Aus der Klinik für Nuklearmedizin
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Aus der Klinik und Poliklinik für Nuklearmedizin der Universität zu Köln Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. A. Drzezga Einfluss der Iodkonzentration auf die Strahlensensibilität von FRTL-5-Zellen Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Hohen Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln vorgelegt von Anika Herrmann aus Köln promoviert am 25. September 2013 Gedruckt mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität zu Köln 2013 Dekan: Universitätsprofessor Dr. med. Dr. h.c. Th. Krieg 1. Berichterstatter: Professor Dr. rer. nat. K. Schomäcker 2. Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. med. W. Krone Erklärung Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Dissertationsschrift ohne unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht. Bei der Auswahl und der Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des Manuskriptes habe ich Unterstützungsleistung von folgenden Personen erhalten: Herrn Professor Dr. rer. nat. K. Schomäcker, Herrn Dr. rer. medic. T. Fischer, Herrn Dipl.-Phys. Dr. rer. nat. W. Baus. Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit nicht beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe einer Promotionsberaterin/ eines Promotionsberaters in Anspruch genommen. Dritte haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertationsschrift stehen. Die Arbeit wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt. Köln, den 24.04.2013 Anika Herrmann Die dieser Arbeit zugrunde liegenden Experimente und deren Auswertung sind nach entsprechender Anleitung durch Herrn Professor Dr. rer. nat. K. Schomäcker, Herrn Dr. rer. medic. T. Fischer und Frau B. Zimmermanns von mir selbst in der Klinik und Poliklinik für Nuklearmedizin der Universität zu Köln ausgeführt worden. Die Bestrahlungen im Linearbeschleuniger wurden in der Klinik und Poliklinik für Strahlentherapie mit Hilfe von Herrn Dipl.-Phys. Dr. rer. nat. W. Baus durchgeführt. Danksagung Mein Dank gilt Herrn Professor Dr. rer. nat. K. Schomäcker für die Betreuung während der gesamten Zeit, für die Überlassung des Themas und der Hilfe bei der Fertigstellung dieser Arbeit. Auch möchte ich mich bei Herrn Dr. rer. medic. T. Fischer für die Hilfestellungen und Ideen bedanken, die mir bei der Fertigstellung dieser Arbeit weitergeholfen haben. Ein ganz besonderer Dank gilt Frau B. Zimmermanns, die mir im Labor stets zur Seite stand, mir in vielen Stunden bei der Durchführung der Experimente geholfen hat und ohne deren Hilfe, so manches Experiment nicht geglückt wäre. Ein herzlicher Dank geht auch an Herrn Dipl.-Phys. Dr. rer. nat. W. Baus, der mit mir so manche Feierabendstunde am Linearbeschleuniger verbracht hat und mir geholfen hat, die Zellen mit den richtigen Strahlendosen zu versorgen. Bedanken möchte ich mich bei meinen Freunden, die mir in so mancher Stunde des Zweifelns stets zur Seite standen und mich immer wieder davon überzeugten, weiterzumachen. Maria, die mir immer wieder Mut gemacht hat und mir bei allen Fragen weitergeholfen hat. Felix, für das penible Korrekturlesen, ohne den so mancher Punkt noch immer an der falschen Stelle wäre. Sebastian: Dir gilt mein besonderer Dank. Ohne Deine Unterstützung in den letzten Jahren hätte ich diese Arbeit wohl bis heute nicht fertig gestellt. Danke, dass Du immer für mich da bist. An wichtigster Stelle bedanke ich mich bei meiner Familie, die mich vom Anfang an unterstützt hat und immer an mich geglaubt hat. Ohne Euch alle wäre ich nicht so weit gekommen! Liebe Mama, lieber Papa, DANKE, dass Ihr mir dieses Studium ermöglicht habt. Dass Ihr in allen Situationen für mich da ward und meine Entscheidungen immer mitgetragen habt. Ich habe Euch sehr lieb!! Meinen Eltern Inhaltsverzeichnis Inhalt Abkürzungsverzeichnis ................................................................................................. 8 Einleitung ...................................................................................................................... 9 Hintergrund ............................................................................................................... 9 Theoretische Grundlagen ........................................................................................... 12 Funktion der Schilddrüse ......................................................................................... 12 Nicht-radioaktives Iod in der Schilddrüse................................................................. 12 Welchen Einfluss hat ionisierende Strahlung auf Schilddrüsenzellen? .................... 14 Schilddrüsenkarzinom ............................................................................................. 16 Apoptose und Nekrose ............................................................................................ 18 Material und Durchführung der Versuche.................................................................... 19 Material ................................................................................................................... 19 Zellen ................................................................................................................... 19 Chemikalien ......................................................................................................... 19 Geräte ................................................................................................................. 20 Erläuterung des Ablaufes eines ELISA .................................................................... 21 Herstellung der Zellkulturen und Kulturbedingungen ............................................... 22 FRTL-5-Zellen ..................................................................................................... 22 HaCaT-Zellen ...................................................................................................... 22 Vorbereitung der FRTL-5-Zellen für die Versuche ................................................... 23 Vorbereitung der HaCaT-Zellen für die Versuche .................................................... 23 Durchführung der Versuche .................................................................................... 24 Externe Bestrahlung ............................................................................................ 24 Interne Bestrahlung ............................................................................................. 25 Untersuchung der strahleninduzierten Zellschäden ................................................. 25 Berechnung der Versuchsergebnisse ...................................................................... 27 Ergebnisse.................................................................................................................. 28 Camptothecin-Test .................................................................................................. 28 Camptothecin-Test .................................................................................................. 29 5 Inhaltsverzeichnis Camptothecin-Test mit FRTL-5-Zellen ohne Iod ...................................................... 29 Camptothecin-Test mit FRTL-5-Zellen mit 10 µg Iod/ml .......................................... 29 Bestrahlung der FRTL-5- Zellen im Linearbeschleuniger ......................................... 30 Verhalten der Negativkontrollen ........................................................................... 30 Vergleich der Apoptose bei Zellen ohne Iod......................................................... 31 Vergleich der Apoptose bei Zellen mit 10 µg Iod/ml ............................................. 31 Vergleich der Apoptose bei Zellen mit 50 µg Iod/ml ............................................. 32 Vergleich der Apoptose bei Zellen mit 150 µg Iod/ml ........................................... 32 Auswertung der Apoptosen bei FRTL-5-Zellen ........................................................ 33 Bestrahlung der FRTL-5- Zellen im Linearbeschleuniger ......................................... 34 Nekrose der Negativkontrollen ............................................................................. 34 Vergleich der Nekrosen bei Zellen ohne Iod ........................................................ 35 Vergleich der Nekrose bei Zellen mit 10 µg Iod/ml ............................................... 35 Vergleich der Nekrose bei Zellen mit 50 µg Iod/ml ............................................... 36 Vergleich der Nekrose bei Zellen mit 150 µg Iod/ml ............................................. 36 Auswertung der Nekrose bei FRTL-5-Zellen............................................................ 37 Bestrahlung von HaCaT-Zellen im Linearbeschleuniger .......................................... 38 Vergleich der Apoptosen bei Hautzellen .............................................................. 38 Vergleich der Apoptosen bei Hautzellen .............................................................. 38 Vergleich der Apoptose bei Zellen ohne Iod......................................................... 39 Vergleich der Apoptose bei Zellen mit 150 µg Iod/ml ........................................... 39 Vergleich der Nekrose bei Hautzellen .................................................................. 40 Vergleich der Nekrose bei Zellen ohne Iod .......................................................... 40 Vergleich der Nekrose bei Zellen mit 150 µg Iod/ml ............................................. 40 Auswertung der Bestrahlung von HaCaT-Zellen im Linearbeschleuniger ................ 41 Vergleich der Apoptose bei FRTL-5-Zellen .......................................................... 43 Vergleich der Nekrose bei FRTL-5-Zellen ............................................................ 44 Bestrahlung der HaCaT- Zellen mit radioaktivem Iod ([131I]) .................................. 47 Vergleich der Apoptose bei HaCaT-Zellen ohne Iod ............................................ 47 6 Inhaltsverzeichnis Vergleich der Nekrose bei HaCaT-Zellen ............................................................. 48 Auswertung der Bestrahlung von HaCaT-Zellen mit radioaktivem Iod ..................... 49 Ergebnisauswertung ................................................................................................... 50 Camptothecin-Test .................................................................................................. 50 Apoptose der Negativkontrollen............................................................................... 50 Apoptosen der FRTL-5-Zellen ................................................................................. 51 Nekrosen der Negativkontrolle ................................................................................ 52 Nekrosen der FRTL-5-Zellen ................................................................................... 53 Apoptosen der HaCaT-Zellen .................................................................................. 54 Nekrosen der HaCaT-Zellen .................................................................................... 54 Bestrahlung der FRTL-5-Zellen mit radioaktivem Iod............................................... 55 Bestrahlung der HaCaT-Zellen mit radioaktivem Iod ............................................... 