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Strukturelle und funktionelle Anpassung
des Ubiquitin-Proteasomsystems durch
IFNγ
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades
doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
im Fach Biologie
eingereicht an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
der Humboldt-Universität zu Berlin
von
Diplom-Biologin Melanie Rieger
geboren am 03.04.1976 in Coesfeld
Präsident der Humboldt-Universität zu Berlin
Prof. Dr. Christoph Markschies
Dekan der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät I
Prof. Dr. Lutz-Helmut Schön
Gutachter:
1. Prof. Dr. Peter-Michael Kloetzel
2. Prof. Dr. Burkhardt Dahlmann
3. Prof. Dr. Wolfgang Lockau
Tag der mündlichen Prüfung: 09. 10. 2008
Abstract (de)
__________________________________________________________________________
Abstract (de)
Das Ubiquitin-Proteasom-System ist an der Degradation cytosolischer Proteine und der Generierung von Antigenen beteiligt, die über MHC Klasse I Moleküle CD8+ T Zellen präsentiert werden.
Die Antigenprozessierung wird durch Typ I und II Interferone beeinflusst, welche die Formierung
des Immunoproteasoms und des Proteasomen-Aktivators PA28 induzieren und so die katalytische
Aktivität des Ubiquitin-Proteasom-Systems qualitativ verändern. In der vorliegenden Arbeit wurde
im Zellkulturmodell unter dem Einfluss von IFN gamma die zunehmende Inkorporation der Immunountereinheiten in de novo assemblierende 20S Proteasomen und die daraus resultierende
Veränderung der proteolytische Aktivität untersucht.
Die Inkorporation der Immunountereinheiten wurde mittels 2D Gelelektrophorese und Western
Blots von 20S Proteasomen untersucht, die nach unterschiedlicher Stimulationsdauer mit IFN
gamma aus HeLa Zellen isoliert wurden. Es konnte gezeigt werden, dass innerhalb der ersten 24h
einer IFN gamma Stimulation die strukturelle Heterogenität des zellulären Proteasomenpools zunimmt, indem sowohl intermediäre als auch Immunoproteasomen assemblieren. In der NativPAGE von Lysaten IFN gamma stimulierter Zellen wurde eine Zunahme des 20S Proteasoms als
freier Komplex und in Assoziation mit PA28 beobachtet, während die Menge des zum ATPabhängigen Abbau von polyubiquitinierten Proteinen notwendigen 26S Proteasoms unverändert
blieb. Die Stimulation mit IFN gamma hatte eine Steigerung der gesamtproteasomalen Aktivität zur
Folge, die unter Inhibition der Interaktion zwischen 20S Proteasom und PA28 verzögert erfolgte.
Die katalytischen Eigenschaften isolierter Proteasomen wurden anhand der Generierung eines immunrelevanten Hepatitis C CTL Epitops des viralen Core Proteins in vitro untersucht. Im Verlauf
der IFN gamma Stimulation de novo assemblierte Proteasomen wiesen jeweils unterschiedliche
Präferenzen für die Generierung des untersuchten CTL Epitops auf. Eine weitere, proteasomenspezifische Änderung der katalytischen Aktivität bewirkte die Assoziation des ProteasomenAktivators. Innerhalb der ersten zwölf Stunden einer IFN gamma Stimulation wurde das Epitop
vermehrt mit der Unterstützung des Proteasomen-Aktivators generiert, nach 24 Stunden zunehmend durch freies 20S Proteasom. Die Ergebnisse der vorgestellten Arbeit zeigen, dass Strukturvarianten des Proteasoms zusammen mit PA28 redundant funktionieren und eine hohe proteolytische Plastizität des UPS gewährleisten.
Schlagwörter:
20S Proteasom, Anionaustauschchromatographie, Antigenprozessierung, CTL Epitop, HCV,
Immunoproteasom, Interferon gamma, intermediäre Proteasomen, PA28, ProteasomenAktivator, Ubiquitin-Proteasom-System
I
Abstract (en)
__________________________________________________________________________
Abstract (en)
The ubiquitin proteasome system is responsible for the degradation of cytosolic proteins and the
processing of MHC class I restricted antigens. The generation of these antigens is influenced by
type I and II interferons which induce the expression of immunoproteasomes and the proteasome
activator PA28; and thereby impact the quality of peptides processed by the proteasome system.
The adoption of the proteasome system to a proinflammatory environment has been investigated
in a cell culture model by isolating proteasomes after different stages of IFN gamma stimulation.
The composition of isolated proteasomes was analysed by 2D PAGE and western blot approach.
The presented work shows that within 24h of IFN gamma stimulation an increasing heterogeneity
of the cellular proteasome pool is observed, resulting from the assembly of both intermediate type
proteasomes and immunoproteasomes at the early stage of IFN gamma stimulation.
It could be shown by native PAGE of HeLa cell lysates that IFN gamma induces increasing
amounts of 20S proteasomes and PA28 associated proteasomes without decreasing the amount of
26S proteasomes that are necessary for the ATP dependent degradation of ubiquitinated proteins;
and resulting in an enhanced total proteasomal activity in vitro. This increase in activity was delayed
when the interaction of 20S proteasomes and PA28 was inhibited. A comparative analysis of the
ability of isolated 20S proteasomes to generate a known hepatitis C virus derived CTL epitope in
vitro proved that during early IFN gamma stimulation de novo assembled proteasomes exhibited a
structure specific preference to generate the HCV CTL epitope either alone or in combination with
the proteasome activator PA28. Within the first 12h of IFN gamma stimulation the epitope was
generated with higher efficiency by 20S proteasomes in association with PA28, whereas after 24h
the impact of PA28 on the proteasome pool was less pronounced. The presented work shows that
IFN gamma induces a heterogeneity of 20S proteasomes in the early stage of stimulation, acting in
combination with the proteasome activator in a redundant manner; and provides a high proteolytic
placticity of the proteasome system.
Keywords:
20S proteasome, anion exchange chromatography, antigen processing, CTL epitope,
immunoproteasome, interferon gamma, intermediate type proteasome, PA28, proteasome
activator, Ubiquitin proteasome system
II
Inhaltsverzeichnis
__________________________________________________________________________
Inhaltsverzeichnis
ABSTRACT (DE)
I
ABSTRACT (EN)
II
INHALTSVERZEICHNIS
III
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
VI
TABELLENVERZEICHNIS
VIII
ZUSAMMENFASSUNG
1
1
3
EINLEITUNG
1.1
Das 20S Proteasom
3
1.1.1
Struktur des 20S Proteasoms
3
1.1.2
Katalytische Eigenschaften des eukaryotischen 20S Proteasoms
4
1.1.3
Expression und Inkorporation der Immunountereinheiten
6
1.1.4
Proteasomen-Subtypen
8
1.2
Regulatoren des 20S Proteasoms
1.2.1
Der 19S Regulator
1.2.2
Der Proteasomen-Aktivator PA28
1.3
9
9
10
Antigenpräsentation über MHC Klasse I Moleküle
12
1.3.1
Antigenprozessierung durch das Proteasomsystem
12
1.3.2
Regulation der Antigenpräsentation durch IFNγ
13
1.3.3
Interaktionspartner der angeborenen und der adaptiven Immunantwort für MHC
Klasse I Moleküle
14
1.4
2
Zielstellung
MATERIAL UND METHODEN
2.1
17
18
Material
18
2.1.1
Geräte
18
2.1.2
Software
18
2.1.3
Verbrauchsmaterial, Kits, Enzyme und Chemikalien
19
2.2
Methoden
2.2.1
Zellkultur
20
20
2.2.1.1
Zelllinien
20
2.2.1.2
Kultur adhärenter Zellen
20
2.2.1.3
Zytokinstimulation
20
2.2.2
Proteinbiochemie
21
III
Inhaltsverzeichnis
__________________________________________________________________________
3
2.2.2.1
Zelllyse
21
2.2.2.2
Bestimmung der Proteinkonzentration
21
2.2.2.3
SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)
21
2.2.2.4
2D Gelelektrophorese
22
2.2.2.5
Native Gelelektrophorese
22
2.2.2.6
Proteinfärbung (Coomassiefärbung)
23
2.2.2.7
Western Blot
23
2.2.2.8
Immundetektion spezifischer Proteine
24
2.2.2.9
Tabellen primärer und sekundärer Antikörper
25
2.2.2.10
Densitometrische Messung von Spot- und Bandenintensitäten
25
2.2.2.11
Glyceroldichtegradienten
26
2.2.2.12
Messung der proteasomalen Enzymaktivität in Glyceroldichtegradienten mit
fluorogenem Substrat
26
2.2.2.13
Bestimmung der gesamtproteasomalen Aktivität in Glyceroldichtegradienten
26
2.2.2.14
Antikörper für die Immunpräzipitation
27
2.2.2.15
Immunpräzipitation von 20S Proteasomen und assoziierten Regulatoren
27
2.2.2.16
Verwendung von Mg-ATP in Immunpräzipitation und Glyceroldichtegradienten
27
2.2.2.17
Präparation von 20S Proteasomen
27
2.2.2.18
Präparation der Proteasomenfraktionen
28
2.2.2.19
Präparation des Proteasomen-Aktivators PA28
29
2.2.2.20
In vitro Rekonstitution von 20S-PA28 Komplexen
29
2.2.2.21
Proteolytische Prozessierung des synthetischen HCV Core122 - 165 Peptids in vitro
29
2.2.2.22
Bestimmung des Aktivierungspotentials und der Reinheit von PA28
30
2.2.2.23
Massenspektrometrische Analyse der Prozessierungsprodukte
30
ERGEBNISSE
3.1
Einfluss von IFNΓ auf Interaktionen zwischen dem Proteasom und seinen
Regulatoren
31
31
3.1.1
Einfluss von IFNγ auf die Aktivität des Proteasoms
31
3.1.2
Lokalisation der Regulatoren PA28 und 19S in Glyceroldichtegradienten
34
3.2
Rolle des Proteasomen-Aktivators PA28 während der frühen Phase der IFNΓ
Stimulation
40
3.2.1
Untersuchung in vitro rekonstituierter 20S-PA28 Komplexe
41
3.2.2
Einfluss von Mg-ATP auf die Interaktion zwischen dem 20S Proteasom und PA28
45
Strukturelle Heterogenität des 20S Proteasoms IFNΓ stimulierter HeLa Zellen
51
3.3
3.3.1
Inkorporation der Immunountereinheiten im Verlauf der IFNγ Stimulation
51
3.3.2
Anteile der inkorporierten Immunountereinheiten
52
3.4
IV
Anreicherung von Proteasomen-Subtypen
54
Inhaltsverzeichnis
__________________________________________________________________________
3.4.1
3.5
Trennung der 20S Proteasomen-Subpopulationen
Charakterisierung der Proteasomenfraktionen
55
60
3.5.1
Einbau der Immunountereinheiten in den 20S Subpopulationen
61
3.5.2
Funktionelle Eigenschaften der Proteasomenfraktionen
64
3.5.3
In vitro Generierung des HLA-A2.1 restringierten HCV Core Epitops ADLMGYIPLV
65
4
DISKUSSION
69
4.1
Selbstregulation proteasomaler Komplexe in der Immunantwort
69
4.2
PA28 ermöglicht eine schnelle Anpassung des UPS an die zytokininduzierten
Antigenpräsentation
73
4.2.1
4.3
4.3.1
4.3.2
4.4
4.4.1
4.5
Eine Rolle für PA28 in der angeborenen Immunantwort
Adaption des 20S Proteasoms an den proinflammatorischen Status
76
78
Die unterschiedliche Inkorporation der Immunountereinheiten bewirkt eine
strukturelle Heterogenität der Proteasomenpopulation
78
IFNγ-unabhängige strukturelle Unterschiede von Proteasomen-Subtypen
81
Modulation der Funktionellen Plastizität des Proteasoms durch IFNγ
82
Die strukturelle Heterogenität des Proteasoms bedingt eine funktionelle Plastizität
82
Die funktionelle Anpassung des Proteasoms an IFNΓ verläuft nicht progressiv
84
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
86
LITERATURVERZEICHNIS
87
PUBLIKATIONEN
101
DANKSAGUNG
102
EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG
103
V
Abbildungsverzeichnis
__________________________________________________________________________
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Modell und Kristallstruktur des 20S Proteasoms......................................................................... 4
Abb. 2: Formierung des Immunoproteasoms ............................................................................................ 6
Abb. 3: Theoretische Struktur intermediärer 20S Proteasomen .............................................................. 8
Abb. 4: 3D Rekonstruktion des 26S Proteasoms..................................................................................... 11
Abb. 5: Prozessierung, Transport und Präsentation von MHC Klasse I restringierten
Antigenen ...................................................................................................................................... 14
Abb. 6: Interaktion zwischen MHC Klasse I Molekül und Epitop....................................................... 15
Abb. 7: Bestimmung der proteolytischen Aktivität in
Glyceroldichtegradientenfraktionen von Zelllysaten IFNγ stimulierter HeLa
Zellen ............................................................................................................................................. 32
Abb. 8: Dichtegradientenzentrifugation der Lysate IFNγ stimulierter HeLa Zellen und
Nachweis des 20S Proteasoms................................................................................................... 33
Abb. 9: Lokalisation von PA28 in Glyceroldichtegradienten IFNγ stimulierter HeLa
Zellen ............................................................................................................................................. 35
Abb. 10: Aktivierendes Potential des freien Aktivators PA28 ............................................................... 36
Abb. 11: Lokalisation des 19S Komplexes in Glyceroldichtegradienten IFNγ
stimulierter HeLa Zellen ............................................................................................................. 37
Abb. 12: Immunpräzipitation von 20S Komplexen aus Glyceroldichtegradienten und
Nachweis von PA28α und S1..................................................................................................... 38
Abb. 13: Nachweis proteasomaler Komplexe IFNγ stimulierter HeLa Zellen ................................... 39
Abb. 14: In vitro Rekonstitution von 20S-PA28 Komplexen .................................................................. 42
Abb. 15: Proteolytische Aktivität in vitro rekonstituierter 20S-PA28 Komplexe ................................ 43
Abb. 16: In vitro Assoziation von PA28 an Proteasomen IFNγ stimulierter MEC PA28/Zellen und Steigerung der proteolytischen Aktivität........................................................... 44
Abb. 17: Einfluss von Mg-ATP auf die Stabilität der Assoziation von PA28 an
20S Proteasomen.......................................................................................................................... 46
Abb. 18: Nachweis von PA28 und 20S Proteasomen in Mg-ATP-haltigen
Glyceroldichtegradienten von Lysaten IFNγ stimulierter HeLa Zellen .............................. 47
Abb. 19: Einfluss von Mg-ATP auf die proteasomale Aktivität in Glycerolgradientenfraktionen ......................................................................................................................... 49
Abb. 20: Entwicklung der proteasomalen Aktivität nach IFNγ Stimulation ....................................... 50
Abb. 21: Immunpräzipitation von 20S Proteasomen und Nachweis der katalytischen
Untereinheiten.............................................................................................................................. 52
Abb. 22: 2D Gelelektrophorese und densitometrische Quantifizierung der
katalytischen β-Untereinheiten isolierter 20S Proteasomen aus IFNγ
stimulierten HeLa Zellen ............................................................................................................ 53
VI
Abbildungsverzeichnis
__________________________________________________________________________
Abb. 23: Trennung der 20S Proteasomenpopulationen IFNγ stimulierter HeLa Zellen
mittels Anionenaustauschchromatographie ............................................................................. 57
Abb. 24: Relativer Anteil der vier Abschnitte der Absorptionskurven (λ=280nm) ............................ 58
Abb. 25: Rechromatographie vereinigter Fraktionen der 20S Proteasomenpopulationen
IFNγ stimulierten HeLa Zellen.................................................................................................. 59
Abb. 26: Nomenklatur der Proteasomenfraktionen ................................................................................ 60
Abb. 27: Quantifizierung der 20S Proteasomen in Proteasomenfraktionen........................................ 61
Abb. 28: Nachweis und densitometrische Quantifizierung katalytischer βUntereinheiten der Proteasomenfraktionen............................................................................. 63
Abb. 29: Aminosäuresequenz des verwendeten HCV Core122 – 165 Peptids........................................... 65
Abb. 30: In vitro Prozessierung des Epitops ADLMGYIPLV durch 20S Proteasomen in
An- und Abwesenheit von PA28............................................................................................... 66
VII
Tabellenverzeichnis
__________________________________________________________________________
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Verwendete Zelllinien ................................................................................................................ 20
Tabelle 2: Gellösungen für 3,5 – 5%ige native Gradientengele ............................................................. 23
Tabelle 3: Primäre Antikörper für die Western Blot Analyse................................................................. 25
Tabelle 4: Sekundäre Antikörper für die Western Blot Analyse ............................................................ 25
Tabelle 5: Antikörper für die Immunpräzipitation................................................................................... 27
Tabelle 6: Einfluss von IFNγ auf Elutionsverhalten und Aktivität des 20S Proteasoms................... 56
VIII
Zusammenfassung
__________________________________________________________________________
Zusammenfassung
CTLs (zytotoxische T Lymphozyten) erkennen infizierte oder transformierte Zellen anhand
von spezifischen Antigenen, die über MHC (major histocompatibility complex 1) Klasse I Moleküle
in höheren Vertebraten präsentiert werden. Die Generierung der MHC I Peptidliganden erfolgt
durch das UPS (Ubiquitin-Proteasomsystem). Proinflammatorische Zytokine wie Typ I und II
IFN (Interferone) induzieren die Expression alternativer katalytischer Immunountereinheiten
des 20S Proteasoms sowie den Proteasomen-Aktivator PA28. Die dadurch induzierte Bildung
von Immunoproteasomen und die Assoziation von PA28 an das 20S Proteasom bewirken eine
verbesserte Generierung von verschiedenen bekannten CTL-Epitopen. In der vorliegenden
Arbeit wurde im Zellkulturmodell untersucht, ob der Prozess der Anpassung des UPS an IFNγ
infolge der zunehmenden Inkorporation der Immunountereinheiten mit einer erhöhten strukturellen Heterogenität des Proteasoms verbunden ist und wie sich dieser Prozess auf die proteolytischen Eigenschaften des Proteasoms auswirkt.
Die Inkorporation der drei Immunountereinheiten wurde an 20S Proteasomen untersucht, die
nach unterschiedlicher Stimulationsdauer aus HeLa Zellen isoliert wurden. Mittels 2D Gelelektrophorese konnte gezeigt werden, dass die Immunountereinheiten in unterschiedlichem
Maße in de novo formierte 20S Proteasomen inkorporiert wurden. Mit chromatographischen
Methoden wurden die isolierten 20S Proteasomen in Subpopulationen separiert. Diese enthielten unterschiedliche Strukturvarianten des 20S Proteasoms, die als Immunoproteasomen und
intermediäre 20S Proteasomen, welche parallel konstitutive und Immunountereinheiten enthielten, eingeordnet wurden. Es konnte gezeigt werden, dass die Subpopulationen des 20S Proteasoms bei der in vitro Prozessierung eines synthetischen HCV Core Polypeptids eine unterschiedliche Schnittpräferenz für ein darin enthaltenes CTL-Epitop aufwiesen und dass ihre
Schnittpräferenzen durch PA28 zusätzlich verschieden beeinflusst wurden. Innerhalb der ersten
zwölf Stunden der Adaption des 20S Proteasoms an IFNγ wurde das Epitop vermehrt mit der
Unterstützung des Proteasomen-Aktivators generiert, nach 24 Stunden jedoch zunehmend
durch freies 20S Proteasom. Daraus wurde geschlossen, dass die Adaption des Proteasoms an
IFNγ diskontinuierlich verläuft. Die Ergebnisse der vorgestellten Arbeit weisen darauf hin, dass
die Generierung von CTL-Epitopen nicht zwangsläufig durch spezifische Strukturvarianten
erfolgen muss, sondern dass Strukturvarianten des Proteasoms zusammen mit PA28 redundant
funktionieren können und eine hohe proteolytische Plastizität des UPS gewährleisten.
In der Nativ-PAGE von Lysaten IFNγ stimulierter Zellen wurde eine Zunahme des 20S Proteasoms als freier Komplex und in Assoziation mit PA28 beobachtet, während die Menge des
zum ATP-abhängigen Abbau von polyubiquitinierten Proteinen notwendige 26S Proteasoms
annähernd unverändert blieb. Damit war ein im Verlauf der Adaption an IFNγ gesteigerter
Umsatz eines fluorogenen Substrats durch proteasomale Komplexe verbunden. Es wurde gezeigt, dass der Proteasomen-Aktivator schneller zu einem Anstieg der proteolytischen Aktivität
beiträgt als das 20S Proteasom. Damit kann eine höhere Quantität der generierten MHC I Li-
1
Zusammenfassung
__________________________________________________________________________
ganden und der MHC I Präsentation erzielt werden, was die Wahrscheinlichkeit einer Erkennung infizierter oder transformierter Zellen erhöht.
2
Einleitung
________________________________________________________________________
1
Einleitung
1.1
Das 20S Proteasom
1.1.1
Struktur des 20S Proteasoms
Das UPS (Ubiquitin-Proteasomsystem) ist an der Regulation des Proteinhaushalts eukaryotischer Zellen beteiligt und realisiert die Proteolyse von über 90% der Proteine (Coux et al.,
1996). Der kontrollierte Abbau von Proteinen durch das UPS ist Teil grundlegender zellulärer
Funktionen wie Proliferation, Zellzyklusregulation, Apoptose und Signaltransduktionsprozessen. Die Degradation eines Proteins durch das UPS unterliegt der Kontrolle einer Enzymkaskade, die potentielle Substrate kovalent mit dem Markerprotein Ubiquitin verknüpft. Erst die
Assoziation längerer Polyubiquitinketten führt zu der Erkennung und ATP-abhängigen Degradation eines Proteins durch das 26S Proteasom (Hershko und Ciechanover, 1998). Das 20S
Proteasom bildet den zentralen proteolytisch aktiven Komplex des UPS. Der 700kDa große
zylinderförmige Multiproteinkomplex besteht aus vier heptameren Ringen. In Eukaryoten setzen sich die Ringe aus je sieben verschiedenen α- und β-Untereinheiten (α1-7β1-7β1-7α1-7) zusammen, die eine feste Position im Komplex einnehmen. Die beiden äußeren Ringe bestehen aus
α-Untereinheiten, und die beiden inneren Ringe aus β-Untereinheiten. Daraus ergibt sich eine
C2-Symmetrie des Komplexes; die Symmetrieachse verläuft zwischen den beiden β-Ringen
(Groll et al., 1997; Unno et al., 2002). Innerhalb des Proteinkomplexes zwischen den α- und βRingen befinden sich drei miteinander verbundene Kavitäten. Die größte dieser Kavitäten bildet die katalytische Kammer, in welche die aktiven Zentren des 20S Proteasoms weisen (Groll
et al., 1997). Die an beiden Enden des Zylinders gelegenen α-Ringe bilden eine Öffnung, die
Substraten Zugang zum Inneren des Enzyms bietet. Liegt das 20S Proteasom als freier Komplex vor, verschließen die N-Termini der α-Untereinheiten den Ring (closed conformation). Eine
Deletion des N-Terminus der Untereinheit α3 in Saccharomyces cerevisiae resultiert in einer geöffneten Konformation des α-Rings. In vivo bewirkt die Assoziation der Regulatoren PA28 oder
des 19S Komplexes an das 20S Proteasom eine Konformationsänderung der α-Untereinheiten,
die eine Öffnung (gating) des α-Rings zur Folge hat und einen Substrateintritt ermöglicht (Groll
et al., 2000; Whitby et al., 2000).
3
Einleitung
________________________________________________________________________
Abb. 1: Modell und Kristallstruktur des 20S Proteasoms
Das eukaryotische 20S Proteasom ist aus 28 Untereinheiten zusammengesetzt. Je sieben α- und β- Untereinheiten bilden
heptamere Ringe, die in einer C2-Symmetrie angeordnet sind. Die Untereinheiten β1, β2 und β5 sind die katalytisch aktiv.
Die Position der aktiven Zentren im Inneren des Komplexes wird an der Kristallstruktur des 20S Proteasoms von Saccharomyces cerevisiae ersichtlich. Die Darstellung zeigt einen Schnitt durch die Längsachse des Proteasoms (Groll et al., 2000).
Die Assemblierung des 20S Proteasoms wird durch Chaperone unterstützt und ist mit einer
Bildung von Vorläuferkomplexen verbunden, die aus je einem α- und einem β-Ring bestehen.
Die β-Untereinheiten werden mit Ausnahme von β3 und β4 zunächst als Vorläuferproteine
synthetisiert. An einen α-Ring assoziieren die Untereinheiten β3 und β4 sowie die Proform der
Untereinheit β2 (Frentzel et al., 1994). Die Proformen der β-Untereinheiten 1, 5, 6 und 7 werden daran anschließend in diesen Vorläuferkomplex integriert, der damit einen kompletten αund einen β-Ring umfasst (Frentzel et al., 1994; Fricke et al., 2007; Schmidt und Kloetzel,
1997). Nach der Dimerisierung von zwei Proteasomenhälften erfolgt die Aktivierung des Proteasoms durch autokatalytische Abspaltung der β-Propeptide (Schmidtke et al., 1996). Die
Kompartimentierung und die geschützte Maturierung des 20S Proteasoms verhindert eine unkontrollierte Degradation potentieller Substrate (Chen und Hochstrasser, 1996).
1.1.2
Katalytische Eigenschaften des eukaryotischen 20S Proteasoms
Das 20S Proteasom gehört zur Klasse der N-terminal nukleophilen Hydrolasen (NtnHydrolasen) und vermittelt die endoproteolytische Hydrolyse von Peptidbindungen (Brannigan
et al., 1995). Die katalytischen Aktivitäten werden durch die Untereinheiten β1, β2 und β5 vermittelt. Das aktive Zentrum ist jeweils ein N-terminales Threonin, dass in einer Substratbindungstasche der katalytischen Kammer liegt. Darüber hinaus sind die Aminosäuren Asp17,
Lys33 und Asp166 essentiell für die proteolytische Aktivität. Diese Aminosäuren sind nur in
den Untereinheiten β1, β2 und β5 konserviert, daher verfügt das eukaryotische 20S Proteasom
insgesamt über sechs aktive Zentren (Groll et al., 1997).
Anhand von synthetischen Peptiden, welche aus drei bis fünf Aminosäuren und einer Cterminal gekoppelten fluorogenen Gruppe bestehen, wurden den katalytisch aktiven β4
Einleitung
________________________________________________________________________
Untereinheiten des Proteasoms drei unterschiedliche Aktivitäten zugeordnet. Die endoproteolytische Spaltung nach sauren Aminosäuren wird als caspaseähnliche oder PGPH-Aktivität (peptidyl-glutamyl peptide hydrolizing activity) bezeichnet und wird durch die Untereinheit β1 vermittelt.
Die trypsinähnliche Aktivität bezeichnet die Spaltung nach basischen Aminosäuren. Sie wird
durch β2 vermittelt. Die chymotrypsinähnliche Aktivität des Proteasoms vermittelt die Spaltung
nach hydrophoben Aminosäuren über die Untereinheit β5 (Dahlmann et al., 1986; Dick et al.,
1998; Wilk und Orlowski, 1983).
In Vertebraten existieren neben den drei konstitutiven katalytischen β-Untereinheiten β1, β2
und β5 Homologe, die ursprünglich durch Genduplikationen entstanden sind und ebenfalls
katalytisch aktiv sind. Sie werden analog als induzierbares β1 (iβ1), iβ2 und iβ5 oder übergeordnet als Immunountereinheiten bezeichnet, da ihre Expression durch proinflammatorische Zytokine induziert wird (Aki et al., 1994; Groettrup et al., 1996; Loukissa et al., 2000; Shin et al.,
2007). Aminosäuren, welche die Oberfläche der Substratbindungstasche bilden, bestimmen
wahrscheinlich durch Ladung und Hydrophobizität die Affinität einer Bindungstasche für proteasomale Substrate und nehmen dadurch Einfluss auf den endoproteolytischen Schnitt der
jeweiligen katalytischen Untereinheit. Hierzu gehören die Aminosäuren Arg45 (β1), Gly45 und
Asp53 (β2) und Met45 (β5) (Groll et al., 1997). Diese Aminosäuren sind auch in den Immunountereinheiten mit zwei Ausnahmen konserviert: Arg45 (β1) ist in der Immunountereinheit
iβ1 durch Leucin ersetzt und Asp53 (β2) in der korrespondierenden Immunountereinheit iβ2
durch Glutamin.
Bisherige Untersuchungen zur Auswirkung einer Inkorporation der Immunountereinheiten auf
die Hydrolyse fluorogener Substrate durch das 20S Proteasom führten zu unterschiedlichen
Ergebnissen. Neben methodischen Unterschieden bei der Isolation der untersuchten Proteasomen können diese Unterschiede speziesspezifische Eigenschaften der humanen und murinen
Immunountereinheiten widerspiegeln. Die Inkorporation der Immunountereinheit iβ1 hat sowohl in murinen als auch in humanen 20S Proteasomen eine Verringerung der caspaseähnlichen Aktivität zur Folge (Gaczynska et al., 1994; Kuckelkorn et al., 1995). In murinen 20S Proteasomen wurde nach einer Stimulation mit IFNγ außerdem eine verminderte
chymotrypsinähnliche Aktivität beobachtet (Boes et al., 1994), während in humanen 20S Proteasomen eine gesteigerte chymotrypsinähnliche und trypsinähnliche Aktivität beobachtet wurde (Driscoll et al., 1993; Gaczynska et al., 1993).
Bei einer Prozessierung von Peptiden, deren Länge drei bis fünf Aminosäuren überschreiten, ist
eine strikte Zuordnung der Schnittpräferenzen zu einzelnen β-Untereinheiten des Proteasoms
nicht mehr ohne weiteres möglich (Kisselev et al., 1999). Die Schnittpräferenz des 20S Proteasoms wird nicht allein durch die Aminosäure direkt N-terminal vom endoproteolytischen
Schnitt determiniert, sondern ebenso durch weiter N- und C-terminal vom Schnitt liegende
Aminosäuren (Beekman et al., 2000; Eggers et al., 1995; Nussbaum et al., 1998).
5
Einleitung
________________________________________________________________________
1.1.3
Expression und Inkorporation der Immunountereinheiten
Die Expression der Immunountereinheiten wird durch proinflammatorische Zytokine kontrolliert. In den Promotorregionen der Immunountereinheiten sind ISRE (interferon stimulatory response elements) und IRF-E (interferon regulatory factor – enhancer) Sequenzen enthalten, die durch die
Transkriptionsfaktoren IRF-1 und 2 (interferon regulatory factor 1 & 2) erkannt werden (Brucet et
al., 2004; Foss und Prydz, 1999; Namiki et al., 2005; Wright et al., 1995). Die Expression dieser
Transkriptionsfaktoren wird durch Typ I und II Interferone, aber auch durch den Tumornekrosefaktor α (TNFα), Interleukin 1(IL-1) und IL-6 sowie den leukemia inhibitory factor induziert (Abdollahi et al., 1991; Harada et al., 1989). Die Expressionskontrolle von IRF-1 über die
genannten Zytokine hat zur Folge, dass Immunountereinheiten durch Typ I und II Interferone
sowie TNFα induziert werden; aber auch LPS (Lipopolysaccharide) oder Hitzeschock können
eine Induktion der Immunountereinheiten bewirken (Aki et al., 1994; Callahan et al., 2006; Shin
et al., 2006; Stohwasser et al., 2000). Die konstitutiven katalytischen Untereinheiten β1 und β5
werden durch IFNγ posttranskriptionell reziprok reguliert, allerdings ist bisher nicht bekannt,
wie diese Regulation erfolgt (Belich et al., 1994).
Abb. 2: Formierung des Immunoproteasoms
Durch proinflammatorische Zytokine wie Typ I und II Interferone sowie TNFα werden die Immunountereinheiten iβ1, iβ2
und iβ5 induziert und in de novo assemblierende Proteasomen inkorporiert.
Die Immunountereinheiten werden alternativ zu ihren korrespondierenden konstitutiven Homologen in de novo assemblierende 20S Proteasomen inkorporiert und nehmen deren Position
im Komplex ein (Frentzel et al., 1994; Griffin et al., 1998; Groettrup et al., 1997). 20S Proteasomen, die alle Immunountereinheiten enthalten, werden als Immunoproteasom bezeichnet.
