Elektrophorese

Analytische Chemie
(für Biol. / Pharm. Wiss.)
Teil: Trenntechniken (Chromatographie, Elektrophorese)
Dr. Thomas Schmid
HCI D323
[email protected]
http://www.analytik.ethz.ch/
ETH Zurich | Dr. Thomas Schmid | [email protected]
Herbstsemester 2011
Elektrophorese
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Elektrophorese
Allgemein:
Wanderung geladener Teilchen im elektrischen Feld
Analytische Chemie:
Trennung von Ionen im elektrischen Feld
Elektrophoretische Trenntechniken zählen
im Allgemeinen nicht zur Chromatographie
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„Chromatographie-Check“
Damit eine Technik eine Chromatographie ist, müssen folgende Punkte
vorhanden bzw. erfüllt sein:
•  Trenntechnik
•  Zwei nicht mischbare Phasen
•  Eine mobile und eine stationäre Phase
•  Trennung beruht auf der Verteilung von Substanzen zwischen den Phasen
•  Kontinuierliche Abfolge von Gleichgewichtseinstellungen
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Elektrophorese
•  Gel-Elektrophorese
•  Agarose-Gelelektrophorese,
Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)
•  Natriumdodecylsulfat-PAGE (SDS-PAGE)
•  Kapillarelektrophorese (CE)
•  Kapillarzonenelektrophorese (CZE)
•  Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC)
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Gel-Elektrophorese
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Gel-Elektrophorese
Gel-Elektrophorese: http://www.youtube.com/watch?v=qMxQ-65qYDk
„Genetischer Fingerabdruck“: http://www.youtube.com/watch?v=W5HeXufSFE4
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Agarose-Gelelektrophorese,
Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)
Standard Probe
–
•  Moleküle wandern entsprechend ihrer Ladung
im elektrischen Feld
•  Das Gel behindert die Moleküle bei ihrer Wanderung
•  Kleine Moleküle wandern schneller als grosse
•  Detektion: chemische Anfärbemethoden
(z.B. Fluoreszenz)
•  Trennung aufgrund von Ladung und Molekülgrösse
•  z.B. Auftrennung von DNA-Fragmenten
(z.B. „Genetischer Fingerabdruck)
+
Probe: DNA-Fragment
mit 522 Basenpaaren (bp)
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Agarose-Gelelektrophorese,
Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)
•  Trennung nach
Ladung und Grösse
•  Grösse:
hydrodynamischer
Durchmesser
•  d.h.: Proteine werden
nach Ladung,
Molekulargewicht
und Faltung getrennt
•  Bei Proteinen wird
häufig die SDS-PAGE
angewandt
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SDS-PAGE
SDS =
sodium dodecyl sulfate
Natriumdodecylsulfat
Natriumlaurylsulfat
C12H25NaO4S
Tensid
SDS bildet Mizellen
SDS denaturiert Proteine
SDS bildet negativ geladene
Komplexe mit Proteinen
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SDS-PAGE
•  Trennung von negativ
geladenen Komplexen
von SDS mit denaturierten,
entfalteten Proteinen
•  Faltung beeinflusst nicht
die Trennung
•  Zahl der SDS-Moleküle pro
Protein hängt nur vom
Molekulargewicht ab,
Eigenladung der Proteine
spielt keine Rolle
•  Trennung von Proteinen
nur aufgrund des
Molekulargewichts
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SDS-PAGE
•  Trennung von negativ
geladenen Komplexen
von SDS mit denaturierten,
entfalteten Proteinen
•  Faltung beeinflusst nicht
die Trennung
•  Zahl der SDS-Moleküle pro
Protein hängt nur vom
Molekulargewicht ab,
Eigenladung der Proteine
spielt keine Rolle
SDS-PAGE-Trennung verschiedener Proteine (1-8)
gemäss ihres Molekulargewichts.
Links: Gemisch von Proteinen bekannter Grösse
als Molekulargewichtsstandard (14–97 kDa)
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•  Trennung von Proteinen
nur aufgrund des
Molekulargewichts
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Kapillarelektrophorese
(capillary electrophoresis = CE)
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CE: Theoretische Grundlagen
Elektrophoretische Mobilität µEP eines Ions im elektrischen Feld E
η ... Viskosität der Pufferlösung
z ... Ladung des Ions
r ... Hydrodynamischer Durchmesser des Ions
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Ion (Analyt)
e ... Elementarladung
Pufferlösung
Konstante
µEP
v Geschwindigkeit eines Ions e 1 z
= =
=
" "
E
Elektrische Feldstärke
6! # r
Trennung
aufgrund von
Ladung und
Grösse der Ionen
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CE: Theoretische Grundlagen
Elektroosmotischer Fluss (EOF)
Quarzkapillare (SiO2)
EOF
Quarzkapillare (SiO2)
–
Kathode
Anode
+
Aufgrund der negativ geladenen Innenwand der Quarzkapillare bildet sich ein Fluss
der Pufferlösung in Richtung Kathode aus, der elektroosmotische Fluss (EOF).
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Kapillarzonenelektrophorese (CZE)
•  Trennung von
Kationen und Anionen
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Anionen
Neutrale Moleküle
(ungetrennt)
Kationen
•  Neutrale Moleküle verlassen
ungetrennt mit dem EOF
die Kapillare
•  Detektor wegen EOF
kathodenseitig angebracht
•  Nur Anionen, die schneller als
der EOF wandern, erreichen
den Detektor nicht
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Mizellare Elektrokinetische
Chromatographie (MEKC)
Abhängig von ihrer
Polarität halten sich
die Analyten v.a.
in der Pufferlösung
(polar) oder in den
Mizellen (unpolar) auf.
Dem Puffer wird ein
Tensid (z.B. SDS)
zugegeben, welches
Mizellen bildet.
•  Trennung ungeladener Analyten (keine Ionen)
•  Chromatographie
•  Mobile Phase:
Pufferlösung (polar)
•  Pseudo-stationäre Phase: Mizellen (unpolar)
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Mizellare Elektrokinetische
Chromatographie (MEKC)
•  Trennung von
ungeladenen Analyten
•  Pufferlösung (mobile Phase)
bewegt sich wegen EOF
in Richtung Kathode
•  Mizellen (pseudo-stationäre
Phase) bewegen sich langsamer
•  Elutionsreihenfolge wie in
RP-HPLC: polare Moleküle
eluieren vor unpolaren
hoch
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Polarität der Analyten
gering
•  Detektor wegen EOF
kathodenseitig angebracht
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Zusammenfassung: Elektrophorese
•  Gel-Elektrophorese
•  Agarose-Gelelektrophorese, Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)
•  Trennung geladener Makromoleküle (z.B. DNA-Fragmente)
•  Trennung aufgrund von Ladung und Grösse (Faltungszustand)
•  Natriumdodecylsulfat-PAGE (SDS-PAGE)
•  Trennung von Proteinen (als SDS-Protein-Komplex)
•  Trennung nur aufgrund des Molekulargewichts
•  Kapillarelektrophorese (CE)
•  Kapillarzonenelektrophorese (CZE)
•  Trennung geladener, kleiner Moleküle (z.B. Aminosäuren, Ionen)
•  Trennung von Kationen und Anionen (wegen EOF)
•  Mizellare Elektrokinetische Chromatographie (MEKC)
•  Trennung ungeladener, kleiner Moleküle
•  Trennung aufgrund der Polarität (Elutionsreihenfolge analog RP-HPLC)
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