56 Diskussion .................................................................................................................. 57 I. Welchen Einfluss hat nicht-radioaktives Iod allgemein auf Schilddrüsenzellen?57 II. Reagieren FRTL-5-Zellen in Abhängigkeit von ihrer Iodversorgung unterschiedlich auf ionisierende Strahlung? ............................................................ 60 III. Gibt es hierbei einen Unterschied zwischen externer Bestrahlung und Bestrahlung mit radioaktivem Iod? .......................................................................... 61 IV. Gehen die Zellen durch Bestrahlung eher in Apoptose oder in Nekrose? ......... 62 Ausblick................................................................................................................... 63 Zusammenfassung ..................................................................................................... 64 Literaturverzeichnis ..................................................................................................... 65 Anhang: Abbildungsverzeichnis .................................................................................. 69 Lebenslauf .................................................................................................................. 72 7 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis ATP Adenosintriphosphat bzw. beziehungsweise ca. circa CDDT Cell Death Detecting Test d.h. das heißt DNA Desoxyribonukleinsäure et al. aus dem lateinischen: und andere FRTL-5 Fisher rat thyrocytes cell line no. 5 ggf. gegebenenfalls Gy Gray HaCaT human adult low calcium temperature keratinocytes [ 131 ]-Iod radioaktives Iod mg Milligramm ml Milliliter mM Millimolar, entspricht mmol/Liter µg Mikrogramm NIS Natrium-Iodid-Symporter PBS phosphate buffered saline = phosphatgepufferte Salzlösung POD Anti-DNA-Peroxidase PS Polystyrol-Platten SSD skin surface distance = Fokus-Messpunkt-Abstand T3 Triiodthyronin T4 Thyroxin T-Zellen Thymus-Zellen TAD-2 fetale Schilddrüsen Zelllinie TNF-α Tumornekrosefaktor-α TSH Thyreoidea-stimulierendes Hormon = Thyreotropin u.a. unter anderem z.B. zum Beispiel 8 Einleitung Einleitung Hintergrund Die Schilddrüse ist ein Organ, dessen Zellen eine geringe Strahlensensibilität zeigen, ebenso wie die Zellen von Herz, Hornhaut, Dickdarm, Magen, Blutgefäßen und Speiseröhre. Im Gegensatz dazu zeigen zum Beispiel Embryonen und Feten, Gonaden, das lymphatische System und Dünndarmepithel eine besonders hohe Strahlensensibilität. Trotz der nicht so hohen Strahlensensibilität ist die Bestrahlung der Schilddrüse ein sehr effektives Therapieverfahren bei Schilddrüsenerkrankungen. Sowohl eine interne Bestrahlung als auch eine externe Bestrahlung ist bei der Schilddrüse durchführbar. Bei der Radioiodtherapie wird die Schilddrüse intern mit radioaktivem Iod, einem Beta- und Gammastrahler, bestrahlt, woraufhin die Schilddrüsenzellen durch Apoptose oder Nekrose zugrunde gehen. Die Radioiodtherapie wird heutzutage vielfältig eingesetzt, beispielsweise zur Behandlung von immunogenen Hyperthyreosen, thyreoidaler Autonomie, kleinen Strumen oder als ergänzende Therapie beim follikulären oder papillären Schilddrüsenkarzinom. Dahingegen ist eine Radioiodtherapie bei medullären und anaplastischem Schilddrüsenkarzinom ohne Bedeutung, da diese Karzinome nicht am Iodstoffwechsel teilnehmen und aus diesem Grund kein radioaktives Iod aufnehmen können (3;8;9). Exogen bestrahlt werden kann die Schilddrüse beispielsweise zur Rezidivtherapie eines Schilddrüsenkarzinoms, abhängig vom genauen Differenzierungstyp. Hierbei wird in einem Linearbeschleuniger gerichtete Strahlung auf die Schilddrüsenregion gegeben um eine Zerstörung des entarteten Gewebes zu erreichen. Bei nur einmaliger Bestrahlung der Schilddrüse, z.B. im Rahmen eines Reaktorunfalls, geht die Schilddrüse nur teilweise zugrunde. Ein Teil der Schilddrüsenzelle wird zwar geschädigt, schafft es aber, durch zelleigene Reparaturmechanismen den Zellschaden zu überbrücken, während ein anderer Teil der Schilddrüse in Apoptose oder Nekrose übergeht. In einigen Fällen kommt es dazu, dass die Zelle es zwar schafft, durch Reparationsmechanismen zu überleben, jedoch werden Fehler in die DNA eingebaut und von der Zelle nicht erkannt. In einem solchen Fall hat die Zelle das Potential zu entarten. Heutzutage geht man davon aus, dass ca. 10 % aller Schilddrüsenkarzinome durch Bestrahlung hervorgerufen sind. Besonders deutlich wurde dies nach der Tschernobyl-Katastrophe. Bei dieser Katastrophe konnten radioaktive Stoffe, unter 9 Einleitung anderem das Isotop Caesium-137 und radioaktives Iod, vom Körper aufgenommen werden und sich in der Schilddrüse anreichern. In den Jahren nach dem Ereignis wurde eine deutlich angestiegene Neuerkrankungszahl an Krebserkrankungen festgestellt, unter anderem an Schilddrüsenkarzinomen (21;22;25). Die Entscheidung darüber, ob eine bestrahlte Schilddrüse oder Teile von ihr zugrunde gehen oder ob ihre Zellen Reparationsmechanismen einleiten, wird in den Zellen selbst getroffen. Gehen die bestrahlten Zellen durch programmierten Zelltod, sprich Apoptose, zugrunde, so werden möglicherweise entartete Zellen von selbst eliminiert. Die Zelle kann von der Bestrahlung auch direkt so stark beschädigt werden, dass sie keine Reparationsmechanismen mehr einleiten kann und nicht selber den geplanten Zelltod induzieren kann. In solchen Situationen geht die Zelle in den nicht-geplanten, plötzlichen Zelltod, der auch Nekrose genannt wird, über. Hierbei wird eine lokale Entzündungsreaktion hervorgerufen, die das restliche Zellmaterial abbaut und dadurch entartetes Zellmaterial teilweise entfernt. Bei der Radioiodtherapie konnte festgestellt werden, dass die Zellen hauptsächlich durch Nekrose zerstört werden und damit eine lokale Entzündungsreaktion hervorgerufen wird (3). Weiterhin konnte in der Radioiodtherapie entdeckt werden, dass es einen Zusammenhang zwischen der Iodmenge in der Schilddrüse und der Bestrahlung gebe könnte. Hier konnte man gehäuft feststellen, dass Menschen, die an einem Iodmangel leiden, mit einer niedrigeren Strahlendosis bestrahlt werden können als Menschen, die eine gut mit Iod versorgte Schilddrüse besitzen. Da die mit Iod versorgten Zellen schwächer durch die Bestrahlung geschädigt werden, müssen Patienten, deren Schilddrüse gut mit Iod versorgt ist, mit einer höheren Strahlendosis behandelt werden (33). Dies könnte bedeuten, dass Iod dafür sorgt, dass die Zellen sich besser regenerieren können und dadurch weniger häufig in Nekrose oder in Apoptose übergehen. 10 Einleitung Dieser Beobachtung aus der Radioiodtherapie, soll in dieser Arbeit in in-vitro Experimenten nachgegangen werden. Zur genaueren Differenzierung sollen folgende Fragestellungen genauer betrachtet werden: Fragestellungen: I. Welchen Einfluss hat nicht-radioaktives Iod auf Schilddrüsenzellen? II. Reagieren Schilddrüsenzellen in Abhängigkeit von ihrer Iodversorgung unterschiedlich auf ionisierende Strahlung? III. Gibt es einen Unterschied zwischen externer Bestrahlung und Bestrahlung mit radioaktivem Iod? IV. Gehen die Zellen nach Strahlenexposition eher in Apoptose oder in Nekrose? 11 Theoretische Grundlagen Theoretische Grundlagen Funktion der Schilddrüse Die Schilddrüse hat im menschlichen Körper eine sehr vielfältige Funktion. Über ihre Hormone T3 und T4 hat sie Einfluss auf viele Organsysteme. Hierbei ist die Wirkung von T3 wesentlich stärker als die Wirkung von T4. Weiterführende Informationen sind den angegebenen Quellen zu entnehmen (4;5;16;31). Nicht-radioaktives Iod in der Schilddrüse Durch Nahrung zugeführtes Iod wird nach Aufnahme in den Blutkreislauf hauptsächlich der Schilddrüse zur Verfügung gestellt. Iod wird in die Schilddrüse über den Natrium-Iodid-Symporter (NIS) (7) aufgenommen und in der Schilddrüse selber entweder direkt zu Hormonen umgebaut oder aber als Thyreoglobulin, als Vorläuferprotein der Schilddrüsenhormone, in Schilddrüsenfollikeln gespeichert. Der Natrium-IodidSymporter wird durch Thyreotropin (TSH) stimuliert (39) und durch hohe Mengen an Iod, Thyreoglobulin und einigen anderen Faktoren gehemmt (47). Um die Hormone Thyroxin (T4) und Triiodthyronin (T3) herstellen zu können, muss die Schilddrüse Iod aufnehmen. Dieses Iod wird in der Schilddrüse in seine einzelnen Atome zerlegt und anschließend neu zusammengebaut (19;24). Die Produktion dieser Schilddrüsenhormone ist überlebenswichtig für den menschlichen Organismus, da über die Schilddrüse der Energiehaushalt des Körpers gesteigert und/oder gehemmt wird (4;31). Da die Schilddrüse TSH-gesteuert arbeitet und auf die zugeführte Iodmenge mit Produktionssteigerung oder -hemmung reagiert, läge die Vermutung nahe, dass bei einer exzessiven Iodzufuhr eine große Menge an Schilddrüsenhormonen hergestellt wird. Weiterhin müsste angenommen werden, dass der Natrium-Iodid-Symporter gehemmt wird, so dass kein weiteres Iod in die Schilddrüse gelangt. Tatsächlich konnte man Schilddrüsenhormonproduktion jedoch ins beobachten, Unermessliche dass steigt, noch weder dass die die Iodaufnahme in die Schilddrüse irgendwann stoppt. Stattdessen treten zwei unterschiedliche Mechanismen ein, die die Schilddrüsenhormonproduktion hemmen. Zum einen wird durch die hohe Iodkonzentration die Abgabe der Schilddrüsenhormone aus der Schilddrüse gehemmt, was zu einem starken Abfall der Schilddrüsenhormone im Körper führt (11). Zum anderen wird über einen bisher nicht komplett geklärten Mechanismus die Iodaufnahme in den Schilddrüsenfollikeln 12 Theoretische Grundlagen gehemmt, so dass dadurch die Schilddrüsenhormonsynthese gesenkt wird, während weiterhin Iod im Blut vorhanden ist. Diesen Effekt nennt man den WolffChaikoff-Effekt (51). Der Wolff-Chaikoff-Effekt ist selbstlimitierend, so dass nach einigen Tagen die Schilddrüsenhormonsynthese erneut beginnt, unabhängig von der aktuellen Iodkonzentration (Escape-Phänomen) (52). In vielen Versuchsreihen und Experimenten hat man noch weitere Effekte von Iod entdeckt, welche teils besonders bei in vitro-Versuchen von Relevanz sind. Sowohl in vivo (26;49), als auch in vitro (18) konnte man zeigen, dass Iod sowohl einen inhibierenden, als auch einen stimulierenden Effekt auf Schilddrüsenzellen bzw. FRTL-5-Zellen (“Fisher rat thyrocytes cell line no. 5“) hat. In mehreren Versuchen wurde gezeigt, dass insbesondere bei FRTL-5 Zellen dieser Effekt nicht zu vernachlässigen ist (40). Während in niedrigen Dosen ein wachstumsfördernder Effekt gezeigt werden konnte, konnte bei höheren Ioddosen ein ausgeprägter proliferationshemmender Effekt festgestellt werden (10;17). Doch nicht nur auf das Wachstum der Zellen hat Iod einen Einfluss. Das nichtradioaktive Iod greift in den kompletten Stoffwechsel der Zellen ein und hemmt dabei die DNA-Synthese (2), so dass auch durch diesen Mechanismus das Wachstum und die Vermehrung der Zellen gehemmt wird. Vor einiger Zeit konnte in Experimenten gezeigt werden, dass Iod, vor allem in hohen Konzentrationen, auch einen zytotoxischen Effekt auf Schilddrüsenzellen hat. Nachgewiesen wurde dieser Effekt bereits in mehreren Versuchen. Dass dieser Effekt auch in-vitro bei Schilddrüsenzellen vorhanden ist, zeigten unter anderem Golstein und Vitale in ihren Versuchsreihe (18;50). So zeigte Vitale anhand von primären humanen Thyreozyten (TAD-2 und verschiedene Zellvarianten), dass die Zellen bei einer Dosis von 30 mM Iod sehr sensitiv reagieren und schließlich in den Zelltod übergehen. Ein solcher Effekt konnte in verschiedenen anderen Untersuchungen ebenfalls nachgewiesen werden (6;48;50). Dieser Effekt wird bei der Behandlung von Schilddrüsenstrumata genutzt. Dabei kommt es durch iod-induzierte Apoptose zu einer Abnahme der Struma. Führt man in-vivo eine Therapie mit Iod in pharmazeutischen Konzentrationen bei einer Schilddrüse mit Iodmangel durch, so kommt es in therapeutischen Ioddosen durch die zytotoxischen Effekte des Iods zur Apoptose, so dass die Struma sich zurückbildet. Therapiert man mit Hochdosis-Iod-Gaben so kommt es jedoch zur Nekrose und damit zur Entzündungsreaktion in der Schilddrüse (26). Während in-vivo schon geringe Ioddosen eine Abnahme der Struma bewirken, sind in-vitro zur Auslösung der Apoptose in Einzelzellkulturen recht hohe Ioddosen erforderlich (18;50). 