Elektrophorese

Elektrophorese
Herbstsemester 2015
ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid | Dr. Martin Badertscher, [email protected]
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Elektrophorese
Allgemein:
Wanderung geladener Teilchen im elektrischen Feld
Analytische Chemie:
Trennung von Ionen im elektrischen Feld
(Elektrophoretische Trenntechniken zählen
im Allgemeinen nicht zur Chromatographie)
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„Chromatographie-Check“
Damit eine Technik eine Chromatographie ist, müssen folgende Punkte
vorhanden bzw. erfüllt sein:
•  Trenntechnik
•  Zwei nicht mischbare Phasen
•  Eine mobile und eine stationäre Phase
•  Trennung beruht auf der Verteilung von Substanzen zwischen den Phasen
•  Kontinuierliche Abfolge von Gleichgewichtseinstellungen
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Übersicht Elektrophorese:
•  Gel-Elektrophorese
•  Agarose-Gelelektrophorese, Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)
•  Natriumdodecylsulfat-PAGE (SDS-PAGE)
•  Kapillarelektrophorese (CE)
•  Kapillarzonenelektrophorese (CZE)
•  Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC)
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Gel-Elektrophorese
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Gel-Elektrophorese
Gel-Elektrophorese: http://www.youtube.com/watch?v=qMxQ-65qYDk
„Genetischer Fingerabdruck“: http://www.youtube.com/watch?v=W5HeXufSFE4
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Agarose-Gelelektrophorese
Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)
–
Standard
Probenauftragung
Probe
•  Moleküle wandern entsprechend ihrer Ladung
im elektrischen Feld
•  Das Gel behindert die Moleküle bei ihrer Wanderung
•  Kleine Moleküle wandern schneller als grosse
•  Detektion: chemische Anfärbemethoden
(z.B. Fluoreszenz)
•  Trennung aufgrund von Ladung und Molekülgrösse
+
Probe: DNA-Fragment
mit 522 Basenpaaren (bp)
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•  z.B. Auftrennung von DNA-Fragmenten
(z.B. „Genetischer Fingerabdruck)
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Agarose-Gelelektrophorese, PolyacrylamidGelelektrophorese (PAGE)
Z.B.: DNA fingerprinting
•  Trennung nach
Ladung und Grösse
•  Grösse:
hydrodynamischer
Durchmesser
•  Proteine werden
also nach Ladung,
Molekulargewicht
und Faltung getrennt
•  Bei Proteinen wird
häufig die SDS-PAGE
angewandt
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SDS-PAGE
SDS =
sodium dodecyl sulfate
Natriumdodecylsulfat
Natriumlaurylsulfat
C12H25NaO4S
Tensid, Detergent =
Herabsetzen der Grenzflächenspannung
zwischen zwei Phasen
z.b.: Öl und Wasser fein vermengbar
SDS bildet Mizellen
SDS denaturiert Proteine
SDS bildet negativ geladene
Komplexe mit Proteinen
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SDS-PAGE
•  Trennung von negativ
geladenen Komplexen
von SDS mit denaturierten,
entfalteten Proteinen
•  Faltung beeinflusst nicht
die Trennung
•  Zahl der SDS-Moleküle pro
Protein hängt nur vom
Molekulargewicht ab,
Eigenladung der Proteine
spielt keine Rolle
•  Trennung von Proteinen
nur aufgrund des
Molekulargewichts
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SDS-PAGE
•  Trennung von negativ
geladenen Komplexen
von SDS mit denaturierten,
entfalteten Proteinen
SDS-PAGE-Trennung verschiedener Proteine (1-8)
gemäss ihres Molekulargewichts.
Links: Gemisch von Proteinen bekannter Grösse
als Molekulargewichtsstandard (14–97 kDa)
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• 
Faltung beeinflusst nicht
die Trennung
• 
Zahl der SDS-Moleküle pro
Protein hängt nur vom
Molekulargewicht ab,
Eigenladung der Proteine
spielt keine Rolle
• 
Trennung von Proteinen
nur aufgrund des
Molekulargewichts
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Übersicht Elektrophorese:
•  Gel-Elektrophorese
•  Agarose-Gelelektrophorese, Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)
•  Natriumdodecylsulfat-PAGE (SDS-PAGE)
•  Kapillarelektrophorese (CE)
•  Kapillarzonenelektrophorese (CZE)
•  Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC)
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Kapillarelektrophorese
(capillary electrophoresis = CE)
Migration eines Ions
im elektrischen Feld E
Analyten müssen „geladen“ sein
(basische oder acide Analyten)
Elektrophorese ist keine
Chromatographie!
Adenosine Triphosphate
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Neuraminsäuren
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CE: Theoretische Grundlagen
Elektrophoretische Mobilität µEP eines Ions im elektrischen Feld E
η ... Viskosität der Pufferlösung
z ... Ladung des Ions
r ... Hydrodynamischer Durchmesser des Ions
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Ion (Analyt)
Pufferlösung
e ... Elementarladung
Konstante
µEP
v Geschwindigkeit eines Ions e 1 z
= =
=
⋅ ⋅
E
Elektrische Feldstärke
6π η r
Trennung
aufgrund von
Ladung und
Grösse der Ionen
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CE: Theoretische Grundlagen
Migration der Ionen im elektrischen Feld
v Geschwindigkeit eines Ions e 1 z
=
=
⋅ ⋅
E
Elektrische Feldstärke
6π η r
Analyt
+
Anode
Man würde in diesem Fall nur die
Kationen detektieren…
-
Analyt
Anionen wandern in Richtung
Anode und
Kationen in Richtung Kathode
Detektor
Probeneinlass
Analyt
Analyt
+
Analyt
+
+
Analyt
Analyt
–
Kathode
µEP =
Nach dem Probeneinlass wird Spannung angelegt (bis zu 30.000V)
Analytionen trennen sich nach Ladung (und Grösse)
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CE: Theoretische Grundlagen
Elektroosmotischer Fluss (EOF) bei Quartzkapillaren
Quarzkapillare (SiO2)
-
Analyt
EOF
+
Analyt
Quarzkapillare (SiO2)
–
Kathode
Anode
+
Aufgrund der negativ geladenen Innenwand der Quarzkapillare bildet sich ein Fluss
der Pufferlösung in Richtung Kathode aus, der elektroosmotische Fluss (EOF).
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Kapillarzonenelektrophorese (CZE)
•  Trennung von
Kationen und Anionen
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Anionen
Neutrale Moleküle
(ungetrennt)
Kationen
•  Neutrale Moleküle verlassen
ungetrennt mit dem EOF
die Kapillare
•  Detektor wegen EOF
kathodenseitig angebracht
•  Nur Anionen, die schneller als
der EOF wandern, erreichen
den Detektor nicht
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Aufbau eines CE Systems:
A)
B)
C)
2 x glass vials
Fused silica capillaries
High voltage power supply
(with platin electrodes)
A
C
D) Detector
B
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D)
B
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CE: Beispiel
Trennung von Metaboliten:
75cm Kapillare
Voltage: -15/-20/-25/-30
Ammonia bicarbonate
EOF block, pumping
Detektion:
Elektropherogram
In der Regel UV Detektoren
Kopplung an MassenSpektrometrie ist schwierig
Trennung:
Spannung (+/-)
Kapillarlänge
Puffer
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CE: Beispiel
Detektion:
In der Regel UV Detektoren
Kopplung an MassenSpektrometrie ist schwierig
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