Sie weisen gegenüber den konstitutiven 20S Proteasomen eine deutlich verringerte Halbwertszeit von 27 statt 120 Stunden auf und stellen damit eine transient induzierbare Variante des
konstitutiven 20S Proteasoms dar (Heink et al., 2005).
In lymphoiden Organen gesunder Organismen, wie Milz, Thymus oder Dünndarm, werden
Immunountereinheiten unter physiologischen Bedingungen exprimiert (Eleuteri et al., 1997;
Kuckelkorn et al., 2002). In nicht-lymphoiden Organen wie z.B. Leber oder Dickdarm werden
Immunountereinheiten erst nach viraler, fungaler oder bakterieller Infektion induziert. Sie können bis zu 95% der katalytischen β-Untereinheiten ausmachen, ersetzen die konstitutiven kata6
Einleitung
________________________________________________________________________
lytischen Untereinheiten jedoch nie vollständig (Barton et al., 2002; Khan et al., 2001; Strehl et
al., 2006). Bei der Untersuchung einer Population von 20S Proteasomen stellt sich daher die
Frage, ob jeweils diskrete konstitutive und Immunoproteasomen vorliegen oder ob heterogene
Komplexe existieren, die parallel sowohl konstitutive als auch Immunountereinheiten enthalten
(intermediäre Proteasomen, Abb. 3).
Die Assemblierung von Immunoproteasomen scheint durch den Einbau der Immunountereinheit iβ1 in Vorläuferkomplexe determiniert zu werden, da iβ1 früher in den Vorläuferkomplex
integriert wird als sein Homolog β1 (Nandi et al., 1997). Die Immunountereinheit iβ2 wird
überwiegend kooperativ mit iβ1 in Vorläuferkomplexe des 20S Proteasoms eingebaut (Griffin
et al., 1998; Groettrup et al., 1997). Diese Kooperativität wird durch die Prosequenz der Untereinheit iβ2 vermittelt. Die Inkorporation von iβ1 hängt dagegen nicht von der Anwesenheit von
iβ2 ab (De et al., 2003). Die Untereinheiten β5 und iβ5 werden später in den Komplex integriert. Die Maturierung von Immuno-Vorläuferkomplexen erfolgt durch die Inkorporation der
Immunountereinheit iβ5 wesentlich effizienter als durch dessen konstitutives Homolog β5
(Griffin et al., 1998; Kingsbury et al., 2000). Die Inkorporation von iβ5 ist jedoch nicht auf einen bestimmten Vorläuferkomplex festgelegt (De et al., 2003; Groettrup et al., 1997). Obwohl
die Propeptide der Immunountereinheiten iβ1 und iβ5 einen positiven Einfluss auf die Assemblierung homogener (konstitutiver oder Immuno-) Proteasomenhälften haben (De et al.,
2003; Kingsbury et al., 2000), konnte gezeigt werden, dass 20S Proteasomen existieren, die sowohl die Immunountereinheit iβ1 als auch die korrespondierende konstitutive Untereinheit β1
enthalten (Klare et al., 2007). Das lässt vermuten, dass eine Assemblierung asymmetrischer Proteasomenhälften möglich ist. Wahrscheinlich existieren daher neben dem konstitutiven und
dem Immunoproteasom weit mehr strukturelle Varianten in Form von intermediären 20S Proteasomen.
7
Einleitung
________________________________________________________________________
Abb. 3: Theoretische Struktur intermediärer 20S Proteasomen
(A) Die C2 Symmetrieachse des 20S Proteasoms verläuft zwischen den beiden β-Ringen durch die katalytische Kammer.
Jeder β-Ring enthält drei katalytische Untereinheiten, die durch ihre jeweiligen Homologe ersetzt werden können. (B)
Ein intermediärer β-Ring kann sowohl konstitutive Untereinheiten (grün) als auch Immunountereinheiten (rot) enthalten. Intermediäre Proteasomen enthalten intermediäre β-Ringe oder sind aus asymmetrischen Proteasomenhälften
aufgebaut (zwei der möglichen Kombinationen sind gezeigt).
1.1.4
Proteasomen-Subtypen
20S Proteasomen, die aus Organen von Ratten isoliert wurden, konnten anhand ihrer Bindungseigenschaften an eine Anionenaustauschersäule in sechs Proteasomen-Subtypen getrennt
werden. Neben einer spezifischen Affinität zum Säulenmaterial weisen sie unterschiedliche proteolytische Aktivität auf. Zwei der Subtypen konnten den konstitutiven und zwei weitere den
Immunoproteasomen zugeordnet werden. Die verbleibenden beiden Subtypen enthielten nur
eine oder zwei der drei Immunountereinheiten (Dahlmann et al., 2001; Dahlmann et al., 2000).
Auf welchen strukturellen Unterschieden die Trennung rein konstitutiver oder Immunoproteasomen-Subtypen beruht, ist derzeit noch ungeklärt.
Die Trennung proteasomaler Untereinheiten in denaturierenden 2D Gelen gibt weitere Hinweise auf eine strukturelle Varianz des 20S Proteasoms. Die isoelektrische Fokussierung und anschließende Trennung nach Molekulargröße führt zum Nachweis von mehr als den theoretisch
17 (α1-7, β1-7, iβ1, iβ2 und iβ5) möglichen Proteasomenuntereinheiten. Durch massenspektro8
Einleitung
________________________________________________________________________
metrische Identifizierung wurde gezeigt, dass einige der proteasomalen Untereinheiten in zwei
bis drei verschiedenen Varianten vorliegen. Dabei gibt es sowohl Variationen im isoelektrischen
Punkt als auch im Molekulargewicht (Claverol et al., 2002; Froment et al., 2005; Kuckelkorn et
al., 2002; Seelig et al., 1993). Die Veränderung des isoelektrischen Punktes eines Proteins kann
durch eine abweichende Aminosäuresequenz oder durch posttranslationale Modifikationen
verursacht werden. In Drosophila melanogaster wurden Isoformen der Untereinheiten α3, α4, α6,
β2, β4 und β5 beschrieben, ebenso existiert eine Isoform der humanen proteasomalen Untereinheiten α6 (Ma et al., 2002; Silva Pereira et al., 1992). Auch posttranslationale Modifikationen
proteasomaler Untereinheiten sind bekannt. Hierzu gehören Phosphorylierungen der Untereinheiten α3, α7 und β3 in Rattus norvegicus (Bose et al., 2001; Wehren et al., 1996), NAcetylierungen der α-Untereinheiten sowie von β3 und β4 in Saccharomyces cerevisiae (Kimura et
al., 2000) und der Nachweis von HNE (4-Hydroxy-2-Nonenal) an α1, α2 und α4 humaner 20S
Proteasomen (Bulteau et al., 2001; Okada et al., 1999). Bisher wurde experimentell beschrieben,
dass die Phosphorylierung der proteasomalen Untereinheit α7 die Assoziation des 19S Regulators an 20S Proteasomen unterstützt, und dass IFNγ eine verminderte Phosphorylierung von
α7 zur Folge hat (Bose et al., 2004). Ob Modifikationen jedoch für die Trennung einzelner Proteasomenuntereinheiten in der 2D Gelelektrophorese in mehrere Varianten ursächlich sind, und
welche weiteren physiologischen Funktionen ihnen zugeordnet werden können, ist noch nicht
geklärt.
1.2
Regulatoren des 20S Proteasoms
1.2.1
Der 19S Regulator
Das 26S Proteasom, das für den ATP-abhängigen Abbau polyubiquitinierter Proteine verantwortlich ist, besteht aus dem zentralen 20S Proteasom und einem oder zwei assoziierten 19S
Regulatorkomplexen (Peters et al., 1993). Der 19S Komplex vermittelt die Erkennung polyubiquitinierter Proteine sowie deren Deubiquitinierung und Entfaltung, bevor sie durch das 20S
Proteasom zu Peptiden hydrolysiert werden. Der 19S Komplex besteht aus bis zu 18 Untereinheiten, die in zwei Subkomplexe, in „Lid“ und in „Base“ unterteilt werden. Die Integration des
Lidkomplexes in das 26S Proteasom ist für den ATP-abhängigen Abbau ubiquitinierter Substrate essentiell. Verschiedene Untereinheiten des Lidkomplexes sind für die Erkennung polyubiquitinierter Proteine, deren Bindung und Deubiquitinierung erforderlich (Glickman und Ciechanover, 2002). Der Basekomplex vermittelt die ATP-abhängige Assoziation des 19S
Komplexes an das 20S Proteasom. Die Interaktion des Basekomplexes mit dem Proteasom
erfolgt über sechs AAA ATPasen (ATPases associated with a variety of cellular activities), die einen
hexameren Ring bilden. Die C-Termini der ATPasen vermitteln eine Interaktion des 19S Komplexes mit den α-Ringen des 20S Proteasoms und bewirken deren Öffnung (Groll et al., 2000;
Smith et al., 2007). Dieser Vorgang wird als gating bezeichnet. Eine chaperonähnliche Aktivität
der ATPasen ermöglicht die Entfaltung der zu degradierenden Proteine und ihren Eintritt in
9
Einleitung
________________________________________________________________________
die katalytische Kammer des 20S Proteasoms (Braun et al., 1999). Die Nicht-ATPaseUntereinheiten S1 (Rpn2, regulatory particle non-ATPase 2) und S2 (Rpn1) bilden eine Interaktionsoberfläche zwischen den ATPasen und dem Lidkomplex (Wilkinson et al., 1997) und können außerdem Interaktionen des 26S Proteasoms mit weiteren nicht proteasomalen Proteinen
vermitteln (Hartmann-Petersen und Gordon, 2004).
1.2.2
Der Proteasomen-Aktivator PA28
Ein weiterer Interaktionspartner des 20S Proteasoms ist der Proteasomen-Aktivator PA28 oder
11S Regulator, der ATP-unabhängig mit dem 20S Proteasom assoziiert (Dubiel et al., 1992; Ma
et al., 1992). Im Gegensatz zum 19S Komplex unterstützt PA28 nur die Degradation ungefalteter, nicht ubiquitinierter Proteine sowie kurzer Peptide durch das Proteasom. Kristallstrukturanalysen des in Trypanosoma brucei vorkommenden homologen Komplexes PA26 weisen auf eine
heptamere Struktur des Proteasomen-Aktivators hin. Der Aktivator besteht aus sieben α- und
β-Untereinheiten, die eine Größe von 29 bzw. 28 kDa aufweisen. In vitro kann aus rekombinantem PA28α allein ein funktioneller Komplex rekonstituiert werden, dessen aktivierendes Potential jedoch nicht das eines heterooligomeren PA28αβ Komplexes erreicht (Realini et al., 1997).
Während der 19S Komplex eine regulatorische Funktion bezüglich der Substratwahl und der
Zuführung des Substrats zum 20S Proteasom ausübt, verstärkt PA28 vermutlich durch das
gating den Substratumsatz des 20S Proteasoms (Stohwasser et al., 2000). PA28 vermittelt durch
seine Interaktion mit dem α-Ring des 20S Proteasoms eine Konformationsänderung der NTermini der α-Untereinheiten und damit eine Öffnung des Rings (Whitby et al., 2000). Neben
der Verstärkung des Substratumsatzes verändert PA28 auch die Präferenz des 20S Proteasoms
für endoproteolytische Schnitte in einer Peptidsequenz (Dick et al., 1996; Groettrup et al.,
1996).
10
Einleitung
________________________________________________________________________
Abb. 4: 3D Rekonstruktion des 26S Proteasoms
(A) Das Modell des 26S Proteasoms basiert auf elektronenmikroskopischen Aufnahmen des 26S Proteasoms aus Drosophila
melanogaster und der Kristallstruktur des 20S Proteasoms aus Thermoplasma acidophilum (Voges et al., 1999). (B) Kristallstruktur des 20S Proteasoms aus Saccharomyces cerevisiae in Assoziation mit PA26 aus Trypanosoma brucei, einem Homolog zu PA28.
Oben: Sicht von oben auf den PA26-Komplex, unten: Seitenansicht des 20S-PA26 Komplexes. (Whitby et al., 2000).
Analog zu den Immunountereinheiten des 20S Proteasoms sind die Untereinheiten PA28α und
PA28β durch Typ I und II Interferone induzierbar (Realini et al., 1994; Shin et al., 2007). Infolgedessen erhöht sich die intrazelluläre Konzentration der 20S-PA28 Komplexe, was zu Lasten
des Anteils an 26S Proteasomen geht. Dieser Prozess wird vermutlich auch über die Phosphorylierung von α7 reguliert (Bose et al., 2001; Bose et al., 2004). Nach einer Induktion des Proteasomen-Aktivators konnte auch eine Zunahme von Hybridproteasomen beobachtet werden
(Tanahashi et al., 2000). Hybridproteasomen besteht aus einem 20S Proteasom, das über einen
α-Ring an PA28 und über den anderen α-Ring an einen 19S Komplex bindet (Hendil et al.,
1998). Es wurde diskutiert, ob die gleichzeitige Assoziation beider Regulatoren an das 20S Proteasom zu einem effizienteren Abbau ubiquitinierter Proteine beitragen kann. Der Abbau entfalteter Proteine durch Hybridproteasomen ist jedoch gegenüber dem 26S Proteasom nicht
beschleunigt. Es konnte auch kein erhöhter Umsatz fluorogener Peptide durch Hybridproteasomen im Vergleich zu zweifach mit 19S Komplexen assoziierten 26S Proteasomen beobachtet
werden (Kopp et al., 2001). Dieser Befund wurde damit begründet, dass die Aktivierung des
Proteasoms auf der Öffnung des α-Rings und einem verbesserten Substratdurchlass basiert. Da
die Assoziation des 19S Komplexes ebenso mit einem gating des α-Rings verbunden ist, kann
eine Assoziation von PA28 im Austausch gegen einen 19S Komplex keine weitere Aktivierung
des 20S Komplexes mehr bewirken. Andererseits hat die Assoziation von PA28 an das 26S
11
Einleitung
________________________________________________________________________
Proteasom Einfluss auf die dabei generierten Peptidfragmente, was im Bezug auf die adaptive
Immunantwort von Interesse sein kann (Cascio et al., 2002).
Neben dem 19S Komplex und dem Proteasomen-Aktivator existieren weitere Komplexe, die
an das 20S Proteasom binden können. Hierzu gehört das PA28αβ Homolog PA28γ, welches
ein Homoheptamer bildet und vermutlich einen evolutionären Vorläufer des PA28αβ darstellt.
PA28γ wird wahrscheinlich nicht durch Interferone induziert und ist anders als PA28αβ nicht
im Zytoplasma, sondern im Zellkern lokalisiert. PA28γ aktiviert das Proteasom ebenfalls, allerdings mit geringerer Effizienz als PA28αβ. Ein weiterer Komplex, PA200, weist Homologie
zum Maturierungsfaktor Blm3 in Saccharomyces cerevisiae auf. PA200 ist ebenfalls im Nukleus lokalisiert, und es wird eine Funktion von PA200 bei der Reparatur von DNADoppelstrangbrüchen und bei der Spermatogenese diskutiert (Khor et al., 2006; Rechsteiner
und Hill, 2005).
1.3
Antigenpräsentation über MHC Klasse I Moleküle
1.3.1
Antigenprozessierung durch das Proteasomsystem
Peptide, die an MHC Klasse I Moleküle binden, werden CD8+ T Zellen als Epitope auf der
Zelloberfläche präsentiert. Diese Peptide werden hauptsächlich durch das UPS generiert
(Michalek et al., 1993). Dabei werden nicht nur Epitope, sondern auch N-terminal verlängerte
Vorläuferpeptide generiert, die durch zytosolische oder im ER (endoplasmatisches Retikulum)
lokalisierte Aminopeptidasen zu Epitopen prozessiert werden können (Knuehl et al., 2001;
York et al., 2002). Das UPS generiert jedoch mit wenigen Ausnahmen den C-terminalen Schnitt
der über MHC Klasse I Moleküle präsentierten Epitope (Kloetzel, 2004).
Da die Immunountereinheiten des 20S Proteasoms unter dem Einfluss von IFNγ zusammen
mit anderen Komponenten der MHC Klasse I Präsentation induziert werden, wurde angenommen, dass deren Inkorporation in das Proteasom zu einer verbesserten Antigenprozessierung durch das UPS beiträgt. MHC I Moleküle und der zum Transport der Epitope in das ER
erforderliche TAP Transporter (transporter associated with antigen processing) weisen eine hohe Affinität zu Peptiden mit einem hydrophoben oder basischen Carboxyterminus auf (van Endert et
al., 1995). Eine höhere Schnittpräferenz des Proteasoms nach basischen und hydrophoben
Aminosäuren unter dem Einfluss von IFNγ bewirkt daher die verstärkte Generierung solcher
Peptide, die effizient transportiert und präsentiert werden können (Boes et al., 1994; Niedermann et al., 1995; Ossendorp et al., 1996).
Verschiedene Epitope viraler Proteine wie des HBV (Hepatitis B Virus) Core Proteins, des
HCV NS3 (Hepatitis C Virus Nicht-Strukturprotein 3) oder des Nukleoproteins des Influenza
A Virus werden durch das Immunoproteasom effizienter prozessiert als durch das konstitutive
20S Proteasom (Seifert et al., 2004; Sijts et al., 2000; Van Kaer et al., 1994). Aber auch einige
Selbst-Epitope werden verstärkt generiert wie z.B. Epitope der Proteine Enolase-1 oder
MAGE3 (Schultz et al., 2002; Toes et al., 2001). Der Einbau von Immunountereinheiten muss
12
Einleitung
________________________________________________________________________
jedoch nicht in jedem Fall eine verbesserte Generierung eines MHC I Liganden zur Folge haben, wie die unveränderte Generierung eines Epitops des MuLV (Murinen Leukämie Virus)
(van Hall et al., 2000) oder auch die verminderte Bildung von Epitopen der Proteine Melan-A,
gp100 oder Tyrosinase zeigte (Morel et al., 2000; Van den Eynde und Morel, 2001).
Die Assoziation von PA28 an das 20S Proteasom kann ebenfalls zu einer verbesserten Generierung eines Epitops beitragen. Für ein Melanoma-Differenzierungsantigen des TRP2 Proteins
(tyrosine-related protein 2) wurde gezeigt, dass es in Abhängigkeit von PA28 generiert wird, und
dass diese Abhängigkeit durch die N-terminal das Epitop flankierende Peptidsequenz vermittelt
wird (Sun et al., 2002; Textoris-Taube et al., 2007). Auch die Prozessierung eines Epitops des
MCMV (murinen Cytomegalovirus) pp89 Proteins wird durch PA28 verstärkt (Dick et al.,
1996; Groettrup et al., 1996). Die Assoziation von PA28 an 20S Proteasomen hat auf die Generierung einiger anderer Epitope dagegen keinen Einfluss (Schwarz et al., 2000; van Hall et al.,
2000). Die Präferenz für einen endoproteolytischen Schnitt scheint daher für strukturelle Varianten des 20S Proteasoms unterschiedlich stark ausgeprägt zu sein. Unter dem Einfluss von
IFNγ wird eine strukturelle Heterogenität des 20S Proteasoms induziert, und zusammen mit
dem Proteasomen-Aktivator können diese Proteasomen eine größere Vielfalt an Peptidfragmenten aus einem gegebenen Polypeptid generieren als unter Standardbedingungen.
1.3.2
Regulation der Antigenpräsentation durch IFNγ
Höhere Vertebraten begegnen einer Infektion mit Pathogenen zunächst mit einer angeborenen,
später mit einer adaptiven Immunantwort. Vorraussetzung für die Erkennung einer viralen
oder bakteriellen Infektion sind unter anderem toll like Rezeptoren, die doppelsträngige RNA
erkennende Proteinkinase oder der Mannoserezeptor. Zu den ersten proinflammatorischen
Zytokinen, die auf die Erkennung pathogener Strukturen hin exprimiert werden, gehören Typ I
Interferone (IFN). Diese werden von Monozyten und Makrophagen (IFNα) oder Fibroblasten
(IFNβ) in das umliegende Gewebe sezerniert. Typ I Interferone induzieren ebenso wie TNFα
sowie IL-12 und IL-18 die Expression und Sezernierung des Typ II Interferons IFNγ in NK
Zellen (natürlichen Killerzellen), CD8+ Effektorzellen, dendritischen Zellen und Makrophagen
(Malmgaard, 2004). IFNγ vermittelt die Expression von gamma activated site (GAS) regulierten
Genen. Dies führt zur Expression einer großen Anzahl von Proteinen, zu denen Transkriptionsfaktoren und viele der an der Präsentation von Antigenen beteiligten Proteine gehören.
Hierzu zählen neben den Immunountereinheiten des 20S Proteasoms und PA28 die Untereinheiten TAP1 und 2 des TAP Transporters sowie Tapasin, die α-Kette der MHC I Moleküle und
β2 Mikroglobulin (Boehm et al., 1997).
Die vom UPS generierten Peptide können aus dem Zytosol über den heterodimeren TAP
Transporter in das ER überführt werden (Abb. 5). Der TAP Transporter bindet bevorzugt Peptide mit einem basischen oder hydrophoben C-Terminus und transportiert diese unter ATPVerbrauch in das ER. Er assoziiert im Lumen des ER über Tapasin an den PLC (peptide loading
complex), der im Weiteren den unbeladenen MHC I Komplex und Chaperone wie Calreticulin
13
Einleitung
________________________________________________________________________
und ERp57 umfasst. Im Wesentlichen stabilisiert der PLC den unbeladenen MHC I Komplex
und unterstützt die Beladung der Bindungstasche mit geeigneten Liganden (Elliott und Williams, 2005). Die Aminopeptidasen ERAP1 und 2 (ER-Aminopeptidasen) können translozierte
Peptide im ER verkürzen und die Präsentation von Epitopen ermöglichen, welche als Vorläuferpeptide über TAP transportiert werden (Knuehl et al., 2001; York et al., 2002). Die PeptidMHC-Komplexe werden über den Golgiapparat an die Zelloberfläche transportiert und dort
Zellen der angeborenen und der adaptiven Immunantwort präsentiert.
Abb. 5: Prozessierung, Transport und Präsentation von MHC Klasse I restringierten Antigenen
(A) Ubiquitinierte Substrate werden vom 26S Proteasom degradiert. Dabei entstehen MHC I Liganden und deren Vorläufer. (B) Zytosolische Amino-peptidasen können generierte Vorläuferpeptide N-terminal verkür-zen, bevor sie (C) über
den TAP Transporter in das ER transportiert und (D) auf MHC Klasse I Moleküle geladen werden. Im ER kann eine
weitere N-terminale Verkürzung der Peptide durch Aminopeptidasen erfolgen. Beladene MHC Klasse I Moleküle
kommen über den Golgi-apparat an die Zelloberfläche (E) und präsentieren ihr Epitop spezifischen zytotoxischen TLymphozyten (Kloetzel, 2001).
1.3.3
Interaktionspartner der angeborenen und der adaptiven Immunantwort für
MHC Klasse I Moleküle
MHC I Moleküle sind in der Membran verankerte Moleküle, die von allen kernhaltigen Zellen
exprimiert werden und die kurze Peptide von 8 bis 10 Aminosäuren binden. MHC I Moleküle
bestehen aus dem invarianten β2-Mikroglobulin und einer α-Kette, die entweder den klassischen
MHC I Molekülen HLA-A (human leukocyte antigen-A) -B oder -C (MHC Ia) oder nicht klassi14
Einleitung
________________________________________________________________________
schen MHC I Molekülen wie HLA-E, -F und -G (MHC Ib) zugeordnet werden (Shawar et al.,
1994). Die Interaktion des MHC I Moleküls mit Liganden erfolgt über eine Peptidbindungsfurche der α-Kette, die bei klassischen MHC I Molekülen hochpolymorph ist und die Bindung
verschiedenster Liganden ermöglicht (Parham et al., 1989).
Eine übergreifende strukturelle Vorraussetzung für die Bindung eines Peptids an MHC I Moleküle ist eine Länge von acht bis zehn Aminosäuren. MHC I Liganden interagieren mit der Bindungsfurche des MHC I Moleküls über das Rückgrat des Peptids sowie spezifisch für das jeweilige HLA Allel über sekundäre Seitenketten einer Aminosäure an Ankerresten des Peptids
(Abb. 6). Die Restriktion der verbleibenden Aminosäurereste der MHC I Liganden klassischer
MHC I Moleküle ist dagegen promiskuitiv und erlaubt die Präsentation einer hohen Anzahl
unterschiedlicher Epitope (Madden, 1995). Die Peptidbeladung stabilisiert die MHC I Moleküle
auf der Zelloberfläche.
Abb. 6: Interaktion zwischen MHC Klasse I Molekül und Epitop
Die α-Kette des MHC I Moleküls bildet eine Bindungsfurche, mit der Peptide über ihre Ankerreste interagieren. HLA-A2.1
restringierte Epitope binden über Valin oder Leucin an Position P1 und Leucin oder Methionin an Position P8 (Kloetzel,
2001).
MHC I Moleküle bilden die Liganden für verschiedene Rezeptoren, die von Zellen der angeborenen und der adaptiven Immunantwort exprimiert werden. Die Interaktion zwischen antigenpräsentierenden Zellen und CTLs (zytotoxische T Lymphozyten) erfolgt über den αβ-TCR (αβ
T Zellrezeptor). Für diese Interaktion ist das Repertoire der generierten MHC I Liganden von
großer Bedeutung, da der TCR antigenspezifisch mit dem beladenen MHC I Komplex interagiert. Der TCR wird zur Immunglobulin-Superfamilie gezählt, und durch somatische Rekombination der Gene wird eine hohe Variabilität der Interaktionsdomäne mit den Liganden er-
15
Einleitung
________________________________________________________________________
zielt. Damit entspricht er in seiner Diversität der polymorphen Peptidbindungstasche des MHC
I Moleküls und dem breiten Repertoire der präsentierten Antigene.
Naive T Zellen werden aktiviert, indem sie mit einem für sie spezifischen Antigen in Kontakt
kommen und gleichzeitig kostimulatorische Signale erhalten. Dieses priming erfordert die Aufnahme von Fremdantigenen durch APC (professionelle antigenpräsentierende Zellen) am Ort
der Infektion, die den T Zellen dann in den sekundären Lymphorganen präsentiert werden
(Banchereau und Steinman, 1998). Die Zeitspanne zwischen einer Infektion mit Listeria monocytogenes und dem Auftreten der CTLs beträgt etwa sieben Tage (Porter und Harty, 2006), weshalb
CD8+ Zellen verglichen mit NK Zellen erst später in der Immunantwort wirken können.
NK Zellen exprimieren KIR Rezeptoren (Killer cell immunoglobulin-like receptors), die restriktiv mit
spezifischen klassischen MHC I Molekülen interagieren (Moretta et al., 1999). Einige inhibitorische LIR Rezeptoren (leukocyte immunoglobulin-like receptors) erkennen ein breiteres Spektrum an
HLA-A, -B, -C, oder -G Molekülen (Fanger et al., 1999). Ein Ausbleiben der Interaktion zwischen solchen inhibitorischen Rezeptoren und MHC I Molekülen der Zielzellen kann zu einer
Aktivierung zytotoxischer Effektorfunktionen der NK Zelle führen (Bottino et al., 2004). Diese
Wahrnehmung des missing-self stellt eine Anpassung an Infektionen oder eine Transformation
von Zellen dar, da transformierte oder virusinfizierte Zellen sich häufig durch eine supprimierte
MHC I Antigenpräsentation auszeichnen (Seliger et al., 2006). Eine geringe Dichte oder die
Abwesenheit von MHC I Molekülen stellt daher ein wichtiges Signal für die Erkennung infizierter und tumorigener Zellen dar.
Die mit MHC I Molekülen interagierenden NK- und T Zellen induzieren durch die Sezernierung von IFNγ transient die Präsentation ihrer Interaktionspartner auf der Oberfläche der umliegenden Zellen, was einerseits den Schutz nicht infizierter Zellen vor zytotoxischen Effektorfunktionen und andererseits die Präsentation von Fremdantigenen verbessert. Eine optimale
Anpassung des Proteasomsystems an eine verstärkte MHC Klasse I Präsentation würde daher
sowohl in einer quantitativen Verstärkung der proteolytischen Aktivität zum Schutz vor NK
Zellen liegen als auch in einer möglichst hohen funktionellen Plastizität für die Präsentation
eines breiten Repertoires an Antigenen für die T-Zellstimulierung. In der vorliegenden Arbeit
soll die Generierung eines HLA-A2.1 restringierten HCV Core Epitops untersucht werden,
gegen das Patienten im Rahmen einer HCV Infektion CTLs entwickeln (Cerny et al., 1995;
Gruner et al., 2000). Da eine Infektion mit dem Hepatitis C Virus häufig symptomlos verläuft
und nur von einer geringen Inflammation begleitet wird, ist es für den infizierten Organismus
von großer Bedeutung, wie die Generierung der CTL Epitope durch das Proteasom realisiert
wird, und ob sie durch bestimmte Strukturvarianten des Proteasoms erfolgt bzw. präferiert
wird.
16
Einleitung
________________________________________________________________________
1.4
Zielstellung
Die proteolytische Aktivität des Proteasomsystems trägt zu einer effektiven zellulären Immunantwort bei. Dabei spielt sowohl die Quantität als auch die Diversität der generierten MHC I
Liganden eine Rolle. Zellen, die mit diesen Liganden interagieren, induzieren über das
proinflammatorische Zytokin IFNγ die Immunountereinheiten des Proteasoms und den Proteasomen-Aktivator PA28. In der vorliegenden Arbeit soll untersucht werden, ob die Adaption
des UPS an ein proinflammatorisches Signal mit einer erhöhten strukturellen Heterogenität des
Proteasoms verbunden ist, und welche Folgen dies für die Antigenprozessierung hat. Dabei
sollen strukturelle Varianten des 20S Proteasoms und deren Interaktion mit Regulatoren untersucht werden. Am Beispiel eines HCV Core Epitops soll die biologische Funktion dieser Komplexe analysiert werden. Folgende Schwerpunkte sollen untersucht werden:
•
Die Struktur der 20S Proteasomen in kultivierten Zellen soll im Verlauf einer IFNγ Stimulation bestimmt werden. Dafür werden 20S Proteasomen chromatographisch getrennt und
die Inkorporation der katalytischen Untereinheiten analysiert.
•
Im Verlauf der IFNγ Stimulation soll die Interaktion von 20S Proteasomen mit den Regulatoren PA28 und dem 19S Komplex untersucht werden. Ferner soll analysiert werden, wie
sich die proteolytische Aktivität des Proteasoms während der Adaption an den proinflammatorischen Status verändert.
•
Anhand der in vitro Generierung des HLA-A2.1 restringierten HCV Core Epitops
ADLMGYIPLV soll untersucht werden, inwieweit die funktionellen Eigenschaften der 20S
Proteasomen und des Proteasomen-Aktivators zu einer Immunität gegen das Hepatitis C
Virus beitragen können.
