben. Einen Unterschied der IGF-I-Konzentrationen beobachteten auch Kawashima et al. (71). In ihrer Studie hatten Kühen mit antepartal hohen IGF-I-Konzentrationen, deutlich früher nach der Geburt ovuliert als Kühe mit niedrigen IGF-I-Konzentrationen. Untersuchungen von Piechotta et al. (112) zeigten, dass sich Tiere, die nach den IGF-IKonzentrationen zwischen den Tagen 244 bis 250 p. insem. ausgewählt und in eine hohe und niedrige IGF-I-Gruppe eingeteilt wurden, bis zum 275. Tag p. insem. in den IGF-I-Konzentrationen unterschieden. Zu diesem Zeitpunkt wurde ein Kaiserschnitt durchgeführt, so dass Daten in Bezug auf den natürlichen Geburtszeitpunkt fehlen. In der vorliegenden Arbeit wurden deshalb Proben bis zum Eintritt einer Spontangeburt genommen, um die Hypothese zu prüfen, dass auch nach dem 275 Tag p. insem. noch Unterschiede in den IGF-I- und in den GH-Konzentrationen bestehen. Das Immunsystem und die metabolische Dysadaptation gelten als wichtige Auslöser für Produktionserkrankungen (1, 2). Allerdings ist nicht bekannt, ob die Somatotrope Achse auch Einfluss auf andere endokrine Gegebenheiten der Milchkühe hat und dadurch die unterschiedlichen Erkrankungsinzidenzen zustande kommen könnten. In diesem Zusammenhang sind gerade uterine Erkrankungen von Bedeutung, da sie sowohl bei uni- als auch bei pluriparen Milchkühen besonders häufig auftreten (4). Die vorliegende Studie sollte deshalb weiterhin zeigen, ob zwischen Tieren, die vor der Geburt auf Grundlage unterschiedlicher IGF-I-Konzentrationen ausgewählt worden sind, ein Unterschied in der Änderung ausgewählter Parameter auf einen lokalen Entzündungsreiz im Uterus nach der Geburt besteht. Dabei sollte auch untersucht werden, ob sich die endokrinen Gegebenheiten vor der Geburt zwischen den Tieren mit niedrigen und hohen IGF-I-Spiegeln unterscheiden. 67 5.1 Tiere In der vorliegenden Arbeit wurden die Tiere eines Betriebes auf Grundlage einer einzigen Bestimmung der IGF-I-Konzentration im Blut zwischen den Tagen 240 bis 254 p. insem. ausgewählt. Nach Piechotta et al. (10) liegt der mittlere IGF-I-Wert zwischen den Tagen 242 bis 248 p. insem. bei 131,5 ng/ml. Die Tiere wurden deshalb so ausgewählt, dass sich ihre IGF-I-Konzentration deutlich von dem mittleren Wert von 131,5 ng/ml unterschieden. Tiere der in dieser Arbeit beschriebenen IGF-I niedrigen Gruppe wiesen IGF-I-Werte von ≤ 125 ng/ml und Tiere der IGF-I hohen Gruppe IGF-I-Werte von ≥ 175 ng/ml auf. Da in der vorliegenden Arbeit vorwiegend auf Unterschiede im endokrinen System geachtet werden sollte, wurden ausschließlich pluripare Tiere gleichen Alters, vergleichbarer Milchleistung und ähnlichem BCS für den Versuch ausgewählt. Dadurch sollten andere Einflüsse so gering wie möglich gehalten werden, da es bekannt ist, dass das Alter einen Einfluss auf die IGF-I-Konzentrationen hat: In der Pubertät haben die Rinder die höchsten IGF-I-Konzentrationen. Diese sinken anschließend bis zum Alter von 5 Jahren ab. Vor allem Färsen weisen demnach im Vergleich zu pluriparen Kühen höhere IGF-I-Konzentrationen auf (113). In der vorliegenden Arbeit wurden Tiere mit einer eher niedrigen Milchleistung während der vorherigen Laktation gewählt. Dies erfolgte vor allem aus betriebswirtschaftlichen Gründen, da der Betrieb bei der Auswahl vor allem Tiere mit einer geringen Milchleistung für den Versuch abgegeben hat. Da die Milchleistung in anderen Studien keinen Einfluss auf die Inzidenz uteriner Erkrankungen (2) und die IGF-I-Konzentrationen (114, 115) hatte, dürfte diese Selektion die untersuchten Parameter nicht beeinflusst haben. Hoedemaker et al. (116) konnten zeigen, dass Kühe mit einem präpartal beurteilten BCS von unter 3 häufiger an Lahmheiten, Nachgeburtsverhaltungen und Dystokien litten. Dagegen zeigten Tiere mit einem BCS von über 3,5 eine deutliche Zunahme an metabolischen Entgleisungen (117). Um den Einfluss der Körperkondition auf die eigenen Versuchsergebnisse auszuschließen, wurde daher bei der Selektion der Tiere darauf geachtet, dass der BCS inter-individuell nicht stark differierte. Ein Nachteil der vorliegenden Versuchsdurchführung war, dass die Tiere nach der Selektion vom Betrieb zur Klinik über 3 Stunden transportiert werden mussten. Dies führt zu einer Stressbelastung der Tiere und kann sich damit auf die endokrinologischen Parameter auswirken (118, 119). Da allerdings alle Versuchstiere transportiert wurden und den Tiere mit Ausnahme einer Kuh vor der Entnahme der ersten Blut68 probe eine Eingewöhnungszeit von mindestens 3 Tagen in der Klinik für Rinder gewährt wurde, dürften die Auswirkungen auf das hormonelle Geschehen vermutlich relativ gering und bei den Tieren mit niedrigen und hohen IGF-I-Spiegeln vergleichbar gewesen sein. Angestrebt wurde zunächst eine Gruppengröße von jeweils 10 Tieren. Da einige Tiere aufgrund von Erkrankungen von den Auswertungen ausgeschlossen werden mussten, blieben jeweils 6 Tiere in den beiden IGF-I-Gruppen, denen postpartal LPS infundiert wurde, übrig. Auffällig war der relativ hohe Anteil an Nachgeburtsverhaltungen in dieser Arbeit (n=5). Dieser lag nach 12 Stunden mit 26,3% höher als in der Literatur beschrieben (2 bis 12% nach 12 Stunden) (4, 83). Allerdings ist darauf hinzuweisen, dass bei 4 der 5 Tiere die Nachgeburt innerhalb von 24 Stunden ausgestoßen wurde und teilweise in der Literatur von einer Nachgeburtsverhaltung erst dann gesprochen wird, wenn die Plazenta später als 24 Stunden nach der Entwicklung des Kalbes abgeht (82). Würde man die letztgenannte Definition auch für die vorliegende Arbeit heranziehen, dann wäre die Inzidenz der Nachgeburtsverhaltungen in der vorliegenden Studie mit 5,3% nicht erhöht. Unabhängig davon ist nicht auszuschließen, dass die im Rahmen der Studie erforderlichen Untersuchungen um den Geburtszeitpunkt dazu beigetragen haben könnten, dass die Nachgeburt verzögert abging, da Stress als ein Faktor für Nachgeburtsverhaltungen gilt (120). Da die fünf Tiere, die an einer Nachgeburtsverhaltung litten, gleichmäßig über beide IGF-I-Gruppen verteilt waren, bestand kein offensichtlicher Zusammenhang zwischen der Inzidenz dieser Erkrankung und den IGF-I-Konzentrationen. 5.2 Antepartaler Zeitraum In der vorliegenden Arbeit unterschieden sich die Tiere bei der Untersuchung am Tag der Einstallung in die Klinik, d.h. zwischen den Tagen 249 bis 265 p. insem. nicht nur hinsichtlich des IGF-I-Spiegels, sondern auch bezüglich der klinisch-chemischen Parameter HST, GB, Leukozyten und Magnesium. Hohe Harnstoffkonzentrationen in Zusammenhang mit höheren IGF-I-Werten haben bereits Zulu et al. (121) und Hoedemaker et al. (122) beschrieben. Eine höhere HSTKonzentration spricht für mehr verfügbares Protein (123), so dass die IGF-I hohen Tiere eine höhere Proteinversorgung gehabt haben könnten. Ein Zusammenhang 69 zwischen niedrigeren HST-Konzentrationen und vermehrt auftretenden Krankheiten wurde von Kaufmann et al. (87) festgestellt. Allerdings sind die HST-Konzentrationen bei den letztgenannten Autoren erst nach der Geburt und nicht wie in der vorliegenden Arbeit vor der Geburt bestimmt worden. Ob sich HST ebenfalls als Marker für Produktionserkrankungen zwischen den Tagen 240 bis 254 p. insem. ähnlich dem IGF-I eignet, müsste durch weitere Studien geklärt werden. Gesamt-Bilirubin ist ein Indikator für die Leberbelastung (124). Da IGF-I niedrige Tiere in der vorliegenden Studie höhere Bilirubinwerte aufwiesen, könnte dies, wie bei McSherry et al. (124) beschrieben, auf eine erhöhte Leberbelastung bei diesen Tieren hindeuten. Diese Annahme wird zusätzlich durch die erhöhten FFSKonzentrationen bei diesen Tieren gestützt, die zu einer Leberbelastung führen können (21). Aus Studien mit Mäusen weiß man, dass bei höheren IGF-I-Konzentrationen mehr Leukozyten bei einer anschließenden mit E. coli erzeugten Peritonitis nachzuweisen sind (125). Hoedemaker et al. (122) beobachteten bei Rindern keinen Zusammenhang zwischen der Zahl neutrophiler Granulozyten und den IGF-I-Konzentrationen. Dagegen konnten Sander et al. (97) eine moderate negative Korrelation zwischen IGF-I und der Phagozytoseleistung neutrophiler Granulozyten in der Transitperiode nachweisen. Dabei war die Gesamtleukozytenzahl nach der Geburt negativ mit IGF-I korreliert. Allerdings ist nach Auffassung der Autoren in Betracht zu ziehen, dass durch die Entkopplung der Somatotropen Achse niedrigere IGF-I-Konzentrationen eine vermehrte GH-Sekretion bedingen könnten und sich zu dieser Zeit eine besondere Situation darstellt. Die höheren GH-Konzentrationen könnten sich positiv auf die neutrophilen Granulozyten auswirken. Interessanterweise waren in der vorliegenden Studie vermehrt Leukozyten in der IGF-I hohen Gruppe nachzuweisen. Dieser Unterschied war allerdings bereits vor der Geburt zu sehen, wo noch keine Entkopplung der Somatotropen Achse vorgelegen hat. Es ist denkbar, dass es durch den Transport in die Klinik für Rinder zu einer vermehrten Freisetzung von Leukozyten aus dem Knochenmark kam. Bei allen Tieren lagen die Leukozytenzahlen im oberen Referenzbereich, ohne dass klinisch eine Entzündung nachgewiesen werden konnte. Dies könnte darauf hindeuten, dass die IGF-I hohen Tiere vermehrt Leukozyten in einer Stresssituation freisetzen können. Für eine genaue Interpretation dieses Ergebnisses sind allerdings weitere Untersuchungen notwendig, 70 da für den Transport und die ersten Tage in der Klinik Daten aufgrund des Versuchsdesigns fehlen. 5.2.1 Somatotrope Achse In der vorliegenden Arbeit wurde antepartal das Wachstumshormon und IGF-I als Bestandteil der Somatotropen Achse quantitativ im Plasma bestimmt. In beiden IGFI-Gruppen sanken die IGF-I-Konzentrationen zur Geburt hin vergleichbar ab. Dieses Ergebnis deckt sich mit einer Beobachtung von Cavestany et al. (126), in deren Studie führte eine erhöhte Energieversorgung zu höheren praepartalen IGF-IWerten, wohingegen die IGF-I-Spiegel bis zur Geburt abfielen und sich unmittelbar peripartal gegenüber einer Kontrollgruppe ohne erhöhte Energieversorgung nicht mehr unterschieden. Das Absinken der IGF-I-Konzentration wird der verminderten Transkription des GHR 1A in der Leber zugeschrieben (7). Dadurch kommt es zu einer verminderten Expression des GHR an der Hepatozytenoberfläche und dadurch zu einer geringen Stimulation der IGF-I-Synthese durch GH. Möglich ist ein stärkeres Absinken des GHR 1A in der IGF-I hohen Gruppe, was aber in der vorliegenden Arbeit aufgrund fehlender mRNA Analysen des GHR 1A nicht überprüft werden konnte. Allerdings sind auch, ähnlich wie beim Menschen, sinkende IGFBP-3 im Blut durch eine verstärkte Proteasenaktivität als Ursache für einen deutlichen praepartalen IGF-I Abfall denkbar (127). Durch einen verstärkten Abbau von IGFBP-3 in der IGF-I hohen Gruppe wären die stärker sinkenden IGF-I-Konzentrationen zu erklären, allerdings fehlt in dieser Arbeit hierzu eine quantitative Bestimmung des IGFBP-3. Es konnte in dieser Arbeit aber gezeigt werden, dass sich Tiere, die durch eine einmalige Blutprobe hinsichtlich ihrer IGF-I-Konzentration selektiert wurden, in diesem Parameter auch bis zum 275. Tag p. insem. signifikant voneinander unterschieden. Dies Ergebnis geht mit der Beobachtung von Piechotta et al. (112) einher, die unterschiedliche IGF-I-Werte bis zum Kaiserschnitt am 275. Tag p. insem. gemessen haben. Offen blieb bei der Studie von Piechotta et al. (112), ob durch die Einteilung in Abhängigkeit vom IGF-I-Spiegel möglicherweise Tiere selektiert wurden, die sich unterschiedlich weit von der Spontangeburt weg befanden und sich der Parameter IGF-I deshalb unterschied. Es ist bekannt, dass die IGF-I-Konzentration mit der Annäherung an den Geburtszeitpunkt absinkt (7). In der hier beschriebenen 71 Arbeit konnten die Proben retrospektiv nach dem Zeitpunkt der Spontangeburt geordnet werden. Die Tiere wiesen sowohl bis zum 275. Tag p. insem. als auch bis zum 6. Tag vor der Geburt unterschiedliche IGF-I-Werte auf. Somit scheint bis zum 275. Tag p. insem. eine Einteilung in IGF-I hohe und niedrige Tiere möglich zu sein. Die Differenz der IGF-I-Konzentrationen zwischen den Tiergruppen wurde wesentlich geringer je näher die Proben zum 275. Tag liegen und ab dem 276. Tag war kein Unterschied mehr feststellbar. Unabhängig von der Einteilung in die Gruppen mit hohen und niedrigen IGF-IWerten, war in der hier vorliegenden Studie ein deutlicher Anstieg der Wachstumshormonkonzentrationen ab dem 4. Tag vor der Geburt erkennbar. Dieses Ergebnis ist mit den Aussagen anderer Studien vergleichbar (7, 71). Die beiden IGF-I-Gruppen wiesen ferner während des gesamten getesteten Zeitraums vergleichbare GHKonzentrationen auf. Betrachtet man den endokrinologischen Regelkreis, dann hätte man eigentlich vermutet, dass die IGF-I niedrige Gruppe zum Zeitpunkt der Auswahl (240. bis 254. Tag p. insem.) höhere GH-Konzentrationen besitzt, da IGF-I zu einem negativen Feedback hinsichtlich der hypophysären GH-Ausschüttung führt. Diese Hypothese wurde in der vorliegenden Arbeit nicht bestätigt. Zugrunde liegende Ursachen können sein, dass die GH-Ausschüttung einer circadianen, individuellen Rhythmik unterliegt und somit über den Tag bzw. die Nacht verschiedene Konzentrationen messbar sind (45). Die maximale GH-Ausschüttung erfolgt nachts und es ist nicht auszuschließen, dass in dieser Zeit die IGF-I niedrigeren Tiere vermehrt GH vor allem durch eine höhere Frequenz ausschütten (45). Weiterhin ist zu beachten, dass vor allem das freie IGF-I für das negative Feedback der GH-Ausschüttung in der Hypophyse von Bedeutung ist (128). In der vorliegenden Arbeit ist allerdings ausschließlich Gesamt-IGF-I, also das an alle sieben Bindungsproteine gebundene IGF-I, gemessen worden. Inwieweit sich in der vorliegenden Arbeit die freien IGF-IKonzentrationen von den gemessenen Gesamt-IGF-I-Konzentrationen unterschieden haben, ist nicht bekannt. Es ist aber durchaus möglich, dass die IGF-I hohen und niedrigen Gruppen ähnliche Konzentrationen an freiem IGF-I hatten und dies dazu geführt hat, dass sich die GH-Konzentrationen nicht unterschieden. Eine andere mögliche Erklärung für die vergleichbaren GH-Konzentrationen bei beiden IGF-I-Gruppen vor der Geburt könnte die geringe analytische Sensitivität des 72 GH-Tests sein, der somit geringe GH-Unterschiede nicht ausreichend angezeigt haben könnte. Auffällig ist weiterhin, dass sich die IGF-I-Konzentrationen der Tiere zur Geburt hin anglichen. Die stärker abfallenden IGF-I-Konzentrationen der IGF-I hohen Gruppe führten aber zu keinem vermehrten Anstieg der GH-Konzentrationen im Vergleich zur IGF-I niedrigen Gruppe. Nach Kawashima et al. (71) ist davon auszugehen, dass die IGF-I niedrigen Tiere höhere GH-Konzentrationen postpartal entwickeln. Zu beachten ist, dass andere Faktoren, wie z.B. Insulin, Leptin und Glukose neben dem IGF-I einen bedeutenden Einfluss auf die GH-Sekretion haben (45, 128). Eine unterschiedliche Entwicklung der Insulinkonzentrationen in beiden IGF-I-Gruppen könnte auch zu einer unterschiedlichen GH-Ausschüttung führen, allerdings wären hierfür Untersuchungen an einer größeren Tiergruppe notwendig. 