WS06 Mikrobiologie und Hygiene VU / SS07

HYGIENE
Skriptum für Studierende der Pharmazie
WS 06 Mikrobiologie und Hygiene
VU (4St)
SS 07 Hygiene und Mikrobiologie
VU (3St)
Institut für Hygiene der Medizinischen Universität
Universitätsplatz 4
8010 Graz
Platzer S., G. Ruckenbauer, F. Mascher, F.F. Reinthaler
1
Inhaltsverzeichnis
1. Kultivierung von Bakterien …………..……………………………………………. 3
2. Spezielle Identifikationsverfahren …………………………………………….….. 4
3. Färbemethoden ……………………………………………………….................... 5
4. Schnelltests zur Keimidentifizierung …………………………………….……….. 7
5. Physiologische Besiedelung des Menschen ……………………………………14
Praktische Übung - Handabklatsch ………………………………….………. 14
Praktische Übung - Rachenabstrich ………………………………….……… 15
Praktische Übung - Interdentalabstrich ……………………………...………. 16
6. Lebensmittelmikrobiologie ……………………………………………………..… 17
Praktische Übung - Nahrungsmitteluntersuchung ………………………….. 19
Praktische Übung - Umgebungsabstrich ……………………………………. 20
7. Chemotherapeutika ………………………………………………………….…… 21
Praktische Übung - Agardiffusionstest ………………………...…………….. 23
8. Harnwegsinfekt ……………………………………...………………………….… 24
Praktische Übung - HWI / Uricult …………………………………………... 24
9. Der bakteriologische Trinkwasserbefund ……………………………….....……26
10 Blut ………………………………………………………………………………… 40
2
1. Kultivierung von Bakterien
Definition: Bakterien außerhalb ihres natürlichen Standortes zur Vermehrung bringen.
Inokulation: Verbringung bakterienhältigen Materials in ein Kulturmedium
Inkubation: „Bebrütung“ der beimpften Kulturmedien
Kultur: die durch Vermehrung entstandene Bakterienpopulation
flüssige Kulturmedien: Nährbouillon (Fleischextrakt, Pepton, Glucose)
feste Kulturmedien: Nährbouillon + 2% Agar (Polysaccharid aus Seetang)
Minimalmedium: "Existenzminimum"
Optimalmedium: komplexe Universalmedien, die das Wachstum vieler Bakterien
fördern (Substrate im Überfluss)
Selektivmedium: selektiv für einzelne Keimgruppen wachstumshemmend; zur
Anreicherung „interessanter“ Keime, um sie von Begleitflora zu trennen
Differentialmedium: enthalten Stoffe, welche von einzelnen Bakterienarten
metabolisiert werden Stoffwechselprodukte werden zB durch Farbindikatoren
angezeigt („Bunte Reihe“)
Direkter Nachweis von Bakterien oder deren Produkten
Mikroskop: nativ - Einfachfärbungen - Differentialfärbungen
Form- und Größe der Zellen, Flagellen, Kapseln, Sporen usw.; Pseudozellverbände,
Färbeverhalten
Kultivierung: auf festen und flüssigen Nährmedien
Makroskopisch-morphologische Merkmale der Kolonien
Physiologische Merkmale
Wachstumsbedingungen (t°, C, pH, pO2, pCO2, osmot.Druck, Nährstoffe, Mineralien)
Stoffwechseleigenschaften (Verwertung von C- und N-Quellen, Nachweis von Stoffwechselprodukten und Enzymen)
Chemische Merkmale (DNA-Struktur, Antigen-Struktur)
3
2. Spezielle Identifikationsverfahren
Identifizierung von Bakterien heißt, sie mit so wenigen Eigenschaften wie möglich und so
vielen wie notwendig zu bestimmen, um einer unbekannten Kultur ihren Platz in der
Klassifikation zuzuordnen und damit auch benennen zu können. (z.B. Bestimmung
morphologischer Merkmale wie Gramverhalten, Form, Größe oder physiologischer Merkmale
wie z.B. den Nachweis verschiedener Enzyme wie Katalase oder Koagulase ...)
Anlegen einer Kultur:
In vielen Fällen sind in einer Untersuchungsprobe mehrere Bakterienarten enthalten. Da nur von
einer Reinkultur einer Bakterienspezies eine entsprechende Identifizierung möglich ist, ist eine
Trennung der unterschiedlichen Bakterienarten notwendig.
Man entnimmt das zu identifizierende Material mit einer sterilen Öse und bringt es im oberen
Drittel des Nährbodens auf. Danach wird die Platinöse ausgeglüht und abgekühlt. Mit der
sterilen Öse wird nun das Material im Winkel von 90° auf das darunterliegende Drittel gebracht.
Darauf folgt eine nochmalige Sterilisation der Öse. Das Material aus dem zweiten Drittel wird
wiederum im Winkel von 90° über den Rest der noch unbeimpften Nährbodenfläche verteilt.
Durch die Wahl eines entsprechenden Selektivnährmediums kann teilweise unerwünschtes
Keimmaterial („Begleitflora“) im Wachstum unterdrückt werden.
4
3. Färbemethoden
Methylenblaufärbung:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
kl.Tropfen NaCl-Lösung auf entfetteten Objektträger auftropfen
Untersuchungsmaterial einrühren (vom Abstrichtupfer oder Material von der Kultur)
Präparat lufttrocknen
Hitzefixieren (3x durch die Flamme ziehen)
1-2 Minuten
Methylenblau
mit Wasser abspülen
Lufttrocknen
Mikroskopieren (1000fach; Ölimmersion)
Gramfärbung:
1. 1 kl.Tropfen NaCl-Lösung auf entfetteten Objektträger auftropfen
2. Untersuchungsmaterial einrühren (vom Abstrichtupfer oder Material von der Kultur)
3. Präparat lufttrocknen
4. Hitzefixieren (3x durch die Flamme ziehen)
5. 2 Minuten
Gentiana(Kristallviolett-)lösung
mit Wasser abspülen
6. 2 Minuten
Lugol`sche Lösung
mit Wasser abspülen
7. ca. 20 Sekunden
96% - Alkohol
mit Wasser abspülen
8. 2 Minuten
Karbolfuchsin
mit Wasser abspülen
9. Lufttrocknen
10. Mikroskopieren (1000fach, Ölimmersion)
Grampositiv:
Gramnegativ:
dunkelblau
rot
Neisserfärbung:
1. essigsaures Methylenblau (2 Teile) + Kristallviolett (1 Teil) - knapp vor Benützung mischen
2. 20 - 30 Sekunden auf hitzefixiertes Präparat auftragen
3. mit Wasser abspülen
4. 10 Sekunden
Lugol´sche Lösung (mit 1% Milchsäure versetzt)
5. abspülen mit Wasser
6.. 5-7 Minuten
Bismarckbraun
7. mit Wasser abspülen und lufttrocknen
8. Mikroskopieren (1000fach; Ölimmersion)
Diphtherie: Stäbchen hellbraun; Polkörperchen schwarzblau Lagerung oft V oder Y förmig
apathogene Corynebakterien: Stäbchen hellbraun; Polkörperchen wenige bis keine Lagerung,
oft palisadenartig (////)
5
Ziehl-Neelsen-Färbung:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Ausstrich lufttrocknen und hitzefixieren
10 Minuten
Isopropanol
mit Wasser abspülen
Karbolfuchsin auftragen und erhitzen bis Dämpfe aufsteigen und 10 Minuten belassen
mit Wasser abspülen
10 Minuten
mit HCl-Alkohol entfärben
mit Wasser abspülen
10 Minuten
wässriges Methylenblau
mit Wasser abspülen, lufttrocknen und mikroskopieren (1000fach; Ölimmersion)
säurefeste Stäbchen: rot
übrige Strukturen: blau
Kapseldarstellung:
Kapseln oder Schleimhüllen von Bakterien sind im Lichtmikroskop nicht erkennbar, können
durch eine „Negativdarstellung“ mit Tusche aber sichtbar gemacht werden. Die Tuschepartikel
können nicht in die Schleimhülle oder Kapsel eindringen, wodurch diese Strukturelemente hell
auf dunklem Tuschehintergrund erscheinen. Die Bakterienzelle selbst wird mit Methylenblau
gefärbt.
Durchführung und Auswertung:
1. eine Impföse mit Bakterien in 1 ml Salzlösung suspendieren und mit 1 ml Tusche mischen
2. Gemisch mit Impföse auf entfetteten Objektträger aufbringen, mit Objektträger dünn ausstreichen und trocken lassen
3. Hitzefixieren (3x durch die Flamme ziehen)
4. 5 Minuten
mit Methylenblaulösung bedecken
5. Methylenblau gut abspülen, lufttrocknen und mikroskopieren (1000fach; Ölimmersion)
Schleimhüllen oder Kapseln erscheinen hell auf dunklem Hintergrund,
Bakterienzellen blau
Sporenfärbung:
In gut sporulierenden Kulturen lassen sich die Sporen als stark lichtbrechende Körperchen
innerhalb der Bakterienzelle bzw. als freie Sporen mit dem Phasenkontrastmikroskop feststellen
(40er Objektiv oder 100er Objektiv mit Ölimmersion). Zur Einleitung der Sporulationsphase bei
endosporenbildenden Bakterien werden diese Organismen auf Sporulationsagar kultiviert. Die
Methode der Sporenfärbung beruht auf der Fähigkeit der Sporen, bestimmte Farbstoffe
wesentlich stärker zu binden als das Cytoplasma.
Durchführung und Auswertung:
1. Ausstrich lufttrocknen und hitzefixieren
2. Objektträger mit Malachitgrünlösung überschichten
3. Objektträger bis kurz vor Siedebeginn erhitzen, ca. 10 Minuten heiß halten, nicht eintrocknen lassen, eventuell Malachitgrünlösung nachgeben.
4. mit Wasser gut abspülen und zur Gegenfärbung 5 Minuten mit Safraninlösung bedecken
5. mit Wasser gut abspülen, lufttrocknen und mikroskopisch auswerten (40er Objektiv, oder
100er Objektiv - Ölimmersion)
Sporen sind grün, die übrigen Zellen rot gefärbt
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4. Schnelltests zur Keimidentifizierung
KOH-Lysis Test:
Die Auflösung von Zellwand und zytoplasmatischer Membran von Bakterien durch 3%ige KOH
liefert einen zuverlässigen Hinweis auf das Vorliegen von gramnegativen Organismen, die dabei
mit dem Reagenz eine zähflüssige, fadenziehende Masse bilden.
Dieser Test dient der Differenzierung grampositiver und gramnegativer Bakterien
Durchführung:
Reichlich Bakterienmasse von nicht-selektiven Festnährböden in 1 Tropfen KOH auf einem
Objektträger einrühren; nach 15 Sekunden Impföse mehrmals um einige Zentimeter vom
Tropfen abheben und auf die Bildung eines Fadens zwischen Tropfen und Öse achten. Im
negativen Fall noch einige Male innerhalb 1 Minute auf Fadenbildung prüfen, dann Test
abbrechen. Zur Kontrolle sollten je ein grampositiver und -negativer Stamm mitgeprüft werden.
Nach Durchführung der Tests Objektträger sofort in bereitgestellter Desinfektionsmittellösung
entsorgen!
Katalase:
Die Katalase ist ein Atmungskettenenzym und wird in der Routinediagnostik vorwiegend zur
Differenzialdiagnostik von Staphylokokken und Streptokokken
Durchführung:
Das zu untersuchende Keimmaterial wird mit der Öse auf einen Objektträger aufgebracht und
danach mit 1 Tropfen H2O2 überschüttet.
aufschäumen:
kein Aufschäumen:
Katalase positiv
Katalase negativ
Staphylokokken
Streptokokken
Achtung: Da diese Reaktion nur zur Unterscheidung zwischen Staphylokokken und Streptokokken dient, ist es notwendig sich vorher zu vergewissern, daß es auch wirklich gram-positive
Kokken sind. Auch andere Bakterien können Katalase-pos. bzw. -neg. sein!!!)
Nach Durchführung der Tests Objektträger sofort in bereitgestellter Desinfektionsmittellösung
entsorgen!
Plasmakoagulase:
Dieses extrazellulär von S. aureus gebildete Enzym führt zu einer Verklumpung von Plasma. Die
Mechanismen sind denen der physiologischen Blutgerinnung ähnlich, aber nicht ident.