13 Theoretische Grundlagen Welchen Einfluss hat ionisierende Strahlung auf Schilddrüsenzellen? Dass ionisierende Strahlung, also z.B. Gammastrahlen, Röntgenstrahlen oder kurzwellige Ultraviolettstrahlen, einen Einfluss auf die Schilddrüse hat, ist nicht erst seit der Reaktor-Katastrophe von Tschernobyl bekannt (29;29;30). In der Radioiodtherapie macht man sich heutzutage den, bei Tschernobyl unerwünschten, Effekt der ionisierenden Strahlung zu Nutze (9). Bei der Radioiodtherapie wird das radioaktive Iodisotop 131 genutzt, da es sowohl die Eigenschaften eines Beta- als auch eines Gammastrahlers besitzt. Das Schilddrüsengewebe wird hauptsächlich durch den Beta - Anteil des [131]-Iod zerstört, da dieser einen Apoptosemechanismus auslösen kann (43) . Marx et al konnten zeigen, dass bei [131]-Iod -Dosen bis zu 40 Gy die Zellen hauptsächlich in Apoptose übergehen, während sie bei höheren Bestrahlungsdosen über 40 Gy vermehrt in Nekrose gehen (27). Doch nicht nur die Strahlung von radioaktivem Iod führt zu Apoptose und Nekrose in Zellen. In den USA konnte beobachtet werden, dass die Schilddrüse Jahre nach einer therapeutischen Bestrahlungstherapie mit einer malignen Entartung auf die vorherige Bestrahlung reagieren kann. Es wurden über viele Jahre hinweg Kinder in der Halsregion therapeutisch bestrahlt. In den Jahren nach der Bestrahlung konnte bei diesen Kindern eine deutlich erhöhte Rate an Schilddrüsenkarzinomen festgestellt werden (1;13;42). Auch nach der Reaktor-Katastrophe von Tschernobyl konnte ein Anstieg der Schilddrüsenkarzinom-Inzidenz festgestellt werden (29;30;34;38). In Experimenten konnte unter anderem nachgewiesen werden, dass externe Bestrahlung durch hoch-energetische Photonen die Aufnahme von radioaktivem Iod erhöht (28). Auch für andere radioaktive Metabolite wie beispielsweise 18 F- Fluorodesoxyglucose konnte gezeigt werden, dass die aktive Aufnahme nach externer Bestrahlung deutlich höher war, als in Vergleichsgruppen ohne Bestrahlung (15). Jedoch werden die Zellen durch die hoch-energetischen Photonen in ihrer Proliferation gehemmt (28). Gezeigt wurde auch, dass FRTL-5-Zellen, die extern bestrahlt wurden, bis zu einer Dosis von 16 Gy ihre Schäden in der Zeit nach der Bestrahlung per Autoregeneration reparieren konnten. Ab einer Dosis von 24 Gy wurden die Zellen jedoch irreparabel geschädigt (44). Die Zellen gingen dadurch in Apoptose oder Nekrose über. Dass externe Bestrahlung auch einen Einfluss auf das Zellkern-ZytoplasmaVerhältnis hat, ist ebenfalls nachgewiesen worden. Abhängig von der TSH14 Theoretische Grundlagen Konzentration wuchs das Zellkern-Zytoplasma-Verhältnis bei einer Bestrahlung mit 4 Gy deutlich stärker an als bei 2 Gy. Die Autoren Stiblar-Martincic et al. beschrieben, dass die Bestrahlung wohl einen größeren Effekt auf den Zellkern als auf die Zelle selbst hat (45). 15 Theoretische Grundlagen Schilddrüsenkarzinom Die Karzinome der Schilddrüse werden nach dem Differenzierungsgrad der Tumorzellen in vier Hauptgruppen klassifiziert, die sich wiederum in verschiedene Untergruppen einteilen lassen. Eingeteilt werden die Schilddrüsenkarzinome in differenzierte und undifferenzierte Karzinome. Zu den differenzierten Karzinomen zählen das papilläre, das follikuläre und das medulläre Karzinom. Die undifferenzierten Karzinome werden auch anaplastische Karzinome genannt (31;36). Insgesamt machen Schilddrüsenkarzinome 1,9% der malignen Tumorerkrankungen bei Frauen und ca. 0,7% der malignen Erkrankungen bei Männern aus. Es verursacht jedoch bei Frauen nur 0,5% und bei Männern 0,2% aller Krebssterbefälle (35;36). Die Risikofaktoren für das Auftreten eines Schilddrüsenkarzinoms sind vielfältig. Eine wichtige Rolle spielen genetische Faktoren. Während papilläre und follikuläre Karzinome nur sehr selten familiär gehäuft auftreten (2-6%) und meistens sporadisch vorkommen, ist bei den medullären Karzinomen eine starke familiäre Häufung zu finden. Dabei treten ein Viertel bis ein Drittel der medullären Karzinome hereditär auf und werden autosomal-dominant mit nahezu 100%iger Penetranz vererbt (23;32). Weitere Risikofaktoren sind Strahlen. Besonders im jüngeren Alter unter 20 Jahren können ionisierende Strahlen die Schilddrüse nachhaltig schädigen. Bei Kindern und Jugendlichen, die eine Röntgenbestrahlung in der Halsgegend erhalten, ist die Schilddrüsenkarzinom-Gefahr deutlich erhöht (1;31;32). In den USA wurden von 1935-1950 die Tonsillen und Halslymphknoten von Kindern oft mit Röntgenbestrahlen behandelt. Mehrere Studien konnten zeigen, dass sich bei 11% der Betroffenen nach einer längeren Zeit ein Schilddrüsenkarzinom (minimale Induktionszeit 5 Jahre) entwickelte (31;35). Dass besonders ionisierende Strahlen die Schilddrüse nachhaltig und bis zur Regenerationsunfähigkeit schädigen können und stattdessen eine maligne Entartung provozieren, wurde in den Jahren nach der Reaktorkatastrophe von Tschernobyl beobachtet (14;31;35). Generell scheint die Inzidenz differenzierter Schilddrüsenkarzinome, im Gegensatz zu den undifferenzierten, nicht von der Iodversorgung der Bevölkerung abzuhängen (14). Es gibt keinen direkten Zusammenhang zwischen Iodversorgung und differenzierten Schilddrüsenkarzinomen. Bei den undifferenzierten, anaplastischen, Schilddrüsenkarzinomen sieht man hingegen jedoch klar, dass die Inzidenz mit steigender Iodzufuhr deutlich abnimmt (12;14). 16 Theoretische Grundlagen Allerdings beeinflusst die Iodaufnahme die Verteilung der histologischen Typen der differenzierten Schilddrüsenkarzinome erheblich. So überwiegen zum Beispiel mit zunehmender Iodaufnahme die papillären Karzinome gegenüber den follikulären Karzinomen (12). 17 Theoretische Grundlagen Apoptose und Nekrose Nekrose und Apoptose sind zwei Formen des Zelltods. Beide unterscheiden sich in der Art und Weise und den Mechanismus, wie die Zelle zugrunde geht. Bei der Nekrose kommt es zu einem plötzlichen, nicht geplanten Zelltod. Die Zelle bekommt durch äußere Einflüsse einen schweren Schaden zugeführt, den sie nicht durch eigene Mechanismen beheben kann. Solche Einflüsse können verschiedene physikalische und chemische Ursachen haben. Im menschlichen Organismus sind z.B. Sauerstoffmangel und starke Hitzeeinwirkung Ursachen für solche nicht reparablen Schäden. Im Gegensatz zur plötzlich einsetzenden Nekrose gibt es auch den geplanten Zelltod in Form der Apoptose. Diese Form des Zelltods ist eine vorprogrammierte Reaktion des Gewebes, bei dem es bestimmte alte, nicht mehr voll funktionstüchtige Zellen aussortiert und ihnen das Signal gibt, in den programmierten Zelltod überzugehen. Dieser Mechanismus ist entscheidend für die Entwicklung, Umwandlung und Aufrechterhaltung der Hämostase des jeweiligen Gewebes. Zusätzlich ist die Apoptose der entscheidende Schritt in der Tumorvorbeugung: Das Gewebe gibt Zellen, die einen DNA-Schaden erlitten haben, das Signal dazu, in Apoptose über zu gehen, damit aus ihnen keine schädlichen Tumorzellen entstehen und die Gene an Tochterzellen vererbt werden können (7;8;21;28;31;46;55;60). 18 Material und Durchführung Material und Durchführung der Versuche Material Zellen FRTL-5 Zellen (“Fisher rat thyrocytes cell line no. 5“) HaCaT-Zellen (“human adult low calcium temperature keratinocytes”) Chemikalien Hersteller Herkunftsort Material Berlin-Chemie Berlin, Deutschland Aqua ad iniectabilia Boehringer Ingelheim, Deutschland Trypsin EDTA 0,25 % Merck Darmstadt, Deutschland Kaliumiodid Tabletten, 50 µg Pasching, Deutschland Penicillin/Streptomycin PAA Laboratories GmbH DMEM High Glucose (4,5 g/l) Dulbecco’s PBS without calcium chloride and magnesium chloride, 1x Dulbecco’s PBS With calcium chloride and magnesium chloride, 1× Glutamin neugeborenen Kälberserum Roche Science Roth Sigma Applied Mannheim, Deutschland Cell Death Detection ELISA plus, 10 x Karlsruhe, Deutschland Wasser Deisenhofen, bovines TSH (=Thyreoidea-stimulierendes Deutschland Hormon) Camptothecin Coon´s Medium EDTA solution 0,02% Glycyl-Histidyl-L-Lysin Hydrocortison Insulin Sigma Deisenhofen, Deutschland Newborn Calf Serum 19 Material und Durchführung Somatostatin Transferrin Geräte Hersteller Herkunftsort Material BD Heidelberg, Deutschland Spritzen, verschiedene Größen Brand Wertheim, Deutschland Elekta GmbH Innsbruck, Österreich Transferpette und Transferpette 8 Elekta SLi linear accelerator Elekta SL 75-5 linear accelerator Eppendorf AG Hamburg, Deutschland Pipettenspitzen Greiner Frickenhausen, Deutschland 75 cm2 Kulturflaschen GFL Burgwedel, Deutschland Schüttelapparat 3005 Hettich Zentrifugen Tuttlingen, Deutschland Zentrifuge EBA 20 Zentrifuge ROTIXA 50 S Memmert Schwabach, Deutschland Wasserbad Microsoft Hamburg, Deutschland Excel 2007 Millipore GmbH Schwalbach/Ts., Deutschland Millipore Amicon Ultra Stericup & Steritop Sterile Falcon-Röhrchen Sarstedt Nümbrecht, Deutschland M-Sarpette® / Automatic-Sarpette® Pipettenspitzen (TipStack-Pack) Reagiergefäße für Mikrolitersysteme Serologische Pipetten SLT Labinstruments Achterwehr, Deutschland Tecan Männedorf, Schweiz Microplate washer Magellan™ - Data Analysis Software Spectra ELISA Reader for 96-well Microplates Thermo life sciences Egelsbach, Deutschland Clean Air Thermo scientific Dreieich, Deutschland HERA cell 150 VWR Darmstadt, Deutschland Zentrifugenröhren 20 Material und Durchführung Erläuterung des Ablaufes eines ELISA Der ELISA, also ein Enzyme-linked Immunosorbent Assay, nutzt ein Enzym, um damit bestimmte Substanzen zu markieren und nachzuweisen. Anhand des Substratumsatzes kann auf die Antigenkonzentration geschlossen werden. Mit dem verwendeten Test können sowohl Apoptose als auch Nekrose nachgewiesen werden. Bei der Nekrose erhöht die Plasmamembran ihre Permeabilität und Ionen können vermehrt in die Zelle gelangen. Das so entstehende Zellödem schwemmt die Zelle auf und sie lysiert binnen kurzer Zeit (Osmolyse). Die Apoptose hingegen ist durch bläschenförmige Ausstülpungen der Plasmamembran, Kondensation des Zytoplasmas und Aktivierung einer endogenen Endonuklease gekennzeichnet. Diese Nuklease spaltet den DNA-Doppelstrang in den Linker-Regionen zwischen den Nukleosomen in Mono- und Oligonukleosome. Da die Zellmembran bei der Apoptose jedoch intakt bleibt, sammeln sich die Nukleosomenbruchstücke in der Zelle selbst. Der genutzte Test basiert auf dem quantitativen Sandwich-Enzym-ImmunoassayPrinzip. Für die Versuche werden zwei monoklonale Maus-Antikörper gegen DNA und Histone eingesetzt, wodurch ein spezifischer Nachweis von Mono- und Oligonukleosomen in der zytoplasmatischen Fraktion von Zell-Lysaten möglich ist. Im ersten Inkubationsschritt wird Anti-Histon an der Wand der MikrotiterplattenWells fixiert. Als nächstes werden mit Hilfe eines Inkubationspuffers die unspezifischen Bindungsstellen gesättigt. Durch ihren Histon-Anteil werden die Nukleosomen nun in einem zweiten Inkubationsschritt an den an der Wand immobilisierten Anti-Histon-Anteil gebunden, so dass die Nukleosomen nun selber immobilisiert sind. Bei einer letzten Inkubation bindet Anti-DNA-Peroxidase (POD) an den DNA- Anteil der Nukleosomen. Nach Auswaschen des nicht-gebundenen Peroxidase- Konjugates wird der Anteil der im Immunkomplex fixierten Peroxidase mit ABTS (2,2’-Azino-di-[3- ethylbenzthiazolin-sulfonat (6)]) als Substrat photometrisch bestimmt. Photometrisch werden die entsprechenden Platten ausgewertet. Per zugehörigem Computerprogramm können die erhaltenen Absorptionswerte ermittelt werden (37). 