5.2.2 Schilddrüsenhormone Bereits Elsasser et al. (129) wiesen auf einen engen Zusammenhang zwischen der Somatotropen Achse und der Schilddrüsenachse hin. Beispielsweise ist Thyreotropin Releasing Hormon (TRH) bei Rindern in der Lage, sowohl die TSH- als auch die GHAusschüttung zu stimulieren. In der vorliegenden Arbeit sanken die T4-Konzentrationen vor der Geburt deutlich ab. Dieser T4-Abfall stimmt mit Beschreibungen in der Literatur überein (26, 130) und wird von Aceves et al. (26) zum einen mit der metabolischen Belastung, zum anderen aber auch mit einem erhöhten Verbrauch an Schilddrüsenhormonen durch den Fetus und durch die beginnende Laktation in Zusammenhang gebracht. Gleiches gilt für die Entwicklung der T3-Konzentrationen im Serum, die sich nach Literaturangaben parallel zu den T4-Konzentrationen ändern und ebenfalls absinken (130). Hierbei spielt die Energieversorgung eine entscheidende Bedeutung für den Schilddrüsenhormonstoffwechsel: Bei einer höheren Energieversorgung zeigen Kühe 14 Tage vor der Geburt höhere T4- und T3-Konzentrationen als Tiere mit einer minderwertigeren Energieversorgung (130). Ähnlich verhält es sich auch mit IGF-I und der Energieversorgung (131), so dass höhere IGF-I-Konzentrationen hier als ein Indikator für eine bessere Energieverwertung stehen könnten und dieser Umstand auch die unterschiedliche Entwicklung 73 der Schilddrüsenhormone bedingen könnte. Leider konnte in der eigenen Studie die Energie- oder Futteraufnahme der Tiere nicht gemessen werden und somit über den Einfluss an dieser Stelle nur spekuliert werden. Das T3 wird in peripheren Körperzellen und auch in der Leber durch die Abspaltung eines Jodatoms vom Thyroxin durch die 5’Deiodinase gebildet. Die unterschiedliche Entwicklung der T3-Konzentrationen bei Tieren mit unterschiedlichen IGF-I-Konzentrationen wurde mit einer verminderten 5’Deiodinase Aktivität in der Leber in Zusammenhang gebracht. Die Aktivität war bei den IGF-I hohen Tieren signifikant höher (112). Die Beobachtung der sinkenden T3-Konzentrationen bei fallenden IGF-IKonzentrationen ist auch bereits beim Menschen beschrieben worden (132) und kann anhand der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit auch für das Rind bestätigt werden. Sowohl die T3- als auch die IGF-I-Konzentrationen scheinen eine unterschiedliche metabolische Adaptation an den erhöhten Energieverbrauch der Milchkuh zu zeigen. Es liegen Studien vor, in denen Kühe mit T 3 behandelt wurden und dies zu niedrigen IGF-I-Konzentrationen führte (133). Hier stellt sich nun die Frage, inwieweit die Schilddrüse auf Unterschiede in der Somatotropen Achse reagiert oder ob die Unterschiede im T3 ursächlich für Differenzen in den IGF-I-Konzentrationen sind. Vermutet wird, dass höhere T3-Konzentrationen durch einen erhöhten Katabolismus eine erhöhte GH-Resistenz auslösen und niedrigere IGF-I-Konzentrationen bedingen. Diesem Mechanismus kann mit einer anabolen Behandlung entgegen gewirkt werden (133). In der vorliegenden Arbeit würden also eher die IGF-I-Konzentrationen die Schilddrüsenwerte bedingen als umgekehrt. Ein solcher kausaler Zusammenhang kann aber durch das Versuchsdesign der vorliegenden Arbeit nicht bestätigt werden, sondern müsste in weiteren Tierexperimenten oder in vitro nachgestellt werden. 5.2.3 Cortisol Das Nebennierenrindenhormon Cortisol ist auf der einen Seite als das typische Stresshormon bekannt, initiiert aber auf der anderen Seite bei Rindern auch die Geburt durch das Heranreifen der fetalen Nebennierenrindenachse (27). Dementsprechend sind zur Geburt hin erhöhte Cortisolkonzentrationen beim Muttertier zu erwarten. Desweiteren ist auch der Geburtsvorgang an sich mit Stress für das Tier verbunden und führt ebenfalls zu erhöhten peripheren Cortisolkon74 zentrationen (27, 111). Darüber hinaus kann es auch allein beim Umgang mit den Tieren zu einer stressinduzierten Cortisolausschüttung kommen, die tierindividuell und abhängig vom Umgang mit den Tieren unterschiedlich hoch sein kann (111). Rhoads et al. (134) sind der Ansicht, dass Stress, der mit einer erhöhten Cortisolkonzentration einhergeht, auch einen Einfluss auf die Somatotrope Achse hat. Die Autoren fanden heraus, dass die erhöhten Cortisolkonzentrationen zu verminderten GH- und IGF-I-Konzentrationen führen. Diese Beobachtungen würden auch mit den Ergebnissen der vorliegenden Studie einhergehen, da die IGF-I niedrigen Tiere eine höhere Cortisolkonzentration aufwiesen. Allerdings lässt sich ein kausaler Zusammenhang in dieser Studie nicht nachweisen. Umgekehrt ist beim Menschen bekannt, dass sich GH und IGF-I auf die Cortisolbildung auswirken können. Dieses Phänomen wird vor allem durch die Enzyme 11βHydroxysteroiddehydrogenase Typ 1 und Typ 2 (HSD1 bzw. HSD2) vermittelt. Eine verminderte GH- und IGF-I-Konzentration verringert die HSD2 und es kommt zu einer erhöhten Cortisolkonzentration durch eine verminderte Deaktivierung des Cortisols zu Cortison (135). Dabei können die Cortisolkonzentrationen im physiologischen Bereich liegen, allerdings zeigt sich ein verschobenes Verhältnis von Cortisol zu Cortison zugunsten des Cortisols (135). In der vorliegenden Arbeit war bei beiden Tiergruppen der in der Literatur (27, 136) beschriebene Anstieg der Cortisolkonzentrationen zur Geburt hin zu beobachten und vergleichbar. Allerdings war aber über den gesamten antepartalen Zeitraum eine erhöhte Cortisolkonzentration bei der IGF-I niedrigen Gruppe messbar. Dies könnte, wie oben bereits beschrieben, entweder zu einer niedrigeren IGF-I-Konzentration führen oder durch eine verminderte HSD2-Aktivität bedingt sein. Diese Gegebenheiten wären ein interessanter Ansatzpunkt für weitere Untersuchung dieses endokrinen Netzwerkes. Auf der anderen Seite könnte auch die erhöhte Cortisolkonzentration zu einer niedrigeren IGF-I-Konzentration geführt haben. Ausgelöst durch Cortisol kann es zu einer GH-Resistenz der Leber kommen und damit zu verminderter IGF-I-Ausschüttung (6). Es kann aber auch die GH-Sekretion durch Cortisol vermindert sein (134). Welcher der auslösende Faktor für die Unterschiede in der Cortisolkonzentration war, ist in der vorliegenden Arbeit nicht näher untersucht worden. 75 Bemerkenswert ist aber, dass Cortisol für den Verlauf einer Infektion eine entscheidende Rolle spielt, da die Anfälligkeit für mikrobiologische Infektionen durch erhöhte Cortisolkonzentrationen zunimmt (137). Dies wäre eine mögliche Erklärung für eine von Piechotta et al. (10) beschriebene erhöhte Krankheitsanfälligkeit für IGF-I niedrige Tiere, allerdings kann darüber in der hier beschriebenen Arbeit nur spekuliert werden. Diese Hypothese müsste in weiteren Studien überprüft werden. 5.2.4 Reproduktionshormone Die zeitlichen Verläufe der Reproduktionshormone Progesteron, 17β-Östradiol und PGFM entsprachen den Beschreibungen in der Literatur. Progesteron sank zur Geburt ab, E2 stieg im letzten Drittel der Trächtigkeit an und PGFM nahm zur Geburt hin zu, um die Austreibung der Frucht zu unterstützen (27, 32). In der vorliegenden Arbeit waren zwischen den beiden IGF-I Tiergruppen keine Unterschiede in den P4-, E2- und PGFM-Konzentrationen zu erkennen. Durch die erhöhten Cortisolkonzentrationen wäre eine vermehrte Aktivierung des Enzyms 17α-Hydroxylase mit einer höheren Östrogenkonzentration und einer niedrigeren Progesteronkonzentration bei den IGF-I niedrigen Tieren zu erwarten gewesen (31, 33, 34). Da allerdings gerade bei den E2-Konzentrationen hohe tierindividuelle Unterschiede festzustellen sind, müsste zur Prüfung dieser Fragestellung eine größere Gruppe geprüft werden (138). 5.2.5 Insulin und FFS In der vorliegenden Arbeit wurde ein Rückgang der Insulinkonzentrationen in der letzten Woche vor der Geburt in beiden Gruppen beobachtet. Dies stimmt mit den Untersuchungen von Bell et al. (22) überein, die ebenfalls einen Abfall der Insulinkonzentration zur Geburt hin beschreiben. Durch die enge, auch strukturelle Vernetzung, von Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren und Insulin hätte man niedrigere Insulinwerte bei der IGF-I niedrigen Gruppe erwarten können. Dieser Zusammenhang wurde von Cavestany et al. (126) schon bei Tiergruppen mit unterschiedlichen Fütterungsregimen und damit einhergehenden unterschiedlichen IGF-I-Konzentrationen beobachtet. 76 In der eigenen Arbeit waren allerdings die Insulinkonzentrationen bei den verschiedenen Tiergruppen vergleichbar. Ein möglicher Grund dafür könnte sein, dass Insulin eine wesentlich geringere Halbwertzeit als IGF-I besitzt und schnell auf metabolische Gegebenheiten reagiert, so dass es zu erheblichen Schwankungen im Verlauf eines Tages kommt (24). Das Absinken der Insulinkonzentrationen zur Geburt hin wurde bei Hochleistungsmilchkühen mit einer Bereitstellung der Nährstoffe für das insulinunabhängige Euter beschrieben, da mit einer verminderten Insulinkonzentration weniger Glukose in die insulinabhängigen Organe, wie Muskulatur und Fettgewebe aufgenommen wird (139). Der Abfall der Insulinkonzentrationen entspricht demnach dem aus der Literatur erwarteten Verlauf dieses metabolischen Hormons. Zum Zeitpunkt der Tierauswahl auf dem Betrieb (240 bis 254 Tage p. insem.) waren die FFS-Konzentrationen bei Tieren mit niedrigen IGF-I-Konzentrationen höher als bei Tieren mit hohen IGF-I-Konzentrationen. Diese Signifikanz konnte zu diesem Zeitpunkt in vorangegangenen Studien nicht beobachtet werden (112). Dieses Ergebnis zeigt, dass sich die IGF-I niedrigen Tiere bereits in einer Phase mit erhöhter Energiebereitstellung durch Lipolyse befanden. Dabei scheint allerdings im Vergleich mit anderen Arbeiten, eine Nutzung der FFSKonzentration zu diesem Zeitpunkt nicht möglich, da keine Zusammenhänge beobachtet wurden (10, 71). Über den 266. Tag p. insem. bis zur Geburt war die FFS-Konzentration in der IGF-I niedrigeren Gruppe erhöht. In der Arbeit von Piechotta et al. (10) war die Zahl der Kühe mit klinischer Ketose in der IGF-I niedrigen Gruppe höher. Da IGF-I ähnlich wie Insulin auf die Adipozyten wirkt und eine vermehrte Aufnahme lipogener Stoffe aus der Blutbahn in die Adipozyten bewirkt, könnte die höhere IGF-I-Spiegel auch die FFS-Konzentrationen beeinflussen (45). Höhere IGF-I-Werte würden somit für eine vermehrte Aufnahme von freien Fettsäuren in die Adipozyten sprechen und damit niedrigere FFS-Konzentrationen erklären. In der von Huzzey et al. (111) durchgeführten Studie konnte ein Zusammenhang zwischen höheren FFS vor der Geburt und dem vermehrtem Auftreten von Krankheiten in den ersten 30 Tagen der anschließenden Laktation beobachtet werden. Die Beobachtung, dass sich in der IGF-I niedrigen Gruppe vermehrt Tiere mit hohen FFS-Konzentrationen befinden, würde also dafür sprechen, dass es zu vermehrten 77 Krankheiten in der Gruppe in den ersten 30 Tagen der Laktation kommen würde. Dies konnte aufgrund des Versuchsaufbaus in der vorliegenden Studie nicht nachverfolgt werden, deutete sich aber in anderen Untersuchungen an (10). Zur Geburt hin kommt es zu einer katabolen Stoffwechsellage der Milchkuh (140). Da eine höhere negative Energiebilanz höhere FFS-Konzentrationen im Blut bedingt (65), könnte in der vorliegenden Arbeit eine stärkere negative Energiebilanz bei der IGF-I niedrigen Gruppe vorgelegen haben. Bei den Rassen mit hoher Milchleistung ist auch eine Insulinresistenz der Gewebe beschrieben. Diese Insulinresistenz führt zu einem vermehrten Transport von Glukose in die Milchdrüse über den insulinunabhängigen Glukosetransporter (140). Durch eine verstärkte Insulinresistenz kommt es neben erhöhten Glukose- und Insulinkonzentrationen auch zu erhöhten FFS-Konzentrationen (141). Ob tatsächlich eine erhöhte Insulinresistenz bei der IGF-I niedrigen Gruppe vorgelegen hat, lässt sich in dieser Arbeit nicht klären. Für eine solche Aussage fehlen die Informationen zu den Glukosekonzentrationen und darüber hinaus zum sicheren Nachweis einer Insulinresistenz ein Glukosetoleranztest, der in der vorliegenden Studie nicht durchgeführt wurde (141). 5.3 Bakterielle Untersuchung Ähnlich wie von Sheldon et al. (142) beschrieben, zeigten die Ergebnisse der Uterustupferproben aus der eigenen Studie, dass die Uteri aller Tiere bakteriologisch mit unterschiedlichen aeroben und anaeroben Bakterien kontaminiert waren. Auffällig war allerdings in der hier vorliegenden Studie der deutlich höhere Anteil von IGF-I niedrigen Tieren, bei denen Clostridium perfringens nachgewiesen werden konnte. Clostridium spp. wurden auch von Dohmen et al. (85) im Uterus nachgewiesen und deren Vorkommen war positiv mit der Kontamination durch Escherichia coli korreliert. Die Autoren (85) zeigten in ihrer Veröffentlichung den Zusammenhang zwischen einer erhöhten Inzidenz von Nachgeburtsverhaltungen und der bakteriellen Belastung, unter anderem mit Clostridien. In der vorliegenden Arbeit waren allerdings bei den Tieren mit einer Nachgeburtsverhaltung nur die drei IGF-I niedrigen Tiere, nicht aber die beiden IGF-I hohen Tiere von einer Kontamination durch Clostridien betroffen. Dazu waren aber auch bei drei weiteren IGF-I niedrigen Tieren, die keine Nachgeburtsverhaltung zeigten, in den Uterustupferproben Clostridien nachweisbar. 