Der Test dient der Unterscheidung von Koagulase positiven (S. aureus) und Koagulase
negativen (S. epidermidis, S. saprophyticus, ...) Staphylokokken.
Durchführung:
Auf einem Objektträger wird 1 Tropfen Staph. aurex Kontrollreagenz (graue Kappe)
aufgetragen. In dieses wird die zu untersuchende Bakterienkolonie mit einer Platinöse eingerührt
und gleichmäßig verteilt. Danach wird der Objektträger etwa 30 Sekunden geschwenkt. (Falsch
positive Keime verklumpen bereits!)
Nachdem sich eine homogene Suspension gebildet hat, wird 1 Tropfen Testreagenz (gelbe
Kappe) dazugetropft und neuerlich mit einer Platinöse gleichmäßig verteilt. Danach wird der
Objektträger etwa 30 Sekunden geschwenkt.
Tritt eine Verklumpung auf:
Tritt keine Verklumpung auf:
Koagulase positiv
Koagulase negativ
7
=
=
Staphylokokkus aureus
Staphylokokken
Oxidasetest
Der Oxidasetest weist das Vorhandensein von Cytochromen in der Atmung von Spezies nach,
die Sauerstoff als endgültige Elektronenakzeptoren im Energiestoffwechsel verwenden.
Cytochrome ermöglichen den Eintritt von atmosphärischem Sauerstoff in den Zellstoffwechsel,
indem sie durch molekularen Sauerstoff oxidiert werden. Unter dem Einfluss von Enzymen
werden sie durch oxidierbare Substanzen in der Zelle anschließend wieder reduziert. Beim
Oxidasetest bewirken künstliche Substrate anstelle natürlicher Elektronen-Akzeptoren die
Reduktion des Cytochromoxidase-Systems. Solche Substrate sind je nach ihrem aktuellen
Reduktions- oder Oxidasezustand farblos bzw. gefärbt. Die positive Oxidasereaktion ist
gekennzeichnet durch ein gefärbtes Produkt.
Durchführung:
Auf das Cytochromoxidase-Testkärtchen wird mit der Platinöse Material aufgetragen. Kommt
es nach spätestens 30 Sekunden zu einer Blauverfärbung ist das Ergebnis positiv.
Blauverfärbung:
keine Blauverfärbung:
Oxidase positiv
Oxidase negativ
Pseudomonas sp. (aber auch Aeromonas u.a.)
Enterobacteriacaeen u.a.
Streptex (Seroagglutination nach Lancefield)
Die Mehrheit der Spezies Streptokokkus besitzt gruppenspezifische Antigene, die im allgemeinen
Kohlenhydratbestandteile der Zellwand sind. Lancefield zeigte, dass diese Antigene in löslicher
Form extrahiert und durch Präzipitation mit homologen Antiseren nachgewiesen werden können.
Im Streptex-System kommt eine einfache Enzymextraktion zur Anwendung.
Testprinzip: Gruppenspezifische Antigene werden aus Streptokokken in einem einfachen
Inkubationsschritt extrahiert. Die Antigene werden mit Latexpartikeln identifiziert, die mit
gruppenspezifischen Antikörpern sensibilisiert sind. Diese Latexpartikel agglutinieren stark in
Anwesenheit des homologen Antigens und bleiben in homogener Suspension, wenn kein
Antigen vorhanden ist.
Der Test dient zur Identifikation (Serotypisierung) der ß-hämolysierenden Streptokokken.
Durchführung:
In ein entsprechend beschriftetes Teströhrchen 0,4ml Extraktionsenzym pipettieren.
Mit einer Platinöse Untersuchungsmaterial in das Teströhrchen einrühren. Liegt eine Mischkultur vor, wird empfohlen, Streptokokkenkolonien von einem Bereich mit möglichst wenig
Fremdkeimen abzunehmen.
Die Suspension mindestens 20 Minuten bei 37°C im Brutschrank inkubieren.
Vor Gebrauch die Fläschchen der Latexsuspensionen kräftig schütteln. Die Tropfflasche
senkrecht halten und je einen Tropfen (20µl) jeder Latexsuspension (A-G) auf die Kreise
der Reaktionskarte (A-G) geben.
Hinweis: Es ist wichtig, dass die Tropfflaschen senkrecht gehalten werden und der Tropfen
sich an der Spitze der Auslassdüse bildet. Tritt Feuchtigkeit außen an der Auslassdüse auf,
entsteht ein inkorrektes Volumen um das Ende herum. In diesem Fall ist die Düse vor
Gebrauch abzuwischen.
Mit einer Pasteurpipette je einen Tropfen Testsubstrat auf jeden der sechs Kreise der
Reaktionsplatte geben.
Den Inhalt jedes Kreises der Reihe nach mit einem Rührstäbchen gut mischen um die
gesamte Kreisfläche zu bedecken. Für jeden Kreis ein eigenes Stäbchen verwenden und
anschließend in Desinfektionslösung entsorgen.
Die Reaktionskarte maximal 1 Minute leicht schwenken und auf Agglutination überprüfen.
Hinweis: Die Reaktionskarte sollte in einer normalen Lesedistanz (25-35cm) gehalten
werden. Die erhaltenen Reaktionsbilder treten sehr deutlich auf und können unter normalen
Lichtbedingungen leicht erkannt werden.
8
Die Reaktionskarte nach Desinfektion vernichten.
Sicherstellen, dass die Reagenzien im mitgelieferten Aufbewahrungsgestell wieder in den
Kühlschrank zurückgestellt werden.
Ablesen der Ergebnisse: Eine positives Ergebnis wird durch eine Agglutination als deutlich
sichtbares Verklumpen der Latexpartikel angezeigt. Eine schnelle und intensive Agglutination
hängt von der Stärke des Antigenextrakts ab. Ein starker Extrakt liefert innerhalb weniger
Sekunden nach Durchmischen großen Latexpartikel-Klumpens, dagegen ein schwacher Extrakt
eine verzögerte Reaktion mit kleinkörnigen Latexpartikel-Klumpen.
Formen der Hämolyse
α-Hämolyse: Vergrünung (gut erkennbar auf Kochblutagar); um die Kolonien findet man grüne
Höfe von unterschiedlicher Farbintensität, in deren Bereich der Blutfarbstoff zum Methämoglobin umgewandelt ist, während die Erythrozytenmembran weitgehend erhalten ist.
ß-Hämolyse: (gut erkennbar auf Blutagar) relativ große scharf begrenzte Hämolysezone um die
Kolonien, die Erythrozyten sind aufgelöst und der Blutfarbstoff ist abgebaut, sodass eine klare
Zone im sonst undurchsichtigen Blutagar entsteht.
Achtung: auch andere Keime (zB. Staphylokokken, aerobe Sporenbildner, E. coli, Neisserien)
können eine ß-Hämolyse verursachen! Man muss wissen, dass Streptokokken vorliegen
(Gramfärbung!).
γ-Hämolyse: keine hämolytische Aktivität
Anwendung: dient der Differenzierung von Streptokokken
Bunte Reihe
Mikroorganismen sind mit einem sehr differenzierten Enzymsystem ausgestattet, wobei ein Teil
dieser Enzyme in der sog. „kleinen bunten Reihe“ nachgewiesen werden kann. Dabei werden
dem Keim verschiedene Nährmedien angeboten, bei deren Verbrauch es zu einem Farbumschlag
in den entsprechenden Nährmedien (durch Indikatoren) kommt. Bakterien unterscheiden sich
vielfältig in ihrer Enzymausstattung und damit in ihren Fähigkeiten, organische und
anorganische Verbindungen ab- oder umzubauen. In einem System aus verschiedenen festen und
flüssigen Medien können solche Stoffwechselleistungen durch verschiedene Indikatorreaktionen
sichtbar gemacht werden. Da bei dieser Testmethode mehrere Eigenschaften gleichzeitig in einer
Reihe von Reaktionsansätzen überprüft werden, entsteht wegen der unterschiedlichen Farbreaktionen einzelner Indikatoren ein buntes Bild. Man spricht von einer „bunten Reihe“.
Anwendung: dient zur Differenzierung gramnegativer Stäbchen
Bunte Reihe - Erklärungen und Auswertung
Kligler-Röhrchen (Zweizucker-Eisen-Harnstoff-Schrägagar)
Der „Kligler“ ist ein kombinierter Nährboden, in dem folgende Reaktionen nebeneinander ablaufen:
a.)
Dextrose-Abbau (durch alle Enterobakterien)
b.)
Lactose-Abbau (durch die meisten „apathogenen“ Darmbakterien)
c.)
d.)
H2S-Bildung (z.B. durch die meisten Salmonellen, Citrobacter, Proteus vulgaris &
mirabilis)
Gas-Bildung (durch alle Enterobacterien; Ausnahmen: Shigellen, Salmonella typhi,
Proteus morganii & rettgeri)
9
Durch den Indikator (Phenolrot) ist der unbeimpfte Kligler rot.
Die Beimpfung erfolgt im Stich und auf der Schrägfläche.
a.)
b.)
c.)
d.)
Dextrose-Abbau: durch Dextrose-(Glucose)-Abbau entsteht Säure; der Indikator schlägt
um nach gelb. Da der Kliger nur sehr wenig Dextrose enthält, ist dieser Zucker nach
wenigen Stunden verbraucht. Danach kommt es durch den Sauerstoff der Luft auf der
Schrägfläche zu einer Realkalisierung mit Farbrückschlag nach rot.
Kligler nach 24 Stunden: rot/gelb
Lactose-Abbau: durch Lactose-Spaltung entsteht Säure; der Indikator schlägt um nach
gelb. Da im Kligler zehnmal so viel Laktose wie Dextrose enthalten ist, wird Lactose in
24 Stunden nicht ganz aufgebraucht. Es tritt also keine Realkalisierung der Schrägfläche
auf.
Kligler nach 24 Stunden: gelb/gelb
H2S-(Schwefelwasserstoff)-Bildung aus schwefelhaltigen Aminosäuren oder anorganischen Sulfaten und Sulfiten erfolgt zB durch Salmonellen und Citrobacter. Die im
positiven Fall entstehende Schwarzfärbung ergibt sich aus der Verbindung von H2S mit
Eisensalzen (FeSO4).
Gasbildung: entsteht beim Zucker-Abbau durch die meisten Enterobakteriaceaen
(Ausnahmen s.o.)
Zuckerspaltung
Die meisten Bakterien sind in der Lage, durch Fermente (Carbohydrasen) verschiedene Zucker
abzubauen. Zur Differenzierung der Enterobakterien eigenen sich besonders:
1.)
2.)
3.)
Glucose (=Dextrose, Traubenzucker), ein Monosaccharid
Lactose (=Milchzucker), ein Disaccharid aus einem Glucose- und einem Galaktosemolekül
Saccharose (=Rohrzucker), ein Disaccharid aus Glucose und Fructose
Bei der Zuckerspaltung entstehen saure Abbauprodukte, die den pH-Wert des Mediums
herabsetzen, sodass der zugesetzte Indikator (Bromthymolblau) von blaugrün nach gelb
umschlägt.
Glucose positiv: alle Enterobakterien
Lactose positiv: die meisten „apathogenen“ Enterobakterien
Darüberhinaus entsteht beim Zucker-Abbau durch Enterobakterien Gas (Ausnahmen: Shigellen,
Salmonella typhi, Proteus morganii & rettgeri).
Die Prüfung der Gasbildung erfolgt am einfachsten mit DURHAM-Röhrchen, das sind kleine
Eprouvetten von etwa 30 mm Länge und 8 mm Durchmesser, die im Dextrose-Röhrchen mit der
Öffnung nach unten versenkt werden. Bei der Bebrütung gasbildender Keime bildet sich im
Gärröhrchen eine mehr oder weniger große Gasblase.
Hinweis: Bei anaerober Bebrütung können Indikatorfarben reduziert werden. Deshalb empfiehlt
sich der Zusatz des Indikators erst nach abgeschlossener Bebrütung! Außerdem ist zu bedenken,
dass fast alle Farbstoffe auf empfindliche Keime hemmend wirken können.
Harnstoffspaltung
Proteusstämme (außer Prot. inconstans = Providentia) produzieren das Ferment Urease. Urease
hydrolisiert Harnstoff zu Ammoniumcarbonat: CO (NH2)2 + Urease und H2O (NH4)2CO3.