21 Material und Durchführung Herstellung der Zellkulturen und Kulturbedingungen FRTL-5-Zellen Für die Versuche wurden FRTL-5 Zellen („Fisher rat thyrocytes cell line no. 5“) verwendet. Die Zellen wurden kultiviert in Coon´s Medium mit Ham´s F-12 Modifikation, bestehend aus 1% Penicillin/Streptomycin (10.000 Units/10 mg/ml), 1% Glutamin (200 mM), 5% neugeborenen Kälberserum, 3,3% Natriumbicarbonat und einem Hormoncocktail aus Glycyl-Histidin-L-Lysin (1 µg/ml), Hydrocortison (0,362 µg/ml), Insulin (1 mg/ml), Transferrin (500 µg/ml), Somatostatin (1 µg/ml) und 0,5% bovinem TSH (5 mU/ml). Die Zellen wurden bei 37°C unter 5%iger CO2Atmosphäre im Brutschrank in 75 cm2 Kulturflaschen mit 20 ml Medium kultiviert. Sie wurden mit unterschiedlichen Iodkonzentrationen (kein Iod, 10 µg Iod/ml, 50 µg Iod/ml oder 150 µg Iod/ml) versehen. Das Kulturmedium wurde alle 48 bis 72 Stunden sowie direkt vor Versuchsdurchführung gewechselt. Umgesetzt wurden die Zellen bei einer 70-80%igen Konfluenz. Die Experimente wurden an Kulturen durchgeführt die zum Zeitpunkt der Versuchsdurchführung 60-70% konfluent waren. Zu diesem Zeitpunkt lag eine Kultivierungszeit von 21 ± 5 Tagen vor. Bei jedem Mediumwechsel wurde anschließend Iod in der entsprechenden Menge zugegeben und die Zellen mit diesem Iod über die genannten 21 ± 5 Tage kultiviert, bevor die Versuche starteten. HaCaT-Zellen Für die Versuche wurden zudem HaCaT-Zellen („human adult low calcium temperature keratinocytes“) verwendet. Die Zellen wurden kultiviert in DMEM High Glucose, welche versetzt wurde mit Glutamin, 10% FCS und Antibiotika/Antimykotika. Die Zellen wurden bei 37°C unter 5%iger CO2-Atmosphäre im Brutschrank in 75 cm2 Kulturflaschen mit 20 ml Medium kultiviert. Die Zellen wurden mit unterschiedlichen Iodkonzentrationen (kein Iod oder 150 µg Iod/ml) versehen. Das Kulturmedium wurde alle 48 bis 72 Stunden sowie direkt vor Versuchsdurchführung gewechselt. Umgesetzt wurden die Zellen bei einer 7080%igen Konfluenz. Die Experimente wurden ebenfalls an Kulturen durchgeführt die zum Zeitpunkt der Versuchsdurchführung 60-70% konfluent waren. Zu diesem Zeitpunkt lag eine Kultivierungszeit von 21 ± 5 Tagen vor. Bei jedem Mediumwechsel wurde anschließend Iod in der entsprechenden Menge zugegeben und die Zellen mit diesem Iod über die genannten 21 ± 5 Tage kultiviert, bevor die Versuche starteten. 22 Material und Durchführung Vorbereitung der FRTL-5-Zellen für die Versuche Für die Versuche wurden die Zellen einen Tag vor Versuchsdurchführung aus dem Zellverband gelöst. Anschließend wurden die Zellen mit PBS ohne Magnesium und Kalzium gespült, mit EDTA-Lösung versetzt und somit vereinzelt. Danach konnten die Zellen mit 10 ml Medium in Zentrifugenröhrchen gegeben werden und für 10 Minuten bei 1000 U/min (200xg) zentrifugiert werden. Nach dem Dekantieren der überstehenden Flüssigkeit erhielt man die komplett voneinander gelösten Zellen. Die Zellen wurden in einer Fuchs-Rosenthal-Zählkammer gezählt und jeweils 3*105 Zellen entnommen und in 10 ml Kulturmedium gegeben. Von der so erhaltenen Zellsuspension wurden jeweils 100 µl in ein well der 96-well-Mikrotiterplatte gefüllt. Die Mikrotiter-Platte wurde für 24 Stunden im Brutschrank kultiviert. Nach den 24 Stunden erhielten die Zellen kurz vor Durchführung des Versuches noch einmal 100 µl Kulturmedium. In einer Wärmebox wurden die Zellen zum Versuchsaufbau transportiert. Vorbereitung der HaCaT-Zellen für die Versuche Die HaCaT-Zellen wurden analog der FRTL-5-Zellen für die Versuche vorbereitet. 23 Material und Durchführung Durchführung der Versuche Externe Bestrahlung Die Zellen wurden (bis auf die Kontrollgruppen) in der Klinik und Poliklinik für Strahlentherapie der Universität zu Köln von Herrn Dr. Wolfgang Baus in einem Linearbeschleuniger bestrahlt. Der Großteil der Versuche wurde im Linearbeschleuniger „Elekta SL 75-5 linear accelerator“ durchgeführt. Hierbei hatte das Bestrahlungsfeld eine Größe von 38x38 cm2, die Plattendicke betrug 1,5 cm (Halterung + 0,5 cm PS), der Fokus-Messpunkt-Abstand (SSD) 58,5 cm. Zusätzlich wurden 10 cm Polystyrol-Platten (PS) als Rückstreumaterial verwendet. Da dieses Gerät vor Abschluss aller Versuche einen Defekt hatte, wurden die restlichen Versuche im Linearbeschleuniger „Elekta SLi linear accelerator“ ausgeführt. Hierbei hatte das Bestrahlungsfeld eine Größe von 36x36 cm2, die Plattendicke betrug 2,0 cm (Halterung + 1,0 cm PS), der Fokus-Messpunkt-Abstand (SSD) 57,2 cm. Zusätzlich wurden 7 cm PS Rückstreumaterial verwendet. In beiden Fällen erfolgte eine isozentrische Bestrahlung, d.h. es wurde mittels der Mehr-Felder-Technik aus unterschiedlichen Winkeln Teildosen appliziert. Um zu erreichen, dass die Zellen unter den gleichen Bestrahlungsbedingungen bestrahlt werden, wurde ein spezielles Bestrahlungsverfahren gewählt: Alle Zellen wurden zusammen in das Bestrahlungsfeld gebracht und die Bestrahlung wurde begonnen. Beim Erreichen der kleinsten gewünschten Bestrahlungsdosis wurde die Bestrahlung unterbrochen und die entsprechenden Zellen aus dem Bestrahlungsfeld genommen wurden. Anschließend wurde die Bestrahlung fortgesetzt bis zur nächsten erwünschten Bestrahlungsdosis, bei der wieder Zellen aus dem Bestrahlungsfeld genommen. Insgesamt konnten so pro Bestrahlungsvorgang acht Bestrahlungsdosen erreicht werden. Bei den ersten Versuchen wurden die Bestrahlungsdosen auf 0,01 Gy, 0,11 Gy, 1,0 Gy, 4,4 Gy, 9,6 Gy, 21 Gy, 45,8 Gy, 96 Gy und 100 Gy festgesetzt. Während der Arbeit wurde beschlossen, die Zellen höheren Strahlendosen auszusetzten, so dass die Bestrahlungsdosen auf 1 Gy, 5 Gy, 12,5 Gy, 25 Gy, 50 Gy, 100 Gy, 200 Gy und 400 Gy erhöht wurden. Die ausgesuchten Bestrahlungsdosen sollten als Beispiel für den gesamten Bestrahlungsraum stehen. 24 Material und Durchführung Interne Bestrahlung Die Zellen wurden analog der externen Bestrahlung vorbereitet. Die einzelnen wells der Mikrotiterplatte wurden mit radioaktivem Iod beimpft. Dabei wurde mit vier verschiedenen Bestrahlungdosen gearbeitet (0,1 MBq/ml, 1,0 MBq/ml, 10 MBq/ml und 50 MBq/ml). Untersuchung der strahleninduzierten Zellschäden Im Anschluss an die Bestrahlung wurden die Zellen für 24 Stunden im Wärmeschrank untergebracht, um den Zellen eine Chance zur Regeneration zu geben. Anschließend wurden die Zellen entnommen, um die strahleninduzierten Zellschäden zu untersuchen. Die Versuchsauswertung wurde mit Hilfe des „Cell Death Detection ELISA plus, 10 x“ (CDDT) der Firma Roche nach der beigelegten Versuchsanleitung durchgeführt. Für jede bestrahlte 96-well-Platte wurden zwei ELISA-Platten angelegt, um jeweils Apoptose und Nekrose getrennt voneinander beurteilen zu können. Nach Abschluss des ELISA wurden die Platten mit Hilfe des „Tecan Spectra Classic Plate Reader“ bei 405 nm (Referenzwellenlänge 492nm) ausgewertet und die Ergebnisse im Programm „Magellan™ - Data Analysis Software“ der Firma Tecan dargestellt. In das Programm „Microsoft Excel 2007“ wurden die Daten schließlich eingelesen und dort weiter bearbeitet. 25 Material und Durchführung Die Aufteilung der Zellen auf den Mikrotiterplatten war dabei wie folgt gegeben: Abbildung 1: Mikrotiterplatte Blau: Orange: Grün: Weiß: Negativkontrollen Untersuchte Proben (Ziffern 2-11 mit den verschiedenen Bestrahlungskonzentrationen, A-H sind die verschiedenen Probe pro Bestrahlungskonzentration) Positivkontrolle Background 26 Material und Durchführung Berechnung der Versuchsergebnisse Zur Berechnung der Versuchsergebnisse wurde ein Mittelwert aus den acht Einzelwerten der Negativkontrolle gebildet. Zudem wurden die vier den Background darstellenden Werte gemittelt. Ähnlich wurde mit den Probenwerten vorgegangen: Alle Werte, die einer Bestrahlungskonzentration angehörten, wurden gemittelt. Der jeweilige Apoptose- oder Nekrosefaktor wurde nach folgender Rechnung berechnet: Fi= (Xₐ-BG) (Xₒ-BG) i = Bestrahlungskonzentration Fi = Anreicherungsfaktor bei einer bestimmten Bestrahlungskonzentration (Xa) = Mittelwert der zusammengehörenden Proben Xo = Mittelwert der Negativkontrollen BG = Background 27 Ergebnisse Ergebnisse Camptothecin-Test Camptothecin ist ein zelltoxisches Alkaloid, welches in der Lage ist, das Enzym Topoisomerase I zu hemmen. Wird dieses Enzym gehemmt, so kommt es zu hohen Torsionskräften an der DNA-Doppelhelix, während sich diese für den Ablesevorgang entspiralisiert. Normalerweise würde die Topoisomerase I diese Kräfte mindern, indem sie ATP-unabhängige Einzelstrangbrüche induziert und diese am Ende des Vorgangs wieder verschließt. Durch die Zugabe von Camptothecin kommt es nun zu einer Stabilisierung des Topoisomerase-I-DNA-Komplexes. Der Wiederverschluss der DNA nach dem Ablesevorgang kann nicht mehr durchgeführt werden. Neben den Einzelstrangbrüchen kommt es durch die wirkenden Kräfte zu Doppelstrangbrüchen, welche schließlich zur Apoptose führen. Die Wirksamkeit von Camptothecin ist auf die S-Phase des Zellzyklus, der Phase in der auch die DNA-Synthese stattfindet, beschränkt (20). In den Versuchen soll mit Hilfe des Camptothecin-Testes geprüft werden, ob die Zellen grundsätzlich in der Lage sind, in Apoptose zu gehen. Dies zeigt schließlich, ob die Versuche, die durchgeführt wurden, überhaupt aussagekräftig sind. Für die Versuchsdurchführung wurden FRTL-5-Zellen ausgewählt. Eine Gruppe wurde komplett ohne Iod inkubiert, die andere Gruppe wurde mit 10 µg Iod/ml inkubiert. Camptothecin wurde in den Konzentrationen 0,1 mg/ml, 1 mg/ml, 2 mg/ml oder 4 mg/ml zugegeben. Vier Stunden nach der Zugabe wurde der CDDT durchgeführt. Die Berechnung der Versuchsergebnisse erfolgte, wie bereits unter Material und Durchführung beschrieben. 28 Ergebnisse Camptothecin-Test Camptothecin-Test mit FRTL-5-Zellen ohne Iod . Abbildung 2: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Apoptose von FRTL-5-Zellen, welche ohne Iod inkubiert wurden und anschließend mit Camptothecin in vier verschiedenen Konzentrationen versetzt wurden. Camptothecin-Test mit FRTL-5-Zellen mit 10 µg Iod/ml Abbildung 3: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Apoptose von FRTL-5-Zellen, welche mit 10 µg Iod/ml Iod inkubiert wurden und anschließend mit Camptothecin in vier verschiedenen Konzentrationen versetzt wurden. 