78 Weiterhin war auffällig, dass obligat anaerobe Keime nur in der IGF-I niedrigen Gruppe vorhanden waren. Möglicherweise wirkt sich IGF-I vor der Geburt auf das Uterusmilieu aus und die Höhe des IGF-I-Wertes zeigt ein bestimmtes Uterusmilieu als Indikator an. Das IGF-I stimuliert das Wachstum von vaskulären glatten Muskelzellen und bedingt gleichzeitig eine erhöhte Bereitstellung von reaktiven Sauerstoffspezies (143). Dies könnte bei den IGF-I hohen Tieren für eine verbesserte Diffusion des Uterusgewebes sorgen und dadurch einen höheren Sauerstoffpartialdruck bedingen, der der Besiedelung mit anaeroben Keimen entgegenwirken könnte. Die vermehrte Besiedelung der IGF-I niedrigen Tiere mit Clostridien würde auch für eine quantitativ höhere Belastung mit Escherichia coli und LPS sprechen (85). In der vorliegenden Arbeit fehlt die quantitative Bestimmung der Bakterien und der LPSKonzentration, sowohl direkt als auch über einen längeren Zeitraum post partum. Es könnte eine erhöhte Belastung des Uterus mit Escherichia coli und LPS bei den IGF-I niedrigen Tieren in den ersten Stunden post partum vorgelegen haben. Die höheren LPS-Konzentrationen im Uterus bedingen nach den Untersuchungen von Dohmen et al. (85) vermehrt Endometritiden. Dazu zeigten Sheldon et al. (142), dass eine höhere bakterielle Belastung sich negativ auf die Follikelentwicklung auswirkt und dadurch auch auf die Fertilität. Allerdings zeigten Sheldon et al. (142) auch, dass das bakterielle Milieu im postpartalen Zeitraum individuell unterschiedlich zeitlich bedingten Veränderungen unterliegt. Die eigenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass IGF-I niedrige Tiere eher an uterinen Infektionen erkranken. Um dies abzuklären sind aber weitere Untersuchungen erforderlich, die idealerweise an einer größeren Tiergruppe untersucht werden sollten. 5.4 LPS-Versuch Die zugrundeliegende Hypothese des LPS-Versuches bestand darin, dass sich Tiere, die sich zwischen den Tagen 240 bis 254 p. insem. in der IGF-I-Konzentration unterscheiden, auch unterschiedlich auf einen Entzündungsreiz reagieren. Elsasser et al. (9) stellten bei Rindern, die GH injiziert bekamen, fest, dass sowohl TNF-α als auch Cortisol nach einem mit LPS induzierten Entzündungsreiz geringer waren. Dieses deutet darauf hin, dass die Somatotrope Achse das Entzündungsgeschehen bereits in einer frühen Phase der Immunantwort beeinflussen könnte (6). 79 Allerdings war bisher nicht bekannt, ob dieses auch für eine hormonelle Antwort auf einen inflammatorischen Reiz um den Zeitpunkt der Geburt gilt, da es zu diesem Zeitpunkt zu steigenden GH-Konzentrationen kommt (71). Dazu wurden in der vorliegenden Arbeit die Tiere der IGF-I hohen und IGF-I niedrigen Gruppen während des LPS-Versuches hinsichtlich der Änderungen endokriner Parameter miteinander verglichen. Für den Versuch wurde eine „Kontrollgruppe“ aus den Tieren gebildet, die aus der LPS-Gruppe aufgrund von Krankheiten und erschwerten Geburten ausgeschlossen wurden. In dieser Gruppe wurde den Tieren 12 Stunden nach der Geburt intrauterin physiologische NaCl-Lösung infundiert. Zu dem Zeitpunkt war die Diagnose einer Nachgeburtsverhaltung gestellt und die betroffenen Tiere aus dem LPS-Versuch genommen worden. Dies geschah vor allem aus der Überlegung heraus, dass zu diesem Zeitpunkt eine wahrscheinliche bakterielle Besiedelung und damit einhergehende LPS-Kontamination, am größten waren und dieser Einfluss gezielt mit der LPS-Infusion verglichen werden sollte. Der unterschiedliche Gesundheitsstatus ist bei dieser „Kontrollgruppe“ ein großer Nachteil und wurde bei der Auswertung der einzelnen Hormone kritisch begutachtet, um Fehlinterpretationen zu vermeiden. Vor allem der LPS-Einfluss auf endokrine Parameter sollte gegen eine Gruppe von Tieren berechnet werden, die keine intrauterine Infusion mit LPS bekamen. Es ist allerdings davon auszugehen, dass bei allen Tieren bereits LPS durch eine Besiedelung mit Bakterien im Uterus vorhanden war. Dazu kommt, dass in der Studie von Dohmen et al. (85) besonders Kühe mit Nachgeburtsverhaltungen eine höhere Belastung mit LPS aufwiesen, so dass die höchste Kontamination in der „Kontrollgruppe“ zu vermuten war. Sowohl die Hormonkonzentrationen als auch die vitalen Funktionen zwischen der NaCl-Gruppe und den beiden IGF-I-Gruppen (IGF-I hoch und IGF-I niedrig) war zum Zeitpunkt 0 Minuten vergleichbar. Folglich sind die nachfolgenden Ergebnisse der LPS-Gruppe mit denen der NaCl-Gruppe als „Kontrolle“ verglichen worden. Die NaCl-Gruppe setzte sich aus IGF-I hohen und IGF-I niedrigen Tieren zum Zeitpunkt der Auswahl (Tag 240 bis 254 p. insem.) zusammen. Dieses hat zur Folge, dass eine Vergleichbarkeit zwischen den einzelnen IGF-I-Gruppen (IGF-I hoch bzw. IGF-I niedrig) und der NaCl-Gruppe nur bedingt gegeben ist und in den Auswertungen auch berücksichtigt wurde. 80 5.4.1 Somatotrope Achse In dieser Arbeit waren zwischen den Tiergruppen trotz der vorherigen Einteilung nach dem Parameter IGF-I keine Unterschiede in den IGF-I- und GH-Konzentrationen während des LPS-Versuches nachweisbar. Whitlock et al. (92) stellten fest, dass beim Schaf die IGF-I-Konzentrationen durch eine intravenöse Gabe von LPS absinken. Dabei scheint der Mechanismus in einer Resistenz des GHR begründet zu liegen, da auch eine GH-Gabe keinen IGF-IKonzentrationsanstieg bewirkte. Der genaue Mechanismus wird von Whitlock et al. (92) in der verminderten Phosphorylierung des intrazellulären Signalproteins JAK-2 durch eine stärkere Nitrifizierung der JAK-2 angenommen. Damit ist der Signalweg in der Zelle weniger effektiv und bewirkt eine geringere Transkription der IGF-I mRNA. Weiterhin lässt LPS die Pulsatilität von GH bei Schafen ansteigen (92). Whitlock et al. (92) nehmen diese Mechanismen auch für andere Wiederkäuer an. Die Autoren gehen aufgrund ähnlicher Studien an Ratten, die vergleichend zu den Rindern mit einer verminderten GH-Ausschüttung nach einer LPS-Applikation reagierten, davon aus, dass die Hemmung der GH-Sekretion bei Rindern auch eher indirekt durch Zytokine, als direkt durch LPS beeinflusst wird. In diesem Zusammenhang werden aber neben Zytokinen wie TNF-α auch Steroidhormone wie Cortisol diskutiert, die die Ausschüttung von GH sowohl direkt als auch durch die erhöhte Sekretion von GHIH hemmen könnten (92). In der vorliegenden Arbeit mag ein Grund dafür, dass weder Änderungen in der IGF-I- noch der GH-Konzentration gefunden worden sind, der kurze Untersuchungszeitraum von drei Stunden nach der LPS-Infusion sein. In anderen Arbeiten traten nach einer intravenösen Verabreichung Unterschiede beim GH erst nach 4 Stunden deutlich hervor (92). Ursächlich hierfür könnte sein, dass die Bildung von GH von GHRH und GHIH abhängig ist und IGF-I wiederum von GH (45). Die Synthese und Freisetzung dieser Hormonkaskade scheint länger als drei Stunden in Anspruch nehmen. Eine Besonderheit von Milchkühen ist, dass es um den Geburtszeitpunkt bereits zu einer GH-Resistenz kommt, was vor allem durch das Absinken der GHR 1A mRNA in der Leber hervorgerufen wird (55). Diese GH-Resistenz ist auch in der vorliegenden Arbeit indirekt durch steigende GH-Konzentrationen und sinkende IGF-I-Konzentrationen vor der Geburt zu sehen. Dadurch scheint es möglich, dass das Absinken der IGF-I-Konzentrationen nicht weiter stattfinden kann, da der Mechanismus der GH81 Resistenz schon ausgeschöpft ist und durch LPS nicht weiter verstärkt wird. Um eine Aussage über die GH-Resistenz in der Leber treffen zu können, wäre die Untersuchung der mRNA des GHR1A und der gesamten GHR mRNA während des Versuches und darüber hinaus von Interesse. Solche Studien wurden nicht durchgeführt. 5.4.2 Schilddrüsenhormone Bei Erkrankungen kommt es zu einer Entkopplung der Schilddrüsenachse mit erniedrigten Thyroxin- und Trijodthyroninkonzentrationen ohne einen Anstieg der TSHWerte (106). Darüber hinaus ist bei Mensch und Pferd sogar eine diagnostische Einschätzung von Erkrankungen anhand der Schwere des NTIS möglich. Je niedriger die T4-Konzentrationen sind, desto schlechter ist die Prognose (144, 145). Beim Rind wurde ein Absinken der Schilddrüsenhormone nach intravenöser LPSApplikation bereits von Kahl et al. (146) und Waggoner et al. (147) beobachtet. Dagegen konnten Husier et al. (148) keine Änderungen der Schilddrüsenhormone nach LPS-Applikation bei der Milchkuh feststellen. Die Hypothese in der vorliegenden Arbeit war, dass es zu einer Senkung der T 4Konzentrationen in beiden IGF-I-Gruppen nach intrauteriner Applikation von LPS kommt. Ein Abfall der T4-Konzentration konnte interessanterweise aber nur in der IGF-I niedrigen Gruppe bestätigt werden. In der IGF-I hohen Gruppe dagegen stiegen die T4-Konzentrationen entgegen den ursprünglichen Erwartungen sogar an. Das Absinken der T4-Werte in der IGF-I niedrigen Gruppe gegenüber der IGF-I hohen Gruppe könnte für die Entwicklung eines NTIS sprechen. Je stärker ein NTIS ausgeprägt ist, desto niedriger sind die T4-Konzentrationen, bei gleichbleibenden TSH-Werten. Zur genaueren Beurteilungen des Schilddrüsenstoffwechsels wäre dementsprechend die zusätzliche Messung von TSH notwendig, was in der vorliegenden Arbeit aber nicht Gegenstand der Untersuchung war (106). Die Bedeutung des NTIS ist noch nicht vollständig geklärt (26). Eine These besagt, dass es sich um einen protektiven Mechanismus handelt, der einen verringerten Verbrauch von Energiereserven durch einen verringerten Grundumsatz bedingt (106). Eine andere These ist, dass es sich um eine Fehladaption durch eine zu hohe Verstoffwechselung der Schilddrüsenhormone in der Peripherie kommt (106). Beide Thesen nehmen Bezug auf den Metabolismus. Somit kann geschlussfolgert werden, dass die 82 Entwicklung der Schilddrüsenhormonkonzentrationen in der vorliegenden Arbeit bei den beiden IGF-I-Gruppen auf eine unterschiedliche Adaptation des Metabolismus auf den Entzündungsreiz zurückzuführen ist. Die IGF-I niedrige Gruppe reagiert mit einer Reduzierung des Grundumsatzes, wohingegen die IGF-I hohe Gruppe den Grundumsatz erhöht (106). Ergänzend kam es in der IGF-I hohen Gruppe zu einem signifikanten Anstieg der Körpertemperatur, wohingegen die IGF-I niedrige Gruppe nur einen tendenziellen Anstieg zeigte, was durch eine höhere Aktivität der Körperzellen bedingt sein könnte (149). Durch einen NTIS ist bei Mensch und Pferd eine prognostische Einschätzung einer Krankheit möglich (144, 145). Je stärker der NTIS ausgeprägt ist, desto schlechter ist die Prognose. Übertragen auf diese Studie würde die Prognose für die IGF-I niedrige Gruppe schlechter zu stellen sein. Für die Klärung dieser Hypothese sind aber weitere Studien erforderlich. Die Hypothese wird aber auch dadurch gestützt, dass Tiere mit niedrigen IGF-IKonzentrationen eher zu postpartalen Krankheiten neigen (10). 5.4.3 Reproduktionshormone Die Auswirkungen einer intravenösen bzw. intrauterinen LPS-Applikation auf die Progesteron- und PGFM-Konzentrationen sind bereits von Gilbert et al. (150) bei zyklischen Kühen beschrieben worden. Gilbert und Kollegen wählten Probenabstände von vier Stunden nach einer LPS-Infusion und zeigten einen Anstieg der P4-Konzentrationen nach intravenöser Gabe von LPS, allerdings keinen P 4-Anstieg bei der intrauterinen LPS-Gabe. Diesen Unterschied führen Richards et al. (151) auf die vermehrten Aktivität der Nebenniere nach intravenöser Gabe von LPS zurück, da die Nebenniere neben Cortisol auch P4 produzieren kann. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass sich die P4-Konzentrationen nicht zwischen den IGF-I-Gruppen unterscheiden. Mit Blick auf die erhöhten Cortisolkonzentrationen der IGF-I niedrigen Tiere, wäre bei diesen Tieren eine erhöhte P4-Konzentration denkbar gewesen, diese Vermutung ließ sich allerdings nicht bestätigen. Weiterhin kann die vermehrte Bildung von P4 in der Nebenniere durch den noch stattfindenden Abbau der P4Konzentrationen aus der Trächtigkeit überlagert worden sein, denn es ist auch denkbar, dass das P4 aus der Nebenniere in der Leber schnell abgebaut wurde (27). 83 Unter Einfluss von LPS kommt es zu einer verminderten Produktion von Östrogenen durch Granulosazellen (152). Auf der anderen Seite bewirkt nach einer Studie von Kahl et al. (153) eine Behandlung mit Östrogenen eine erhöhte Blutkonzentration von TNF-α nach einem Entzündungsreiz mit LPS. In der vorliegenden Arbeit waren weder Unterschiede hinsichtlich der E2-Konzentrationen zwischen den IGF-I-Gruppen erkennbar, noch ließ sich durch die LPS-Gabe ein Abfall der E2-Konzentrationen nachweisen. Die Beeinflussung von Granulosazellen scheint so kurz post partum eher von untergeordneter Rolle zu sein, da der Sexualzyklus noch nicht wieder begonnen hat (27, 154). Somit sind die Ergebnisse aus Studien an zyklischen Tieren nicht mit den hier so kurz nach der Geburt gewonnenen Daten zu vergleichen. Der Einfluss von E2 auf die Entzündung ist in dieser Studie durch fehlende Entzündungsparameter, wie TNF-α und Interleukine nicht detailliert zu verfolgen. Durch die vergleichbaren E2-Konzentrationen beider IGF-I-Gruppen liegt die Vermutung nahe, dass mögliche Auswirkungen von E2 auf die Zytokinausschüttung und die Entzündungsreaktion in beiden Gruppen ähnlich waren. Die PGFM-Konzentrationen waren bei den Rindern aus der Studie von Gilbert et al. (150) vier Stunden nach einer intravenösen Gabe von LPS erhöht, nach der intrauterinen Applikation blieb sie jedoch unverändert. In der vorliegenden Arbeit war ein Anstieg der PGFM-Konzentrationen in den beiden LPS-Gruppen nach 60 Minuten feststellbar. Bereits nach 120 Minuten wurden jedoch wieder die Ausgangswerte erreicht. Gilbert et al. (150) gingen davon aus, dass eine uterine LPS-Applikation keinen Einfluss auf die PGFM-Konzentrationen hat. Im Gegensatz dazu zeigen aber die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit, dass die PGFMKonzentrationen auch nach einer uterinen LPS-Infusion kurzfristig ansteigen. Eine Ursache hinsichtlich dieser unterschiedlichen Ergebnisse könnte sein, dass bei Gilbert et al. (150) einerseits zyklische Tiere untersucht wurden, die gänzlich andere Entzündungsantworten zeigen und anderseits die Zeitpunkte der Blutprobengewinnungen mit vier Stunden viel weiter auseinander lagen als in der vorliegenden Studie. Die Vermutung, dass eine vermehrte Manipulation des Uterus zu einem Konzentrationsanstieg von PGFM geführt haben könnte, wird durch die NaCl-Gruppe entkräftet, in der ein Anstieg nach 60 Minuten ausblieb. 