APP - ApxIV

Eine Firma von
Serologische Diagnose der Schweine-Pleuropneumonie
anhand eines indirekten ELISAs spezifisch für
Antikörper gegen das ApxIV RTX Toxin
-APP-ApxIV
u CHEKIT-APP-Apx-IV
u Diagnostik
u Epidemiologie
u Der Erreger
Übersicht
Eine Firma von
1960 erstmals in England, in Kalifornien und in Australien beschrieben
Früher der Gruppe Heamophilus zugeordnet:
Im 1983 wird eine Verwandtschaft zwischen H. pleuropneumoniae & A. lignieresii
beschrieben
Variable Virulenz je nach Serotyp
Das Schwein ist der einzige Wirt für APP
Weltweite Verbreitung mit massgeblichem wirtschaftlichen Einfluss auf die
Schweineindustrie
15 verschiedene Serotypen
•
•
•
•
•
•
•
Eine Firma von
hoch virulent ó Schwach virulent
H. paraheamolyticus
H. pleuropneumoniae
Gramnegatives Bakterium
•
Actinobacillus pleuropneumoniae
Der Erreger
Exotoxine
Lipopolysacharide (Fennwick and Osburn, 1986)
Bakterielle Kapsel (Jnzana et al, 1993; Ward et al. 1998)
Adhesionsfaktoren (Dom et al. 1994)
Urease (Bosse and McInnes, 1997)
•
•
•
•
•
Virulenzfaktoren
Der Erreger
Eine Firma von
Apx-I
Apx-II
Apx-III
Neu Apx-IV
•
•
•
•
APX: Actinobacillus pleuropneumoniae RTX toxine
Exotoxine: RTX Toxine
Toxine
Der Erreger
Eine Firma von
Cross reaction
1
2
2
3
4
5a
5b
6
7
7
8
9
9
10
11
12
13
14
15
Serotype
APX RTX Toxine
a b
Biovar
A.suis
ApxI
Der Erreger
A.suis
A.rossii
“A.porcitonsillarum”
ApxII
-
ApxIII
Secreted toxins
-
H
L/H
L/H
L
L
H
H
L
L/H
L/H
L
H
H
H
H
L
n.d.
n.d.
n.d.
Virulence
Eine Firma von
ApxIV
Virulenz abhängig von:
•
•
Bei akuten Infektionen rasche Verbreitung im Stall (aerogen, Stallpersonal)
•
Schwache Widerstandsfähigkeit in der Umwelt
- Stallmanagement
Eine Firma von
- Prim. /sekundäre Infektionen (PRRS, Circo, Influenza, usw…)
hoch virulent ó Schwach virulent
Übertragung durch infizierte Tiere
•
- Serotyp
Hochansteckende Krankheit
•
Epidemiologie
Eine Firma von
Trägertiere ohne klinische Symptome
Problematik
Epidemiologie
Klinik
Pathologie
Serologie
Erregernachweis
•
•
•
•
Diagnostische Mittel
Diagnostik
Bakteriologie/PCR
Eine Firma von
– Arbeitsaufwendige Technik
Eine Firma von
– Schlechte Sensitivität
– Nachteil:
– Schwierige Standardisierung
– Keine Kreuzreaktion mit H. parasuis
KBR
– Vorteil:
•
Serologie
Diagnostik
– Arbeitsaufwendige Technik
Eine Firma von
– Schlechte Sensitivität
– Nachteil:
– Schwierige Standardisierung
– Keine Kreuzreaktion mit H. parasuis
Indirekte Hämaglutination
– Vorteil:
•
Serologie
Diagnostik
– Nachteil:
Eine Firma von
– Kreuzreaktionen mit anderen Keimen (A. porcitonsillarum)
– Mehrere Tests notwendig um alle Serotypen abzudecken
– Nicht serotypenspezifisch (z.B. 1-9-11)
– Leistungsmerkmale abhängig von Antigenreinigungsgrad
– Einfache Standardisierung
– Schnelle Methode
ELISA mit Kapselantigene oder zelluläres Lipopolysacharidantigen
– Vorteil:
