Dokument_1

Versuche zum ribosomalen Einbau unnatürlicher Aminosäuren in
Proteine und Untersuchung von Struktur-Funktionsbeziehungen in
thermophilen ATP-Synthasen mittels Spin-markierter Nukleotide
Vom Fachbereich Chemie
der Technischen Universität Kaiserslautern
zur Verleihung des akademischen Grades
Doktor der Naturwissenschaften
genehmigte
DISSERTATION
(D 386)
vorgelegt von
Dipl.-Chem. Dirk Mannweiler
Betreuer: Prof. Dr. Wolfgang E. Trommer
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 3. Juli 2006
Kaiserslautern
2006
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 03. Juli 2006
Promotionskommission:
Vorsitzender:
Prof. Dr. S. Ernst
1. Berichterstatter:
Prof. Dr. W. E. Trommer
2. Berichterstatter:
Prof. Dr. Dr. D. Schrenk
Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von Juni 2000 bis Dezember 2005 an der
Technischen Universität Kaiserslautern.
Herrn Prof. Dr. Trommer danke ich für den mir gewährten Freiraum bei der
Gestaltung des Themas, die Diskussionsbereitschaft bei fachlichen Problemen sowie
die Unterstützung bei der Durchführung der Arbeit
Frau Prof. Dr. Vogel danke ich für die Unterstützung bei den Untersuchungen an der
β-Untereinheit der FOF1-ATP-Synthase des thermophilen Bacillus PS3
Der Wissenschaftler ist verantwortlich für die Erklärung seines Wissens, nicht aber
dafür, wie dieses Wissen angewendet wird.
Edward Teller
Inhaltsverzeichnis
1.
Einleitung ........................................................................................................ 1
1.1
1.1.1
1.1.2
1.1.3
1.1.4
1.1.5
1.2
1.3
1.3.1
1.3.2
1.4
1.4.1
1.4.2
1.5
2.
Translation in Prokaryonten ............................................................................ 1
Transfer-RNA (tRNA) ...................................................................................... 1
Bildung der Aminoacyl-tRNA........................................................................... 3
Wobble Theorie............................................................................................... 4
Das Ribosom .................................................................................................. 5
Mechanismus der Proteinsynthese ................................................................. 6
Ortsspezifischer Einbau unnatürlicher Aminosäuren in Proteine..................... 7
FOF1-ATP-Synthase ...................................................................................... 10
Die F1-ATPase .............................................................................................. 11
Katalytischer Mechanismus .......................................................................... 11
ESR-Spektroskopie....................................................................................... 14
Grundlagen ................................................................................................... 14
Spin-Label..................................................................................................... 20
Matrix-unterstützte Laser-Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie
(MALDI-MS) .................................................................................................. 21
Problemstellung ............................................................................................ 22
3.
Eigene Ergebnisse und Diskussion............................................................... 24
3.1
Synthese einer amber Suppressor tRNA mit Spin-markierter Aminosäure ... 24
3.1.1 Synthese des Cyanomethylesters der Aminosäure HO3007 ........................ 25
3.1.2 Acylierung der aktivierten Spin-Label Aminosäure an
das Dinukleotid pdCpA.................................................................................. 26
3.1.3 Entfernung der tBoc-Schutzgruppe am N-Terminus
der Spin-Label Aminosäure........................................................................... 27
3.1.4 Herstellung und Reinigung der verkürzten tRNA .......................................... 29
3.1.5. Ligation der verkürzten Suppressor tRNA mit dem aminoacylierten
Dinukleotid dpCpA ........................................................................................ 32
3.2
Konstruktion des Expressionsvektors pIVEX2.3MCSMtj1pN-term................ 33
3.2.1 Das Mtj1p-Protein ......................................................................................... 33
3.2.2 Herstellung eines N-terminalen Mtj1p-Fragments......................................... 34
3.3
Ortsspezifischer Einbau einer Spin-markierten Aminosäure in den N-Terminus
des Mtj1p-Proteins ........................................................................................ 37
3.4
Gentechnische Gewinnung und Reinigung der β-Untereinheit
der FOF1-ATP-Synthase des thermophilen Bacillus PS3............................... 40
3.5
ESR-Untersuchungen der β-Untereinheit der FOF1-ATP Synthase des
thermophilen Bacillus PS3 mit 2-N3-2’,3’-SL-ATP ......................................... 43
3.5
Massenspektrometrische Untersuchungen an der β-Untereinheit der
FOF1-ATP-Synthase des thermophilen Bacillus PS3.....................................45
Inhaltsverzeichnis
4
Zusammenfassung .......................................................................................51
5
Material und Methoden ................................................................................. 54
5.1
Material ......................................................................................................... 54
5.1.1 E.coli Stämme............................................................................................... 54
5.1.2 Plasmide ....................................................................................................... 54
5.1.3 Enzyme und Marker ...................................................................................... 54
5.1.4 Medien .......................................................................................................... 55
5.1.5 Chemikalien .................................................................................................. 55
5.1.6 Sonstige Materialien...................................................................................... 56
5.1.7 Geräte ........................................................................................................... 57
5.2
Aufzucht und Lagerung von E.coli................................................................. 58
5.2.1 Autoklavieren ................................................................................................ 58
5.2.2 Flüssigmedien ............................................................................................... 58
5.2.3 Festmedien ................................................................................................... 59
5.2.4 Kulturbedingungen ........................................................................................ 59
5.2.5 Wachstumsmessungen................................................................................. 60
5.3
Allgemeine Arbeitsmethoden ........................................................................ 60
5.3.1 Herstellung kompetenter Zellen .................................................................... 60
5.3.2 Transformation.............................................................................................. 61
5.3.3 Plasmid-Minipräparation ............................................................................... 61
5.3.4 Restriktionsverdau ........................................................................................ 61
5.3.5 Agarose-Gelelektrophorese .......................................................................... 62
5.3.6 DNA-Größenstandards ................................................................................. 63
5.3.7 Konzentrationsbestimmung von Plasmid-DNA ............................................. 63
5.3.8 Isolierung von DNA aus Agarosegelen ......................................................... 64
5.3.9 Reinigung von PCR-Produkten ..................................................................... 64
5.3.10 Ligation von DNA-Fragmenten...................................................................... 64
5.3.11 Rekonstitution und Lagerung von Trypsin Gold ............................................ 64
5.4
Konstruktion des Vektors pIVEX2.3MCSMtj1pN-term................................... 65
5.4.1 Konstruktion des N-terminalen Mtj1p-Fragments mittels PCR ...................... 65
5.4.2 Linearisierung von pIVEX2.3MCS................................................................. 67
5.4.3 Ligation des PCR-Produkts mit linearisiertem Vektor pIVEX2.3MCS............ 68
5.5
Isolierung der β-Untereinheit der FoF1-ATP-Synthase des thermophilen
Bacillus PS3 aus E.coli ................................................................................. 69
5.5.1 Transformation von pUCβ in E.coli................................................................ 69
5.5.2 Expression der β-Untereinheit in E.coli JM109 ............................................. 69
5.5.3 Isolation der β-Untereinheit aus E.coli JM109............................................... 70
5.5.4 Photoaffinitätsmarkierung der β-Untereinheit der FoF1-ATP-Synthase des
thermophilen Bacillus PS3 ............................................................................ 72
5.6
ESR-Studien an der β-Untereinheit der FOF1-ATP-Synthase des thermophilen
Bakteriums PS3 ............................................................................................ 73
5.6.1 Geräteeinstellungen ...................................................................................... 73
5.6.2 Vorbereitung des Proteins für die ESR-Messungen...................................... 73
5.7
Massenspektrometrische Untersuchungen von Peptiden und Proteinen ...... 74
5.7.1 Tryptischer Verdau von Proteinen im SDS-Gel............................................. 74
5.7.2 Vorbereitung von Peptiden und Proteinen für MALDI-MS............................. 75
5.7.3 Geräteeinstellungen ...................................................................................... 76
5.7.4 Kalibrierung................................................................................................... 77
5.8
Synthesen ..................................................................................................... 78
5.8.1 Cyanomethylester von HO3007 .................................................................... 78
Inhaltsverzeichnis
5.8.2 Acylierung von dpCpA mit HO3007............................................................... 78
5.8.3 Entschützen des acylierten Dinukleotids....................................................... 79
6
Abkürzungen................................................................................................. 80
7
Literatur......................................................................................................... 81
1 Einleitung
1
1. Einleitung
1.1 Translation in Prokaryonten
Der Mechanismus der Proteinsynthese wird als Translation bezeichnet, da er das
vierbuchstabige Alphabet der Nukleinsäuren in das völlig andere der Proteine
übersetzt.
Der komplexe Prozess der Translation erfordert ein Zusammenspiel von mehr als
100 Makromolekülen zusätzlich zu tRNA, mRNA und Ribosomen.
In diesem Abschnitt wird die Proteinsynthese in E.coli beschrieben, da diese viele
allgemeingültige Prinzipien aufweist.
1.1.1 Transfer-RNA (tRNA)
Die tRNA fungiert als ein Adaptermolekül. Sie erkennt sowohl das zur Anknüpfung
der richtigen Aminosäure erforderliche Enzym als auch das Codon auf der mRNA.
Die erstmalige Bestimmung der Basensequenz der tRNA gelang Robert Holley
(Holley 1965). Das Molekül besteht aus einem einzelnen Strang von 76
Ribonukleotiden. Am 5'-Ende ist es phosphoryliert, das 3'-Ende trägt eine freie
Hydroxylgruppe. Charakteristisch ist der hohe Gehalt an seltenen Basen wie Inosin,
Pseudouridin, Ribothymin und methylierten Derivaten von Guanosin und Inosin.
Die 3'-OH Gruppe des Adenosinrestes am 3'-Ende ist die Aminosäurebindungsstelle.
In der Mitte des Moleküls befindet sich das Anticodon. Es ist komplementär zu einem
bestimmten Codon auf der mRNA (s. Abbildung 1). So ist die Sequenz GAA
komplementär zu UUC, einem Codon für Phenylalanin.
1 Einleitung
2
Abbildung 1: Basensequenz der Hefe-Alanyl-tRNA (L.Stryer; Biochemie)
Alle bekannten tRNA-Moleküle können in der Form eines Kleeblattes beschrieben
werden, in dem circa 50% der Basen gepaart sind.
Dieses immer gleiche Strukturmerkmal ermöglicht den tRNA's auf fast gleiche Weise
mit Ribosomen, mRNA's und Elongationsfaktoren zu reagieren. So müssen alle
tRNA Moleküle in die A-, P- und E-Stellen der Ribosomen passen, um mit dem
enzymatischen Zentrum, welches die Knüpfung der Peptidbindung katalysiert, in
Wechselwirkung treten zu können.
Die Aufklärung der Raumstruktur der tRNA erfolgte durch die Arbeitsgruppen von
A. Rich und A. Klug (Suddath 1974, Robertus 1974). Ihre voneinander unabhängigen
Arbeiten lieferten eine Vielzahl von Informationen.
Das Molekül besitzt zwei doppelhelikale Abschnitte. Diese Abschnitte stehen
senkrecht aufeinander, dadurch entsteht eine L-Form. In den nichthelikalen
Abschnitten sind die meisten Basen an ungewöhnlichen Wasserstoffbrücken
beteiligt. Diese Wechselwirkungen finden zwischen Basen, die nicht komplementär
sind,
dem
Ribose-Phosphat-Rückgrat
und
einigen
verschiedenen Abschnitten des Rückgrats selbst statt.
Basen
sowie
zwischen
1 Einleitung
3
Die Enden des L werden von der Aminosäurenbindungsstelle (CCA-Ende) und der
Anticodonschleife gebildet. Das bedeutet, dass die Aminosäure in der AminoacyltRNA weit vom Anticodon entfernt ist. (s. Abbildung 2)
Abbildung 2: Skelettmodell der Hefe-Phenylalanyl-tRNA (Sussmann 1978)
1.1.2 Bildung der Aminoacyl-tRNA
Die Bildung einer Peptidbindung zwischen zwei Aminosäuren ist thermodynamisch
ungünstig. Die Überwindung dieser Barriere erfolgt durch die Aktivierung der
Carboxylgruppe der Aminosäuren. Es handelt sich um Aminosäureester, bei denen
die Carboxylgruppe einer Aminosäure mit der 2' bzw. 3'-Hydroxylgruppe der Ribose
am CCA-Ende der tRNA verknüpft ist. Diese Verbindungen werden als AminoacyltRNA bezeichnet.
Die Aminoacyl-tRNA’s sind auch für den Transport der Aminosäuren zum Ribosom
zuständig. Da die Aminosäuren die Codons der mRNA nicht ablesen können, werden
sie von spezifischen tRNA's, die die Codons der mRNA erkennen können, zu den
Ribosomen transportiert.
Die Aktivierung und Bindung der Aminosäuren wird von spezifischen AminoacyltRNA-Synthetasen katalysiert (Hoagland 1957).
1 Einleitung
4
Im ersten Schritt erfolgt die Bildung eines Aminoacyladenylats aus der Aminosäure
und ATP, es entsteht ein Aminoacyl-AMP. Im zweiten Schritt erfolgt die Übertragung
der Aminoacylgruppe des Aminoacyl-AMP auf die tRNA. Es entsteht eine AminoacyltRNA.
Die Aktivierung und die Übertragung für eine bestimmte Aminosäure werden von ein
und derselben Aminoacyl-tRNA-Synthetase katalysiert.
Die Erkennung des richtigen tRNA-Partners erfolgt bei einigen Synthetasen vor allem
durch das jeweilige Anticodon. Bei anderen tRNAs erfolgt die Identifikation nach
mehreren Kriterien. Beispielsweise erkennt die Glutaminyl-tRNA-Synthetase sowohl
das Anticodon als auch den Akzeptorstamm der tRNA(Gln).
1.1.3 Wobble Theorie
Nach einer einfachen Hypothese müsste jede Base eines Codons eine Watson-Crick
Basenpaarung
mit
einer
komplementären
Base
des
Anticodons
eingehen,
vorausgesetzt, dass ein bestimmtes Anticodon nur ein Codon erkennt.
Tatsächlich erkennen einige reine tRNA's mehr als ein Codon. Zum Beispiel bindet
die Hefe-Alanyl-tRNA an die drei Codons GCU, GCC und GCA. Die Codons
unterscheiden sich nur in der dritten Base. Das bedeutet, dass die Erkennung der
dritten Base des Codons manchmal weniger genau erfolgt als die der ersten beiden.
Die Degeneration des genetischen Codes deutet auch darauf hin. XYU und XYC
codieren immer dieselbe Aminosäure, während das bei XYA und XYG meistens der
Fall ist.
Setzt man einige sterische Freiheiten bei der Paarung der dritten Base voraus, dann
erscheinen
folgende
Kombinationen
(engl.: wobble) (Tabelle 1).
plausibel,
wenn
die
Base
"wackelt"
1 Einleitung
5
erste Base
dritte Base
des Anticodons
des Anticodons
C
G
A
U
U
A oder G
G
U oder G
I
U,C oder A
Tabelle 1: Erlaubte Paarungen der dritten Base des Codons nach der WobbleTheorie
1.1.4 Das Ribosom
Das Ribosom ist der Ort der Proteinbiosynthese. Hier erfolgt die Translation der
mRNA-Sequenz in die Proteinsequenz.
Ein E.coli Ribosom ist ein Ribonukleinpartikel mit einer Masse von ca. 2.700 kd,
einem Durchmesser von etwa 20 nm und einem Sedimentationskoeffizienten von
70 S.
Dieser kann in eine kleine (30 S) und in eine große Untereinheit (50 S) dissoziieren.
Die Untereinheiten können in 55 verschiedene Proteine und drei verschiedene RNA's
aufgespalten werden (s. Abbildung 3).
Abbildung 3: Aufspaltung eines Ribosoms in verschiedene Proteine und RNA's
(L. Stryer Biochemie)
Etwa zwei Drittel der Masse eines Ribosoms wird von RNA ausgemacht. Die drei
RNA's (5 S, 16 S und 23 S) sind für die Funktion und Architektur des Ribosoms
1 Einleitung
wichtig.
Die
6
ribosomalen
RNA's
haben eine steuernde Funktion bei der
Proteinbiosynthese.
Zum Beispiel kommt durch Spaltung einer einzigen Bindung in der 16 S-rRNA die
Proteinsynthese zum Erliegen. Außerdem wird die Startstelle auf der mRNA von
einer Sequenz der 16 S-rRNA ausgewählt.
1.1.5 Mechanismus der Proteinsynthese
Durch 3H Markierungsexperimente konnte H. Dintzis (Dintzis 1961) zeigen, dass das
Kettenwachstum bei der Peptidsynthese vom Amino- zum Carboxylende verläuft.
Im Gegenzug wird die mRNA in 5’ Æ 3’-Richtung übersetzt.