84 5.4.4 Cortisol und ACTH Der Zusammenhang zwischen der Somatotropen Achse und Cortisol ist im Kapitel 5.2.3 bereits beschrieben worden. Bei einer Entzündung wird beim Menschen durch die inflammatorischen Zytokine, wie beispielsweise TNF-α und IL 1β, die HSD1 vermehrt synthetisiert. Dieses Enzym bewirkt eine vermehrte Synthese von Cortisol aus Cortison. Hierdurch wird einer überschießenden bzw. lang anhaltenden Entzündungsreaktion mit der Bildung von Cortisol endogen entgegengewirkt (155). Beim Rind führt eine durch LPS hervorgerufene Entzündung ebenfalls zur Bildung von TNF-α, ACTH und Cortisol (9, 156). Bei einer experimentellen Entzündung mit LPS führt eine Behandlung mit GH bei Rindern zu verringerten TNF-α- und Cortisolkonzentrationen im Plasma (9). Ob es sich dabei um denselben Mechanismus wie beim Menschen handelt, ist anzunehmen, da auch Rinder HSD1 und HSD2 synthetisieren (157). In der vorliegenden Arbeit war bei den IGF-I niedrigen Tieren eine höhere Cortisolkonzentration nach dem Entzündungsreiz durch LPS gegenüber den IGF-I hohen Tieren zu beobachten. Ob dieses Phänomen auch mit erhöhten TNF-α-Konzentrationen bei der IGF-I niedrigen Gruppe, vergleichbar der Studie von Elsasser et al. (9) einhergeht, wurde in dieser Arbeit nicht untersucht. Ein Anstieg der ACTH-Konzentration im Gegensatz zur NaCl-Gruppe war in beiden IGF-I-Gruppen zu beobachten und scheint mit der uterinen LPS-Infusion zusammen zuhängen. Dieser Zusammenhang ist vermutlich vergleichbar mit einem ACTH-Anstieg bei intravenöser LPS-Gabe, der in der Literatur beim Rind beschrieben ist (156). Die Cortisolkonzentrationen stiegen in der IGF-I niedrigen Gruppe zwischen 30 und 150 Minuten nach der LPS-Infusion an. Ein solcher Anstieg war bei der IGF-I hohen Gruppe nicht zu beobachten. Leider ist der Zeitpunkt 180 Minuten nach LPS-Gabe für die Cortisolmessung nicht aussagekräftig, da aufgrund des Versuchsaufbaus die Tiere vor der Probe 180 Minuten an einen anderen Ort gebracht wurden und ein stressinduzierter Cortisolanstieg hier nicht auszuschließen war (158). Für die vermehrte Bildung von Cortisol bei den IGF-I niedrigen Tieren gibt es verschiedene Vermutungen, die mit der Somatotropen Achse zusammenhängen könnten: 85 Zum einen könnte die vermehrte Bildung von ACTH in der IGF-I niedrigen Gruppe dazu geführt haben, dass Cortisol höher war. Allerdings waren in der vorliegenden Arbeit keine erhöhten ACTH-Konzentrationen nachweisbar. Die Versuchsgruppe war aber auch relativ klein und dies könnte die Ursache dafür sein, dass ein statistisch nicht nachweisbarer ACTH-Unterschied zwischen den Gruppen zu unterschiedlichen Cortisolunterschieden führte. Weiterhin könnte sich die ACTH-Rezeptordichte an der Nebenniere zwischen den Tiergruppen unterschieden haben. Denkbar wäre, dass die IGF-I niedrigen Tiere mehr ACTH-Rezeptoren exprimieren und es somit zu einer vermehrten Freisetzung von Cortisol durch ACTH kam, obwohl die peripheren ACTH-Konzentrationen vergleichbar waren (159). Auch könnte die vermehrte Bildung von HSD1 in der IGF-I niedrigen Gruppe durch antepartal niedrigere IGF-I-Werte eine erhöhte Cortisolkonzentration bedingt bzw. eine erhöhte HSD2 bei den IGF-I hohen Tieren eine höhere Inaktivierung des Cortisol bewirkt haben (155). Da aber weder die ACTH-Rezeptoren der Nebenniere noch die beiden Enzyme HSD1 und HSD2 untersucht worden sind, lassen sich zu diesem Unterschied nur Vermutungen anstellen. Im Laufe einer Erkrankung nimmt Cortisol beispielsweise Einfluss auf die Lymphozyten; es kommt zu einer Verschiebung der zellulären T-Helferzellen Typ 1 (TH1) vermittelten Antwort zu einer humoralen T-Helferzellen Typ 2 (TH2) Antwort (160). Die T-Helferzellen sind an der lokale Immunantwort auch des Uterus zusammen mit den Antigen präsentierenden Zellen und T- und B-Zellen beteiligt (161). Inwiefern die Subpopulationen der T-Helferzellen sich zwischen den IGF-I-Gruppen unterscheiden und dadurch die Entwicklung einer Metritis oder Endometritis beeinflusst wird, ließ sich nicht abschließend klären. Dafür wären weitere Untersuchungen notwendig. 5.4.5 Lipopolysaccharide In der vorliegenden Arbeit konnten keine Lipopolysaccharide im Blut der Versuchstiere nachgewiesen werden. Dohmen et al. (85) erhielten vergleichbare Ergebnisse bei Versuchen mit Kühen, die eine hohe uterine Kontamination mit Bakterien aufwiesen und damit auch nachweislich LPS im Uterus, aber nicht in der Blutbahn. Dohmen et al. (85) gehen deshalb davon aus, dass LPS entweder nicht aus dem 86 Uterus aufgenommen wird oder durch IgG-Anti-LPS-Antikörper gebunden und/oder durch weitere Mechanismen entfernt wird. Eine Entzündungsreaktion ohne die Anwesenheit von LPS in der Blutbahn kann durch die LPS bindenden Rezeptoren auf den Endometriumszellen erklärt werden, die zu einer Ausschüttung von Zytokinen führen, die ihrerseits wiederum die Entzündungsantwort endokrin über den Hypothalamus und die Hypophyse zu beeinflussen vermögen (162). 5.5 Histologie In der Hämatoxylin-Eosin-Färbung histologischer Schnitte vom Uterus, der Leber, dem Muskelgewebe und dem Fettgewebe waren zwischen beiden IGF-I-Gruppen keine qualitativen morphologischen Unterschiede erkennbar. Auffällig war aber im Uterus, besonders im Endometrium, die hohe Zahl an Entzündungszellen. Um welche Immunzellen es sich handelt ist nicht abschließend zu klären, da eine Spezialfärbung nicht durchgeführt wurde. Aufgrund der Morphologie liegt aber die Vermutung nahe, dass es sich um neutrophile Granulozyten handelt. Auch hinsichtlich dieser Immunzellen waren in der Färbung keine Unterschiede zwischen den IGF-I-Gruppen zu erkennen. Ob die vermehrte Zahl der Leukozyten auf das infundierte LPS zurückzuführen ist oder im Allgemeinen mit der Geburt mit einer bakteriellen Kontamination des Uterus in Zusammenhang steht, ist hier nicht zu klären, da eine Kontrollgruppe für die Histologie fehlte. Allerdings ist zu vermuten, dass die LPS-Infusion ursächlich für einen hohen Leukozytenanteil, vor allem im Endometrium des Uterus, verantwortlich ist. LPS bedingt eine Zytokinausschüttung im Uterus und es kommt somit zu einem Anlocken der Leukozyten (88, 162). Somit ist ein massenhaftes Auftreten neutrophiler Granulozyten im Uterus nicht überraschend. Sowohl Kawashima et al. (72) als auch die vorliegenden Arbeit zeigten, dass Tiere mit niedrigem IGF-I-Konzentrationen einen erhöhten Blutgehalt an FFS haben. In der Literatur wird eine erhöhte FFS-Konzentration auch mit einem erhöhten Lipidgehalt der Leber korreliert (38, 163) und es kommt zu einer Speicherung des Fettes in Vakuolen der Leber (164). Diese Beobachtungen waren Grund für die Hypothese, dass IGF-I niedrigere Tiere deutlich mehr Lipid-Vakuolen in der Leber aufweisen könnten, verglichen mit IGF-I hohen Tieren. Diese Hypothese konnte durch Auszählen der Vakuolen im histologischen Schnitt der Leber allerdings in der eigenen 87 Arbeit nicht bestätigt werden. Durch den unterschiedlichen Gehalt an FFS im Blut der beiden IGF-I-Gruppen wäre eine objektive Auswertung des Gesamt Lipidgehalt der Leber notwendig gewesen, um mögliche Unterschiede darstellen zu können. Die Expression des Wachstumshormonrezeptors im Uterus decken sich mit den Beschreibungen von Kölle et al. (165). Der GHR war immunhistologisch im Endometrium in den uterinen Drüsen und in den Wänden der Arterien nachweisbar. In der vorliegenden Arbeit sind allerdings vermehrt Immunzellen darstellbar gewesen, die GHR positiv gefärbt sind. Diese, wie bereits bei der HE-Färbung beschrieben, wahrscheinlichen neutrophilen Granulozyten befinden sich vornehmlich im Endometrium. Dieser Umstand könnte mit der Chemotaxis ausgelöst durch LPS zusammenhängen (88). Der GHR ist in verschieden Publikationen auf Immunzellen nachgewiesen worden und auch um den Geburtszeitpunkt sind bei den Milchkühe morphologisch die GHR auf den Immunzellen nachweisbar. Über deren Funktionstüchtigkeit kann an dieser Stelle keine Aussage getroffen werden. Der positive Nachweis von GHR auf dem neutrophilen Granulozyten untermauert die von Borghetti et al. (6) vermuteten engen Regulationsmechanismen zwischen der zum Teil lokalen Hormonfreisetzung und den Immunzellen. Im Zytoplasma der Hepatozyten der Leber war ebenfalls eine deutliche GHR-Färbung zu beobachten. Dies geht einher mit den Beobachtungen von Kobayashi et al. (52), die zwar einen Rückgang des GHR zum Zeitpunkt der Geburt, aber kein vollständiges Verschwinden in der Leber nachweisen konnten. Die immunhistochemische Darstellung des GHR in den Gallengänge ist in dieser Arbeit nicht endgültig zu bewerten, da eine positive Färbung auch mit dem Kontrollserum erfolgte und nicht weiter bearbeitet worden ist. Der Rückgang der IGF-I-Konzentration wurde mit einer verminderten Expression des GHR 1A in Zusammenhang gebracht (55). In der vorliegenden Arbeit wurde allerdings nur der qualitative Nachweis des GHR erbracht. Dabei zeigten sich zwischen den IGF-I-Gruppen keine Unterschiede. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit dem in der Literatur beschriebenen (55). Zum Zeitpunkt der Geburt unterschieden sich die IGF-I-Werte nicht mehr zwischen den Tiergruppen und eine positive Korrelation des GHR mit den IGF-I-Konzentrationen wurde gezeigt (55). Hierbei konnte aber auch gezeigt werden, dass in der Verteilung des GHR in den 88 verschiedenen Arealen kein qualitativer Unterschied bestand. Es ist anhand des vorliegenden immunhistologischen Nachweises keine Aussage über die Funktionsfähigkeit des GHRs zu machen, da mittlerweile Untersuchungen gezeigt haben, dass der intrazelluläre Übertragungsweg verändert sein könnte und somit die Funktion der GHR eingeschränkt ist, obwohl das Protein immunhistochemisch noch auf den Hepatozyten nachweisbar ist (166). Im Fettgewebe war keine Färbung des GHR erkennbar. Von Lucy et al. (54) ist der GHR allerdings auf den Fettzellen nachgewiesen worden. Es lässt sich leider nicht ausschließen, dass es in der eigenen Arbeit zu einem Auslösen der GHR aus den Fettzellen während der Präparation kam. 5.6 Schlussfolgerungen Mit einer einzelnen Bestimmung des Parameters IGF-I war eine Einteilung in zwei Tiergruppen möglich, die sich auch noch bis kurz vor die Geburt in ihren IGF-IKonzentrationen unterschieden. Dabei blieben die GH-Konzentrationen entgegen der anfänglichen Hypothese aber vergleichbar. Zusätzlich zeigten das metabolisch aktive Hormon T4 und der metabolische Parameter FFS an, dass die IGF-I niedrige Gruppe offenbar einer höheren metabolischen Belastung unterlag als die IGF-I hohe Gruppe. Diese Entwicklung könnte sich bereits zum Zeitpunkt der Geburt auf das Uterusmilieu ausgewirkt haben, dass mit einer stärkeren Besiedelung durch anaerobe Bakterienarten in der IGF-I niedrigen Gruppe korrelierte. Die Entwicklung während der Frühphase einer postpartal induzierten uterinen Entzündung zeigte, dass die beiden Tiergruppen unterschiedliche hormonelle Änderungen aufwiesen. Hierbei fielen vor allem die metabolisch aktiven T 4-Konzentrationen und die Cortisolkonzentrationen auf, die sich zwischen den beiden IGF-IGruppen unterschiedlich entwickelten. Die unterschiedlichen endokrinen Gegebenheiten lassen Aufgrund der Auswirkungen auf Immunzellen eine unterschiedliche Wirkung auf Erreger vermuten. Eine Bewertung des IGF-I-Wertes vor der Geburt könnte somit helfen, immunologisch gefährdetere Tiere bereits im Vorfeld zu erkennen und gegebenenfalls bei Krankheitserscheinungen zu intervenieren. Im Vorhandensein des GHR in den verschiedenen Geweben konnte mit den hier verwendeten Methoden entgegen der Hypothese keine Unterschiede festgestellt werden. 89 6 Zusammenfassung Lars Holzhausen „Einfluss des Insulin-like Growth Factor Systems auf die endokrinologische Antwort nach einer experimentell induzierten Inflammation des Uterus“ Milchkühe mit einer niedrigen Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor I (IGF-I)Konzentration vier bis sechs Wochen vor der Geburt zeigen eine höhere Krankheitsinzidenz als Tiere mit hohen IGF-I-Werten. Die Wachstumshormon (GH)-IGF-I-Achse interagiert mit dem Immunsystem und anderen endokrinen Achsen. In der vorliegenden Arbeit wurde geprüft, welchen Einfluss unterschiedliche IGF-IKonzentrationen bei Rindern zwischen dem 240. bis 254. Tag post inseminationem (p. insem.) auf die endokrinologische Entwicklung während der Spätträchtigkeit haben. Desweiteren sollte nach der Geburt die endokrinologische Reaktion auf einen Entzündungsreiz im Uterus untersucht werden. Für die Untersuchung wurde zunächst gesunden pluriparen Holstein Friesian Kühen zwischen dem 240. bis 254. Tag p. insem. jeweils eine Blutprobe entnommen, um die periphere IGF-I-Konzentration zu bestimmen. Anhand der Blutwerte wurden daraufhin jeweils zehn Tiere mit hohen (>175 ng/ml) und zehn mit niedrigen (<125 ng/ml) IGF-I-Konzentrationen ausgewählt und vor dem 266. Tag p. insem in die Klinik für Rinder überführt. Ein IGF-I niedriges Tier wurde aufgrund hoher Aggressivität aus dem Versuch ausgeschlossen, so dass letztlich mit Gruppen von 10 IGF-I hohen und 9 IGF-I niedrigen Tieren gearbeitet wurde. Allen Tieren wurde vom 266. Tag p. insem. bis zur Spontangeburt täglich Blut entnommen. Die Kühe, die bis zur Spontangeburt klinisch gesund waren und eine physiologische Geburt sowie einen normalen Nachgeburtsabgang (< 12 Stunden; h) zeigten, wurden im weiteren Verlauf der Studie für einen postpartalen Entzündungsversuch verwendet. Hierzu erfolgte eine intrauterine Infusion von 1000 ml Lipopolysaccharid (LPS) Lösung (E. coli O55:B5, Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA, Endkonzentration 5 µg/ml, IGF-I hoch n=6 und IGF-I niedrig n=6) 30 Minuten nach Abgang der Nachgeburt. 