Poster

Molekularbiologisches Screening
von zwei neuen Blutgruppensystemen: Vel und Jr
1. Zusammenfassung
Obwohl die Antigene Vel und Jr(a) schon länger bekannt sind, konnte erst 2012 (Jr) und 2013 (Vel) der genetische Hintergrund aufgeklärt werden, was zur
Anerkennung als Blutgruppe führte. Beides sind hochfrequente Antigene, deren Antikörper zu schweren hämolytischen Transfusionsreaktionen und Morbus
haemolyticus neonatorum führen können. Vel-Negativität wird durch eine homozygote Deletion von 17bp im Exon 3 des Genes SMIM1 (SMIM1*64_80del) verursacht.
Jr(a)-Negativität wird durch diverse homozygote Mutationen des Genes ABCG2 verursacht. Das Ziel dieser Arbeit war es, eine Multiplex-PCR für SMIM1*64_80del und
die beiden „häufigsten“ Mutationen des JR (JR*01N.01 und JR*01N.02) zu etablieren, um einerseits die Häufigkeit der negativen Allele bestimmen und andererseits
Jr(a)- und Vel-negative Personen finden zu können, die wertvolle Spender und Spenderinnen wären. Die in dieser Arbeit entwickelte Multiplex-PCR erlaubt eine
Detektion von diesen drei Allelen in Einzel- und Poolproben. 564 Einzelproben wurden auf das Vorliegen vom VEL negativen Allel untersucht, wovon 14 heterozygot
waren. 2820 Proben wurden auf das Vorliegen von den zwei häufigsten JR negativen Allelen untersucht. Drei Proben mit dem JR*01N.02 Allel konnten detektiert
werden, wobei alle heterozygot waren. In Pools auf JR negative Allele zu testen ist angebracht, für das VEL negative Allel ist ein Screening von Einzelproben
sinnvoller, da die Allelfrequenz >2% war.
2. Einleitung
3. Ziele und Fragestellungen
Durch die breite Genotypisierung ist es möglich Blutgruppenmerkmale schneller und
kostengünstiger zu bestimmen, deshalb ist die stetige Erweiterung davon wichtig.
Da Vel und Jr(a) hochfrequente Antigene sind (bei mehr als 99% der Bevölkerung
vorhanden), deren Antikörper zu schweren hämolytischen Transfusionsreaktionen und
Morbus haemolyticus neonatorum führen können, macht es Sinn, diese in neuen
molekularbiologischen Screenings abzuklären, um die wenig vorhandenen Vel- oder Jr(a)negativen Spender oder Spenderinnen aus der Masse herauszufiltern.
Vel: Vel-Negativität wird durch eine homozygote Deletion von 17bp im Exon 3 des Genes
SMIM1 (SMIM1*64_80del) verursacht.1
Jr: Jr(a)-Negativität wird durch diverse homozygote Mutationen des Genes ABCG2
verursacht, die beiden „häufigsten“ dieser seltenen Mutationen sind die Single Nucleotide
Polymorphism (SNP) 376C>T (JR*01N.01) und 706C>T (JR*01N.02).2
Zielsetzung 1: Etablierung einer neuen SSP-PCR für die Allele
SMIM1*64_80del, JR*01N.01 und JR*01N.02
Fragestellungen zu Zielsetzung 1:
Gelingt es eine Singleplex-PCR und eine Multiplex-PCR für die
VEL- und JR-negativen Allele zu entwickeln?
Gelingt es Einzelproben und Poolproben mit der SSP-PCR auf
VEL- und JR-negative Allele zu testen?
Zielsetzung 2: Spender und Spenderinnen auf die Häufigkeit von
VEL- und JR-negativen Allelen zu screenen
Fragestellung zu Zielsetzung 2:
Ist es möglich mit der neuen SSP-PCR auf VEL- und JR-negativen
Allele zu screenen und somit deren Häufigkeit zu ermitteln?
4. Material, Methodik, Vorgehen
Es wurden 23 verschiedene Primer-Mixe getestet und 3 verschiedene PCR-Programme. Dazu wurden 17 verschiedene Primer verwendet, 11 davon wurden selber
designt. Es wurde mit 16 verschiedenen Referenzproben (für eine/mehrere Mutationen negative, positive, unverdünnte, 1:24 und 1:94 verdünnte Proben) ausgetestet.
Das Austesten der PCR-Methode basierte ganz auf der Trial-and-Error-Methode.