Ammoniumcarbonat verschiebt den pH-Wert des Mediums in den alkalischen Bereich, was
durch Zusatz eines geeigneten Indikators (Phenolphtalein) sichtbar gemacht werden kann:
Rotfärbung.
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Indolbildung
Zur Prüfung der Indolbildung verwendet man durch Trypsinverdauung weitgehend aufgespaltene, tryptophanhältige, flüssige Eiweißsubstrate. Einige Bakterien (z.B. E.coli) bilden das
Ferment Tryptophanase, das Tryptophan zu Indol abbaut.
Tryptophan (+Tryptophanase) ⇒ Indol (+Indolreagenz = rot)
Nachweis: Einfach und spezifisch ist der Nachweis mittels p-Dimethylaminobenzaldehyd in
saurer Lösung. Etwa 5 ml der Kultur versetzt man mit 1 ml Indolreagenz. Schwenken, nicht
schütteln! Im positiven Fall entsteht ein roter Ring.
Citratausnutzung
Auch Mikroorganismen benötigen zum Leben und Wachsen mindestens Kohlenstoff (C), Stickstoff (N) und verschiedene Salze. Sie können diese Grundsubstanzen dank ihres Fermentsystems
aus verschiedenen organischen und anorganischen Verbindungen herauslösen und verwerten.
Jedoch können z.B. nur bestimmte Bakterien, wie Salmonellen und Citrobacter, Kohlenstoff aus
dem Citratmolekül heraus lösen:
H2 – C – COOH

HO –C – COOH

H2 – C – COOH
Andere Keime, wie E.coli, können in einem Nährmedium, das Citrat als einzige Kohlenstoffquelle enthält, nicht wachsen.
Nachweis: Das Citratmedium nach Koser (klare Flüssigkeit) enthält folgende Bestandteile:
als Kohlenstoffquelle: Citrat: C6H8O7
als Stickstoffquelle: Ammoniumphosphat: (NH4)2 HPO4) und Salze (MgSO4, K2HPO4)
Positiv: Trübung (Wachstum)
Negativ: Röhrchen bleibt klar
Nitratreduktion
Bilden Bakterien das Ferment Nitratreduktase, wird im Nährboden enthaltenes Nitrat zu Nitrit
reduziert. Das entstandene Nitrit lässt sich mit einer Mischung aus Sulfanilsäure, α-Naphtylamin
und Essigsäure nachweisen.
Nachweis: 5ml eines Testsubstrats der folgenden Zusammensetzung
KNO3 (nitritfrei)
Pepton
Aqua dest.
0,2g
5,0g
1000ml
werden mit dem zu prüfenden Keim beimpft und 2-4 Tage bebrütet. Dann wird eine Mischung
der folgenden Lösungen zu gleichen Teilen hergestellt:
Lösung A:
Sulfanilsäure
Essigsäure (5N)
1,0g
125,0ml
Lösung B:
α- Naphtylamin
Essigsäure(5N)
1,0g
200,0ml
und davon der Bouillon 0,1 ml zugesetzt. Im positiven Fall tritt in wenigen Minuten kräftige
Rotfärbung auf.
11
Bleibt die Rotfärbung aus, kann dies zwei Ursachen haben:
1.) Nitrat wurde nicht abgebaut. Beweis: durch Zusatz von etwas Zinkstaub zum Testsubstrat
tritt Rotfärbung ein.
2.) Nitrat wurde zu Nitrit abgebaut, das Nitrit jedoch weiter reduziert zu Stickoxyd, Ammoniak
oder elementarem (gasförmigem) Stickstoff. In diesem Fall bleibt die Rotfärbung nach
Zusatz von Zinkstaub aus.
Chemismus:
NO3 →
NO2 →
(Nitrat)
(Nitrit)
NO
→
(Stickoxyd)
NH2OH
→
NH3 (Ammoniak)
N2O (Distickoxyd) → N2 (Stickstoff)
Reduktionsvorgänge
Auswerten der bunten Reihe:
1. Kligler (rot) ist ein kombinierter Nährboden (Schrägagar), in dem folgende Reaktionen
nebeneinander ablaufen:
Dextrose Abbau
Indikator: Phenolrot reagiert auf Ansäuerung des Milieus
mit einer Gelbfärbung
H2S-Bildung
positiv: schwarz
Gasbildung
2. Lactose (grünlich)
positiv: gelb
negativ: grün
3. Trypsin (gelb)
Zusatz: Indolreagenz
positiv: roter Ring
negativ: gelber Ring
4. Harnstoff (weiß)
Zusatz: Phenolphtalein
positiv: rot
negativ: keine Farbveränderung
5. Citrat (grün)
Indikator: Bromthymolblau reagiert auf Alkalisierung blau
positv: blau
negativ: grün
6. Nitrat (farblos)
Zusatz: Jodzinktinktur + H2SO4
positiv: blau
negativ: farblos
7. Beweglichkeitsagar:
Wachstum nur beim Impfstrich: unbeweglich
Nährmedium diffus (trüb) durchsetzt: beweglich
12
Röhrchen Nr.
1
2
3
4
5
6
7
Kligler
Dextrose H2S
Lactose
Trypsin
Harnstoff
Citrat
Nitrat
Beweglichkeit
+
+
+
+
+
-+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
-
+
+
+
+
-+
+++
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Escherichia coli
+
+
+
+
+
-
Klebsiella pneumonie
Klebsiella oxytoca
Enterobacter sp.
Citrobacter sp.
Proteus vulgaris
Proteus mirabilis
Morganella morganii
Salmonella sp.
Pseudomonas sp.
Acinetobacter sp.
Serratia sp.
+
+
+
+
-
+
API
Das Testsystem beruht auf dem Prinzip der Bunten Reihe.
In einem Teststreifen mit 20 Mikroröhrchen befinden sich verschiedene dehydrierte Testsubstanzen, die mit einer Bakteriensuspension in Aqua dest. befüllt werden. Der Test wird
anschließend bei 37°C ca. 24 Std. bebrütet.
Ein meist Indikator bedingter Farbumschlag zeigt an, ob die getesteten Substanzen von Bakterien
umgesetzt wurden.
Fällt die erste Reaktion einer Dreiergruppe positiv aus, so wird dies mit einer 1 protokolliert, fällt
die zweite positiv aus, so wird dies mit einer 2 protokolliert, und ist die dritte Reaktion einer
Dreiergruppe positiv, so protokolliert man eine 4. Im negativen Fall wird eine 0 protokolliert.
Durch Addition der Zahlen jeder Dreiergruppe ergibt sich ein siebenstelliger Code, der zur
Identifizierung der Keime führt.
+
+ +
QNPG ADH LDC
5
+ +
+
ODC ‚CIT H2S
URE TDA IND
1
4
VP
+ +
+
GEL GLU MAN IND SOR RHA SAC MEL AMY ARA OX
4
5
Kodierungsprinzip des API-Systems
z.B.: Escherichia coli
13
1
2
5. Physiologische Besiedelung des
Menschen
Haut und Schleimhäute des Menschen sind mit unzähligen Mikroorganismen besiedelt, die man
als Normalflora bezeichnet. Dabei ist eine generelle Trennung der Erreger in apathogen und
pathogen nicht möglich. Diese Mikroorganismen befinden sich im Gleichgewicht mit ihrem
Wirt, sodaß es unter normalen Lebensumständen zu keiner Infektion bzw. Infektionskrankheit
kommt, es sei denn, die Keime werden aus ihrer angestammten Region in andere Körperregionen
bzw. in primär sterile Organsysteme verschleppt. Die Zusammensetzung dieser Normalflora
variiert und hängt von verschiedenen Faktoren, wie Allgemeinzustand, Alter und Geschlecht des
Menschen, Ernährung, Schwangerschaft, Grunderkrankung etc., ab.
5.1. Haut
Den wichtigsten Anteil der normalen Hautflora bilden Bakterien, die ein gewisses Haftvermögen
für dieses Organ besitzen = Residentflora. Aus dem ständigen Kontakt mit der Umwelt
resultiert die sog. Transientflora, Anflugkeime, die vorübergehend auf der Haut vorkommen,
aber bei einem intakten Makroorganismus keine Möglichkeit der Besiedelung finden.
Die Zusammensetzung der Residentflora wird auch durch äußere Einflüsse, wie starkes
Schwitzen oder häufiges Waschen nicht verändert. Die bakterielle Normalbesiedelung findet sich
vorwiegend in den äußeren Schichten der Haut (bis 10 6 Keime/ cm2).
Keime der normalen Hautflora sind:
Staphylococcus epidermidis und andere koagulasenegative Staphylokokken, Mikrokokken,
apathogene Corynebakterien (aerobe und anaerobe), Streptokokken und Peptostreptokokken.
Praktische ÜBUNG - HANDABKLATSCH
Blut-Agar (B): festes Universalmedium („blutrot“)
1.) Beschriftung der Blutagarplatte (B): auf der Unterseite der Agarplatte wird mit einem Filzstift in der Mitte ein Teilungsstrich gezogen und die beiden Hälften mit einem „V“ (= vorher)
bzw. „N“ (= nachher) und dem Namen beschriftet.
2.) Auf die Oberfläche eines festen Nährbodens werden nun 3 Fingerspitzen einer Hand unter
leichtem Druck auf die mit „V“ markierte Fläche aufgelegt
2.) Danach erfolgt eine hygienische Händedesinfektion:
1: Aus dem Desinfektionsmittelspender mittels Ellbogenbedienung ca. 3 ml alkoholisches Desinfektionsmittel entnehmen (die Menge entspricht etwa einer hohlen Hand,
große Hände brauchen etwas mehr!)
2: Händedesinfektionsmittel über mind. 30 Sekunden gründlich auf den Händen
verreiben (am besten, bis sie trocken sind)
3.) Anschließend werden wiederum 3 Finger leicht auf die mit „N“ markierte Agarfläche gelegt
(Achtung: mit dieser Hand nichts angreifen!)
4.)Nach 24-stündiger Bebrütung bei 37° C das Resultat begutachten.
14
5.2. Mund/Rachen
Die Mundhöhle bietet ein breites Spektrum verschiedenster Bakterien, Pilze und Protozoen.
Äußere Einflüsse, wie z.B. Alter, Ernährung oder z.B. die Einnahme von Antibiotika führen zu
einer dauernd wechselnden Transientflora. Aber auch die Residentflora ist vielgestaltig.
Keime der normalen Mund/Rachenflora sind:
vergrünende Streptokokken, apathogene Neisserien, diphtheroide Stäbchen, Bacteroides sp.,
Staphylococcus epidermidis.
In geringer Menge als normal zu betrachten sind Hämophilus influenzae, Streptococcus
pneumoniae und Candida sp.
Eine Sonderstellung im Mund/Rachenraum weisen ß-hämolysierende Streptokokken und
Neisseria meningitidis auf. Diese Bakterien können sich zur Normalflora gesellen, ohne dass es
zu einer Erkrankung kommt (asymptomatische Keimträger).
Ebenfalls eine Sonderstellung im Nasen/Rachenraum nimmt Staphylococcus aureus ein, der im
Gebiet von Nase bzw. Perineum (Damm) als Haftkeim vorkommen kann. Da S. aureus auch
häufig bei nosokomialen Infektionen beteiligt ist, werden beim Auftreten nosokomialer
Infektionen durch S. aureus bei Personal und Patienten Nasenabstriche durchgeführt, um Keimträger zu erfassen und gegebenenfalls zu sanieren.
Praktische ÜBUNG - RACHENABSTRICH
Blut-Agar (B): festes Universalmedium („blutrot“)
Kochblut-Agar (KB): festes Nährmedium zum Nachweis sehr empfindlicher Keime
(„schokoladenbraun“)
1.) Die Probenentnahme erfolgt unter Zuhilfenahme eines Spatels mit einem sterilen Abstrichtupfer durch eine drehende Bewegung am Ort der Infektion. Unbedingt notwendig ist eine gute
Lichtquelle. Eine Kontamination durch andere Strukturen im Mund- Rachenraum sollte dabei
vermieden werden. (Hinweis: vor der Probennahme sollte der Patient seinen Mund mit klarem
Wasser spülen Reduktion der Begleitflora)
2.) Das entnommene Material wird mit dem Abstrichtupfer auf die Nährmedien Blutagar (B)
und Kochblutagar (KB) übertragen, indem der Abstrichtupfer im oberen Drittel des Nährbodens über die gesamte Fläche gleichmäßig verteilt wird. Mit einer sterilen Öse wird aus
diesem Areal Material in den unteren Anteil gebracht und in einer fortlaufenden Zick-Zack-Linie
aufgetragen. Dadurch kommt es zu einer kontinuierlichen Verringerung der Keimzahl, sodass die
Möglichkeit zur Bildung von Einzelkolonien nach der Bebrütung besteht.