Die Translation läuft zeitgleich zur Transcription ab, da die mRNA in E.coli ebenfalls
in 5’ Æ 3’-Richtung synthetisiert wird. Schon kurz nach der Entstehung tritt das 5’Ende der mRNA mit dem Ribosom in Wechselwirkung.
Mehrere Ribosomen können ein mRNA-Molekül gleichzeitig übersetzen. Eine
Gruppe von Ribosomen die ein mRNA-Molekül übersetzt, bezeichnet man als
Polyribosom oder Polysom (s. Abbildung 4).
Abbildung 4: Darstellung eines Polyribosoms (L. Stryer Biochemie)
Die Translation beginnt meist mehr als 25 Nukleotide vom 5’-Ende der mRNA
entfernt. Außerdem sind mRNA's bei Prokaryonten oft polycistronisch, das heißt sie
codieren für mehr als eine Peptidkette.
1 Einleitung
7
1.2 Ortsspezifischer Einbau unnatürlicher Aminosäuren in Proteine
Es sind verschiedene Methoden entwickelt worden, bei denen, unter Ausnutzung der
biosynthetischen Maschinerie der Zelle, unnatürliche Aminosäuren in Proteine
inkorporiert werden. Diese Methoden nutzen die Tatsache aus, dass die Erkennung
von Anticodon und Codon zwischen mRNA und tRNA nahezu unabhängig von der
Struktur der Aminosäure ist, die mit dem 3’-Ende des Akzeptorstamms der tRNA
verknüpft ist. Diese Adaptor Hypothese (Crick 1958) konnte von Chapeville
(Chapeville1962) unter Beweis gestellt werden. Die cysteinyl-tRNACys wurde durch
Reduktion mit H2/Ni in alanyl-tRNAcys umgewandelt. Mit dieser tRNA konnte in vitro
sehr effizient Alanin, unter Erkennung des Codons für Cystein (UGU), in Polypeptide
eingebaut werden. Die chemische Behandlung von tRNAs führte zu einer ganzen
Reihe von Derivaten einfacher Aminosäuren (Johnson 1976).
Der Nachteil dieser Methoden liegt darin, dass die modifizierten Aminosäuren an
allen Stellen eingebaut werden, die vom Anticodon der modifizierten tRNA
vorgegeben sind. Außerdem erfolgt der Einbau der Aminosäurenderivate in
Konkurrenz mit den natürlichen Aminosäuren. Diese Faktoren führen zu einem
heterogenen Produkt.
Die Konsequenz daraus war die Entwicklung von semisynthetischen Methoden, bei
denen verkürzte tRNA’s (fehlender CA-Schwanz am 3’-Ende) enzymatisch mit
chemisch aminoacylierten Dinukleotiden ligiert werden. Zum Beispiel entwickelten
Hecht und Mitarbeiter (Heckler 1984) einen Ansatz, bei dem das Dinukleotid pCpA
chemisch mit Nα-geschützten Aminosäuren acyliert wird. Anschließend erfolgt die
Ligation mit einer verkürzten tRNA. Auch diese Methode hat entscheidende
Nachteile. Die Ausbeute der Aminoacylierung ist unzureichend und das Entfernen
der N-terminalen Schutzgruppe führt zur Hydrolyse der Aminoacylesterbindung.
Eine
generelle
Methode
zur
ortsspezifischen
Einführung
von
künstlichen
Aminosäuren in Peptide wurde 1989 von Schultz und Mitarbeitern vorgestellt (Noren
1989). Dieser Ansatz nutzt die Degeneration der drei Stopp-Codons UAA, UAG und
UGA (sog. Nonsense Codons) aus. Diese Codons codieren keine Aminosäuren
sondern bewirken die Termination der Polypeptidsynthese durch Bindung der release
Faktoren (Crick 1961, Brenner 1965). Da nur ein Stopp-Codon für die Beendung der
Proteinsynthese benötigt wird, stehen zwei Codons zur Verfügung,
die spezifisch für unnatürliche Aminosäuren kodieren könnten (s. Abbildung 5).
1 Einleitung
8
Abbildung 5: Biosynthetische Methode zum ortsspezifischen Einbau unnatürlicher
Aminosäuren in Proteine in vitro. Uaa = unnatürliche Aminosäure
(Schultz 2005)
Es konnte nachgewiesen werden, dass tRNA’s, die das Stopp-Codon erkennen
(amber-Suppressor
tRNA’s),
natürliche
Aminosäuren
effizient
in
Proteine
inkorporieren (Miller 1977, Bossi 1980). Durch Experimente mit [3H]Phe und
α-Hydroxysäuren wurde demonstriert, dass die gewünschte Aminosäure in vitro
selektiv an der Position eingebaut wird, die von dem Codon UAG vorgegeben ist
(Noren 1989, Ellman 1992a).
Für eine hohe Effizienz muss die verwendete tRNA orthogonal zu den
Aminoacyltranferasen des Organismus sein, aus dem das in vitro Translationssystem
gewonnen wird. Das bedeutet, dass die tRNA kein Substrat der anwesenden
Aminoacyltransferasen sein darf, da es sonst zum proof-reading (Deacylierung und
Reacylierung mit der natürlichen Aminosäure) kommt.
Daher wurde eine orthogonale amber-Suppressor tRNA aus der Hefe tRNAPhe für
den Einsatz in E.coli in vitro Translationssystemen modifiziert (Ellman 1992b).
1 Einleitung
9
Die Nukleotide 34-37 der Anticodonschleife wurden durch 5’-CUAA-3’ ersetzt. Mit
Hilfe der runoff Transkription steht die Suppressor tRNA in hohen Ausbeuten zur
Verfügung (Milligan 1987, Noren 1990).
Eine Verbesserung der Methode von Hecht (Heckler 1984) ermöglicht die effiziente
Aminoacylierung orthogonaler
tRNA. Dabei monoacylieren Cyanomethylester
Nα-geschützter Aminosäuren selektiv die 2’,3’-Hydroxy-Gruppe des Dinukleotides
pCpA. Die Schutzgruppen können von der aminoacyl-tRNA (nach der Ligation) unter
milden Bedingungen abgespalten werden (Ellman 1992a). Dieses Aminoacylierungsprotokoll ist relativ unkompliziert und verspricht hohe Ausbeuten sowohl bei der
Aminoacylierung als auch bei der Ligation. Nach dieser Methode wurden eine ganze
Reihe von unnatürlichen Aminosäuren ortsspezifisch in Proteine eingebaut (Ellman
1992b).
1 Einleitung
10
1.3 FOF1-ATP-Synthase
Die FOF1-ATP-Synthase ist an den Plasmamembranen von Bakterien, der inneren
Mitochondrienmembran und den Thylakoidmembranen der Chloroplasten lokalisiert.
Sie katalysiert die Synthese von ATP aus ADP und Pi bei der oxidativen bzw.
Photophosphorylierung. Die dazu notwendige Energie liefert ein Protonengradient,
der durch Elektronentransportprozesse aufgebaut wird.
Der FOF1-ATP-Synthase Komplex besteht aus zwei oligomeren Einheiten, FO und F1
(s. Abbildung 6).
Abbildung 6: Cartoonhafte Darstellung der Raumstruktur der FoF1-ATP-Synthase
Der FO-Teil ist ein hydrophober membranintegraler Proteinkomplex, der den
Protonenkanal bildet. Der F1-Teil ist dagegen ein hydrophiler Proteinkomplex und
trägt die Bindungsstellen für die Synthese und Hydrolyse von Nukleotiden. Trennt
man FO von F1, so verliert F1 die Fähigkeit ATP zu synthetisieren, da die Triebkraft
des Protonengradienten fehlt. Daher bezeichnet man diesen Teil oft als F1-ATPase.
1 Einleitung
11
1.3.1 Die F1-ATPase
Die F1-ATPase aus Bakterien, Mitochondrien und Chloroplasten setzt sich aus fünf
verschiedenen Untereinheiten der Stöchiometrie α3β3γδε zusammen. Die drei α- und
die
drei
β-Untereinheiten
sind
alternierend
um
eine
sechszählige
Pseudosymmetrieachse angeordnet (s. Abbildung 6). In der Symmetrieachse
befindet sich die γ-Untereinheit, die zum Teil aus dem α3β3 Hexamer herausragt und
einen Stiel bildet, der die F1- und FO-Domänen des ATP Synthase-Komplexes
miteinander verbindet.
Alle
F1-ATPasen
besitzen
insgesamt
sechs
Nukleotidbindungsstellen.
Drei
Bindungsstellen sind katalytisch aktiv und werden deshalb als katalytische
Bindungsstellen bezeichnet. Die Nukleotidbindungsstellen befinden sich an den
Grenzflächen zwischen den α- und β-Untereinheiten. Dabei werden die katalytischen
Bindungsstellen größtenteils von den β-Untereinheiten die nichtkatalytischen
Bindungsstellen von den α-Untereinheiten gebildet.
1.3.2 Katalytischer Mechanismus
Die F1-ATPase arbeitet nach dem von Boyer formulierten Binding Change
Mechanismus (Boyer 1973). Anhand der Kristallstruktur von mitochondrialer
F1 konnten Walker und Mitarbeiter diesen Mechanismus weitgehend bestätigen. Für
ihre herausragenden Leistungen zur Erforschung der F1-ATPase erhielten Boyer und
Walker 1997 je zur Hälfte den Nobelpreis für Chemie.
Drei Merkmale charakterisieren den Binding Change Mechanismus:
1.
Die drei katalytischen Bindungsstellen sind im Prinzip identisch,
jedoch sind sie zu keinem Zeitpunkt der Katalyse strukturell und
funktionell äquivalent.
2.
Die Energie des Protonengradienten dient nicht zur Synthese
von
ATP,
sondern
zur
Freisetzung
von
ATP
aus
der
Bindungstasche, in der es spontan aus ADP und Pi gebildet wird.
Die Bindungstasche geht dabei von der tight in die loose
Konformation über.
1 Einleitung
12
3.
Die
drei
Prozesse
Produktfreisetzung
Substratbindung,
laufen
zeitgleich
an
Katalyse
und
verschiedenen
Bindungsstellen ab.
Die Bindungsstellen sind um 120° versetzt angeordnet und wechseln periodisch
zwischen drei verschiedenen Konformationen.
Nach ihrer unterschiedlich starken Affinität für Nukleotide werden die Konformere als
O (open), T (tight) oder L (loose) bezeichnet.
Durch Energiezufuhr wird die Konformationsänderung induziert und somit die Affinität
der Bindungsstelle für Nukleotide verändert. Das erste katalytische Zentrum beginnt
in der unbesetzten O-Form, das zweite in der katalytisch inaktiven L-Form und das
dritte in der T-Form, die das Substrat fest bindet und katalytisch aktiv ist. Wenn man
ein Enzymmolekül betrachtet, welches ATP im T-Zentrum gebunden hat, so werden
ADP und Pi an das L-Zentrum binden. Die Energie aus dem Protonenfluss wandelt
das T- in ein O-Zentrum, das L- in ein T-Zentrum und das O- in ein L-Zentrum um.
Diese Umwandlungen ermöglichen die Freisetzung von ATP aus dem neuen OZentrum und die Synthese von ATP aus ADP und Pi im neuen T-Zentrum. Danach
kann der Zyklus von Neuem beginnen (s. Abbildung 7).
Abbildung 7: Binding Change Mechanismus der FOF1ATP-Synthase
(L. Stryer Biochemie)
Eine Weiterführung des Modells ergab, dass die Konformationsänderungen der
Bindungsstellen
durch
die
Rotation
einer
asymmetrischen
Gruppe
von
Untereinheiten, relativ zum Rest des Enzyms, verursacht werden.
Durch Experimente der Arbeitsgruppe von Yoshida konnte dieses Modell bestätigt
werden (Noji 1997). Es gelang eine direkte Beobachtung der Rotation. Dazu wurden
fluoreszenzmarkierte Actinfilamente mit der γ-Untereinheit verknüpft und das
α3β3-Hexamer
mit
Histidin-Tags
an
einer
nickelbeschichteten
Glasplatte
immobilisiert. Unter Hydrolysebedingungen konnte die Rotation direkt unter dem
Fluoreszenzmikroskop beobachtet werden (s. Abbildung 8).
1 Einleitung
Abbildung 8: Das zur Beobachtung der Rotation der γ-Untereinheit der F1-ATPase
benutzte System (Noji 1997)
13
1 Einleitung
14
1.4 ESR-Spektroskopie
Die Elektronenspinresonanz- (ESR-)Spektroskopie ist eine „schnelle“ Messmethode,
deren Zeitfenster, in dem dynamische Prozesse beobachtet werden können, bei ca.
10-11 bis 10-7 Sekunden liegt. Bei der speziellen Methode der Sättigungstransfer-ESR
erreicht man sogar bis 10-3 Sekunden. Ebenso wie die Kernspinresonanz ist auch die
ESR eine Absorptionsmethode, das heißt, das zu untersuchende Molekül nimmt
Energie in Form von elektromagnetischer Strahlung auf. Die zu untersuchende
Substanz muss dazu paramagnetische Gruppen enthalten. In der Biochemie sind im
Wesentlichen drei Arten von Interesse:
a) Übergangsmetalle, z. B. in Proteinen und Enzymen
b) freie Radikale, z. B. als Zwischenstufe bei der lichtinduzierten Reaktion der
Photosynthese sowie Coenzyme wie Flavine und Semichinone (z. B.
Ubichinon und Plastochinon)
c) Spinsonden, das sind stabile organische Radikale, die meist an
Biomoleküle gebunden und in das zu untersuchende System inkorporiert
werden.
1.4.1 Grundlagen
1.4.1.1 Die Resonanzbedingung
Das Elektron besitzt einen Eigendrehimpuls, den so genannten Spin. Der Spin wird
durch die Quantenzahl S = ½ charakterisiert, seine z-Komponente durch die
Quantenzahl ms = + ½ oder ms = - ½ .
Der Spin des Elektrons bewirkt sein magnetisches Moment µE. Dessen z-Komponente µ Ez darf nur die zwei Werte annehmen, die den Spinquantenzahlen ms = + ½
und ms = - ½ entsprechen.
Die Beziehung zwischen µ Ez und ms lautet:
µ Ez = -ms⋅gE⋅µB
(1)
1 Einleitung
15
Dabei ist µB das Bohrsche Magneton und gE eine dimensionslose Zahl, die für ein
freies Elektron 2,0023 beträgt. Der gE Wert von Elektronen in Atomen oder
Molekülen kann von dem des freien Elektrons verschieden sein.
Identifiziert man die Richtung der z-Komponente des magnetischen Moments mit der
eines äußeren Magnetfeldes, so ist µ Ez für das Verhalten des Elektrons im
Magnetfeld verantwortlich.
Ohne ein äußeres Magnetfeld sind die Spinzustände ms = + ½ und ms = - ½ entartet.
Wird aber ein Magnetfeld der Stärke H in z-Richtung angelegt, tritt eine
Wechselwirkung zwischen diesem Feld und dem magnetischen Moment des
Elektrons auf. Dadurch wird die Entartung der beiden Spinzustände aufgehoben.
Diese Aufspaltung ist als Zeeman-Effekt bekannt. Für die Wechselwirkungsenergie
gilt die folgende Formel:
E = µ Ez ⋅H = (ms⋅gE⋅µB)⋅H
(2)
Der Energieunterschied zwischen den beiden bevorzugten Positionen beträgt
E2 – E1 = gE⋅µB⋅H.
(3)
Das bedeutet, dass der Abstand der beiden Zeeman Energieniveaus von der Stärke
des Magnetfeldes H abhängig ist (Abbildung 9).
1 Einleitung
16
Abbildung 9: Oben: Aufspaltung der Spinzustände eines Elektrons in einem
äußeren Magnetfeld der Stärke H.
Mitte: ESR-Signal bei konstanter Frequenz ν und variabler Stärke H
des Feldes.
Unten: Ableitung der Absorptionsintensität nach der Feldstärke H als
Funktion von H. (F. Gerson, Hochauflösende ESR-Spektroskopie)
Übergänge zwischen E1 und E2, bei denen das Elektron seinen Spinzustand ändert,
können mit einer elektromagnetischen Strahlung der Resonanzfrequenz ν angeregt
werden. Diese Frequenz muss der Resonanzbedingung
hν = gE⋅µB⋅H (h = Planck’sches Wirkungsquantum)
(4)
gehorchen.
Damit hängt die Resonanzfrequenz von der Feldstärke H ab. Der Proportionalitätsfaktor zwischen ν und H ist das so genannte gyromagnetische Verhältnis γE:
γE =
ν gE ⋅ µ B
=
H
h
(5)
1 Einleitung
17
1.4.1.2 Hyperfeinstruktur
Ein gut aufgelöstes ESR-Signal eines Radikals in Lösung kann aus mehreren
hundert Linien bestehen. Diese Aufspaltung, die man als Hyperfeinstruktur
bezeichnet, ist unabhängig von der Stärke H des äußeren Magnetfeldes. Sie entsteht
durch die Wechselwirkung zwischen dem ungepaarten Elektron und magnetischen
Kernen im Radikal. Magnetische Kerne sind Kerne, deren Spinquantenzahl I von Null
verschieden ist (1H, 14N).