29 Ergebnisse Bestrahlung der FRTL-5- Zellen im Linearbeschleuniger Verhalten der Negativkontrollen Bei jeder Versuchsreihe wurde jeweils eine Negativkontrolle mitbestimmt, welche zwar mit Iod versetzt und inkubiert, jedoch nicht im Linearbeschleuniger bestrahlt wurde. Da auch schon die Negativkontrollen eine Aussage über den Einfluss von Iod auf FRTL-5-Zellen liefern, werden alle erhaltenen Negativkontrollen aus den jeweiligen Versuchen einmal zusammen aufgeführt. Zur Berechnung wurden hier die erhaltenen Werte als Probenwerte genommen und der dazugehörige Background abgezogen. Abbildung 4: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Apoptose von FRTL-5-Zellen mit den angegebenen Mengen an Iod. Man erkennt, dass Iod einen Einfluss auf die Apoptose der FRTL-5 Zellen hat. Mit steigender Iodkonzentration sinkt die Apoptose der Zellen. Der Apoptosefaktor bleibt bei allen Iodkonzentrationen relativ niedrig. Jedoch ist die Abnahme deutlich ersichtlich. Da es anscheinend einen physiologischen Zusammenhang zwischen Iodkonzentration und Apoptose gibt, wird in den folgenden Versuchen die Negativkontrolle heraus gerechnet, um die Ergebnisse nicht hierdurch zu verfälschen. 30 Ergebnisse Vergleich der Apoptose bei Zellen ohne Iod Abbildung 5: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Apoptose von FRTL-5-Zellen, ohne Iod, in Abhängigkeit von der jeweiligen Strahlendosis. Vergleich der Apoptose bei Zellen mit 10 µg Iod/ml Abbildung 6: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Apoptose von FRTL-5-Zellen, mit 10 µg Iod, in Abhängigkeit von der jeweiligen Strahlendosis. 31 Ergebnisse Vergleich der Apoptose bei Zellen mit 50 µg Iod/ml Abbildung 7: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Apoptose von FRTL-5-Zellen, mit 50 µg Iod, in Abhängigkeit von der jeweiligen Strahlendosis. Vergleich der Apoptose bei Zellen mit 150 µg Iod/ml Abbildung 8: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Apoptose von FRTL-5-Zellen, mit 150 µg Iod, in Abhängigkeit von der jeweiligen Strahlendosis. 32 Ergebnisse Auswertung der Apoptosen bei FRTL-5-Zellen In den Einzelversuchen erkennt man einen deutlichen Zusammenhang zwischen steigender Strahlendosis und steigender Apoptose. Um beurteilen zu können, ob die jeweilige Iodkonzentration einen Einfluss auf die Apoptose hat, wurden die Apoptosen bei den unterschiedlichen Iodkonzentrationen zusammen dargestellt: Abbildung 9: Apoptose FRTL-5-Zellen, mit unterschiedlichen Iodkonzentrationen, welche mit den angegebenen Strahlendosen exponiert wurden. Auf den ersten Blick erkennt man deutlich, dass Iod einen relevanten Einfluss auf die Apoptose der Zellen ausübt. Bis zu einer Strahlendosis von 25 Gy verlaufen die Apoptosen bei den unterschiedlichen Iodkonzentrationen einigermaßen parallel, es ist kein relevanter Unterschied auszumachen. Ab 50 Gy erkennt man, dass die Apoptoserate mit steigender Iodkonzentration bei gleicher Strahlendosis abnimmt. Dieser Trend ist ab 200 Gy besonders deutlich sichtbar. Sowohl bei 200 Gy, als auch bei 400 Gy erkennt man eindrucksvoll, dass die Apoptoserate mit steigender Iodkonzentration sich negativ reziprok zur Iodkonzentration verhält. 33 Ergebnisse Bestrahlung der FRTL-5- Zellen im Linearbeschleuniger Nekrose der Negativkontrollen Adäquat zur Apoptose wurden auch bei der Nekrose die Negativkontrollen ausgewertet. Abbildung 10: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Nekrose von FRTL-5-Zellen mit den angegebenen Mengen an Iod. Man erkennt, dass Iod einen Einfluss auf die Nekrose der FRTL-5 Zellen hat. Mit steigender Iodkonzentration sinkt die Nekrose der Zellen zunächst um dann bei 150 µg/ml deutlich anzusteigen. Die Nekrose bleibt bei allen Iodkonzentrationen relativ niedrig. Jedoch ist die Abnahme der Nekrose deutlich ersichtlich. 34 Ergebnisse Vergleich der Nekrosen bei Zellen ohne Iod Abbildung 11: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Nekrose von FRTL-5-Zellen, ohne Iod, in Abhängigkeit von der jeweiligen Strahlendosis. Vergleich der Nekrose bei Zellen mit 10 µg Iod/ml Abbildung 12: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Nekrose von FRTL-5-Zellen, mit 10 µg Iod, in Abhängigkeit von der jeweiligen Strahlendosis. 35 Ergebnisse Vergleich der Nekrose bei Zellen mit 50 µg Iod/ml Abbildung 13: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Nekrose von FRTL-5-Zellen, mit 50 µg Iod, in Abhängigkeit von der jeweiligen Strahlendosis. Vergleich der Nekrose bei Zellen mit 150 µg Iod/ml Abbildung 14: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Nekrose von FRTL-5-Zellen, mit 150 µg Iod, in Abhängigkeit von der jeweiligen Strahlendosis. 36 Ergebnisse Auswertung der Nekrose bei FRTL-5-Zellen Um beurteilen zu können, ob die jeweilige Iodkonzentration einen Einfluss auf die Nekrose hat, wurden die Nekrosen bei unterschiedlichen Iodkonzentrationen gemeinsam dargestellt: Abbildung 15: Nekrose FRTL-5-Zellen, mit unterschiedlichen Iodkonzentrationen, welche mit den angegebenen Strahlendosen bestrahlt wurden. Anhand der Graphen ist zu erkennen, dass ab 100 Gy die Nekroserate mit steigender Bestrahlungsdosis zunimmt. Bis zu 100 Gy ist ein solcher Trend aufgrund der großen Streuung nicht eindeutig erkennbar. Es ist fast durchgehend zu erkennen, dass bei allen Bestrahlungsdosen die Zellen, welche mit 150 µg Iod inkubiert waren, am wenigsten in Nekrose gehen, während die Zellen ohne Iod am meisten in Nekrose übergehen. Die Zellen, welche mit 10 µg und 50 µg Iod inkubiert waren, zeigen einen etwas unregelmäßigen Verlauf. Bei 100 Gy haben die FRTL-5-Zellen mit 50 µg Iod eine Spitze, während die FRTL-5-Zellen mit 10 µg Iod diese Spitze bei 400 Gy zeigen. Grob lässt sich jedoch erkennen, dass Iod einen Einfluss auf die Nekrose hat und mit steigender Iodkonzentration die Nekrose bei gleichbleibender Bestrahlungsdosis abnimmt. 37 Ergebnisse Bestrahlung von HaCaT-Zellen im Linearbeschleuniger Vergleich der Apoptosen bei Hautzellen Um herauszufinden, ob die bisher erworbenen Ergebnisse ein spezielles Phänomen von Schilddrüsenzellen sind oder ob es ein Effekt durch z.B. die toxischen Eigenschaften des Iod ist, wurden zusätzlich Hautzellen mit Iod versetzt und bestrahlt. Hierfür wurden HaCaT-Zellen (human adult low calcium temperature keratinocytes), humane Keratinozyten, ausgewählt. Diese wurden, analog zu den Versuchen mit FRTL-5-Zellen, mit Iod versetzt, im Inkubator für ungefähr 21 Tage inkubiert und anschließend im Linearbeschleuniger bestrahlt. Vergleich der Apoptosen bei Hautzellen Es wurden Hautzellen einmal ohne Iod und einmal mit 150 µg Iod/ml im Linearbeschleuniger bestrahlt und mit Hilfe des ELISA die Apoptose jeweils bestimmt. 38 Ergebnisse Vergleich der Apoptose bei Zellen ohne Iod Abbildung 16: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Apoptose von HaCaT-Zellen, ohne Iod, in Abhängigkeit von der jeweiligen Strahlendosis. Vergleich der Apoptose bei Zellen mit 150 µg Iod/ml Abbildung 17: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Apoptose von HaCaT-Zellen, mit 150 µg Iod, in Abhängigkeit von der jeweiligen Strahlendosis. 39 Ergebnisse Vergleich der Nekrose bei Hautzellen Jeweils parallel zu den Apoptosen wurden auch die Nekrosen bestimmt. Vergleich der Nekrose bei Zellen ohne Iod Abbildung 18: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Nekrose von HaCaT-Zellen, ohne Iod, in Abhängigkeit von der jeweiligen Strahlendosis. Vergleich der Nekrose bei Zellen mit 150 µg Iod/ml Abbildung 19: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Nekrose von HaCaT-Zellen, mit 150 µg Iod, in Abhängigkeit von der jeweiligen Strahlendosis. 40 Ergebnisse Auswertung der Bestrahlung von HaCaT-Zellen im Linearbeschleuniger Bei den bestrahlten HaCaT-Zellen wurde ein gleiches Vorgehen wie bei den FRTL5-Zellen gewählt. Die Ergebnisse zeigen bei den Apoptosen der HaCaT-Zellen folgendes: Abbildung 20: Apoptose HaCaT-Zellen, mit unterschiedlichen Iodkonzentrationen, welche mit den angegebenen Strahlendosen bestrahlt wurden. Die Auswertung der Apoptose sowohl bei den Zellen ohne Iod als auch bei den Zellen mit 150 µg Iod/ml ergibt, dass es einen fast gleichen Verlauf der Apoptose in Abhängigkeit von der Bestrahlungsdosis gibt. Bei beiden Versuchen steigt der Anreicherungsfaktor der Apoptose bis zu einer Strahlendosis von 25 Gy linear zur Dosis an. Ab 25 Gy sieht man, dass der Anreicherungsfaktor der Apoptose bei ca. 10 konstant bleibt. 41 Ergebnisse Bei den HaCaT-Zellen zeigt sich folgendes Bild für die Nekrosen: Abbildung 21: Nekrose HaCaT-Zellen, mit unterschiedlichen Iodkonzentrationen, welche mit den angegebenen Strahlendosen bestrahlt wurden. Bei den bestrahlten Hautzellen erkennt man, dass der Anreicherungsfaktor der Nekrosen fast bei 0 liegt. Es werden nur minimal höhere Werte gemessen. Dies ist sowohl bei den Zellen ohne Iod, als auch bei den Zellen mit 150 µg Iod/ml zu erkennen. 42 Ergebnisse Bestrahlung der FRTL-5- Zellen mit radioaktivem Iod ([131I]) Vergleich der Apoptose bei FRTL-5-Zellen Da in dieser Arbeit bisher ausschließlich auf die externe Bestrahlung mittels Linearbeschleuniger eingegangen wurde, wurden zum Vergleich mit der internen Bestrahlung jeweils Schilddrüsen- und Hautzellen noch einmal mit radioaktivem Iod versetzt, wie es auch in der Radioiodtherapie zum Einsatz kommt. Die Zellen wurden jeweils einmal mit und einmal ohne Iod verwendet. Abbildung 22: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Apoptose von FRTL-5-Zellen, welche ohne Iod inkubiert und anschließend mit [131I] versetzt wurden. Abbildung 23: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Apoptose von FRTL-5-Zellen, welche mit 150 µg Iod/ml inkubiert und anschließend mit [131I] versetzt wurden. 43 Ergebnisse Vergleich der Nekrose bei FRTL-5-Zellen Analog zu den restlichen Versuchen wurde auch bei den mit radioaktivem Iod bestrahlten Zellen die Nekrose mitbestimmt. Abbildung 24: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Nekrose von FRTL-5-Zellen, welche ohne Iod inkubiert und anschließend mit [131I] versetzt wurden. Abbildung 25: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Nekrose von FRTL-5-Zellen, welche mit 150 µg Iod/ml inkubiert und anschließend mit [131I] versetzt wurden. 44 Ergebnisse Auswertung der Bestrahlung von FRTL-5-Zellen mit radioaktivem Iod Zum Vergleich der bei der externen Bestrahlung erhaltenen Anreicherungsfaktoren wurden die Zellen in einem Vergleichsversuch mit radioaktivem Iod ([131I]) bestrahlt. Dabei wurden einmal Zellen ohne Iod und einmal Zellen mit 150 µg Iod/ml inkubiert und anschließend für 24 Stunden mit radioaktivem Iod versetzt. Danach fand eine ELISA- Auswertung statt. Abbildung 26: Apoptose von FRTL-5-Zellen, welche mit verschiedenen Iodkonzentrationen inkubiert und anschließend mit [131I] versetzt wurden. Im Trend erkennt man, dass sowohl bei den Zellen mit 150 µg Iod/ml als auch bei den Zellen ohne Iod der Anreicherungsfaktor der Apoptose mit steigender Bestrahlungsdosis des [131I] ansteigt. Hierbei zeigt sich in beiden Versuchen ein annähernd linearer Verlauf. Abbildung 27: Nekrose von FRTL-5-Zellen, welche mit verschiedenen Iodkonzentrationen inkubiert und anschließend mit [131I] versetzt wurden. 45 Ergebnisse Sowohl bei den Zellen ohne Iod als auch bei den Zellen mit 150 µg Iod/ml erkennt man keine Anreicherung unabhängig von der Bestrahlungsdosis. 46 Ergebnisse Bestrahlung der HaCaT- Zellen mit radioaktivem Iod ([131I]) Vergleich der Apoptose bei HaCaT-Zellen ohne Iod Auch HaCaT-Zellen wurden mit radioaktivem Iod ([131I]) bestrahlt, um einen Vergleich zu haben, ob die beobachteten Apoptose- und Nekrose- Anreicherungsfaktoren spezifisch für die FRTL-5-Zellen zu sein scheint oder ob es ein genereller Effekt des radioaktiven Iods ist. Abbildung 28: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Apoptose von HaCaT-Zellen, welche ohne Iod inkubiert und anschließend mit [131I] versetzt wurden. Abbildung 29: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Apoptose von HaCaT-Zellen, welche mit 150 µg Iod/ml inkubiert und anschließend mit [131I] versetzt wurden. 