3.) Die beimpften Platten werden beschriftet (Plattenboden!) und für 24h bei 37°C inkubiert.
Unterscheidung der verschiedenen Streptokokkenarten
Die Differenzierung der verschiedenen Streptokokkenarten basiert auf
a) Einteilung nach Lancefield (Einteilung nach antigenen Eigenschaften in der Zellmembran von
Streptokokken) und
b) Unterscheidung nach dem Hämolyseverhalten der Streptokokken auf Blut bzw. Kochblutagar.
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Praktische ÜBUNG - INTERDENTALABSTRICH
Der Interdentalabstrich wird unter Zuhilfenahme eines sterilen Zahnstochers durchgeführt. Das
gewonnene Material wird auf einen Objektträger übertragen und eine Gramfärbung
durchgeführt.
Mikroskopisch läßt sich die Vielfalt einer normalen Rachen/Interdentalflora erkennen. Neben
zellulären Elementen (Plattenepithelzellen, Leukocyten), sieht man die bereits bekannten Formen
von Kokken- bzw. Stäbchenbakterien. Ebenfalls zu sehen sind aber auch spindelförmige, bzw.
unregelmäßig geformte gramnegative Stäbchen (Fusobakterien, Bacteroides sp.), sowie auffällig
gewellte Stäbchenbakterien (apathogene Spirochäten). Die Anzucht dieser Bakterien ist sehr
langwierig und gelingt zT. nur auf Spezialnährböden, was den Rahmen dieses Praktikums
sprengen würde.
5.3. Respirationstrakt
Im vorderen Abschnitt der Nase finden sich hauptsächlich Keime der normalen Hautflora
(koagulasenegative Staphylokokken, etc.). Durch die Verbindung mit der Mundhöhle können in
der Nase aber auch Keime der normalen Rachenflora gefunden werden. Normalerweise steril
sind die Nasennebenhöhlen, ebenso das Bronchialsystem und die Alveolen. Dafür zuständig sind
sowohl strukturelle (Flimmerepithel), wie auch immunologische Faktoren.
5.4. Magen und Duodenum
Durch die Wirkung des Magensaftes sind Magen und Duodenum keimarm bis keimfrei. Im
Dünndarm findet man Enterokokken, sowie milchsäurebildende Bakterien (Laktobazillen), erst
im unteren Dünndarm tritt E. coli auf.
5.5. Darm
Die normale Darmflora ist das größte Keimreservoir des Körpers (bis 300 Arten). Die
Zusammensetzung der Darmflora wird von verschiedenen Faktoren beeinflusst, wie Ernährung,
Alter, Darmsekretion, therapeutische Eingriffe, etc. Antibiotika können zur Reduktion der
Normalflora führen und gleichzeitig einen Anstieg antibiotikaresistenter Keime bewirken (zB
Clostridium difficile).
95% der Keime im Darm sind Anaerobier (Bacteroides Arten, Lactobacillus sp.,
Fusobakterien, Clostridien und Peptostreptokokken). Von den aeroben bzw. fakultativ anaerob
wachsenden Keimen sind die häufigsten Enterobacteriaceae (E. coli, Proteus sp. Enterobacter
sp., etc.), bzw. Enterokokken, transient Candida sp. und Pseudomonas sp.
5.6. Urogenitaltrakt
Nierenbecken, Ureter und Harnblase sind normalerweise keimfrei, nur der äußere Teil der
Harnröhre ist mit Keimen der umgebenden Haut bzw. transient mit Keimen des Darms besiedelt
(S. epidermidis, E. coli, Enterokokken).
5.7. Vaginalflora
Diese wechselt stark, je nach Entwicklungsstufe.
Kindesalter: keimarm, wenige Kokken und Stäbchen, fast keine Laktobazillen
Pubertät: reichlich Laktobazillen, daneben Streptokokken, Staphylokokken und E. coli
Menopause: die Laktobazillen gehen stark zurück, es besteht eine Mischflora aus Kokken und
Stäbchen.
16
6. Lebensmittel-Mikrobiologie
6.1. Lebensmittelvergiftungen
Eine Lebensmittelvergiftung kann zahlreiche biologische und nicht biologische Ursachen haben.
Dazu gehört die Vergiftung durch
Arzneimittel oder wachstumsfördernde Substanzen im Fleisch und in Fleischprodukten nach zu später Absetzung vor der Schlachtung
Pestizide, Schwermetalle, Chlorkohlenwasserstoffe und andere toxische Umweltstoffe, die über Futtermittel, Wasser und Luft in Tier und Pflanze gelangen können
nicht erlaubte Zusatzstoffe, die über Futtermittel, Wasser und Luft in Tier und
Pflanze gelangen können
nicht erlaubte Zusatzstoffe zB zur Konservierung der Lebensmittel (Antibiotika,
Natriumazid im Wein, Monobromessigsäure in Bier u.a.)
Reinigungs- und Desinfektionsmittel
physiologische Gifte von Pflanzen und Tieren
Parasiten
Mikroorganismen(Bakterien, Pilze und Viren)
Ob ein Mikroorganismus eine Lebensmittelvergiftung verursachen kann, ist von zahlreichen
Faktoren abhängig. Dazu gehört die Fähigkeit im Lebensmittel infektiös zu bleiben bzw. sich im
Lebensmittel vermehren zu können, die Anwesenheit spezifischer Pathogenitätsfaktoren wie die
Fähigkeit zur Bildung von Toxinen (Toxizität) und/oder die Fähigkeit zur Ausbreitung im
Gewebe (Invasivität) sowie eine ausreichende Infektionsdosis. Beeinflusst wird die Erkrankung
auch von der momentanen Abwehrlage des infizieren Menschen.
Lebensmittelinfektionen werden von invasiven Mikroorganismen hervorgerufen, die in das
menschliche Gewebe eindringen und sich dort ausbreiten können. Häufig können sich diese
Mikroorganismen nicht im Lebensmittel vermehren, bleiben aber infektiös. Wichtige
epidemiologische Transportmittel für derartige Infektionserreger sind die Rohmilch und das
Wasser. Typische Mikroorganismen aus dieser Gruppe sind zB Mycobacterium tuberculosis,
Brucella, A-Streptokokken, Leptospira, Yersinia enterocolitica, Campylobacter jejuni, Viren und
Parasiten. Voraussetzung für die Invasivität ist die Anheftung (Adhäsion) der Erreger über
unspezifische oder spezifische Strukturen der Mikroorganismenzelloberfläche (zB Fimbrien bei
Escherichia coli) an die Zelloberfläche des Wirtes. Die Ausbreitung und Vermehrung im
menschlichen Gewebe ist abhängig von der Resistenz der Mikroorganismen gegenüber den
körpereigenen Abwehrmechanismen wie der Phagozytose und der Toxizität des Serums.
Lebensmittelintoxikationen werden durch toxinbildende Mikroorganismen ausgelöst, die sich
meistens im Lebensmittel vermehren können. Die Toxizität beruht auf der Bildung von Endooder Exotoxinen.
6.2. Hygicult
Hygicult-TPC
Hygicult-TPC wurde zur schnellen Überwachung der mikrobiologischen Hygiene in verschiedenen Materialien entwickelt. Es ist sowohl bei festen als auch bei flüssigen Materialien
anwendbar. Feste Stoffe werden untersucht, indem man beide Seiten des Trägers fest gegen die
Oberfläche drückt. Halbfeste oder flüssige Proben werden mit Hilfe eines sterilen Wattestäbchens beimpft. Flüssigkeiten werden am besten untersucht, indem man den Träger 3-4
Sekunden in die Probe taucht. Nach der Beimpfung wird der Träger sorgfältig in das Trägergefäß zurückgesteckt und bei 35-37°C einen Tag bebrütet.
17
18
Praktische ÜBUNG - NAHRUNGSMITTELUNTERSUCHUNG
Hefeextrakt-Agar (YEAST): festes Universalmedium („farblos“)
Rambach-Agar (RA): festes Selektivmedium für Salmonellen („zuckerlrosa“)
Blut-Agar (B): festes Universalmedium („blutrot“)
Endo-Agar (E): festes Selektivmedium für gramnegative Stäbchen („hellrosa“)
Nahrungsmittel homogenisieren
(Stomacher)
Probe zu 100ml Peptonwasser
(37°C, 24 Std.)
Hygicult-TPC
(37°C, 24Std.)
Rambach
(37°C, 24Std.)
Bebrütung 24Std.
Blut
(37°C, 24Std.)
19
0,1ml auf YEAST
(37°C, 24Std.)
Endo
(37°C, 24Std.)
Durchführung:
Die mitgebrachten Proben (Lebensmittel, Pharmazeutische Produkte, etc.) werden in 100ml
Peptonwasser (Glaskolben) mit Hilfe des STOMACHER’s (im Plastiksack) homogenisiert und
die homogenisierte Probe in den Glaskolben geleert.
0,1ml werden mit Hilfe einer Pipette auf YEAST-Agar aufgetragen und ausgespachtelt.
Parallel dazu wird ein HYGICULT-TPC 3-4 Sekunden in die homogenisierte Probe getaucht.
Anschließend erfolgt eine Bebrütung aller drei Medien für 24h bei 37°C.
Vom HYGICULT und YEAST-Agar wird die Gesamtkeimzahl bestimmt.
Peptonwasser (Glaskolben) auf Blut- Endo- und Rambach-Agar überimpfen und 24h bei
37°C bebrüten.
Makroskopische und mikroskopische Bestimmung und weitere Differenzierung
Praktische ÜBUNG - UMGEBUNGSABSTRICH
Thioglykolat: flüssiges Optimal-/ Anreicherungsmedium
Die Probenentnahme erfolgt mit einem sterilen Abstrichtupfer von einer beliebigen
Keimquelle (Fussboden, Schuhsohle, Toilette, Mülltonne, Kaffeeautomat… etc.).
Der Abstrichtupfer wird anschließend in ein flüssiges Anreicherungsmedium (Thioglycolat)
getaucht und für 24-48h bei 37°C bebrütet.
Danach wird das Keimwachstum im Thioglykolat makroskopisch beurteilt. Wenn eine
Trübung des Nährmediums zu beobachten ist erfolgt eine Überimpfung auf eine Blut- und eine
Endoagarplatte. Die Agarplatten werden dann für 24h bei 37°C bebrütet. Ist keine Trübung
vorhanden ist kein Keimwachstum erfolgt.
Beurteilung des Keimwachstums auf der Blut- bzw. Endoagarplatte.
Gramfärbung der makroskopisch unterscheidbaren Kolonien und weitere Differenzierung.
20
7. Chemotherapeutika
Die Unwirksamkeit mancher Antibiotika auf gewisse Keime ist auf die Resistenzart
zurückzuführen:
1) primäre Resistenz:
2) erworbene Resistenz:
entspricht der natürlichen Resistenz
a) Mutation (chromosomal)
b) „infektiöse“ Resistenz (Plasmide)
diese Resistenzen können, wenn der Druck des Antibiotikums
ausbleibt, wieder verloren gehen.
Die Resistenzprüfung von Erregern in vitro, auch Empfindlichkeitsbestimmung genannt, ist
notwendig, weil die Empfindlichkeit vieler Bakterienarten von Stamm zu Stamm wechselt und
das Resistenzverhalten nicht im vor hinein zu erkennen ist. Daraus ergibt sich die zwingende
Notwendigkeit die Resistenztestung zur vollständigen Befunderstellung durchzuführen.
Durch die Testung erfolgt der Ausschluß jener Substanzen, die schon in vitro nicht wirksam sind
und damit für die klinische Anwendung nicht mehr in Frage kommen. Über die richtige Auswahl
aus den wirksamen Substanzen entscheiden dann andere Parameter (Bioverfügbarkeit,
Applikation, klinische Aspekte, etc.).