17
Material und Methoden
________________________________________________________________________
2
Material und Methoden
2.1
Material
2.1.1
Geräte
Äkta-FPLC
Amicon
Gradientenmischer
HPLC HP1100
Massenspektrometer LCQ Classic
MiniQ 4.6/50
MonoQ 5/50 GL
Multi-Detection Microplate Reader
Odyssey® Infrared Imaging System
Phenyl SepharoseTM High Performance
Photometer
Phosphoimager FLA-3000
Rotor JA 25.50
Rotor SW40
µRPC C2/C18 SC 2.1/10
Ultrazentrifuge OptimaTM-L
Zentrifuge Avanti J-E
2.1.2
Software
ImageJ 1.36b
LCQuan
Unicorn 3.20
Xcalibur
18
GE Healthcare
Millipore
Syscomp
Hewlett Packard
Thermo Finnegan
GE Healthcare
GE Healthcare
BioTek
Li-cor
GE Healthcare
GE Healthcare
Fujifilm
Beckman Coulter
Beckman Coulter
GE Healthcare
Beckman Coulter
Beckman Coulter
NIH
Thermo Finnegan
GE Healthcare
Thermo Finnegan
Material und Methoden
________________________________________________________________________
2.1.3
Verbrauchsmaterial, Kits, Enzyme und Chemikalien
ATP
Basal Iscove Medium
BCATM Protein Assay
Bradford Protein Assay Dye
Centricon® Plus 20
Complete®
DEAE
Fötales Kälberserum (FCS)
Gradientengele 3 – 12%
HCV Core Peptid122 – 165
IFNγ, human, rekombinant E. coli
IFNγ, murin, rekombinant E. coli
L-Glutamin
Microcon 50
Penicillin, Streptomycin
Proteasome-GloTM Cell Based Assay
Protein G Sepharose
Protein A Sepharose
Proteinstandard für Native PAGE
Proteinstandard für SDS PAGE
PVDF Membran
Suc-LLVY-AMC
Vivaspin
Roche
Biochrom
Pierce
Bio-Rad
Millipore
Roche
GE Healthcare
Biochrom
Invitrogen
Dr. Peter Henklein, Institut für Biochemie
Roche
Roche
PAA
Millipore
PAA
Promega
GE Healthcare
GE Healthcare
GE Healthcare
Fermentas
Millipore
Bachem
Sartorius
19
Material und Methoden
________________________________________________________________________
2.2
Methoden
2.2.1
Zellkultur
2.2.1.1
Zelllinien
Tabelle 1: Verwendete Zelllinien
Zelllinie
Abstammung
HeLa
Human
humanes Zervixkarzinom
ATCC CCL-2
C4
Balb/c
murine embryonale Fibroblasten
Prof. Dr. Koszinowski
MEC
PA28α/β-/-
C57Bl/6
murine embryonale Zelllinie aus C57Bl/6defizient für PA28 α und β
(Murata et al., 2001)
MEC29
C57Bl/6
murine embryonale Zelllinie aus C57Bl/6defizient für p53
(van Hall et al., 2000)
2.2.1.2
Kultur adhärenter Zellen
PBS: 0,137M NaCl, 2,7mM KCl, 6,5mM Na2HPO4, 1,5mM KH2PO4 pH7.2
Ca/MgCl2-freies Medium: 140mM NaCl, 2,7mM KCl, 8mM NaH2PO4•12H2O, 1,5mM
KH2PO4, 80 μM EDTA, 0,5% Phenolrot, sterilfiltriert
In der vorliegenden Arbeit wurden die in Tabelle 1 aufgelisteten Zelllinien verwendet. Die Kultivierung erfolgte in Basal Iscove Medium mit 10% FCS, 2mM L-Glutamin und 100 U/ml Penicillin sowie 100 µg/ml Streptomycin bei 37°C und 5% CO2. Zellen wurden bis zu einer Konfluenz von 90 – 95% in sterilen Kulturschalen kultiviert und alle zwei bis drei Tage passagiert.
Hierfür wurden die Zellen mit sterilem PBS gewaschen und für 5min mit Ca/MgCl2-freiem
Medium inkubiert. Die Zellen wurden von der Schale gespült und in geeigneter Dichte ausgesät.
2.2.1.3
Zytokinstimulation
Für die Stimulation von humanen oder murinen Zellen mit IFNγ wurden Zytokine der Firma
Roche verwendet. 200U/ml (human) oder 40U/ml (murin) IFNγ wurden für die angegebenen
Zeiträume dem Medium zugesetzt.
20
Material und Methoden
________________________________________________________________________
2.2.2
2.2.2.1
Proteinbiochemie
Zelllyse
TSDG-Lysepuffer: 10% Glycerol, 10mM Tris/HCl pH7.0, 25mM KCl, 10mM NaCl, 1,1mM
MgCl2, 1mM DTT
Zellen wurden mit Ca/MgCl2-freiem Medium von der Kulturschale gelöst und bei 200 x g und
4°C für 5min zentrifugiert. Das Pellet wurde mit PBS gewaschen, nochmals zentrifugiert und
bei -80°C bis zur weiteren Verwendung gelagert. Zur Lyse wurden die Zellen mit dem fünf- bis
zehnfachen Volumen Lysepuffer resuspendiert, dreimal in Flüssigstickstoff gefroren und bei
25°C wieder aufgetaut. Das Lysat wurde für 15min bei 13000xg und 4°C 15min zentrifugiert
und der Überstand im weiteren Verlauf als Gesamtzelllysat verwendet.
2.2.2.2
Bestimmung der Proteinkonzentration
Zur quantitativen Bestimmung der Proteinkonzentration wurde das BCATM Protein Assay Kit
oder Bradfordreagenz gemäß der Anleitung des Herstellers verwendet. Die Proben wurden in
zwei verschiedenen Konzentrationen in Doppelwerten vermessen und die Proteingesamtkonzentration anhand einer BSA Standardreihe errechnet.
2.2.2.3
SDS Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)
Trenngelpuffer: 1,5M Tris/HCl pH8.8, 0,2% SDS (w/v)
Sammelgelpuffer: 0,5M Tris/HCl pH6.8, 0,2% SDS (w/v)
5x SDS Probenpuffer: 0,5M Tris/HCl pH6.8, 20% Glycerol (v/v), 8% SDS (w/v), 8% βMercaptoethanol (v/v), 0,1mg/ml Bromphenolblau
Laufpuffer: 2,5mM Tris/HCl, 19,2mM Glycin, 0,1% SDS (w/v)
Zum Gießen von 5 Gelen im Hoefer Sammelgießstand wurden folgende Gellösungen verwendet:
15% Trenngel: 16,25ml 30%ige Acrylamidlösung, 8,2ml Trenngelpuffer, 8ml H2O dd., 100 µl
APS (10% Lsg.), 30 µl TEMED
Sammelgel: 3ml 30%ige Acrylamidlösung, 5ml Sammelgelpuffer, 7ml H2O dd., 50 µl APS (10%
Lsg.), 20 µl TEMED
Proteine wurden in Abhängigkeit von der Größe unter denaturierenden Bedingungen in SDS
Polyacrylamid-Gelen im diskontinuierlichen Puffersystem getrennt. Die Proben wurden mit
1/5 Volumen Probenpuffer versetzt und 5min bei 95°C denaturiert. Die Elektrophorese wurde
bei 1,5V/cm2 gestartet und nach Eintritt der Proben in das Trenngel bei 2V/cm2 weitergeführt.
Die Proteingrößen wurden anhand eines mitgeführten Größenstandard bestimmt.
21
Material und Methoden
________________________________________________________________________
2.2.2.4
2D Gelelektrophorese
Ampholinemix: 37,5% (v/v) PharmalyteTM 4-6,5; 25% (v/v) PharmalyteTM 5-8; 12,5% (v/v)
AmpholineTM 7-9; 12,5% (v/v) AmpholineTM 3,5-10; 12,5% (v/v) Servalyte® 2-11
2D-Probenpuffer: 9M Harnstoff; 5% (v/v) Ampholinemix; 2% (w/v) NP40; 0,3% (w/v) SDS,
70mM DTT
Überschichtungspuffer: 2D-Probenpuffer 1:2 verdünnt
Acrylamid-Stammlösung: 28,4% (w/v) Acrylamid; 1,6% (w/v) Bisacrylamid
1.Dimensions-Gel: 9M Harnstoff; 5% (v/v) Ampholinemix; 2% (w/v) NP40; 13,2% (v/v) Acrylamid-Stammlösung; filtriert, entgast
Anodenpuffer: 0,01M H3PO4
Kathodenpuffer: 0,02M NaOH
Äquilibrierungspuffer: 62mM Tris/HCl pH6.8; 10% (w/v) Glycerol; 2,3% (w/v) SDS; 70mM
DTT
2.Dimension-Gel: 15% SDS Gel
Die Gele der ersten Dimension wurden in Glasröhrchen blasenfrei gegossen, die Geloberfläche
wurde mit Überschichtungspuffer abgeschlossen und die Polymerisierung erfolgte bei Raumtemperatur für mindestens 3 h. 20 – 50µg gereinigte 20S Proteasomen wurden mit dem 2 ½
fachen Volumen Ethanol bei –80°C für 2h gefällt und für 30min bei 13000xg und 4°C zentrifugiert. In Probenpuffer wurde das 20S Proteasom bei 37°C über Nacht wieder gelöst und anschließend auf die Anodenseite der ersten Dimension aufgetragen. Die isoelektrische Fokussierung verlief 4h bei 400V und 1h bei 800V. Die Gele wurden mit Druckluft aus den Röhrchen
gepustet und dreimal in 15ml Äquilibrierungspuffer geschwenkt. Die Gele der ersten Dimension wurden luftblasenfrei auf die SDS Gele (zweite Dimension) gelegt und die SDS Gelelektrophorese erfolgte wie unter 2.2.2.3 beschrieben. Die hochauflösende Mini-2D Gelelektrophorese mit 10 µg 20S Proteasom wurde im Max Planck Institut für Infektionsbiologie
von Dr. Ursula Zimney-Arndt durchgeführt.
2.2.2.5
Native Gelelektrophorese
5x Probenpuffer: 50% Glycerol (v/v), 0,1mg/ml Xylencyanol
Zur Trennung nativer Proteinkomplexe nach Größe und Ladung wurden die Proben mit NativProbenpuffer versetzt und in 3,5 – 5%igen selbstgegossenen Gelen oder 3 – 12%igen kommerziellen Gelen (Invitrogen) getrennt. Zur Größenorientierung wurden ein Nativ-Proteinstandard
und isolierte 20S Proteasomen mitgeführt.
2.2.2.5.1 Gradientengele (3,5 – 5%)
5x Tris-Boratpuffer: 0,45M Tris Base pH8.4, 0,45M Borsäure, 10mM MgCl2
ATP-Lösung: 200mM ATP, 20mM Tris/HCl pH7.4, 20mM MgCl2
22
Material und Methoden
________________________________________________________________________
Tabelle 2: Gellösungen für 3,5 – 5%ige native Gradientengele
3,5% Gellösung
5% Gellösung
5,17ml
-
H2O
Glycerol
2,4ml
2,4ml
1,57ml
5x Tris-Boratpuffer
1,57ml
39,6µl
0,92ml
ATP-Lösung
Acrylamid 30%
39,6µl
1,3ml
39,6µl
APS (10% Lsg.)
39,6µl
3,9µl
TEMED
3,9µl
Die Gellösungen wurden in linearen Gradienten mit Polyacrylamid-Konzentrationen von 3,5
bis 5% gegossen. Die Elektrophorese erfolgte in Tris-Boratpuffer mit 2mM ATP über Nacht
bei maximal 50V für 960Vh bei 4°C.
2.2.2.5.2 Gradientengele (3 – 12%), Invitrogen
Tris/Glycin-Laufpuffer: 2,5mM Tris, 19,2mM Glycin
Bei der Verwendung von gekauften Gelen erfolgte die Trennung in Tris/Glycin-Laufpuffer
über Nacht bei maximal 75V für 1300Vh bei 4°C.
2.2.2.6
Proteinfärbung (Coomassiefärbung)
Coomassie Färbelösung: 10% (v/v) Essigsäure, 25% (v/v) Methanol, 0,1% (w/v) Coomassie
brilliant blue R250
Entfärber: 10% (v/v) Essigsäure, 25% (v/v) Methanol
SDS Gele und PVDF Membranen wurden in Färbelösung 30min geschwenkt und anschließend
der Hintergrund wieder entfärbt. PVDF Membranen wurden mit 50% Methanol entfärbt, eingescannt und anschließend mit 100% Methanol vollständig entfärbt.
2.2.2.7
Western Blot
Anodenpuffer 1: 300mM Tris, 20% (v/v) Methanol
Anodenpuffer 2: 25mM Tris, 20% (v/v) Methanol
Kathodenpuffer: 40mM ε-Aminocapronsäure, 20% (v/v) Methanol
PBS-T: PBS, 0,1% Tween 20 (v/v)
Blockierlösung: 10% Roti®Immunoblock in PBS-T
Nach denaturierender oder nativer Elektrophorese wurden die Gele im semi dry Verfahren auf
PVDF Membranen transferiert. Auf zwei in Anodenpuffer 1 und ein in Anodenpuffer 2 getränkte Whatman Papiere wurde die methanolaktivierte PVDF Membran gelegt, darauf das Gel
und über das Gel wurden drei in Kathodenpuffer getränkte Blätter Whatman Papier gelegt. Der
23
Material und Methoden
________________________________________________________________________
Elektrotransfer erfolgte für 1h bei 400mA. Die PVDF Membran wurde mit Coomassie gefärbt
und anschließend wieder entfärbt, freie Bindungsstellen wurden mit Blockierlösung abgesättigt.
2.2.2.8
Immundetektion spezifischer Proteine
ECL-Reagenz: 0,1M Tris/HCl pH8.5, 0,2mM Coumarinsäure, 1,25mM Luminol, 0,1% (v/v)
H2O2
Die blockierten Membranen wurden für den Nachweis spezifischer Proteine mit den in Tabelle
3 aufgelisteten primären Antikörpern (3h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4°C) und
anschließend viermal für 15min in PBS-T gewaschen. Die Markierung des primären Antikörpers erfolgte mit sekundärem Antikörper für 2 h bei RT und viermaligem Waschen für 15min
mit PBS-T (Tab. 4).
Meerrettich-Peroxidase gekoppelte sekundäre Antikörper: Die Membran wurde für 1min in
ECL-Reagenz geschwenkt und die Chemilumineszenz des umgesetzten Substrates auf Röntgenfilmen sichtbar gemacht.
Fluoreszenzfarbstoff gekoppelte Antikörper: Inkubation und Waschschritte erfolgten lichtgeschützt. Die Fluoreszenzfarbstoffe wurden im Phosphoimager (Alexa488) oder Odyssee® Infrared Imaging System (IRDye®680 und 800) angeregt und die emittierten Lichtsignale in Bilddateien dargestellt.
24
Material und Methoden
________________________________________________________________________
2.2.2.9
Tabellen primärer und sekundärer Antikörper
Tabelle 3: Primäre Antikörper für die Western Blot Analyse
Antigen
Spezies
Verd.
α4
Kaninchen polyklonal
1:5000
α6
Kaninchen polyklonal
1:5000
β1 (Delta )/ Kaninchen polyklonal
β1i (LMP2)
1:2000
β2 (Z)
Maus monoklonal
1:500
β2i (Mecl-1)
Kaninchen polyklonal
1:6000
β5 (MB1)
Kaninchen polyklonal
1:5000
β5i (LMP7)
Kaninchen polyklonal
1:15000
PA28α
Kaninchen polyklonal
1:5000
PA28β
Kaninchen polyklonal
1:5000
S1
Maus monoklonal
1:2000
Affinity Biomol
S10a
Maus monoklonal
1:2000
Affinity Biomol
S6a
Maus monoklonal
1:2000
Affinity Biomol
Bezugsquelle
(Hendil et al., 1995)
Tabelle 4: Sekundäre Antikörper für die Western Blot Analyse
gerichtet gegen
Spezies
Verdünnung
Kopplung
Bezugsquelle
Kaninchen
Ziege
1:5000
Peroxidase
Dianova
Maus
Ratte
1:5000
Peroxidase
Dianova
Kaninchen
Ziege
1:1000
Alexa 488
Rockland
Kaninchen
Esel
1:5000
IRDye® 680
Li-cor
Kaninchen
Esel
1:5000
IRDye® 800
Li-cor
Maus
Esel
1:5000
IRDye® 680
Li-cor
2.2.2.10 Densitometrische Messung von Spot- und Bandenintensitäten
Mit Coomassie gefärbte Proteine und Banden der Western Blot Analysen wurden mit dem Programm ImageJ ausgewertet. Hierfür wurden die Pixel der eingescannten Spots oder Banden
gemessen und der Hintergrund subtrahiert. Bei der Messung von Bandenintensitäten in Western Blot Analysen wurden die gemessenen Pixelintensitäten verglichen.
Um Zuwachs und Verhältnis von austauschbaren Untereinheiten des 20S Proteasoms zu
bestimmen, wurden die gemessenen Pixelintensitäten von konstitutiver und Immunountereinheit addiert. Bei der Auswertung von Coomassie gefärbten 2D Spots wurde der Anteil einer
Untereinheit an dieser Summe in Prozent angegeben.
25
Material und Methoden
________________________________________________________________________
Bei der Western Blot Analyse der katalytischen Untereinheiten des 20S Proteasoms wurden die
Pixelintensitäten addiert und der Anteil einer Untereinheit an der Summe als relative Menge
angegeben, da die Affinität von Antikörpern zu ihren Antigenen individuell ist.
2.2.2.11 Glyceroldichtegradienten
Gradientenpuffer: 10mM Tris pH7.0, 25mM KCl, 1,1mM MgCl2, 15 bzw. 45% (w/v) Glycerol
15 bis 45% Glyceroldichtegradienten wurden in Polyallomerröhrchen für den SW40 Rotor unterschichtet und im Gradientenmischer zu einem linearen Gradienten vermischt. Der Gradient
wurde mit 1 bis 4mg zytosolischer Proteine überschichtet und bei 208000xg (ω2t=1.0E12) bei
4°C für 16h zentrifugiert und mit der Pipette zu 360µl fraktioniert.
2.2.2.12 Messung der proteasomalen Enzymaktivität in Glyceroldichtegradienten mit fluorogenem Substrat
Substratpuffer: 30mM Tris pH7.5, 10mM KCl, 5mM MgCl2, 10% Glycerol (v/v), 40µM SucLLVY-AMC
10µl einer Fraktion wurde mit 100µl Substratpuffer für 1h bei 37°C inkubiert und die Fluoreszenz der abgespaltenen fluorogenen Gruppe bei einer Anregungswellenlänge von 360nm und
die Emission bei einer Wellenlänge von 460nm gemessen. Die Leerwerte des Puffers wurden
von den dargestellten Werten subtrahiert.
2.2.2.13 Bestimmung der gesamtproteasomalen Aktivität in Glyceroldichtegradienten
Mittels Western Blot wurden Glyceroldichtegradientenfraktionen auf den Gehalt proteasomaler
Untereinheiten überprüft. Die proteolytische Aktivität der Fraktionen wurde bestimmt
(2.2.2.13) und in der Excel Software in einem standardisierten Diagramm als farbige Fläche
dargestellt. Das Diagramm wurde in eine JPG Bilddatei exportiert. Die Pixelintensitäten der
Fläche des Aktivitätsprofils, welche der proteasomalen Aktivität entsprach, wurde mit der
Software ImageJ bestimmt und als spezifische proteasomale Gesamtaktivität bezogen auf die
Proteinmenge definiert. Die proteasomale Gesamtaktivität ruhender Zellen wurde 100% gesetzt
und mit der IFNγ stimulierter Zellen verglichen.
26
Material und Methoden
________________________________________________________________________
2.2.2.14 Antikörper für die Immunpräzipitation
Tabelle 5: Antikörper für die Immunpräzipitation
Antikörper
Antigen
Spezies
Verdünnung
Bezugsquelle
K08
20S (Maus)
Kaninchen
1:500
Pineda Antikörper Service
Mcp444
20S (human)
Maus
1:500
Hendil et al. 1995
2.2.2.15 Immunpräzipitation von 20S Proteasomen und assoziierten Regulatoren
Saccharosepuffer: 0,25M Saccharose, 0,025mM Hepes pH7.2, 10mM MgCl2, 1mM DTT
1 x 107 Zellen wurden mit TSDG-Lysepuffer lysiert (2.2.2.1) und die Proteinkonzentration mit
dem BCATM Protein Assay Kit bestimmt. Für vergleichende Analysen wurden gleiche Proteinmengen eingesetzt. Bei Immunpräzipitationen aus Gradientenfraktionen wurden gleiche Volumina eingesetzt. Die Probe wurde mit 1mg/ml BSA und 2µl K08 oder mcp444 über Nacht bei
4°C rotierend inkubiert, anschließend mit 20µl ProteinA Sepharose (K08) oder ProteinA/G
Sepharose (mcp444) versetzt und für weitere 2h bei 4°C rotierend inkubiert. Die beads wurden
viermal mit Saccharosepuffer gewaschen und abschließend in 30µl 2x SDS-Probenpuffer aufgenommen. Die Proben wurden für 5min bei 95°C denaturiert und in SDS Gelen getrennt.
2.2.2.16 Verwendung von Mg-ATP in Immunpräzipitation und Glyceroldichtegradienten
10x ATP Stammlösung: 20mM ATP, 20mM Tris pH 7.0, 20mM MgCl
Um PA28 in vitro vom 20S Proteasom zu dissoziieren, wurde Mg-ATP zu Lysaten (2.2.2.1), in
Immunpräzipitationen (2.2.2.15) oder in Puffern für Glyceroldichtegradienten (2.2.2.11) in einer Konzentration von 2mM zugesetzt und das Experiment wie in den jeweiligen Abschnitten
beschrieben durchgeführt.
2.2.2.17 Präparation von 20S Proteasomen
10x TEAD: 200mM Tris/HCl pH7.5, 1mM EDTA, 10mM Na-Azid, 10mM DTT
Lysepuffer: 1x TEAD, 50mM NaCl
TEAD 50: 1x TEAD, 50mM NaCl
TEAD 100: 1x TEAD, 100mM NaCl
TEAD 350: 1x TEAD, 350mM NaCl
TEAD 1000: 1x TEAD, 1000mM NaCl
Lösungen für den Saccharosegradienten: 1x TEAD, 10 bzw. 40% Saccharose (w/v)
Substratpuffer: TEAD 100, 20µM Suc-LLVY-AMC oder Z-GGL-AMC
Zellen wurden wie unter 2.2.1.2 beschrieben kultiviert. 1-2 x109 Zellen wurden in PBS gewaschen und zentrifugiert, die Pellets bis zur Präparation bei –80°C gelagert. Die Zellpellets wurden auf Eis aufgetaut und in 5-10 Volumen Lysepuffer resuspendiert. Mittels Douncer wurden
27
Material und Methoden
________________________________________________________________________
die Zellen mechanisch aufgeschlossen. Das Homogenat wurde bei 45000xg bei 4°C für 20min
zentrifugiert und das Pellet verworfen. Um 20S Proteasomen enthaltende Proben zu identifizieren wurden in den verschiedenen Anreicherungsschritten 10µl der zu testenden Proben mit
100µl Substratpuffer für 30min bei 37°C inkubiert und anschließend die Fluoreszenz des abgespaltenen Fluorophors bei einer Anregung von 360nm und einer Emission von 460nm gemessen. Das Lysat wurde mit DEAE Sephacel bei 4°C für 1h rotierend inkubiert und in eine
Säule überführt. Das Säulenbett wurde mit >100ml TEAD 50 gewaschen bis das Eluat eine
Absorption bei 280nm < 0,08 aufwies. Gebundene Proteine wurden mit 30ml TEAD 350 in
1,5ml Fraktionen eluiert und die proteolytisch aktiven Fraktionen gepoolt. Zum DEAE Eluat
wurde auf Eis unter Rühren zunächst (NH4)2SO4 bis zu einer 35%igen Sättigung gegeben und
das Präzipitat bei 19000xg bei 4°C für 10min zentrifugiert. Anschließend wurde die (NH4)2SO4
Konzentration auf 75% Sättigung erhöht und bei 25000xg bei 4°C für 20min zentrifugiert. Das
Pellet der zweiten Fällung wurde mit 0,5 bis 1ml TEAD 50 gelöst. Lineare Gradienten (10 –
40% Saccharose (w/v)) wurden gegossen und die gelösten Präzipitate bei 208000xg
(ω2t=1.0E12) bei 4°C für 16h zentrifugiert. Anschließend wurden die Gradienten zu 0,6ml fraktioniert und auf proteasomale Aktivität überprüft. Aktive Fraktionen wurden gepoolt, mit
TEAD 100 (Puffer A) auf das vierfache Volumen verdünnt und an der ÄKTA-FPLC bei einem
Fluss von 1ml/min auf eine MonoQ 5/50 GL Säule mit einem Säulenbettvolumen von 0,98ml
aufgetragen. Es wurde mit einem 3-Segment-Salzgradienten eluiert. Segment 1: 0 – 20% TEAD
1000 (Puffer B) in 3 SV; Segment 2: 20 – 35% TEAD 1000 in 20 SV; Segment 3: 35 – 100%
TEAD 1000 in 3 SV. Proteolytisch aktive Fraktionen wurden in TEAD 100 umgepuffert und
mit Centricon® Plus 20 Filtereinheiten konzentriert. Die Proteinkonzentrationsbestimmung
erfolgte geräteintern über die Messung der Absorption bei λ=280nm und dem Bradfordassay.
2.2.2.18 Präparation der Proteasomenfraktionen
20S Proteasomen wurden nach der Isolation (2.2.2.15) einer weiteren Anionenaustauschchromatographie unterzogen. Die 20S Proteasomenpopulation wurde in der ÄKTA-FPLC mit einem Fluss von 0,2ml/min auf eine MiniQ 4.6/5 Säule mit einem Säulenbettvolumen von
0,98ml aufgetragen und mit einem 3-Segment-Salzgradienten in Fraktionen zu 0,2ml eluiert.
Segment
1:
0
–
24%
TEAD
1000
in
1,5
SV;
Segment
2:
24 – 29% TEAD 1000 in 20 SV; Segment 3: 29 – 100% TEAD 1000 in 3 SV. Die Fraktionen
wurden hinsichtlich der proteolytischen Aktivität überprüft und unter Berücksichtigung von
Aktivität und Absorption bei 280nm in 4 Pools unterteilt. Jede Proteasomenfraktion wurde
nach demselben Protokoll rechromatographiert, um potentiell vorliegende proteasomale Subtypengemische voneinander zu trennen. Anhand der Absorption bei λ=280nm wurden nochmals
Fraktionen gepoolt. Alle Proben wurden zunächst in Vivaspin 100, anschließend in Microcon
50 Filtereinheiten konzentriert und in TEAD 100 umgepuffert, die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte über die Bestimmung der Absorption bei λ=280nm.
28
Material und Methoden
________________________________________________________________________
2.2.2.19 Präparation des Proteasomen-Aktivators PA28
Lysepuffer: 1x TEAD, 0,25M Saccharose, 0,1% NP40, 10% Glycerol (w/v), Complete®
Gradientenpuffer: 1x TEAD, 15 bzw. 45% Glycerol,
TEAD 100: 1x TEAD, 100mM NaCl, 10% Glycerol (w/v)
TEAD 250: 1x TEAD, 250mM NaCl, 10% Glycerol (w/v)
TEAD 500: 1x TEAD, 500mM NaCl, 10% Glycerol (w/v)
TEAD-AS: 1x TEAD, 1M (NH4)2SO4
Substratpuffer: TEAD 100, 50µM Suc-LLVY-AMC, 20S Proteasom (1000ng/ml)
Die Präparation erfolgte aus 2 x 109 MEC29 Zellen. Zellaufschluss und DEAE Batch wurden
wie für 20S Proteasomen unter (2.2.2.15) beschrieben durchgeführt. Das DEAE Batch wurde
mit TEAD gewaschen, die Elution erfolgte mit TEAD 500 (1,5ml Fraktionen, 30ml). Über die
Aktivierung von isoliertem 20S Proteasom wurde PA28 in den verschiedenen Anreicherungsschritten nachgewiesen. 10µl der zu testenden Proben wurden mit 100µl Substratpuffer in Gegenwart und Abwesenheit von 20S Proteasomen für 30min bei 37°C inkubiert und der Aktivierungsgrad gemessen. Aktivierende Fraktionen wurden gepoolt und das Volumen in der Amicon
eingeengt. Die Probe wurde auf 15 - 45%ige Glyceroldichtegradienten aufgetragen und bei
208000xg bei 4°C für 16h zentrifugiert. Der Gradient wurde fraktioniert, aktivierende Fraktionen gepoolt und auf eine MonoQ Säule aufgetragen (Fluss 1ml/min). Die Elution erfolgte mit
einem 3-Segment-Salzgradienten (Basis: TEAD 50; Elutionspuffer: TEAD 250). Segment 1: 0 –
20% TEAD 250 in 3 SV, Segment 2: 20 – 40% TEAD 250 in 20 SV; Segment 3: 40 – 100%
TEAD 250 in 6 SV. Es wurden aktivierende Fraktionen gepoolt, auf 1M (NH4)2SO4 gebracht
und abschließend über eine Phenyl SepharoseTM High Performance Säule in der ÄKTA-FPLC
über einen linearen Gradienten getrennt. 0 – 100% TEAD in 25 SV (Basis: TEAD-AS;
Elutionspuffer: TEAD).
2.2.2.20 In vitro Rekonstitution von 20S-PA28 Komplexen
Zur Rekonstitution von 20S-PA28 Komplexen wurden Zelllysate der PA28-defizienten Zelllinien MEC PA28-/- mit PA28 aus Erythrozyten inkubiert. Dafür wurden 40 µl einer PA28 enthaltenden Glyceroldichtegradientenfraktion (2.2.2.17) für 15min bei Raumtemperatur zu 2mg
Gesamtzelllysat der MEC PA28-/- Zellen in TSDG Puffer gegeben und anschließend in der
nativen Gelelektrophorese oder in Glyceroldichtegradienten weiter analysiert.
2.2.2.21 Proteolytische Prozessierung des synthetischen HCV Core122 - 165 Peptids in vitro
Peptidlösung: 3mg/ml HCV Core122 – 165 in 20% DMF
10x Hepespuffer: 200mM Hepes pH7.8, 20mM DTE
Die Prozessierungseigenschaften unterschiedlicher 20S Proteasomen und der Einfluss durch
PA28 wurden anhand der in vitro Prozessierung eines synthetischen Peptids untersucht. Das
Peptid umfasst die Polypeptidsequenz der Aminosäuren 122 – 165 des HCV Core Proteins.
0,132µg/µl Peptid und 0,014µg/µl gereinigtes 20S Proteasom wurden mit oder ohne gereinigtes
29
Material und Methoden
________________________________________________________________________
PA28 in 30 µl 1x Hepespuffer bei 37°C für 0, 1, 2, 4, 6 oder 8h inkubiert und mit TFA (0,5%
Endkonz.) abgestoppt.
2.2.2.22 Bestimmung des Aktivierungspotentials und der Reinheit von PA28
Peptidlösung: 3mg/ml HCV Core122 – 165 in 20% DMF
Substratpuffer: TEAD 100, 50µM Suc-LLVY-AMC, 20S Proteasom (1µg/ml)
10x Hepespuffer: 200mM Hepes pH7.8, 20mM DTE
Um gereinigtes PA28 zur in vitro Prozessierung von synthetischen Peptiden einzusetzen wurden
Reinheit und das 20S Proteasom aktivierende Potential bestimmt. Es wurden 1, 2, 4 und 8µl
einer PA28 enthaltenden Fraktion mit 100µl Substratpuffer und 100ng 20S Proteasom für
30min bei 37°C inkubiert und der Substratumsatz anhand der Fluoreszenz der abgespaltenen
AMC Gruppe bestimmt. Das geringste Volumen einer PA28 Fraktion, das zu einer maximalen
Aktivierung von 100ng 20S Proteasomen führte, wurde für 100 µl in vitro Prozessierungsansatz
mit dem HCV Core122-165 Peptid eingesetzt. Die Reinheit der PA28 Präparation wurde bestimmt, indem 5µl der zu testenden Probe mit 0,132µg/µl synthetischem Peptid in 1x Hepespuffer bei 37°C für 4h inkubiert und wie unter (2.2.2.22) beschrieben analysiert wurde. Bei
der Verwendung von isoliertem PA28 zur in vitro Prozessierung von synthetischen Peptiden
durfte kein Abbau des Substrates erfolgen.
2.2.2.23 Massenspektrometrische Analyse der Prozessierungsprodukte
Laufmittel A: HPLC-H2O; 0,05% TFA
Laufmittel B: 70% Acetonitril; 0,045% TFA
Peptidstandard: 3,1% Peptidstandard-Stammlösung in Laufmittel A
Peptidstandard-Stammlösung: 50% Methanol; 1% Essigsäure; 10µg/ml 9GPS
30µl des in vitro Prozessierungsansatzes wurden mit 20µl des internen Peptidstandards 9GPS
(YPHFMPTNLGPS) versetzt. und im HPLC-System HP1100 über die µRPC C2/C18 Säule
getrennt. Die Bedienung erfolgte über die Software Xcalibur. Eluierte Fragmente wurden online im LCQ Classic (Elektrospray-Ionisierung) gemessen. Die Trennung erfolgte in einem 25 –
95%igen Gradienten bei einer Flussrate von 0,4ml/min. Das Eluat wurde online im Positivmodus in der ESI analysiert, ein scan umfasste das m/z von 200 – 2000 in 1,8sec. Die Mengen an
generiertem Fragment wurden als gemessene Intensitäten dargestellt. Die Quantifizierung des
Standards GPS ermöglichte eine Normierung der Intensitäten eines Fragmentes und den Vergleich von Fragmentmengen, die in unterschiedlichen Ansätzen gemessen wurden.