47 Ergebnisse Vergleich der Nekrose bei HaCaT-Zellen Parallel wurde auch hier jeweils die Nekrose mitbestimmt. Abbildung 30: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Nekrose von HaCaT-Zellen, welche ohne Iod inkubiert und anschließend mit [131I] versetzt wurden. Abbildung 31: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Nekrose von HaCaT-Zellen, welche mit 150 µg Iod/ml inkubiert und anschließend mit [131I] versetzt wurden. 48 Ergebnisse Auswertung der Bestrahlung von HaCaT-Zellen mit radioaktivem Iod Auch HaCaT-Zellen wurden mit radioaktivem Iod bestrahlt, nachdem sie zuvor inkubiert waren. Dabei wurde eine Gruppe ohne Iod und eine Gruppe mit 150 µg Iod/ml inkubiert. Abbildung 32: Apoptose von HaCaT-Zellen, welche mit verschiedenen Iodkonzentrationen inkubiert und anschließend mit [131I] versetzt wurden. Zu erkennen ist, dass sowohl bei den Zellen mit Iod als auch bei den Zellen ohne Iod bis zu einer Dosis von 10 MBq/ml fast kein Anstieg des Anreicherungsfaktors der Apoptose feststellbar ist. Ab einer Strahlendosis von 50 MBq/ml erkennt man einen plötzlichen leichten Anstieg. Abbildung 33: Nekrose von HaCaT-Zellen, welche mit verschiedenen Iodkonzentrationen inkubiert und anschließend mit [131I] versetzt wurden. Bei beiden Versuchen ist zu sehen, dass der Anreicherungsfaktor unabhängig von der Bestrahlungsdosis bei ca. 1 liegt. Ein minimaler Anstieg deutet sich bei 50 MBq/ml an. 49 Ergebnisse Ergebnisauswertung Camptothecin-Test Bei den durchgeführten Versuchen kann man erkennen, dass die FRTL-5-Zellen unabhängig von der Iodmenge in der Lage sind, in Apoptose zu gehen. Dabei steigt die Apoptoserate mit steigender Camptothecin-Zugabe. Die erreichten Apoptosewerte sind bei den Zellen mit Iod nur unwesentlich kleiner als bei den Zellen ohne Iod. Apoptose der Negativkontrollen Um die physiologischen Apoptosewerte nicht mit in die Versuchsergebnisse einzubinden, wurde jeweils eine Negativkontrolle durchgeführt. Diese Negativkontrolle wurde parallel zu den Versuchszellen inkubiert und mit der gleichen Menge Iod versorgt. Statt die Zellen im Linearbeschleuniger zu bestrahlen wurden die Zellen bis zur Auswertung im Wärmeschrank belassen. Bei der Auswertung wurden die Negativkontrollen mit den gleichen Test-Kits ausgewertet wie die bestrahlten Zellen. Bei der Auswertung kann man erkennen, dass auch bei den Negativkontrollen immer eine Apoptose vorliegt, welche ständig abläuft um geschädigte Zellen auszusortieren. Interessanterweise erkennt man, dass bei höheren Iodkonzentrationen eine geringere Apoptose zu verzeichnen ist. Es lässt sich die Vermutung äußern, dass die Zellen durch einen Iodmangel empfänglicher für Schäden sind und dass aus diesem Grund eine höhere Apoptose zu verzeichnen ist. Es könnte auch durchaus möglich sein, dass die Zellen durch eine hohe Iodkonzentration einen gewissen Schutz vor schädigenden Einflüssen haben und aus diesem Grund weniger in Apoptose gehen müssen. In den weiteren Versuchen wird nun, um keine Ergebnisverfälschung durch die physiologische Apoptose zu haben, die Absorptionsrate der Negativkontrolle des jeweiligen Versuches in Bezug gesetzt. Damit erhalten wir in den Versuchen jeweils nur eine Aussage über die durch den Versuchsaufbau ausgelöste Apoptose. 50 Ergebnisse Apoptosen der FRTL-5-Zellen Bei allen Bestrahlungen erkennt man, dass eine Strahlendosis bis 25 Gy fast keinen Einfluss auf die Apoptose zu haben scheint. Die Apoptosewerte bewegen sich leicht oberhalb der physiologischen Apoptosewerte jedoch mit Werten bis 1 nicht wirklich im aussagekräftigen Bereich. Ab 25 Gy ist in den durchgeführten Versuchen ein deutlicher Anstieg der Apoptose zu verzeichnen. Der Anstieg der Apoptose ist jedoch bei den verschiedenen Iodmengen unterschiedlich. Mit je weniger Iod die Zellen inkubiert waren, desto steiler steigt die Apoptose bei steigender Bestrahlungsdosis an. Bei den Zellen mit Iod erkennt man bis einschließlich 400 Gy eine Zunahme der Apoptose. Die ohne Iod inkubierten Zellen zeigen ab 200 Gy nur noch eine minimale Steigerung der Apoptose. Möglicherweise wird hier eine maximale Sättigung erreicht, so dass die Zellen keine Möglichkeit mehr haben, ihre Apoptose weiter zu steigern. Doch nicht nur der Anstieg der Apoptose scheint von der Iodmenge abhängig, auch die maximal erreichte Apoptose bei 400 Gy ist wahrscheinlich Iodmengen-abhängig oder wird durch die Iodmenge zumindest mit beeinflusst. Es scheint einen exponentiellen Zusammenhang zwischen Iodmenge und Apoptose zu geben. Je höher die Iodmenge, desto niedriger ist die Apoptose bei 400 Gy. Eine mögliche Erklärung ist, dass die Zellen durch die höhere Iodmenge vor der zugeführten Bestrahlung besser geschützt sind und weniger geschädigt werden, so dass keine Apoptose ausgelöst werden muss. Eine andere Erklärung könnte sein, dass die Zellen ein höheres Regenerationspotential besitzen und auch bei einer höheren Bestrahlungsdosis noch eine erfolgreiche Reparatur des zugefügten Schadens durchführen können. Zusammenfassend kann man aus den gewonnenen Versuchsergebnissen schließen, dass es einen Zusammenhang zwischen Iodmenge und Apoptose gibt. Bis zu einer Bestrahlungsdosis von 25 Gy haben die Zellen genug Regenerationspotential und werden nicht irreparabel geschädigt, die Apoptose steigt nur minimal an. Ab 25 Gy steigt die Apoptose deutlich an. Je höher die vorher zugeführte Iodmenge, desto weniger strahlensensibel reagieren die Zellen auf die Bestrahlung. 51 Ergebnisse Nekrosen der Negativkontrolle Parallel zu den Apoptosen wurden jeweils die Nekrosen mitbestimmt um herauszufinden, ob es einen direkten Strahlenschaden gibt, so dass die Zellen sofort zugrunde gehen. Zusätzlich sollte geprüft werden, ob dieser direkte Strahlenschaden abhängig ist von der zugeführten Iodmenge und/oder der applizierten Strahlendosis. Zu Beginn wurden, um die Nekrosen vergleichbar machen zu können, die Negativkontrollen bestimmt. Für die Auswertung der Versuche wurden die Zellen aus dem Wärmeschrank genommen. Anschließend wurden sie für den Versuch aufbereitet. Hierbei wurden die Zellen, welche die Nekrose zeigen sollten, ca. 1 Stunde vor den Zellen für die Apoptose auf die Mikrotiterplatte aufgebracht. Anschließend sollten, laut Anleitung im Test-Kit, die Zellen im Kühlschrank aufbewahrt werden. Möglicherweise wurden die Zellen hier, durch Kälte oder die schnelle Temperaturschwankung geschädigt, so dass sie hierbei in Nekrose gingen. Nicht außer Acht lassen sollte man, dass die Zellen möglicherweise auch durch physiologische Umstände geschädigt werden könnten. Dabei sind sowohl Verunreinigungen im Nährmedium, Einflüsse aus der Luft oder aus der Umgebung im Wärmeschrank zu beachten. Bei der Auswertung der bestrahlten Zellen wurde die jeweilige Nekrose der Negativkontrolle aus dem Ergebnis herausgerechnet unter der Annahme, dass diese Nekrose durch die Inkubationsbedingungen oder durch andere Einflüsse bedingt seien. 52 Ergebnisse Nekrosen der FRTL-5-Zellen Da in allen Versuchen Zellen in Nekrose gehen, kann auf einen starken Strahlenschaden mit direkter Zellzerstörung geschlossen werden. Im Trend kann man erkennen, dass die Nekrose mit steigender Bestrahlungsdosis zunimmt. Zusätzlich kann man ausmachen, dass die Nekrose mit steigender Iodmenge im Trend sinkt. Durch recht große Streuungen in einzelnen Versuchen und nicht einheitlichen Ergebnissen ist die Aussagefähigkeit leicht eingeschränkt. 53 Ergebnisse Apoptosen der HaCaT-Zellen Es wurden zwei Versuche durchgeführt, in denen HaCaT-Zellen im Linearbeschleuniger bestrahlt wurden. Einmal wurden die Zellen ohne Iod inkubiert, einmal mit 150 µg Iod/ml. HaCaT-Zellen besitzen keinen Rezeptor für Iod, so dass sich das Iod in freier Form im Medium um die Zellen herum befindet. Theoretisch dürfte das Iod keinen Einfluss auf die Apoptose der HaCaT-Zellen haben. Aus diesem Grund sollte bei den Bestrahlungen eine annähernd gleiche Apoptose herauskommen. In den Versuchen konnte gezeigt werden, dass bei beiden Versuchen die Apoptose mit steigender Bestrahlungsdosis ansteigt. Gleichzeitig erkennt man, dass beide Versuchsreihen auch annähernd die gleichen Apoptosen aufweisen. Dieses Ergebnis spricht dafür, dass die Apoptose nicht durch die Anwesenheit von Iod beeinflusst wird. Die Apoptose kommt allein durch die zugefügte Bestrahlungsdosis zustande. Übertragen auf die Schilddrüsenzellen kann man schließen, dass auch hier das Iod selbst keinen zytotoxischen Effekt hat. Nekrosen der HaCaT-Zellen Auch scheint es keinen Einfluss von Iod auf die Nekrose der Zellen nach Bestrahlung zu geben. In beiden Versuchen lässt sich ein fast identischer Kurvenverlauf darstellen, der anzeigt, dass die Nekrose weder durch die Iodmenge noch durch eine höhere Bestrahlungsdosis ansteigt. 54 Ergebnisse Bestrahlung der FRTL-5-Zellen mit radioaktivem Iod Um vergleichen zu können, ob die Zellen auf interne Bestrahlung genauso reagieren wie auf externe Bestrahlung wurden FRTL-5-Zellen nach der Inkubationszeit für 24 Stunden mit radioaktivem Iod versetzt. Für die Apoptose zeigt sich ein linearer Verlauf, der erkennen lässt, dass die Apoptose mit steigender Bestrahlungsdosis ansteigt. Gleichzeitig wird sichtbar, dass die Zellen mit Iod seltener in Apoptose gehen als die Zellen ohne Iod. Analog zu der externen Bestrahlung scheint auch hier ein protektiver Effekt seitens des Iods auf die FRTL-5-Zellen eingetreten zu sein. Für die Nekrose lässt sich kein Zusammenhang zwischen Iodmenge und/oder Bestrahlungsdosis mit radioaktivem Iod zeigen. 55 Ergebnisse Bestrahlung der HaCaT-Zellen mit radioaktivem Iod Auch hier wurde ein Vergleich zwischen FRTL-5-Zellen und HaCaT-Zellen durchgeführt, indem auch HaCaT-Zellen mit radioaktivem Iod versetzt wurden. Bei der Auswertung des ELISA 24 Stunden nach Zugabe von radioaktivem Iod zeigt sich, dass die Apoptose mit steigender Bestrahlungsdosis ansteigt. Es gibt keinen deutlichen Unterschied zwischen den Zellen mit und ohne Iod. Da in allen Versuchen Zellen in Nekrose gehen, kann auf einen starken Strahlenschaden mit direkter Zellzerstörung geschlossen werden. Bei der Nekrose ist in beiden Durchführungen zu erkennen, dass die Nekrose gleich niedrig liegt, unabhängig von einer höheren Bestrahlungsdosis. Ein möglicher Effekt des Iods ist nicht auszumachen. 