90 Die Tiere, die den Kriterien nicht entsprachen, wurden als Kontrolltiere (n=7) genutzt, d.h. an ihnen wurden die Änderungen endokriner Parameter ohne iatrogen induzierten Entzündungsreiz (12 h p.p.; 1000 ml physiologische Kochsalzlösung intrauterin) untersucht. Bei allen Tieren wurde zehn Minuten vor der Infusion eine Tupferprobe aus dem Uterus entnommen, die auf den mikrobiellen Keimgehalt hin untersucht wurde. Des Weiteren wurden jeweils einmal vor und sechs Mal nach der Infusion im Abstand von jeweils 30 Minuten Blutproben aus der Vena jugularis entnommen. Nach 180 Minuten wurden die LPS-Versuchstiere euthanasiert und Gewebeproben aus Uterus, Leber, Muskulatur und Fettgewebe entnommen. Anhand der Blutproben wurden die Konzentrationen von IGF-I, GH, Cortisol, Prostaglandin F2α Metabolit, Trijodthyronin, Thyroxin (T4), Insulin, freien Fettsäuren (FFS) und dem adrenocorticotropen Hormon bestimmt. In den Gewebeproben wurde die Expression des Wachstumshormonrezeptors immunhistologisch ermittelt. Eine semiquantitative Analyse der Rezeptor Expressionsstärke wurde in Leberproben durchgeführt. Bis zum 275. Tag p. insem. unterschied (P < 0,05) sich die IGF-I-Konzentrationen im Blut der beiden Gruppen. Jedoch fiel zur Geburt hin die IGF-I-Konzentration in der IGF-I hohen Gruppe stärker ab als in der IGF-I niedrigen Gruppe (P < 0,05). Die Wachstumshormonkonzentrationen blieben hingegen bei beiden Gruppen vergleichbar (P > 0,05). Zudem wiesen die IGF-I niedrigen Tiere während des präpartalen Zeitraums niedrigere T4-Konzentrationen, sowie höhere FFS- und Cortisolkonzentration als die IGF-I hohen Tiere auf (P < 0,05). Zum Zeitpunkt des LPS-Versuches enthielten die Tupferproben der IGF-I niedrigen Tiere signifikant häufiger Clostridien als diejenigen der Tiere mit hohen IGF-I-Konzentrationen. Die intrauterine Infusion von LPS führte bei den sechs Tieren der IGF-I niedrigen Gruppe zu einem Abfall der T4-Konzentrationen. Im Gegensatz dazu kam es bei den sechs IGF-I hohen Tieren zu einem Anstieg (P < 0,05). Des Weiteren waren die Cortisolkonzentrationen der IGF-I niedrigen Tiere höher (P < 0,05) als die der IGF-I hohen Tiere und nur bei den IGF-I niedrigen Tieren war zudem 150 Minuten post infusionem ein Anstieg der Cortisolkonzentrationen zu verzeichnen (P < 0,05). Histologisch waren zwischen den beiden IGF-I-Gruppen keine Unterschiede zu erkennen. Der Wachstumshormonrezeptor war immunhistologisch in 91 allen untersuchten Geweben nachweisbar. Eine unterschiedliche Expressionsstärke war nicht erkennbar. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen Unterschiede in der hormonellen Konstellation und der Reaktion auf einen Entzündungsreiz im Uterus zwischen den IGF-I-Gruppen. Dieses könnte mit einer erhöhten Krankheitsanfälligkeit der IGF-I niedrigen Tiere aus anderen Publikationen korrelieren. Die endokrinen Unterschiede könnten sich unterschiedlich auf die Immunzellen auswirken. 92 7 Summary Lars Holzhausen “Influence of the Insulin-like Growth Factor system on the endocrinological answer after an experimentally induced inflammation of the uterus” Dairy cattle with low Insulin-like Growth Factor I (IGF-I) concentrations four to six weeks before parturition show a higher incidence of production diseases in comparison to animals with high IGF-I levels at this time. The Growth Hormone (GH)-IGF-I axis interacts with the immune system and other endocrine axes. This present work analysed the influence of different IGF-I concentrations of cattle between the days 240 to 254 post inseminationem (p. insem.) on the endocrine systems during late pregnancy. Furthermore, endocrine changes after an intrauterine inflammatory insult after parturition were investigated. Blood samples were taken from healthy pluriparous Holstein Friesian cows between days 240 and 254 p. insem. to determine peripheral IGF-I concentrations. Ten animals with high (>175 ng/ml) and ten with low (<125 ng/ml) IGF-I concentrations were selected for further studies. The cows were transported to the Clinic for Cattle before day 266 p. insem. One IGF-I low animal was excluded from the experiment before day 266 due to severe aggressiveness. Blood samples were taken daily from the remaining ten IGF-I high and nine IGF-I low animals until birth occurred spontaneously. For a postpartal inflammatory challenge the following essential factors were defined: clinical healthiness until birth, a physiological parturition, and an expulsion of the placenta within 12 hours after birth. Thirty minutes after the release of the placenta an intrauterine infusion was performed with 1000 ml Lipopolysaccharide (LPS) solution (E. coli O55:B5, Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA, concentration 5 µg/ml, IGF-I high and IGF-I low cows each n = 6). Cows, which did not fulfill the present criteria, were used as a control group (n = 7). Endocrine parameters were examined without an iatrogenic inflammatory insult (12 h p.p.; 1000 ml physiological sodium chloride solution intrauterine). 93 A swap sample was taken from every cow 10 minutes before the infusion and examined for microbiological contamination. Furthermore, a blood sample from the vena jugularis was withdrawn before and six times after the infusion in 30 minutes intervals. After 180 minutes the LPS group was sacrificed and tissue samples were taken from uterus, liver, muscle, and fat. The parameters IGF-I, GH, Cortisol, Prostaglandin F2α metabolite, Trijodthyronin, thyroxin (T4), Insulin, Non-Esterified Fatty Acids (NEFA), and Adrenocorticotropic hormone were determined in blood. The tissue samples were examined for the expression of the GH receptor. The liver was additionally semi-quantitatively analyzed for the expression amount of the GH receptor. Until day 275 p. insem. the IGF-I concentrations between the groups were different (P < 0.05). The IGF-I concentration of the IGF-I high group showed a more distinct decline compared to the IGF-I low group (P < 0.05). In contrast the GH concentrations remained constant in both groups of animals (P > 0.05). Furthermore, during the time period before parturition the IGF-I low group showed lower T4 concentrations as well as higher cortisol and higher NEFA concentrations than the IGF-I high group (P < 0.05). Immediately before the LPS infusion the swap samples of the IGF-I low animals contained significantly more Clostridium species compared to the IGF-I high animals. The intrauterine infusion of LPS led to a decline of T 4 in the six IGF-I low cows and to rise of T4 in the six IGF-I high animals (P < 0.05). Cortisol concentrations of the IGF-I low animals were higher (P < 0.05) compared to the IGF-I high group and after 150 minutes an increase (P < 0.05) could be noticed only in the IGF-I low group. There were no histological differences (P ≥ 0.05) between the two IGF-I groups. The GH receptor was detectable via immune histology in all examined tissues. A difference in the expression amount of the liver was not seen. The results of this work show differences in the endocrine constellation and the reaction on an inflammatory insult in the uterus between the IGF-I groups. This might correlate to a higher risk of production diseases in the IGF-I low group out of other publications. This endocrine differences could influence immune cells differently. 94 8 Literatur 1. Mulligan FJ, Doherty ML. Production diseases of the transition cow. Vet J. 2008 Apr;176(1):3-9. 2. Ingvartsen KL, Dewhurst RJ, Friggens NC. On the relationship between lactational performance and health: is it yield or metabolic imbalance that cause production diseases in dairy cattle? A position paper. Livestock Production Science. 2003 Oct;83(2-3):277-308. 3. Sheldon IM, Dobson H. Postpartum uterine health in cattle. Anim Reprod Sci. 2004 Jul;82-83:295-306. 4. Sheldon IM, Williams EJ, Miller AN, Nash DM, Herath S. Uterine diseases in cattle after parturition. Vet J. 2008 Apr;176(1):115-21. 5. Sheldon IM, Cronin J, Goetze L, Donofrio G, Schuberth HJ. Defining postpartum uterine disease and the mechanisms of infection and immunity in the female reproductive tract in cattle. Biol Reprod. 2009 Dec;81(6):1025-32. 6. Borghetti P, Saleri R, Mocchegiani E, Corradi A, Martelli P. Infection, immunity and the neuroendocrine response. Vet Immunol Immunopathol. 2009 Aug 15;130(34):141-62. 7. Radcliff RP, McCormack BL, Crooker BA, Lucy MC. Plasma hormones and expression of growth hormone receptor and insulin-like growth factor-I mRNA in hepatic tissue of periparturient dairy cows. J Dairy Sci. 2003 Dec;86(12):3920-6. 8. Heemskerk VH, Daemen MA, Buurman WA. Insulin-like growth factor-1 (IGF- 1) and growth hormone (GH) in immunity and inflammation. Cytokine Growth Factor Rev. 1999 Mar;10(1):5-14. 9. Elsasser TH, Fayer R, Rumsey TS, Hartnell GF. Recombinant bovine somatotropin blunts plasma tumor necrosis factor-alpha, cortisol, and thromboxaneB2 responses to endotoxin in vivo. Endocrinology. 1994 Mar;134(3):1082-8. 10. al. Piechotta M, Sander AK, Kastelic JP, Wilde R, Heppelmann M, Rudolphi B, et Short communication: Prepartum plasma insulin-like growth factor-I concentrations based on day of insemination are lower in cows developing postpartum diseases. Journal of Dairy Science. 2012;95(3):1-4. 11. Grummer RR. Impact of changes in organic nutrient metabolism on feeding the transition dairy cow. J Anim Sci. 1995 Sep;73(9):2820-33. 95 12. Drackley JK. ADSA Foundation Scholar Award. Biology of dairy cows during the transition period: the final frontier? J Dairy Sci. 1999 Nov;82(11):2259-73. 13. Jouany JP. Optimizing rumen functions in the close-up transition period and early lactation to drive dry matter intake and energy balance in cows. Anim Reprod Sci. 2006 Dec;96(3-4):250-64. 14. Grant RJ, Albright JL. Feeding behavior and management factors during the transition period in dairy cattle. J Anim Sci. 1995 Sep;73(9):2791-803. 15. LeBlanc S. Monitoring metabolic health of dairy cattle in the transition period. J Reprod Dev. 2010 Jan;56 Suppl:S29-35. 16. Bertics SJ, Grummer RR, Cadorniga-Valino C, Stoddard EE. Effect of prepartum dry matter intake on liver triglyceride concentration and early lactation. J Dairy Sci. 1992 Jul;75(7):1914-22. 17. Moe PW, Tyrrell HF. Metabolizable energy requirements of pregnant dairy cows. J Dairy Sci. 1972 Apr;55(4):480-3. 18. Bell AW. Regulation of organic nutrient metabolism during transition from late pregnancy to early lactation. J Anim Sci. 1995 Sep;73(9):2804-19. 19. Bauman DE, Currie WB. Partitioning of nutrients during pregnancy and lactation: a review of mechanisms involving homeostasis and homeorhesis. J Dairy Sci. 1980 Sep;63(9):1514-29. 20. Chilliard Y, Sauvant D, Hervieu J, Dorleans M, Morandfehr P. Lipoprotein- Lipase Activity and Composition of Omental Adipose-Tissue as Related to LipidMetabolism of Goat in Late Pregnancy and Early Lactation. Annales De Biologie Animale Biochimie Biophysique. 1977;17(6):1021-33. 21. Vernon RG. Lipid metabolism during lactation: a review of adipose tissue-liver interactions and the development of fatty liver. J Dairy Res. 2005 Nov;72(4):460-9. 22. Bell AW, Burhans WS, Overton TR. Protein nutrition in late pregnancy, maternal protein reserves and lactation performance in dairy cows. Proc Nutr Soc. 2000 Feb;59(1):119-26. 23. Lucy MC, Jiang H, Kobayashi Y. Changes in the Somatotrophic Axis Associated with the Initiation of Lactation. J Dairy Sci. 2001 29.8.2000;84(E. Suppl.):E113 - E9. 24. von Engelhardt W, Breves G. Physiologie der Haustiere. 2 ed. Stuttgart: Enke; 2005. 96 25. Pezzi C, Accorsi PA, Vigo D, Govoni N, Gaiani R. 5'-deiodinase activity and circulating thyronines in lactating cows. J Dairy Sci. 2003 Jan;86(1):152-8. 26. Aceves C, Ruiz A, Romero C, Valverde C. Homeorhesis during early lactation. Euthyroid sick-like syndrome in lactating cows. Acta Endocrinol (Copenh). 1985 Dec;110(4):505-9. 27. Kindahl H, Kornmatitsuk B, Gustafsson H. The cow in endocrine focus before and after calving. Reprod Domest Anim. 2004 Aug;39(4):217-21. 28. Eissa HM, el-Belely MS. Sequential changes in plasma progesterone, total oestrogens and corticosteroids in the cow throughout pregnancy and around parturition. Br Vet J. 1990 Jan-Feb;146(1):24-9. 29. Patel OV, Takahashi T, Takenouchi N, Hirako M, Sasaki N, Domeki I. Peripheral cortisol levels throughout gestation in the cow: effect of stage of gestation and foetal number. Br Vet J. 1996 Jul;152(4):425-32. 30. Chew BP, Erb RE, Fessler JF, Callahan CJ, Malven PV. Effects of ovariectomy during pregnancy and of prematurely induced parturition on progesterone, estrogens, and calving traits. J Dairy Sci. 1979 Apr;62(4):557-66. 31. Hoffmann B, Schuler G. The bovine placenta; a source and target of steroid hormones: observations during the second half of gestation. Domest Anim Endocrinol. 2002 Jul;23(1-2):309-20. 32. Stabenfeldt GH, Osburn BI, Ewing LL. Peripheral plasma progesterone levels in the cow during pregnancy and parturition. Am J Physiol. 1970 Feb;218(2):571-5. 33. Konigsson K, Kask K, Gustafsson H, Kindahl H, Parvizi N. 15-ketodihydro- PGF2 alpha, progesterone and cortisol profiles in heifers after induction of parturition by injection of dexamethasone. Acta Vet Scand. 2001;42(1):151-9. 34. Flint APF, Ricketts AP, Craig VA. Control of Placental Steroid-Synthesis at Parturition in Domestic-Animals. Animal Reproduction Science. 1979;2(1-3):239-51. 35. Edqvist LE, Kindahl H, Stabenfeldt G. Release of prostaglandin F 2alpha during the bovine peripartal period. Prostaglandins. 1978 Jul;16(1):111-9. 36. Robinson R, Anastassiadis PA, Common RH. Estrone concentrations in the peripheral blood of pregnant cows. II. Values around parturition. J Dairy Sci. 1971 Dec;54(12):1832-9. 37. Sheldon IM, Noakes DE, Dobson H. Effect of the regressing corpus luteum of pregnancy on ovarian folliculogenesis after parturition in cattle. Biol Reprod. 2002 Feb;66(2):266-71. 97 38. Hammon HM, Sturmer G, Schneider F, Tuchscherer A, Blum H, Engelhard T, et al. Performance and metabolic and endocrine changes with emphasis on glucose metabolism in high-yielding dairy cows with high and low fat content in liver after calving. J Dairy Sci. 2009 Apr;92(4):1554-66. 39. Rhoads RP, Kim JW, Leury BJ, Baumgard LH, Segoale N, Frank SJ, et al. Insulin increases the abundance of the growth hormone receptor in liver and adipose tissue of periparturient dairy cows. J Nutr. 2004 May;134(5):1020-7. 40. Meikle A, Kulcsar M, Chilliard Y, Febel H, Delavaud C, Cavestany D, et al. Effects of parity and body condition at parturition on endocrine and reproductive parameters of the cow. Reproduction. 2004 Jun;127(6):727-37. 41. Bonczek RR, W. YC, Wheaton JE, Miller KP. Responses of Somatotropin, Insulin, Prolactin, and Thyroxine to Selectionfo Milk Yield in Holsteins. J Dairy Sci. 1988;71:2470 - 9. 42. Evans HM, Long JA. The effect of the anterior lobe of the hypophysis administered intraperitoneally upon growth and maturity and estrous cycles of the rat. Anat Record. 1921;21:62 - 3. 43. Salmon WD, Jr., Daughaday WH. A hormonally controlled serum factor which stimulates sulfate incorporation by cartilage in vitro. J Lab Clin Med. 1957 Jun;49(6):825-36. 44. Rinderknecht E, Humbel RE. The amino acid sequence of human insulin-like growth factor I and its structural homology with proinsulin. J Biol Chem. 1978 Apr 25;253(8):2769-76. 45. Frago LM, Chowen JA. Basic physiology of the growth hormone/insulin-like growth factor axis. Adv Exp Med Biol. 2005;567:1-25. 