•
Serologie
Diagnostik
– Nachteil:
Eine Firma von
– Kreuzreaktionen mit anderen Keimen
- E.coli
- A. porcitonsillarum
- Pasteurellen
- A. suis - A. rossi
– Mehrere Tests notwendig um alle Serotypen abzudecken
– Leistungsmerkmale abhängig von Antigenreinigungsgrad
– Einfache Standardisierung
– Schnelle Methode
ELISA mit ApxI, ApxII und/oder ApxIII Antigen
– Vorteil:
•
Serologie
Diagnostik
ELISA mit ApxIV
(Schaller et al. 2001)
– Vorteil:
•
Serologie
Eine Firma von
– Differenzierung von geimpften und infizierten Tieren
– APP spezifisch
– Erfassung aller 15 Serotypen
– Einfache Standardisierung
– Schnelle Methode
Diagnostik
1
6xHis
6xHis
pJFFROK7
600
400
200
ApxIV-N‘
hydrophobic domains
800
1000
ApxIV
6xHis
ApxIV
1800
1400
1200
10xHis
10xHis
Eine Firma von
ApxIV-C‘
repeated glycine-rich nonapeptides
1600
Affinitätschromatografische Reinigung mit Ni2+ Chelate
Expression in E. coli B Stamm BL21(DE3)
Produktion und Reinigung von rekombinantem ApxIV
Diagnostik
aa
ApxIV-N’
ApxIV-C’
1
2
3
4
5a
5b
6
7
8
9
10
11
12
Experimentelle
Infektion
mit 12 APP
Serotypen
88-1368/3
88-1209/14
88-1209/58
88-1356/657
88-1209/35
1925 Bre
1926 Bre
1930 Bre
1935 Bre
1765 Jen
Control +
Schaller et al. (1999)
Natürliche Natürliche
Infektion Infektion
mit APP1 mit APP2
Eine Firma von
Seren von
APP freien
Schweinen
Ko 91- 446
Ko 91- 447
Kel. 1
Kel. 2
Kel. 3
Kel. 4
Control +
A. suis
24.4
33.1
48.9
75.0
113.0
198.0
kDa
Serologische Reaktion von ApxIV mit Serum von
experimentell und natürlich APP infizierten
Schweine
Standard
32.2 -
47.5 -
62 -
83 -
175 -
kDa
ApxII
ApxI
serotype 2
serotype 1
ApxIVA
ApxIII
ApxII
ApxIVA
ApxIVA
anti- anti- antiApxI ApxII ApxIII
Ak
Ak
Ak
ApxI
ApxIII
Schaller et al. (1999)
anti - ApxIVA Ak
std
Serum von einem
A. suis
infizierten Tier
ApxII
Eine Firma von
19.5 -
29.5 -
50.3 -
80 -
123 -
ApxI
ApxIVA
std
Antigenetische Spezifität von von ApxIVA
ApxIII
ApxIVA
32
47
83
175
kDa
Serotyp 1
2
3
1
Serotyp 5
4
5
6
Serotyp 7
7
8
9
Schaller et al. (1999)
Eine Firma von
ApxIVA-C’
ApxIVA-N’
ApxIVA
T. n. i
Tier-Nr.
ApxIV wird nur während der Infektion exprimiert
0
14
120
0
14
120
0
14
120
0
14
120
0
14
120
0
14
120
0
14
120
0
14
120
0
14
120
Cross reaction
1
2
2
3
4
5a
5b
6
7
7
8
9
9
10
11
12
13
14
15
Serotype
a
b
Biovar
A.suis
ApxI
A.suis
A.rossii
“A.porcitonsillarum”
ApxII
-
ApxIII
Secreted toxins
ApxIV Zusammenfassung
Eine Firma von
-
ApxIV
H
L/H
L/H
L
L
H
H
L
L/H
L/H
L
H
H
H
H
L
n.d.
n.d.
n.d.
Virulence
Eine Firma von
-APP-ApxIV
10 Platten Kit
2 x 5 Stück
1 x 0.6 ml
2 x 0.9 ml
2 x 0.9 ml
1 x 100 ml
3 x 100 ml
2 x 100 ml
1 x 60 ml
2 Platten Kit
2 Stück
1 x 0.6 ml
1 x 0.9 ml
1 x 0.9 ml
1 x 100 ml
1 x 100 ml
1 x 100 ml
1 x 60 ml
à 60 ml
à 100 ml
à 500 ml
à 100 ml
à 0.9 ml
à 0.9 ml
à 1.2 ml
à 5 Stück
"Bulk" Ware
Eine Firma von
CHEKIT-TMB-Stopplösung, gebrauchsfertig.