Für das Screening wurde dann der PM 22 zusammen mit dem PCR Programm 1 benutzt. Der Ansatz sah je 18 µl PM 22 und 2 µl DNA von den Proben vor. Es
wurden 24 Pools mit 23 resp. 24 Proben und 24 94er Pools getestet. Auf Jr(a) wurden alle Proben vollständig ausgetestet, bei Vel wurden nicht alle positiven Pools auf
die Einzelprobe ausgetestet. Daraus folgt, dass 2820 Spender und Spenderinnen auf Jr(a) und 564 komplett auf Vel getestet worden sind.
Es wurden folgende drei Geräte verwendet: der Qiagen BioRobot EZ1 zur Extraktion der Proben, der Biometra T3000 Thermocycler zur Amplifikation der DNA und der
QIAxcel zur Messung mittels Kapillar-Elektrophorese und zur Auswertung.
5. Ergebnisse/Resultate
6. Diskussion
Austestung:
Rechts in der Abb. 5.1 wird das Resultat des PM 22
dargestellt. Die roten Banden, Alignment-Marker (AM),
markieren 100bp und 1000bp. Die schwarzen Banden
markieren die Produkte. HGH ist die interne Kontrolle
und befindet sich bei 439bp. SMIM1*64_80del (VELdel)
wird bei 152bp nachgewiesen. JR*01N.01 (JR376T)
wird bei 247bp und JR*01N.02 (JR706T) bei 381bp
nachgewiesen. Referenzprobe 14 (Verdünnung 1:24)
und Referenzprobe 15 (Verdünnung 1:94) weisen alle
drei Mutationen auf. Es fehlen keine Banden und es
hat keine falschen/überzähligen Banden bei PM 22.
Zielsetzung 1:
Es war sowohl möglich Singleplex-PCR als auch Multiplex-PCR
von Einzelproben/Poolproben zu machen. Während dem Austesten
zeigten sich beim PM 22 kräftige Banden, Peaks klar über dem
Threshold, weder falsch-positive, noch falsch-negative Resultate.
Während des Screenings zeigte sich jedoch, dass bei den
Poolproben teilweise auch extrem schwache Banden des
SMIM1*64_80del Allels als positive Reaktionen betrachtet werden
mussten und schwach positive Poolproben des Allels JR*01N.02
als negativ gewertet werden mussten. Das Resultat der Proben
musste stets in Relation zum Resultat des HGH, der internen
Kontrolle gestellt werden.
Screening:
Jr: Insgesamt wurden 2820 Proben getestet und keine
war positiv für das SNP 376T, drei jedoch für den
SNP 706T, jedoch waren alle 3 heterozygot, also
serologisch gesehen Jr(a) positiv.
Vel: 14 heterozygote SMIM1*64_80del positive Proben
konnten aus 564 Einzelproben nachgewiesen werden, was
jedoch einem Vel-positiven Phänotyp entspricht.
Zielsetzung 2:
In Bezug auf JR-negative Allele war möglich auf deren Häufigkeit
zu screenen. Eine Anzahl von 3 heterozygot JR*01 negativen
Spendern oder Spenderinnen aus 2820 Proben entspricht einer
Allelfrequenz von ca. 0.1 %. Mit der niedrigen Allelfrequenz ist es
sinnvoll das Screenen in 94er Pools durchzuführen.
Die Allelfrequenz (ca. 2.5 %) beim SMIM1*64_80del war höher als
erwartet und da zusätzlich falsch-negative Resultate bei
Poolproben nicht ausgeschlossen werden konnten ist es sinnvoller
wenn man Einzelproben auf Vel-Negativität untersucht.
Abb. 5.1 Resultate des PM 22
Quellenverzeichnis/Abbildungsverzeichnis
1: Ballif, B. A., Helias, V., Peyrard, T., Menanteau, C., Saison, C., Lucien, N., Bourgouin, S., Le Gall, M., Cartron, J.-P. und Arnaud, L. (2013) Disruption of SMIM1
causes the Vel – blood type | EMBO Molecular Medicine 5
2: Haer-Wigman, L., Ait Soussan, A., Ligthart, P., de Haas, M. und van der Schoot, C. E. (2014) Molecular analysis of immunized Jr(a-) or Lan- patients and validation
of a high-throughput genotyping assay to screen blood donors for Jr(a-) and Lan- phenotypes | TRANSFUSION 54
Abb. 5.1: Fasler, M. (2015) Resultate des PM 22. Oberentfelden, eigene Abbildung
Fasler Michaela │ BMA 12-15 │ Interregionale Blutspende SRK AG (Bern) │ 11. September 2015