Die antimikrobiellen Chemotherapeutika unterscheiden sich in ihrem Wirkungsmechanismus,
bzw. Angriffsort:
Angriffsort
Wirkmechanismus
Chemotherapeutikum
Zellwand
Muraminsäuresynthese
Pyruvyl-Transferase
Phospholipidsynthese
Glucansynthese
Betalaktam-Antibiotika
Vancomycin
Teicoplanin
Fosfomycin
Bacitracin
Echinocandine
Ribosomen
Peptidyl-Transferase
Ribosom A
Translokation
Peptidyl-Transferase
Elongationsfaktor G
Abbauende Enzyme
Chloramphenicol
Tetracycline
Makrolide
Clindamycin
Fusidinsäure
Aminoglykoside
Nukleinsäure
DNS-Gyrase
RNS-Polymerase
DNS-Stränge
Gyrase-Hemmer
Rifampicin
Nitroimidazole
Zellmembran
Phospholipide
Ergosterolsynthese
Ergosterolsynthese
Polymyxine
Amphotericin B
Azole
Folatsynthese
Pteroatsynthetase
Sulfonamide
Dihydrofolat-Reduktase Trimethoprim
21
Einteilung der Antibiotika (Chemotherapeutika)
22
Wirkungstypen der Antibiotika
1) Bakteriostase: Hemmung der Bakterienvermehrung (zB durch Sulfonamide, Chloramphenicol und Tetracycline), wobei die Keime nicht abgetötet werden. Die natürliche Absterberate ruhender Bakterien wird dabei nicht beeinflusst.
2) Bakterizidie: Abtötung der Bakterienzelle (zB infolge Verhinderung der Zellwandsynthese
durch Penicillin). Penicilline und Cefalosporine wirken nur in der Vermehrungsphase der
Bakterien bakterizid, Aminoglykoside auch in der Ruhephase.
Nebenwirkungen:
Toxische Reaktionen (zB Nephrotoxisch, Ototoxisch)
Allergische Reaktionen
Biologische Nebenwirkungen (Beeinflussung der Normalbesiedelung)
Methoden der Resistenzbestimmung
• Agardiffusion: wirkstoffgetränkte Filterpapierblättchen werden auf den mit dem Keim
beimpften Agar aufgebracht. Die Hemmhöfe werden nach der Bebrütung abgelesen.
• Bouillondilution: Keim wird in die Antibiotikaverdünnungsreihe eingebracht und der
Wachstumsendpunkt ermittelt = MHK (Minimale Hemmkonzentration). Wird heute in
Mikrotiterplatten oder Automaten gemacht.
• Agardilution: Antibiotikaverdünnung wird mit festem Agar ausgegossen und dann mit Keim
beimpft (MHK).
Praktische ÜBUNG - AGARDIFFUSIONSTEST
Müller-Hinton-Agar (MH): festes Nährmedium („farblos“)
zur Durchführung des Agardiffusionstests (ANTIBIOGRAMM)
1.) Mit der Öse wird das zu untersuchende Keimmaterial (zB vom Uricult) abgenommen
und in physiologischer NaCl-Lösung eingerührt, sodass eine leicht trübe Suspension
entsteht.
2.) Die Keimsuspension wird mittels sterilem Wattetupfer flächendeckend auf einen
Nährboden aufgetragen.
3.) Mit dem Dispenser, der die Antiobiotika-Testblättchen enthält, werden die Testblättchen
auf den Agar gedrückt.
4.) Die Probe wird nun 24h bei 35-37°C bebrütet und dann ausgewertet.
Die Chemotherapeutika diffundieren von dem aufgelegten imprägnierten Filterpapierplättchen in
das Agargel und bewirken je nach Wirksamkeit eine Hemmung des Bakterienwachstums um das
Testplättchen (Hemmhof). Bei Unwirksamkeit der Testsubstanz kommt es zu einem ungehinderten Bakterienwachstum. Der Hemmhofdurchmesser ist ein Maß für die Empfindlichkeit
eines Bakteriums gegen ein Antibiotikum
Abhängig von der Größe des Hemmhofes und der Wirkstoffkonzentration werden die Ergebnisse
in "sensibel" (oder empfindlich), "mäßig sensibel" und "resistent" (oder unempfindlich)
unterteilt. Die Interpretation der Ergebnisse basiert auf festgelegten Grenzwerten (siehe Tabelle).
23
empfindlich
wenn > als
Penicillin (P 10)
Augmentin (AMC)
Aminopenicillin (Am)
Cefoxitin (Fox)
Sulfonamid +
Trimethoprim (SXT)
Norfloxacin (Nor)
mäßig empf.
wenn von – bis
resistent
wenn < als
29
20
29
18
15-17
28
17
28
14
16
18
11-15
13-17
10
12
18-19
8. Harnwegsinfekt (HWI)
Praktische ÜBUNG – HWI / Uricult
Ziel der Übungen:
Beurteilung der Keimzahl anhand einer Vergleichstabelle (siehe Seite 25)
Identifizierung des Infektionserregers (MacConkey-Agar - Bunte Reihe)
Erstellen eines Antibiogramms (MacConkey-Agar)
Interpretation des Ergebnisses und Abgabe eines Therapievorschlags
Durchführung:
Jeder Arbeitsplatz bekommt aus dem bakteriologischen Routinelabor einen bereits
bebrüteten und bearbeiteten URICULT zur Verfügung gestellt.
Cled-Agar: durchgehende Agarfläche (Universalmedium) für aerobe Bakterien
MacConkey-Agar: auf der unterteilten Rückseite oben: Selektivagar für gram-negative
Bakterien
Slanetz-Agar: auf der unterteilten Rückseite unten: Selektivagar für Enterokokken
Die Beurteilung der Gesamtkeimzahl (Uricult-Cled-Agar):
Mittelstrahlharn: Signifikanzgrenze: ≥105 Keime/ml Harn
Katheterharn: die Signifikanzgrenze wird um den Faktor 10 tiefer angesetzt (≥104)
Blasenpunktationsharn: jeder Keimnachweis gilt als signifikant
24
25
9. Der bakteriologische Trinkwasserbefund: Interpretation und Maßnahmen
Der heutige hohe Stand der Trinkwasserhygiene gehört zu den erfolgreichsten Umsetzungen
hygienischer Erkenntnisse in wirksame Präventionsmaßnahmen. Hierdurch konnten vor allem
Infektionskrankheiten wie Typhus, Paratyphus, Cholera, Shigellenruhr u.a. so nachhaltig
bekämpft werden, dass diese Erkrankungen ihre epidemiologische Bedeutung in Mitteleuropa
weitgehend verloren haben. Die Aufgaben der Hygiene verlagerten sich in andere
Problembereiche. Die Belastung der Umwelt und des Trinkwassers durch chemischphysikalische Schadstoffe wurde in zunehmendem Maße höhere Priorität zuerkannt, wohingegen
den Mikroorganismen nicht mehr die erforderliche Aufmerksamkeit gewidmet wurde. So ist es
auch nicht verwunderlich, dass die Anzahl, aber auch die Grenzwerte chemischer Parameter im
Trinkwasser ständig erweitert bzw. herabgesetzt wurden, während die mikrobiologischen
Beurteilungskriterien seit den Anfängen dieses Jahrhunderts im Prinzip weitgehend unverändert
bleiben. Ihnen liegt die Vorstellung zugrunde, dass trinkwasserbedingt Erkrankungen durch
Erreger verursacht werden, welcher mit Fäkalien in das Rohwasser gelangen. Der hygienische
Zustand des Trinkwassers könne an bakteriologischen Indikatoren, namentlich der Abwesenheit
von Escherichia coli, Coliformen und Enterokokken in 100 ml Trinkwasser, abgelesen werden.
Anforderungen an ein Trinkwasser gemäß Österr. Lebensmittelbuch Kapitel B1
„Trinkwasser“ vom 22. Juli 2002.
„Trinkwasser ist Wasser, das in nativem Zustand oder nach Aufbereitung geeignet ist, vom
Menschen ohne Gefährdung seiner Gesundheit genossen zu werden und das geruchlich,
geschmacklich und dem Aussehen nach einwandfrei ist.“
„Prinzipiell ist für den menschlichen Genuss nativ hygienisch einwandfreies Wasser einem
aufbereiteten Wasser vorzuziehen, auch wenn die Erschließungs- und Transportkosten höher
sind“
„Trinkwasser muss frei von solchen Bakterien, Viren und Parasiten sein, die durch Verschlucken
eine Erkrankung des Menschen verursachen können. Da deren Nachweis langwierig und nicht
immer sicher ist, wird Trinkwasser routinemäßig nur auf das Vorhandensein von so genannten
Indikatorkeimen überprüft“.
Die Anforderungen des ÖLMB B1 gelten als erfüllt, wenn die nachstehend angeführten
Richtzahlen (RZ) und zulässigen Höchstkonzentrationen (ZHK) eingehalten werden:
Bakteriologische Parameter
natives Wasser
RZ
Koloniebildende Einheiten (KBE/ml) bei 22°C 100
Koloniebildende Einheiten (KBE/ml) bei 37°C 20
Escherichia coli
Coliforme Bakterien
Enterokokken
Pseudomonas aeruginosa1)
Sulfitred. Clostridien2)
n.n. = nicht nachweisbar
ZHK
n.n. in 100ml
n.n. in 100ml
n.n. in 100ml
n.n. in 100ml
n.n. in 100ml
1) bei erweiterter bakt. Untersuchung bzw. bei chem.-techn. Aufbereitungsverfahren
2) bei erweiterter bakteriologischer Untersuchung
26
desinfiziertes Wasser
RZ
10
10
ZHK
n.n. in 250ml
n.n. in 250ml
n.n. in 250ml
n.n. in 250ml
n.n. in 250ml
Loeffler (1890): „Für die Beurteilung einer Infektionswahrscheinlichkeit interessiert es zu
wissen, ob in dem betreffenden Wasser Organismen vorhanden sind, welche der Darmflora, der
Jauchenflora, der Fäulnisflora oder der Flora der oberflächennahen Bodenschichten angehören.“
Kurze Charakterisierung der Indikatorbakterien
Escherichia coli: wird in großer Anzahl im Darminhalt des Menschen und warmblütiger Tiere
angetroffen, sein Nachweis gilt als sicheres Zeichen einer fäkalen Verunreinigung (der Mensch
scheidet täglich bis zu 1 Trillion! Colibakterien aus.)
Coliforme Bakterien: können fäkalen Ursprungs sein aber sich auch im Abwasser und Oberflächenwasser vermehren. Ihr Nachweis im Trinkwasser gilt solange als Zeichen einer fäkalen
Verunreinigung, bis ihre nicht-fäkale Herkunft gesichert ist.
Enterokokken: werden ebenfalls im Darminhalt des Menschen und warmblütiger Tiere angetroffen, auf Grund ihrer relativ kurzen Überlebensdauer im Wasser (wenige Tage bis Wochen)
gilt ihr Nachweis als Indikator für frische fäkale Kontaminationen. Enterokokken sind gegenüber
Chlor resistenter als E. coli und Coliforme.
Pseudomonas aeruginosa: als Saprophyt weit verbreitet, aber auch in geringer Anzahl im Darm
von Mensch und Tier; fakultativ pathogen. Da er zu den feuchtigkeitsliebenden und auch bei
niedrigen Temperatur- und Nährstoffverhältnissen wachsenden Bakterien zählt, muss mit seiner
Vermehrung in Toiletten, Ausgüssen und Geruchsverschlüssen und damit im gesamten wasserableitenden System gerechnet werden, insbesondere können auch Wasserhähne, Waschbecken,
Wasserbehälter und Wasseraufbereitungsanlagen (z.B. Ionenaustauscher) kontaminiert sein.
Sulfitreduzierende Clostridien: kommen u.a. im Darm von Mensch und Tier vor und können
daher fäkalen Ursprungs sein. Durch die besondere Widerstandfähigkeit der Sporen in der
Umwelt aber auch gegenüber Desinfektionsmittel gilt ihr Nachweis als Indikator für länger
zurückliegende fäkale Verunreinigungen bzw mangelnde Funktionstüchtigkeit von
Desinfektionsmaßnahmen.
Wenn auch das Prinzip der bakteriologischen Wasseruntersuchung mit dem Nachweis sog.