Die Kernspinmomente der Atome, in deren Umgebung sich das ungepaarte Elektron
befindet, können selbst 2I + 1 Einstellungen im Magnetfeld einnehmen. Des Weiteren
erzeugen sie ein schwaches lokales Magnetfeld, welches das äußere Magnetfeld
verstärkt oder abschwächt. Das Ein-Linien-Signal des Elektrons erhält also eine
Hyperfeinstruktur von 2I + 1 Linien für die Wechselwirkung mit jedem einzelnen Kern
(Abbildung 10).
Abbildung 10: Aufspaltung eines ESR-Signals durch Hyperfein-Wechselwirkung des
Elektrons mit einem Kern der Spinquantenzahl I = ½ (links) oder I = 1
(rechts) (F. Gerson, Hochauflösende ESR-Spektroskopie)
1.4.1.3 Anisotropie
Das Spektrum eines Nitroxidradikals in Lösung zeigt im Idealfall drei äquidistante
Linien gleicher Intensität. Untersucht man jedoch einen Einkristall, so beobachtet
man eine starke Abhängigkeit von der Richtung des Magnetfeldes relativ zur
Orientierung der Nitroxidgruppe. Dieser Effekt ist in Abbildung 11 dargestellt.
Deutlich erkennbar sind stark veränderte Werte der Kopplungskonstanten a und
kleine Abweichungen des g-Faktors.
1 Einleitung
18
Im Falle des isotropen Spektrums gilt
aiso = 1/3 (axx + ayy + azz)
(6)
giso = 1/3 (gxx + gyy + gzz)
(7)
sowie
Betrachtet man keinen Einkristall, sondern eine Probe mit vielen unterschiedlich
orientierten Kristallen, so erhält man ein Pulverspektrum. Dieses bildet die Summe
aus den drei Extremen sowie allen statistisch gewichteten dazwischen liegenden
Orientierungen.
Abbildung 11: Orientierungsabhängigkeit des ESR-Spektrums eines Nitroxidradikals
(H-J. Galla, Spektroskopische Methoden in der Biochemie)
Obwohl auch im isotropen Spektrum statistisch orientierte Moleküle vorliegen,
unterscheiden
sich
die
Spektrenformen
durch
die
unterschiedliche
Rotationsgeschwindigkeit der Radikale stark. Anisotrope Effekte werden durch
ungehinderte Rotation (τ = 1/3 (axx + ayy + azz) < 10-11 s) ausgemittelt.
Einschränkungen der Rotation, die zu einer Erhöhung der Rotationskorrelationszeit τ
führen, bewirken eine Verbreiterung der Linien. Dieser Effekt ist beim Hochfeldsignal
am größten. Prozesse, die die Beweglichkeit einschränken, können die Kopplung an
1 Einleitung
19
ein Makromolekül oder die Erhöhung der Viskosität des Lösungsmittels sein. Der
Effekt der Lösungsmittelviskosität ist in Abbildung 12 dargestellt.
Abbildung 12: ESR-Spektrum eines Nitroxidradikals in Lösungen mit steigender
Viskosität (H-J. Galla, Spektroskopische Methoden in der Biochemie)
Im schwach immobilisierten Bereich ist eine Abnahme der Intensität der feldhöchsten
Hyperfeinlinie zu beobachten. Im mittleren und stark immobilisierten Bereich kommt
es zur Linienverbreiterung. Aus diesem Effekt ergibt sich die Anwendung der ESRSpektroskopie in der Biochemie.
Bindet man Spin-Label an ein Makromolekül, kann man durch Ligandenbindung
induzierte
Konformationsänderungen
untersuchen,
da
sich
dabei
der
Immobilisierungsgrad des Labels und somit auch das ESR-Spektrum verändern.
Die Verknüpfung des Labels mit Liganden dient hauptsächlich zur Untersuchung der
Bindung dieser Substanz an ihre Rezeptoren. Durch Komplexierung des gelabelten
Liganden mit dem entsprechenden Makromolekül wird das Radikal weitgehend
immobilisiert. Die Rotationskorrelationszeiten liegen in der Regel nur wenig unter
denen des Biopolymers. Das ESR-Spektrum zeigt dann praktisch keine Absorption
im Bereich des Hochfeldpeaks des freien Labels. Die Intensitätsabnahme dieses
Peaks ist ein direktes Maß für den gebundenen Anteil des Spin-Label-Liganden. Die
verbliebene Absorption des Peaks liefert die absolute Konzentration des freien
Liganden.
1 Einleitung
20
1.4.2 Spin-Label
Stabile Nitroxide wurden 1968 von Hamilton und McConnell (Hamilton 1968) unter
der Bezeichnung Spin-Label erstmals zur Verwendung als Reportergruppe
beschrieben. Im Unterschied zu reaktiven Zwischenstufen sind diese Radikale
langlebig und durch sterische Abschirmung, wie im klassischen Beispiel des Ditert.butyl-nitroxids, weitgehend vor chemischen Angriffen geschützt. Die Abwesenheit
von α-H-Atomen verhindert auch intramolekulare Zersetzungs-reaktionen. Obwohl
sie
kinetisch
stabilisiert
sind,
reagieren
diese
Substanzen
mit
einigen
Reduktionsmitteln, Organometallverbindungen sowie unter sauren Bedingungen
unter Verlust der Nitroxidgruppe. Trotzdem ist vor allem wegen der bahnbrechenden
Arbeiten von Rozantsev (Rozantsev 1970) eine Vielzahl von Reaktionen bekannt, bei
denen die paramagnetische Gruppe erhalten bleibt.
Während die Piperidin- (TEMPO-) und Pyrrolinradikale als fertige Fragmente
vorliegen, müssen Oxazolidin- (DOXYL-) Gruppen in der Regel am Zielmolekül
aufgebaut werden.
Zum Einbau von Nitroxiden wurden zahlreiche reaktive Gruppen eingesetzt, die den
Spin-Label kovalent an Proteine binden können. Eine vergleichende Übersicht findet
man bei Esmann et al (Esmann 1993).
R
R
O
R1
N
.
O
TEMPO
N
.
O
Pyrrolin-SL
N
.
R2
R2
R1
N
.
O
O
DOXYL
Azethoxyl
Abbildung 13: Verschiedene als Spin-Label eingesetzte Nitroxide
1 Einleitung
21
1.5 Matrix-unterstützte Laser-Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI-MS)
In einem Massenspektrometer werden gasförmige Ionen erzeugt und nach ihrem
Masse/Ladungs-Verhältnis aufgetrennt und detektiert.
Mit der Laser-Desorptions/Ionisations-Massenspektrometrie können Molekulargewichtsbestimmungen von Peptiden und Proteinen durchgeführt werden. Die
MALDI-Massenspektrometrie
zeichnet
sich
durch
eine
hohe
Nachweis-
empfindlichkeit aus. Es können Molekülmassen von bis zu mehreren kDa erfasst
werden. (Hillenkamp 1991)
Zur Analyse wird die Probe mit einer definierten Matrix co-kristallisiert. Die Probe wird
im Hochvakuum des Massenspektrometers einem kurzwelligen Laserimpuls von
wenigen Nanosekunden ausgesetzt. Die Wahl der Matrix richtet sich nach ihrem UVAbsorptionsmaximum, das in den Bereich der Wellenlänge des verwendeten Lasers
fallen muss. Die Matrixmoleküle absorbieren die Energie des Lasers, die für die
Desorption der Ionen notwendig ist. Hierbei relaxiert die in den Matrixmolekülen
gespeicherte elektrostatische Anregungsenergie in das Gitter des Festkörpers. Dies
führt zu einer Störung und Aufweitung der Gitterstruktur. Dadurch werden Matrix- und
Probenmoleküle freigesetzt, die in die Gasphase übertreten und durch den
Laserimpuls ionisiert werden. Die ionisierten Moleküle werden mit Hilfe eines
elektrostatischen
Feldes
in
Richtung
des
Analysators
beschleunigt.
Die
Massenbestimmung erfolgt über die Erfassung der Zeit, die zwischen der Desorption
der Ionen bis zum Eintreffen am Detektor vergeht. Nach der Beschleunigung der
Ionen auf mehrere keV kinetische Energie durchlaufen diese eine feldfreie
Driftstrecke von 0,5 – 2m Länge. Bei gleicher kinetischer Energie haben Ionen
unterschiedlicher
Masse
damit
unterschiedliche
Flugzeiten.
Leichte
Ionen
durchlaufen die Driftstrecke in kürzerer Zeit als schwere Ionen. Durch Vergleich mit
bekannten Referenzmassen ergibt sich aus der gemessenen Flugzeit die Masse des
Probenmoleküls.
Die Methode der Flugzeitmessung wird in Anlehnung an die englische Bezeichnung
als TOF (time of flight) bezeichnet.
2 Problemstellung
22
2. Problemstellung
Im ersten Teil der Arbeit soll mit der amber-Suppressor-Technik, die von Schultz
entwickelt wurde (Schultz 2005) eine geeignete Spin-markierte Aminosäure
ortsspezifisch in ein Protein eingebaut werden. Der Einbau der Aminosäure soll in
der Transmembranregion eines C-terminalen Fragments des humanen Mtj1pProteins erfolgen. Ziel dieses Ansatzes ist es zu untersuchen, ob es tatsächlich
gelingt den Einbau der Spin-markierten Aminosäure mittels ESR-Spektroskopie
nachzuweisen. Bei Erfolg des Experiments erwartet man ein typisches ESRSpektrum eines stark immobilisierten Spin-Labels (s. Abbildung 12). Diese
Untersuchungen sollen den Weg zum mehrfachen Einbau von Spin-LabelAminosäuren in Proteine ebnen, um später Spin-Spin-Abstände in Proteinen
bestimmen zu können.
Mittels Photoaffinitätsmarkierug der F1-ATPase aus Rinderherzen mit dem
Substratanalogon
Verdau
konnte
[β,γ-32P]-2-N3-2’,3’-SL-ATP
P.
Vogel
(Vogel
1992)
und
anschließendem
zeigen,
dass
das
für
tryptischen
Struktur-
Funktionsuntersuchungen eingesetzte Substratanalogon trotz seiner Modifikationen
an Tyr-345 der β-Untereinheit der FOF1-ATP-Synthase bindet. Damit war der Beweis
erbracht, dass das Substratanalogon in der gleichen Weise wie das natürliche
Substrat ATP an die F1-ATPase bindet, da sich Tyr-345 in der katalytischen
Bindungstasche der β-Untereinheit befindet.
In späteren Arbeiten (Burgard 2003) wurde gezeigt, dass auch die isolierte
β-Untereinheit der FOF1-ATP-Synthase des thermophilen Baciilus PS3 kovalent mit
dem Substratanalogon 2-N3-2’,3’-SL-ATP markiert werden kann. Allerdings konnte
nicht geklärt werden, ob das Substratanalogon tatsächlich an die katalytische
Bindungsstelle bindet.
Im zweiten Teil dieser Arbeit soll daher überprüft werden, ob das Substratanalogon
2-N3-2’,3’-SL-ATP auch in der isolierten β-Untereinheit der FOF1-ATP-Synthase des
thermophilen Bacillus PS3 an die katalytische Bindungsstelle bindet. Dazu soll die
β-Untereinheit der FOF1-ATP-Synthase des thermophilen Bacillus PS3 mit dem
2 Problemstellung
23
Substratanalogon 2-N3-2’,3’-SL-ATP kovalent markiert und darauffolgend tryptisch
verdaut werden. Durch die Untersuchung der entstandenen Peptidfragmente mit
MALDI-TOF Massenspektrometrie soll anschließend das Peptidfragment identifiziert
werden, das mit 2-N3-2’,3’-SL-ATP modifiziert wurde. Mit Datenbankanalyse kann
dann geklärt werden, ob das Substratanalogon tatsächlich an das Tyrosin bindet, das
sich in der katalytischen Bindungsstelle befindet. Ist dies tatsächlich der Fall, wäre
der Beweis erbracht, dass die strukturellen Modifikationen des Substratanalogons
auch bei der isolierten β-Untereinheit die Substratbindung nicht beeinflussen und es
daher für weitergehende Untersuchungen als Reportermolekül geeignet ist.
3 Eigene Ergebnisse und Diskussion
24
3. Eigene Ergebnisse und Diskussion
3.1 Synthese einer amber Suppressor tRNA mit Spin-markierter
Aminosäure
Ziel dieses Teils der Arbeit war es, eine amber-Suppressor tRNA herzustellen, an
deren Akzeptorstamm eine Spin-markierte Aminosäure acyliert ist. Mit dieser tRNA
sollen in Peptide Spin-markierte Aminosäuren ortsspezifisch eingebaut werden. Dazu
verwendet man eine messenger-RNA, die eine oder mehrere amber-Mutationen
trägt. Wird das amber-Codon von der Suppressor tRNA erkannt, erfolgt statt des
Abbruchs der Peptidsynthese der Einbau der Spin-markierten Aminosäure in das
Polypeptid.
Zur Synthese wurde folgende Strategie angewendet. Zuerst wurde das Dinukleotid
dpCpA mit der Aminosäure acyliert und anschließend das modifizierte Dinukleotid mit
einer verkürzten tRNA (tRNA-CA) zur vollständigen tRNA ligiert.
Bei der Wahl der Spin-markierten Aminosäure muss darauf geachtet werden, dass
der Spin-Label während des Syntheseprozesses nicht abgespalten wird. Damit
schieden die weit verbreiteten Spin-markierten Cysteine aus, bei denen SH-reaktive
Spin-Label an die Thiolgruppe des Cysteins unter Ausbildung einer Schwefelbrücke
gebunden sind. Grund ist die Schwefel-Schwefel Einfachbindung, die chemisch
unbeständig ist und leicht gespalten werden kann. Daher wurde eine Spin-Label
Aminosäure gesucht, deren Label mit einer Kohlenstoff-Kohlenstoff Bindung an die
Aminosäuren-Seitenkette gekoppelt ist. Eine Aminosäure, die diesen Anforderungen
genügt, wurde freundlicherweise von Prof. K. Hideg (Universität Pécs, Ungarn) zur
Verfügung gestellt. Die Aminosäure ist ein Derivat des Alanins, dessen Seitenkette
mit dem Spinlabel 2,2,5,5-Tetramethylpyrrolin-nitroxid modifiziert ist. Des Weiteren ist
der N-Terminus der Aminosäure mit der tBoc-Gruppe geschützt (s. Abbildung 14). Im
weiteren Verlauf der Arbeit wird diese Aminosäure als HO3007 bezeichnet.
3 Eigene Ergebnisse und Diskussion
25
COOH
NH C
O
N
O
O
.
Abbildung 14: Spin-markierte Aminosäure HO3007
Bevor die Kopplung der Aminosäure mit dem Dinukleotid erfolgen kann, muss die
Aminosäure am Carboxy-Ende aktiviert werden.
3.1.1 Synthese des Cyanomethylesters der Aminosäure HO3007
Zur Aktivierung der Carboxylgruppe wurde die literaturbekannte Methode der
Umsetzung mit Chloracetonitril gewählt (Schwyzer 1955). Dabei entsteht unter
Freisetzung von HCl der entsprechende Cyanomethylester (s. Abbildung 15).
O
C
COOH
O
CH2CN
ClCH2CN
NH Boc
NH Boc
NEt3 / -NEt3.HCl
N
N
.
.
O
O
Abbildung 15: Schematische Darstellung der Synthese des Cyanomethylesters
Dazu wird die Spin-Label Aminosäure auf Eis in Gegenwart von Triethylamin mit
einem
Äquivalent
Chloracetonitril
versetzt.
Anschließend
lässt
man
die
Reaktionslösung über Nacht auftauen. Zur Aufarbeitung werden die entstandenen
Triethylammoniumsalze durch Zentrifugation entfernt und mit Triethylamin extrahiert.
Aus dem Lyophilisat der Triethylammoniumphasen erhält man ein Reinprodukt. Die
Reinheitskontrolle erfolgt mit RP18 DC-Platten und 30%igem, wässrigem Acetonitril
als Laufmittel.
3 Eigene Ergebnisse und Diskussion
26
3.1.2 Acylierung der aktivierten Spin-Label Aminosäure an das
Dinukleotid pdCpA
Der Reaktionsverlauf ist in Abbildung 16 schematisch dargestellt. Außerdem zeigt die
Abbildung den Vorteil der Verwendung des DNA/RNA Hybrid-Dinukleotids pdCpA
anstelle des reinen RNA Dinukleotids pCpA.