CHEKIT-TMB-Substrat, gebrauchsfertig.
CHEKIT-10x-Konzentrat, nicht gebrauchsfertig.
CHEKIT-APP-ApxIV Probenverdünner, gebrauchsfertig
CHEKIT-APP-ApxIV-Kontrollserum , negativ, vom Schwein,
konserviert mit 0.1 % Natriumazid.
CHEKIT-APP-ApxIV-Kontrollserum , positiv, vom Schwein,
konserviert mit 0.1 % Natriumazid.
CHEKIT-Anti-Schwein-IgG-PO-Konjugat, monoklonal,
markiert mit Meerrettichperoxidase.
CHEKIT-APP-ApxIV Testplatten, mit rekombinantem ApxIV
Antigen beschichtet.
-APP-ApxIV
Wasch-& Verdünnerlösung
= ApxIV Antigen
Inkubation:
60 Minuten bei 37°C
TMB-Substrat:
100 µl / Well
Eine Firma von
= anti-Schwein-PO-Konjugat
Waschen der Platte:
3 x 300 µl
Inkubation:
Wasch-& Verdünnerlösung 20 + 5 Minuten, bei
Inkubation:
RT
60 Minuten bei 37°C
messen bei 450 nm
Konjugat
Verdünnung:
1:400, 100 µl/Well
= anti-ApxIV AKs
Verdünnung der Proben und Kontrollen:
1:10 Verdünnung
Waschen der Platte:
100 µl/Well
3 x 300 µl
Testablauf
-APP-ApxIV
n = 208
111 negative Proben
97 positive Proben
ROC Kurve
0
20
40
60
80
100
0
20
APP
60
100-Specificity
40
-APP-ApxIV
Sensitivity
80
100
Eine Firma von
Verteilung
-100
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
APP
Diagnosis=1
Positive
-APP-ApxIV
CHEKIT-APP-ApxIV (S/P in %)
APP
Diagnosis=0
Negative
Eine Firma von
>30.4
Sens: 93.8
Spec: 100.0
111 Proben von
SPF Tieren und
von Herden ohne
APP
Vorgeschichte
(Western Blot
negativ)
0
10
20
30
40
1
< -5
50
20
-5 - 0
60
67
20
3
20 - 25
15 - 20
-
CHEKIT-APP-ApxIV % classes
0-5
70
5 - 10
80
10 - 15
Spezfität
25 - 30
Number of samples
-APP-ApxIV
35 - 40
+
Eine Firma von
?
> 40
30 - 35
Eine Firma von
Ak gegen 9953L55 kreuzreagieren mit App S1- 9 -11 spezifischen LPS ELISA
Phylogenetische Analyse (16S rRNA) : Stämme unterscheiden sich von App
Experimentelle Infektion: beide Stämme sind nicht pathogen
h Mit allen phänotypischen Eigenschaften von APP
h Ursprünglich antigenetisch und biochemisch als APP S1 und APP S9 erkannt
- Keine pathologischen Veränderungen
- Historisch kein APP im Bestand
h Isoliert von Schweinen: - Ohne klinische Symptome einer Pleuropneumonie
Zwei atypische Actinobacillus Stämme (9953L55 and 0347) wurden isoliert:
Gottschalk et al., University of Montréal, 2003
Nicht pathogener Actinobacillus Stamm
Gottschalk et al. (2003)
Eine Firma von
Stamm 953L55 führt zu Kreuzreaktionen in konventionellen O-Ketten LPS
ELISA (Gottschalk et al., 2003)
Non-pathologische Actinobacillus Isolate
1
2
3
-APP-ApxIV
4
5
Eine Firma von
1 = APP negative Schweine, n = 134
2 = APP/6 experimentell infizierte Schweine ± 30 Tage n.i., n = 2
3 = APP/7 experimentell infizierte Schweine ± 30 Tage n.i., n = 2
4 = APP/10 experimentell infizierte Schweine ± 30 Tage n.i., n = 2
5 = “A. porcitonsillarum” experimentell infizierte Schweine 55 Tage n.i. n = 4
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Spezifität
CHEKIT-APP-ApxIV (%)
- Alle Tiere zeigten
- Infektionskeim wurde aus
Läsionen isoliert
- Euthanasie nach 5 Wochen
Experimentelle Infektion
- aerosol
- 10 Wochen alte SPF Tiere
- APP Serotyp 6, 7 and 10.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Analytische Sensitivität
-1
dpi
-
?