30
Ergebnisse
________________________________________________________________________
3
Ergebnisse
3.1
Einfluss von IFNΓ auf Interaktionen zwischen dem Proteasom
und seinen Regulatoren
Das proinflammatorische Zytokin IFNγ gehört zu den Faktoren, die in höheren Vertebraten
den Übergang zwischen der angeborenen und der adaptiven Immunantwort vermitteln. Während dieses Prozesses wird die Antigenpräsentation über MHC Klasse I Moleküle wesentlich
verstärkt, da die Expression vieler daran beteiligter Faktoren durch IFNγ reguliert wird. Das
UPS generiert einen Großteil der MHC Klasse I restringierten Epitope. Es unterliegt einer
Modulation durch proinflammatorische Zytokine, welche die Inkorporation von Immunountereinheiten in de novo assemblierende Proteasomen und die Formierung des ProteasomenAktivators PA28 induzieren. Diese strukturellen Veränderungen wirken sich auf die funktionellen Eigenschaften des Proteasoms aus (Schwarz et al., 2000; Sijts et al., 2000; van Hall et
al., 2000). In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, welche Veränderungen des
UPS während des Übergangs vom nicht induzierten zum inflammatorischen Status realisiert
werden. Da sich die Assoziation des Aktivators mit dem Proteasom sowohl auf dessen Substratumsatz als auch auf die Schnittpräferenz auswirkt (Stohwasser et al., 2000; TextorisTaube et al., 2007), sollte der Einfluss von IFNγ auf die Interaktion zwischen dem 20S Proteasom und PA28 strukturell und funktionell näher untersucht werden.
3.1.1
Einfluss von IFNγ auf die Aktivität des Proteasoms
In einem einführenden Experiment wurden die Auswirkungen des proinflammatorischen
Zytokins IFNγ auf die proteolytische Aktivität des UPS im Verlauf einer IFNγ Stimulation
untersucht. Da bekannt ist, dass nach 24stündiger IFNγ Stimulation die Formierung von
Immunoproteasomen erfolgt ist (Heink et al., 2005), wurden HeLa Zellen für 24h mit IFNγ
(200U/ml) stimuliert und zu verschiedenen Zeitpunkten (0, 4, 8, 12 und 24h) in drei
Frier/Tau Zyklen lysiert und zentrifugiert. 2mg Protein der zytosolischen Überstände wurden
in 15-45%igen Glyceroldichtegradienten bei 208000xg ultrazentrifugiert. Die proteolytische
Aktivität der Fraktionen wurde mit dem Substrat Suc-LLVY-AMC bestimmt. Ein Umsatz des
verwendeten Substrates konnte in den Fraktionen 13 bzw. 14 bis 24 der Glyceroldichtegradienten gemessen werden. Die Stimulation mit IFNγ hatte innerhalb der ersten acht Stunden
nur eine geringe Auswirkung auf die proteolytische Aktivität. Nach 12 und 24h war jedoch
eine deutliche Aktivitätssteigerung im gesamten Bereich der aktiven Fraktionen zu verzeichnen. Die höchste, eine dreifache (12h) bzw. fünffache (24h) Zunahme der Aktivität, war besonders in den Fraktionen 14 und 15 zu beobachten (Abb. 7).
31
Ergebnisse
________________________________________________________________________
Abb. 7: Bestimmung der proteolytischen Aktivität in Glyceroldichtegradientenfraktionen
von Zelllysaten IFNγ stimulierter HeLa Zellen
2mg Protein der zytosolischen Überstände IFNγ stimulierter HeLa Zellen wurden in 15 – 45% Glyceroldichtegradienten
ultrazentrifugiert und fraktioniert. Der Umsatz des fluorogenen Substrats Suc-LLVY-AMC (40µM) durch 10µl jeder
Fraktion wurde anhand der Fluoreszenz der abgespaltenen AMC-Gruppe gemessen (… unstimuliert ‘ 4h ¡ 8h U 12h
S 24h IFNγ).
Das 20S Proteasom aus den Fraktionen der Glyceroldichtegradienten wurde mittels Western
Blot nachgewiesen. Die Verwendung eines Antikörpers, der sowohl die konstitutive Untereinheit β1 als auch die homologe Immunountereinheit iβ1 detektiert, erlaubte es zusätzlich,
die Inkorporation der Immunountereinheit in maturierte 20S Proteasomen zu überprüfen. In
Korrelation zur proteolytischen Aktivität in den Gradientenfraktionen wurden die maturierten Untereinheiten β1 und iβ1 in den Fraktionen 14 bis 24 jedes Gradienten detektiert und
zeigte somit in den proteolytisch aktiven Fraktionen das Vorhandensein aktiver 20S Proteasomen an (Abb. 8).
32
Ergebnisse
________________________________________________________________________
Abb. 8: Dichtegradientenzentrifugation der Lysate IFNγ stimulierter HeLa Zellen und
Nachweis des 20S Proteasoms
2mg Protein der zytosolischen Überstände IFNγ stimulierter HeLa Zellen wurde in 15-45%igen Glyceroldichtegradienten ultrazentrifugiert und 10 µl jeder Fraktion für die Western Blot Analyse in der SDS PAGE getrennt. Der Nachweis
des 20S Proteasoms erfolgte über die Untereinheiten iβ1 und β1 mit einem für beide Untereinheiten spezifischen Antikörper. Die proteolytisch aktiven Fraktionen sind rot markiert.
Im Verlauf der IFNγ Stimulation wurde ein fortschreitender Einbau der Immunountereinheit
iβ1 und die Abnahme der korrespondierenden Untereinheit β1 beobachtet. Ähnlich wie iβ1
war auch iβ5 in allen Proteasomen enthaltenden Gradientenfraktionen nach 24stündiger
IFNγ Stimulation nachweisbar. iβ2 konnte dagegen nur in Fraktionen mit hoher Proteasomenkonzentration detektiert werden, was entweder für eine geringere Inkorporation der Immunountereinheit spricht oder auf eine geringere spezifische Affinität des Antikörpers hinweist (nicht gezeigte Daten). Nach 24stündiger IFNγ Stimulation wurden proteasomale
Untereinheiten auch in Fraktionen sehr hoher Dichte detektiert, die ebenfalls proteolytische
Aktivität aufwiesen (Fraktion 28-30). Dies weist auf eine besonders schnelle Migration dieses
Komplexes hin, die durch ein hohes Molekulargewicht und/oder eine ungewöhnliche Form
des Komplexes verursacht werden kann. Möglicherweise interagiert ein Teil der Proteasomen
als Reaktion auf die Stimulation mit IFNγ mit weiteren, bisher nicht identifizierten Proteinen.
Nach achtstündiger IFNγ Stimulation war bereits eine zunehmende Inkorporation der Immunountereinheit iβ1 in das 20S Proteasom nachweisbar. Zu diesem Zeitpunkt wurde jedoch
noch kein Anstieg der proteasomalen Aktivität in Glyceroldichtegradientenfraktionen beobachtet, der Substratumsatz war gegenüber der Ausgangsaktivität sogar leicht verringert. Die
Inkorporation der Immunountereinheit iβ1 konnte folglich nicht direkt mit einem Aktivitätszuwachs gleichgesetzt werden. Das Migrationsverhalten des 20S Proteasoms im Dichtegradienten weist darauf hin, dass es in Komplexen verschiedener Größe und damit wahrscheinlich assoziiert an Regulatoren vorlag, welche ebenfalls Einfluss auf die proteolytische Aktivität
des Proteasoms haben. Da die Immunountereinheit iβ1 in Fraktionen unterschiedlicher Dichte im Gradienten nachgewiesen wurde, ist anzunehmen, dass de novo assemblierte 20S Protea33
Ergebnisse
________________________________________________________________________
somen in gleicher Weise wie bereits vor der Stimulation existierende 20S Proteasomen mit
Regulatoren interagierten und hochmolekulare Komplexe bildeten.
3.1.2
Lokalisation der Regulatoren PA28 und 19S in Glyceroldichtegradienten
Eine Assoziation von PA28 an das 20S Proteasom bewirkt einen höheren Substratumsatz in
vitro (Stohwasser et al., 2000). Um zu untersuchen, ob die höhere proteolytische Aktivität im
Stimulationsverlauf auf eine IFNγ-abhängige Interaktion zwischen PA28 und dem 20S Proteasom zurückzuführen ist, wurde der Proteasomen-Aktivator im Glyceroldichtegradienten
über die Untereinheit PA28α nachgewiesen. Hierfür wurden dieselben Glyceroldichtegradientenfraktionen verwendet wie für die Bestimmung der proteolytischen Aktivität und den
Nachweis der proteasomalen Untereinheiten β1 und iβ1 (Abb. 7 und Abb. 8). Im Verlauf der
Stimulation mit IFNγ konnte beobachtet werden, dass die Menge an PA28α im Gradienten
bereits nach vierstündiger Stimulation zunahm. PA28α wurde ebenso in zunehmendem Maße
in Fraktionen höherer Dichte detektiert und kolokalisierte dabei mit dem Proteasom in proteolytisch aktiven Fraktionen. Sowohl die Expression des Aktivators als auch eine erhöhte
Interaktion zwischen dem Proteasom und PA28 scheint also bereits vier Stunden nach Auslösen der IFNγ Signalkaskade induziert zu werden und erreicht nach 12h ein Maximum. Zwischen der Kolokalisation des Aktivators mit dem Proteasom und der gesteigerten Aktivität
nach 12-24stündiger IFNγ Stimulation bestand eine direkte Korrelation. Während nach 12h
in fast allen Proteasomen enthaltenden Fraktionen eine vergleichbare höhere proteolytische
Aktivität messbar war, war nach 24h ein starkes Aktivierungsgefälle von den Fraktionen geringerer Dichte hin zu den Fraktionen hoher Dichte zu verzeichnen. Dies wurde von den im
Western Blot detektierten Mengen des Proteasomen-Aktivators in denselben Fraktionen reflektiert und führte zu der Annahme, dass eine frühe IFNγ vermittelte Assoziation von PA28
an das Proteasom eine Ursache für die verstärkte proteasomale Aktivität sein könnte (Abb. 9).
34
Ergebnisse
________________________________________________________________________
Abb. 9: Lokalisation von PA28 in Glyceroldichtegradienten IFNγ stimulierter HeLa Zellen
2mg Protein der zytosolischen Überstände IFNγ stimulierter HeLa Zellen wurden in 15-45%igen Glyceroldichtegradienten ultrazentrifugiert und 10 µl jeder Fraktion für die Western Blot Analyse in der SDS PAGE getrennt. Der Nachweis
des Proteasomen-Aktivators erfolgte mit einem gegen die Untereinheit PA28α gerichteten Antikörper (→ = PA28α, ¿
= unspezifische Reaktion). Die proteolytisch aktiven Fraktionen sind rot markiert.
PA28α wurde zu einem großen Anteil im Bereich geringer Dichte im Glyceroldichtegradienten (Fraktionen 6-12) nachgewiesen. Aus dem Migrationsverhalten des Aktivators wurde geschlossen, dass PA28 in diesen Fraktionen als freier Komplex vorlag. Frei verfügbares PA28
verschafft der Zelle die Kapazität, einen erhöhten Bedarf an proteolytischer Aktivität unmittelbar zu kompensieren, indem es durch seine Assoziation an das Proteasom dessen Aktivität
potenziert. Freier PA28 Komplex wurde durch Zugabe von 40ng isolierten 20S Proteasomen
im Messansatz bestimmt. Die Aktivierung des Proteasoms wurde abzüglich der Basisaktivität
des Proteasoms als relative Fluoreszenz dargestellt. Die Zugabe von 10µl der Fraktionen 10
bis 12 jedes Gradienten reichte aus, um den Substratumsatz von 20S Proteasomen zu steigern, was das Vorhandensein voll assemblierter Aktivatorkomplexe bestätigt. Funktionelles,
nicht assoziiertes PA28 war demzufolge bereits in unstimulierten HeLa Zellen vorhanden. Im
Verlauf der IFNγ Stimulation war ein höheres Aktivierungspotential der Fraktionen messbar,
was mit der im Western Blot detektierten höheren PA28 Konzentration übereinstimmte und
auf eine Akkumulation freier Aktivatorkomplexe hinweist (Abb. 10).
35
Ergebnisse
________________________________________________________________________
Abb. 10: Aktivierendes Potential des freien Aktivators PA28
2mg Gesamtprotein IFNγ stimulierter HeLa Zellen wurde in Dichtegradienten getrennt. 10 µl der Fraktionen 1 bis 15
von 34 Fraktionen eines Gradienten wurde mit 40ng gereinigtem 20S Proteasom und dem fluorogenen Substrat SucLLVY-AMC (40 µM) inkubiert. Das aktivierende Potential einer Fraktion ist als Quotient der Aktivität [20S + Fraktion /
20S] dargestellt (□ unstimuliert, ■ 4h ■ 8h ■ 12h ■ 24h IFNγ).
PA28 interagiert ebenso wie der 19S Regulator über den α-Ring mit dem 20S Proteasom.
Unter dem Einfluss von IFNγ ist eine Zunahme der 20S-PA28 Komplexe mit einer Abnahme des 26S Proteasoms verbunden (Bose et al., 2004). Aus diesem Grund sollte überprüft
werden, ob eine IFNγ induzierte Assoziation von PA28 an das 20S Proteasom eine verminderte Interaktion zwischen dem 20S Proteasom und dem 19S Komplex bedingt. Als Referenz
für den 19S Regulator im Dichtegradienten wurde die Untereinheit S1 des Basekomplex ausgewählt. Diese Untereinheit nimmt im 26S Proteasom ebenso wie die ATPasen des Basekomplexes eine Position in direkter räumlicher Nähe zum α-Ring des 20S Proteasoms ein.
Die Konzentration der Untereinheit S1 wurde mittels Western Blot in den Glyceroldichtegradientenfraktionen bestimmt, die bereits zum Nachweis des 20S Proteasoms und des Proteasomen-Aktivators dienten (Abb. 11).
36
Ergebnisse
________________________________________________________________________
Abb. 11: Lokalisation des 19S Komplexes in Glyceroldichtegradienten IFNγ stimulierter
HeLa Zellen
2mg Protein der zytosolischen Überstände IFNγ stimulierter HeLa Zellen wurden in 15-45%igen Glyceroldichtegradienten ultrazentrifugiert und 10 µl jeder Fraktion für die Western Blot Analyse mittels SDS PAGE getrennt. Der Nachweis
des 19S Komplexes erfolgte mit einem gegen die Untereinheit S1 gerichteten Antikörper. Die proteolytisch aktiven Fraktionen sind rot markiert.
Der freie 19S Regulator weist im Dichtegradienten aufgrund seines vergleichbaren Molekulargewichts von 700 kDa ein ähnliches Migrationsverhalten auf wie das 20S Proteasom. Da
sich der Nachweis der Untereinheit S1 des Basekomplexes hauptsächlich auf die proteolytisch
aktiven Fraktionen beschränkte, wurde vermutet, dass die Untereinheit in den 19S Regulator
integriert und als solcher entweder frei oder an das 20S Proteasom assoziiert vorlag. Im Verlauf der Stimulation mit IFNγ war nach 12 und 24h die Untereinheit S1 auch in Fraktionen
sehr hoher Dichte nachweisbar, was zusammen mit dem Nachweis proteasomaler Untereinheiten (vergleiche Abb. 8) auf eine Interaktion des 26S Proteasoms mit weiteren Proteinen
hindeutete. Es ist vorstellbar, dass es sich bei diesen Aggregaten um Proteasomen in Assoziation mit Proteinsubstraten oder Adapterproteinen handelt (Hartmann-Petersen und Gordon,
2004). Dass eine solche Interaktion durch IFNγ induziert wird, deutet auf einen weitreichenden Einfluss des Zytokins hin, der sich nicht auf die zentralen Komplexe des UPS, das Proteasom und die Regulatoren zu beschränken scheint. Vielmehr könnte IFNγ auch den Prozess der Zuführung von Substraten des Proteasoms beeinflussen, was angesichts einer
Regulation von mehr als 400 Genen durch IFNγ unwahrscheinlich ist (Boehm et al., 1997).
Im Verlauf der IFNγ Stimulation konnte eine Verschiebung der S1 enthaltenden Fraktionen
um zwei Fraktionen in den Bereich geringerer Dichte beobachtet werden. Dies könnte ein
Hinweis darauf sein, dass nach IFNγ Stimulation ein höherer Anteil des 19S Regulators nicht
mehr in Assoziation mit dem Proteasom vorliegt. Allein aus der Lokalisation der Untereinheit
S1 im Glyceroldichtegradienten konnte jedoch nicht zwischen freiem und an das Proteasom
gebundenem 19S Regulator differenziert werden.
37
Ergebnisse
________________________________________________________________________
Die Untereinheit des Proteasomen-Aktivators PA28α kolokalisierte im Dichtegradienten mit
proteasomalen Untereinheiten. Aufgrund des Molekulargewichts des Aktivatorkomplexes von
200 kDa wurde angenommen, dass eine Komigration mit dem maturierten 20S Proteasom
(700 kDa) auf einer Interaktion der beiden Komplexe beruhte. Dagegen konnte eine Komigration der Untereinheit S1 nicht zwangsläufig auf eine Interaktion mit dem Proteasom
zurückgeführt werden, da der 19S Komplex ein vergleichbares Molekulargewicht hat wie das
Proteasom (siehe oben). Daher wurde das 20S Proteasom aus Dichtegradientenfraktionen
unterschiedlicher Dichte präzipitiert und im Western Blot überprüft, ob Untereinheiten der
Regulatoren 19S und PA28 kopräzipitiert wurden. Es wurde vermutet, dass aufgrund der
Größe der Komplexe in den Fraktionen 14/15 hauptsächlich 20S Proteasomen, der freie 19S
Regulator und 20S-PA28 Komplexe migrierten, während in den Fraktionen 19/20 die größeren Hybridproteasomen und das 26S Proteasom enthalten sein könnten. Das 20S Proteasom
wurde aus diesen Fraktionen der Glyceroldichtegradienten mit einem gegen die Untereinheit
β7 gerichteten Antiköper präzipitiert. Dabei war die eingesetzte Menge des Antikörpers limitierend, so dass gleiche Mengen von 20S Proteasom präzipitiert wurden (Abb. 12).
Abb. 12: Immunpräzipitation von 20S Komplexen aus Glyceroldichtegradienten und
Nachweis von PA28α und S1
20S Proteasomen wurden mit einem gegen die Untereinheit β7 gerichteten Antikörper aus den Gradientenfraktionen
14/15 und 19/20 präzipitiert. Mittels Western Blot Analyse wurden α4, PA28α und S1 als Referenz für das 20S Proteasom und die Regulatoren PA28 und 19S nachgewiesen. À = unspezifische Reaktion
In den Fraktionen 14/15 wurden im Verlauf der IFNγ Stimulation zunehmende Mengen
PA28α kopräzipitiert. Damit wurde eine IFNγ induzierte Assoziation des Aktivators an das
20S Proteasom bestätigt. Die Untereinheit S1 des 19S Regulators wurde ebenfalls aus den
Fraktionen 14/15 kopräzipitiert. Dies entsprach nicht den Erwartungen, da davon ausgegangen wurde, dass in diesen Fraktionen das 20S Proteasom nicht mit dem 19S Komplex interagiert. Da die Komplexe im Dichtegradienten nicht vollständig voneinander getrennt wurden,
konnte aber nicht ausgeschlossen werden, dass diese Fraktionen auch 26S Proteasomen enthielten. Die relativen Mengen der kopräzipitierten Untereinheit S1 aus diesen Fraktionen
blieben im Verlauf der IFNγ Stimulation unverändert. Demgegenüber wurden nach 4 bis
12stündiger IFNγ Stimulation aus Fraktionen höherer Dichte geringere Mengen S1 kopräzipitiert. Da sich in dieser Immunpräzipitation die relative Menge des kopräzipitierten PA28α
38
Ergebnisse
________________________________________________________________________
reziprok zu S1 verhielt, wurde eine transiente Verdrängung des 19S Komplexes durch den
Proteasomen-Aktivator vermutet. Die schnelle Migration der präzipitierten Komplexe im
Dichtegradienten deutete auf eine transiente Induktion des Hybridproteasoms nach 4 bis 12h
IFNγ Stimulation hin.
Um die Interaktion zwischen dem 19S Regulator und 20S Proteasom näher zu untersuchen,
wurden die proteasomalen Komplexe in der Nativ-PAGE untersucht. Diese Methode ermöglicht eine alternative Trennung der Komplexe. HeLa Zellen wurden im Verlauf einer
24stündigen IFNγ Stimulation nach 0, 4, 8, 12 und 24h lysiert und die zytosolischen Proteine
durch Zentrifugation gewonnen. Jeweils gleiche Proteinmengen wurde in der Nativ-PAGE
getrennt. Die Komplexe des UPS wurden mit spezifischen Antikörpern gegen einzelne Untereinheiten des 19S Regulators, des 20S Proteasoms und des Proteasomen-Aktivators detektiert (Abb. 13).
Abb. 13: Nachweis proteasomaler Komplexe IFNγ stimulierter HeLa Zellen
100µg der zytosolischen Proteine IFNγ stimulierter HeLa Zellen (0, 4, 8, 12 oder 24h) wurden in 3-12%igen Nativgelen
getrennt und die proteasomale Untereinheit α4, die Untereinheiten des 19S Komplexes S6a und S1 sowie die Untereinheit PA28α des Proteasomen-Aktivators im Western Blot nachgewiesen. À = Proteinaggregat
Die gegen die 19S Untereinheiten S6a und S1 gerichteten Antikörper detektierten im Lysat
zwei Komplexe, die im oberen Abschnitt des Nativgels migrieren. Bei dem schneller migrierenden Komplex könnte es sich um den freien 19S Regulator handeln, da er weder α4 noch
PA28α enthielt. Ein vom 20S Proteasom abweichendes Migrationsverhalten des 19S Regulators in der Nativ-PAGE wurde trotz ähnlichem Molekulargewicht der Komplexe auch von
anderen Arbeitsgruppen beobachtet (Shibatani et al., 2006). Der langsamer migrierende
Komplex enthielt neben S1 und S6a auch die proteasomale Untereinheit α4. Daher wird vermutet, dass dieser Komplex dem 26S Proteasom entspricht. Im Stimulationsverlauf detektierte der gegen die proteasomale Untereinheit α4 gerichtete Antikörper eine leichte Abnahme
des 26S Proteasoms, mit den gegen die 19S Untereinheiten gerichteten Antikörpern war je39
Ergebnisse
________________________________________________________________________
doch keine Konzentrationsänderung des 26S Proteasoms zu beobachten. Da auch in Wiederholungen eine Abnahme des 26S Proteasoms nicht bestätigt werden konnte, war ein Einfluss
von IFNγ auf die relative Konzentration des 26S Proteasoms nicht feststellbar.
Der gegen α4 gerichtete Antikörper detektierte unmittelbar oberhalb des 20S Proteasoms, das
bei 669 kDa migriert, einen weiteren Komplex. Durch den Nachweis der Untereinheit
PA28α, nicht aber der Untereinheiten des 19S Regulators, wurde dieser Komplex als 20SPA28 Komplex definiert. Im Verlauf der IFNγ Stimulation nahm dessen relativer Anteil zur
Proteinmenge ebenso zu wie der des freien 20S Proteasoms.
Anders als die ATPase S6a wurde die Untereinheit S1 des 19S Komplex im Verlauf der IFNγ
Stimulation in zunehmendem Maße auch auf gleicher Höhe mit dem 20S Proteasom nachgewiesen (roter Pfeil, Abb. 13). Dieses Ergebnis könnte eine Erklärung für die Kopräzipitation
der Untereinheit S1 mit dem 20S Proteasom aus Fraktionen geringer Dichte bieten. Die Daten deuten auf einen kleineren Komplex hin, der auch in Abwesenheit der ATPase S6a mit
der Untereinheit S1 interagiert. Dieser Komplex weist vergleichbare biochemische Eigenschaften auf wie das 20S Proteasom und akkumuliert im Verlauf der IFNγ Stimulation. Es
stellt sich die Frage, welche biologische Funktion diesem bisher nicht beschriebenen Komplex in vivo zukommt.
Zusammengefasst weisen die vorgestellten Ergebnisse darauf hin, dass das proinflammatorische Zytokin IFNγ das UPS bereits wenige Stunden nach dem ersten Auslösen der Signalkaskade in umfassender Weise beeinflusst. Neben einer Induktion der Immunountereinheiten
und des Proteasomen-Aktivators wurde eine verstärkte Interaktion zwischen PA28 und dem
20S Proteasom beobachtet, die sich in einer zunehmenden Akkumulation von 20S-PA28
Komplexen und einer vermuteten transient verstärkten Konzentration des Hybridproteasoms
äußerte, die sich allerdings nur aus der Immunpräzipitation ableiten ließ. Gleichzeitig nahm
auch die Konzentration des 20S Proteasoms im Stimulationsverlauf zu. Aus diesen Resultaten
geht hervor, dass IFNγ die proteolytischen Eigenschaften des UPS quantitativ bereits nach
wenigen Stunden über mehrere Faktoren deutlich verstärkt. Dieser Prozess scheint nicht zu
Lasten des 26S Proteasoms zu gehen, da relativ zur Proteinmenge zwar eine Zunahme des
20S Proteasoms und des 20S-PA28-Komplexes feststellbar ist, die jedoch nicht an eine Konzentrationsabnahme des 26S Proteasoms geknüpft ist.
3.2
Rolle des Proteasomen-Aktivators PA28 während der frühen
Phase der IFNΓ Stimulation
Die Induktion der MHC I Präsentation infolge einer IFNγ Stimulation erfordert die Bereitstellung einer größeren Menge an MHC I Liganden. Die Generierung solcher Epitope, die
hauptsächlich durch das UPS erfolgt, stellt einen limitierenden Faktor der durch IFNγ induzierten Antigenpräsentation dar (Benham und Neefjes, 1997). Die in 3.1 gezeigte Induktion
und Assoziation von PA28 an das 20S Proteasom durch IFNγ entspricht diesen Anforderungen an das UPS, da eine Assoziation des Proteasomen-Aktivators PA28 an das 20S Protea40
Ergebnisse
________________________________________________________________________
som dessen Substratumsatz erhöht (Stohwasser et al., 2000). Die nach wenigen Stunden induzierte Menge an Aktivatorkomplexen gewährleistet eine frühzeitige Verstärkung der proteasomalen Aktivität, allerdings hat auch die Inkorporation der Immunountereinheiten und eine
Induktion der 20S Proteasomen-Biogenese einen Einfluss auf die Aktivität des Proteasoms.
Der Einfluss von PA28 auf die proteasomale Gesamtaktivität wurde daher während der Anpassung des UPS an einen proinflammatorischen Status genauer untersucht.
3.2.1
Untersuchung in vitro rekonstituierter 20S-PA28 Komplexe
Im Verlauf der Stimulation mit IFNγ kam es zu einer verstärkten Interaktion zwischen dem
20S Proteasom und PA28 (3.1.2). Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass PA28 durch
die IFNγ Induktion in höherer Konzentration im Zytosol vorlag. Andererseits stellte sich die
Frage, ob die Interaktion zwischen den beiden Komplexen auch von der Beschaffenheit des
20S Proteasoms beeinflusst wird, da während der IFNγ Stimulation auch die Inkorporation
von Immunountereinheiten in das 20S Proteasom induziert wird. Ebenso bestand die Möglichkeit, dass PA28 die 20S Proteasomen unterschiedlicher Struktur verschieden aktivierte.
Aus diesem Grund wurde eine vergleichende Analyse zur Interaktion von PA28 und 20S Proteasomen aus IFNγ stimulierten Zellen und deren Aktivierbarkeit durchgeführt. Hierfür wurden eine Mauszelllinie verwendet, die aus einer PA28α-/-β-/- (PA28-/-)-defizienten Maus generiert wurde (Murata et al., 2001). In Gesamtzelllysaten dieser Zelllinie wurde eine in vitro
Rekonstitution von PA28 an proteasomale Komplexe durchgeführt und untersucht, welchen
Einfluss die Zugabe von PA28 auf die proteasomale Aktivität hat.
MEC PA28-/- Zellen wurden nach 0, 12 und 24stündiger IFNγ Stimulation lysiert und zentrifugiert. Gleiche Proteinmengen der zytosolischen Überstände wurden mit isoliertem PA28
bzw. als Kontrolle mit dem entsprechenden Volumen Puffer versetzt. Um zu überprüfen, ob
PA28 mit proteasomalen Komplexen der MEC PA28-/- Zellen interagierte, wurden 100µg der
mit PA28 inkubierten zytosolischen Proteine und der Kontrollen in der nativen Gelelektrophorese getrennt und das 20S Proteasom mit einem gegen die Untereinheit α4 gerichteten Antikörper im Western Blot nachgewiesen. Parallel aufgetragenes isoliertes 20S Proteasom sowie der Nachweis der Baseuntereinheit S1 ermöglichten eine Zuordnung des 20S und
26S Proteasoms. (Abb. 14).
41
Ergebnisse
________________________________________________________________________
Abb. 14: In vitro Rekonstitution von 20S-PA28 Komplexen
100µg der zytosolischen Proteine IFNγ stimulierter MEC PA28-/- Zellen wurden mit isoliertem PA28 im Überschuss
bzw. dem entsprechenden Volumen Puffer versetzt und 30min bei Raumtemperatur inkubiert und in 3-12%igen nativen
Tris/Glycingelen getrennt. Zur Kontrolle wurde isoliertes 20S Proteasom mitgeführt. Die Untereinheiten α4 (20S Proteasom), PA28α (PA28) und S1 (19S Regulator) wurden im Western Blot nachgewiesen.Á= α4: Proteasomaggregat;
W=PA28α: unspezifische Reaktion
Der Nachweis der Untereinheit PA28α des Proteasomen-Aktivators belegte, dass 20S-PA28Komplexe durch die Zugabe von PA28 zum Lysat rekonstituiert wurden. Die Stimulation der
Zellen mit IFNγ hatte dabei auf die Affinität des Aktivators für das 20S Proteasom keinen
nachweisbaren Einfluss. Obwohl PA28 in deutlichem Überschuss zu den Lysaten zugegeben
wurde, erfolgte keine vollständige Assoziation des 20S Proteasoms mit Aktivatoren. Dieses
Ergebnis deutet darauf hin, dass die Interaktion zwischen den beiden Komplexen entweder
gering ist oder einer Regulation unterliegt, die dafür sorgt, dass stets auch ein Anteil freier 20S
Proteasomen im Zytosol vorhanden ist.
In MEC PA28-/- Zellen wurde neben dem 20S und dem 26S Proteasom ein Komplex detektiert, der die gleiche Größe wie der zuvor als 20S-PA28 identifizierte Komplex hat, aber kein
PA28α enthielt (vergleiche Abb. 13). Die proteolytische Aktivität der Komplexe wurde durch
einen Substrat-overlay des Nativgels nachgewiesen. Das Gel wurde für 15min bei 37°C mit
dem fluorogenen Substrats Suc-LLVY-AMC inkubiert. Der Substratumsatz wurde anhand
der Fluoreszenz der abgespaltenen AMC-Gruppe mittels UV-Anregung (λ=312nm) visualisiert. Sämtliche über die Untereinheit α4 detektierten Komplexe wiesen proteolytische Aktivität auf. Die Zugabe von PA28 und die resultierende Formierung von 20S-PA28 Komplexen
hatte zur Folge, dass die proteolytische Aktivität des Proteasoms unabhängig von der Dauer
der IFNγ Stimulation gesteigert wurde. Diese funktionelle Eigenschaft unterschied den in vitro
rekonstituierten vom endogenen Komplex (Abb. 15).