Aufgrund des Fehlens der 2‘-OH Gruppe am Cytidylrest kann die Aminosäure nur an
die 2‘-OH bzw. 3’-OH Gruppe der entsprechenden Ribose binden. Eine fehlerhafte
Verknüpfung wird somit ausgeschlossen. Außerdem wird die biologische Aktivität
einer tRNA, die am CCA-Ende dieses Hybrid-Dinukleotid trägt, nicht beeinträchtigt
(Schultz 2005).
O
NH2
H
N
C
C
O
NH O
CH2 CN
NH2
C
N
O
O
-
O
O
P
O
O
N
O
O
-
N
NH2
.
-
O
N
O
O
P
O
O
N
NH2
O
-
N
N
N
DMF, NEt3
O
-
O
P
N
O
N
-
O
O
O
O
P
N
O
N
O
O
OH
OH
O
O
H
R
C
O
C
H
NH O
C
O
Abbildung 16: Schematische Darstellung des Reaktionsverlaufs zur Synthese des
Spin-markierten Dinukleotids
Für die Synthese löst man in der Kälte die aktivierte Spin-Label Aminosäure in
trockenem, frisch destilliertem DMF und einem leichten Überschuss an Triethylamin.
Dazu gibt man einen leichten Überschuss des in DMF gelösten Dinukleotids.
Anschließend taut das Reaktionsgemisch über Nacht auf. Zur Aufarbeitung wird die
Reaktionslösung mit Ethylacetat verdünnt und lyophilisiert. Die anschließende
Reinigung
erfolgt
mittels
Reversed
Phase
HPLC.
Zur
Identifikation
Reaktionsprodukts werden alle Fraktionen ESR-spektroskopisch untersucht.
Man erhält das Spin-markierte Dinukleotid (pdCpA-SLAA) als Reinsubstanz.
des
3 Eigene Ergebnisse und Diskussion
27
Die Fraktion, die das Spin-markierte Dinukleotid enthält, zeigt das typische
ESR-Spektrum eines leicht immobilisierten Spin-Labels mit einem Hochfeld zu
Mittelfeld Verhältnis von 0,83 (s. Abbildung 17).
Abbildung 17: ESR-Spektrum des Spin-markierten Dinukleotids
3.1.3 Entfernung der tBoc-Schutzgruppe am N-Terminus der Spin-Label
Aminosäure
Bevor das Spin-markierte Dinukleotid mit einer verkürzten tRNA ligiert werden kann,
muss die tBoc-Schutzgruppe am N-Terminus der Spin-Label Aminosäure entfernt
werden, da sonst nach dem Einbau dieser Aminosäure in das Protein die
Proteinbiosynthese abbrechen würde. Die häufigste Methode für die Abspaltung
dieser Schutzgruppe ist die Behandlung mit Trifluoressigsäure (TFA).
Dazu löst man das Dinukleotid in DMF und versetzt mit wenig wasserfreier TFA.
Anschließend wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und der Rückstand erneut
in DMF aufgenommen.
Die oft beobachtete irreversible Zerstörung des Spin-Labels in der Gegenwart von
TFA tritt hier nicht auf.
3 Eigene Ergebnisse und Diskussion
28
Zwar sinkt die Radikalkonzentration direkt nach der Zugabe von TFA ab, doch kann
eine fast vollständige Reoxidierung des Radikals beobachtet werden, wie die
nachstehenden Abbildungen eindrucksvoll beweisen.
10.000
8.000
6.000
Intensität
4.000
2.000
0
-2.000
-4.000
-6.000
-8.000
-10.000
3.400
3.420
3.440
3.460
3.480
3.500
magnetic field [G]
Abbildung 18: ESR-Spektrum des Spin-markierten Dinukleotids vor der Zugabe von
Trifluoressigsäure
3.000
2.000
Intensität
1.000
0
-1.000
-2.000
-3.000
3.400
3.420
3.440
3.460
3.480
3.500
magnetic field [G]
Abbildung 19: ESR-Spektrum der selben Probe direkt nach der Zugabe von TFA
3 Eigene Ergebnisse und Diskussion
29
10.000
8.000
6.000
Intensität
4.000
2.000
0
-2.000
-4.000
-6.000
-8.000
3.400
3.420
3.440
3.460
3.480
3.500
magnetic field [G]
Abbildung 20: ESR-Spektrum der obigen Probe 40 min nach TFA Zugabe.
Wie man durch Vergleich der Abbildungen Abbildung 19 und Abbildung 20 erkennt,
steigt die Radikalkonzentration nach 40 min auf etwa 90% des Ausgangswertes an.
Das aminoacylierte Dinukleotid ist entschützt und ESR-aktiv. Im nächsten Schritt
kann es mit einer verkürzten tRNA ligiert werden.
3.1.4 Herstellung und Reinigung der verkürzten tRNA
Zur Darstellung der verkürzten tRNA wurde die Methode der runoff Transkription
verwendet. Eine linearisierte DNA-Matrize wurde mit Hilfe von RNA Polymerase in
die komplementäre RNA transcribiert. Als DNA-Matrize diente das Plasmid pStR1
(Graf 1998). Die cDNA des aus pUC19 gewonnenen Plasmids codiert in der multiple
cloning site stromabwärts zum T7 Promotor für eine am 3’-Ende verkürzte amberSuppressor tRNA (s. Abbildung 21). Am Ende der tRNA-Sequenz befindet sich eine
FokI Restriktionsschnittstelle. Die Sequenz der Suppressor tRNA entspricht, mit
Ausnahme des Anticodons, der E.coli tRNAGly.
3 Eigene Ergebnisse und Diskussion
30
Das Plasmid pStR1 wurde freundlicherweise von Prof. J. Brunner von der
Eidgenössischen Technischen Hochschule Zürich (Schweiz) zur Verfügung gestellt.
Abbildung 21.: Plasmidkarte von pStR1 mit den wichtigsten Restriktionsschnittstellen
3.1.4.1 Linearisierung von pStR1
Für die Linearisierung wird das Plasmid im Reaktionspuffer gelöst und entsprechend
der Plasmidmenge das Restriktionsenzym FokI zugegeben. Der anschließende
Verdau erfolgt bei 37°C. Am Ende des Verdaus wird FokI inaktiviert. Um die
Vollständigkeit des Verdaus zu garantieren, wurde ein Teil des Ansatzes auf ein
Agarosegel
aufgetragen
und
elektrophoretisch
getrennt.
Als
Marker
diente λ-DNA/HindIII.
Wie aus Abbildung 21 ersichtlich ist, trägt pStR1 sechs Schnittstellen für FokI.
Dadurch können sechs Fragmente mit Längen von 108, 181, 244, 287 643, und
1.309 Basenpaaren entstehen. Das aus 1.309 bp bestehende Fragment trägt die
Sequenz der tRNA. Im Agarosegel findet man allerdings nur eine Bande, die dem
Fragment von 1.309 bp Größe entspricht (s. Abbildung 22). Unverdautes Plasmid
wurde nicht dedektiert. Die anderen Fragmente wandern aufgrund ihrer geringen
3 Eigene Ergebnisse und Diskussion
31
Größe bei der Elektrophorese so schnell, dass sie im Gel nicht mehr detektiert
werden können.
1 2 3
Abbildung 22: Gelelektrophorese des mit FokI verdauten Plasmids pStR1
Bahn 1: λ-HindIII-Marker,
Bahn 2: pStR1 unverdaut
Bahn 3: pStR1 verdaut mit FokI
3.1.4.2 Runoff Transkription
Die runoff Transkription wurde mit dem T7-MEGAshortscript Kit der Firma Ambion
durchgeführt.
Das linearisierte Plasmid pStR1, die vier Nukleotidtriphosphate (ATP, CTP, GTP,
UTP)
und
die
T7
RNA-Polymerase
wurden
nach
Herstellerangaben
im
Reaktionspuffer vermischt und je nach eingesetzter DNA Menge für zwei bis vier
Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend erfolgte in der Kälte die Fällung der tRNA
mit Ethanol. Das weiße tRNA Pellet wurde getrocknet und in TE-Puffer
aufgenommen.
Die so erhaltene verkürzte Suppressor tRNA kann bis zur Verwendung bei –78°C
gelagert werden.
3 Eigene Ergebnisse und Diskussion
32
3.1.5. Ligation der verkürzten Suppressor tRNA mit dem aminoacylierten
Dinukleotid dpCpA
Zur Ligation der verkürzten Suppressor tRNA mit dem Dinukleotid wurden die beiden
Substanzen und die T4 RNA Polymerase nach Herstellerangaben im Reaktionspuffer
gemischt und inkubiert. Nach der Reaktion wurde das RNA-Pellet mit Ethanol
ausgefällt und in TE-Puffer resolubilisiert.
Das Reaktionsprodukt ist eine vollständige aminoacylierte Suppressor tRNA die es
ermöglicht,
mittels
amber-Suppression
Aminosäure in ein Protein einzuführen.
ortsspezifisch
eine
Spin-markierte
3 Eigene Ergebnisse und Diskussion
33
3.2 Konstruktion des Expressionsvektors pIVEX2.3MCSMtj1pN-term
3.2.1 Das Mtj1p-Protein
Das Mtj1p-Protein ist das Analogon von Sec63p in Hefe (Dudek 2002). Es
wechselwirkt mit dem Sec62p-Komplex und dem Binding Protein (BiP). Mtj1p kommt
in Pankreas Mikrosomen in niedrigerer Konzentration als Sec63p vor, besitzt aber
eine höhere Affinität zu BiP.
Außer einer lumelnalen J-Domäne besitzt das Protein eine einzelne TransmembranDomäne und eine cytosolische Domäne. Der enge Kontakt der cytosolischen
Domäne mit den translatierenden Ribosomen ermöglicht dem Protein die Modulation
der Translation.
Das Gen des Mtj1p-Proteins wurde in die multiple cloning site (MCS) des
pIVEX2.4MCS Expressionsvektors (s. Abbildung 23) einkloniert und freundlicherweise von Prof. Zimmermann (Universitätsklinikum Homburg) zur Verfügung gestellt.
Abbildung 23: Restriktionskarte des Plasmids pIVEX2.3MCS (Roche Applied
Science)
3 Eigene Ergebnisse und Diskussion
34
3.2.2 Herstellung eines N-terminalen Mtj1p-Fragments
Um eine hohe Effizienz in der in vitro Translation von Mtj1p zu erzielen, sollte ein
N-terminales Fragment des Proteins erzeugt werden, welches eine amber-Mutation
(TAG) anstelle von Phe113 (TAC) besitzt.
Unter Verwendung der Oligonukleotidprimer amber1 und amber2 sowie des Vektors
pIVEX2.3MCSMtj1p wurde mittels PCR ein PCR-Produkt erzeugt, dass N-terminal
eine NdeI-Schnittstelle und C-Terminal eine XhoI-Schnittstelle besitzt.
Die beiden verwendeten Oligonukleotidprimer haben die folgende Sequenz:
amber1
5’- GGG AAT TTC ATA TGT GGG AGA GCG GAG ACC TG-3’
amber2
5’- CCG CTC GAG GTA GAT GGA CCA AAC CAC AGC ATA GTG ACC CAC TGT
GAG AAT AAT CTA CAA GAG-3’
Das PCR-Produkt codiert für ein 137 Aminosäuren langes N-terminales Fragment
des Mtj1p-Proteins. An Position 113 befindet sich anstatt der Aminosäure
Phenylalanin die amber-Mutation.
Nach Aufreinigung des PCR-Produkts mittels des QIAquick PCR Purification Kits
erfolgte der Restriktionsverdau mit den Restriktionsenzymen NdeI und XhoI. Das
entstandene
429
bp
große
Fragment
wurde
im
Anschluss
durch
Agarosegelelektrophorese von Fremd-DNA befreit und mit Hilfe des QIAEX II Gel
Extraction Kits aus dem Agarosegel isoliert. Gleichzeitig wurde der pIVEX2.3MCSVektor ebenfalls mit NdeI und XhoI verdaut, durch Agarosegelelektrophorese
gereinigt und aus dem Gel extrahiert.
Anschließend erfolgte die Ligation des 429 bp Oligonukleotids (Mtj1pN-term) mit dem
3534
bp
großen
linearisierten
pIVEX2.3MCS
mit
T4
DNA
Ligase.
Das
Ligationsprodukt ist der 3963 bp große Vektor pIVEX2.3MCSMtj1pN-term.
Nach Inaktivierung der Ligase erfolgte die Transformation der Ligationslösung in
kompetente E.coli DH5α.
Der erzeugte Vektor pIVEXMtj1N-term codiert für ein 137 Aminosäuren langes
N-terminales Fragment des Mtj1p-Proteins. Zusätzlich befindet sich in der
Transmembranregion anstelle der Aminosäure Phe113 eine amber Mutation. Das für
3 Eigene Ergebnisse und Diskussion
35
das Mtj1p-Fragment codierende Gen wurde so in den pIVEX2.3MCS-Vektor
einkloniert, dass das Transcript C-terminal einen 6-fachen Histidin-Tag (His-Tag)
trägt,
der
eine
Aufreinigung
des
Expressionsprodukts
mittels
Nickel-
Affinitätschromatographie ermöglicht.
Um den Erfolg der Klonierung zu verifizieren, wurde der Vektor mit den
Restriktionsenzymen XbaI und PstI einem Doppelverdau unterworfen. Für beide
Restriktionsenzyme liegt auf dem Vektor jeweils nur eine Schnittstelle vor. Bei
richtiger Orientierung des Inserts (Mtj1pN-term) erhält man zwei Fragmente von
139 und 3.824 bp Größe. Bei falscher Orientierung des Inserts erhält man dagegen
Fragmente von 350 und 3.613 bp Größe.
Nach
Hitzeinaktivierung
der
Restriktionsenzyme
wurde
der
Verdau
mittels
Agarosegelelektrophorese analysiert. Das in Abbildung 24 gezeigte Agarosegel
veranschaulicht den Erfolg der Ligation. In den Bahnen 1 und 2 ist die Ligation
gelungen. Man erkennt eine Bande nahe 4000 bp. Diese repräsentiert das Fragment
von 3824 bp Größe. Das andere zu erwartende Fragment mit einer Größe von 139
bp kann nicht detektiert werden. Die "Gesamtmasse“ der DNA dieses Fragments ist
zu gering um detektiert zu werden. In den Bahnen 3 und 4 sieht man eine
fehlgeschlagene Ligation des linearisierten Vektors pIVEX2.3MCS mit dem Fragment
Mtj1pN-term. In diesem Fall wurde das Insert nicht in den Vektor eingebaut. Man
erkennt jeweils eine Bande zwischen 3000 und 4000 bp, die dem linearisierten
Vektor entspricht. Die Bande zwischen 400 und 500 bp repräsentiert das Insert.
1 2 3 4 5
Abbildung 24: Bahnen 1 und 2 gelungene Ligation, Bahnen 3 und 4 fehlgeschlagene Ligation, Bahn 5: 2-Log Ladder Marker
Mit dem neu konstruierten Vektor pIVEX2.3MCSMtj1pN-term ist man in der Lage,
ortsspezifisch eine künstliche Aminosäure in das N-terminale Fragment des Mtj1p-
3 Eigene Ergebnisse und Diskussion
36
Proteins einzubauen. Mit einer entsprechenden aminoacylierten amber Supressor
tRNA kann eine unnatürliche Aminosäure an Position 113 des Proteinfragments
eingebaut werden. Außerdem ist das Proteinfragment aufgrund seiner geringen
Größe gut in in vitro Translationssystemen zu handhaben.
Zur Plasmidamplifikation wurde der Verktor in kompetente E.coli DH5α transformiert
und in Glycerinkultur gelagert.
3 Eigene Ergebnisse und Diskussion
37
3.3 Ortsspezifischer Einbau einer Spin-markierten Aminosäure in
den N-Terminus des Mtj1p-Proteins
Der
Einbau
der
entschützten,
Spin-markierten
Aminosäure
HO1007
(s. Abbildung 14) an Position 113 der Aminosäurensequenz des N-terminalen
Fragments des Mtj1p-Proteins soll nach der Methode der amber Suppression
erfolgen (s. 1.2). Für diese in vitro Methode benötigt man den Expressionsvektor
pIVEX2.3MCSMtj1pN-term (s. 3.2.2.) und eine entsprechende amber-Suppressor
tRNA (s. 3.1.5).
Der Expressionsvektor codiert für ein N-terminales Fragment des Mtj1p Proteins und
trägt an Position 113 der Aminosäurensequenz die amber-Mutation. Zwei reguläre
Stopp-Codons am Ende des Gens sorgen für die Termination der Translation und für
die Dissoziation des synthetisierten Peptids vom Ribosom.
Die amber-Suppressor tRNA trägt am Akzeptor-Stamm die entschützte Aminosäure
HO3007 und erkennt mit ihrem Anticodon das Basentriplett des amber-Codons.
Zur in vitro Translation wurde das RTS 100 E.coli HY Kit der Fa. Roche Diagnostics
verwendet. Mit Hilfe dieses Kits kann der N-Terminus des Mtj1p-Proteins exprimiert
werden. Nach erfolgter in vitro Translation wurde der Gesamtansatz bis zur weiteren
Verwendung bei -80°C gelagert.