+
3
Figure 2a.
-APP-ApxIV
CHEKIT- APP- ApxIV (%)
7
10
dpi
14
17
APP Serotype 7
24
32
Eine Firma von
21
34
CHEKIT- APP - ApxIV (%)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
1
-
?
-
?
+
+
2
3
4
dpi
5
APP Serotype 6
-APP-ApxIV
6
7
8
Eine
Firma von
A company
of
9
CHEKIT- APP- ApxIV (%)
0
50
100
150
200
250
300
0
3
6
10
13
17
dpi
20
24
27
APP Serotype 10
-APP-ApxIV
31
34
41
Eine Firma von
38
-
?
+
5-10x höhere Sensitivität
verglichen mit der KBR
Titer 1/320
APP/2 KBR Referenzserum
(VLDIA070, SW-APP2, AHS,
Deventer, NL).
Analytische Sensitivität
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1/1.25
-APP-ApxIV
CHEKIT-APP-ApxIV (%)
1/5
1/20
Dilution
1/320
Eine Firma von
1/80
-
?
+
ApxIV negativ
Impfung
Eine Firma von
ApxIV positiv
Infektion
Differenzierung zwischen geimpften (Porcilis APP) und infizierten Tieren
-APP-ApxIV
Titer (LOG2)
9
10
11
12
13
14
Age (week)
-10.0
-10.0
8
-5.0
-5.0
7
0.0
0.0
6
5.0
10.0
10.0
5.0
15.0
15.0
Group 1 (Control)
Porcilis APP trial
PP (%)
Eine Firma von
Apx IV (%)
OMP (titer)
Apx III (titer)
Apx II (titer)
Apx I (titer)
Titer (LOG2)
9
10
11
12
13
14
1st vacc.
Pig age (week)
2nd vacc.
-10.0
-10.0
8
-5.0
-5.0
7
0.0
0.0
6
5.0
10.0
10.0
5.0
15.0
15.0
Group 2 (Lot vaccin 70405 A)
PP (%)
Titer (LOG2)
7
8
9
10
11
12
13
14
-10.0
-10.0
Apx IV (%)
OMP (titer)
Apx III (titer)
Apx II (titer)
Eine Firma von
Pig age (week)
2nd vacc.
-5.0
-5.0
1st vacc.
0.0
0.0
5.0
10.0
10.0
5.0
15.0
6
Group 3 (Lot vaccin 70409B)
15.0
Apx I (titer)
Porcilis APP trial
PP (%)
Submitted (2003)
b
Eine Firma von
Institute of Veterinary Bacteriology, University of Berne, Laenggass-Strasse 122, CH-3001 Bern, Switzerland
Bommeli Diagnostics, Stationsstr. 12, CH-Liebefeld, Bern, Switzerland
c Intervet International, P.O. Box 31, NL-5830 AA Boxmeer, The Netherlands.
d Unité de mycoplasmologie bactériologie, AFSSA, BP 53, F-22440 Ploufragan, France
e Laboratoire de développement et d'analyses des Côtes d'Armor, BP 54, F-22440 Ploufragan, France
f Danish Veterinary Institute, Bülowsvej 27, DK-1790 Copenhagen V, Denmark
g Clinic for Swine Diseases University of Berne, and pig health service, Bremgartenstrasse 109 A, CH-3012 Bern
h SBAG Schlachtbetrieb SG AG, CH-9015 St. Gallen,
a
A. Dreyfusa, A. Schallerb, S. Nivolletb, R.P.A.M. Segersc, M. Kobisch d, L. Mieli e, V. Soerensen f, D.
Hüssya, R. Misereza, W. Zimmermanng, F. Inderbitzinh and J. Freya
Use of recombinant ApxIV in serodiagnosis of Actinobacillus pleuropneumoniae
infections; development and prevalidation of the ApxIV ELISA.
Bestätigungsmethode: Western-blot
-APP-ApxIV
u
u
u
u
u
95% - 100 %
99% - 100%
Eine Firma von
Differenzierung zwischen geimpften (Porcilis APP) and infizierten Tieren
Keine Kreuzreaktionen mit anderen Keimen
Einzige serologische Methode welche alle Serotypen abdeckt
Sensitivität:
Spezifität:
Zusammenfassung
-APP-ApxIV
-APP-ApxIV
Eine Firma von