46. Jansson JO, Eden S, Isaksson O. Sexual dimorphism in the control of growth hormone secretion. Endocr Rev. 1985 Spring;6(2):128-50. 47. Zeitler P, Vician L, Chowen-Breed JA, Argente J, Tannenbaum GS, Clifton DK, et al. Regulation of somatostatin and growth hormone-releasing hormone gene expression in the rat brain. Metabolism. 1990 Sep;39(9 Suppl 2):46-9. 48. Butler ST, Marr AL, Pelton SH, Radcliff RP, Lucy MC, Butler WR. Insulin restores GH responsiveness during lactation-induced negative energy balance in dairy cattle: effects on expression of IGF-I and GH receptor 1A. J Endocrinol. 2003 Feb;176(2):205-17. 98 49. Renaville R, Hammadi M, Portetelle D. Role of the somatotropic axis in the mammalian metabolism. Domest Anim Endocrinol. 2002 Jul;23(1-2):351-60. 50. Lucy MC. Functional differences in the growth hormone and insulin-like growth factor axis in cattle and pigs: implications for post-partum nutrition and reproduction. Reprod Domest Anim. 2008 Jul;43 Suppl 2:31-9. 51. Berryman DE, List EO, Sackmann-Sala L, Lubbers E, Munn R, Kopchick JJ. Growth hormone and adipose tissue: beyond the adipocyte. Growth Horm IGF Res. 2011 Jun;21(3):113-23. 52. Kobayashi Y, Boyd CK, Bracken CJ, Lamberson WR, Keisler DH, Lucy MC. Reduced growth hormone receptor (GHR) messenger ribonucleic acid in liver of periparturient cattle is caused by a specific down-regulation of GHR 1A that is associated with decreased insulin-like growth factor I. Endocrinology. 1999 Sep;140(9):3947-54. 53. Ballesteros M, Leung KC, Ross RJ, Iismaa TP, Ho KK. Distribution and abundance of messenger ribonucleic acid for growth hormone receptor isoforms in human tissues. J Clin Endocrinol Metab. 2000 Aug;85(8):2865-71. 54. Lucy MC, Boyd CK, Koenigsfeld AT, Okamura CS. Expression of somatotropin receptor messenger ribonucleic acid in bovine tissues. J Dairy Sci. 1998 Jul;81(7):1889-95. 55. Radcliff RP, McCormack BL, Crooker BA, Lucy MC. Growth hormone (GH) binding and expression of GH receptor 1A mRNA in hepatic tissue of periparturient dairy cows. J Dairy Sci. 2003 Dec;86(12):3933-40. 56. Carroll JA. Bidirectional communication: growth and immunity in domestic livestock. J Anim Sci. 2008 Apr;86(14 Suppl):E126-37. 57. Lassarre C, Hardouin S, Daffos F, Forestier F, Frankenne F, Binoux M. Serum insulin-like growth factors and insulin-like growth factor binding proteins in the human fetus. Relationships with growth in normal subjects and in subjects with intrauterine growth retardation. Pediatr Res. 1991 Mar;29(3):219-25. 58. Holland MD, Hossner KL, Williams SE, Wallace CR, Niswender GD, Odde KG. Serum concentrations of insulin-like growth factors and placental lactogen during gestation in cattle. I. Fetal profiles. Domest Anim Endocrinol. 1997 Jul;14(4):231-9. 59. Yakar S, Liu JL, Stannard B, Butler A, Accili D, Sauer B, et al. Normal growth and development in the absence of hepatic insulin-like growth factor I. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Jun 22;96(13):7324-9. 99 60. D'Ercole AJ, Stiles AD, Underwood LE. Tissue concentrations of somatomedin C: further evidence for multiple sites of synthesis and paracrine or autocrine mechanisms of action. Proc Natl Acad Sci U S A. 1984 Feb;81(3):935-9. 61. Hwa V, Oh Y, Rosenfeld RG. The insulin-like growth factor-binding protein (IGFBP) superfamily. Endocr Rev. 1999 Dec;20(6):761-87. 62. Baxter RC. Insulin-like growth factor binding proteins as glucoregulators. Metabolism. 1995 Oct;44(10 Suppl 4):12-7. 63. Firth SM, Baxter RC. Cellular actions of the insulin-like growth factor binding proteins. Endocr Rev. 2002 Dec;23(6):824-54. 64. Rodriguez FM, Salvetti NR, Panzani CG, Barbeito CG, Ortega HH, Rey F. Influence of insulin-like growth factor-binding proteins-2 and -3 in the pathogenesis of cystic ovarian disease in cattle. Anim Reprod Sci. 2011 Oct;128(1-4):1-10. 65. Gross J, van Dorland HA, Schwarz FJ, Bruckmaier RM. Endocrine changes and liver mRNA abundance of somatotropic axis and insulin system constituents during negative energy balance at different stages of lactation in dairy cows. J Dairy Sci. 2011 Jul;94(7):3484-94. 66. Breier BH. Regulation of protein and energy metabolism by the somatotropic axis. Domest Anim Endocrinol. 1999 Oct;17(2-3):209-18. 67. Okamura CS, Bader JF, Keisler DH, Lucy MC. Short communication: Growth hormone receptor expression in two dairy breeds during the periparturient period. J Dairy Sci. 2009 Jun;92(6):2706-10. 68. Jiang H, Lucy MC, Crooker BA, Beal WE. Expression of growth hormone receptor 1A mRNA is decreased in dairy cows but not in beef cows at parturition. J Dairy Sci. 2005 Apr;88(4):1370-7. 69. Dahl GE, Chapin LT, Allen MS, Moseley WM, Tucker HA. Comparison of somatotropin and growth hormone-releasing factor on milk yield, serum hormones, and energy status. J Dairy Sci. 1991 Oct;74(10):3421-8. 70. Bauman DE, Vernon RG. Effects of exogenous bovine somatotropin on lactation. Annu Rev Nutr. 1993;13:437-61. 71. Kawashima C, Fukihara S, Maeda M, Kaneko E, Montoya CA, Matsui M, et al. Relationship between metabolic hormones and ovulation of dominant follicle during the first follicular wave post-partum in high-producing dairy cows. Reproduction. 2007 Jan;133(1):155-63. 100 72. Kawashima C, Sakaguchi M, Suzuki T, Sasamoto Y, Takahashi Y, Matsui M, et al. Metabolic profiles in ovulatory and anovulatory primiparous dairy cows during the first follicular wave postpartum. J Reprod Dev. 2007 Feb;53(1):113-20. 73. Kelton DF, Lissemore KD, Martin RE. Recommendations for recording and calculating the incidence of selected clinical diseases of dairy cattle. J Dairy Sci. 1998 Sep;81(9):2502-9. 74. DeGaris PJ, Lean IJ. Milk fever in dairy cows: a review of pathophysiology and control principles. Vet J. 2008 Apr;176(1):58-69. 75. Herath S, Dobson H, Bryant CE, Sheldon IM. Use of the cow as a large animal model of uterine infection and immunity. Journal of Reproductive Immunology. 2006 Feb;69(1):13-22. 76. Tierschutzleitlinie für die Milchkuhhaltung, (2007). 77. Dirksen G, Gründer H-D, Stöber M. Innere Medizin und Chirurgie des Rindes. 5. ed: Parey, Stuttgart; 2006. 78. Drackley JK, Overton TR, Douglas GN. Adaptations of Glucose and Long- Chain Fatty Acid Metabolism in Liver of Dairy Cows During the Periperturient Period. J Dairy Sci(E Suppl). 2001;84:E100 - E12. 79. Doll K, Sickinger M, Seeger T. New aspects in the pathogenesis of abomasal displacement. Vet J. 2009 Aug;181(2):90-6. 80. Seifi HA, Leblanc SJ, Leslie KE, Duffield TF. Metabolic predictors of post- partum disease and culling risk in dairy cattle. Vet J. 2011 May;188(2):216-20. 81. Kankofer M, Albera E, Feldman M, Gundling N, Hoedemaker M. Comparison of antioxidative/oxidative profiles in blood plasma of cows with and without retained fetal placental membranes. Theriogenology. 2010 Nov;74(8):1385-95. 82. Beagley JC, Whitman KJ, Baptiste KE, Scherzer J. Physiology and treatment of retained fetal membranes in cattle. J Vet Intern Med. 2010 Mar-Apr;24(2):261-8. 83. Drillich M, Pfutzner A, Sabin HJ, Sabin M, Heuwieser W. Comparison of two protocols for the treatment of retained fetal membranes in dairy cattle. Theriogenology. 2003 Feb;59(3-4):951-60. 84. Heuwieser W, Grunert E. SIGNIFICANCE OF CHEMOTACTIC ACTIVITY FOR PLACENTAL EXPULSION IN CATTLE. Theriogenology. 1987 Jun;27(6):90712. 85. Dohmen MJ, Joop K, Sturk A, Bols PE, Lohuis JA. Relationship between intra- uterine bacterial contamination, endotoxin levels and the development of 101 endometritis in postpartum cows with dystocia or retained placenta. Theriogenology. 2000 Oct 15;54(7):1019-32. 86. Sheldon IM, Lewis GS, LeBlanc S, Gilbert RO. Defining postpartum uterine disease in cattle. Theriogenology. 2006 May;65(8):1516-30. 87. Kaufmann TB, Drillich M, Tenhagen BA, Heuwieser W. Correlations between periparturient serum concentrations of non-esterified fatty acids, beta-hydroxybutyric acid, bilirubin, and urea and the occurrence of clinical and subclinical postpartum bovine endometritis. BMC Vet Res. 2010;6:47. 88. Tizard IR. Veterinary Immunology: An Introduction. 7. ed. Philadelphia, Pennsylvania: Saunders; 2004. 89. Herath S, Fischer DP, Werling D, Williams EJ, Lilly ST, Dobson H, et al. Expression and function of Toll-like receptor 4 in the endometrial cells of the uterus. Endocrinology. 2006 Jan;147(1):562-70. 90. edge: Hoshino K, Takeuchi O, Kawai T, Sanjo H, Ogawa T, Takeda Y, et al. Cutting Toll-like receptor 4 (TLR4)-deficient mice are hyporesponsive to lipopolysaccharide: evidence for TLR4 as the Lps gene product. J Immunol. 1999 Apr 1;162(7):3749-52. 91. Bertok L. Endotoxins and endocrine system. Domest Anim Endocrinol. 1998 Sep;15(5):305-8. 92. Whitlock BK, Daniel JA, Wilborn RR, Elsasser TH, Carroll JA, Sartin JL. Comparative aspects of the endotoxin- and cytokine-induced endocrine cascade influencing neuroendocrine control of growth and reproduction in farm animals. Reprod Domest Anim. 2008 Jul;43 Suppl 2:317-23. 93. Sartin JL, Elsasser TH, Gunter DR, McMahon CD. Endocrine modulation of physiological responses to catabolic disease. Domest Anim Endocrinol. 1998 Sep;15(5):423-9. 94. Mehrzad J, Duchateau L, Pyorala S, Burvenich C. Blood and milk neutrophil chemiluminescence and viability in primiparous and pluriparous dairy cows during late pregnancy, around parturition and early lactation. J Dairy Sci. 2002 Dec;85(12):3268-76. 95. Hoeben D, Monfardini E, Opsomer G, Burvenich C, Dosogne H, De Kruif A, et al. Chemiluminescence of bovine polymorphonuclear leucocytes during the periparturient period and relation with metabolic markers and bovine pregnancyassociated glycoprotein. J Dairy Res. 2000 May;67(2):249-59. 102 96. Mallard BA, Dekkers JC, Ireland MJ, Leslie KE, Sharif S, Vankampen CL, et al. Alteration in immune responsiveness during the peripartum period and its ramification on dairy cow and calf health. J Dairy Sci. 1998 Feb;81(2):585-95. 97. Sander AK, Piechotta M, Schlamberger G, Bollwein H, Kaske M, Sipka A, et al. Ex vivo phagocytic overall performance of neutrophilic granulocytes and the relation to plasma insulin-like growth factor-I concentrations in dairy cows during the transition period. J Dairy Sci. 2011 Apr;94(4):1762-71. 98. Tibbetts TA, Conneely OM, O'Malley BW. Progesterone via its receptor antagonizes the pro-inflammatory activity of estrogen in the mouse uterus. Biol Reprod. 1999 May;60(5):1158-65. 99. Heuwieser W, Tenhagen BA, Tischer M, Luhr J, Blum H. Effect of three programmes for the treatment of endometritis on the reproductive performance of a dairy herd. Vet Rec. 2000 Mar 18;146(12):338-41. 100. LeBlanc SJ, Duffield TF, Leslie KE, Bateman KG, Keefe GP, Walton JS, et al. The effect of treatment of clinical endometritis on reproductive performance in dairy cows. J Dairy Sci. 2002 Sep;85(9):2237-49. 101. Sheldon IM, Noakes DE. Comparison of three treatments for bovine endometritis. Vet Rec. 1998 May 23;142(21):575-9. 102. Eskandari F, Webster JI, Sternberg EM. Neural immune pathways and their connection to inflammatory diseases. Arthritis Res Ther. 2003;5(6):251-65. 103. Dorshkind K, Horseman ND. The roles of prolactin, growth hormone, insulinlike growth factor-I, and thyroid hormones in lymphocyte development and function: insights from genetic models of hormone and hormone receptor deficiency. Endocr Rev. 2000 Jun;21(3):292-312. 104. French RA, Zachary JF, Dantzer R, Frawley LS, Chizzonite R, Parnet P, et al. Dual expression of p80 type I and p68 type II interleukin-I receptors on anterior pituitary cells synthesizing growth hormone. Endocrinology. 1996 Sep;137(9):402736. 105. Kelley KW, Weigent DA, Kooijman R. Protein hormones and immunity. Brain Behav Immun. 2007 May;21(4):384-92. 106. Economidou F, Douka E, Tzanela M, Nanas S, Kotanidou A. Thyroid function during critical illness. Hormones (Athens). 2011 Apr-Jun;10(2):117-24. 103 107. Matsas DJ, Nebel RL, Pelzer KD. Evaluation of an on-farm blood progesterone test for predicting the day of parturition in cattle. Theriogenology. 1992 Apr;37(4):859-68. 108. Roh SG, Matsunaga N, Miyamoto A, Hidaka S, Hidari H. Competitive enzyme immunoassay for bovine growth hormone. Endocr J. 1997 Feb;44(1):195-8. 109. Guven B, Ozsar S. Set up an enzymeimmunoassay for PGFM and its release during estrus cycle in the Angora goat. . World Congress on Animal Production. [Abstract]. 1993:289 110. Mishra DP, Meyer HH, Prakash BS. Validation of a sensitive enzymeimmunoassay for 13,14-dihydro-15-keto-PGF2alpha in buffalo plasma and its application for reproductive health status monitoring. Anim Reprod Sci. 2003 Sep 15;78(1-2):33-46. 111. Huzzey JM, Nydam DV, Grant RJ, Overton TR. Associations of prepartum plasma cortisol, haptoglobin, fecal cortisol metabolites, and nonesterified fatty acids with postpartum health status in Holstein dairy cows. J Dairy Sci. 2011 Dec;94(12):5878-89. 112. Piechotta M, Kedves K, Hoeflich A, Wilkening S, Wrenzycki C, Bollwein H. Differences in hepatic gene expression of insulin-like growth factor binding protein and liver deiodinase 1 in late pregnant dairy cows with different total IGF-I plasma concentrations. 7th International Congress on Farm Animal Endocrinology; 24. - 26. August 2011; Bern, Switzerland: Universität Bern; 2011. p. 30-1. 113. Velazquez MA, Spicer LJ, Wathes DC. The role of endocrine insulin-like growth factor-I (IGF-I) in female bovine reproduction. Domest Anim Endocrinol. 2008 Nov;35(4):325-42. 114. Weber WJ, Wallace CR, Hansen LB, Chester-Jones H, Crooker BA. Effects of genetic selection for milk yield on somatotropin, insulin-like growth factor-I, and placental lactogen in Holstein cows. J Dairy Sci. 2007 Jul;90(7):3314-25. 115. Bonakdar E, Rahmani HR, Edriss MA, Sayed Tabatabaei BE. IGF-I gene polymorphism, but not its blood concentration, is associated with milk fat and protein in Holstein dairy cows. Genet Mol Res. 2010;9(3):1726-34. 116. Hoedemaker M, Prange D, Gundelach Y. Body condition change ante- and postpartum, health and reproductive performance in German Holstein cows. Reprod Domest Anim. 2009 Apr;44(2):167-73. 104 117. Roche JR, Friggens NC, Kay JK, Fisher MW, Stafford KJ, Berry DP. Invited review: Body condition score and its association with dairy cow productivity, health, and welfare. J Dairy Sci. 2009 Dec;92(12):5769-801. 