Bei erfolgreichem Verlauf des Experiments sollte an Position 113 des Proteins, mit
Hilfe der amber-Suppressor tRNA, die Spin-markierte Aminosäure eingebaut werden.
Wird die Spin-Label Aminosäure eingebaut, erwartet man bei der Untersuchung des
Protein-Fragments im ESR-Spektrometer, wenn es in nativer Faltung vorliegt, das
typische Signal eines stark immobilisierten Spin-Labels.
Das vom Translationsansatz gemessene ESR-Spektrum zeigte kaum freie SpinLabel Anteile (s. Abbildung 25). Im Gegensatz dazu traten die Anteile von
gebundenem Spin-Label mit einer Aufspaltung von 62,8 Gauß deutlich hervor.
Der geringe Anteil von freiem Spin-Label deutet darauf hin, dass fast die gesamte
amber-Suppressor tRNA während der in vitro Tranlation verbraucht wurde und dass
die Suppressor tRNA nicht oder kaum deacyliert wurde. Im Fall der Deacylierung
würde man im ESR-Spektrum Anteile von freiem Spin-Label beobachten, die von der
abgespaltenen Spin-Label Aminosäure HO3007 stammen. Außerdem kann ein freies
3 Eigene Ergebnisse und Diskussion
38
Spin-Label Signal von ungefaltetem Protein verursacht werden, in das die Spin-Label
Aminosäure
inkorporiert
wurde.
In
diesem
Fall
können
keine
höheren
Proteinstrukturen die Beweglichkeit des Spin-Labels einschränken.
Es können daher drei Effekte gleichzeitig für Signale von freiem Spin-Label
verantwortlich sein, die hier aber nur in untergeordnetem Maße auftraten. Zu
welchem Anteil jede dieser Möglichkeiten an der Entstehung des schwachen Signals
des freien Spin-Label beteiligt waren, konnte anhand des ESR-Spektrums nicht
geklärt werden.
25.000
20.000
15.000
10.000
5.000
0
-5.000
-10.000
-15.000
62,8 G
-20.000
3.400
3.420
3.440
3.460
3.480
3.500
Magnetfeld [G]
Abbildung 25: ESR-Spektrum des N-Terminus des Mtj1p-Proteins
Die hohen gebundenen Anteile im ESR-Spektrum zeigen, dass die Aminosäure
HO1007 tatsächlich in das Proteinfragment inkorporiert wurde und dass die SpinLabel Seitenkette der Aminosäure stark immobilisiert ist. Das bedeutet, dass das
Mtj1p Fragment in nativer Faltung vorliegt und damit die Beweglichkeit des SpinLabels stark eingeschränkt ist.
Die zusammenfassende Betrachtung dieser Ergebnisse zeigt, dass es gelungen ist
die
Spin-Label
Aminosäure
HO3007
ortsspezifisch
an
Position
113
der
Aminosäurensequenz des nativ gefalteten N-terminalen Fragments des Mtj1pProteins einzubauen.
3 Eigene Ergebnisse und Diskussion
39
Damit konnte nachgewiesen werden, dass mit der amber-Suppressor Technik SpinLabel Aminosäuren ortsspezifisch in Proteine eingebaut und ESR-spektroskopisch
detektiert werden können.
3 Eigene Ergebnisse und Diskussion
40
3.4 Gentechnische Gewinnung und Reinigung der β-Untereinheit
der FOF1-ATP Synthase des thermophilen Bacillus PS3
Die β-Untereinheit der FOF1-ATP Synthase des thermophilen Bacillus PS3 sollte mit
Hinsicht auf hohe Reinheit gentechnisch aus E.coli gewonnen werden.
Das für die β-Untereinheit codierende Plasmid pUC118β wurde freundlicherweise
von T. Hisabori (Chemical Resources Laboratory, Tokyo Institute of Technology,
Yokohama, Japan) zur Verfügung gestellt. Die Aufzucht der mit pUC118β
transformierten E.coli erfolgte mit einigen Modifikationen in Anlehnung an eine
Veröffentlichung von Ohtsubo (Ohtsubo 1987).
Die Aufreinigung des Zellysates fand in zwei Schritten mit Ionenaustausch- und
Gelchromatographie statt.
Laut SDS-PAGE erhält man die β-Untereinheit als nahezu reines Protein.
Zur weiteren Kontrolle wurde die entsprechende Bande des SDS-Gels tryptisch
verdaut und im MALDI-TOF Massenspektrometer analysiert. Durch Analyse des
gemessenen Massenspektrums mit der MASCOT-Datenbank stellte sich heraus,
dass das augenscheinlich reine Protein eine Mixtur von Tryptophanase aus E.coli
und der β-Untereinheit ist. Der Treffer der Datenbank hat einen Score (Punktzahl)
von 211 (s. Abbildung 26). Bei einem Score von über 67 ist das Ergebnis signifikant.
Alle anderen signifikanten Treffer beinhalten nur die E.coli Tryptophanase.
Abbildung 26: Trefferdiagramm der MASCOT-Datenbank für die Mixtur aus
Tryptophanase und β-Untereinheit
In der untersuchten Bande wurde die Tryptophanase mit einer Sequenzabdeckung
von 43,9% und die β-Untereinheit mit einer Sequenzabdeckung von 37,0% gefunden.
3 Eigene Ergebnisse und Diskussion
41
Das Molekulargewicht der Tryptophanase ist mit 52.789 Da dem der β-Untereinheit
(51.938 Da) sehr ähnlich. Daher verhalten sich beide Proteine im SDS-Gel gleich und
erscheinen als eine Bande.
Aufgrund dieses Ergebnisses wurde die Aufreinigung leicht modifiziert. Anstelle eines
linearen Kochsalzgradienten bei der Ionenaustauschchromatographie wurde ein
Stufengradient angelegt (s. 5.5.3). Anschließend wurde mit SDS-PAGE in zwei
Elutionsbanden
Protein
mit
einem
Molekulargewicht
von
ca.
52.000
Da
nachgewiesen. Mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie der tryptisch verdauten
Banden und anschließender Datenbankanalyse konnte verifiziert werden, dass sich
in den Banden jeweils nur die Tryptophanase oder die β-Untereinheit befindet. Die
Tryptophanase
konnte
mit
einem
maximalen
Score
von
94
und
einer
Sequenzabdeckung von 49,7% gefunden werden, die β-Untereinheit entsprechend
mit einem maximalen Score 138 und einer Sequenzabdeckung von 41,4% (s.
Abbildung 27 und Abbildung 28).
Abbildung 27: Trefferdiagramm der MASCOT-Datenbank für die Tryptophanase
Abbildung 28: Trefferdiagramm der MASCOT-Datenbank für die β-Untereinheit
3 Eigene Ergebnisse und Diskussion
42
Die beiden Proteine konnten durch die Modifikation bei der Durchführung der
Ionenaustauschchromatographie eindeutig separiert werden.
Nach der gelchromatographischen Reinigung der β-Untereinheit konnte die Reinheit
nochmals mit SDS-PAGE und MALDI-TOF Massenspektrometrie bestätigt werden.
Bis auf nicht signifikante Verunreinigungen im höher- und niedermolekularen Bereich
ist das Protein sauber (s. Abbildung 38 im experimentellen Teil).
Das Protein wurde bis zur weiteren Verwendung bei -80°C in Elutionspuffer gelagert.
3 Eigene Ergebnisse und Diskussion
43
3.5 ESR-Untersuchungen der β-Untereinheit der FOF1-ATP-Synthase
des thermophilen Bacillus PS3 mit 2-N3-2’,3’-SL-ATP
NH2
N
O
O
O
-O P O P O P O
OOO-
N
N
H
N3
N
O
H
H
H
OH O
O
N
O
Abbildung 29: 2-N3-2’,3’-SL-ATP
Das ESR-Spektrum der β-Untereinheit nach Inkubation mit dem Substratanalogon
2-N3-SL-ATP (s. Abbildung 29) in magnesiumhaltigem Puffer (SHPMg) ist in
Abbildung 30 zu sehen. Neben den Signalen für freie Spin-Label Radikale erkennt
man im Hoch- und Tieffeldbereich zwei zusätzliche Signale mit einer Aufspaltung von
52
G
(s.
Pfeile
in
Abbildung
30).
Dieses
Signalpaar
resultiert
aus
hochimmobilisierten, enzymgebundenen Spin-Label Radikalen. Die beobachtete
Aufspaltung
entspricht
praktisch
den
von
S.
Burgard
bestimmten
Werten
von 53 – 54 G (Burgard 1995).
Das Substratanalogon bindet an eine Bindungsstelle der β-Untereinheit und kann
anschließend durch Bestrahlung mit UV-Licht kovalent mit dem Protein verknüpft
werden.
3 Eigene Ergebnisse und Diskussion
44
8.000
6.000
4.000
2.000
0
-2.000
-4.000
-6.000
3.400
3.420
3.440
3.460
3.480
3.500
Magnetfeld [G]
Abbildung 30: ESR-Spektrum der β-Untereinheit in magnesiumhaltigem Puffer
inkubiert mit 2-N3-2’,3’-SL-ATP
3 Eigene Ergebnisse und Diskussion
45
3.5 Massenspektrometrische Untersuchungen an der β-Untereinheit
der FOF1-ATP-Synthase des thermophilen Bacillus PS3
Unter UV-Bestrahlung kann das Substratanalogon 2-N3-2’,3’-SL-ATP mit der
Seitenkette
der
Aminosäure
massenspektrometrische
Tyrosin
Untersuchungen
stabile
soll
Addukte
überprüft
bilden.
werden,
Durch
ob
das
Substratanalogon der FOF1-ATP-Synthase kovalent an Tyr-341 in der katalytischen
Bindungsstelle der isolierten β-Untereinheit des thermophilen Bacillus PS3 bindet.
Anhand der Ergebnisse soll bewiesen werden, dass das Substratanalogon in der
gleichen Weise an die β-Untereinheit bindet wie in der vollständigen F1-ATPase.
Aufbauend auf die Ergebnisse von P. Vogel (Vogel 1992) und S. Burgard
(Burgard
2003)
könnte
so
gezeigt
werden, dass die Modifikationen des
Substratanalogons 2-N3-2’,3’-SL-ATP im Vergleich zum natürlichen Substrat ATP
auch in der isolierten β-Untereinheit der F1-ATPase keinen Einfluss auf das
Bindungsverhalten haben.
Nach Inkubation der β-Untereinheit mit 2-N3-2’,3’-SL-ATP in magnesiumhaltigem
Puffer wird der Enzymsubstratkomplex mit UV-Licht bestrahlt, um gebundenes
Substrat kovalent mit dem Enzym zu verknüpfen. Nach Aufreinigung des Proteins
mittels SDS-PAGE erfolgte ein Verdau mit Trypsin. Die auf diese Weise erhaltenen
Peptidfragmente wurden im MALDI-TOF-Massenspektrometer vermessen und
mittels Datenbankanalyse identifiziert.
Intens. [a.u.]
3 Eigene Ergebnisse und Diskussion
46
x10 4
1471.629
2.5
2140.082
2268.995
1921.883
1781.797
2.0
2307.224
1605.636
1.5
1262.442
1.0
63.216
0.5
2018.971
1000.441
481.493
2751.444
1130.538
710.204
2433.224
2968.504
103.314
0.0
500
1000
1500
2000
2500
3000
m/z
Abbildung 31: Typisches Massenspektrum der tryptisch verdauten β-Untereinheit
Bei erfolgreichem kovalenten Einbau des Substratanalogons sollten Anteile des
Peptidfragmentes, das Tyr-341 beinhaltet, zu höheren Massen verschoben sein.
Ein entsprechendes Massenspektrum zeigt Abbildung 31. Durch Analyse der
Fragmente mit der MASCOT-Datenbank konnte die β-Untereinheit mit einem Score
von 81 (s. Abbildung 32) und einer Sequenzabdeckung von 78,9 % gefunden
werden.
Abbildung 32: Trefferdiagramm der MASCOT Datenbank für die kovalent
modifizierte β-Untereinheit
3 Eigene Ergebnisse und Diskussion
47
Ebenfalls wurde ein Fragment identifiziert, welches β-Tyr341 als einziges Tyrosin
beinhaltet. Dieses Fragment hat ein Molekulargewicht von 1.890,85 und tritt mit einer
relativen Intensität von 21,8 % auf. Ausgehend davon wurde nach dem
entsprechenden modifizierten Peptid gesucht.
Eine Markierung mit dem ATP-Derivat konnte nicht gefunden werden. Allerdings
kann ATP unter den Bedingungen im Massenspektrometer Phosphatgruppen
abspalten. Einen ersten Hinweis darauf lieferte in diesem Fall die Software Bio Tools
der Fa. Bruker, die nach dem Einlesen von Massenspektren, unabhängig vom
eingestellten Detektionsbereich, nach abgespaltenen Phosphatgruppen sucht.
Wurden Phosphatgruppen detektiert, erscheint auf dem Bildschirm ein kleines
Ausgabefenster (s. Pfeil in Abbildung 33). Dabei spielt es keine Rolle, dass wie hier
der Detektionsbereich von m/z = 500 bis m/z = 3.500 eingestellt ist. Die Software
analysiert auch den Bereich m/z < 500, obwohl in der Steuersoftware des
Spektrometers die Option Matrix-Suppression aktiviert wurde. Das bedeutet, dass
der Messbereich m/z < 400 abgeschnitten wird.
Der Nachweis von abgespaltenen Phosphatgruppen ist eindeutig. Eine Kontaminaton
der Probe kann ausgeschlossen werden, da jede Probe vor der Applikation auf ein
MALDI-Target mit ZipTip®-Pipettenspitzen entsalzt wurde.
3 Eigene Ergebnisse und Diskussion
48
Abbildung 33: Ausgabefenster der Software Bio Tools
Den Ergebnissen der Software Bio Tools entsprechend konnte die Modifizierung mit
dem ADP-Derivat erfolgreich nachgewiesen werden.
Gemäß eines berechneten Molekulargewichts von 2.497,25 wurde experimentell ein
schwacher
Peak
mit
einem
Molekulargewicht
von
2.497,252
gefunden
(s. Abbildung 34). Damit konnte eindeutig bestätigt werden, dass 2-N3-2’,3’-SL-ATP
in das Protein eingebaut wird und dass eine Phosphatgruppe des Substratanalogons
abgespalten wird.
3 Eigene Ergebnisse und Diskussion
49
Intensität [au]
120000
60000
m / z = 2497,252
0
2300
2350
2400
2450
m/z
Abbildung 34: Ausschnitt aus dem Massenspektrum
2500
3 Eigene Ergebnisse und Diskussion
50
Einen weiteren Beweis für den kovalenten Einbau konnte durch das Massespektrum
des unverdauten Enzyms erbracht werden (s. Abbildung 35).
7500
β-Untereinheit nicht modifiziert
β-Untereinheit modifiziert
7000
6500
6000
5500
5000
4500
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
m/z
Abbildung 35: Massenspektren der unverdauten modifizierten und nicht modifizierten
β-Untereinheit
Im Vergleich zum unmodifizierten Protein weist das modifizierte Protein ein
deutliches Peak-tailing zu höheren Massen auf (s. Abbildung 35). Dies ist ein
Zeichen kovalenter Bindung niedermolekularer Substanzen an das Protein. Die
Proben wurden vor der Messung mit ZipTip®-Pipettenspitzen entsalzt, da Ionen wie
Na+ ebenfalls Peak-tailing verursachen.
Anhand dieser Ergebnisse konnte eindeutig nachgewiesen werden, dass das
Substratanalogon kovalent an Tyr-341 der β-Untereinheit bindet. Das bedeutet, dass
das Substratanalogon auch in der isolierten β-Untereinheit an die katalytische
Bindungsstelle bindet.
4 Zusammenfassung
51
4 Zusammenfassung
Im ersten Teil dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob Spin-Label Aminosäuren mit
der Methode der amber-Suppression in Proteine inkorporiert werden können. Des
Weiteren sollte der Einbau ESR-spektroskopisch bewiesen werden.
Dazu wurde eine neue amber-Suppresor tRNA synthetisiert. Diese tRNA leitet sich
von einer Hefe tRNA ab und ist somit orthogonal zu E.coli Aminoacylsynthetasen.
Am Akzeptorstamm trägt die tRNA die entschützte Spin-Label-Aminosäure HO3007.
Mit ihrem Anticodon erkennt die tRNA das amber Codon.
Weiterhin wurde in den in vitro Expressionsvektor pIVEX2.3MCS das Gen für ein 137
Aminosäuren langes N-terminales Fragment des humanen Mtj1p-Proteins einkloniert.