42
Ergebnisse
________________________________________________________________________
Abb. 15: Proteolytische Aktivität in vitro rekonstituierter 20S-PA28 Komplexe
100µg des zytosolischen Überstands IFNγ stimulierter MEC PA28-/- Zellen wurde für 30min mit isoliertem PA28 im
Überschuss bei Raumtemperatur inkubiert und in einem 3-12%igen nativen Tris/Glycingel getrennt. Nach der
Elektrophorese wurde das Gel 15min bei 37°C mit dem fluorogenen Substrats Suc-LLVY-AMC inkubiert. Der Substratumsatz wurde anhand der Fluoreszenz der abgespaltenen AMC-Gruppe mittels UV-Anregung (λ=312nm) visualisiert.
Á = Proteasomaggregat
Für eine genauere funktionelle Analyse wurden die rekonstituierten Komplexe in Glyceroldichtegradienten ultrazentrifugiert und fraktioniert. Die proteolytische Aktivität der Fraktionen wurde mit dem fluorogenen Peptid Suc-LLVY-AMC gemessen. Die Fraktionen 15-34
jedes Glyceroldichtegradienten wiesen proteolytische Aktivität auf. In diesen Fraktionen ist
das 20S Proteasom über die Untereinheit α4 im Western Blot nachweisbar (nicht gezeigte
Daten). Die Zugabe von PA28 zu den zytosolischen Überständen der MEC PA28-/- Zellen
bewirkte unabhängig von der Dauer der IFNγ Stimulation eine drastische Steigerung der proteolytischen Aktivität in den Fraktionen 15-22. Im Verlauf der IFNγ Stimulation war in Lysaten der MEC PA28-/- Zellen im Gegensatz zu HeLa Zellen (Abb. 7) statt eines gesteigerten
ein verminderter Umsatz des fluorogenen Substrats Suc-LLVY-AMC zu verzeichnen. Auch
die Aktivitätssteigerung durch die Zugabe von PA28 fiel nach 24stündiger IFNγ Stimulation
geringer aus. (Abb. 16).
43
Ergebnisse
________________________________________________________________________
Abb. 16: In vitro Assoziation von PA28 an Proteasomen IFNγ stimulierter MEC PA28-/Zellen und Steigerung der proteolytischen Aktivität
MEC PA28-/- Zellen wurden für 0, 12 oder 24h mit IFNγ stimuliert und lysiert. Gleiche Proteinmengen wurden entweder mit PA28 aus Erythrozyten oder mit Puffer für 30min bei RT inkubiert und anschließend in Glyceroldichtegradienten getrennt. Isoliertes PA28 wurde im Überschuss hinzugegeben. Die proteolytische Aktivität der Fraktionen wurde anhand des Umsatzes von Suc-LLVY-AMC gemessen († = Gesamtzelllysat Ø PA28 S Gesamtzelllysat + PA28).
Um auszuschließen, dass dieses Ergebnis auf einer geringeren Konzentration des 20S Proteasoms beruhte, wurde die relative Konzentration proteasomaler Komplexe in der NativPAGE analog zu der in HeLa Zellen untersucht. In MEC PA28-/- Zellen wurde eine gesteigerte Biogenese des 20S Proteasoms ebenso gefunden wie in murinen C4 Zellen, welche keine PA28 Defizienz aufweisen (nicht gezeigte Daten). Der verminderte Umsatz des fluorogenen Substrats Suc-LLVY-AMC könnte aber eine speziesspezifische Eigenschaft des murinen
20S Proteasoms sein, da verschiedene Untersuchungen diesen Unterschied zwischen huma-
44
Ergebnisse
________________________________________________________________________
nen und murinen Proteasomen bestätigen (Boes et al., 1994; Klare et al., 2007; Kuckelkorn et
al., 1995).
Die vorgestellten Daten zeigen, dass PA28 unabhängig von der Dauer der IFNγ Stimulation
in vitro spontan mit dem 20S Proteasom interagiert und dieses stark aktiviert. Interessanterweise reichte die Assoziation von PA28 nicht aus, um den Substratumsatz IFNγ-stimulierter,
d.h. Immunountereinheiten enthaltender Proteasomen auf das gleiche Niveau zu steigern wie
das des konstitutiven 20S Proteasoms. Dieses Ergebnis bestätigt den Befund, dass ein durch
PA28 hervorgerufenes gating und der dadurch höhere Substratumsatz des 20S Proteasoms
durch die strukturellen Eigenschaften des 20S Proteasoms limitiert ist und die daraus resultierenden funktionellen Unterschiede durch PA28 nicht ausgeglichen werden (Stohwasser et al.,
2000).
3.2.2
Einfluss von Mg-ATP auf die Interaktion zwischen dem 20S Proteasom
und PA28
Das 20S Proteasom mit seinen Regulatoren geht reversible Interaktionen ein, die durch die
Lyse der Zelle zum Teil zerstört werden können. Die Interaktion zwischen dem 19S Regulator und dem 20S Proteasom wird in vitro durch Mg-ATP verstärkt (Hoffman und Rechsteiner,
1997). Mg-ATP wurde aus diesem Grund in der vorliegenden Arbeit zunächst während der
Zelllyse und den nachfolgenden Arbeitsschritten zugesetzt, um die Interaktionen des 20S
Proteasoms mit dem 19S Regulator zu erhalten. In Gegenwart von 2 mM Mg-ATP wurde
jedoch beobachtet, dass die Interaktion zwischen dem 20S Proteasom und PA28 stark beeinträchtigt war, auch wenn das Nukleotid erst nach der Zelllyse hinzugegeben wurde (nicht
gezeigte Daten). Der Einfluss von Mg-ATP auf die Interaktionen des 20S Proteasoms mit
den Regulatoren wurde über eine Immunpräzipitation des 20S Proteasoms aus Gesamtzelllysaten IFNγ stimulierter HeLa Zellen nachgewiesen. HeLa Zellen wurden für 0, 4, 8, 12 oder
24h mit IFNγ stimuliert. Jeweils gleiche Proteinmengen der zytosolischen Überstände wurde
während der Immunpräzipitation mit 2mM Mg-ATP versetzt bzw. ohne Mg-ATP-Zusatz
analysiert. Das 20S Proteasom wurde aus beiden Ansätzen mit dem gegen die proteasomale
Untereinheit β7 gerichteten Antikörper präzipitiert. Die Kopräzipitation von PA28α über das
20S Proteasom wurde im Western Blot überprüft (Abb. 17).
45
Ergebnisse
________________________________________________________________________
Abb. 17: Einfluss von Mg-ATP auf die Stabilität der Assoziation von PA28 an
20S Proteasomen
20S Proteasomen wurden mit einem gegen β7 gerichteten Antikörper aus gleichen Lysatmengen IFNγ stimulierten HeLa
Zellen präzipitiert. Die Präzipitation wurde in An- oder Abwesenheit von 2mM Mg-ATP durchgeführt. Gleiche Mengen
des Präzipitats sowie 10µl Lysat (0 und 24h IFNγ) wurden in SDS Gelen getrennt, auf PVDF Membran transferiert und
α4, PA28α und S1 wurden als Referenz für das 20S Proteasom und die Regulatoren PA28 und 19S nachgewiesen.
PA28α wurde in Gegenwart von Mg-ATP nur noch in sehr geringen Mengen kopräzipitiert,
während in dessen Abwesenheit im Verlauf der IFNγ Stimulation PA28α in steigenden Konzentrationen kopräzipitiert wurde. Die offensichtlich gestörte Interaktion zwischen 20S Proteasomen und PA28 in Gegenwart von Mg-ATP sollte genutzt werden, um den Einfluss von
IFNγ auf die proteasomale Aktivität im Verlauf der 24stündigen IFNγ Stimulation in Abwesenheit von PA28 zu untersuchen. HeLa Zellen wurden nach unterschiedlicher Stimulationsdauer (0, 4, 8, 12 und 24h) lysiert und zentrifugiert. Gleiche Proteinmengen der zytosolischen
Überstände wurden in 15-45%igen, 2mM Mg-ATP-haltigen Glyceroldichtegradienten ultrazentrifugiert. Die Interaktion zwischen PA28 und dem Proteasom wurde im Western Blot der
Gradientenfraktionen mit spezifischen Antikörpern überprüft. Die Induktion von PA28
durch IFNγ erfolgte wie zuvor gezeigt. Der Nachweis von PA28 blieb in Gegenwart von MgATP auf die Fraktionen geringerer Dichte beschränkt. Lediglich nach 24h konnte eine schwache Kolokalisation von PA28 und dem 20S Proteasom in Fraktion 16 detektiert werden
(Pfeil; Abb. 18).
46
Ergebnisse
________________________________________________________________________
Abb. 18: Nachweis von PA28 und 20S Proteasomen in Mg-ATP-haltigen Glyceroldichtegradienten von Lysaten IFNγ stimulierter HeLa Zellen
1mg Gesamtprotein IFNγ stimulierter HeLa Zellen wurden mittels Dichtegradientenzentrifugation in Gegenwart von
2mM Mg-ATP zentrifugiert und 10 µl jeder Fraktion wurden für die Western Blot Analyse in der SDS PAGE getrennt.
Zunächst erfolgte der Nachweis von PA28 mit einem gegen PA28α gerichteten Antikörper. Anschließend wurde die
PVDF Membran zusätzlich mit einem gegen die proteasomale Untereinheit α4 gerichteten Antikörper inkubiert und beide primären polyklonalen Antikörper mit dem sekundären Antikörper detektiert.
Die Kolokalisation von 20S Proteasom und PA28 fiel somit in Gegenwart von Mg-ATP deutlich schwächer aus als in dessen Abwesenheit (Abb. 9) Dieses Ergebnis entspricht der zuvor
gezeigten schwächeren Kopräzipitation des Proteasomen-Aktivators aus Gesamtzelllysaten in
Gegenwart von Mg-ATP. Beide Resultate sprechen für eine deutlich schwächere bis nicht
mehr nachweisbare Interaktion zwischen PA28 und dem Proteasom in Gegenwart von MgATP in vitro. In Muskelzellen, die einen besonders hohen Umsatz an ATP aufweisen, liegt die
intrazelluläre ATP-Konzentration bei 8,5 mM und damit vierfach über der eingesetzten MgATP Konzentration (Kemp et al., 2007). Es ist allerdings nicht auszuschließen, dass die intrazelluläre ATP Konzentration nicht die Menge des frei verfügbaren ATPs in vivo widerspiegelt
und dass ein Großteil des freien ATPs durch zelluläre Kompartimentierung nicht mit den
20S-PA28-Komplexen interferiert. Die mit Mg-ATP erzielte Dissoziation von 20S-PA28
Komplexen wird jedoch wahrscheinlich durch eine Interaktion des im Ansatz enthaltenen
Magnesiums mit PA28 verursacht, welche die Funktion des Aktivators inhibiert (Realini und
Rechsteiner, 1995).
Im Verlauf der IFNγ Stimulation wurde in Abwesenheit von Mg-ATP eine starke Zunahme
der proteasomalen Aktivität beobachtet. Diese Aktivitätssteigerung korrelierte mit der Konzentrationszunahme von 20S-PA28 Komplexen und deutete darauf hin, dass PA28 wesentlich zu der IFNγ induzierten Steigerung der proteolytischen Aktivität beitrug (3.1.1). Um genauer definieren zu können, welche Rolle PA28 bei diesem Vorgang spielt, wurde die IFNγabhängige Entwicklung der proteasomalen Aktivität unter dem Einfluss von Mg-ATP unter47
Ergebnisse
________________________________________________________________________
sucht. Dafür wurde die proteolytische Aktivität der Mg-ATP-haltigen Gradienten-fraktionen
analog zu 3.1.1 über den Umsatz des fluorogenen Substrats Suc-LLVY-AMC (40µM) gemessen. Um einen Vergleich der beiden Untersuchungen zu erleichtern, wurden als Referenz die
Aktivitätsprofile aus Kap. 3.1.1 in demselben Diagramm dargestellt. Die in Gegenwart von
Mg-ATP gemessene proteasomale Aktivität unterschied sich in zwei wesentlichen Punkten
von der in Abwesenheit von Mg-ATP gemessenen Aktivität. Zum einen war das Maximum
der Aktivitätskurve in Gegenwart von Mg-ATP in Fraktionen mit einer höheren Dichte
(Fraktion 20) verschoben, was wahrscheinlich auf eine Aktivierung des 26S Proteasoms durch
ATP zurückzuführen ist. Der zweite Unterschied betraf die IFNγ-induzierte Änderung der
proteasomalen Aktivität: Der in Abwesenheit von Mg-ATP messbare Aktivitätszuwachs in
Fraktionen geringerer Dichte (Fraktion 15) konnte in Gegenwart von Mg-ATP nur noch in
sehr geringem Maße detektiert werden (Abb. 19; Pfeil). Wie der Vergleich der Aktivitätsprofile verdeutlichte, kann dieser jedoch im Falle einer ungestörten Interaktion zwischen 20S Proteasom und PA28 im Verlauf der IFNγ Stimulation bereits nach 12h einen wesentlichen Anteil an der gesamtproteasomalen Aktivität ausmachen (Abb. 19).
48
Ergebnisse
________________________________________________________________________
Abb. 19: Einfluss von Mg-ATP auf die proteasomale Aktivität in Glycerolgradientenfraktionen
HeLa Zellen wurden für 0, 12 oder 24h mit IFNγ stimuliert und lysiert. 1mg Protein der zytosolischen Überstände wurde
in Gegenwart von 2mM Mg-ATP in 15-45%igen Glyceroldichtegradienten ultrazentrifugiert. Die proteasomale Aktivität
der Fraktionen wurde mit dem fluorogenen Substrat Suc-LLVY-AMC (40µM) gemessen. Um die Gradientenfraktionen
vergleichen zu können, wurden die Fraktionen auf die Aktivität in den Fraktionen 6-8 normiert und um bis zu zwei Positionen gegeneinander verschoben. (Schwarze Linien = Glycerol-dichtegradienten ohne Mg-ATP (Kap. 3.1.1), farbige Linien = Mg-ATP-haltige Glyceroldichtegradienten).
Neben PA28 wurde auch das 20S Proteasom einer Veränderung durch IFNγ unterworfen.
Aus den Resultaten der Nativ-PAGE ging bereits hervor, dass im untersuchten Zeitraum der
24stündigen IFNγ Stimulation die Konzentration des 20S Proteasoms zunahm. Ebenso wurde exemplarisch für die drei Immunountereinheiten gezeigt, dass die Immunountereinheit iβ1
in zunehmendem Maße in maturierten 20S Proteasomen inkorporiert wurde. Die Bedeutung
des Proteasomen-Aktivators für die IFNγ-abhängige Entwicklung der proteasomalen Aktivität sollte von diesen anderen Faktoren abgegrenzt werden. Die Aktivitätsprofile der Glyceroldichtegradienten wurden zu diesem Zweck für eine relative Quantifizierung der proteasomalen Gesamtaktivität genutzt. Die proteolytische Aktivität der in Abb. 19 dargestellten
49
Ergebnisse
________________________________________________________________________
Glyceroldichtegradienten wurde über den Substratumsatz des fluorogenen Peptids SucLLVY-AMC analog zu 3.1.1 gemessen. Die proteasomale Gesamtaktivität der Glyceroldichtegradienten wurde bestimmt, indem die Fläche unter dem Aktivitätsprofil Mg-ATP-haltiger
und Mg-ATP-freier Glyceroldichtegradienten integriert wurde (Abb. 20).
Abb. 20: Entwicklung der proteasomalen Aktivität nach IFNγ Stimulation
Gleiche Proteinmengen IFNγ stimulierter HeLa Zellen wurden in Glyceroldichtegradienten in Gegenwart oder Abwesenheit von 2mM Mg-ATP ultrazentrifugiert. Der Substratumsatz der Fraktionen wurde mit dem fluorogenen Substrat
Suc-LLVY-AMC gemessen und die Fläche unter dem Aktivitätsprofil (Proteasomen-haltige Fraktionen, Nr. 14 bis 30)
integriert. Die proteasomale Aktivität der Mg-ATP-freien (weiß) und der Mg-ATP-haltigen (schwarz) Gradienten wurden
bezogen auf die Aktivität ruhender Zellen in Prozent dargestellt.
In den Mg-ATP-haltigen Gradienten konnte eine transient um 50% verringerte Aktivität im
Verlauf der IFNγ Stimulation beobachtet werden. Unter Mg-ATP-freien Bedingungen war
dieser Rückgang der Aktivität nahezu nicht feststellbar. Es wurde vielmehr eine Steigerung
der Aktivität auf 180% beobachtet, die nach 12h IFNγ Stimulation ein Plateau erreicht hatte.
Währenddessen konnte in den Mg-ATP-haltigen Gradienten erst nach 24h eine Aktivitätssteigerung auf 140% beobachtet werden. Dieses Ergebnis zeigte, dass PA28 nicht nur einen
wesentlichen Anteil der proteasomalen Aktivität bereitstellt, sondern dass durch die Assoziation von 20S Proteasomen und PA28 eine Aktivierung der proteasomalen Gesamtaktivität zu
einem führen Zeitpunkt erfolgt.
50
Ergebnisse
________________________________________________________________________
3.3
Strukturelle Heterogenität des 20S Proteasoms IFNΓ stimulierter HeLa Zellen
Das proinflammatorische Zytokin IFNγ induziert in höheren Vertebraten die Expression der
Immunountereinheiten des 20S Proteasoms, deren verstärkte Inkorporation zur Formierung
von Immunoproteasomen führt. Dieser Prozess wird durch eine verminderte Translation
konstitutiver katalytische β-Untereinheiten unterstützt (Belich et al., 1994). Es stellte sich die
Frage, ob diese Veränderung mit einem verstärkten Auftreten intermediärer Proteasomen
verbunden ist; und welche Folgen sich daraus für die Funktion ergeben. Die strukturelle Heterogenität der 20S Proteasomenpopulation kann nur durch eine de novo Formierung von 20S
Proteasomen verursacht werden. Eine unterschiedliche Kombination der katalytischen βUntereinheiten innerhalb desselben Komplexes ist daher nur wahrscheinlich, wenn sowohl
konstitutive als auch Immunountereinheiten zur Inkorporation in das 20S Proteasom bereitstehen. In HeLa Zellen sind nach 24stündiger IFNγ Stimulation Immunoproteasomen formiert (Heink et al., 2005). In diesem experimentellen Rahmen, der dem Status einer Infektion
oder Inflammation in vivo nahe kommt, muss daher die strukturelle Veränderung der 20S Proteasomenpopulation der Zelle stattfinden.
3.3.1
Inkorporation der Immunountereinheiten im Verlauf der IFNγ Stimulation
Die Inkorporation der Immunountereinheiten in das 20S Proteasom wurde im Verlauf der
IFNγ Stimulation untersucht. Hierfür wurden HeLa Zellen mit 200U/ml IFNγ stimuliert und
zu verschiedenen Zeitpunkten innerhalb der 24stündigen Stimulation geerntet. Die Zellen
wurden in drei Frier/Tau Zyklen lysiert, zentrifugiert und 1mg Protein aus den Überständen
mittels Dichtegradientenzentrifugation bei 208000xg, 16h getrennt. In den Fraktionen wurden mittels Western Blot die proteasomalen Untereinheiten β1 und iβ1 detektiert und die
proteolytische Aktivität bestimmt, um die aktiven 20S Proteasomen zu lokalisieren. Anschließend wurde das 20S Proteasom aus den aktiven Fraktionen mit einem gegen die Untereinheit
β7 gerichteten Antikörper immunpräzipitiert. Der Nachweis der sechs katalytischen βUntereinheiten erfolgte im Western Blot mit spezifischen Antikörpern (Abb. 21).
51
Ergebnisse
________________________________________________________________________
Abb. 21: Immunpräzipitation von 20S Proteasomen und Nachweis der katalytischen Untereinheiten
Aus je 1mg Gesamtprotein IFNγ stimulierter HeLa Zellen (0, 4, 8, 12, 24h IFNγ) wurde nach Dichtegradientenzentrifugation das 20S Proteasom aus den Fraktionen 12 bis 16 mit einem gegen β7 gerichteten Antikörper präzipitiert, in SDS Gelen getrennt und auf PVDF Membranen transferiert. Die Untereinheiten β1, iβ1, β2, iβ2, β5 und iβ5
wurden mit spezifischen Antikörpern nachgewiesen Als Kontrolle wurden Blots zudem mit einem Antikörper gegen die
Untereinheit α4 inkubiert.
Im Verlauf einer 24stündigen IFNγ Stimulation konnte eine stetige Zunahme aller Immunountereinheiten und eine parallele Abnahme der korrespondierenden konstitutiven Untereinheiten in den präzipitierten 20S Proteasomen beobachtet werden. Eine Zunahme der Immunountereinheiten iβ1 und iβ5 und eine entsprechende Abnahme der konstitutiven
Homologen β1 und β5 war bereits nach vier Stunden nachweisbar. Im Gegensatz dazu wurde
iβ2 erst nach 8h der IFNγ Stimulation detektiert, was mit einer geringen Abnahme der konstitutiven Untereinheit β2 korrelierte. Der Zuwachs der Immunountereinheiten in de novo formierten 20S Proteasomen erfolgte daher offensichtlich nicht zu gleichen Anteilen. In Western
Blot Analysen IFNγ stimulierter Mauszelllinien konnte gezeigt werden, dass eine Induktion
der Immunountereinheiten innerhalb der ersten 4h der Stimulation nicht beobachtet wurde
(nicht gezeigte Daten).
3.3.2
Anteile der inkorporierten Immunountereinheiten
Um die zunehmende Inkorporation der drei Immunountereinheiten in das 20S Proteasom im
Verlauf einer 24stündigen IFNγ Stimulation zu vergleichen, wurden die relativen Mengen der
katalytischen β-Untereinheiten des 20S Proteasoms nach unterschiedlicher Stimulationsdauer
(0, 8, 12 und 24h) mittels 2D Gelelektrophorese bestimmt. 20S Proteasomen wurden aus
HeLa Zellen isoliert und je 20µg in einer 2D Gelelektrophorese (1. Dimension IEF, 2. Dimension SDS PAGE) getrennt. Die Intensitäten der mit Coomassie gefärbten Immunounte52
Ergebnisse
________________________________________________________________________
reinheiten und der korrespondierenden konstitutiven Untereinheiten wurden densitometrisch
ausgewertet, da die Inkorporation einer Immunountereinheit in das 20S Proteasom immer
anstelle der korrespondierenden konstitutiven Untereinheit erfolgt (Akiyama et al., 1994; Hisamatsu et al., 1996) Die Intensität der eingebauten Immunountereinheiten iβ1 und iβ5 wurden als prozentualer Anteil der summierten Intensitäten eines β/βi Untereinheitenpaares im
Säulendiagramm dargestellt (Abb. 22).
Die drei Immunountereinheiten iβ1, iβ2 und iβ5 waren zu einem geringen Teil bereits in den
20S Proteasomen unstimulierter HeLa Zellen nachweisbar (Abb. 22 B). Im Verlauf der Stimulation mit IFNγ war eine zunehmende Inkorporation der Immunountereinheiten und die
Abnahme der konstitutiven katalytischen Untereinheiten zu beobachten. Der Zuwachs der
Immunountereinheit iβ2 konnte mit dieser Methode nicht bestimmt werden, da die Immunountereinheit iβ2 in den 2D Gelen nicht ausreichend fokussiert war.
Abb. 22: 2D Gelelektrophorese und densitometrische Quantifizierung der katalytischen βUntereinheiten isolierter 20S Proteasomen aus IFNγ stimulierten HeLa Zellen
20µg isoliertes 20S Proteasom unstimulierter oder IFNγ stimulierter HeLa Zellen wurden in der 2D Gelelektrophorese
getrennt und mit Coomassie gefärbt. (A) Repräsentativ ist die 2D Gelelektrophorese des 20S Proteasoms nach
12stündiger IFNγ Stimulation dargestellt. Die katalytischen β-Untereinheiten sind mit Pfeilen markiert (Îkonstitutive,
ÎImmunountereinheit). (B) Die in (A) markierten Ausschnitte der 2D Gele zeigen die katalytischen β-Untereinheiten
der vier isolierten 20S Proteasomen im Vergleich. (C) Densitometrische Auswertung der katalytischen Untereinheiten.
Die Summe der gemessenen Intensität eines β/βi Paares wurde 100% gesetzt und die Anteile der jeweiligen Immunountereinheit in Prozent dargestellt (rot).
Die Analyse der mit Coomassie gefärbten Proteine zeigte, dass sich das Verhältnis zwischen
konstitutiver und korrespondierender Immunountereinheit bei den Untereinheitenpaaren
53
Ergebnisse
________________________________________________________________________
β1/iβ1 und β5/iβ5 in unterschiedlichem Maß änderte. Sowohl in unstimulierten als auch in
IFNγ stimulierten HeLa Zellen wurde ein höherer Anteil der Immunountereinheit iβ5 im
Vergleich zu iβ1 nachgewiesen. Der Anteil an inkorporiertem iβ5 stieg im Verlauf der IFNγ
Stimulation von 28% auf 78% an. Die Immunountereinheit iβ1 war in 20S Proteasomen nicht
stimulierter HeLa Zellen zunächst zu einem weit geringeren Anteil von 8% inkorporiert. Ihr
Anteil erreichte nach 24stündiger IFNγ Stimulation 28% (Abb. 22 C).
Das 20S Proteasom lag somit vor Beginn der Stimulation nicht in rein konstitutiver Form vor
und am Ende der Stimulation war es zu keinem vollständigen Austausch dieses 20S Proteasoms gegen die Immunoform, also keinem kompletten Ersatz der konstitutiven durch Immunountereinheiten gekommen.
Die unterschiedliche Relation der Immunountereinheiten macht die Existenz reiner Immunoproteasomen wenig wahrscheinlich und deutet auf die Existenz intermediärer 20S Proteasomen hin, die sowohl katalytische konstitutive als auch Immunountereinheiten enthalten.
Die stärkere Inkorporation der Immunountereinheit iβ5 gegenüber iβ1 und iβ2 ist ein Indiz
dafür, dass im untersuchten Zeitraum nicht nur die Assemblierung von Immunoproteasomen
möglich ist, sondern dass es darüber hinaus zu einer de novo Assemblierung intermediärer 20S
Proteasomen kommen muss, die neben der konstitutiven Untereinheit β1 die Immunountereinheit iβ5 enthalten.
Bei der Beurteilung dieses Ergebnisses muss berücksichtigt werden, dass die 2D Gelelektrophorese die gesamte 20S Proteasomenpopulation der Zelle zu einem distinkten Zeitpunkt der IFNγ Stimulation repräsentiert und dass die Möglichkeit besteht, dass sich diese
Population aus strukturell verschiedenen Komplexen zusammensetzen kann. Die Zusammensetzung dieser Population wird durch die Neuassemblierung und die Halbwertszeit der
existierenden 20S Proteasomen bestimmt. Die Halbwertszeit des konstitutiven und des Immunoproteasoms liegt bei 120 (konstitutives 20S Proteasom) beziehungsweise 22h (Immunoproteasom) (Heink et al., 2005). Ob die Halbwertszeiten intermediärer 20S Proteasomen in
diesem Zeitrahmen liegen, ist unbekannt. Diese Ergebnisse führten zu der Annahme, dass die
untersuchten 20S Proteasomenpopulationen während der 24stündigen IFNγ Stimulation zu
einer steigenden strukturellen Heterogenität führen.
3.4
Anreicherung von Proteasomen-Subtypen
Im Folgenden sollte untersucht werden, ob sich die Gesamtheit der 20S Proteasomen in Subpopulationen trennen lässt. Isolierte 20S Proteasomen (2.2.2.17) wurden einer Chromatographie an einem MiniQ Anionenaustauscher unterzogen, um eine Trennung dieser heterogenen Populationen zu erreichen und die darin enthaltenden Komplexe funktionell zu
untersuchen.
54
Ergebnisse
________________________________________________________________________
3.4.1
Trennung der 20S Proteasomen-Subpopulationen
Zur Trennung der Proteasomen-Subtypen wurden zunächst 20S Proteasomen aus unstimulierten HeLa Zellen oder aus HeLa Zellen, welche für 12 bzw. 24h mit IFNγ stimuliert wurden, isoliert (2.2.2.17). Dabei wurde im letzten Reinigungsschritt, der Anionenaustauschchromatographie an einer MonoQ Säule, eine Heterogenität der eluierten 20S Proteasoms
beobachtet. Diese 20S Proteasomen wurden anschließend über eine MiniQ Anionenaustauscher-Säule (ÄKTA) getrennt. Um geringe Affinitätsunterschiede der Komplexe zum Säulenmaterial bei der Elution auszunutzen, wurden die gebundenen 20S Proteasomen mit Hilfe
eines flachen NaCl-Gradienten (24%-29%) bei einer Konzentrationssteigerung von
2,25mM/ml NaCl eluiert. Die relativen Proteinmengen und die proteolytische Aktivität der
Fraktionen sind in Abb. 23 dargestellt.
Unabhängig von der gewählten IFNγ Stimulation eluierten die aufgetragenen 20S Proteasomen bei einer Leitfähigkeit des Puffers zwischen 29 und 33mS/cm von der Säule. Mit zunehmender Stimulationsdauer wurde eine veränderte Affinität der in der Population enthaltenen 20S Proteasomen beobachtet. Die eluierten 20S Proteasomen wurden anhand folgender
Parameter charakterisiert:
•
Eluierte Proteinmengen (Absorption λ=280nm)
•
proteolytische Aktivität (Substratumsatz Suc-LLVY-AMC)
•
Leitfähigkeit des Puffers (mS/cm)
Ein Einfluss von IFNγ auf die Affinität von 20S Proteasomen an den Anionenaustauscher
wurde anhand der eluierten Proteinmengen erfasst und spiegelte sich in einer Verbreiterung
und Abflachung des Absorptionsprofils (λ=280nm) wider. Zudem wies das Absorptionsprofil von 20S Proteasomen aus HeLa Zellen, welche für 24h mit IFNγ stimuliert wurden, deutlich zwei Schultern und eine zunehmende eluierte Proteinmenge bei einer Leitfähigkeit von
29 bis 30mS/cm (Fraktionen B9-C2) sowie bei 32mS/cm (Fraktionen C9-D2) auf.
Nach 24h Stimulation wurde eine gesteigerte chymotrypsinähnliche Aktivität in allen proteolytisch aktiven Fraktionen gemessen. Auch die trypsinähnliche Aktivität der Fraktionen (gemessen mit dem fluorogenen Substrat Boc-VGR-AMC) korrelierte in allen Fraktionen mit
der chymotrypsinähnlichen Aktivität (nicht gezeigte Daten). Die durch proinflammatorische
Zytokine hervorgerufenen Veränderungen der 20S Proteasomenpopulation wiesen folglich
sowohl eine veränderte Oberflächenladung der Komplexe als auch eine veränderte proteolytischen Aktivität auf.
Die Fraktionen einer 20S Proteasomenpopulation wurden anhand des Absorptionsprofils
(λ=280nm) und der spezifischen Aktivität in vier Abschnitte (A-D) unterteilt. Diese sind in
Abb. 23 grau unterlegt dargestellt (Tab. 6).
55
Ergebnisse
________________________________________________________________________
Tabelle 6: Einfluss von IFNγ auf Elutionsverhalten und Aktivität des 20S Proteasoms
Subpopulation
Elution bei Leitfähigkeit Einfluss von IFNγ auf
von [mS/cm]
Eluierte Proteinmenge
Proteolytische Aktivität
A
29-30
+
+
B
31
-
+
C
32
+
+
D
32-33
+
-
56
Ergebnisse
________________________________________________________________________
Abb. 23: Trennung der 20S Proteasomenpopulationen IFNγ stimulierter HeLa Zellen mittels Anionenaustauschchromatographie
20S Proteasomen wurden aus 2,2 x 109 (A, unstimuliert) oder 1,6 x 109 (B, 12h IFNγ; C, 24h IFNγ) HeLa Zellen isoliert
und mittels Anionenaustauschchromatographie über eine MiniQ Säule getrennt. Die relative Proteinmenge (Absorption
λ=280nm; blau) wurde ebenso wie die Leitfähigkeit des Puffers (schwarz) geräteintern gemessen. 10µl jeder Fraktion
wurden zur Bestimmung der proteolytischen Aktivität einer Fraktion mit dem fluorogenen Peptid Suc-LLVY-AMC
(20µM) inkubiert und der Substratumsatz nach 40min gemessen (rot). Ausgewählte Fraktionen wurden vereinigt (grau
unterlegte Fraktionen). * Die Fraktion C2 (Pool A, 24 h IFNγ) wurde nicht mit den Fraktionen B9-B12 vereinigt.