Verunreinigungsanzeigern bis heute annähernd gleich geblieben ist, so haben sich die Nachweismethoden doch weitgehend geändert. Positive Reaktionen in flüssigen oder auf halbfesten
Anreicherungsmedien zeigen lediglich eine wahrscheinliche (präsumptive) Anwesenheit von
Indikatorbakterien an, sind jedoch keinesfalls als Beweis für deren Vorhandensein zu bewerten.
Zur wissenschaftlich fundierten Absicherung des Untersuchungsergebnisses bedarf es einer
Reihe von weiteren meist biochemischen Bestätigungstests. Der große Nachteil dieser
bakteriologischen Untersuchungsmethoden liegt im enormen Zeitaufwand. Der gesicherte
Nachweis von Indikatorbakterien ist erst nach 3 bis 5 Tagen möglich. Einen diesbezüglich
wesentlichen Vorteil bringen automatisationsgestützte Identifikationssysteme, die den zeitlichen
Aufwand halbieren können. All diesen zitierten Methoden ist gemeinsam, dass deren
Interpretation nur gut ausgebildeten und erfahrenen Fachkräften möglich ist. Der Grund dafür
liegt hauptsächlich darin, dass es sich dabei um den Nachweis von vermehrungsfähigen
Lebewesen handelt, die sich anders verhalten als chemische (anorganische) Wasserinhaltsstoffe.
Lebewesen unterliegen einer naturgemäßen Variabilität deren Berücksichtigung zu großen
methodischen Problemen führen kann.
27
Beurteilung der Untersuchungsergebnisse und Maßnahmen:
Die seuchenhygienische Beurteilung einer Trinkwasserversorgungsanlage basiert auf die im
Zuge des Lokalaugenscheines vorgefundenen Gegebenheiten und dem Ergebnis der
bakteriologischen Untersuchung. Da der bakteriologische Befund nur einen Momentanzustand
erfasst, kann ein Vergleich mit den Ergebnissen der Vorbefunde aufschlussreiche Erkenntnisse
ergeben.
Auch die bei Beanstandungen zu treffenden Maßnahmen sind vom Ortsbefund und dem
Ausmaß der festgestellten Verunreinigungen abhängig. So wird bei massiven Verunreinigungen,
hervorgerufen durch eine Abwasserbeeinflussung eines Wasserspenders anders vorzugehen sein,
als bei geringfügigen Kontaminationen eines Endstranges.
Ein Beispiel nicht fäkaler Erreger mit dezentraler Vermehrung:
Legionellen: sind Bakterien, die als natürlicher Bestandteil der Mikroorganismenflora in
sämtlichen Süßwässern vorkommen. Sie gelangen in sehr geringen, mit den üblichen Verfahren
der Trinkwassermikrobiologie nicht nachweisbaren Konzentrationen in wasserführende Systeme,
wo sie ihre ökologischen Nischen und optimalen Vermehrungsbedingungen vorfinden. Sie
können Hausinstallationssysteme besiedeln (v.a. Duschköpfe, Wasserauslässe, Stagnationszonen ...) aber auch in Luftbefeuchtern u.a., wobei ihr Temperaturoptimum im Bereich von 25
bis 45°C liegt. Unter 20°C ist ihre Vermehrungsrate äußerst eingeschränkt, über 60°C werden
Legionellen abgetötet.
28
Bakteriologische Trinkwasseruntersuchung
lt. ÖLMB B1
Zu untersuchende Parameter:
1.)
2.)
3.)
4.)
5.)
Koloniebildende Einheiten (KBE) 22°C/ml ( Gussplattenverfahren )
Koloniebildende Einheiten (KBE) 37°C/ml ( Gussplattenverfahren )
Escherichia coli in 100ml ( Membranfiltration ) ( 48h / 37°C )
h
bzw. Coliforme Keime in 100ml (Membranfiltration) (48 /37°C)
Fäkalstreptokokken in 100ml ( Membranfiltration ) ( 48h / 37°C )
Pseudomonas aeruginosa in100ml ( Membranfiltation ) ( 48h / 37°C )
Bakt. Trinkwasseruntersuchung lt. ÖLMB B1: Analysenverlauf:
1.)
2.)
3.)
Probennahme im Außendienst (Begleitschein ausfüllen!) anschließend folgt die
bakteriologische Analyse des Wassers:
Für jede Flasche 3 sterile Petrischalen beschriften, sodass die Platten später zuordbar
sind und die zu pipettierenden Volumina notieren.
1,0ml (KBE 22°C)
0,1ml (KBE 22°C)
1,0ml (KBE 37°C)
Die Proben werden unter sterilen Bedingungen pipettiert, anschließend wird das
entsprechende Nährmedium (Hefeextraktagar) zugegeben; unter vorsichtigem
Schwenken werden Probe und Nährmedium vermischt. Die Platten werden unter
Berücksichtigung der Bebrütungstemperatur in die jeweiligen Brutschränke gegeben.
(Auswertung erfolgt nach 48 Stunden: Auszählen der Koloniebildenden Einheiten
(KBE) / 1ml (Lupe!))
Nachweis der Indikatorkeime mittels Membranfiltration: Porengröße 0,45µm
Membranfiltration:
Das Membranfiltrationsgerät muss vor der Verwendung sterilisiert werden. Das Unterteil des
Gerätes wird mit Hilfe eines Gummistopfens auf eine Saugflasche aufgesetzt und diese mittels
Vakuumschlauch mit der Wasserstrahlpumpe verbunden.
Der sterile Membranfilter wird mit einer sterilen Pinzette dem Kunststoffbeutel entnommen.
Nach Abnehmen des Aufsatzes wird das Filter auf den Filtertisch des Geräteunterteils gelegt und
der Aufsatz sofort wieder aufgesetzt. Nach erfolgter Filtration wird das Membranfilter mit dem
Gitternetz nach oben mit Hilfe einer sterilen Pinzette blasenfrei auf die Oberfläche des Agars
aufgebracht und inkubiert.
Coliforme Keime (incl. E.coli)
Enterokokken
Pseudomonas aeruginosa
4.)
TTC-Agar (37°C, 48h)
Slanetz-Bartley-Agar (37°C, 48h)
Cetrimid-Agar (37°C, 48h)
Nachweis von Coliformen Keimen mittels MPN-Methode
(Durchführung siehe Most Probable Number (MPN)
29
Nachweis von Escherichia coli und coliformen Keimen
Membranfiltration
Definition: E. coli und coliforme Keime gehören zu den Enterobacteriaceae, die folgend
definiert sind. Gramnegative, nicht sporenbildende, gerade, stäbchenförmige Bakterien,
beweglich durch peritriche Begeißelung oder unbeweglich.
Nachweis: Membranfiltration auf TTC-Agar; Inkubation 48h bei 37°C
Auswertung: Typische Kolonien von coliformen Keimen zeigen am TTC-Agar auf der
Unterseite des Filters einen gelben Fleck.
Bestätigungstests:
E. coli:
Gramfärbung, KOH-Lysis-Test
Cytochromoxidase - Reaktion negativ
Indolbildung aus Tryptophan
Gas- und Säurebildung aus Lactose binnen 24 Stunden
Coliforme Keime: ( z.B. Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella...)
Gramfärbung, KOH-Lysis-Test
Cytochromoxidose - Reaktion negativ
Gas- und Säurebildung aus Lactose binnen 48 Stunden!
Identifizierung der gewonnenen Reinkultur durch Bestimmung gewisser
biochemischer Leistungen (Kligler, API, Vitek).
Nachweis von Fäkalstreptokokken
Membranfiltration
Definition: Streptokokken sind runde bis ovale, sich in gewundenen Ketten anordnende, grampositive, unbewegliche, sporenlose Bakterien. Sie produzieren keine Katalase.
Nachweis: Membranfiltration auf Endo Stanetz-Bartley-Agar; Inkubation: 48h bei 37°C
Auswertung: Nach der Bebrütung werden alle Kolonien, welche eine rote, rotbraune oder rosa
Färbung vollständig oder im Zentrum der Kolonie aufweisen, als präsumptive Fäkalstreptokokken gezählt.
Bestätigungstests:
- Gramfärbung, KOH-Lysis-Test
- Katalase-Test (Streptokokken sind katalase-negativ)
- GPI (Vitek)
- Wellcome (Seroagglutination nach Lancefield)
30
MOST - PROBABLE - NUMBER (MPN)
Methode zur Bestimmung der wahrscheinlichsten Colizahl in 100 ml bei Verwendung von
jeweils 3 Röhrchen zu 10ml, 1ml und 0,1ml. (Nach: ISO 9308-2 bzw. Standard Methods for the
Examination of Water and Waste Water)
Nährmedium:
Materialien:
Lactose-Gäragar
Brutschrank, einstellbar auf 44°C bzw. 37°C
Maßpipetten, steril (2,0 ml/10,0 ml)
Eprouvettenständer
Durchführung:
a) Pipettiert werden folgende Probenvolumina:
3 x 10,0 ml der Probe zu je 10 ml doppelt konz. Lactose
3 x 1,0 ml der Probe zu je 5 ml einfach konz. Lactose
3 x 0,1 ml der Probe zu je 5 ml einfach konz. Lactose
b.) Bebrütung:
Fäkalcoliforme Keime:
Gesamtcoliforme Keime:
24 Stunden bei 44°C
48 Stunden bei 37°C
c) Auswertung:
Nach einer Bebrütungsdauer von 24 Stunden wird festgestellt, in welchen Röhrchen eine positive
Reaktion (d.h. Farbumschlag des Agars von grün auf gelb sowie Gasbildung) eingetreten ist. Je
nach Zahl der positiven Reaktionen in den 3 verschiedenen Verdünnungsstufen lässt sich
aufgrund statistischer Berechnungen ermitteln, welche Colizahl am wahrscheinlichsten in der
Wasserprobe zu erwarten ist. Diese Zahlen liegen in Form einer Tabelle vor, aus der die
entsprechenden Werte zu entnehmen sind.
Fehlerquellen:
Unachtsamkeit bei der Durchführung des Verfahrens
Unterschiede in der Zusammensetzung der Nährflüssigkeit
falsche Bebrütungstemperatur
falsche Bebrütungsdauer
kontaminierte Behältnisse
31
AUSWERTUNG
32
Chemische Analytik
Bestimmung der Gesamthärte (Summe Ca, Mg) durch
komplexometrische Titration
Allgemeines:
Ca und Mg-Ionen kommen in allen natürlichen Wässern vor und werden oft als Härtebildner
bezeichnet.
Als „Härte“ eines Wassers wird seine Eigenschaft bezeichnet, aus Seifenlösungen unlösliche
Calcium- und Magnesiumsalze der höheren Fettsäuren auszufällen.
Beurteilung der Gesamthärte :
0°
4°
8°
18,0°
dH
dH
dH
dH
- 3,9 °
- 7,9 °
- 17,9 °
- 30 °
> 30 °
dH:
dH:
dH:
dH:
dH:
sehr weich
weich
mittelhart
hart
sehr hart
Reagenzien:
Na-EDTA
0,05 mmol
Triethanolamin
Indikatorpuffertabletten (Eriochromschwarz T)
Ammoniak-Lösung conc.
Geräte:
Vollpipette
50 ml
Plastikbecher 100 ml
Digitalbürette Brandt 25 ml
Magnetrührer + Rührknochen
Durchführung:
50 ml der titrierten Wasserprobe (Karbonathärte mit 0,1 N HCL) werden mit einer
Indikatorpuffertablette sowie einige Tropfen Triethanolamin und einem Milliliter
Ammoniaklösung conc. versetzt.
Nach ca. 10 min. Standzeit (bis sich die Indikatorpuffertablette gelöst hat) wird mit 0,05 mmol
Na-EDTA bis zum Endpunkt titriert. (Farbumschlag von rot auf graugrün).
Auswertung:
Summe Erdalkalionen in mmol = axMx1000
V
a:
Verbrauch EDTA-Lösung in ml
M:
Molorität der EDTA-Lösung. (0,05 mmol)
V:
Probevolumen in ml (50 ml)
Umrechnung in ° dH:
° dH = mmol Erdalkali x 5,6
Ergebnis auf eine Kommastelle genau angeben.