Das Gen wurde so mutiert, dass sich an der Position des Codons für die Aminosäure
Phe113 (TAC) die amber-Mutation (TAG) befindet. Der neu synthetisierte Vektor
trägt die Bezeichnung pIVEX2.3MCSMtj1pN-term.
Der Vektor und die amber-Suppressor tRNA wurden in einem E.coli in vitro
Translationssystem eingesetzt.
Durch
ESR-spektroskopische
Untersuchung
des
Reaktionsansatzes
konnte
nachgewiesen werden, dass fast die gesamte eingesetzte tRNA verbraucht wurde.
Außerdem kann anhand des hohen gebundenen Anteils im ESR-Spektrum darauf
geschlossen werden, dass die Spin-Label Aminosäure in das nativ gefaltete Nterminale Fragment des Mtj1p-Proteins eingebaut wurde.
Die Methode der amber-Suppression konnte erfolgreich auf die Spin-Label
Aminosäure HO3007 übertragen werden. In Versuchen, die späteren Arbeiten
vorbehalten bleiben, kann untersucht werden, ob durch den ortsspezifischen Einbau
von zwei Spin-Label Aminosäuren Spin-Spin Abstände in nativ gefalteten Proteinen
gemessen werden können. Durch geeignete Variation der Abstände der Spin-Label
Aminosäuren in der Aminosäurensequenz könnten die verschiedenen gemessenen
Spin-Spin Abstände zur Strukturaufklärung beitragen. So werden in α-helicalen
Strukturen die Spin Abstände kleiner sein als in ungefalteten Aminosäureketten. Auf
diese Weise könnte man zum Beispieldirekt während der Translation von
4 Zusammenfassung
52
sekretorischen Proteien nachweisen, ob bereits während der Translation die Faltung
der Proteine erfolgt.
Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit sollte nachgewiesen werden, dass das
Substratanalogons 2-N3-2’,3’-SL-ATP auch in der isolierten β-Untereinheit der
FOF1-ATP-Synthase
des
thermophilen
Bacillus
PS3
an
die
katalytische
Bindungsstelle bindet und somit für weiteregehende Untersuchungen von StrukturFunktionsbeziehunhen als Reportermolekül geeignet ist.
Bereits
P.
Vogel
konnte
zeigen,
dass
sich
das
Bindungsverhalten
des
Substratanalogons für die F1-ATPase aus Rinderherzen trotz der strukturellen
Modifikationen nicht von dem des natürlichen Substrats ATP unterscheidet
(Vogel 1992). Die F1-ATPase aus Rinderherz wurde dazu mit dem Substratanalogon
[β,γ-32P]2-N3-2’,3’-SL-ATP
kovalent
markiert,
tryptisch
verdaut
und
die
Peptidfragmente mit Reversed Phase HPLC identifiziert. Später zeigte S. Burgard
(Burgard 2003), dass auch die isolierte β-Untereinheit des thermophilen Bacillus PS3
kovalent mit 2-N3-2’,3’-SL-ATP markiert werden kann.
In der vorliegenden Arbeit wurde überprüft ob das Substratanalogon tatsächlich an
die katalytische Bindungsstelle der isolierten β-Untereinheit der FOF1-ATP-Synthase
des thermophilen Bacillus PS3 bindet.
Dazu wurde die in der Literatur beschriebene Methode zur gentechnischen
Gewinnung der β-Untereinheit vereinfacht und die Reinheit des Proteins mittels
MALDI-TOF Massenspektrometrie und Datenbankanalyse bestätigt.
Die
isolierte
Untereinheit
wurde
anschließend
mit
dem
Substratanalogon
2-N3-2’,3’-SL-ATP inkubiert. Das danach gemessene ESR-Spektrum des EnzymSubstratkomplexes entspricht dem für die F1-ATPase (Burgard 1995). Nach der
kovalenten Markierung der β-Untereinheit mit dem Substratanalogon wurde das
Protein tryptisch verdaut. Die entstandenen Peptidfragmente wurden anschließend
mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie analysiert. Mit Hilfe der MASCOTDatenbank konnte die β-Untereinheit mit einer Sequenzabdeckung von 78,9 %
identifiziert werden. Außerdem wurde ein Peptid gefunden, das Tyr 341 beinhaltet.
Diese Aminosäure befindet sich in der katalytischen Bindungstasche der βUntereinheit. Das entsprechende Fragment hat ein Molekulargewicht von 1.890,85
und tritt mit einer relativen Intensität von 21,8% auf. Ausgehend von diesem Peptid
konnte das entsprechende mit dem ATP-Analogon markierte Peptid nicht gefunden
4 Zusammenfassung
53
werden. Die Software BioTools der Fa. Bruker lieferte die Begründung. Bei der
Auswertung der Massenspektren detektierte die Software Phosphorylierung, also
abgespaltene
Phosphatgruppen.
Modifizierung
mit
dem
Dieser
ADP-Derivat
Aussage
entsprechend
nachgewiesen
werden.
konnte
Gemäß
die
eines
berechneten Molekulargewichts von 2.497,25 konnte experimentell ein Peak mit
einem Molekulargewicht von 2.497,252 gefunden werden. Das Substratanalogon hat
zweifelsfrei kovalent an Tyr 341 der katalytischen Bindungsstelle gebunden.
Einen
weiteren
Hinweis
für
die
erfolgreiche
kovalente
Modifizierung
der
β-Untereinheit mit 2-N3-2’,3’-SL-ATP lieferte die Untersuchung des unverdauten
Proteins im MALDI-TOF Massenspektrometer. Im Vergleich zum unmodifizierten
Protein weist der Peak der modifizierten β-Untereinheit ein deutliches Peak-tailing zu
höheren Massen auf. Da die Proben vor der Messung entsalzt wurden, spricht diese
Beobachtung deutlich für die kovalente Modifizierung des Proteins.
Die Ergebnisse dieses Teils der Arbeit beweisen, dass das Substratanalogon
2-N3-2’,3’-SL-ATP auch im Fall der isolierten β-Untereinheit an die katalytische
Bindungsstelle bindet. Aufbauend auf die Arbeiten von P. Vogel (Vogel 1992) und
S. Burgard (Burgard 2003) bedeutet das, dass die strukturellen Modifikationen des
Substratanalogons im Vergleich zum natürlichen Substrat ATP auch in der isolierten
β-Untereinheit keinen Einfluss auf das Bindungsverhalten an die katalytische
Bindungsstelle haben. Das Substratanalogon 2-N3-2’,3’-SL-ATP kann daher für
weitergehende
Untersuchungen
Reportermolekül verwendet werden.
von
Struktur-Funktionsbeziehungen
als
5 Material und Methoden
54
5 Material und Methoden
5.1 Material
5.1.1 E.coli Stämme
Stamm
DH5α
JM109
Genotyp
Quelle
F- (Φ80d∆(lacZ)M15) gyrA96 (Nalr) endA1 recA1
relA1 λ-thi-1 deoR glnV44 hsdR17 (rk-, mk-)
∆(lacZYA-argF)U169
F- traD36 proA+B+ lac/q ∆(lacZ)M15/ e14- (McrA-)
∆(lac-proAB) gyrA96 (Nalr) endA1 recA1 relA1 λthi-1 glnV44 hsdR17 (rk-, mk-)
Woodcock et al.
1989
Yanisch-Perron
et al, 1995.
5.1.2 Plasmide
pStR1
pUCβ
pIVEX2.3MCSMtj1p
5.1.3 Enzyme und Marker
2-Log DNA Ladder
New England BioLabs
Alkaline Phosphatase (CIP)
New England BioLabs
DpnI
New England BioLabs
FokI
New England BioLabs
λ-DNA/HindIII-Marker
MBI-Fermentas
Nde I
New England BioLabs
Pfu Turbo DNA Polymerase
Stratagene
5 Material und Methoden
55
PstI
New England BioLabs
Roti®-Mark STANDARD
Roth
T4 DNA-Ligase
New England BioLabs
T4 RNA-Ligase
New England BioLabs
Trypsin Gold
Promega
XbaI
New England BioLabs
XhoI
New England BioLabs
5.1.4 Medien
Agar
ICN Biochemicals
Bacto-Trypton (-Pepton)
Difco
Hefeextrakt
Fluka
5.1.5 Chemikalien
Acrylamidlösung
Roth
Agarose
Roth
Ampicillin
Sigma
Borsäure
MERCK
Bromphenolblau
Sigma
Butanol
Riedel-de Haen
BSA
Roche Diagnostics
Chloracetonitril
Fluka
Coomassie Brilliant Blue R 250
Serva
α-Cyno-4-hydroxyzimtsäure
Sigma
DEAE Sephacel
Serva
dpCpA
Photo Probes
N,N-Dimethylformamid
MERCK
EDTA
Serva
Ethanol
Roth
Ethidiumbromid
USB
Fractogel TSK HW-40 (S)
MERCK
Glycerin
Caldic Deutschland
5 Material und Methoden
56
Glycin
Serva
IPTG
Roth
β-Mercaptoethanol
Fluka
Natriumazid
MERCK
Natriumchlorid
MERCK
Pefabloc SC (AEBSF)
Roche
Rubidiumchlorid
Roche
Schwefelsäure
MERCK
SDS
Roche
Sinapinsäure
Sigma
TEMED
Sigma
Tetrabutylammoniumacetat
Fluka
Trifluoressigsäure
Riedel-de Haen
Tris
MERCK
Alle nicht aufgeführten Chemikalien waren im Arbeitskreis vorhanden oder wurden
über die Chemikalienausgabe bezogen.
5.1.6 Sonstige Materialien
QIAEXII Gel Extraction Kit
Qiagen
QIAprep Spin Miniprep Kit
Qiagen
QIAquick PCR Purification Kit
Qiagen
RTS 100 E.coli HY Kit
Roche Diagnostics
Starter Kit for MALDI-TOF-MS
Bruker Daltonics
T7 - MEGAshortscript Kit
Ambion
5 Material und Methoden
57
5.1.7 Geräte
Gerät
Bezeichnung
Hersteller
Autoklav
Dampfkochtopf
Sitram
Brutschrank
S40 Ü
Memmert
Elektrophoresezubehör
Mini Protean 3 Kammern
BIO-RAD
Lichtbank
REX
Sofortbildkamera
DS 34
Polaroid
Fraktionssammler
2111 MULTIRAC
LKB BROMMA
Gefriertrocknung
LYOVAC GT 2
Leybold Heraeus
Geltrockner
2003 Slab Gel Dryer
LKB
HPLC
System Gold
Beckman
HPLC-Säulen
Supersphere 100 RP18
GROM
PARTISIL 10 SAX
Whatman
innova 4000
New Brunswick Scientific
AQUATRON
INFORS
Amicon Ultra (10000 MWCO)
Amicon
Inkubatoren
Konzentratoren
VIVASPIN 2 30,000 MWCO RC VIVASCIENCE
Küvetten
Plastibrand
Brand
Suprasil
Hellma
Kryostat
UKT
Edmund Bühler
Leistungssteller
voltron
messner emtronic
MALDI-Target
MTP Anchor Chip var/384
Bruker Daltonics
Massenspektrometer
ultraflex II TOF/TOF
Bruker Daltonics
Mixer
Mixer 5432
Eppendorf
pH-Meter
pH 521
WTW
Spektralphotometer
DU-640
Beckman
Rotoren
JA-10, JA-14, JA-20
Beckman
Schreiber
2210
LKB BROMMA
Spannungsgeräte
Power Pac 3000
BIO-RAD
DA 150/0,5 GB
zentro-elektrik
Thermocycler
PCR Sprint
Thermo Hybaid
Thermostat
ULTRATEMP 2000 F30
julabo
5 Material und Methoden
58
Ultraschall-Zelldisruptor
SONIFIER B-12
BRANSON
UV-Monitor
2138 UVICORD S
LKB BROMMA
UV-Transilluminator TFX-20M
Waagen
Zentrifugen
Labortechnik Fröbel
Feinwaage 1204 M
Sartorius
1601 MP8-1
Sartorius
5415 C
Eppendorf
J2-21
Beckman
UNIVERSAL
Hettich
5.2 Aufzucht und Lagerung von E.coli
5.2.1 Autoklavieren
Die Flüssigmedien werden in einem Dampfkochtopf bei 121°C und 1,5 bar für
zwanzig Minuten autoklaviert.
5.2.2 Flüssigmedien
2xYT-Medium:
16 g Bacto-Trypton
10 g Hefeextrakt
5 g NaCl
pH 7,5 mit 1 M NaOH; ad 1000 ml mit H2Obidest
LB-Medium:
10 g Bacto-Trypton
5 g Hefeextrakt
10 g NaCl
pH 7,5 mit 1 M NaOH; ad 1000 ml mit H2Obidest
5 Material und Methoden
59
Ampicillin, IPTG, Pefabloc SC
Ampicillin-Stocklösung: 50 mg/ml in H2Obidest
IPTG-Stocklösung: 1 mol/l in H2Obidest
Pefablock-Stocklösung 80 mg/ml in H2Obidest
Die Stocklösungen werden durch einen Membranfilter mit 0,45 µm Porenweite steril
filtriert und bei –20°C gelagert. Da Ampicillin hitzeempfindlich ist, darf es dem
Medium erst zugegeben werden, wenn dessen Temperatur unter 50°C gesunken ist.
Die Konzentration des Ampicillins im Flüssigmedium beträgt üblicherweise
150 µg/ml.
5.2.3 Festmedien
Zum Anfertigen der Agarplatten wird dem Flüssigmedium 1,5 % Agar zugegeben.
Anschließend wird autoklaviert und nach dem Abkühlen auf unter 50 °C Ampicillinlösung bis zur Endkonzentration von 50 µg/ml zugesetzt.
5.2.4 Kulturbedingungen
5.2.4.1 Festmedien
Aus einer Glycerinkultur (Kap. 5.4.2.3) wird ein Verdünnungsausstrich auf einer
Agarplatte angefertigt und über Nacht bei 37°C im Brutschrank kultiviert. Beimpfte
Platten können eine Woche bei 4°C, unbeimpfte Platten maximal zwei Monate bei
4°C gelagert werden.
5.2.4.2 Flüssigmedium
Es wird eine einzelne Kolonie von einer frischen plattierten Agar-Platte in 15 ml des
gewünschten Mediums überführt. Die Inkubation der Kulturen erfolgt über Nacht bei
37°C und 200 bis 300 rpm im Luft- oder Wasserbadschüttler. Ausgehend von dieser
Übernachtkultur kann eine größere Kultur angeimpft werden.
5 Material und Methoden
60
5.2.4.3 Glycerinkulturen
500 bis 750 µl einer Übernachtkultur, die sich noch im exponentiellen Wachstum
befindet, werden in einem sterilen Kryoröhrchen mit demselben Volumen 80%igem
sterilen Glycerin vermischt und im Aceton/Trockeneis-Bad schockgefroren. Die
Glycerinkulturen werden bei –80°C gelagert. Jede Glycerinkultur wird höchstens
zweimal für einen Verdünnungsausstrich verwendet.
Zur Kultivierung von Einzelkolonien wird mit einer sterilen Impföse ein kleiner Teil von
der Oberfläche der tiefgefrorenen Glycerinkultur abgeschabt und ausgestrichen.
5.2.5 Wachstumsmessungen
Die Bestimmung der Bakterienzahl erfolgt indirekt durch eine Trübungsmessung der
Bakteriensuspension. Das Messprinzip beruht auf der teilweisen Streuung sichtbaren
Lichts beim Durchtritt durch die Bakteriensuspension. Die Streuung hängt von der
Form, Größe und Zahl der Bakterien ab (Süßmut et al., 1987). Die Lichtschwächung
wird durch einen Vergleich mit unbeimpftem Medium (Nullwert, Blank) bei 600 nm
bestimmt, so lässt sich als Maß für das Bakterienwachstum die optische Dichte (OD)
einführen. Bei einer OD über 0,3 muss die Kultur vor der Messung verdünnt werden,
da nur bis zu diesem Wert eine lineare Abhängigkeit zwischen der Trübung der
Flüssigkultur und der Zellzahl besteht.
5.3 Allgemeine Arbeitsmethoden
5.3.1 Herstellung kompetenter Zellen
Um die Transformation eines Plasmids in eine E.coli-Zelle zu ermöglichen, benötigt
man kompetente Zellen. Dabei ist eine sehr hohe Transformationseffizienz
erwünscht, welche man in Gegenwart von Rubidiumchlorid (Hanahan, 1983) erreicht.
Je nach verwendetem Plasmid bzw. E.coli Stamm können mit dieser Art kompetenter
Zellen über 107 Transformanden pro µg eingesetzter DNA erhalten werden.