57
Ergebnisse
________________________________________________________________________
Der Einfluss von IFNγ auf die Affinität der 20S Proteasomenpopulation für den Anionenaustauscher wurde über eine Flächenintegration der Absorptionskurven (λ=280nm) gemessen. Die vier definierten Abschnitte A-D wurden jeweils als separate Anteile der Gesamtflächen integriert. Die Gesamtfläche unter der Absorptionskurve wurde 100% gesetzt und die
Anteile der Abschnitte A-D für jede Trennung separat prozentual dargestellt (Abb. 24).
Abb. 24: Relativer Anteil der vier Abschnitte der Absorptionskurven (λ=280nm)
Die Flächen der vier festgelegten Abschnitte (Pool A-D) der Absorptionskurven (λ=280nm, Abb. 9) wurden mithilfe der
ÄKTA Unicorn Software integriert und als prozentuale Anteile der Gesamtfläche einer Absorptionskurve dargestellt.
Die Bestimmung der relativen Anteile der gewählten Abschnitte der Absorptionskurve
(λ=280nm) verdeutlichte, dass sich im Verlauf der IFNγ Stimulation die Relationen der Subpopulationen A-D zueinander änderte. Der Anteil des Abschnitts B verringerte sich, die prozentualen Anteile der Abschnitte A, C und D an der Gesamtfläche nahmen demgegenüber im
Verlauf der IFNγ Stimulation zu. Die Zunahme erfolgte in unterschiedlichem Maße: Während die Abschnitte A und C einen großen Anteil von bis zu 30% nach 24stündiger IFNγ
Stimulation entsprachen, erreichte der Anteil des Abschnitts D im gleichen Zeitraum nur 6%
der Gesamtfläche. Bei der Bewertung der relativen Anteile muss jedoch beachtet werden, dass
in den vereinigten Fraktionen weiterhin eine Mischung der potentiellen Subpopulationen vorlag. Daher waren die prozentualen Flächenanteile eines Abschnitts nicht gleichzusetzen mit
realen prozentualen Anteilen der Subpopulationen A-D. Es wurde angenommen, dass die
vereinigten Fraktionen der 20S Proteasomenpopulationen ein Gemisch heterogener 20S
Komplexe enthielten. Jede Probe wurde daher einer Rechromatographie an der MiniQ Säule
unterzogen. Die Elutionsprofile (λ=280nm) der eluierten Proteine dieser Chromatographien
sind in Abb. 25 dargestellt.
58
Ergebnisse
________________________________________________________________________
Abb. 25: Rechromatographie vereinigter Fraktionen der 20S Proteasomenpopulationen
IFNγ stimulierten HeLa Zellen
Die in Kap. 3.4.1 beschriebenen vereinigten Fraktionen wurden einer Rechromatographie an der MiniQ Säule unterzogen. Die relativen eluierten Proteinmengen (Absorption λ=280nm) wurden geräteintern gemessen. Abschließend wurden
die umrahmten Fraktionen vereinigt. * Pool A der 20S Proteasomenpopulation nach 24h IFNγ bestand aus zwei Proben,
die separaten Rechromatographien unterzogen wurden. Links ist die Absorption (λ=280nm) der Fraktionen B9-B12 dargestellt, rechts die der Fraktion C2.
Die Absorptionsprofile (λ=280nm) der Rechromatographien wiesen zum Teil deutliche
Schultern auf, was darauf zurückzuführen ist, dass auch in diesen Fraktionen noch eine Heterogenität des 20S Proteasoms vorliegt. Hierbei könnte es sich sowohl um 20S Proteasomen
heterogener Struktur im Sinne der Zusammensetzung katalytischer β-Untereinheiten handeln,
als auch um 20S Proteasomen mit posttranslationalen Modifikationen. Anhand der Absorptionsprofile wurden die Rechromatographien ebenfalls in Abschnitte unterteilt und aufkonzentriert. Letztlich war die Trennung der Proben jedoch auch mit diesem Verfahren noch
nicht vollständig. Bei der weiteren Charakterisierung der gewonnenen Proteasomenfraktionen
musste daher berücksichtigt werden, dass eine Heterogenität der enthaltenen 20S Proteasomen nicht ausgeschlossen werden konnte.
Die Proteasomenfraktionen wurden in den nachfolgenden Kapiteln nach einer Nomenklatur
benannt, die Informationen darüber gibt, zu welchem Zeitpunkt der IFNγ Stimulation die
20S Proteasomen isoliert wurden (0, 12 oder 24h), und darüber, aus welchem Pool (A-D, 0)
und welchem Abschnitt der Rechromatographie (1-3) sie stammt (Abb. 26).
59
Ergebnisse
________________________________________________________________________
Abb. 26: Nomenklatur der Proteasomenfraktionen
Der Name jeder Proteasomenfraktion gibt Aufschluss über die Stimulationsdauer der Zellen mit IFNγ und darüber, aus
welchem Pool der ersten (A-D) und zweiten Chromatographie (1-3) sie abstammt.
Zusammengefasst wurden zur vergleichenden Analyse der proteolytischen Eigenschaften und
der katalytischen β-Untereinheiten die 20S Proteasomen einer Gesamtpopulation aufgrund
ihrer strukturellen und funktionellen Unterschiede in vier Subpopulationen separiert. Aus den
Ergebnissen ließ sich bereits ableiten, dass ein proinflammatorisches Signal die Assemblierung von neuen Strukturvarianten des 20S Proteasoms induzierte. Damit bestätigte sich die
Annahme, dass unter dem Einfluss proinflammatorischer Signale die Heterogenität des 20S
Proteasoms gesteigert wird. 20S Proteasomen wiesen unter IFNγ eine höhere proteolytische
Aktivität auf als 20S Proteasomen, die vor der Induktion in der Zelle vorlagen. Dies lässt die
Vermutung zu, dass die beobachtete Heterogenität auch Auswirkungen auf die Prozessierung
oligomerer Peptide haben kann, die in vivo das proteasomale Substrat für die Generierung von
MHC Klasse I restringierten Epitopen bilden.
3.5
Charakterisierung der Proteasomenfraktionen
Die Subpopulationen, die aus den drei 20S Proteasomenpopulationen IFNγ stimulierter HeLa
Zellen isoliert wurden, sollten im Folgenden vergleichend charakterisiert werden und wurden
zu diesem Zweck zunächst quantifiziert. Die Quantifizierung erfolgte mittels Western Blot
Analyse und einer anschließenden densitometrischen Auswertung. Für diese Untersuchung
wurde die konstitutiv exprimierte Untereinheit α4 ausgewählt. Für die Quantifizierung wurden parallel 50 bis 250ng isolierte 20S Proteasomen auf das SDS Gel geladen und die Signale
der Western Blots densitometrisch ausgewertet. Diese Werte dienten der Erstellung einer
Kalibrierungskurve (Abb. 27).
60
Ergebnisse
________________________________________________________________________
Abb. 27: Quantifizierung der 20S Proteasomen in Proteasomenfraktionen
150ng einer Proteasomenfraktion (Kalkulation nach Absorption λ=280nm) sowie definierte Mengen 20S Proteasom aus
Erythrozyten wurde in SDS Gelen getrennt und die Proteine auf PVDF Membranen transferiert. 20S Proteasomen wurden mit einem gegen die Untereinheit α4 gerichteten Antikörper markiert und über einen mit dem Fluoreszenzfarbstoff
Alexa488 gekoppelten sekundären Antikörper nachgewiesen. Die Fluoreszenzsignale der Western Blot Analyse wurden
densitometrisch ausgewertet. Mit den Signalen der Referenzproteasomen wurde eine Eichkurve sowie eine Regressionsgerade erstellt. Exemplarisch ist die Quantifizierung der Proteasomenfraktionen nach 12stündiger IFNγ Stimulation dargestellt.
Auf Basis der densitometrischen Quantifizierung der Referenzproteasomen wurden Eichgeraden mit Korrelationskoeffizienten R2 von 0,91 ± 0,02 für jeden Western Blot erstellt. Unter
Berücksichtigung der vorhandenen Volumina wurde die Proteasomenkonzentration der Proben über die Geradengleichungen der Regressionsgeraden errechnet.
3.5.1
Einbau der Immunountereinheiten in den 20S Subpopulationen
Während der Stimulation mit IFNγ konnte im Zeitverlauf auf mehreren Ebenen eine Veränderung der 20S Proteasomenpopulation beobachtet werden. Das Zytokin hatte Einfluss auf
die Oberflächenladung der 20S Proteasomen, was zu einem veränderten Elutionsverhalten
der 20S Proteasomen führte. Darauf beruhte die Trennung der Gesamtpopulation in vier
Subpopulationen. Weiterhin verstärkte sich die proteolytische Aktivität der Subpopulationen
A, B und C. Schließlich wies die 20S Proteasomenpopulation im Verlauf der IFNγ Stimulation einen unterschiedlich starken, aber kontinuierlichen Zuwachs der Immunountereinheiten
auf. Vor diesem Hintergrund stellte sich die Frage, ob die unterschiedliche Oberflächenladung der 20S Subpopulationen A-D auf Unterschieden in den inkorporierten katalytischen βUntereinheiten beruhte. Dies wurde mittels Western Blot untersucht. Um relative Aussagen
über das Verhältnis zwischen konstitutiver und korrespondierender Immunountereinheit treffen zu können, wurden die Western Blot Signale aller katalytischen β-Untereinheiten densitometrisch ausgewertet. Zunächst wurden die 20S Proteasomen wie oben gezeigt auf die Un61
Ergebnisse
________________________________________________________________________
tereinheit α4 normiert. Anschließend wurden die proteasomalen Untereinheiten β1, β2, β5,
iβ1, iβ2 und iβ5 mit spezifischen Antikörpern nachgewiesen und die Signale densitometrisch
ausgewertet. Die nachgewiesenen Mengen der Immunountereinheiten iβ1, iβ2 und iβ5 wurden als prozentuale Anteile der Summe der gemessenen Signale [konstitutive + korrespondierende Immunountereinheit] dargestellt.
Analog zu den bisherigen Ergebnissen war ein Zuwachs der Immunountereinheiten als Antwort auf eine IFNγ Stimulation auch in den Proteasomenfraktionen nachweisbar. Es wurde
vermutet, dass die Änderung der proteolytische Aktivität und die Akkumulation von 20S Proteasomen mit unterschiedlicher Affinität zum Anionenaustauscher (0) mit einer unterschiedlichen Inkorporation von Immunountereinheiten in 20S Proteasomen der verschiedenen Subpopulationen korrelierte. Die Ergebnisse aus der Western Blot Analysen weisen darauf hin,
dass die isolierten Proteasomenfraktionen einer Gesamt-population bezüglich der Anteile
inkorporierter Immunountereinheiten tatsächlich Unterschiede aufwiesen (Abb. 28).
Der Nachweis der beiden Immunountereinheiten iβ1 und iβ2 war in den Subpopulationen A
und B jeder 20S Proteasomenpopulation jeweils stärker als in den Subpopulationen C und D.
Die Inkorporation dieser Immunountereinheiten war demzufolge mit einer geringeren Affinität zum Anionenaustauscher verbunden. Im Gegensatz dazu war iβ5 in allen Proteasomenfraktionen einer Population zu gleichen Anteilen nachweisbar und bewirkte somit vermutlich keine Änderung der Oberflächenladung des 20S Komplexes.
62
Ergebnisse
________________________________________________________________________
.
Abb. 28: Nachweis und densitometrische Quantifizierung katalytischer β-Untereinheiten
der Proteasomenfraktionen
(A) 150ng jeder Proteasomenfraktion (Kalkulation nach Absorption bei 280 nm) wurden in SDS Gelen getrennt, die
Proteine auf PVDF Membranen transferiert und die Untereinheiten α4, β1, iβ1, β2, iβ2, β5 und iβ5 nachgewiesen. (B)
Die Bandenintensitäten der katalytischen Untereinheiten wurden densitometrisch ausgewertet. Die relativen Anteile jeder
Immunountereinheit an der Gesamtintensität [konstitutive + korrespondierende Immunountereinheit] sind in Prozent
dargestellt (rot). Die Summe der gemessenen Intensitäten eines β/βi Paares entsprach 100%.
Aus dem Zuwachs der Immunountereinheiten konnten Rückschlüsse darüber gezogen werden, welche Strukturvarianten im Verlauf der IFNγ Stimulation in den Subpopulationen ak63
Ergebnisse
________________________________________________________________________
kumulierten. Aufgrund der bevorzugt kooperativen Inkorporation der Immunountereinheiten
(De et al., 2003; Griffin et al., 1998; Kingsbury et al., 2000) und angesichts des hohen Zuwachses aller Immunountereinheiten in der Subpopulation A liegt die Vermutung nahe, dass
die in dieser Subpopulation akkumulierenden Komplexe dem Immunoproteasom zuzuordnen
sind. Der relativ geringere Anteil der Immunountereinheiten iβ1 und iβ2 gegenüber iβ5 in den
Subpopulationen C und D deutete dagegen auf eine Akkumulation intermediärer 20S Proteasomen hin
Die Ergebnisse der 2D Gelelektrophorese wiesen bereits darauf hin, dass die Immunountereinheit iβ5 zu einem größeren Anteil als iβ1 und iβ2 inkorporiert wird und daher ein Teil der
de novo assemblierten 20S Proteasomen einen oder zwei β-Ringe enthalten können, die neben
iβ5 die konstitutiven Untereinheiten β1 und β2 beinhalten (β1/β2/iβ5). Aus den Western
Blots kann abgeleitet werden, dass diese Strukturvariante vermutlich Hauptbestandteil der
Subpopulation D ist, wohingegen in Subpopulation C auf eine Akkumulation von 20S Proteasomen mit einer Kombination der katalytischen β-Untereinheiten iβ1/β2/iβ5 geschlossen
werden konnte.
Die Zuordnung konstitutiver 20S Proteasomen erfolgte über eine Konzentrationsabnahme
der konstitutiven Untereinheiten β1, β2 und β5. In den Fraktionen der Subpopulation B unstimulierter HeLa Zellen waren nahezu keine Immunountereinheiten nachweisbar. Nach 12
und 24stündiger IFNγ Stimulation stieg in Subpopulation B jedoch der Anteil aller Immunountereinheiten an. Zusammen mit dem zunehmend geringeren Flächenanteil des entsprechenden Abschnitts der Chromatographie ließ sich daraus schlussfolgern, dass diese Subpopulation zunächst einen hohen Anteil konstitutiver 20S Proteasomen enthielt, der im Verlauf
der Stimulation jedoch abnahm. Vermutlich spiegelt dieses Ergebnis eine Mischpopulation
aus konstitutiven 20S Proteasomen und de novo assemblierten, Immunountereinheiten enthaltenden, 20S Proteasomen wider. Die Zelle antwortet auf den Impuls eines proinflammatorischen Signals auf proteasomaler Ebene folglich mit der Assemblierung von verschiedenen
Strukturvarianten des 20S Proteasoms, die sich in der Zusammensetzung ihrer katalytischen
β-Untereinheiten voneinander unterscheiden.
3.5.2
Funktionelle Eigenschaften der Proteasomenfraktionen
Die Etablierung einer adaptiven Immunantwort ist mit einem erhöhten Bedarf an geeigneten
Epitopen zur Präsentation auf MHC Klasse I Molekülen verbunden. Zwei bekannte Varianten, dass konstitutive und das Immunoproteasom weisen zum Teil unterschiedliche Schnittpräferenzen für ein gegebenes Epitop auf (Morel et al., 2000; Seifert et al., 2004; Van den
Eynde und Morel, 2001). Aus den vorhergehenden Experimenten kann gefolgert werden,
dass die Heterogenität der 20S Proteasomen im Verlauf der IFNγ Stimulation steigt und mehrere Strukturvarianten induziert werden. Dass dies eine Auswirkung auf die Funktion des 20S
Proteasoms hat, wurde bereits am gesteigerten Umsatz fluorogener Substrate deutlich (0). In
64
Ergebnisse
________________________________________________________________________
vivo könnte eine heterogene Proteasomenpopulation dazu beitragen, eine möglichst breite
Vielfalt MHC Klasse I restringierter Epitope zu generieren.
Es sollte daher untersucht werden, ob sich die Unterschiede in den katalytischen βUntereinheiten der hier untersuchten Subpopulationen des 20S Proteasoms in ihrem Schnittverhalten widerspiegeln, und ob sich daraus funktionelle Konsequenzen ableiten lassen. Auch
der Proteasomen-Aktivator PA28 nimmt Einfluss auf die Schnittpräferenz des Proteasoms,
was z.B. für die Generierung eines MHC Klasse I restringierten Tumorepitops gezeigt wurde
(Sun et al., 2002)(Textoris-Taube et al., 2007). Da eine Assoziation des Aktivators an das Proteasom bereits in unstimulierten HeLa Zellen beobachtet wurde (Abb. 12) hat er zu jeder Zeit
der IFNγ Stimulation einen Einfluss auf die Proteasomenpopulation und muss bei einer Analyse des Schnittverhaltens des Proteasoms mit einbezogen werden.
Als Substrat wurde ein Modellpeptid mit einer Teilsequenz des HCV Core Proteins ausgewählt, das in vitro durch die isolierten 20S Proteasomen prozessiert wird. Der ausgewählte
Sequenzbereich beinhaltet drei potentielle HLA-A2.1 restringierte Epitope, die mit unterschiedlicher Effizienz durch das 20S Proteasom generiert werden. Die vergleichende Analyse
des Schnittverhaltens der 20S Proteasomen wurde anhand des CTL- Epitops
ADLMGYIPLV durchgeführt, für das ein effizienter Transport in das ER nachgewiesen
wurde (Dr. U. Seifert, persönliche Mitteilung). Die immunologische Relevanz dieses Epitops
ist bekannt, da dafür spezifische zytotoxische CD8+ T Lymphozyten im Blut HCV infizierter
Patienten nachgewiesen wurden (Cerny et al., 1995; Gruner et al., 2000). Die Sequenz des
verwendeten HCV Core122 – 165 Peptids ist in Abb. 29 dargestellt.
Abb. 29: Aminosäuresequenz des verwendeten HCV Core122 – 165 Peptids
Das für die Untersuchung gewählte Peptid umfasst die Aminosäuren 122 bis 165 des HCV Core Proteins. Potentielle in
der Sequenz enthaltene Epitope sind unterstrichen. Die zur endoproteolytischen Spaltung des HLA-A2.1 restringierten
Epitops erforderlichen Schnitte nach F131 und V140 sind mit Pfeilen markiert.
3.5.3
In vitro Generierung des HLA-A2.1 restringierten HCV Core Epitops
ADLMGYIPLV
In einem in vitro Prozessierungsansatz wurde analysiert, mit welcher Effizienz das CTLEpitop ADLMGYIPLV durch 20S Proteasomen generiert wird, die nach 0, 8, 12 oder
24stündiger IFNγ Stimulation aus HeLa Zellen isoliert wurden. 0,4µg isolierte 20S Proteasomen (2.2.2.17) wurden in An- oder Abwesenheit von PA28 mit 4µg des HCV Core122-165 Peptids inkubiert. Die prozessierten Fragmente wurden nach der reversed phase HPLC Chromatographie in der ESI-MS identifiziert. Die relativen Mengen des generierten Decamers
65
Ergebnisse
________________________________________________________________________
wurden über eine Integration der Fläche unter dem massenspektrometrischen Peak ermittelt.
In einem weiteren Ansatz wurden die isolierten Proteasomenfraktionen (0) analysiert, um zu
untersuchen, welchen Einfluss die strukturelle Heterogenität der 20S Gesamtpopulationen
auf die Generierung des CTL-Epitops hat. Um einen Vergleich der Prozessierungsansätze
untereinander zu ermöglichen, wurden die detektierten Mengen des Epitops auf den internen
zugesetzten Standard 9GPS normiert. In Abb. 30 sind die gemessenen Intensitäten des Decamers ADLMGYIPLV dargestellt, die nach vierstündiger in vitro Prozessierung mit den einzelnen 20S Proteasomen, in An- oder Abwesenheit von PA28, generiert wurden.
Abb. 30: In vitro Prozessierung des Epitops ADLMGYIPLV durch 20S Proteasomen in
An- und Abwesenheit von PA28
0,4 µg 20S Proteasom der 20S Gesamtpopulation (A) oder der isolierten Proteasomenfraktionen (B) wurden mit oder
ohne PA28 für 4h mit 4µg des HCV Core122 – 165 Peptids inkubiert und das generierte Fragment mittels HPLC-MS detektiert. Die durch 20S Proteasomen (weiß) oder durch die Zugabe von PA28 aktivierte 20S Proteasomen (rot) generierten
Mengen des Decamers ADLMGYIPLV sind als relative gemessene Intensitäten dargestellt. n.d.: nicht definiert.
Nach unterschiedlich langer IFNγ Stimulation wurde das HLA-A2.1 restringierte Epitop
ADLMGYIPLV durch das freie 20S Proteasom in vitro mit geringfügig veränderter Effizienz
generiert. Nach 8 und 12h IFNγ Stimulation wurden leicht verringerte Mengen Epitop detektiert, nach 24h war dagegen eine erhöhte Schnittpräferenz der 20S Gesamtpopulation für das
untersuchte Epitop zu beobachten (Abb. 30A). Dies wies auf einen moderaten, aber nicht
kontinuierlichen Einfluss von IFNγ auf die Schnittpräferenz des freien 20S Proteasoms hin.
Betrachtet man nun die Generierung des Epitops durch die verschiedenen Proteasomenfraktionen einer Gesamtpopulation, so wird deutlich, dass das untersuchte Epitop stets mit
unterschiedlicher Effizienz generiert wurde. Die strukturelle Heterogenität des 20S Proteasoms korrelierte folglich mit einem unterschiedlichen Schnittverhalten. Dies konnte sowohl
bei Proteasomen aus nicht stimulierten als auch aus IFNγ-stimulierten HeLa Zellen beobach66
Ergebnisse
________________________________________________________________________
tet werden, woraus geschlossen wurde, dass eine Heterogenität der Proteasomenpopulation
bereits vor der Stimulation mit IFNγ bestand (Abb. 30B). In unstimulierten Zellen machen
die Immunountereinheiten jedoch noch einen sehr geringen Anteil der katalytischen βUntereinheiten aus. Daher besteht die Möglichkeit, dass auch andere Faktoren, wie posttranslationale Modifikationen oder die Heterogenität innerhalb der Proteasomenfraktion, Einfluss
auf die Funktion des 20S Proteasoms ausüben.
Auch in analogen Subpopulationen führte die Stimulation mit IFNγ zu einer Veränderung der
Schnittpräferenzen. In Subpopulation A konnte nach 12 und 24h insgesamt eine Steigerung
der Schnittpräferenz der 20S Proteasomen in Abwesenheit von PA28 beobachtet werden. Da
angenommen wurde, dass in Subpopulation A hauptsächlich Immunoproteasomen akkumulieren, deutet dies auf eine verbesserte Generierung des CTL-Epitops durch Immunoproteasomen hin. Es wurde weiterhin vermutet, dass zu dieser Subpopulation auch die Proteasomenfraktion B1 zu zählen ist, da IFNγ in diesen Fraktionen eine vergleichbare Veränderung
der Schnittpräferenz gegenüber dem CTL-Epitop bewirkte und eine Zunahme der Immunountereinheiten in vergleichbarer Relation zueinander beobachtet wurde. Für die Subpopulation B, in welcher der Hauptanteil des konstitutiven Proteasoms vermutet wurde, konnte
insgesamt kein eindeutiger Trend im Verlauf der Stimulation festgestellt werden. Demgegenüber verringerte sich die Schnittpräferenz der Proteasomen der Subpopulation C nach 12
bzw. 24h IFNγ Stimulation, was darauf schließen ließ, dass die darin akkumulierenden, iβ1
und iβ5 enthaltenden 20S Proteasomen eine geringere Schnittpräferenz für das untersuchte
Epitop aufwiesen. Die eluierten Proteinmengen in der Anionenaustauschchromatographie
(vergleiche Abb. 23) zeigen, dass die Subpopulationen A und B den größten Anteil der 20S
Gesamtpopulation ausmachen, was eine Erklärung dafür bietet, warum das Schnittverhalten
der 20S Gesamtpopulationen diesen Populationen am meisten entspricht.
In Assoziation mit PA28 wurde das Decamer durch die 20S Gesamtpopulationen verstärkt
generiert. Diese durch PA28 verursachte verstärkte Prozessierung erreichte nach 12h ein Maximum und nahm nach 24h wieder ab (Abb. 30A). Auch dieses Ergebnis wird von den analogen Proteasomenfraktionen reflektiert und deutet auf eine diskontinuierliche Veränderung der
20S Proteasomenpopulation durch IFNγ hin. 20S Proteasomen der Subpopulationen A und
B wurden durch PA28 zu jedem untersuchten Zeitpunkt der IFNγ Stimulation aktiviert. Dabei war der Einfluss nach 12h IFNγ Stimulation stärker als nach 24h. Auf Proteasomen der
Subpopulation C war der Einfluss von PA28 dagegen eher gering. In den Fraktionen B2 und
B3 unstimulierter HeLa Zellen wurde nach Zugabe von PA28 zum in vitro Ansatz sogar eine
verminderte Generierung des Epitops beobachtet (Abb. 30B). Aus diesem Ergebnis geht hervor, dass PA28 auf die Strukturvarianten des 20S Proteasoms einen unterschiedlichen Einfluss hat.
Die Identifizierung IFNγ-induzierter Strukturvarianten des 20S Proteasoms konnte mit den
geringen isolierten Mengen nur indirekt erfolgen, weshalb keine Schlüsse auf ein definiertes
Schnittverhalten einzelner Strukturvarianten gezogen wurden. Die unterschiedliche Generie67
Ergebnisse
________________________________________________________________________
rung des HCV Core CTL-Epitops belegt aber auf funktioneller Ebene, dass die Proteasomenpopulation der Zelle heterogen ist und aus 20S Proteasomen mit unterschiedlichen proteolytischen Eigenschaften besteht. Die Untersuchung der proteolytischen Eigenschaften der
Subpopulationen diente somit einem Nachweis einer IFNγ induzierten funktionellen Plastizität des 20S Proteasoms.
68
Diskussion
________________________________________________________________________
4
Diskussion
4.1
Selbstregulation proteasomaler Komplexe in der Immunantwort
Durch das in allen Eukaryoten hochkonservierte UPS wird der Hauptteil der nicht-lysosomalen
Degradation von Proteinen realisiert. Deletionen einzelner Untereinheiten des 19S Regulators,
des 20S Proteasoms oder des Markerproteins Ubiquitin sind letal (Finley et al., 1987; Hilt und
Wolf, 1995). Dysfunktionen des UPS sind mit unterschiedlichen Krank-heitsbildern assoziiert
(Basler et al., 2006; Dahlmann, 2007; Fehling et al., 1994; Van Kaer et al., 1994), was die Bedeutung des UPS für essentielle Zellfunktionen herausstellt. Die evolutionär jüngeren und IFNinduzierbaren Komponenten des UPS, die Immunountereinheiten und der ProteasomenAktivator PA28, sind für eine grundsätzliche Funktionalität der Zelle nicht essentiell. Mäuse,
die eine Defizienz einer der drei Immunountereinheiten aufweisen, zeichnen sich durch einen
schwachen Phänotyp aus, der sich erst unter immunologischem Stress, wie einer Infektion bzw.
Inflammation, ausprägt. Diese Mausstämme zeichnen sich durch Veränderungen der MHC I
Präsentation oder durch ein verändertes T-Zellrepertoire aus (Basler et al., 2006; Fehling et al.,
1994; Van Kaer et al., 1994). Bei einer Defizienz des Proteasomen-Aktivators wurde bisher kein
Phänotyp beobachtet (Murata et al., 2001). Während also der Ubiquitin-abhängige Abbau von
Proteinen eine essentielle Funktion des UPS ist, stellt die IFNγ-abhängige Induktion einzelner
Komponenten des UPS zunächst eine entbehrliche Modulation dar. Einige Antigene von viralen Pathogenen oder tumorassoziierten Proteinen werden jedoch nur mit Hilfe der Immunountereinheiten oder PA28 generiert, weshalb deren Existenz für die adaptive Immunantwort von
entscheidender Bedeutung sein kann (Cerundolo et al., 1995; Sijts et al., 2000; Textoris-Taube
et al., 2007).
Das 26S Proteasom reguliert die physiologische Konzentration vieler Proteine über den Ubiquitin-abhängigen Abbau. Damit kann das Konzentrationsgleichgewicht von Enzymen oder interagierenden, stimulierenden bzw. inhibitorischen Proteinen reguliert werden. Dies kann bei
Signaltransduktionsprozessen, die auch zum Auslösen einer Immunantwort erforderlich sind,
eine entscheidende Rolle spielen. Der Transkriptionsfaktor NF κB, der durch das proinflammatorische Zytokin TNFα aktiviert wird, induziert die Expression von Proliferationsfaktoren und
Genen des Akutphasesystems sowie der Stressantwort im Rahmen der angeborenen Immunität.
Zur Freisetzung des Transkriptionsfaktors NF κB ist jedoch die Ubiquitin-abhängige Degradation des Proteins IκBα notwendig (Palombella et al., 1994). Auch die Expression einiger Proteine der MHC Klasse I Präsentation wird in synergistischer Weise durch NF κB und den durch
IFNγ induzierten Transkriptionsfaktor IRF-1 gesteigert (Paludan, 2000). Das 26S Proteasom
wird also zu einer Etablierung einer Immunantwort benötigt, und eine Senkung der intrazellulären Konzentration des 26S Proteasoms als Antwort auf proinflammatorische Zytokine wie Typ
I und II Interferone wäre hierbei, soweit derzeit bekannt, kontraproduktiv. Überraschenderwei69
Diskussion
________________________________________________________________________
se wurde jedoch beobachtet, dass nach 48stündiger IFNγ Stimulation das Gleichgewicht zwischen 26S Proteasom und 20S-PA28 Komplexen in Richtung der 20S-PA28 Komplexe verschoben ist (Bose et al., 2001; Bose et al., 2004). In der hier untersuchten frühen Phase der
IFNγ Stimulation zeichnete sich dieser Prozess allerdings nur sehr schwach ab. In HeLa Zellen
wurde nach einer Stimulation mit dem proinflammatorischen Zytokin IFNγ vereinzelt nach 12
bis 24h eine geringe Abnahme des 26S Proteasoms beobachtet. In murinen Zelllinien wurde
nach einer IFNγ Stimulation mit verschiedenen Antikörpern gegen proteasomale Untereinheiten keine Änderung der Konzentration des 26S Proteasoms detektiert (Abb. 13 und nicht gezeigte Daten). Auch andere Untersuchungen weisen darauf hin, dass die unter IFNγ verstärkte
Interaktion zwischen dem 20S Proteasom und PA28 die Konzentration des 26S Proteasoms
nicht beeinflusst (Yang et al., 1995). Die Diskrepanz dieser Ergebnisse könnte darauf hindeuten, dass der Einfluss von IFNγ auf die Konzentration des 26S Proteasoms unter den hier gewählten Bedingungen der Kurzzeitstimulation kaum detektierbar ist. Die Induktion der Immunountereinheiten durch IFNγ ist konzentrations- und zeitabhängig (Stohwasser und Kloetzel,
1996), und gleiches kann für das Gleichgewicht der Komplexe gelten: Die Inkorporation der
Immunountereinheit iβ5 beeinflusst die Assemblierungskinetik des Proteasoms, was sich auf
die Anzahl der proteasomalen Komplexe auswirken kann. Eine stärkere Abnahme des 26S Proteasoms kann zur Folge haben, dass Signaltrans-duktionsprozesse wie die exemplarisch aufgeführte Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF κB verlangsamt ablaufen oder stagnieren, was
unter anderem zur Folge hätte, dass Mechanismen der angeborenen Immunität unterdrückt
werden. Die Auswirkungen einer Inhibition der NF κB Signaltransduktionswege wird am Beispiel TNF-Rezeptor-defizienter Mäuse deutlich. Diese Tiere versterben im Gegensatz zu Wildtyp-Mäusen nach zweitägiger Infektion mit dem Bakterium Listeria monocytogenes (Strehl et al.,
2006). Auch für den veränderten und vermutlich erhöhten Bedarf an Antigenen, der auch aus
dem Abbau kurzlebiger, polyubiquitinierter Proteinkonjugate gedeckt wird (Reits et al., 2000;
Schubert et al., 2000), ist eine ausreichende Konzentration des 26S Proteasoms notwendig. Es
ist daher unwahrscheinlich, dass der Anteil des 26S Proteasoms in vivo in Gegenwart von IFNγ
oder anderen proinflammatorischen Zytokinen unter eine kritische Grenze sinkt.