56 Diskussion Diskussion Die zu Beginn formulierten Fragen, sollen im Folgenden diskutiert werden: I. Welchen Einfluss hat nicht-radioaktives Iod allgemein auf Schilddrüsenzellen? II. Reagieren Schilddrüsenzellen in Abhängigkeit von ihrer Iodversorgung unterschiedlich auf ionisierende Strahlung? III. Gibt es hierbei einen Unterschied zwischen externer Bestrahlung und Bestrahlung mit radioaktivem Iod? IV. Gehen die Zellen durch Bestrahlung eher in Apoptose oder in Nekrose? I. Welchen Einfluss hat nicht-radioaktives Iod allgemein auf Schilddrüsenzellen? Die Schilddrüse ist einer der wichtigsten Regulatoren im menschlichen Körper. Über ihre Hormone T3 und T4, welche die Schilddrüse selber herstellt, reguliert die Schilddrüse unter anderem Wachstum und Entwicklung beim Kind, den Energiehaushalt des Menschen, ist mitverantwortlich für die Temperaturregulation, organisiert den Eiweiß-, Fett- und Kohlenhydratstoffwechsel mit, sie hat Einfluss auf die körperliche und geistige Leistungsfähigkeit und auch Herz- und Kreislauffunktion werden von ihr mit beeinflusst. Für die Herstellung der wichtigen Schilddrüsenhormone T3 und T4 benötigt die Schilddrüse essentiell Iod, welches oral aufgenommen, im Darm resorbiert wird und damit ins Blutsystem gelangt. Anschließend nimmt die Schilddrüse das Iod über NIS auf und beginnt mit dem Umbau der Iodatome. Die Schilddrüse hat, um ausreichend Schilddrüsenhormone herzustellen, einen täglichen Iodbedarf von ca. 200 µg (41). In Deutschland leidet ein Großteil der Menschen an einer Iodmangelversorgung. Die Schilddrüse hat zu wenig Iod zur Verfügung um ausreichend Schilddrüsenhormone herzustellen. Diesen Mangel versucht sie zu kompensieren indem sie selber größer wird und sich zu einer Struma entwickelt. Zur Vorbeugung einer Struma ist es in Deutschland üblich, dass dem Speisesalz Iod zugesetzt wird, um so eine ausreichende Iodversorgung der Bevölkerung sicherzustellen. In den letzten Jahren hat man festgestellt, dass Iod nicht nur einen Einfluss auf die Funktion der Schilddrüse hat, sondern auch eine Wirkung auf die Schilddrüsenzellen selber hat. Sowohl in vivo (26;49), als auch in vitro (18) konnte man zeigen, dass Iod einen inhibierenden Effekt auf Schilddrüsenzellen bzw. FRTL-5-Zellen hat. In niedrigen Dosen konnte an Schweinefollikeln ein wachstumsfördernder Effekt gezeigt werden, 57 Diskussion der bei höheren Ioddosen in einen proliferationshemmenden Effekt umschlägt (10;17). In der Klinik konnte festgestellt werden, dass ein Iodmangel zu einem Schilddrüsenstruma führt, indem über eine mangelnde T3 und T4-Ausschüttung eine erhöhte TSH-Produktion ausgelöst wird. Bei gleichzeitiger TSH-Überproduktion und Iod-Mangel beginnt eine Schilddrüsenzellenhyperplasie und -hypertrophie. Die Behandlung eines Schilddrüsenstrumas wird in Deutschland primär mit einer Iodgabe begonnen. Dabei kommt es durch iod-induzierte Apoptose zu einer Abnahme der Struma. Dieser Effekt konnte in verschiedenen Untersuchungen nachgewiesen werden (48;50). Zur Auslösung der Apoptose sind in Einzelzellkulturen recht hohe Ioddosen erforderlich (18;50). In den hier durchgeführten Versuchen sollte die Apoptose nach Bestrahlung der Schilddrüse untersucht werden. Da, wie von Golstein und Dumont gezeigt, schon das Iod alleine eine Apoptose induzieren kann, wurde parallel zu jeder Bestrahlung eine Negativprobe gemacht, damit die physiologische Apoptose, welche unter anderem durch Iod ausgelöst wird, zu den Werten der bestrahlten Zellen in Bezug gesetzt werden kann. Bei allen Negativkontrollen konnte eine Absorptionsrate und damit eine Apoptose nachgewiesen werden. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass bei den hier verwendeten Iodmengen bis zu einer Menge von 150 µg Iod/ml keine erhöhte Apoptose durch das Iod alleine provoziert werden konnte. Im Gegenteil konnte festgestellt werden, dass die Zellen ohne Iod eine deutlich höhere Apoptose zeigten, als die mit Iod versetzen Zellen. Dabei sank die Apoptose mit steigender Iodmenge. Da stets Einzelzellkulturen verwendet wurden, ist davon auszugehen, dass bei einer weiteren Steigerung der Iodkonzentration der von Goldstein und Dumont beobachtete iod-induzierte Apoptoseeffekt auch hätte beobachtet werden können. Erwartet hätte man, dass Iod Apoptose induziert. Schon bei den Negativkontrollen konnte gesehen werden, dass dieser Effekt für die Iodmengen, die in diesen Versuchsreihen gegeben wurden, nicht zu beobachten ist. Im Gegenteil ist eine Apoptose-Abnahme bei höheren Ioddosen zu erkennen. Die Ergebnisse der Bestrahlungen geben nun sogar Anlass zu der Vermutung, dass Iod in den verabreichten Dosen sogar einen schützenden Effekt auf die Schilddrüsenzelle hat, so dass diese weniger in Apoptose gehen. Auch ein reparationssteigender Effekt könnte durch Iod ausgelöst sein, so dass die Zellen mehr Potential haben, ihre Bestrahlungsschäden selbst zu reparieren. Es liegt die Vermutung nahe, dass sich hier ein Dosis-abhängiger Iodeffekt zeigt: Bis zu einer gewissen Ioddosis zeigt sich bei steigender Iodmenge ein protektiven 58 Diskussion Effekt auf die Schilddrüsenzellen, so dass diese vor Bestrahlungsschäden geschützt werden. Ab einer bestimmten Iodmenge schlägt dieser Effekt um in einen Apoptoseinduzierenden Effekt, der dann die Schilddrüsenzellen nicht mehr schützen kann. Um dieser Vermutung weiter nachzugehen, müsste man in den hier durchgeführten Versuchen die Iodmenge weiter steigern und erneut Apoptosen bestimmen, da bisher nur der protektiven Effekt nicht aber der Apoptose-induzierende Effekt gesehen werden konnte. Ein solcher dosis-abhängiger Iodeffekt konnte ebenfalls bei der Wachstumsrate gesehen werden: Niedrige Ioddosen zeigen einen wachstumsfördernder Effekt, höheren Ioddosen hingegen einen proliferationshemmenden Effekt (10;17). Möglicherweise gibt es einen Zusammenhang zwischen dem Einfluss auf die Wachstumsrate und der Apoptose: Bei niedrigeren Iodmengen wird die Zelle so stimuliert, dass sie eine größere Wachstumsrate zeigt und dementsprechend wird sie vor Apoptose geschützt, um nicht gleich wieder zugrunde zu gehen. Ab einer zu hohen Iodmenge fungiert Iod als Apoptosetrigger und hemmt das Wachstum der Zelle. Vitale et al konnten anhand von Osteosarkomazellen und Fibroblasten zeigen, dass Iod keinen generell apoptotischen Effekt hervorruft, sondern nur spezifisch bei Schilddrüsenzellen. Ähnliches konnte in den durchgeführten Versuchsreihen beobachtet werden. Es wurden zur Kontrolle jeweils HaCaT-Zellen mit Iod versetzt, inkubiert und bei den nicht bestrahlten Zellen die Apoptose bestimmt. Die HaCaT-Zellen zeigten unabhängig von der zugeführten Iodmenge fast die gleichen Apoptosen. Aus diesem Grund ist davon auszugehen, dass das Iod keinen Effekt auf die Zellen ausgeübt hat, der dazu führte, dass die Zellen vermehrt in Apoptose gehen. 59 Diskussion II. Reagieren FRTL-5-Zellen in Abhängigkeit von ihrer Iodversorgung unterschiedlich auf ionisierende Strahlung? Die Arbeitsgruppe von Stiblar-Martincic fand im Jahr 1998 heraus, dass FRTL-5Zellen, welche bis zu einer Strahlendosis von 16 Gy bestrahlt wurden, in der Lage sind ihre Strahlenschäden selbstständig zu reparieren. Ab 24 Gy konnte ein irreversibler Strahlenschaden festgestellt werden. Stiblar-Martincic et al untersuchten die Zellen in einem Zeitrahmen von 7-21 Tagen nach der Bestrahlung. Sie legten Wert auf die Morphometrie der Zellen nach der Bestrahlung (46). Die Feststellung von Stiblar-Martincic trifft in gleicher Weise auch auf die Ergebnisse der hier durchgeführten Bestrahlungen zu. In durchgehend allen Versuchen konnte bei Bestrahlungsdosen bis ca. 25 Gy beobachtet werden, dass die Apoptose nur wenig ansteigt. Da die Ergebnisauswertung jeweils 24 Stunden nach Versuchsdurchführung stattfand, liegt die Vermutung nahe, dass die Zeit ausgereicht hat, um erste Reparationsmechanismen in Gang zu setzen, so dass nur wenige Zellen in Apoptose bzw. Nekrose gehen konnten. Ab Werten über 25 Gy wurde überwiegend ein deutlicher Anstieg in der Apoptose und Nekrose sichtbar, so dass dies ein möglicher Hinweis auf irreperable Schäden sein kann. Diese Beobachtung konnte sowohl bei den Zellen ohne Iod als auch bei denen mit Iod gemacht werden. Diese Beobachtung könnte darauf schließen lassen, dass die natürlichen Reperationsmechanismen durch Iod nicht wesentlich beeinflusst werden. Man konnte feststellen, dass es mit steigender Iodmenge zu deutlich weniger Apoptose kommt. Dementsprechend wurde bei gleicher Bestrahlungsdosis bei den Zellen ohne Iod eine deutlich höhere Apoptose ausgelöst, als bei den mit Iod vorbehandelten und bestrahlten Zellen. Dieses Ergebnis bedeutet, dass Iod einen Einfluss auf die Strahlensensibilität der FRTL-5-Zellen hat, die Zellen reagieren anders auf die Bestrahlung. Die besser mit Iod versorgten Zellen zeigten durchweg eine geringe Strahlensensibilität, da sie auch über einen breiten Dosisbereich deutlich weniger in Apoptose und Nekrose gegangen sind. Möglicherweise schützt Iod, in den hier verabreichten Mengen bis 150 µg/ml, die Zellen vor der Reparationsmechanismen. 60 Bestrahlung und/oder fördert Diskussion III. Gibt es hierbei einen Unterschied zwischen externer Bestrahlung und Bestrahlung mit radioaktivem Iod? Auch bei den mit [131I] bestrahlten Zellen zeigte sich ein ähnliches Bild. Die mit 150 µg Iod/ml versorgten Zellen gingen deutlich weniger in Apoptose als die Zellen, welche ohne Iod vorbehandelt waren. Dieser Effekt ist in der Radioiodtherapie schon länger bekannt. Bei der Radioiodtherapie konnte man gehäuft feststellen, dass Menschen, die an einem Iodmangel leiden, mit einer niedrigeren Strahlendosis behandelt werden können als Menschen, die eine gut mit Iod versorgte Schilddrüse haben (33). Auch dies lässt auf einen protektiven Effekt des Iodes schließen. Damit liegt die Vermutung nahe, dass Iod die Zelle so gut schützt, dass sie sowohl einen Beta- und Gammastrahler, wie es das radioaktive Iod ist, als auch hochenergetische Photonenstrahlen aus dem Linearbeschleuniger weniger geschädigt überstehen kann. 61 Diskussion IV. Gehen die Zellen durch Bestrahlung eher in Apoptose oder in Nekrose? Ähnlich wie für die Apoptose zeigte sich für die Nekrose, dass mit steigender Iodversorgung die Zellen nach externer Bestrahlung weniger in Nekrose gehen. Die Nekrosen waren im Durchschnitt ähnlich hoch wie die Apoptosen. Jedoch muss man betrachten, dass die Nekrosewerte deutlich stärker streuen als die Apoptosewerte. Zusätzlich zeigen sich bei mehreren Bestrahlungen mit der gleichen Iodmenge keine einheitlichen Ergebnisse. Es lässt sich zwar ein Trend ausmachen, jedoch ist eine definitive Aussage darüber, ob die Nekrose höher liegt als die Apoptose, nicht möglich. Marx et al konnten zeigen, dass bei niedrigen Dosen an radioaktivem Iod die Zellen hauptsächlich in Apoptose übergehen, während sie bei höheren Bestrahlungsdosen vermehrt in Nekrose gehen (27). In den durchgeführten Bestrahlungen mit [131I] konnte hier gesehen werden, dass die Apoptose mit steigender [131I]-Zugabe ansteigt. Die Nekrose zeigt sich jedoch unabhängig von der zugesetzten Menge an radioaktivem Iod. Diese Beobachtung lässt sich aus diesem Grund teilweise mit Marx übereinbringen: Bis zu einer Bestrahlungsdosis von 50 MBq/ml kann man in den durchgeführten Versuchen hauptsächlich Apoptose und kaum Nekrose sehen. Möglicherweise steigt bei einer höheren Bestrahlungsdosis die Nekrose noch mehr an, so dass diese dann höher liegt als die Apoptose. Auch der Zeitfaktor könnte das unterschiedliche Ergebnis erklären: Marx untersuchte die Zellen 2 Tage nach Applikation des radioaktivem Iod. Hier wurden die Zellen bereits nach 24 Stunden untersucht. Eine mögliche Erklärung wäre, dass die Zellen noch im Prozess der Apoptose- und Nekroseeinleitung waren und deshalb der ELISA nicht die kompletten Raten detektieren konnte. So lässt sich keine Antwort auf die Frage, ob die Zellen bei höherer Bestrahlungsdosis mehr in Apoptose oder Nekrose gehen, geben. 