5 Material und Methoden
61
5.3.2 Transformation
Die kompetenten Zellen werden auf Eis aufgetaut und mit der gewünschten Menge
an Plasmid-DNA (1-2 µl, ca. 10ng) versetzt. Anschließend wird eine Stunde auf Eis
inkubiert. Nach der Inkubation werden die Zellen für 3 Minuten bei 42°C einem
Hitzeschock ausgesetzt und danach sofort auf Eis gestellt. Die Bakteriensuspension
wird dann in ein steriles Reagenzglas mit 1 ml LB-Medium überführt und für eine
Stunde bei 37°C und 150 rpm im Luftschüttler inkubiert. Von der Suspension werden
je 100 µl mit einem Trigalski-Spatel auf Agarplatten ausgestrichen, die das
entsprechende Antibiotikum enthalten und über Nacht im Brutschrank bei 37°C
inkubiert.
5.3.3 Plasmid-Minipräparation
Die Isolierung von Plasmid DNA erfolgt mit dem kommerziellen System QIAprep
Spin Miniprep der Fa. Qiagen. Das Verfahren basiert auf der Bindung von PlasmidDNA an eine Silica-Matrix.
Die Isolierung erfolgt aus 3 ml einer Übernachtkultur von E.coli-Zellen nach dem
Protokoll des Herstellers. Die isolierte und gereinigte DNA wird mit 50 µl EB-Puffer
(1 mM Tris⋅HCl pH 8,5) oder H2Obidest von der Säule eluiert.
5.3.4 Restriktionsverdau
Für den Restriktionsverdau von DNA werden die Herstellervorgaben befolgt und die
mitgelieferten 10x Reaktionspuffer verwendet. Der Ansatz variiert abhängig vom
Volumen und der Konzentration der verwendeten DNA-Lösung. Ein Standardansatz
setzt sich wie folgt zusammen:
2 µl 10x Puffer
2-3 µl DNA
1 µl Enzym (5-10 U/µl)
ad 20 µl H2Obidest
Der Verdau wird bei der empfohlenen Temperatur (i. A. 37°C) durchgeführt. Die
anschließende
Inaktivierung
Herstellerangaben.
der
Restriktionsenzyme
erfolgt
nach
den
5 Material und Methoden
62
5.3.5 Agarose-Gelelektrophorese
Das wichtigste Verfahren zur Auftrennung und Identifikation von DNA-Molekülen ist
die Elektrophorese in Agarosegelen. Als Trennmedium dient eine Agarose-Matrix.
Die Geschwindigkeit mit der sich DNA im elektrischen Feld auf die Anode zubewegt,
ist von der Struktur, Größe und Mobilität der DNA abhängig. So bewegt sich lineare,
doppelsträngige DNA mit einer Geschwindigkeit, die umgekehrt proportional zum
Logarithmus ihres Molekulargewichts ist, durch das Agarosegel. Die Mobilität der
DNA ist von der Konzentration der Agarose abhängig. Im Allgemeinen verwendet
man 0,9%-ige Agarosegele.
Durchführung:
Elektrophoresepuffer (TBE-Puffer)
Loading Dye
0,089 M Tris
0,25% Bromphenolblau
0,089 M H3BO3
0,25% Xylenblau
0,002 M EDTA
30% Glycerin in H2Obidest
pH 8,3 mit H3BO3
50 mM EDTA
Die entsprechende Menge Agarose wird in 70 ml TBE-Puffer aufgeschmolzen. Nach
dem Abkühlen auf 50°C erfolgt die Zugabe von 3,5 ml Ethidiumbromid-Stammlösung
(10 mg/ml). Die Lösung wird in eine entsprechende Form gegossen und mit einem
Kamm, der die Probentaschen ausbildet, versehen. Nach dem Erstarren des
Agarosegels wird der Kamm entfernt und das Gel in der Elektrophoresekammer
positioniert. Die vorbereiteten DNA-Proben werden in die Geltaschen pipettiert.
Anschließend wird die Elektrophorese bei konstant 100 V für 1,5 bis 2 Stunden
durchgeführt.
Die Detektion der DNA erfolgt mit Hilfe des Ethidiumbromids, welches in
dopplesträngige DNA-Moleküle intercaliert und somit die DNA unter UV-Licht sichtbar
macht.
5 Material und Methoden
63
Probenvorbereitung:
Unverdaute Plasmide und DNA-Marker Lösungen werden mit TE-Puffer auf 20 µl
aufgefüllt und mit 7µl Loading Dye versetzt. Zu den PCR-Produkten und den
verdauten DNA-Ansätzen werden direkt 7 µl Loading Dye zugegeben. Nach
fünfminütiger Inkubation bei 65°C werden die Proben bis zum Beladen des Gels auf
Eis gelagert.
5.3.6 DNA-Größenstandards
Zur Abschätzung der Größe der verdauten und unverdauten DNA-Fragmente werden
λ-DNA/HindIII-Marker sowie 2-Log DNA Ladder Marker benutzt. Die Größe der
Fragmente ist in Basenpaaren (bp) angegeben
λ-DNA/HindIII
23.130, 9.416, 6.557, 4.361, 2.322, 2.027, 564, 125
2-Log DNA Ladder
10.000, 8.000, 6.000, 5.000, 4.000, 3.000, 2.000, 1.500,
1.200, 1.000, 900, 800, 600, 500, 400, 300, 200, 100
5.3.7 Konzentrationsbestimmung von Plasmid-DNA
Die DNA besitzt bei 260 nm ein Absorptionsmaximum. Aufgrund dessen kann die
Konzentration von Plasmidlösungen unter Verwendung der folgenden Gleichung
bestimmt werden (Sambrook et al., 1989):
1 OD260 = 50 µg/ml ds DNA
Die Messungen erfolgen in Quartzküvetten mit einer Schichtdicke von 1 cm. Das
Absorptionsspektrum wird im Bereich von 230 – 350 nm aufgenommen.
5 Material und Methoden
64
5.3.8 Isolierung von DNA aus Agarosegelen
Für die Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen wurde das QIAEX®II Gel
Extraction Kit der Fa. Qiagen benutzt. Die Durchführung erfolgte nach dem Protokoll
des Herstellers.
5.3.9 Reinigung von PCR-Produkten
Die Reinigung von PCR-Produkten erfolgte mit dem QIAquick PCR Purification Kit
der Fa. Qiagen nach dem Protokoll des Herstellers. Die Elution der DNA erfolgte mit
50 µl sterilem Wasser.
5.3.10 Ligation von DNA-Fragmenten
Die Ligation von zwei DNA-Fragmenten erfolgte ausschließlich mit der T4-DNALigase, einem Enzym, das die Bildung einer Phosphordiester-Bindung zwischen der
5’-Phosphat- und der 3’-Hydroxylgruppe in doppelsträngiger DNA katalysiert. Die
Ligase besitzt die Fähigkeit, sowohl sticky-ends als auch blunt-ends zu ligieren. Ein
typischer Ligationsansatz bestand aus den zu ligierenden Fragmenten, die aus
Agarosegelen isoliert wurden (s. 5.3.8). Die DNA-Lösung wurde mit Wasser auf 17 µl
aufgefüllt. Der Ansatz wurde mit 2µ 10x Ligasepuffer und 1µl T4-DNA-Ligase
komplettiert.
Die
genauen
Reaktionsbedingungen
sind
der
entsprechenden
Versuchs-
beschreibung zu entnehmen.
5.3.11 Rekonstitution und Lagerung von Trypsin Gold
100 µg des lyophilisierten Enzympulvers werden nach Herstellerangaben in 100 µl 50
mM Essigsäure rekonstituiert. Die Enzymlösung wird in 5 µl Portionen aufgeteilt und
kann so bei –78°C gelagert werden. Zum Verdau von Proteinen wird die
Trypsinkonzentration mit 40 mM Ammoniumhydrogencarbonat-Lösung in 10%igem
Acetonitril auf 20 µg/ml eingestellt. Dieser Verdaupuffer kann bei –20°C gelagert
werden.
5 Material und Methoden
65
5.4 Konstruktion des Vektors pIVEX2.3MCSMtj1pN-term
Die nachfolgenden Arbeitschritte erfolgten ausschließlich im pIVEX2.3MCS-Vektor.
5.4.1 Konstruktion des N-terminalen Mtj1p-Fragments mittels PCR
Bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) katalysiert eine DNA-Polymerase die
Verlängerung eines DNA-Einzelstranges in Anwesenheit des komplementären
Stranges. Der Strang kann durch Hinzufügen komplementärer Basen so lange
ergänzt
werden,
bis
beide
Stränge
gleichlang
sind
und
ein
normales
doppelsträngiges DNA-Molekül bilden. Die Polymerase-Kettenreaktion läuft nur dann,
wenn dem zu kopierenden Strang eine kurze doppelsträngige DNA-Sequenz, die
sogenannte Primer-Sequenz, vorausgeht.
Das PCR-Verfahren besteht im Wesentlichen aus zwei Schritten, die so lange
wiederholt werden, bis ausreichend viele Kopien vorhanden sind. Im ersten Schritt
wird die vorliegende doppelsträngige DNA durch vorsichtiges Erhitzen getrennt. Im
zweiten Schritt koppelt man die Einzelstränge mit dem Primer und ergänzt die
komplementären Basen mit der DNA-Polymerase (Lenhof 1997).
Das Design des Plasmids pIVEX2.3MCSMtj1pN-term wurde so gewählt, dass das
Codon für die Aminsäure Phenylalanin (TTC) in der Transmembranregion des
Proteins Mtj1p durch ein amber-Codon (TAG) ersetzt wird.
Der zur PCR verwendete Vektor pIVEX2.3MCSMtj1p wird nach der Qiagen Methode
(s. 5.3.3) isoliert und gereinigt.
Zur Durchführung der PCR verwendeten Lösungen wurden gemäß Tabelle 2 in
200 µl PCR-Reaktionsgefäße pipettiert. Das Temperatur- und Zeitprofil der PCR ist in
Tabelle 3 dargestellt
5 Material und Methoden
66
10x Reaction Buffer
10
µl
dNTP-Mix (je 2 mM)
2,5 µl
pIVEX2.3MCSMtj1p (50 ng/µl)
4
µl
Primer amber1 (750 ng/µl)
2
µl
Primer amber1 (750 ng/µl)
2
µl
DMSO
2
µl
H2Obidest
77,5 µl
Pfu Turbo Polymerase (2,5 U/ml)
2
µl
Tabelle 2: Pipettierschema für die PCR
Segment
Temperatur [°C]
Zeit [Minuten]
Zyklenzahl
1
95
3
1
95
0,5
60
0,75
72
1
72
10
4
∞
2
3
30
1
Tabelle 3: Zusammenfassung der PCR-Parameter zur Konstruktion des PCRProdukts
Die PCR-Ansätze werden vor und nach der PCR auf Eis gelagert. Nach Beendigung
der PCR wird ein Aliquot der amplifizierten Probe auf ein Agarosegel aufgetragen
(s. 5.3.5), um den Erfolg des Experiments zu überprüfen. Bei erfolgreicher PCR wird
das PCR Produkt mittels des QIAquick PCR Purification Kits von Kontaminationen
befreit (s. 5.3.9) und mit den Restriktionsenzymen NdeI und XhoI nach folgendem
Schema verdaut:
5 Material und Methoden
67
PCR-Produkt
30 µl
Buffer NEB 2
4 µl
BSA (1mg/ml)
4 µl
NdeI
1 µl
XhoI
1 µl
Tabelle 4: Pipettierschema für den Verdau des PCR-Fragments
Die Reaktion erfolgt über Nacht bei 37°C und wird anschließend durch
zwanzigminütige Inkubation bei 65°C gestoppt.
Man erhält das 429 bp lange PCR-Produkt Mtj1pN-term.
5.4.2 Linearisierung von pIVEX2.3MCS
Die Linearisierung des Vektors erfolgt ebenfalls mit den Restriktionsenzymen NdeI
und XhoI. Es wurde folgendes Pipettierschema angewendet:
Vektor (1mg/ml)
10 µl
Buffer NEB 2
4 µl
BSA (1mg/ml)
4 µl
NdeI
1 µl
XhoI
1 µl
H2Obidest
20 µl
Tabelle 5: Pipettierschema für den Verdau von pIVEXMCS2.3
Die Reaktion erfolgt ebenfalls bei 37°C über Nacht mit anschließender Hitzeinaktivierung der Enzyme bei 65°C.
Der auf diese Weise erzeugte linearisierte Vektor ist 3.534 bp lang.
5 Material und Methoden
68
5.4.3 Ligation des PCR-Produkts mit linearisiertem Vektor pIVEX2.3MCS
Für die Ligation werden die Fragmente in Ligase Puffer gelöst mit T4-DNA-Ligase
versetzt und homogenisiert. Die Inkubation erfolgt über Nacht bei 25 °C. Für den
Ansatz wurde folgendes Pipettierschema benutzt:
10x Ligase Buffer
1 µl
PCR-Produkt
2 µl
lineariserter Vektor
1 µl
H2Obidest
4 µl
T4 DNA Ligase
1 µl
Tabelle 6: Pipettierschema für die Ligation
Nach thermischer Inaktivierung der Ligase bei 65°C für 20 min wird der
Ligationsansatz in kompetente E.coli DH5α transformiert.
Der erzeugte Expressionsvektor pIVEX2.3MCSMtj1pN-term ist 3963 bp lang.
Der Kontrollverdau des neuen Vektors mit NdeI und XbaI erfolgt über Nacht bei 37°C
nach dem in Tabelle 7 angegebenen Pipettierschema.
Vektor (1mg/ml)
10 µl
Buffer NEB 3
4 µl
BSA (1mg/ml)
4 µl
XbaI
1 µl
PstI
1 µl
H2Obidest
20 µl
Tabelle 7: Pipettierschema für den Kontrollverdau
Nach erfolgtem Verdau werden die Restriktionsenzyme bei 65°C hitzeinaktiviert.
5 Material und Methoden
69
5.5 Isolierung der β-Untereinheit der FoF1-ATP-Synthase des
thermophilen Bacillus PS3 aus E.coli
5.5.1 Transformation von pUCβ in E.coli
Das Plasmid pUCβ, welches sich von pUC118 ableitet und für die β-Untereinheit der
FOF1-ATP-Synthase des thermophilen Bacillus PS3 codiert, wurde in kompetente
E.coli DH5α (zur Plasmidamplifikation) und in E.coli JM109 (zur Expression)
transformiert. Von beiden transformierten Kulturen wurden Glycerinkulturen angelegt
und bei –80 °C gelagert.
5.5.2 Expression der β-Untereinheit in E.coli JM109
Aus einer Glycerinkultur wird ein Verdünnungsausstrich auf einer LBAmp-Agarplatte
angefertigt und bei 37°C über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag impft man 15 ml
2xYT Nährmedium (mit 50 µg Ampicillin pro ml) mit einer Einzelkolonie E.coli an.
Anschließend wird über Nacht bei 37°C und 300 min-1 im Wasserbadschüttler
inkubiert.
Mit der so erhaltenen Startkultur werden 500 ml 2xYT Nährmedium (100 µg/ml Amp.)
angeimpft. Es wird bei 37°C und 200 min-1 im Luftschüttler inkubiert. Von Zeit zu Zeit
wird die Zelldichte photometrisch gemessen. Die optische Dichte bei 600 nm ist bis
zu einem Wert von 0,3 proportional zur Zelldichte. Bei höheren Zelldichten muss die
Lösung entsprechend verdünnt werden.
Bei einer OD600 von 0,5 bis 0,7 werden die Zellen durch Zugabe einer 1 molaren
IPTG-Lösung zu einer Endkonzentration von 1mM induziert. Man lässt dann die
Zellen noch bis zu einer OD600 von ca. 1,5 wachsen und erntet ab. Dazu stoppt man
das Zellwachstum zuerst auf Eis ab und zentrifugiert dann die Zellsuspension bei
8.700 g bei 4 °C für 20 min. ab. Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet in
Lysepuffer (50 mM Tris⋅H2SO4 pH 8,0) resuspendiert. Alternativ kann das Zellpellet
bis zur weiteren Verwendung bei –80 °C gelagert werden.
5 Material und Methoden
70
5.5.3 Isolation der β-Untereinheit aus E.coli JM109
Die im vorherigen Schritt erhaltene Zellsuspension wird mittels eines UltraschallZelldisruptors
bei
aufgeschlossen.
70%
Leistungsabgabe
Unmittelbar
nach
dem
10
mal
10
Zellaufschluss
Sekunden
wird
1
auf
Eis
mg/ml
des
Proteaseinhibitors Pefabloc SC zugegeben. Danach wird der Zellaufschluss bei
22.000 g bei 4°C für 20 min abzentrifugiert. Der Überstand wird zur Fraktionierung
auf eine Ionenaustauschersäule (DEAE Sephacel 1,6x65 cm) appliziert, die in
Lysepuffer equillibriert ist. Dann wird die Säule mit ca. 150 ml Lysepuffer gewaschen.
Anschließend wird ein stufenweisen Natriumchloridgradient (100 mmolar 200ml, 200
mmolar 200 ml, 400 mmolar 200 ml, 600 mmolar 400 ml) angelegt.