Im Gegensatz zur schwachen oder nicht messbaren Abnahme des 26S Proteasoms wurde im
Verlauf der IFNγ Stimulation eine deutlich stärkere und reproduzierbare Zunahme des freien
oder mit PA28 assoziierten 20S Proteasoms beobachtet, die nicht allein aus einer Dissoziation
des 26S Proteasoms resultieren konnte. Andererseits zeigen Bose et al., dass die Gesamtzahl der
20S Proteasomen unter dem Einfluss von IFNγ unverändert bleibt und eine Zu- bzw. Abnahme von 26S Proteasomen und 20S-PA28 Komplexen über eine Phosphorylierung der proteasomalen Untereinheit α7 reguliert wird (Bose et al., 2001; Bose et al., 2004). Die hier gezeigten
Daten weisen jedoch darauf hin, dass IFNγ zusätzlich eine stärkere de novo Synthese des 20S
Proteasoms induziert. Eine verstärkte Biogenese des Proteasoms wird auch bei zellulärem
Stress wie Hitzeschock und einer Inhibition des Proteasoms beobachtet (Meiners et al., 2003).
70
Diskussion
________________________________________________________________________
Sehr wahrscheinlich wird die Biogenese im Kontext einer IFNγ Stimulation durch die Induktion und Inkorporation der Immunountereinheit iβ5 unterstützt, da die Maturierung des 20S
Proteasoms bei Inkorporation der Immunountereinheit iβ5 mit einer vierfach schnelleren Kinetik abläuft als bei der Inkorporation des konstitutiven Homologs β5 (Heink et al., 2005). HeLa
Zellen wiesen im Verlauf der IFNγ Stimulation nach 4h eine verstärkte Inkorporation der Untereinheit iβ5 auf (Zuwachs von 20% auf 80% innerhalb 24stündiger IFNγ Stimulation), was
eine beschleunigte Maturierung ermöglichen und zu einer Zunahme des 20S Proteasoms führen
kann. Für eine verstärkte Biogenese des Proteasoms spricht außerdem, dass die relative Konzentration der proteasomalen Vorläuferkomplexe als Reaktion auf eine IFNγ Stimulation abnimmt (Heink, 2005). Es ist jedoch bisher nicht geklärt, wie der daraus resultierende erhöhte
Bedarf an konstitutiven proteasomalen α- und β-Untereinheiten kompensiert wird. Die
Transkription konstitutiver proteasomaler Untereinheiten wird durch IFNγ nicht induziert
(Heink, 2005). Sofern proteasomale Untereinheiten generell im Überschuss exprimiert und
nicht inkorporierte Untereinheiten wieder degradiert werden, könnte eine höhere Biogenese des
Proteasoms über diesen Überschuss abgedeckt werden (Coux et al., 1996). Für die konstitutiven
Untereinheiten β1 und β5 wurde bereits eine posttranskriptionelle Regulation angenommen, da
deren moderat verringerte Expression der mRNA nach IFNγ Stimulation nicht der wesentlich
geringeren Proteinkonzentrationen entspricht (Belich et al., 1994). Vorausgesetzt dass es sich
um den gleichen Mechanismus handelt, müsste die Regulation der Expression anderer konstitutiver Untereinheiten, für die keine induzierbaren Homologe existieren, eine reziproke Regulation der nicht austauschbaren Untereinheiten des Proteasoms erlauben. Hierfür wären freie proteasomale Untereinheiten eine geeignete Messgröße, die über einen feedback-Mechanismus
wirken könnte. Microarray-Analysen zeigen allerdings, dass nach 6h IFNγ Stimulation noch keine erhöhte Expression der murinen konstitutiven Untereinheiten des Proteasoms erfolgt (Laborinterne Daten). Die potentielle Rolle freier proteasomaler Untereinheiten für die Homöostase des Proteasoms wurden bisher nicht näher untersucht. Eine Bestimmung der
Inkorporationseffizienz und der Konzentration freier proteasomaler Untereinheiten, sowohl in
ruhenden als auch in IFNγ stimulierten Zellen, stellen daher eine notwendige Ergänzung der
hier vorgestellten Daten dar.
Der 19S Komplex und PA28 sind die derzeit am besten charakterisierten Regulatoren des UPS.
Daneben existieren jedoch weitere Regulatoren, deren biologische Funktion bisher nur in Teilen nachvollzogen werden konnte. Hierzu gehört der Proteasomen-Aktivator PA200, der direkt
mit dem Proteasom interagiert (Khor et al., 2006; Rechsteiner und Hill, 2005). Ein anderer Interaktionspartner des Proteasoms, das Protein Ecm29, scheint seinerseits einen stabilisierenden
Einfluss auf das 26S Proteasom auszuüben und sowohl mit dem 19S Komplex als auch mit
dem 20S Proteasom zu interagieren. PA200 und Ecm29 weisen laut Strukturvorhersage ringförmige α-Solenoid-Domänen auf, über welche die Interaktion mit dem α-Ring des Proteasoms
erfolgen soll (Kajava et al., 2004; Leggett et al., 2002).
71
Diskussion
________________________________________________________________________
In der vorliegenden Arbeit wurde mit Antikörpern eine Assoziation der Untereinheit S1 des
Basekomplex mit dem 20S Proteasom in Abwesenheit der ATPase S6a (Rpt5) detektiert. Das
Laufverhalten dieses Komplexes war vergleichbar mit dem freien 20S Proteasom, was auf eine
geringe Größe des assoziierten unbekannten Komplexes schließen lässt und bei dem es sich
nicht um den 19S Regulator handelt. Ähnliche Beobachtungen wurden kürzlich auch von anderen Arbeitsgruppen gemacht (Prof. K.B. Hendil, Prof. M.H. Glickman; persönliche Mitteilungen). Innerhalb des 26S Proteasoms beschränken sich die Interaktionen der Untereinheit S1 auf
die ATPasen S10b und S8 (Rpt4 bzw. Rpt6) sowie die Untereinheit S14 (Rpn12) des Lidkomplexes (Yokota et al., 1996), und die Interaktion des 19S Komplexes mit dem Proteasom wird
ebenso wie das gating nach bisherigen Erkenntnissen durch den ATPase-Ring vermittelt (Smith
et al., 2007). Zwar gehört S1 zum Basekomplex des 19S Regulators, mittels Yeast two Hybrid
Screen konnte bisher aber keine direkte Interaktion zwischen S1 und proteasomalen Untereinheiten nachgewiesen werden (Chen et al., 2008). Mutationen des PSMD1 Gens, welches für die
19S Untereinheit S1 kodiert, resultieren in Saccharomyces cerevisiae in einer gestörten Interaktion
des Basekomplexes mit dem 20S Proteasom (Marques et al., 2007). Dem kann eine veränderte
Konformation oder eine zentrale strukturgebende Rolle der Untereinheit S1 im Basekomplex
zugrunde liegen. Der hier gefundene unbekannte Komplex muss ein weit geringeres Molekulargewicht aufweisen als der 19S Komplex, da er die Migration des 20S Proteasoms in der NativPAGE nicht messbar beeinflusst. Aus der Abwesenheit der ATPase S6a und wurde geschlossen, dass dieser Komplex wahrscheinlich keinen vollständigen ATPase Ring enthält. Leggett et
al. diskutieren, dass die Interaktion zwischen Ecm29 und dem 20S Proteasom redundant zur
Interaktion mit dem ATPase Ring ist (Leggett et al., 2002). Ähnlich könnte auch die Interaktion
zwischen S1 und dem 20S Proteasom erfolgen: Die Untereinheiten S1 und S2 des 19S Komplex enthalten eine PC (Proteasom/Cyclosom) Domäne, die sich durch neun wiederkehrende
α-Helix-Motive auszeichnet. Laut einer Strukturvorhersage bildet diese Domäne eine ringförmige Struktur mit einer Pore von 20Å im Durchmesser, die als α-Tyroid bezeichnet wird und
die eine Verlängerung der proteasomalen Zylinderstruktur darstellen könnte (Kajava, 2002). Es
ist vorstellbar, dass diese ringförmige Domäne der Untereinheit S1 ebenfalls alternativ zu den
ATPasen des Basekomplexes mit dem α-Ring interagiert. Wenn auch die Untereinheit S2, die
ihrerseits in der Lage ist, mit Polyubiquitin-bindenden Proteinen zu interagieren (Hamazaki et
al., 2006; Hartmann-Petersen und Gordon, 2004), und eine Ubiquitinhydrolase Teil des Komplexes sind, wäre ein solcher Komplex zu einer ATP-unabhängigen Degradation polyubiquitinierter oder fehlgefalteter Proteine fähig. Vorraussetzung dafür wäre, dass die Assoziation der
α-Tyroid-Domäne an das 20S Proteasom ein gating des α-Rings ermöglicht. Um die Funktion
des Komplexes zu untersuchen, muss also zunächst dessen genaue Zusammensetzung geklärt
werden. Erste Analysen erfolgten bereits in der Arbeitsgruppe von Prof. K.B. Hendil mittels
2D Gelelektrophorese, und die erhobenen Daten weisen darauf hin, dass neben dem 20S Proteasom und S1 noch andere Proteine in diesem Komplex enthalten sind (Prof. K.B. Hendil,
persönliche Mitteilung). In vitro Analysen mit synthetischen ubiquitinierten Substraten könnten
72
Diskussion
________________________________________________________________________
anschließend Aufschluss darüber geben, ob dieser Komplex eine eigenständige Funktion hat,
wie oben vermutet wurde.
Es ist noch eine andere Funktion für die Interaktion von S1 mit dem 20S Proteasom vorstellbar. Im Verlauf der Adaption an den proinflammatorischen Status wurde S1 in gleichbleibender
Stöchiometrie zum 20S Proteasom aus den leichten Glyceroldichtegradien-tenfraktionen mit
dem Proteasom kopräzipitiert. Deshalb wurde vermutet, dass der Komplex in einem konstanten Verhältnis zum freien 20S Proteasom in der Zelle existiert und dass dessen Zunahme nach
IFNγ Induktion eine Konsequenz der Zunahme des freien 20S Proteasoms ist. In der nativen
Gelelektrophorese wurden beobachtet, dass 20S Proteasomen entweder eine Interaktion mit
PA28 oder mit S1 aufweisen. Sofern die α-Tyroid-Domäne von S1 innerhalb des 19S Komplexes zwischen dem ATPase-Ring und dem α-Ring des Proteasoms Platz findet und gleichzeitig
die Interaktion zwischen den Carboxytermini der ATPasen und dem α-Ring möglich ist (Smith
et al., 2007), könnte S1 auch eine Platzhalterfunktion ausüben, die einen diskreten Anteil des
20S Proteasoms für die Interaktion mit dem 19S Komplex reserviert und die Assoziation von
PA28 verhindert.
4.2
PA28 ermöglicht eine schnelle Anpassung des UPS an die zytokininduzierten Antigenpräsentation
PA28 wurde bereits in unstimulierten Zellen als freier, funktioneller Aktivatorkomplex sowie zu
einem geringeren Anteil als an 20S Proteasomen assoziiert nachgewiesen (Tanahashi et al. 2000,
eigene Ergebnisse). Sowohl die de novo Formierung als auch die Interaktion des Aktivators mit
dem Proteasom wurde durch IFNγ bereits nach 4h induziert. Der weitaus größere Anteil der
Aktivatorkomplexe lag in den vorgestellten Untersuchungen stets als freier Komplex vor. Da
andere Untersuchungen das Verhältnis von freiem zu gebundenem PA28 mit 1:1 bestimmten
(Tanahashi et al., 2000) oder sogar eine vollständige Assoziation von PA28 an das Proteasom
beobachten (Hendil et al., 1998), ist nicht auszuschließen, dass bei der Lyse ein Teil der 20SPA28 Komplexe dissoziiert und deren Anteil in vivo somit tatsächlich höher ist. In beiden Studien kam es im Gegensatz zu den hier vorgestellten Ergebnissen in Gegenwart von ATP nicht
zu einer Dissoziation von 20S Proteasom und PA28. Der hier verwendete Puffer weist bei Zugabe von Mg-ATP eine höhere Mg2+ Konzentration (3,1mM) auf als in den oben genannten
Arbeiten. Damit könnte eine kritische Ionenkonzentration erreicht worden sein, welche 20SPA28 Komplexe destabilisiert. Die Interaktion des Kations Ca2+ mit der KEKE Domäne der
Untereinheit PA28α kann bereits bei 200µM Ca2+ zu einer Inhibition der Aktivierung des 20S
Proteasoms führen. Diese Interaktion wird durch Mg2+ kompetitiert (Realini und Rechsteiner,
1995), was eine Erklärung für den hier beobachteten dissoziativen Einfluss des Mg-ATP bietet
und eine analoge Inhibition des Aktivators durch Mg2+ vermuten lässt. Wenn der hier gezeigte
Effekt des Mg2+ in vivo die gleiche Rolle spielen würde, dann würde die intrazelluläre Mg2+
Konzentration eine Interaktion des 20S Proteasoms mit PA28 wenig wahrscheinlich machen.
Man geht aber davon aus, dass ATP den maßgeblichen intrazellulären Puffer für Mg2+ darstellt
73
Diskussion
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und die freien Magnesiumionen in einer intrazellulären Konzentration von 0,5-1mM vorliegen
(Romani und Scarpa, 2000). Diese Konzentrationen des freien Magnesium dürften in Gegenwart von ATP im hier verwendeten Puffer nicht überschritten worden sein. Da gezeigt wurde,
dass die Präsentation eines PA28-abhängigen Tumorepitops durch eine IFNγ Stimulation induziert wird (Sun et al., 2002), muss die IFNγ induzierte Interaktion zwischen 20S Proteasom und
PA28 auch in vivo stattfinden. Die beobachtete Störung der Interaktion zwischen Proteasom
und PA28 durch Mg-ATP spiegelt damit möglicherweise in vivo keinen relevanten Mechanismus
wider. Der Einfluss des intrazellulären Ca2+ auf die Interaktion zwischen 20S Proteasom und
PA28 ist im Rahmen der angeborenen Immunität dennoch von Interesse, da z.B. eine Aktivierung des TLR2 durch bakterielle Liganden einen Ca2+ Efflux auslöst (Chun und Prince, 2006).
Wie physiologisch die Inhibition der Interaktion zwischen 20S Proteasom und PA28 durch
Ca2+ ist, bleibt allerdings zu klären, da die zytosolische Ca2+ Konzentration mit 0,1 10 µM weit
unter der inhibierenden Konzentration von 200µM liegt (Realini et al., 1994).
Da die Proteasomenpopulation unter dem Einfluss von IFNγ eine strukturelle Veränderung
durchläuft, sollte die Möglichkeit untersucht werden, ob die dabei beobachtete verstärkte Interaktion auf einer strukturspezifischen Affinität des Aktivators zum 20S Proteasom basiert. Bisher ist nur die Affinität rekombinanter PA28-Oligomere zum konstitutiven und zum Immunoproteasom bestimmt worden, wobei keine signifikanten Unterschiede festgestellt wurden
(Stohwasser et al., 2000). In dieser Studie wurden Immunoproteasomen aus Zellen isoliert, die
mit Immunountereinheiten transfiziert wurden und somit Immunoproteasomen in hoher Konzentration enthielten. Andere mögliche, durch IFNγ induzierte Modifikationen des Proteasoms,
die einen Einfluss auf die Interaktion zwischen 20S Proteasom und PA28 haben könnten, waren damit ausgeschlossen. Der hier untersuchte Prozess, die Adaption des Proteasomsystem an
ein inflammatorisches Signal, zeigte jedoch eine dynamische strukturelle Veränderung der Proteasomenpopulation innerhalb einer 24stündigen IFNγ Stimulation, bei der neben Immunoproteasomen weitere Strukturvarianten des Proteasoms akkumulierten. Hinsichtlich der in vitro
Generierung des untersuchten HCV Core CTL-Epitops wurde außerdem beobachtet, dass
PA28 im Verlauf der IFNγ Stimulation das 20S Proteasom unterschiedlich beeinflusst. In HeLa
Zellen war die Interaktion in vivo bereits nach 4h verstärkt, in in vitro Experimenten interagierte
humanes PA28 mit dem 20S Proteasom aus PA28αβ-defizienten MEC Zellen dagegen unabhängig von der Dauer der IFNγ Stimulation dieser Zellen. Zumindest bei Zugabe des Proteasomen-Aktivators im Überschuss haben daher graduelle strukturelle Unterschiede der Proteasomenpopulation in vitro keinen messbaren Einfluss auf die Affinität des ProteasomenAktivators zum Proteasom gezeigt. Möglicherweise wird die Konzentration der 20S-PA28
Komplexe daher über die Menge der vorhandenen 20S und PA28 Komplexe reguliert.
Obwohl für die in vitro Rekonstitution der Interaktion zwischen 20S Proteasom und PA28 der
Aktivator in unphysiologisch hoher Konzentration zugegeben wurde, konnte keine vollständige
Assoziation des 20S Proteasoms mit PA28 beobachtet werden. Dies kann zwar von der Dauer
der in vitro Rekonstitution abhängen, es ist aber auch möglich, dass ein Teil der Proteasomen für
74
Diskussion
________________________________________________________________________
PA28 nicht zugänglich sind, da sie z.B. mit S1 assoziiert sind und die Bindungsstelle für PA28
blockiert ist. Auch andere Proteine könnten den Proteasomen-Aktivator kompetitiv vom αRing des 20S Proteasoms verdrängen. Hierzu gehört der endogene Proteasomen-Inhibitor PI31
(Huang et al., 2002; Zaiss et al., 1999). PI31 erwies sich als besonders effektiv bei der kompetitiven Hemmung einer Interaktion zwischen 20S Proteasom und PA28. Zusammen mit der
Empfindlichkeit der Interaktion zwischen 20S Proteasom und PA28 gegenüber den Kationen
Ca2+ und Mg2+ sowie generell gegenüber hohen Ionenkonzentrationen (Kuehn und Dahlmann,
1996) könnte dies auf eine schwache oder kurzlebige Interaktion zwischen 20S Proteasom und
PA28 hindeuten. Mit einer Erhöhung der proteasomalen Umsatzrate fluorogener Substrate um
den Faktor 10 bis 100 in vitro (Kuehn und Dahlmann, 1996; Ma et al., 1992), zeigt der Aktivator
jedoch ein hohes Potential, auch bei einer niedrigen Interaktionsrate die proteolytische Aktivität
wesentlich zu beeinflussen. Geht man außerdem davon aus, dass die Interaktion zwischen dem
Proteasom und PA28 unter in vivo Bedingungen stärker ausgeprägt ist, kann mit einer noch
stärkeren Potenzierung der proteolytischen Aktivität als in den hier gezeigten Messungen der
proteasomalen Aktivität gerechnet werden. Eine niedrige Affinität des Proteasomen-Aktivators
an das Proteasom könnte dazu führen, dass PA28 Komplexe reversibel mit verschiedenen 20S
Proteasomen interagieren können. Eine solche Eigenschaft des Proteasomen-Aktivators würde
zusammen mit der strukturellen Heterogenität des Proteasoms eine hohe Diversität des proteasomalen Schnittverhalten gewährleisten, da PA28 die Schnittpräferenz der Strukturvarianten
des Proteasoms spezifisch beeinflusst (Kuckelkorn et al., 2002).
Alternativ zur Untereinheiten-Zusammensetzung können Konformationsänderungen des 20S
Proteasoms die Affinität des Proteasomen-Aktivators zum Proteasom beeinflussen. In vitro
wurde die Assoziation von PA28 und dem 20S Proteasom durch den proteasomalen Inhibitor
MG132 induziert (Shibatani et al., 2006). Die Autoren diskutieren, dass die Interaktion des Inhibitors eine Konformationsänderung des Proteasoms bewirkt, welche die Affinität des Proteasoms für PA28 erhöht. Das würde bedeuten, dass sich eine Assoziation des Inhibitors in einer
Konformationsänderung der katalytischen β-Untereinheiten äußert, die sich in den α-Ring fortsetzt. Dass eine Substratbindung generell zu einer Konformationsänderung des 20S Proteasoms
führt, wurde bereits mittels Rasterkraftmikroskop und mit konformations-spezifischen Antikörpern nachgewiesen (Conconi et al., 1999; Osmulski und Gaczynska, 2000). Ein solcher Mechanismus könnte während der Adaption des UPS an den proinflammatorischen Status zum
Tragen kommen, da die IFNγ induzierte Translation kurzlebiger Proteinkonjugate sehr wahrscheinlich in einer höheren Substratbeladung des 20S Proteasoms resultiert und ein größerer
Anteil in der „Substratbindungs-Konformation“ vorliegen sollte. Die maximale Akkumulation
der ubiquitinierten Proteinkonjugate in humanen T2 Zellen (nicht publizierte Daten, Dr. E.
Krüger) korreliert zeitlich mit der verstärkten Interaktion zwischen dem Proteasom und PA28
in HeLa Zellen. Hier wurde mittels Koimmunpräzipitation gezeigt, dass IFNγ vermutlich eine
transient erhöhte Konzentration der Hybridproteasomen zwischen 4 und 12h IFNγ Stimulation
induzierte, und nachfolgend eine verstärkte Interaktion zwischen freien 20S Proteasomen und
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Diskussion
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PA28. Dies könnte den Abbau polyubiquitinierter Substrate zu Peptiden zunächst durch 26S
Proteasomen widerspiegeln, die dann durch freie und mit PA28 assoziierte Proteasomen weiter
prozessiert werden (Bialy, 2006). Hinweise auf eine transiente Induktion von Hybridproteasomen wurden allerdings allein über die Immunpräzipitation des 20S Proteasoms mit einem gegen
die Untereinheit β7 gerichteten Antikörper gewonnen. Eine Koimmunpräzipitation von PA28
mit einem gegen die Untereinheit S14 des 19S Komplexes gerichteten Antikörper war dagegen
nicht erfolgreich (nicht gezeigte Daten), und auch in der nativen Gelelektrophorese wurden
keine Hybridproteasomen detektiert. Es ist daher möglich, dass Hybridproteasomen in vivo verglichen mit 20S-PA28 Komplexen in weit geringerer Konzentration vorkommen.
Obwohl verschiedene Faktoren die Assoziation des Proteasomen-Aktivators an das Proteasom
beeinflussen, ist noch nicht geklärt, ob es dafür eine regulierte Kontrolle in vivo gibt. Auch mit
den bisherigen Daten kann noch keine Aussage über einen solchen konzertierten Mechanismus
getroffen werden. Der mögliche Zusammenhang zwischen Substratbindung des Proteasoms
und der Affinität zu PA28 stellt jedoch einen interessanten Regulationsmechanismus dar. Crosslink-Experimente in Gegenwart oder Abwesenheit von proteasomalen Substraten könnten
hierbei eine erfolgreiche Herangehensweise darstellen. Auch eine Immobilisierung des Proteasoms und eine Bestimmung der Affinität zu PA28 in Gegenwart von Substraten wäre denkbar,
sofern eine Kopplung des Proteasoms an eine Matrix nicht den Zugang zur katalytischen
Kammer behindert.
4.2.1
Eine Rolle für PA28 in der angeborenen Immunantwort
Zellen der angeborenen und adaptiven Immunantwort interagieren mit ihren Zielzellen über die
Erkennung von MHC I Molekülen und die darüber präsentierten Antigenen. Die Sekretion des
proinflammatorischen Zytokins IFNγ von NK Zellen, T Zellen, aber auch von Makrophagen
und dendritischen Zellen induziert die Expression von MHC I Molekülen und deren Stabilisation auf der Zelloberfläche (Boehm et al., 1997). MHC I Moleküle sind außerhalb des PLC erst
durch Beladung mit geeigneten Liganden stabil. Eine höhere Expression der MHC Moleküle
bedingt daher einen höheren Bedarf an Peptidliganden, die durch das UPS bereitgestellt werden
müssen. Eine Nicht-Anpassung des UPS an diesen erhöhten Bedarf wirkt sich limitierend auf
die MHC I Präsentation auf der Zelloberfläche aus (Benham und Neefjes, 1997). Es wurde
gezeigt, dass IFNγ während der Adaption des UPS an den proinflammatorischen Status sowohl
die Expression kurzlebiger Proteinkonjugate (defective ribosomal products, DRiPs) als auch die Ubiquitinierung von Proteinen transient erhöht (Bialy, 2006), womit dem UPS auch eine größere
Substratmenge zur Verfügung steht, aus der MHC I Liganden generiert werden können (Schubert et al. 2000). Die Anforderung, den erhöhten Bedarf an MHC I Liganden zu decken, kann
in Form eines höheren Substratumsatzes des Proteasoms oder einer verbesserten Generierung
geeigneter Liganden realisiert werden. Der Proteasomen-Aktivator PA28 kann hierzu einen
wesentlichen Beitrag leisten, da dessen Assoziation den Substratumsatz des Proteasoms bedeutend steigert (Dubiel et al., 1992; Ma et al., 1992).
76
Diskussion
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Im Gegensatz zum Proteasom, dessen de novo Formierung erst mit der Unterstützung mehrerer
Chaperone erfolgt, assemblieren PA28 Komplexe selbst im rekombinanten System spontan
und bedürfen daher wahrscheinlich keiner weiteren Hilfsfaktoren (Hirano und Murata, 2006;
Zhang et al., 1999). In sofern ist eine Verstärkung der proteasomalen Aktivität durch PA28
schnell und mit geringem Energieaufwand der Zelle umsetzbar. Tatsächlich zeigten die Untersuchungen zur Entwicklung der proteasomalen Aktivität während der IFNγ Stimulation, dass in
Gegenwart von PA28 eine Verstärkung der proteasomalen Aktivität deutlich früher realisiert
wird als in dessen Abwesenheit. In diesem Fall wurde eine Steigerung der chymotrypsinähnlichen Aktivität in humanen Zellen erst mit einer Verzögerung von 12h beobachtet, die wahrscheinlich sowohl auf die höhere Aktivität der humanen 20S Proteasomen als auch auf eine
gesteigerte Konzentration des Proteasoms zurückgeführt werden kann. Eine Beschleunigung
des Substratumsatzes durch das Proteasomsystem kann daher durch PA28 schnell realisiert
werden.
Im Verlauf einer viralen Infektion mit RNA-Viren wie HCV oder CVB3 (Coxsackievirus B3)
kommt es zunächst zu einer Sekretion von Typ I Interferonen (Shin et al., 2007). Im Rahmen
der angeborenen Immunantwort kommen die präsentierenden Zellen vorerst vermehrt mit NK
Zellen in Kontakt. Inhibitorische Rezeptoren, welche die präsentierten MHC I Moleküle erkennen und eine Toleranz der NK Zellen vermitteln können, verhalten sich gegenüber den
präsentierten Antigenen promiskuitiv, weshalb die Anpassung der MHC I Dichte potentieller
Targetzellen auf der Zelloberfläche möglicherweise zunächst eine wichtigere Rolle spielt als die
Generierung spezifischer Antigene. Zum Einfluss des Proteasomsystems auf die Aktivierung
von NK Zellen existieren bisher nur wenige Studien, in denen der proteasomale Inhibitor Bortezomib verwendet wurde. Eine inhibierte oder verminderte Präsentation von MHC I Molekülen kann NK-Zell-Effektorfunktionen induzieren (Pende et al., 1998). Die Inhibition des Proteasoms führt außerdem zu einer verminderten Präsentation von MHC I Molekülen und einer
höheren Empfänglichkeit für NK Zell-vermittelte zytotoxische Effektorfunktionen (Shi et al.,
2008). Ob die Funktion des Proteasomen-Aktivators essentiell für einen Schutz von Effektorfunktionen der NK Zellen ist, bleibt allerdings zu klären, da die proteolytische Kapazität des
Proteasomsystems unter dem Einfluss proinflammatorischer Zytokine auch in Abwesenheit des
Proteasomen-Aktivators induziert wurde. Ein Austausch der konstitutiven gegen die Immunountereinheiten des Proteasoms führt in vitro meist zu einer höheren Umsatzrate von Polypeptiden mit einer Länge von 30 bis 40 Aminosäuren (Strehl et al., 2008), allerdings weisen andere
Abbaukinetiken auch auf einen vergleichbaren Substratumsatz beider Proteasomen hin
(Schwarz et al., 2000). Auch bei der Prozessierung des denaturierten Proteins Enolase-1 generierten konstitutive und Immunoproteasomen zwar unterschiedliche Fragmente, ihr Substratumsatz blieb aber, zumindest nach Aktivierung der Proteasomen durch SDS, annähernd gleich
(Toes et al., 2001). Dies deutet darauf hin, dass eine schnellere Umsatzrate des Immunoproteasoms vom Substrat abhängig ist. Die Inkorporation der Immunountereinheiten des Proteasoms
dient daher wahrscheinlich sowohl einer Veränderung des Antigenrepertoires, bei der die Präfe77
Diskussion
________________________________________________________________________
renz für immunrelevante Epitope verbessert sein kann, als auch der Formierung von Komplexen, die generell eine höhere Aktivität aufweisen. PA28 ist jedoch aufgrund der schnelleren
Induzierbarkeit und seiner stark aktivierenden Eigenschaften ein geeigneter Faktor zur ersten
Anpassung von Zielzellen an die Interaktion mit NK Zellen.
In der vorliegenden Arbeit wurden keine Untersuchungen zur Rolle des UPS bei der Aktivierung von NK Zellen gemacht, aber aufgrund der Tatsache, dass Immunountereinheiten und
PA28 bereits durch Typ I Interferone induziert werden, und dass PA28 die proteolytische Aktivität des Proteasoms innerhalb weniger Stunden in der Inflammation induziert, kann vermutet
werden, dass PA28 eine Form der Anpassung an die angeborene Immunität darstellt. Hierbei
stellt sich allerdings die Frage, welche Rolle die Generierung von Antigenen in der frühen Immunantwort spielt. NK Zellen exprimieren neben den inhibierenden KIR Rezeptoren auch
solche mit aktivierenden Funktionen, ihre Interaktionspartner sind bisher jedoch zum größeren
Teil noch unbekannt (O'Connor et al., 2006). Darüber hinaus scheint es eine Spezifität von NK
Zellen gegenüber den präsentierten MHC I Liganden zu geben (Malnati et al., 1995), und eine
in vitro Studie zeigt, dass diese Spezifität von KIR Rezeptoren ausgehen kann (Rajagopalan und
Long, 1997). Ein interessanter, bisher noch weitestgehend unerforschter Bereich ist daher die
Generierung von Antigenen, welche die Zytotoxizität von NK Zellen beeinflussen können und
eine Funktion für die frühe Präsentation von Epitopen darstellen könnten.
4.3
Adaption des 20S Proteasoms an den proinflammatorischen Status
4.3.1
Die unterschiedliche Inkorporation der Immunountereinheiten bewirkt eine
strukturelle Heterogenität der Proteasomenpopulation
Die Induktion der Immunountereinheiten erfolgt über den IFNγ-induzierbaren Transkriptionsfaktor IRF-1 (Brucet et al., 2004; Foss und Prydz, 1999; Namiki et al., 2005). Die Expression
der murinen Immunountereinheit iβ1 durch IFNγ kann allerdings auch unabhängig von IRF-1
erfolgen (Namiki et al., 2005). Eine konstitutive Expression der humanen Immunountereinheit
iβ1 erfolgt durch nicht phosphoryliertes STAT1 und somit IFNγ-unabhängig (ChatterjeeKishore et al., 2000). In der vorliegenden Arbeit wurde in Abwesenheit von IFNγ eine geringe
Inkorporation aller Immunountereinheiten nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass die Expression der Immunountereinheiten iβ2 und iβ5 unter den Kulturbedingungen auch auf analoge Weise kontrolliert werden könnte. Aber auch eine niedrige Expression von IRF-1 erfolgt
konstitutiv, sodass eine konstitutive Expression der Immunountereinheiten prinzipiell möglich
ist (Levy et al., 1988). Eine differentielle Regulation der Immunountereinheiten kann eine bevorzugte Formierung einzelner Proteasomen-Subtypen zur Folge haben. Hierbei könnten weitere Zytokine, wie TNFα oder Typ I Interferone, eine Rolle spielen und eine für das lokale Zytokinmilieu oder einen bestimmten Zelltyp spezifische Expression der Immunountereinheiten
ermöglichen (Loukissa et al., 2000; Paludan, 2000; Shin et al., 2006). Erst kürzlich wurde eine
78
Diskussion
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gewebespezifisch exprimierte Variante der Immunountereinheit iβ5 entdeckt, die wahrscheinlich eine Rolle bei der T Zell-Selektion im Thymus spielt (Murata et al., 2007).