(Festlegung: 1° dH ^ 10 mg ( Ca 0 und Mg 0)
33
Bestimmung der Karbonathärte (+m-Wert) durch
Titration
Allgemeines:
Die Karbonathärte ist ein Teil der Gesamthärte. Sie entspricht dem Anteil der Erdalkaliionen,
meist Ca und Mg-Ionen, der den im Wasser gelösten Hydrogencarbonat . (HCO -) und
3
Karbonationen (CO 2-) äquivalent ist. Das Verfahren ist für Trink- und Oberflächenwasser, bei
3
denen der pH-Wert größer als 4,3 ist, anwendbar.
Reagenzien:
HCl 0,1N
Methylorange
Geräte:
Vollpipette
50
Plastikbecher
100
Digitalbürette Brandt
25
Magnetrührer + Rührknochen
ml
ml
ml
Durchführung:
50 ml Wasserprobe werden mit einer Vollpipette in einen 100 ml Plastikbecher überführt und
mit 0,1 N HCL gegen Methylorange (3 Tropfen) bis zum Endpunkt titriert. Farbumschlag von
gelb auf Zwiebelschalenfarben (entspricht pH 4,3).
Auswertung:
°dH KH = + m-Wert x 5,6
+ m - Wert ist bezogen auf 50 ml Wasserprobe.
Diese Berechnung gilt im pH-Bereich 4,3 - 8,3 Ergebnis auf eine Kommastelle genau angeben.
Literatur:
DEV H 7 ( Bestimmung der Säurekapazität )
Hütter S 247 ff, 307, 207, 71
34
Bestimmung des pH-Wertes im Trink- und
Oberflächengewässer
Allgemeines:
Der pH-Wert ist der negativ dekadische Logarithmus der Wasserstoffionen - Aktivität H+ (mol/l)
und ist temperaturabhängig.
pH = - log H +
(gilt für Lösungen, in denen die H+ - Ionen 100 % dissoziiert vorliegen)
In natürlichen Wässern liegen die pH-Werte meist zwischen 6,5 und 8,5.
Reagenzien:
Boratpufferlösung
Phosphatpufferlösung
KCl-Lösung 3 M
pH 9,22
pH 6,88
Gerät:
pH-Elektrode: Hamilton-Gelplast
WTW pH 521
Magnetrührer + Rührknochen
Plastikbecher 100 ml
Durchführung:
Die Routinemessung erfolgt mittels WTW pH 521 im Eichbereich 6,88-9,22 bei Raumtemperatur (20°C).
Die Eichung ist routinemäßig 1 mal wöchentlich durchzuführen und täglich durch geeignete
Kontrollen (Puffer) zu prüfen.
Der pH-Wert der Probe muss im Eichbereich liegen, ansonsten ist ein anderer Bereich neu einzueichen (zB 2,00 - 6,88).
50 - 80 ml werden in den Plastikbecker überführt. Die pH-Elektrode wird in die Probe eingetaucht (ca. 3-4 cm) und die Messung erfolgt unter langsamen Rühren , bis sich ein konstantes
Messsignal eingestellt hat. Die Elektrode wird nach der Messung in 3 M KCl aufbewahrt.
Angabe der Ergebnisse :
Das Ergebnis wird auf 2 Stellen nach dem Komma angegeben. Die Bezugstemperatur ist
Raumtemperatur (20°C).
Bei vielen Untersuchungen (Badewässer, Oberflächenwässer) ist es notwendig, den pH-Wert vor
Ort zu messen.
Literatur:
DEV, C 5
ÖNORM M 6244
ÖNORM M 6259/55
35
Bestimmung der elektrischen Leitfähigkeit
Allgemeines:
Die elektrische Leitfähigkeit ( LF ) ist der reziproke Wert des elektrischen Widerstandes ( R ).
Die elektrische Leitfähigkeit von Wässern beruht ganz allgemein auf deren Gehalt an Ionen
(abhängig von Konzentration und Dissoziationsgrad der Elektrolyte, Wertigkeit, Ionenbeweglichkeit in Feldrichtung und Temperatur).
Im Wasser sind die Wertigkeit und die Wanderungsgeschwindigkeit der Ionen konstant, daher ist
bei konstanter Temperatur die elektrische Leitfähigkeit eine Funktion der Ionen-konzentration.
Reagenzien:
KCl 0,01 N ( ^ bei 25°C 1413 µS/cm)
Geräte:
Plastikbecher 100 ml
Meßzelle WTW LTA 1 (LF-Elektrode)
Temperaturfühler WTW TFK 530
WTW LF 530
Magnetrührer + Rührknochen
Durchführung:
Vor jeder Messserie muss die Zellenkonstante mit einer 0,01 N KCL-Lösung (^1413 µS/cm)
überprüft werden, wenn nötig, ist eine Korrektur der Zellkonstante erforderlich.
In den Plastikbecher werden 60 - 80 ml Wasserprobe eingefüllt und mittels Elektrode und
Temperaturfühler wird unter langsamen Rühren, bis sich ein konstantes Messsignal eingestellt
hat, die elektrische Leitfähigkeit bestimmt.
Auswertung:
Angabe der Ergebnisse in µS/cm bei einer Bezugstemperatur von 25°C ohne Kommastelle. Der
Wert erlaubt Rückschlüsse auf den Gesamtsalzgehalt und zur weiteren Kontrolle kann die
Mindestleitfähigkeit aus ( Kappa ) dem + m-Wert berechnet werden.
Kappa = + m-Wert . 80 (µS/cm)
Bei technischen Untersuchungen muss die elektrische Leitfähigkeit vor Ort bestimmt werden.
Literatur:
DEV, C 8
ÖNORM M 6241
ÖNORM M 6259
Bedienungsanleitung des Geräteherstellers (WTW)
36
Empfehlungen zu Bau, Sanierung und Desinfektion von kleinen
Wasserversorgungsanlagen (Hausbrunnen u. Quellfassungen)
Bei Trinkwasserverunreinigungen sind zwei Arten der Kontamination zu unterscheiden:
a)
b)
Verunreinigung des Wasserspenders (Brunnen oder Quellfassung): Durch bauliche Mängel besteht die Gefahr, daß z.B.
verunreinigtes Oberflächenwasser oder Abwasser in den Wasserspender eindringt. Solche Wässer sind charakterisiert durch
eine hohe Gesamtkeimzahl, den Nachweis von Fäkalkeimen und erhöhte Werte von Ammonium, Nitrit und organischen
Substanzen (Kaliumpermanganatverbrauch). Solche Verunreinigungen können durch bauliche Maßnahmen wie Reinigung
und Desininfektion relativ leicht behoben werden.
Eigentliche Verunreinigungen des Grundwassers: Solche durch Industrie, Landwirtschaft und Siedlungswesen, d.h. von
uns allen verursachte, Verunreinigungen des Grundwassers (Nitrat, Pestizide, chlorierte Kohlenwasserstoffe) sind weit
schwieriger und nur langfristig und kostenintensiv wieder gutzumachen.
Empfehlungen zu den am häufigsten angetroffenen baulichen Mängel:
Schachtbrunnen
1.
2.
3.
4.
Von der Abdeckung bis zum höchsten Grundwasserstand dichte Schachtwände.
Brunnenkranz 30 - 50 cm über Erdniveau.
Dichte Abdeckung mit insektensicherem Einstiegdeckel und Entlüftung.
Die Brunnenumgebung ist von möglichen Verunreinigungsquellen freizuhalten.
Quellfassungen
1.
2.
3.
4.
Quellen sind durch Nachgraben auf der wasserundurchlässigen Schicht soweit zu verfolgen, daß sie in einer Tiefe von
mindestens 3 - 4 m gefasst werden können.
Das Quellwasser ist hier durch Drainrohre zu sammeln und mittels Sammelrohre der Quellsammelstube zuzuführen für
deren bauliche Ausführung die gleichen Kriterien wie für den Schachtbrunnen gelten.
Quellsammelstuben müssen eine Überlauf- und Entleerungseinrichtung aufweisen, welche gegen das Eindringen von
Kleintieren durch Klappen (Froschklappe) zu sichern sind.
Die tagwassersichere und versperrbare Einstiegsöffnung darf nicht über der Wasserfläche liegen.
Anweisung zur Brunnendesinfektion
Die nachfolgend angeführten Empfehlungen zur Brunnendesinfektion sind nur dann Erfolg versprechend, wenn
bestehende Verunreinigungsmöglichkeiten vorher beseitigt wurden und sich der Brunnen in baulich einwandfreiem
Zustand befindet.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Frisches Chlorkalkpulver ist in Drogerien oder Apotheken erhältlich (Vorsicht stark ätzend, Dämpfe nicht einatmen, bei
Atemnot nach Chlorungsmaßnahmen sofort einen Arzt aufsuchen).
Mechanische Reinigung (Entfernen von Wandverschmutzungen und schlammigem Bodensatz) und gründliches Auspumpen
und erneutes Aufspiegelnlassen des Brunnens.
Auflösen der notwendigen Chlorkalkmenge in einem Kübel mit Wasser. Für 1 m3 Wasser (= 1000 Liter) werden 5 Gramm
(= 1 gehäufter Kaffeelöffel) Chlorkalkpulver benötigt, das sind bei überschlagsmäßiger Berechnung für einfache
Hausbrunnen (Brunnendurchmesser 0,75 - 1 m) 5 Gramm pro 1 m Wasserstand.
Die Chlorkalklösung in den Brunnen schütten und mindestens 24 Stunden einwirken lassen. Während dieser Zeit ist das
Wasser ungenießbar.
Das Leitungsnetz ist ebenfalls mit chloriertem Wasser zu spülen. Dazu alle Wasserhähne öffnen, bis ein Chlorgeruch
wahrnehmbar ist, dann abdrehen.
Nach Ablauf der Einwirkungszeit das chlorierte Wasser mittels sauberer Pumpe (oder nach Möglichkeit mit der normalen
Fördereinrichtung) vollständig abpumpen, das Wasser im Brunnen wieder aufspiegeln lassen und alle Wasserhähne solange
öffnen, bis kein Chlorgeruch mehr wahrnehmbar ist.
Nach erfolgter Desinfektion keine Arbeiten im Brunnenschacht. Gefahr erneuter Verunreinigungen!
Nach reichlicher Wasserentnahme 10 bis 14 Tage nach Desinfektion Durchführung einer Kontrolluntersuchung.
Erfahrungsgemäß ist eine einmalige Desinfektion nicht immer ausreichend. In diesem Fall muss die Chlorierung wiederholt
werden. Weiters weisen neue Brunnen aufgrund der Bauarbeiten oft keine einwandfreie Wasserqualität in bakteriologischer
Hinsicht auf. Es empfiehlt sich daher, nach Fertigstellung des Brunnens diesen zu desinfizieren. Die hygienische
Kontrolluntersuchung bei neuen Brunnen sollte nach Konsolidierung des Betons (ca. 3 Monate) und nach ständigem
Wasserverbrauch erfolgen.
Sämtliche Brunnenbauarbeiten, Reinigungs- und Desinfektionsmaßnahmen werden von behördlich konzessionierten
Brunnenmeistern durchgeführt.
Brunnenbauarbeiten, Reinigungs- und Desinfektionsmaßnahmen: Handelskammer Steiermark, Landesinnung der
Bauhilfsgewerbe, Körblergasse 111-113, 8010 Graz, Tel. (0316) 601-0
37
Anforderung an die Beschaffenheit von Trinkwasser
(gemäß Österr. Lebensmittelbuch Kapitel B 1 und BGBl. 304/2001 „Trinkwasserverordnung“
Trinkwasser ist Wasser, das in nativem Zustand oder nach Aufbereitung geeignet ist, vom Menschen ohne Gefährdung seiner
Gesundheit genossen zu werden, und das geruchlich, geschmacklich und dem Aussehen nach einwandfrei ist.
Prinzipiell ist für den menschlichen Genuss nativ hygienisch einwandfreies Wasser einem aufbereiteten Wasser vorzuziehen,
auch wenn die Erschließungs- und Transportkosten höher sind.
Parameter für die chemische Routineuntersuchung:
Bei Verdacht auf spezifische Verunreinigungen (Pestizide, Mineralöle u.a.) ist der Untersuchungsumfang entsprechend zu
erweitern.