Verfolgt man die Absorption der einzelnen Fraktionen bei 280 nm, erhält man das in
Abbildung 36 dargestellte Elutionsdiagramm.
6
1,2
1,0
1
E280
0,8
0,6
2
0,4
3
4
0,2
5
7
0,0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Fraktionen
Abbildung 36: Elutionsdiagramm zur Reinigung der β-Untereinheit an einer DEAESephacel Säule
5 Material und Methoden
71
Mit Hilfe der Proteinbestimmung nach Bradford kann in den Fraktionen 3; 4 und 5
Protein nachgewiesen werden. Zur Charakterisierung werden Proben der Fraktionen
auf ein SDS-Gel appliziert und im elektrischen Feld aufgetrennt. Die β-Untereinheit
findet sich in den Fraktionen des Peaks 5, ist aber mit niedermolekularen Proteinen
verunreinigt.
Zur weiteren Aufreinigung werden die entsprechenden Fraktionen gesammelt und
mittels einer Amicon 8050 Zelle mit YM30 Ultrafiltrationsmembran bis auf ca. 5 ml
aufkonzentriert.
Danach wird das Konzentrat auf eine Gelfiltrationssäule (Fractogel TSK HW-40 (S)
16 x 1,5 cm) appliziert. Die Säule ist in in 50 mM Tris⋅H2SO4 pH 8,0/10% Glycerin
equillibriert. Mit dem gleichen Puffersystem erfolgt die Elution. Durch Verfolgung der
Absorption bei 280 nm erhält man das in Abbildung 37 wiedergegebene
Elutionsdiagramm.
1,4
1
1,2
E280
1,0
0,8
0,6
4
0,4
2
3
0,2
0,0
0
5
10
15
20
Fraktionen
Abbildung 37: Elutionsdiagramm zur Reinigung der β-Untereinheit an einer Fractogel
TSK HW-40 (S)-Säule
5 Material und Methoden
72
Mit Hilfe der Proteinbestimmung nach Bradford und SDS-PAGE wird die
β-Untereinheit in Peak 1 identifiziert (s. Abbildung 38).
1
2
Abbildung 38: SDS-Gel der β-Untereinheit nach Gelfiltration
Bahn 1: Marker, Bahn 2: β-Untereinheit
5.5.4 Photoaffinitätsmarkierung der β-Untereinheit der FoF1-ATPSynthase des thermophilen Bacillus PS3
Die Photoaffinitätsmarkierung wird mit dem Cofaktor-Analogon 2-N3-2’,3’-SL-ATP
durchgeführt. Die Durchführung erfolgt in Anlehnung an eine Publikation von P.
Vogel (Vogel 1992).
Das Protein liegt nach der Isolierung in einem glycerinhaltigen Puffer vor. Durch
mehrmaliges Verdünnen mit dem entsprechenden Puffer und anschließendem
Aufkonzentrieren mittels VIVASPIN 2 30,000 MWCO RC wird das Enzym
umgepuffert.
Es wird der folgende Puffer verwendet:
SHPMg:
150 mM Sucrose
10 mM Hepes
10 mM KH2PO4
1mM MgSO4
pH 8,0
5 Material und Methoden
73
Anschließend wird die Proteinlösung auf eine Konzentration von 50 µM eingestellt.
Zum Markieren der katalytischen Bindungsstellen wird die Proteinlösung mit 150 µM
2-N3-2’,3’-SL-ATP 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wird die Probe
4 mal 1 Minute bei 254 nm mit einer Handlampe der Firma Camag bestrahlt. Der
Abstand Lampe – Probe beträgt dabei 1 cm. Zwischen den Bestrahlungen werden
Abstände von 30 Minuten eingehalten, um das Azido-Tetrazol-Gleichgewicht wieder
herzustellen. Der nichtgebundene Anteil an Spin-markiertem Nukleotid wird durch
mehrmaliges starkes Verdünnen der Proteinlösung mit SHPMg-Puffer und
anschließendem Aufkonzentrieren mittels VIVASPIN 2 30,000 MWCO RC entfernt.
Für die ESR-Messungen wird die Probe auf 40 bis 60 µM aufkonzentriert.
5.6 ESR-Studien an der β-Untereinheit der FoF1-ATP-Synthase des
thermophilen Bakteriums PS3
5.6.1 Geräteeinstellungen
Die ESR-Messungen erfolgten mit einem ELEXSYS E580 der Fa. Bruker im X-Band
bei 9,6 GHz. Die Temperatur wurde mit einer Temperiereinheit auf 293 K eingestellt.
Die Proben wurden mittels einer Quarzkapillare im Hohlraumresonator positioniert.
Die Modulationsfrequenz betrug 100 kHz. Die Mikrowellenleistung wurde zwischen
12,2 und 24,5 mW variiert. Die Modulation des Messsignals lag bei 1G.
5.6.2 Vorbereitung des Proteins für die ESR-Messungen
Vor Beginn der Messungen muss das Protein in der gewünschten Konzentration in
den entsprechenden Messpuffer überführt werden.
Dies
geschieht
entsprechenden
in
diesem
Puffer
und
Fall
durch
mehrmaliges
anschließendem
Verdünnen
Aufkonzentrieren
mit
mit
Microkonzentrator (VIVASPIN 2 30,000 MWCO RC der Fa.VIVASCIENCE).
dem
einem
5 Material und Methoden
74
5.7 Massenspektrometrische Untersuchungen von Peptiden und
Proteinen
5.7.1 Tryptischer Verdau von Proteinen im SDS-Gel
Alle Arbeitsschritte wurden steril durchgeführt, um Kontaminationen mit Keratin zu
verhindern.
01 Zu untersuchende Bande aus dem SDS-Gel ausschneiden und in Stücke von ca.
1x1 mm zerkleinern
02 100 µl 50 mM Ammoniumhydrogencarbonat-Lösung hinzufügen, vortexen und 5
min inkubieren
03 Zentrifugieren und Überstand entfernen
04 50 µl 10 mM DDT-Lösung hinzufügen, vortexen und 30 min bei 56°C inkubieren
05 Zentrifugieren und Überstand entfernen
06 50 µl Acetonitril hinzufügen und 10 min inkubieren
07 Zentrifugieren und Überstand entfernen
08 50 µl Iodacetamid (55 mM in 50 mM Ammoniumhydrogencarbonat-Lösung)
hinzufügen und 20 min inkubieren
09 Zentrifugieren und Überstand entfernen
10 100 µl 50 mM Ammoniumhydrogencarbonat-Lösung hinzufügen, vortexen und 10
min inkubieren
11 Zentrifugieren und Überstand entfernen
12 100 µl Acetonitril hinzufügen und 10 min inkubieren
13 Zentrifugieren und Überstand entfernen
14 Gel-Stücke 20 min im Vakuum trocknen
15 Gelstücke in 20 µl Verdau-Puffer (s. 5.3.11) rehydratisieren und 45 min bei 4°C
inkubieren. Falls die Gelstücke die gesamten Lösung absorbieren, etwas VerdauPuffer hinzufügen
16 Verdau bei 37°C über Nacht
17 Hinzufügen von 10 µl 5 mM Trifluoressigsäure
18 Extraktion der Peptide aus den Gelstücken durch heftiges Schütteln für 45 min
5 Material und Methoden
75
5.7.2 Vorbereitung von Peptiden und Proteinen für MALDI-MS
Vor der Applikation auf ein MALDI-Target müssen die Peptide entsalzt und aufkonzentriert werden. Dazu verwendet man C18-ZipTip®-Pipettenspitzen der Fa.
Millipore. Die Peptidlösung soll einen pH-Wert von 2 – 4 haben, damit die Peptide
vollständig an die C18-Matrix der Pipettenspitzen binden. Sollte dies nicht der Fall
sein, werden einige µl 5 M Trifluoressigsäure der Peptidlösung hinzugefügt und der
pH-Wert erneut überprüft.
Folgende Lösungen werden benötigt:
Befeuchtungslösung:
50%iges Acetonitril
Equillibrierlösung:
0,1%ige Trifluoressigsäure
Waschlösung:
0,1%ige Trifluoressigsäure
Elutionslösung:
HCCA gesättigt in 0,1%ige Trifluoressigsäure und
50%iges Acetonitril gesättigt mit HCCA
Die Durchführung erfolgt nach dem Protokoll des Herstellers. Die Elution der Peptide
von der C18-Matrix der Pipettenspitzen erfolgt mit 2,5 µl Elutionslösung. Das Eluat
wird direkt im Anschluss auf ein MALDI-Target präpariert. Nach dem vollständigen
Verdampfen des Lösungsmittels kann die Probe im Massenspektrometer analysiert
werden.
Im Fall von intakten Proteinen wird analog verfahren. Allerdings findet in der
Elutionslösung Sinapinsäure anstelle von HCCA Verwendung.
5 Material und Methoden
76
5.7.3 Geräteeinstellungen
5.7.3.1 Peptide
Peptide werden im Reflektor Modus als positive Ionen gemessen. Desweiteren
finden folgende Geräteparameter Anwendung.
Ionen Quelle 1
25,00 kV
Ionen Quelle 2
22,35 kV
Linse
6,00 kV
Reflektor
26,3 kV
Reflektor 2
14,8 kV
Laser Frequenz
20 Hz
Messbereich
500 – 3200 Da
Die Energie des Lasers wird bei jeder Messung manuell an die jeweilige Probe
angepasst.
5.7.3.2 Proteine
Intakte Proteine werden ebenfalls als positive Ionen gemessen. Im Gegensatz zu
den Peptiden erfolgt die Detektion im linearen Modus. Die Geräteparameter werden
wie folgt eingestellt:
Ionen Quelle 1
25,00 kV
Ionen Quelle 2
22,90 kV
Linse
6,25 kV
Laser Frequenz
20 Hz
Meßbereich
2000 – 150000 Da
Analog zu Peptiden erfolgt die Anpassung der Laserenergie ebenfalls manuell.
In beiden Fällen werden für ein Spektrum 1000 – 2000 Shots aufsummiert.
5 Material und Methoden
77
5.7.4 Kalibrierung
Zur Kalibrierung des Massenspektrometers wird für Peptide der Peptide calibration
standard der Fa. Bruker verwendet. Im Fall von Proteinen findet der Protein
calibration standard II, ebenfalls von der Fa. Bruker, Anwendung.
Die Standards werden nach der dried droplet Methode auf ein MALDI-Target
appliziert. Das heisst, zuerst werden 0,8 µl Matrixlösung (Elutionslösung, s. 5.7.2) auf
das
Target
gebracht
Herstellerangaben
und
bereiteten
getrocknet.
Danach
Standardlösung
werden
auf
Anschließend lässt man das Lösungsmittel verdampfen.
den
0,8
µl
Matrixfleck
der
nach
pipettiert.
5 Material und Methoden
78
5.8 Synthesen
5.8.1 Cyanomethylester von HO3007
2,3 mg (7,02.10-6 mol) der Spin-Label Aminosäure HO3007 werden in 20 µl
Triethylamin gelöst und auf 0°C abgekühlt. Anschließend werden 0,9 µl (14,04.10-6
mol, zweifacher Überschuss) Chloracetonitril unter Rühren hinzugefügt. Dann lässt
man die Lösung auftauen und über Nacht bei Umgebungstemperatur rühren. Am
nächsten Tag wird der entstandene Brei mit 250 µl Ethylacetat versetzt. Die
ausgefallenen Triethylammoniumsalze werden abzentrifugiert und der Überstand mit
je 100 µl 0,5 N HCl, 0,5 N KHCO3 und Wasser gewaschen. Die organische Phase
wird im Anschluss auf -78°C abgekühlt und lyophilisiert.
Man erhält das Produkt als gelben Feststoff. Laut DC auf Kieselgel 60 ist das
Produkt frei von Verunreinigungen.
Die Analyse des Produkts und des Edukts mittels DC (Kieselgel 60) liefert folgende
Ergebnisse:
Rf = 0,6 (CH2Cl2 94%, MeOH 6%) Produkt
Rf = 0,33 (CH2Cl2 94%, MeOH 6%) Edukt
5.8.2 Acylierung von dpCpA mit HO3007
2,4 mg des Ammoniumsalzes des Dinukleotids dpCpA werden mit 200 µl 0,1 M
Tetrabutylammoniumacetatlösung versetzt und lyophilisiert. Man erhält das in DMF
lösliche Tetrabutylammoniumsalz des Dinukleotids.
Das erhaltene dpCpA Pulver wird in 300 µl frisch destilliertem DMF aufgenommen.
Der Cyanomethylester von HO3007 wird in 200µl DMF aufgenommen. Beide
Lösungen werden vereint. Nach 2h rühren wird die Reaktionslösung über Nacht
lyophilisiert. Das Produktgemisch wird in 50 µl Portionen mittels einer C18-RP-HPLCSäule gereinigt. Die Säule ist in 0,1 M Ammoniumhydrogencarbonat-Lösung (pH 4,5)
equillibriert. Nach dem Auftragen der Probe auf die Säule wird ein linearer Gradient
aus 0,1 M NH4OAc-Lösung und Acetonitril angelegt. Bei einem Laufmittelgemisch
von 40%/60% wird der Gradient angehalten und mit diesem Gemisch weiter eluiert.
5 Material und Methoden
79
Alle Fraktionen werden im ESR-Spektrometer untersucht. Die das Produkt
enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und lyophilisiert.
5.8.3 Entschützen des acylierten Dinukleotids
Zum Entfernen der tBoc-Schutzgruppe von der an das Dinukleotid acylierten SpinLabel Aminosäure HO3007 wird das Dinukleotid in 500 µl frisch destilliertem DMF
aufgenommen und mit einem Tropfen wasserfreier Trifluoressigsäure versetzt. Zur
Reoxidation des Spin-Labels rührt man die Lösung eine Stunde unter Luftzufuhr und
entfernt anschließend das Lösungsmittel im Vakuum.
6 Abkürzungen
6 Abkürzungen
ADP
Adenosindiphosphat
AMP
Adenosinmonophosphat
ATP
Adenosintriphosphat
BiP
Binding Protein
bp
Basenpaare
Da
Dalton
DC
Dünnschichtchromatographie
DDT
1,4-Dithiothreitol
DMF
N,N-Dimethylformamid
DNA
Desoxyribonukleinsäure
E.coli
Escherichia coli
ESR
Elektronenspinresonanz
G
Gauß
HCCA
α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure
HPLC
high performance liquid chromatography
IPTG
Isopropyl-Thio-β-D-Galactopyranosid
MALDI
Matrix assisted laser desorption/ionisation
mRNAmessenger-Ribonukleinsäure
MS
Massenspektrometrie
PAGE
Polyacrylamidgelelektrophorese
PCR
polymerase chain reaction
Pi
anorganisches Phosphat
RNA
Ribonukleinsäure
RP
Reversed Phase
SA
Sinapinsäure
SDS
Natriumdodecylsulfat
SL
Spin-Label
TEMED
Tetramethylethylendiamin
TFA
Trifluoressigsäure
TOF
time of flight
tRNA
transfer-Ribonukleinsäure
80
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82
Danksagung
Mein Dank gilt allen, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.
Herrn Prof. Dr. J. Brunner danke ich für das großzügige Überlassen der Plasmids
pStR1.
Herrn Prof. R. Zimmermann danke ich für die Überlassung des Expressionsvektors
pIVEX2.3MCSMtj1p.
Herrn Prof. K. Hideg danke ich für die großzügige zur Verfügungstellung der
Aminosäure HO3007.
Herrn Dr. M. Jung und Herrn Dr. P. Maurer danke ich für die Hilfe bei der Erarbeitung
der Klonierungsstrategien und der in vitro Translation.
Frau Prof. P. Vogel und Herrn Dr. T. Hisabori danke ich für das großzügige
Überlassen des Plasmids pUCβ.
Weiterhin danke ich meinen Kollegen im Arbeitskreis Prof. Dr. W. E. Trommer für die
freundliche Atmosphäre und die vielen anregenden Gespräche.
In besonderem Maß möchte ich mich bei meinen Eltern bedanken, mit deren
Unterstützung das Studium und diese Arbeit erst möglich wurden.
Lebenslauf
Name:
Dirk Mannweiler
Geburtsdatum:
12. Februar 1974
Familienstand:
ledig
Staatsangehörigkeit:
deutsch
Schulausbildung:
1980 – 1990 14. Polytechnische Oberschule in Halle/S
1990 – 1992 Torgymnasium in Halle/S
(Abschluss: Abitur)
Studium
Oktober 1993 – Dezember 1999 Studium der Chemie an
der Universität Kaiserslautern
Mai 1999 – Dezember 1999 Diplomarbeit im Arbeitskreis
von Herrn Prof. W. E. Trommer mit dem Thema:
Kinetische
Untersuchungen
an
der
Glucose-Dye-
Oxidoreduktase
Promotionsstudium:
Im Arbeitskreis von Herrn Prof. W. E. Trommer Juni 2000
– Dezember 2005 an der Universität Kaiserslautern