118. Knights M, Smith GW. Decreased ACTH secretion during prolonged transportation stress is associated with reduced pituitary responsiveness to tropic hormone stimulation in cattle. Domest Anim Endocrinol. 2007 Nov;33(4):442-50. 119. Nanda AS, Dobson H, Ward WR. Relationship between an increase in plasma cortisol during transport-induced stress and failure of oestradiol to induce a luteinising hormone surge in dairy cows. Res Vet Sci. 1990 Jul;49(1):25-8. 120. Wischral A, Verreschi IT, Lima SB, Hayashi LF, Barnabe RC. Pre-parturition profile of steroids and prostaglandin in cows with or without foetal membrane retention. Anim Reprod Sci. 2001 Sep 15;67(3-4):181-8. 121. Zulu VC, Sawamukai Y, Nakada K, Kida K, Moriyoshi M. Relationship among insulin-like growth factor-I, blood metabolites and postpartum ovarian function in dairy cows. J Vet Med Sci. 2002 Oct;64(10):879-85. 122. Hoedemaker M, Prange D, Zerbe H, Frank J, Daxenberger A, Meyer HH. Peripartal propylene glycol supplementation and metabolism, animal health, fertility, and production in dairy cows. J Dairy Sci. 2004 Jul;87(7):2136-45. 123. Waggoner JW, Loest CA, Turner JL, Mathis CP, Hallford DM. Effects of dietary protein and bacterial lipopolysaccharide infusion on nitrogen metabolism and hormonal responses of growing beef steers. J Anim Sci. 2009 Nov;87(11):3656-68. 124. McSherry BJ, Lumsden JH, Valli VE, Baird JD. Hyperbilirubinemia in sick cattle. Can J Comp Med. 1984 Jul;48(3):237-40. 125. Inoue T, Saito H, Fukushima R, Inaba T, Lin MT, Fukatsu K, et al. Growth hormone and insulinlike growth factor I enhance host defense in a murine sepsis model. Arch Surg. 1995 Oct;130(10):1115-22. 126. Cavestany D, Kulcsar M, Crespi D, Chilliard Y, La Manna A, Balogh O, et al. Effect of prepartum energetic supplementation on productive and reproductive characteristics, and metabolic and hormonal profiles in dairy cows under grazing conditions. Reprod Domest Anim. 2009 Aug;44(4):663-71. 127. Suikkari AM, Baxter RC. Insulin-like growth factor-binding protein-3 is functionally normal in pregnancy serum. J Clin Jan;74(1):177-83. 105 Endocrinol Metab. 1992 128. Frystyk J. Free insulin-like growth factors -- measurements and relationships to growth hormone secretion and glucose homeostasis. Growth Horm IGF Res. 2004 Oct;14(5):337-75. 129. Elsasser TH, Rumsey TS, Norton SA. Relationships between the thyroid and somatotropic axes in steers. I: Effects of propylthiouracil-induced hypothyroidism on growth hormone, thyroid stimulating hormone and insulin-like growth factor I. Domest Anim Endocrinol. 1992 Oct;9(4):261-71. 130. Pethes G, Bokori J, Rudas P, Frenyo VL, Fekete S. Thyroxine, triiodothyronine, reverse-triiodothyronine, and other physiological characteristics of periparturient cows fed restricted energy. J Dairy Sci. 1985 May;68(5):1148-54. 131. McGuire MA, Vicini JL, Bauman DE, Veenhuizen JJ. Insulin-like growth factors and binding proteins in ruminants and their nutritional regulation. J Anim Sci. 1992 Sep;70(9):2901-10. 132. Smyczynska J, Stawerska R, Lewinski A, Hilczer M. Do IGF-I concentrations better reflect growth hormone (GH) action in children with short stature than the results of GH stimulating tests? Evidence from the simultaneous assessment of thyroid function. Thyroid Res. 2011;4(1):6. 133. Elsasser TH, Rumsey TS, Kahl S. Relationships between the thyroid and somatotropic axes in steers. II: Effects of thyroid status on plasma concentrations of insulin-like growth factor I (IGF-I) and the IGF-I response to growth hormone. Domest Anim Endocrinol. 1993 Apr;10(2):71-85. 134. Rhoads ML, Rhoads RP, VanBaale MJ, Collier RJ, Sanders SR, Weber WJ, et al. Effects of heat stress and plane of nutrition on lactating Holstein cows: I. Production, metabolism, and aspects of circulating somatotropin. J Dairy Sci. 2009 May;92(5):1986-97. 135. Stewart PM, Toogood AA, Tomlinson JW. Growth hormone, insulin-like growth factor-I and the cortisol-cortisone shuttle. Horm Res. 2001;56 Suppl 1:1-6. 136. Hydbring E, Madej A, MacDonald E, Drugge-Boholm G, Berglund B, Olsson K. Hormonal changes during parturition in heifers and goats are related to the phases and severity of labour. J Endocrinol. 1999 Jan;160(1):75-85. 137. Hulbert LE, Carroll JA, Burdick NC, Randel RD, Brown MS, Ballou MA. Innate immune responses of temperamental and calm cattle after transportation. Vet Immunol Immunopathol. 2011 Sep 15;143(1-2):66-74. 106 138. Shah KD, Nakao T, Kubota H, Maeda T. Peripartum changes in plasma estrone sulfate and estradiol-17beta profiles associated with and without the retention of fetal membranes in holstein-friesian cattle. J Reprod Dev. 2007 Apr;53(2):279-88. 139. Hayirli A. The role of exogenous insulin in the complex of hepatic lipidosis and ketosis associated with insulin resistance phenomenon in postpartum dairy cattle. Vet Res Commun. 2006 Oct;30(7):749-74. 140. Chagas LM, Lucy MC, Back PJ, Blache D, Lee JM, Gore PJ, et al. Insulin resistance in divergent strains of Holstein-Friesian dairy cows offered fresh pasture and increasing amounts of concentrate in early lactation. J Dairy Sci. 2009 Jan;92(1):216-22. 141. Holtenius P, Holtenius K. A model to estimate insulin sensitivity in dairy cows. Acta Vet Scand. 2007;49:29. 142. Sheldon IM, Noakes DE, Rycroft AN, Pfeiffer DU, Dobson H. Influence of uterine bacterial contamination after parturition on ovarian dominant follicle selection and follicle growth and function in cattle. Reproduction. 2002 Jun;123(6):837-45. 143. Meng D, Lv DD, Fang J. Insulin-like growth factor-I induces reactive oxygen species production and cell migration through Nox4 and Rac1 in vascular smooth muscle cells. Cardiovasc Res. 2008 Nov 1;80(2):299-308. 144. Economidou F, Douka E, Tzanela M, Nanas S, Kotanidou A. Thyroid function during critical illness. Hormones (Athens). Apr-Jun;10(2):117-24. 145. Himler M, Hurcombe SD, Griffin A, Barsnick RJ, Rathgeber RA, Macgillivray KC, et al. Presumptive nonthyroidal illness syndrome in critically ill foals. Equine Vet J. 2012 Feb;44 Suppl 41:43-7. 146. Kahl S, Elsasser TH, Blum JW. Effect of endotoxin challenge on hepatic 5'deiodinase activity in cattle. Domest Anim Endocrinol. 2000 Jan;18(1):133-43. 147. Waggoner JW, Loest CA, Mathis CP, Hallford DM, Petersen MK. Effects of rumen-protected methionine supplementation and bacterial lipopolysaccharide infusion on nitrogen metabolism and hormonal responses of growing beef steers. J Anim Sci. 2009 Feb;87(2):681-92. 148. Husier BR, Blum JW. Metabolic and endocrine changes in response to endotoxin administration with or without oral arginine supplementation. J Dairy Sci. 2002 Aug;85(8):1927-35. 107 149. Cageao LF, Mignone IR, Ricci CR, Brignone CC, Brignone JA, Zaninovich AA. Effects of thyroid hormones on mitochondrial oxygen consumption in brown adipose tissue and heart from cold-exposed hypothyroid rats. Acta Endocrinol (Copenh). 1992 Jul;127(1):72-5. 150. Gilbert RO, Bosu WT, Peter AT. The effect of Escherichia coli endotoxin on luteal function in Holstein heifers. Theriogenology. 1990 Mar;33(3):645-51. 151. Richards RG, Almond GW. Lipopolysaccharide-induced increases in porcine serum cortisol and progesterone concentrations are not mediated solely by prostaglandin F2 alpha. Inflammation. 1994 Apr;18(2):203-14. 152. Williams EJ, Sibley K, Miller AN, Lane EA, Fishwick J, Nash DM, et al. The effect of Escherichia coli lipopolysaccharide and tumour necrosis factor alpha on ovarian function. Am J Reprod Immunol. 2008 Nov;60(5):462-73. 153. Kahl S, Elsasser TH, Li CJ. Modeling the effects of estradiol and progesterone on the acute phase proinflammatory axis: variability in tumor necrosis factor-alpha, nitric oxide, and xanthine oxidase responses to endotoxin challenge in steers. Domest Anim Endocrinol. 2011 May;40(4):213-21. 154. Sheldon IM. The postpartum uterus. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 2004 Nov;20(3):569-91. 155. Escher G, Galli I, Vishwanath BS, Frey BM, Frey FJ. Tumor necrosis factor alpha and interleukin 1beta enhance the cortisone/cortisol shuttle. J Exp Med. 1997 Jul 21;186(2):189-98. 156. Qahwash IM, Cassar CA, Radcliff RP, Smith GW. Bacterial lipopolysaccharide-induced coordinate downregulation of arginine vasopressin receptor V3 and corticotropin-releasing factor receptor 1 messenger ribonucleic acids in the anterior pituitary of endotoxemic steers. Endocrine. 2002 Jun;18(1):13-20. 157. Thurston LM, Abayasekara DR, Michael AE. 11beta-Hydroxysteroid dehydrogenase expression and activities in bovine granulosa cells and corpora lutea implicate corticosteroids in bovine ovarian physiology. J Endocrinol. 2007 May;193(2):299-310. 158. Carroll JA, McArthur NH, Welsh TH, Jr. In vitro and in vivo temporal aspects of ACTH secretion: stimulatory actions of corticotropin-releasing hormone and vasopressin in cattle. J Vet Med A Physiol Pathol Clin Med. 2007 Feb;54(1):7-14. 159. Le Roy C, Li JY, Stocco DM, Langlois D, Saez JM. Regulation by adrenocorticotropin (ACTH), angiotensin II, transforming growth factor-beta, and 108 insulin-like growth factor I of bovine adrenal cell steroidogenic capacity and expression of ACTH receptor, steroidogenic acute regulatory protein, cytochrome P450c17, and 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase. Endocrinology. 2000 May;141(5):1599-607. 160. Liberman AC, Refojo D, Druker J, Toscano M, Rein T, Holsboer F, et al. The activated glucocorticoid receptor inhibits the transcription factor T-bet by direct protein-protein interaction. FASEB J. 2007 Apr;21(4):1177-88. 161. Bondurant RH. Inflammation in the bovine female reproductive tract. J Anim Sci. 1999;77 Suppl 2:101-10. 162. Sheldon IM, Roberts MH. Toll-like receptor 4 mediates the response of epithelial and stromal cells to lipopolysaccharide in the endometrium. PLoS One. 2010;5(9):e12906. 163. Rukkwamsuk T, Geelen MJ, Kruip TA, Wensing T. Interrelation of fatty acid composition in adipose tissue, serum, and liver of dairy cows during the development of fatty liver postpartum. J Dairy Sci. 2000 Jan;83(1):52-9. 164. McGavin MD, Zachary JF. Pathologic Basis of Veterinary Disease. 4. ed. St. Louis, Missouri: Mosby Elsevier; 2007. 165. Kolle S, Sinowatz F, Boie G, Lincoln D, Waters MJ. Differential expression of the growth hormone receptor and its transcript in bovine uterus and placenta. Mol Cell Endocrinol. 1997 Aug 8;131(2):127-36. 166. Davey HW, Xie T, McLachlan MJ, Wilkins RJ, Waxman DJ, Grattan DR. STAT5b is required for GH-induced liver IGF-I gene expression. Endocrinology. 2001 Sep;142(9):3836-41. 109 9 Anhang 9.1 ELISA zum Nachweis von Wachstumshormon Mikrotiterplatte (Nunc, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) mit Ziege Anti-Kaninchen beschichtet (Physiologie, Technische Universität München, Weihenstephan, Deutschland) bei Raumtemperatur 2x mit 300µl Waschpuffer (siehe 9.5 Rezepte) waschen 100µl GH-AK (rabbit anti-oGH-3, Lot# AFP0802210Rb; National Hormone & Peptide Program (NHPP), NIDDK, und Dr. Parlow, Torrance, California, USA; 1:250.000 in Assaypuffer (siehe 9.5 Rezepte) verdünnt) pro Well 24 h bei Raumtemperatur inkubieren 4x waschen mit Waschpuffer 15µl Probe bzw. Standard 100µl 1% Hühner-Serum (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) in Assaypuffer pro Well 24 h Raumtemperatur 3x waschen mit Waschpuffer 100µl Biotinmarkiertes GH 1:200.000 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) mit Assaypuffer verdünnt pro Well 3h Raumtemperatur und anschließend abkippen 100µl SAP-solution pro Well (Steptavidin-POD; Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA; 1:125 in Assaypuffer verdünnt) 15 min Raumtemperatur 4x waschen mit Waschpuffer 150µl Substratlösung (siehe 9.5 Rezepte) 40 min 37°C Stoppen der Reaktion mit 50µl 2M Schwefelsäure (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) Messung bei 450 nm Wellenlänge (Spectra II; Tecan Group Ltd, Männedorf, Schweiz) 110 9.2 ELISA zum Nachweis von PGFM Mikrotiterplatte (Nunc, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) mit Ziege anti-Kaninchen beschichtet (Physiologie, Technische Universität München, Weihenstephan, Deutschland) bei Raumtemperatur 2x mit 300µl Waschpuffer (siehe 9.5 Rezepte) waschen 20µl/well Standard (PGFM; Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA; 50 bis 2000 pg/ml) bzw. Probe 100µl/well Antikörper (Anti-PGFM in Assaypuffer, siehe 9.5 Rezepte, 1:20.000 verdünnt) Über Nacht bei 4°C auf Schüttler inkubieren 3x mit 300µl/well Waschlösung waschen 100µl/well Enzym in Assaypuffer (1:30.000) 4x mit 300µl/well Waschlösung waschen 150 µl/well Substrat für 20 min bei 25°C Stoppen der Reaktion mit 50 µl/well 2M Schwefelsäure (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) Optische Dichte messen bei 450 nm (Spectra II; Tecan Group Ltd, Männedorf, Schweiz) 9.3 Verfahren zum Nachweis von LPS Plasmaproben 1:10 in LPS freiem H2O (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) verdünnen 5 min 80°C 100µl/Well Probe 37°C 100µl/Well Chromo-LAL (Charles River, Charleston, USA) 15 min bei 37°C Messung der OD bei 405 nm 111 9.4 Färbeprotokoll der Histologischen Schnitte Entparaffinisierung von Paraffinschnitten 2 x 10 min Xylol 2 min Isopropanol 2 min 100% Ethanol 30 min 80% Ethanol mit 0,6% Wasserstoffperoxid 2 min 70% Ethanol 3 x 5 min PBS Behandlung mit TRIS/EDTA Puffer 10 min 96-99°C TRIS/EDTA Puffer pH 9 (unten beschrieben) 15 min Abkühlen 3 x 5 min PBS Blocken 20 min 100 µl/Schnitt Ziegenserum 1:5 in PBS in feuchter Kammer bei RT Antikörper Über Nacht bei 4°C 60µl/Schnitt mit Antikörper IgG GHR Mouse (mAb 263; Abcam, Cambridge, UK) 1:200 in PBS mit 1% Bovinem Serum Albumin (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) in feuchter Kammer 3 x 5 min PBS Detektion (EnVison Mouse DAKO, Hamburg, Deutschland) 45 min 80µl/Schnitt Polymer HRP Lösung in feuchter Kammer bei Raumtemperatur (im KIT enthalten) 3 x 5 min PBS 5 min Diaminobenzidine DAB (im KIT enthalten) in feuchter Kammer 5 min PBS 10 min fließendes Leitungswasser Gegenfärbung 2 Sekunden Hämalaun nach Delafield (Anatomisches Institut, Tierärztliche Hochschule Hannover) 15 min fließendes Leitungswasser Dehydration + Eindecken 112 3 min 70% Ethanol 3 min 80% Ethanol 3 min 100% Ethanol 3 min Isopropanol 2 x 5 min Xylol Eindecken mit EuKitt 9.5 Rezepte Coatingpuffer 15 mmol/l Natrumcarbonat-10-Hydrat (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) 34,87 mmol/l Natriumhydrogencarbonat (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) H2O Bidest Assaypuffer 40 mmol/l Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) 145,5 mmol/l Natriumchlorid (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) 0,1% Bovines Serumalbumin (Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Deutschland) H2O Bidest Waschlösung 0,05% Polyoxyethylensorbitanmonooleat Tween 80 (AppliChem, Darmstadt, Deutschland) H2O Bidest Substratlösung A 1 g Wasserstoffperoxid Harnstoff in 10ml H2O bidest lösen 113 18 g Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) 9,416 g Zitronensäure (Riedel-de-Haen, Seelze, Deutschland) 100 µl Kathon CG (Röhm und Haas, Michigan, USA) Ad 1000 ml H2O Bidest Substratlösung B Teil 1 0,5 g 3,3´,5,5´-Tetramethylbenzidin (AppliChem, Darmstadt, Deutschland) Lösen in 40 ml Dimethylsulfoxid (min. 99,5%; Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) Teil 2 9,416 g Zitronensäure (Riedel-de-Haen, Seelze, Deutschland) Ad 960 ml H2O Bidest Teil 1 und 2 mischen (pH Wert 2,4) Substratlösung Substratlösung A Substratlösung B TRIS/EDTA Puffer 10 mmol/l TRIS (Sigma Aldrich) 1 mmol/l EDTA (Sigma Aldrich) pH 9 mit NaOH einstellen PBS 40 g NaCl (Sigma Aldrich) 7,8 g NaH2PO4 (AppliChem, Darmstadt, Deutschland) In 5 l Aqua dest. pH 7,2 mit 1M NaOH 114 Formalin nach Lillie 6,5 g Na2HPO4 (wasserfrei) (Sigma Aldrich) 4,0 g NaH2PO4 x H2O (AppliChem) ad 900 ml H2O 100 ml Formaldehyd 36 – 40% (Sigma Aldrich) 115 10 Tabellenanhang Tab. 1: Futterzusammensetzung des Betriebes Agrargesellschaft Siedenlangenbeck, Kuhfelde/Wöpel von dem die Versuchstiere ausgewählt wurden Trockenmasse Frischmasse Trockenmasse [g/kg [kg] [kg] Frischmasse] 1 Min. PANTO R 66 Mineralfutter 0,12 0,114 950 Sojaextraktionsschrot1 44er Kraftfutter 0,75 0,66 880 Rotschwingel, Stroh Grobfutter 4 3,44 860 Roggenstroh Grobfutter 1,5 1,29 860 Maissilage 10 Grobfutter 4,5 1,373 305 Grünland, III/10 Grobfutter 21 4,515 215 Ration Gesamt 31,87 11,392 357 Bezeichnung Futterart 1 Kraft und Mineralfutter: Hamburger Leistungsfutter, Hamburg Deutschland Tab. 2: Mineralstoffzusammensetzung der Futterration des Betriebes Agrargesellschaft Siedenlangenbeck, Kuhfelde/Wöpel von dem die Versuchstiere ausgewählt wurden Mineralstoff [g/kg Trockenmasse] Calcium Phosphor Magnesium Natrium Kalium Chlor Schwefel 7,5 4,26 3,07 2,05 9,56 3,92 1,45 116 Tab. 3: Analysedaten der Futtermittel des Betriebes Agrargesellschaft Siedenlangenbeck, Kuhfelde/Wöpel von dem die Versuchstiere ausgewählt wurden Bezeichnung Min. PANTO R 66 Sojaextraktionsschrot 44er Rotschwingel, Stroh Roggenstroh Maissilage 10 Grünland, III/10 Ration Gesamt Rohasche [g/kg T] 1000 Org. Masse [g/kg T] 0 Rohprotein [g/kg T] Rohfett [g/kg T] Rohfaser [g/kg T] NfE Stärke [g/kg T] [g/kg T] beständi Zucker ge XS [g/kg T] [g/kg T] 0 KohlenXZ+uXS hydrate [g/kg T] [g/kg T] 0 0 Nutzbares Rohprotein [g/kg T] 67 933 510 15 67 341 69 0 108 177 408 315 69 58 45 125 96 931 942 955 875 904 59 37 108 160 128 18 13 26 33 24 392 472 182 236 291 462 420 639 446 461 0 0 225 1 32 0 0 56 0 7 8 50 1 14 0 8 219 2 38 854 892 821 682 752 90 74 138 138 125 T: Trockenmasse; NfE: Stickstofffreie Extrudatstoffe; XS: Stärke; XZ: Zucker Tab. 4: Ruminale Stickstoffbilanz, Umsetzbare Energie, Netto Energie für die Laktation und Strukturwert der Ration des Betriebes Agrargesellschaft Siedenlangenbeck, Kuhfelde/Wöpel von dem die Versuchstiere ausgewählt wurden Bezeichnung Ruminale Stickstoffbilanz Umsetzbare Energie Netto Energie Laktation Strukturwert je kg Trockenmasse [g/kg T] [MJ/kg T] [MJ/kg T] Min. PANTO R 66 Sojaextraktionsschrot 44er Rotschwingel, Stroh Roggenstroh Maissilage 10 Grünland, III/10 Ration Gesamt 0 31,2 -5 -5,9 -4,8 3,5 0,4 13,78 6,82 6 10,84 8,14 8,08 8,65 3,77 3,25 6,55 4,67 4,65 T: Trockensubstanz; MJ: Mega Joule 117 100 100 60 65 74,51 Tab. 5: Kliniknummern der in die Studie aufgenommenen Tiere mit der Einteilung entsprechend den Werten (≤125 ng/ml IGF-I niedrig und ≥175 ng/ml IGF-I hoch) für Insulin-like growth Factor-I (IGF-I), Einstallungs- und Geburtsdatum mit den Tagen post inseminationem (p.insem.): Tier- IGF-I-Gruppe Tag der Tag der Tag der Geburt nummer (IGF-I Konzentration Auswahl Einstallung (Tag p.insem.) am Tag der Auswahl) (Tag p.insem.) (Tag p.insem.) IGF-I hoch (183) 07.07.2010 21.07.2010 02.08.2010 (251) (265) (277) 07.07.2010 21.07.2010 10.08.2010 (246) (260) (280) 05.08.2010 17.08.2010 12.09.2010 (245) (257) (283) 05.08.2010 17.08.2010 16.09.2010 (242) (254) (284) 13.09.2010 22.09.2010 12.10.2010 (254) (263) (283) 13.09.2010 22.09.2010 15.10.2010 (250) (260) (282) 14.10.2010 27.10.2010 15.11.2010 (250) (263) (282) 14.10.2010 27.10.2010 23.11.2010 (243) (256) (283) 03.01.2011 12.01.2011 06.02.2011 (252) (261) (286) 03.01.2011 12.01.2011 05.02.2011 (243) (252) (276) 27.01.2011 10.02.2011 02.03.2011 (248) (262) (282) 09.02.2011 10.02.2011 15.03.2011 (248) (249) (282) 02.03.2011 09.03.2011 12.04.2011 (242) (249) (283) 804/10 803/10 918/10 917/10 1056/10 1057/10 1192/10 1193/10 45/11 46/11 174/11 175/11 302/11 IGF-I hoch (223) IGF-I niedrig (83) IGF-I niedrig (83) IGF-I hoch (214) IGF-I hoch (225) IGF-I hoch (223) IGF-I hoch (176) IGF-I hoch (184) IGF-I hoch (277) IGF-I niedrig (105) IGF-I hoch (187) IGF-I hoch (191) 118 Tab. 5 Fortsetzung 425/11 IGF-I niedrig (125) 479/11 480/11 622/11 623/11 825/11 826/11 IGF-I niedrig (122) IGF-I niedrig (114) IGF-I niedrig (94) IGF-I niedrig (97) IGF-I niedrig (108) IGF-I niedrig (80) 22.03.2011 05.04.2011 (242) (256) 14.04.2011 20.04.2011 11.05.2011 (251) (257) (278) 14.04.2011 20.04.2011 22.05.2011 (250) (256) (288) 02.05.2011 19.05.2011 02.06.2011 (243) (260) (274) 02.05.2011 19.05.2011 06.06.2011 (240) (257) (275) 27.06.2011 12.07.2011 30.07.2011 (245) (260) (278) 27.06.2011 12.07.2011 26.07.2011 (242) (257) (271) 119 Tab. 6: Deskriptive Statistik der Wert IGF-I, Wachstumshormon, Cortisol, Thyroxin, Trijodthyronin, 17β-Östradiol, Insulin, Progesteron und freie Fettsäuren der Gruppen IGF-I hoch (≥175 ng/ml; h) und IGF-I niedrig (≤125 ng/ml; n) am Tag der Auswahl zwischen Tag 240 bis 254 post inseminationem Variabel Mittelwert *** IGF-I Median Maximum Minimum Standard- Unteres Oberes abweichung Quartil Quartil h 208,3 202,6 277,1 176,1 30,8 183,6 223,2 n 101,1 101,0 125,0 80,0 16,3 83,1 114,0 Wachstums- h 5,6 4,3 15,6 3,3 3,7 3,6 5,5 hormon n 6,2 4,3 21,4 2,0 5,8 3,2 6,2 Cortisol h 4,3 2,8 13,9 2,0 3,8 2,0 4,2 n 8,5 6,6 25,2 2,0 7,3 2,8 11,9 h 4,6 4,6 5,2 3,7 0,5 4,3 4,8 n 4,5 4,5 5,5 3,5 0,6 4,2 4,8 h 116,2 121,0 185,0 59,1 31,7 99,1 124,0 n 134,2 138,0 172,0 81,0 30,6 117,0 155,0 h 31,0 27,6 52,8 24,0 9,3 24,1 34,7 n 40,0 33,2 96,6 24,0 21,6 26,5 44,0 h 14,3 11,6 24,6 5,6 5,9 9,5 18,6 n 11,8 10,1 23,1 6,4 4,9 8,9 13,7 h 6,4 6,5 9,3 3,9 1,5 5,4 7,2 n 7,4 7,8 10,5 4,3 1,8 6,0 8,4 h 163 158,5 254 100,0 56,4 111,0 199,0 n 318,6 233,0 789,0 96,4 221,6 181,0 379,0 Thyroxin Trijodthyronin 17β-Östradiol Insulin Progesteron Freie Fettsäuren * Unterschiede zwischen den beiden Gruppen sind folgendermaßen dargestellt: * P<0,05; *** P<0,001 120 Tab. 7: Parameter der Gruppen IGF-I hoch und IGF-I niedrig (≥175 ng/ml bzw. ≤125 ng/ml am Tag der Auswahl zwischen Tag 240 bis 254 post inseminationem) zum Zeitpunkt der Einstallung (Tag 249 bis 265 post inseminationem) IGF-I hoch n=10 IGF-I niedrig n=10 607 ± 65 661 ± 65 Body Condition Score 3,47 ± 0,15 3,55 ± 0,33 Milchleistung der 7045 ± 607 7743 ± 1265 1 1-3 3,3 ± 0,2 3,8 ± 0,7 Gewicht (kg) vorangegangenen Laktation (kg/305d) Anzahl vorheriger Laktationen Alter (Jahre) 121 Tab. 8: Klinisch chemische Parameter der Gruppen IGF-I hoch und IGF-I niedrig (≥175 ng/ml bzw. ≤125 ng/ml am Tag der Auswahl zwischen Tag 240 bis 254 post inseminationem) am Tag der Einstallung (Tag 249 bis 265 post inseminationem) in die Klinik für Rinder Parameter (Einheit) IGF-I hoch IGF-I niedrig 11960 ± 1982,8 10460 ± 1001,3* Erythrozyten *106 (/µl) 6,9 ± 0,9 6,4 ± 0,7 Hämoglobin (g/dl) 11,4 ± 1,5 11,1 ± 1,0 Hämatokrit (%) 36,7 ± 4,9 35,8 ± 3,0 Gesamt Eiweiß (g/l) 86,7 ± 7,8 82,3 ± 4,6 Gesamtbilirubin (µmol/l) 3,1 ± 0,8 4,4 ± 1,7* Aspartat-Amino-Transferase (U/l) 79,3 ± 20,8 74,7 ± 22,0 γ-Glutamyl-Transferase (U/l) 34,0 ± 8,8 27,4 ± 9,0 Glutamat-Dehydrogenase (U/l) 17,9 ± 16,1 9,5 ± 4,5 Cholesterin (mmol/l) 3,3 ± 0,8 3,1 ± 0,7 Harnstoff (mmol/l) 5,1 ± 0,9 3,6 ± 0,6*** Kreatinin (µmol/l) 102,4 ± 15,8 98,3 ± 11,4 Albumin (g/l) 34,8 ± 2,1 34,7 ± 2,5 Kalzium (mmol/l) 2,3 ± 0,1 2,3 ± 0,1 Magnesium (mmol/l) 1,0 ± 0,1 0,9 ± 0,1* Phosphor (mmol/l) 1,6 ± 0,3 1,5 ± 0,2 Selen (µg/l) 111,3 ± 11,2 118,2 ± 27,8 Natrium (mmol/l) 141,7 ± 4,1 141,7 ± 3,5 Kalium (mmol/l) 4,2 ± 0,3 4,2 ± 0,3 Chlorid (mmol/l) 100,0 ± 1,8 99,3 ± 2,3 Leukozyten (/µl) Unterschiede zwischen den beiden Gruppen sind folgendermaßen dargestellt: *P<0,05; ** P<0,01; *** P<0,001 122 Tab. 9: Tupferprobenergebnisse des Uterus der einzelnen Versuchstiere der Gruppen IGF-I hoch (h) und IGF-I niedrig (n; ≥175 ng/ml bzw. ≤125 ng/ml am Tag der Auswahl zwischen Tag 240 bis 254 post inseminationem) 30 Minuten nach der Geburt mit semiquantitativer Einteilung des Keimgehalts der nachgewiesenen Bakterienspezies. IGF-I-Gruppe h h h h h h n n n n n n hk hk hk hk nk nk nk 1056 1057 1192 1193 46 302 917 174 479 480 622 826 804 803 45 175 918 623 825 Acinetobacter species 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Aerococcus species 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 alpha-hämolysierende Streptokokken 0 2 1 0 1 1 0 3 2 1 2 0 0 1 1 2 0 0 0 Gramnegative Anaerobier 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 anhämolys. Streptokopkken 1 1 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 1 0 3 3 0 Bacillus species 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 Burkholderia cepacia 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Citrobacter species 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Clostridium perfringens 0 0 0 0 0 0 0 1 3 0 0 3 0 0 0 0 3 3 3 Enterobacter aerogenes 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 Enterobacter cloacae 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 3 Enterokokken species 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 2 0 0 1 0 0 3 Escherichia coli 0 1 1 0 0 1 1 3 0 1 2 2 3 0 1 2 3 3 3 Klebsiella oxytoca 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Koagulase negative Staphylokokken 1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 Mannheimia varigena 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Pantoea agglomerans 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Proteus species 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 Pseudomonas species 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 2 0 0 0 0 0 0 0 0 Kuhnummer h: IGF-I hoch n: IGF-I niedrig hk: IGF-I hoch NaCl Tier nk: IGF-I niedrig NaCl Tier 0: nicht nachgewiesen 2: mittelgradig nachgewiesen 1: geringgradig nachgewiesen 3: hochgradig nachgewiesen 123 Tab. 10: Atemfrequenz der Gruppen IGF-I hoch und IGF-I niedrig (≥175 ng/ml bzw. ≤125 ng/ml am Tag der Auswahl zwischen dem 240 bis 254 Tag post inseminationem) und der NaCl-Gruppe ohne LPS während des Versuches. IGF-I hoch IGF-I niedrig NaCl-Gruppe 0 min 30 min 60 min 90 min 120 min 150 min 180 min (1/min) (1/min) (1/min) (1/min) (1/min) (1/min) (1/min) 30,7 ± 32,0 ± 28,0 ± 29,3 ± 31,3 ± 28,0 ± 33,3 ± 9,0 9,5 6,7 4,1 5,9 6,7 9,0 33,3 ± 33,3 ± 32,7 ± 33,3 ± 33,3 ± 36,0 ± 36,0 ± 10,9 15,1 12,5 14,0 13,1 17,5 17,9 33,6 ± 40,0 ± 33,7 ± 38,9 ± 36,0 ± 39,3 ± 40,7 ± 13,1 15,6 12,4 12,6 9,2 14,4 15,7 Tab. 11: Pulsfrequenz der Gruppen IGF-I hoch und IGF-I niedrig (≥175 ng/ml bzw. ≤125 ng/ml am Tag der Auswahl zwischen dem 240 bis 254 Tag post inseminationem) und der NaCl-Gruppe ohne LPS während des Versuches. IGF-I hoch IGF-I niedrig NaCl-Gruppe 0 min 30 min 60 min 90 min 120 min 150 min 180 min (1/min) (1/min) (1/min) (1/min) (1/min) (1/min) (1/min) 96,0 ± 98,4 ± 92,7 ± 89,3 ± 92,0 ± 92,7 ± 100,0 ± 11,3 4,6 6,9 7,4 10,4 10,3 10,4 100,7 ± 100,0 ± 102,0 ± 100,0 ± 94,7 ± 99,3 ± 103,3 ± 8,2 16,6 17,7 18,4 13,5 14,4 15,5 93,6 ± 96,7 ± 94,7 ± 94,7 ± 93,3 ± 92,7 ± 93,3 ± 9,2 12,2 9,7 10,3 6,0 8,5 10,6 124 Tab. 12: Die ACTH-Konzentrationen der einzelnen Tiere nach 30 und 150 Minuten nach der Infusion mit LPS (IGF-I; ≥175 ng/ml hoch und IGF-I niedrig ≤125 ng/ml am Tag der Auswahl zwischen dem 240 bis 254 Tag post inseminationem) bzw. NaClLösung Tiernummer 30 Minuten 150 Minuten IGF-I hohe Gruppe 1056/10 10,3 13,5 1057/10 6,4 12,0 1192/10 6,6 9,9 1193/10 65,3 58,8 46/11 8,6 7,5 302/11 10,6 17,4 IGF-I niedrige Gruppe 917/10 11,0 19,2 174/11 10,5 6,6 479/11 15,4 18,8 480/11 22,6 23,4 622/11 20,3 42,2 826/11 27,4 39,4 804/10 19,3 16,4 803/10 39,7 31,7 918/10 18,0 20,3 45/11 12,2 13,8 175/11 11,2 6,8 623/11 18,5 13,9 825/11 30,9 19,1 NaCl-Gruppe 125 Danksagung Mein Dank geht an Herrn Prof. Dr. Heinrich Bollwein für die umfangreiche Betreuung der Dissertation. Ein riesiges Dankeschön geht an Dr. Marion Piechotta für die umfassende Betreuung und Unterstützung während der gesamten Arbeitszeit. Weiterhin danke ich Lara Górriz Martín für die Unterstützung mit den Versuchstieren und der Hilfe bei der Auswahl in Wöpel. Für die Hilfe bei den Versuchstieren danke ich auch Dr. Maike Heppelmann, Dr. Anja Sipka, Dr. Anna Düvel, Hanna Lütkehus, Sarah Fuchs und Constanze Frank. Auch dem Labor der Endokrinologie ein Herzliches Dankeschön, Martina Baumgarten, Angela Jordan und Katrin Koslowski waren immer eine große Hilfe im Umgang mit meinen Proben. Auch all den Tierärzten, Bremsern und Tierpflegern in der Klinik meinen Dank, die immer ein wachsames Auge auf die Versuchstiere hatten und mir viel geholfen haben. Ohne euch wären meine Nächte noch schlafloser gewesen. Bei der Hilfe und Auswertung der Histologie im Anatomischen Institut bedanke ich mich herzlichst bei Frau Prof. Dr. Christiane Pfarrer, Marion Gähle und Doris Walter. Auch für die Mitarbeit der Agrargesellschaft Siedenlangenbeck und das Bereitstellen der Tiere möchte ich mich bei Herrn Christian Schmidt und seinem Mitarbeiter Jörg Kaissuhn bedanken. Für die tatkräftige Unterstützung der statistischen Auswertung danke ich Marcello Antonio Gil Araujo. Nicht zuletzt gilt mein Dank auch meiner Familie und all den Freunden, die mich während der gesamten Zeit unterstützt, mir ihre Zeit geopfert und an mich geglaubt haben. 126