In der vorliegenden Arbeit erfolgte die Inkorporation der Immunountereinheit iβ5 mit einem
Zuwachs von 58% zu einem deutlich größeren prozentualen Anteil als die Inkorporation der
Immunountereinheiten iβ1 (20%) und iβ2 (nicht densitometrisch bestimmt). Eine basale Inkorporation der Immunountereinheit iβ5 in das 20S Proteasom ist, im Gegensatz zu iβ1 und
iβ2, auch in der murinen B Zelllinie RMA und in verschiedenen Mausorganen beobachtet worden (Frentzel et al., 1993; Strehl et al., 2006). Dagegen wird iβ2 auch nach längerer Induktion
durch IFNγ zu einem wesentlich geringeren Anteil als iβ1 oder iβ5 inkorporiert (Stohwasser
und Kloetzel, 1996). Eine höhere basale Expression von iβ5 ermöglicht eine optimale Anpassung an den proinflammatorischen Status, da die Maturierung von iβ1 und iβ2 enthaltenden
Vorläuferkomplexen zum 20S Proteasom in Gegenwart von iβ5 effizienter erfolgt als in Gegenwart von β5 (Griffin et al., 1998; Kingsbury et al., 2000; Schmidt et al., 1999). Es stellt sich
die Frage, ob die Promotorregion des PSMB8-Gens (iβ5) eine bessere Interaktion auf IFNinduzierte Transkriptionsfaktoren vermittelt als die Promotoren des PSMB9- bzw. PSMB10Gens (iβ1 bzw. iβ2) und es deshalb zu einer ungleichmäßigen Expression und Inkorporation
der Immunountereinheiten kommt. Vergleichende Studien sind diesbezüglich jedoch nicht bekannt.
Theoretisch erfolgt eine Formierung des Immunoproteasoms aufgrund der kooperativen Assemblierung der Immunountereinheiten bevorzugt gegenüber anderen Immuno-untereinheiten
enthaltenden Strukturvarianten des 20S Proteasoms (Groettrup et al., 1997; Nandi et al., 1997).
Diese Kooperativität erweist sich jedoch nicht als stringent und die Formierung von 20S Proteasomen, die zwar die Immunountereinheit iβ5, jedoch entweder iβ2 oder beide anderen Immunountereinheiten nicht enthalten, ist ebenso möglich (De et al., 2003; Kingsbury et al.,
2000). Die Analyse von 20S Proteasomen IFNγ stimulierter HeLa Zellen in der 2D Gelelektrophorese weist auf das Vorhandensein solcher intermediären Proteasomen in einer Gesamtpopulation des humanen 20S Proteasoms in vivo hin (Klare et al., 2007). In der vorliegenden Arbeit wurde ein anderer methodischer Ansatz entwickelt, um die Heterogenität der
Proteasomenpopulation während der Adaption an proinflammatorische Signale zu untersuchen
und Rückschlüsse auf die Funktion der dabei neu formierten 20S Proteasomen zu ziehen. Die
IFNγ-abhängige Änderung des Elutionsprofils der gesamten Proteasomenpopulation wurde
genutzt, um eine Abgrenzung einzelner Subpopulationen des 20S Proteasoms zu ermöglichen.
Die relativen Zunahmen der Immunountereinheiten in diesen Subpopulationen lassen Rückschlüsse über die Struktur der während der IFNγ Stimulation akkumulierenden 20S Proteasomen zu. Aus diesem Ansatz geht hervor, dass die de novo Formierung von iβ5 bzw. iβ5 und iβ1
enthaltenden intermediären 20S Proteasomen und Immunoproteasomen bereits 12h nach Beginn der IFNγ Stimulation beobachtet werden kann. Diese Proteasomen entsprechen von den
Bindungseigenschaften und der Zusammensetzung der β-Untereinheiten her den oben genannten intermediären Proteasomen, die von Klare et al. beschrieben wurden (Klare et al., 2007).
79
Diskussion
________________________________________________________________________
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit deuten allerdings darauf hin, dass verhältnismäßig
mehr Immunoproteasomen als iβ1 und iβ5 oder nur iβ5 enthaltende 20S Proteasomen im Verlauf einer 24stündigen IFNγ Stimulation akkumulieren. Bei Klare et al. sind die Mengenverhältnisse nach drei- und sechstägiger IFNγ Stimulation umgekehrt. Diese Unterschiede können
möglicherweise auf die Anwendung unterschiedlicher Methoden zur Isolation der 20S Gesamtpopulation, aber auch auf die eingesetzte Konzentration und Stimulationsdauer mit IFNγ zurückgeführt werden.
Nach viraler oder bakterieller Infektion und auch bei konstitutiver Expression der Immunountereinheiten in lymphoiden Organen enthalten 20S Proteasomen immer auch einen Anteil konstitutiver katalytischer Untereinheiten (Eleuteri et al., 1997; Khan et al., 2001; Macagno et al.,
1999; Strehl et al., 2006). Die hier im Verlauf der IFNγ Stimulation beobachtete Assemblierung
intermediärer Proteasomen setzt sich demnach wahrscheinlich über den beobachteten Zeitraum hinweg fort. Die Zusammensetzung und die Gesamtgröße der Proteasomenpopulation
wird letztlich auch über die Halbwertszeit der Komplexe und die de novo Formierung von Proteasomen reguliert. Um zu beurteilen, wie sich die Zusammensetzung der Proteasomenpopulation im weiteren Verlauf entwickelt, muss berücksichtigt werden, dass Immunoproteasomen
selbst sowohl eine höhere Assemblierungskinetik als auch eine kürzere Halbwertszeit aufweisen als konstitutive Proteasomen (Heink et al., 2005) und entweder die Halbwertszeit oder die
Effizienz der Biogenese der intermediären Proteasomen wesentlich geringer ist, da sie, wie hier
gezeigt, einen kleineren Anteil der ne novo formierten Proteasomen ausmachen. Ob es nach längerer Stimulation auch zu einer de novo Formierung von konstitutiven Proteasomen kommt,
oder ob die konstitutiven Untereinheiten dann ausschließlich in intermediäre Proteasomen integriert werden, ist nicht bekannt. Die Antwort auf diese Frage würde eine wichtige Aussage
darüber liefern, ob auch konstitutive Proteasomen im proinflammatorischen Milieu assemblieren und ob deren Konzentration stabil gehalten wird.
Die ungleich starke Inkorporation der Immunountereinheiten bedingt einen Einbau konstitutiver katalytischer Untereinheiten und damit eine zunehmende Assemblierung intermediärer Proteasomen, womit freie konstitutive Untereinheiten in den Prozess der durch iβ5 beschleunigten
Maturierung mit einbezogen werden Die im Vergleich zu den Immunountereinheiten iβ1 und
iβ2 stärkere Inkorporation der Untereinheit iβ5 ermöglicht daher in zweifacher Weise die Anpassung des Proteasoms an ein proinflammatorisches Signal. Erstens wird die Gesamtzahl der
Proteasomen erhöht (Heink et al., 2005), und zweitens verursacht die Formierung unterschiedlicher Strukturvarianten eine Veränderung der Proteasomenpopulation, die sich nicht auf den
Austausch vom konstitutiven gegen das Immunoproteasom beschränkt. Damit ist eine höhere
Plastizität der proteolytischen Eigenschaften der Proteasomenpopulation verbunden, was innerhalb kurzer Zeit, nach dem hier untersuchten Modell bereits innerhalb von 24h, in einer
Bereitstellung eines sowohl quantitativ als auch qualitativ größeren Repertoire an MHC I Liganden resultieren kann.
80
Diskussion
________________________________________________________________________
4.3.2
IFNγ-unabhängige strukturelle Unterschiede von Proteasomen-Subtypen
Die Isolation von Proteasomen-Subtypen weist auf Konformationsunterschiede des 20S Proteasoms hin, die über die Inkorporation alternativer katalytischer β-Untereinheiten hinausgehen. T2 Zellen weisen eine Deletion des MHC II Locus auf, die für die Gene
der Immunountereinheiten iβ1 und iβ5 kodiert, und bilden daher konstitutive 20S Proteasomen, die jedoch auch in mehrere Subtypen getrennt werden können (Klare, 2004). Die Affinität
zu den Anionenaustauschern müsste besonders über oberflächenexponierte Bereiche des Proteasoms bestimmt werden. Die theoretischen Einflüsse auf die Bindungseigenschaften sind
vielfältig: Eine partielle Degradation einzelner Untereinheiten kann die Ladungseigenschaften
des Proteasoms ebenso beeinflussen wie posttranslationale Modifikationen. Tatsächlich werden
viele Untereinheiten des Proteasoms in mehrere Subformen mittels 2D Gelelektrophorese getrennt. Die proteasomale Untereinheit α6 z.B. migriert im 2D Gel in bis zu sieben Varianten
mit unterschiedlichen Molekulargewichten und isoelektrischen Punkten. Bei der Identifizierung
der Proteine über den tryptischen Verdau konnten C-terminale Bereiche zum Teil nicht mehr
detektiert werden, und die Berechnung von Molekulargewicht und isoelektrischem Punkt eines
schrittweise C-terminal verkürzten Proteins entspricht exakt den Positionen des Proteins im 2D
Gel (nicht gezeigte Daten). Der C-Terminus der Untereinheit α6 enthält mehrere Asparaginsäure- und Glutaminsäurereste an exponierter Position im Komplex, welche die Affinität des Proteasoms an den Anionenaustauscher beeinflussen könnten. Zudem ist seine Kristallstruktur
nicht definiert, was darauf schließen lässt, dass er keine fest determinierte Struktur besitzt oder
verkürzt sein kann (Groll et al., 2000; Unno et al., 2002). Ein Zusammenhang zwischen IFNγ
Stimulation und einer Trunkierung der Untereinheit α6 wurde nicht festgestellt (nicht gezeigte
Daten). Eine längere Lagerung von 20S Proteasomen scheint diese C-terminale Verkürzung
allerdings zu begünstigen und deutet auf eine Labilität des C-Terminus hin (laborinterne Beobachtung). Da diese Modifizierung die Ladung der Untereinheit α6 verändert, könnte sie ebenfalls die Affinität des Proteasoms an den Anionenaustauscher beeinflussen. Für die hier gezeigte, im Vergleich zu Klare et al. geringere Auflösung der Proteasomenpopulation in der
Chromatographie hat diese Modifizierung jedoch wahrscheinlich keine messbare Relevanz.
Ebenso können posttranslationale Modifikationen die Oberflächenladung des Proteasoms verändern. Die Phosphorylierung der Untereinheit α7 unterstützt die Assoziation des 19S Komplexes an das 20S Proteasom und ist unter dem Einfluss von IFNγ nur vermindert nachweisbar
(Bose et al., 2001; Bose et al., 2004). Auch die phosphorylierten Serine dieser α-Untereinheit
liegen im C-terminalen Bereich exponiert am 20S Proteasom und können die Affinität des
Komplexes an den Anionenaustauscher beeinflussen. Diese Modifikation tritt wahrscheinlich
nur in substöchiometrischen Mengen auf und würde eine eher geringe Auswirkung auf die Affinität zum Anionenaustauscher haben. Die Phosphorylierung der Untereinheit scheint den
isoelektrischen Punkt des Proteins nicht wesentlich zu verändern, da α7 nach einer in vitro
Phosphorylierung durch die Caseinkinase 2 unverändert im 2D Gel migriert (nicht gezeigte
Daten). Die veränderte Affinität der Proteasomenpopulation an die MiniQ Säule äußerte sich
81
Diskussion
________________________________________________________________________
im Verlauf der IFNγ Stimulation durch die Verschiebung des Gleichgewichts der definierten
Subpopulationen, was mit einer unterschiedlichen Inkorporation der Immunountereinheiten
korrelierte. Die angewendete Methode ist daher wahrscheinlich nicht sensitiv genug, um eine
Änderung der Phosphorylierung der Untereinheit α7 vor dem Hintergrund anderer struktureller
Veränderungen der Proteasomenpopulation zu detektieren. Andere posttranslationale Modifikationen des Proteasoms treten im Zusammenhang mit oxidativem Stress auf, wie z.B. die Modifikation einiger α-Untereinheiten mit 4-Hydroxy-2-Nonenal (HNE) (Bulteau et al., 2001;
Okada et al., 1999) oder Glutathion (Demasi et al., 2001; Demasi et al., 2003). Solche Modifikationen erfüllen wahrscheinlich weniger eine regulatorische Funktion als dass sie eine Folge von
Prozessen der oxidativen Stressantwort sind (Gianazza et al., 2007; Petersen und Doorn, 2004)
und wurden in der vorliegenden Arbeit nicht näher untersucht. Dennoch können auch solche
Modifikationen einen Einfluss auf die Affinität des Proteasoms zu Anionenaustauschern ausüben und zur Ausprägung von Subpopulationen beitragen.
4.4
Modulation der Funktionellen Plastizität des Proteasoms durch
IFNγ
4.4.1
Die strukturelle Heterogenität des Proteasoms bedingt eine funktionelle
Plastizität
Aus der reproduzierbaren Generierung spezifischer Peptide aus dem denaturierten Protein
Enolase-1 durch konstitutive und Immunoproteasomen wurde geschlossen, dass deren Schnittverhalten vorhersagbar ist, und relative Wahrscheinlichkeiten wurden für den Schnitt Cterminal nach fast jeder Aminosäure bestimmt (Toes et al., 2001). Mittlerweile existieren Vorhersageprogramme, mit denen die Präferenz des Proteasoms für Schnitte innerhalb einer Aminosäuresequenz bestimmt werden kann. Die Relevanz einer zutreffenden Vorhersage muss
jedoch experimentell abgesichert werden. Die Ursache hierfür liegt vermutlich zu einen darin,
dass zwar bekannt ist, dass einzelne Aminosäuren innerhalb einer Aminosäuresequenz das
Schnittverhalten des Proteasoms beeinflussen (Beekman et al., 2000; Eggers et al., 1995; Nussbaum et al., 1998), dass dabei jedoch noch keine stringenten Muster erkannt wurden. Zum anderen kann die experimentelle Herangehensweise zur in vitro Prozessierung von MHC I Liganden eine Abweichung von der Vorhersage bedingen, wenn eine heterogene
Proteasomenpopulationen für die Analyse verwendet wird. Funktionelle Unterschiede zwischen
dem konstitutiven und dem Immunoproteasom sind in vielen Studien mit unterschiedlichen
Substraten belegt worden (Toes et al., 2001; Van den Eynde und Morel, 2001), und viele MHC
I restringierten Epitope werden von Immunoproteasomen mit höherer Effizienz generiert als
von konstitutiven 20S Proteasomen (Kloetzel, 2001). Die Präferenz für einen endoproteolytischen Schnitt wird also letztlich von der Zusammensetzung einer Proteasomenpopulation beeinflusst. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Prozessierung von Substraten in der Summe ein Ergebnis der Schnittpräferenzen mehrerer Strukturvarianten des 20S
82
Diskussion
________________________________________________________________________
Proteasoms ist. Im Verlauf der IFNγ Stimulation veränderten sich die proteolytischen Eigenschaften der einzelnen Subpopulationen individuell, was mit der zunehmenden Inkorporation
der Immunountereinheiten zu unterschiedlichen Anteilen korreliert werden konnte. Es muss
also berücksichtigt werden, dass die Generierung eines Epitops in vivo selten ausschließlich
durch eine einzelne Strukturvariante des 20S Proteasoms realisiert wird, da die strukturelle Heterogenität offensichtlich eine funktionelle Plastizität der Proteasomenpopulation bedingt. Hinzu kommt, dass auch PA28 die Generierung von Epitopen durch konstitutive oder Immunoproteasomen unterschiedlich beeinflusst (Kuckelkorn et al., 2002). Aus der in vitro
Prozessierung des HCV Core Epitops geht hervor, dass PA28 auf jede der Subpopulationen
des Proteasoms einen unterschiedlichen Einfluss hat und so ebenfalls wesentlich zu einer funktionellen Plastizität des Proteasoms beitragen kann. In vivo bedeutet dies, dass die Generierung
von MHC I Liganden nicht an die Existenz eines bestimmten Proteasom-Komplexes geknüpft
sein muss, was ein breites Repertoire an MHC I Liganden gewährleisten kann.
Da die Veränderung der funktionellen Eigenschaften keiner kontinuierlichen Entwicklung unterlag, kann sie nicht ausschließlich mit der zunehmenden Inkorporation von Immunountereinheiten begründet werden. Die Heterogenität der Proteasomenpopulation wird noch von
weiteren, bislang unbekannten Faktoren beeinflusst (Dahlmann et al., 2000; Klare et al., 2007).
Es ist daher nicht auszuschließen, dass neben den Strukturvarianten des 20S Proteasoms, die
über die unterschiedliche Zunahme der Immunountereinheiten zugeordnet werden konnten,
noch weitere Varianten induziert werden, die hier nicht detektiert wurden. Da die hier untersuchten Subpopulationen des 20S Proteasoms mit großer Wahrscheinlichkeit keine homogenen
Subtypen des Proteasoms darstellen, ist außerdem noch ein weiteres Modell für das unterschiedliche Schnittverhalten der Proteasomenpopulation denkbar. Die Degradation eines Substrats erfolgt in den meisten Fällen prozessiv, also indem das entfaltete Polypeptid durch das
Innere des 20S Proteasoms geschleust und dabei zu Fragmenten von 3 bis 30 Aminosäuren
Länge prozessiert wird (Kisselev et al., 2002). Für die Analyse der proteasomalen Schnittpräferenz wurden die generierten Epitopmengen zum dem Zeitpunkt an dem das HCV Core122-165
Peptid zu 50% abgebaut worden war, gemessen. Damit war die Wahrscheinlichkeit eines mehrfachen Eintritts der generierten Fragmente in das 20S Proteasom relativ gering. Geht aber man
davon aus, dass bei der in vitro Prozessierung des HCV Core122-165 Peptids ein Wiedereintritt der
Fragmente prinzipiell möglich ist, kann die Generierung des Epitops durch eine heterogene
Proteasomenpopulation auch durch einen sekundären Schnitt von einer Strukturvariante des
Proteasoms erfolgen, der erst durch einen primären Schnitt einer anderen Strukturvariante ermöglicht wird, indem der primäre Schnitt flankierende Aminosäuren entfernt, die den sekundären Schnitt verhindert hätten (Beekman et al., 2000; Eggers et al., 1995; Nussbaum et al., 1998).
Folglich kann die beobachtete funktionelle Plastizität auch durch ein Zusammenspiel verschiedener 20S Proteasomen hervorgerufen werden.
83
Diskussion
________________________________________________________________________
4.5
Die funktionelle Anpassung des Proteasoms an IFNΓ verläuft
nicht progressiv
In der vorliegenden Arbeit wurden wichtige Hinweise auf funktioneller Ebene gefunden, dass
die Adaption des 20S Proteasoms an IFNγ kein progressiv fortschreitender Prozess ist: 1. wurde das HCV Core Epitop ADLMGYIPLV in vitro nach 12stündiger Stimulation zunächst durch
die Assoziation von PA28, nach 24h jedoch zunehmend in Abwesenheit von PA28 verbessert
generiert. 2. ist der Umsatz des fluorogenen Substrats Suc-LLVY-AMC durch Proteasomen der
Zelllinie MEC PA28-/- in Assoziation von PA28 transient erhöht, obwohl die Inkorporation der
murinen Immunountereinheiten einen verminderten Umsatz des fluorogenen Substrats bedingt
(Boes et al., 1994; Kuckelkorn et al., 1995), was erst nach 24h messbar war. Daraus kann abgeleitet werden, dass die Adaption des Proteasoms an den proinflammatorischen Status in einer
bisher nicht geklärten Weise diskontinuierlich verläuft.
Auch bei geringerer IFNγ Konzentration und einer längeren Stimulationsdauer wurde auf
struktureller Ebene eine transiente Veränderung der Proteasomenpopulation beobachtet: Ein
temporär auftretender Subtyp akkumulierte bis zu 72h nach Beginn der Stimulation, war aber
nach 144h nicht mehr nachzuweisen (Klare et al., 2007). Da die Induktion der Immunountereinheiten von der Konzentration des Zytokins abhängig ist (Stohwasser und Kloetzel, 1996),
könnte die in dieser Arbeit eingesetzte zehnfach höhere Konzentration des rekombinanten
IFNγ bereits nach deutlich kürzerer Stimulationsdauer zu einer Induktion der gleichen Komplexe führen wie bei Klare et al.. Möglicherweise entspricht die transient auftretende Strukturvariante des Proteasoms dem hier beobachteten transienten funktionellen Effekt. Messungen der
IFNγ Konzentration während einer Listerieninfektion in verschiedenen Organen zeigen, dass
die lokale Zytokinkonzentration in vivo zwischen 1 und 10ng IFNγ pro Gramm Gewebe (Leber
bzw. Milz) schwanken kann (Strehl et al., 2006), was einer Konzentration von etwa 0,75 und
7,5ng/ml in Lösung entsprechen würde. In der vorliegenden Arbeit wurde rekombinant hergestelltes IFNγ in einer Konzentration von 200U/ml bzw. 10ng/ml eingesetzt, was daher vermutlich einer sehr hohen Konzentration des Zytokins in vivo entspricht. Hieraus ergibt sich, dass
ein niedriges Zytokinlevel in vivo andere Strukturvarianten des Proteasoms in stärkerem Maße
induzieren bzw. die Proteasomenpopulation länger in einem Übergangstatus halten kann als
eine hohe Zytokinkonzentration. In Konsequenz für die Antigenprozessierung bedeutet das,
dass die Generierung eines Epitops auf Zeitfenster beschränkt sein kann, wenn es nur durch
eine spezifische Strukturvariante des 20S Proteasoms generiert wird wie Epitope des Hepatitis
B Virus oder PA28-abhängig wie das Tumorepitop TRP2 (Robek et al., 2007; Sijts et al., 2000;
Textoris-Taube et al., 2007). Die Generierung des hier untersuchten HCV Core Epitops wurde
dagegen im Verlauf der nicht progressiven Adaption an IFNγ jeweils durch unterschiedliche
proteasomale Komplexe realisiert. Die strukturelle Heterogenität des Proteasoms sichert so
möglicherweise die Generierung eines breiten Repertoires an Antigenen auch bei einer niedrigen IFNγ Konzentration. Eine HCV Infektion ist bei chronischem Verlauf häufig von einer
verminderten IFNγ Sezernierung durch CD8+ T Zellen geprägt (Urbani et al., 2002). Eine er84
Diskussion
________________________________________________________________________
folgreiche Ausheilung der Infektion wird dagegen mit einer ausgeprägten T Zellantwort assoziiert (Gruner et al., 2000). Hierfür müssen infizierte Zielzellen in der Lage sein, CTL-Epitope zu
generieren. Das untersuchte HCV Core Epitop, welches sowohl bei schwacher als auch bei
starker IFNγ Stimulation, jeweils durch unterschiedliche proteasomale Komplexe generiert
wird, stellt ein Beispiel für ein Antigen dar, dessen Generierung auch bei einem geringen Inflammationsstatus gesichert zu sein scheint. PA28 spielt bei der frühen Generierung dieses Epitops eine wichtige Rolle, die der Anpassung des 20S Proteasoms an den proinflammatorischen
Status vorgreift. Daraus und aus der Aktivierung der proteasomalen Gesamtaktivität könnte
geschlossen werden, dass PA28 die Adaption des 20S Proteasoms an den proinflammatorischen Status überbrückt.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit haben gezeigt, dass die Adaption des Proteasoms an
einen inflammatorischen Status nicht progressiv erfolgt, und die gewonnenen funktionellen
Daten stellen eine Ergänzung zu der von Klare et al. gefundenen transient induzierten Strukturvariante des Proteasoms dar (Klare et al., 2007). Was diese Variante von anderen unterschiedet,
ist jedoch nicht bekannt. Es ist vorstellbar, dass zu einem frühen Zeitpunkt der Induktion der
Immunountereinheiten, oder bei niedrigem Inflammationsstatus, eine kooperative Assemblierung und die Formierung von Immunoproteasomen noch nicht effizient erfolgt, und dass in
diesem Zeitfenster 20S Proteasomen formiert werden, die im späteren Verlauf zugunsten der
Formierung des Immunoproteasoms nicht mehr gebildet werden. Vielleicht existiert auch eine
zell- oder gewebespezifische Formierung dieser Strukturvariante, was eine Erklärung für das
unterschiedliche Schnittverhalten von 20S Proteasomen bieten kann, deren strukturellen Unterschiede ebenfalls noch nicht vollständig geklärt sind (Kuckelkorn et al. 2002b). Für dessen
Funktion in vivo ist von Interesse, mit welcher Effizienz diese Variante des 20S Proteasoms andere CTL-Epitope generiert, und welche Eigenschaften sie in Assoziation mit PA28 zeigt.
85
Abkürzungsverzeichnis
________________________________________________________________________
Abkürzungsverzeichnis
2D
β2M
A280
AK
zweidimensional
β2-Mikroglobulin
Absorption bei 280nm
Antikörper
-AMC
APS
ATP
Arg
-7-Amido-4-Methylcoumarin
Ammoniumpersulfat
Adenosintriphosphat
Arginin
Asp
BocBSA
bzw.
Asparaginsäure
-t-Butyloxycarbonylbovines Serum Albumin
beziehungsweise
CTL
D
DEAE
DEPC
DMF
DMSO
DNA
DTT
ECL
EDTA
ER
ESI
et al.
FCS
FFE
FPLC
zytotoxischer T-Lymphozyt
Asparaginsäure
Diethylaminoethanol
Diethylpyrocarbonat
N,N-Dimethylformamid
Dimethylsulfoxid
Desoxyribonukleinsäure
Dithiothreitol
enhanced chemiluminescence
Ethylendiamintetraacetat
Endoplasmatisches Retikulum
Elektrospray-Ionisierung
und andere
fötales Kälberserum
free flow electrophoresis
Fast Protein Liquid Chromatography
g
-GGLh
HBV
HCV
HPLC
Hsp60
IFN
IL
IRF
IP
kDa
K
L
LCMV
Erdbeschleunigung
-Glycin Glycin LeucinStunden
Hepatitis B Virus
Hepatitis C Virus
high performance liquid chromatography
Hitzeschockprotein 60
Interferon
Interleukin
interferon regulatory factor
Immunpräzipitation
Kilodalton
Lysin
Leucin
lymphocytärer Choriomeningitis
Virus
-Leucin Leucin Glutamat-
-LLE
86
-LLVYM
m/z
MALDI
-Leucin Leucin Valin TyrosinMethionin
Masse/Ladungs-Verhältnis
Matrix-unterstützte Laserdesorption/Ionisation
Mg
Magnesium
MHC
major histocompatibility complex
min
Minute
MPIIB
Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie
mRNA
messenger Ribonukleinsäure
MS
mass spectrometry
MuLV
murines Leukämievirus
NEPHGE Nonequilibrium pH Gradient
Electrophoresis
n.n.
nicht nachgewiesen
PA28
Proteasomen-Aktivator 28
PAGE
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PBST
phosphate buffered saline with Tween
PLC
peptide loading complex
PMSF
Phenylmethylsulfonylfluorid
pp89
Immediate Early Phosphoprotein 89
PVDF
Polyvinylidenfluorid
rel.
relativ
RT
Raumtemperatur
SDS
Sodium Dodecylsulfat
sec
Sekunden
SucSuccinylSV
Säulenbettvolumen
TAP
transporter associated with antigen processing
TEMED
N, N, N', N'-Tetramethyl-p
ethylendiamin
TFA
Trifluoressigsäure
TNFα
Tumornekrosefaktor α
TOF
time of flight
Tris
Tris(hydroxymethyl)-Aminomethan
U
units
UPS
Ubiquitin-Proteasomsystem
v/v
volume per volume
-VGR-Valin Glycin Arginin
w/v
weight per volume
Y
Tyrosin
z.B.
zum Beispiel
z.T.
zum Teil
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100
Publikationen
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Publikationen
Melanie Rieger, Ilse Drung, Ulrike Seifert, Peter-M. Kloetzel, Ulrike Kuckelkorn“Intermediate
type proteasomes show different proteolytic properties and contribute to a high
diversity of antigenic peptides in the early phase of infection” Posterbeitrag auf der
Herbsttagung der GBM 2007, Hamburg
Melanie Rieger, Ulrike Seifert, Kathrin Textoris-Taube, Ilse Drung, Peter-M. Kloetzel, Ulrike
Kuckelkorn“Proteasomes in the early phase of IFNγ stimulation - delay of
immunoproteasome formation is bridged by PA28” Posterbeitrag auf dem dritten Charité
Zeuthener See Workshop 2007, Zeuthen
Strehl B, Joeris T, Rieger M, Visekruna A, Textoris-Taube K, Kaufmann SH, Kloetzel PM,
Kuckelkorn U, Steinhoff U. “Immunoproteasomes are essential for clearance of Listeria
monocytogenes in nonlymphoid tissues but not for induction of bacteria-specific CD8+
T cells.”J Immunol. 2006 Nov 1;177(9):6238-44.
101
Danksagung
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Danksagung
An erster Stelle möchte ich mich ganz herzlich bei Herrn Prof. Dr. Peter-Michael Kloetzel bedanken, der es mir ermöglichte, in seiner Arbeitsgruppe unter hervorragenden Bedingungen zu
arbeiten und zu diskutieren. Ein ebenso großer Dank gilt Frau Dr. Ulrike Kuckelkorn für die
Überlassung des überaus interessanten Themas, ihre ausgezeichnete Betreuung und ihre ständige Diskussionsbereitschaft. Weiterhin bedanke ich mich bei Herrn Prof. Burkhardt Dahlmann
und Frau Dr. Ulrike Seifert für viele hilfreiche Diskussionen, Ideen und Anregungen.
Ein herzliches Dankeschön geht an Sandra Jäkel und Ilse Drung für ihre unzähligen PA28Spenden (die mit Gold kaum aufzuwiegen sind), an Frau Dr. Katharina Janek, an Kathrin Textoris-Taube und an Christin Keller für ihren Einsatz am MALDI TOF und an der HPLC sowie
an Frau Dr. Ursula Zimney-Arndt für die schicken 2D Gele. Ein nicht geringeres Dankeschön
geht an Ulrike, Sandra und Ben für das Korrekturlesen meiner Arbeit und die Hilfestellungen,
zu einer gelungenen Ausdrucksweise zu finden!
Für viele schöne Stunden im Labor, eine herzliche Atmosphäre und ihre ständige Hilfsbereitschaft möchte ich mich besonders bei Ilse, Britta und Sandra bedanken, ebenso bei den ehemaligen und den jetzigen Doktoranden Ben, Andrea, Sylvia, Melanie, Melanie, Nicole und Tobias,
mit denen ich eine unvergessliche Zeit in- und außerhalb des Labors verbringen durfte.
Ganz besonders möchte ich mich auch bei Herrn Dr. Horst Priefert bedanken, der im Hauptstudium meine große Faszination für die Proteinbiochemie geweckt hat und damit meinem
Weg eine entscheidende Richtung gegeben hat.
Schließlich gilt mein allerherzlichstes Dankeschön denen, die mich persönlich unterstützt und
motiviert haben: meinen Eltern und Jörg.
102
Erklärung
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Eidesstattliche Erklärung
Hiermit versichere ich, die Dissertation selbständig und ohne unerlaubte Hilfe angefertigt zu haben.
Berlin, im Mai 2008
103