62 Diskussion Ausblick Die Ergebnisse der durchgeführten Untersuchungen zeigen verschiedene Aspekte: - FRTL-5-Zellen werden bis zu einer Iodmenge von 150 µg/ml geschützt und gehen weniger in Apoptose - Dieser Effekt lässt sich bei HaCaT-Zellen nicht hervorrufen, so dass von einem FRTL-5-spezifischen Effekt auszugehen ist - Iod schützt FRTL-5-Zellen auch vor Bestrahlung, so dass bis zu einer Strahlendosis von 400 Gy Zellen mit Iod deutlich weniger in Apoptose gehen, als Zellen ohne Iod oder mit weniger Iod - Dieser Effekt lässt sich auch bei radioaktivem Iod erkennen - Es lässt sich keine genaue Aussage über die Nekrosen machen, da diese stark streuen und in mehreren Versuchen keine einheitlichen Ergebnisse erzielt werden konnten In weiterführenden Versuchen wäre es ratsam die Iodmenge noch weiter zu steigern, da in der Literatur Hinweise darauf zu finden sind, dass Iod in hohen Dosierungen einen gegenteiligen Effekt auf FRTL-5-Zellen hat. Möglicherweise findet sich bei höheren Ioddosen ein Apoptose-steigernder Effekt auch unter Bestrahlung. Zudem wäre es sinnvoll, die Nekrose mit einem weiteren Auswertungsverfahren erneut auszuwerten. Es wäre möglich, dass die Versuchsdurchführung des ELISA zu den streuenden und nicht wiederholbaren Ergebnissen in der Nekrose führte und mit einem anderen Untersuchungsverfahren einheitlichere Ergebnisse zu erreichen wären. 63 Zusammenfassung Zusammenfassung Die Schilddrüse ist ein Organ, dessen Zellen eine geringe Strahlensensibilität zeigen, ebenso wie die Zellen von Herz, Hornhaut, Dickdarm, Magen, Blutgefäßen und Speiseröhre. Im Gegensatz dazu zeigen zum Beispiel Embryonen und Feten, Gonaden, das lymphatische System und Dünndarmepithel eine besonders hohe Strahlensensibilität. Trotz der nicht so hohen Strahlensensibilität ist die Bestrahlung der Schilddrüse ein sehr effektives Therapieverfahren bei Schilddrüsenerkrankungen. Sowohl eine interne Bestrahlung als auch eine externe Bestrahlung ist bei der Schilddrüse durchführbar. Dass Iod einen Einfluss auf Schilddrüsenzellen hat, konnte sowohl in vitro als auch in vivo schon festgestellt werden (2, 10, 18, 26, 49, 50). Bei der Radioiodtherapie zeigte sich beispielsweise, dass Patienten, deren Schilddrüse gut mit Iod versorgt ist, eine höhere Strahlendosis zu Therapiezwecken benötigen als Patienten, die an einem Iodmangel leiden (33). In der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe eines ELISA FRTL-5 Zellen auf Apoptose und Nekrose hin untersucht, nachdem sie zuvor intern oder extern bestrahlt wurden. Festgestellt werden konnte, dass FRTL-5-Zellen durch Iod geschützt werden und weniger in Apoptose und Nekrose übergehen. Dieser Effekt lässt sich bei HaCaT-Zellen nicht hervorrufen, so dass von einem FRTL-5-spezifischen Effekt auszugehen ist. Iod schützt FRTL-5-Zellen auch vor Bestrahlung, so dass Zellen mit Iod deutlich weniger in Apoptose gehen, als Zellen ohne Iod. Dieser Effekt lässt sich sowohl bei Bestrahlung durch einen Linearbeschleuniger als auch bei radioaktivem Iod erkennen. Etwas schwieriger gestaltet sich die Aussage zur Nekrose, da hier keine reproduzierbaren Ergebnisse erzielt werden konnten, die gegebenenfalls mit anderen Untersuchungstechniken als dem ELISA besser erreicht werden können. 64 Literaturverzeichnis Literaturverzeichnis (1) Acharya S, Sarafoglou K, LaQuaglia M, Lindsley S, Gerald W, Wollner N, et al. Thyroid neoplasms after therapeutic radiation for malignancies during childhood or adolescence. Cancer 2003 May 15;97(10):2397-403. (2) Becks GP, Eggo MC, Burrow GN. Organic iodine inhibits deoxyribonucleic acid synthesis and growth in FRTL-5 thyroid cells. Endocrinology 1988 Jul;123(1):545-51. (3) Bell E, Grünwald F. Radiojodtherapie bei Schildrüsenerkrankungen. Springer-Verlag 1999. 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Endocrinology 1949;45(5):504-13. 68 Abbildungsverzeichnis Anhang: Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Mikrotiterplatte .......................................................................... 26 Abbildung 2: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Apoptose von FRTL-5-Zellen, welche ohne Iod inkubiert wurden und anschließend mit Camptothecin in vier verschiedenen Konzentrationen versetzt wurden. ........................................................................................................... 29 Abbildung 3: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Apoptose von FRTL-5-Zellen, welche mit 10 µg Iod/ml Iod inkubiert wurden und anschließend mit Camptothecin in vier verschiedenen Konzentrationen versetzt wurden. .............................................................................................. 29 Abbildung 4: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Apoptose von FRTL-5-Zellen mit den angegebenen Mengen an Iod. ........ 30 Abbildung 5: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Apoptose von FRTL-5-Zellen, ohne Iod, in Abhängigkeit von der jeweiligen Strahlendosis................................................................................................... 31 Abbildung 6: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Apoptose von FRTL-5-Zellen, mit 10 µg Iod, in Abhängigkeit von der jeweiligen Strahlendosis. ................................................................................. 31 Abbildung 7: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Apoptose von FRTL-5-Zellen, mit 50 µg Iod, in Abhängigkeit von der jeweiligen Strahlendosis. ................................................................................. 32 Abbildung 8: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Apoptose von FRTL-5-Zellen, mit 150 µg Iod, in Abhängigkeit von der jeweiligen Strahlendosis. ................................................................................. 32 Abbildung 9: Apoptose FRTL-5-Zellen, mit unterschiedlichen Iodkonzentrationen, welche mit den angegebenen Strahlendosen exponiert wurden. ........................................................................................................... 33 Abbildung 10: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Nekrose von FRTL-5-Zellen mit den angegebenen Mengen an Iod. .......... 34 Abbildung 11: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Nekrose von FRTL-5-Zellen, ohne Iod, in Abhängigkeit von der jeweiligen Strahlendosis................................................................................................... 35 Abbildung 12: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Nekrose von FRTL-5-Zellen, mit 10 µg Iod, in Abhängigkeit von der jeweiligen Strahlendosis. ................................................................................. 35 Abbildung 13: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Nekrose von FRTL-5-Zellen, mit 50 µg Iod, in Abhängigkeit von der jeweiligen Strahlendosis. ................................................................................. 36 Abbildung 14: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Nekrose von FRTL-5-Zellen, mit 150 µg Iod, in Abhängigkeit von der jeweiligen Strahlendosis. ................................................................................. 36 69 Abbildungsverzeichnis Abbildung 15: Nekrose FRTL-5-Zellen, mit unterschiedlichen Iodkonzentrationen, welche mit den angegebenen Strahlendosen bestrahlt wurden. ........................................................................................................... 37 Abbildung 16: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Apoptose von HaCaT-Zellen, ohne Iod, in Abhängigkeit von der jeweiligen Strahlendosis................................................................................................... 39 Abbildung 17: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Apoptose von HaCaT-Zellen, mit 150 µg Iod, in Abhängigkeit von der jeweiligen Strahlendosis. ................................................................................. 39 Abbildung 18: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Nekrose von HaCaT-Zellen, ohne Iod, in Abhängigkeit von der jeweiligen Strahlendosis................................................................................................... 40 Abbildung 19: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Nekrose von HaCaT-Zellen, mit 150 µg Iod, in Abhängigkeit von der jeweiligen Strahlendosis. ................................................................................. 40 Abbildung 20: Apoptose HaCaT-Zellen, mit unterschiedlichen Iodkonzentrationen, welche mit den angegebenen Strahlendosen bestrahlt wurden. ........................................................................................................... 41 Abbildung 21: Nekrose HaCaT-Zellen, mit unterschiedlichen Iodkonzentrationen, welche mit den angegebenen Strahlendosen bestrahlt wurden. ........................................................................................................... 42 Abbildung 22: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Apoptose von FRTL-5-Zellen, welche ohne Iod inkubiert und anschließend mit [131I] versetzt wurden................................................................................ 43 Abbildung 23: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Apoptose von FRTL-5-Zellen, welche mit 150 µg Iod/ml inkubiert und anschließend mit [131I] versetzt wurden.......................................................... 43 Abbildung 24: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Nekrose von FRTL-5-Zellen, welche ohne Iod inkubiert und anschließend mit [131I] versetzt wurden................................................................................ 44 Abbildung 25: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Nekrose von FRTL-5-Zellen, welche mit 150 µg Iod/ml inkubiert und anschließend mit [131I] versetzt wurden.......................................................... 44 Abbildung 26: Apoptose von FRTL-5-Zellen, welche mit verschiedenen Iodkonzentrationen inkubiert und anschließend mit [131I] versetzt wurden. .... 45 Abbildung 27: Nekrose von FRTL-5-Zellen, welche mit verschiedenen Iodkonzentrationen inkubiert und anschließend mit [131I] versetzt wurden. .... 45 Abbildung 28: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Apoptose von HaCaT-Zellen, welche ohne Iod inkubiert und anschließend mit [131I] versetzt wurden................................................................................ 47 Abbildung 29: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Apoptose von HaCaT-Zellen, welche mit 150 µg Iod/ml inkubiert und anschließend mit [131I] versetzt wurden.......................................................... 47 70 Abbildungsverzeichnis Abbildung 30: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Nekrose von HaCaT-Zellen, welche ohne Iod inkubiert und anschließend mit [131I] versetzt wurden................................................................................ 48 Abbildung 31: Mittelwerte und Standardabweichung des Anreicherungsfaktors der Nekrose von HaCaT-Zellen, welche mit 150 µg Iod/ml inkubiert und anschließend mit [131I] versetzt wurden.......................................................... 48 Abbildung 32: Apoptose von HaCaT-Zellen, welche mit verschiedenen Iodkonzentrationen inkubiert und anschließend mit [131I] versetzt wurden. .... 49 Abbildung 33: Nekrose von HaCaT-Zellen, welche mit verschiedenen Iodkonzentrationen inkubiert und anschließend mit [131I] versetzt wurden. .... 49 71 Anhang Lebenslauf Mein Lebenslauf wird aus Gründen des Datenschutzes in der elektronischen Fassung meiner Arbeit nicht veröffentlicht. 72