Parameter
pH-Wert
elektr. Leitfähigkeit (µS/cm)
Gesamthärte (°dH)
Karbonathärte (°dH)
Eisen (mg/l)
Mangan (mg/l)
Ammonium (mg/l)
RZ
6,5 – 9,5
2500
5 – 30
ZHK
-
3 – 25
-
0,2
0,05
Nitrit (mg/l)
-
0,1
Nitrat (mg/l)
25
50
Chlorid (mg/l)
Sulfat (mg/l)
200
250
Oxidierbarkeit (mg KMnO4/l)
20
Bemerkungen
Das Wasser sollte nicht aggressiv sein.
Entsprechend der Mineralisierung des Wassers
Die Gesamthärte ist die Summe aller Kalzium- und
Magnesiumverbindungen im Wasser und setzt sich aus
der Karbonathärte (scheidet sich als Kalk ab) und der
Nichtkarbonathärte (bleibt im Wasser gelöst) zusammen.
Geogen bedingte Überschreitungen bleiben bis zu 5 mg/l außer
Betracht.
Überschreitung bis 0,5 mg/l zulässig falls geogen bedingt oder
technisch bedingt. Wasser mit einem Gehalt von über 0,1 mg/l
Nitrit sind für die Zubereitung von Nahrung für Säuglinge bis
zum Ablauf des 6. Lebensmonates nicht geeignet.
Bei Überschreitung d. ZHK ist das Wasser für die Zubreitung
von Nahrung für Säuglinge bis zum Ablauf d. 6. Lebensmonates
nicht geeignet.
Überschreitungen bis zu 750 mg/l bleiben außer Betracht, sofern
der dem Kalzium nicht äquivalente Gehalt des Sulfates 250 mg/l
nicht übersteigt.
Summenparameter für oxidierbare, organ. Substanzen
Parameter für die bakteriologische Routineuntersuchung:
Parameter
Gesamtkeimzahl
(KBE/ml bei 22°C)
RZ
100
Gesamtkeimzahl
(KBE/ml bei 37°C)
Escherichia coli/100 ml
Coliforme Bakterien/100 ml
Enterokokken/100 ml
20
RZ = Richtzahl (Indikatorparameter)
Null
-
ZHK
-
Bemerkungen
Bei Überschreitung der Richtzahlen ist das Wasser noch
genusstauglich; es ist jedoch zu prüfen, wodurch die
Überschreitung der Richtzahlen verursacht wird und
durch welche Maßnahmen sie gegebenenfalls rückgängig
gemacht werden kann.
Null
Diese Keime sind Darmbakterien, die eine fäkale
Verunreinigung des Wassers anzeigen. Bei deren
Null
Nachweis ist das Wasser nur im verlässlich abgekochten
Zustand genusstauglich.
ZHK = zulässige Höchstkonzentration (Parameterwert)
38
Kriterien für die Beurteilung der Untersuchungsergebnisse
Grundsätzlich ist für die Gesamtbeurteilung einer
Lokalaugenschein und eine Wasseranalyse erforderlich.
Wasserversorgungsanlage
ein
Genusstauglich: Den zulässigen Höchstkonzentrationen entsprechendes Wasser ist als genusstauglich zu beurteilen.
Bedingt genusstauglich:
Den zulässigen Höchstkonzentrationen nicht entsprechendes Wasser, jedoch nicht
gesundheitsgefährdendes Wasser, ist als bedingt genusstauglich zu beurteilen. Es kann innerhalb eines kürzeren Zeitraumes (im
Regelfall innerhalb von 6 Monaten) für Trinkzwecke verwendet werden, wenn eine wirksame Aufbereitung vorgenommen
werden wird oder eine ausreichende Abnahme der Gehalte der beanstandeten Stoffe zu erwarten ist.
Genussuntauglich: Den zulässigen Höchstkonzentrationen nicht entsprechendes Wasser ist als genussuntauglich zu
beurteilen, wenn es die Gesundheit des Menschen gefährden kann. Die zur Sicherung der Gesundheit notwendigen Maßnahmen
sind unverzüglich durchzuführen.
39
10. BLUT
Differentialblutbild
Zur Herstellung von brauchbaren Ausstrichpräparaten des Blutes ist die Verwendung exakt
gereinigter Objektträger wesentlich. Ausgestrichen wird im Allgemeinen mit einem zweiten
Objektträger. Es muss auf eine optimale Schichtdicke des Ausstrichs geachtet werden, da
Ausstrichpräparate mit zu großer Schichtdicke grundsätzlich überfärbt werden und eine Analyse
zellulärer Feinstrukturen dadurch unmöglich ist, während bei Ausstrichpräparaten mit zu
geringer Schichtdicke mehr oder minder viele weiße Zellelemente in lädiertem Zustand gefunden
werden.
Die am häufigsten angewandte Färbung der Blutausstriche nach Pappenheim beginnt mit einer
3-5 minütigen Einwirkung der Farblösung nach May-Grünwald, wobei gleichzeitig eine
Alkoholfixierung des Präparates stattfindet. Danach wird mit Aqua dest. abgespült. Hierauf
erfolgt eine 15-20 minütige Färbung mit verdünnter Giemsa-Lösung. Entscheidend ist dabei
der pH-Wert, der möglichst neutral sein sollte, wobei die Färbezeit bei gering saurem pH etwas
verlängert, bei gering alkalischem pH etwas verkürzt wird. Anschließend wird das Präparat
getrocknet.
Physiologisches Differentialblutbild
Stabkernige neutrophile Granulozyten
Segmentkernige neutrophile Granulozyten
Basophile Granulozyten
Eosinophile Granulozyten
Monozyten
Lymphozyten
0 - 4%
50 - 70%
0 - 1%
1 - 4%
2 - 8%
25 - 45%
Pathologisches Differentialblutbild
• Bakterieller Infekt: Bei einer bakteriellen Infektion ist der prozentuelle Anteil der
Granulozyten erhöht. Zusätzlich findet sich eine mehr oder minder ausgeprägte Vermehrung
der Stabkernigen (=Linksverschiebung). Bei Abklingen der bakteriellen Infektion kann oft
eine Zunahme der Eosinophilen (=eosinophile Morgenröte) beobachtet werden.
• Viraler Infekt: Bei einer viralen Infektion kommt es zu einer reaktiven Vermehrung der
Lymphozyten.
• Infektiöse Mononukleose: Bei der infektiösen Mononukleose kommt es zum Auftreten von
lymphatischen Reaktionsformen (Lymphoidzellen). Sowohl Kerngröße als auch
Zytoplasmadurchmesser können mehr als das Doppelte eines normalen Lymphozyten
erreichen. Besonders charakteristisch ist der weite Plasmasaum von unterschiedlich starker
Basophilie.
• Infektanämie: Bei schweren Infektionen kann man im Erythrozytenbild anämische
Veränderungen beobachten. Dabei treten eine Anisozytose (=Größenunterschiede der
Erythrozyten) und eine mehr oder minder stark ausgeprägte Poikilozytose
(=Formunterschiede der Erythrozyten) auf. Viele Infektanämien sind lange normochrom,
daher treten Anulozyten (=Ringformen der Erythrozyten) meist erst bei chronischen
Infektionen auf.
40
Blutvolumen
Beim erwachsenen Menschen beträgt das Blutvolumen etwa 6-8% des Körpergewichts. Das
entspricht ca. 5-6 Litern Blut.
Männer haben im Durchschnitt mehr Blut als Frauen.
Funktionen des Blutes
I. Transportfunktionen
1. Respiratorische Funktion: - Sauerstofftransport durch Erythrocyten,
- Kohlendioxydtransport im Blutplasma
2. Ernährungsfunktion: Nährstoffe werden zu Organen transportiert
3. Entschlackung: Transport der Stoffwechselendprodukte zu Ausscheidungsorganen
4. Humorale Funktion: Transport von Hormonen zu Erfolgsorganen
5. Regulationsfunktion: Verteilung von Wasser und Salzen im Körper (osmotische Regulation)
II. Wärmeregulation
Eine mehr oder weniger starke Blutversorgung eines Körperteils führt zu einer mehr oder
weniger starken Erwärmung.
III. Eigenfunktion des Blutes
1. Pufferung: Säure-Basen-Gleichgewicht im Körper muss konstant gehalten werden.
(Kohlensäure-Bicarbonat-Puffer, Hämoglobin)
2. Blutgerinnung: Fibrin und Thrombocyten
3. Abwehrfunktion: γ-Globuline, weiße Blutkörperchen
Zusammensetzung des Blutes
Blutplasma
Das Blut setzt sich aus zu 55% aus flüssigen Bestandteilen (=Blutplasma) und zu 45% aus festen
Bestandteilen (=Blutzellen) zusammen.
Blutplasma besteht zu 90% aus Wasser und zu 10% aus darin befindlichen Substanzen wie
gelösten Salzen und Eiweißkörpern.
Bluteiweiße:
Albumin
α-Globuline
β-Globuline
µ-Globuline
Fibrinogen
Blutserum: Blutplasma ohne Fibrinogen
Blutzellen
45% der Blutvolumens sind feste Bestandteile (=Blutzellen)
Erythrocyten: rote Blutkörperchen; 4,5-5,5 Millionen / mm³
Leukocyten: weiße Blutkörperchen; 6.000-8.000 / mm³
Thrombocyten: Blutplättchen; 150.000-300.000 / mm³
41
ERYTHROCYTEN
Anzahl: 4,5-5,5 Millionen / mm³
Anzahl steigt bei dauernder vermehrter Muskelaktivität und bei längerem Aufenthalt in größen
Höhen
Lebensdauer: 110-130 Tage
Regeneration erfolgt im roten Knochenmark
Abbau erfolgt bereits im Blut, in der Milz und in der Leber
Form: bikonkave, runde Scheiben, kernlos, sehr formellastisch; zentrale Eindellung dient der
Oberflächenvergrößerung; die Gesamtoberfläche aller Erythrocyten eines Menschens beträgt
3.000-4.000 m².
Funktion: Sauerstofftransport durch reversible Bindung an das zentrale Eisenatom des
Hämoglobins. Kohlendioxid wird als Kohlensäure hauptsächlich im Blutplasma transportiert.
LEUKOCYTEN
Anzahl: 6.000-8.000 / mm³
Anzahl kann stark schwanken. Bei akuten Erkrankungen kommt es zu einer Vermehrung der
Leukocytenanzahl (spez. neutrophile Granulocyten). Leukämie: bis zu 500.000 / mm³
Form: kernhältige Blutzellen, Zellen mit stark granuliertem Cytoplasma:
Granulocyten:
neutrophile Granulocyten:
eosinophile Granulocyten:
basophile Granulocyten:
Lymphocyten: 20-35%
Monocyten: 4-8%
56-75%
2-4%
0-1%
Lebensdauer: Granulocyten: 1-10 Tage
Lymphocyten: wenige Tage bis mehrere Jahre
Bildung erfolgt im Knochenmark, Lymphocyten werden zusätzlich im Thymus, der Milz und
den Mandeln gebildet. Abbau erfolgt teils im Blut, im Gewebe und der Milz.
Eigenschaften:
Granulocyten: amöboid beweglich, können ins Gewebe einwandern.
Phagocytose von Bakterien und kleinen Fremdstoffen
Lymphocyten: verschiedene Formen: B- und T-Lymphocyten wichtige
Rolle bei humoraler Abwehr und spezifischer Immunantwort.
Monocyten: "Freßzellen", Phagocytose
GRANULOCYTEN
Durchmesser : 9-12µm
Neutrophile Granulocyten
Zellkern: stabkernige Granulocyten: Jugendformen
segmentkernige Granulocyten: stark gelappter Zellkern
Granula: feine Granula im Cytoplasma, färbt sich blau an (Giemsa)
42
Eosinophile Granulocyten
meist etwas größer als neutrophile Granulocyten
Zellkern: besteht meist aus 2 Segmenten
Granula: relativ große Granulation, färbt sich rot an (Giemsa)
Basophile Granulocyten
Zellkern: verhältnismäßig groß, meist kugelig
Granula: große Granula, färbt sich blau an
LYMPHOCYTEN
Form: kugelige Zellen, nicht granuliert
Zellkern: relativ großer Kern, mehr oder weniger kugelig aber nie segmentiert, färbt sich stark
an
MONOCYTEN
Form: große vielgestaltige Zellen, Durchmesser: 12-20µm, Cytoplasma ist nicht granuliert
Zellkern: grobmaschig strukturiert, meist nierenförmig
43
44
45
46
47
48