Untersuchungen mittels konventioneller Parasitologie (Flotation
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Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt (CVUA) Karlsruhe Außenstelle Heidelberg Abschlussbericht: Projekt Neospora caninum 01.11.2005 bis 31.12.2006 1. Projekttitel: Untersuchungen mittels konventioneller Parasitologie (Flotation) und Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Rolle des Fuchses als möglicher Überträger von N. caninum und zur Häufigkeit bei Wildwiederkäuern und Kleinsäugern als mögliche Zwischenwirte in einem Wildtierzyklus 2. Fördernde Institution/Förderkennzeichen: -Fördernde Institution: Ministerium für Ernährung und Ländlicher Raum Baden-Württemberg -Über Drittmittel: Zuschuss der Tierseuchenkasse Baden-Württemberg -Föderkennzeichen: Projekt-Nr. 0296E Antrag vom 26.10.2005 3. Antragnehmer und Projektleitung: -Projektleitung: Dr. Sauter/Frau Dr. Constantin am CVUA Karlsruhe, Außenstelle Heidelberg (Abt. 7, Tierärztliche Diagnostik) 69115 Heidelberg, Czernyring 22 a / b -Antragnehmer: Dr. Uhlenbruck Rinder-/Eutergesundheitsdienst Heidelberg der Tiersuchenkasse Baden-Württemberg 69115 Heidelberg, Czernyring 22 a / b 1 Frau Prof. Dr. Mackenstedt/ Herr Dr. Romig, Fg. Parasitologie der Universität Hohenheim 70599 Stuttgart, Emil-Wolff-Str. 34 Dr. Schares Institut für Epidemiologie Friedrich-Loeffler-Institut-Bundesforschungsinstitut für Tiergesundheit (FLI) 16868 Wusterhausen, Seestrasse 55 4. Literaturhinweise: Albrecht E., Hofmeister B., Seeger H.-J. (2004) Neospora caninum: Beobachtungen im Rahmen von Verkalbungen beim Rind Amtstierärztlicher Dienst und Lebensmittelkontrolle Tierseuchen und Zoonosen 11.Jahrgang-4/2004; S: 293-296 Almeria, S., Ferrer D., Pabon M., Castella J., Manas S. 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Rinderhalter in Baden-Württemberg wollten gegen Hundekot auf den Wiesen vorgehen, da die Hunde einen einzelligen Parasiten, Neospora caninum ausscheiden, der bei den Rindern Aborte verursacht. Nach derzeitigem Kenntnisstand ist der Hund nur zum Teil für eine Infektion der Rinder mit dem Erreger verantwortlich zu machen, insbesondere nur Hofhunde mit Zugang zu 4 zystentragendem Material wie Aborten und Nachgeburten bzw. roher Muskulatur. Neospora caninum wird weltweit als bedeutender Aborterreger beim Rind angesehen (CONRATHS und SCHARES, 1999). Infektionen mit Neospora caninum können Verkalbungen, Totgeburten oder die Geburt lebensschwacher Kälber auslösen (De MERSCHMAN et.al.,2000). Hunde und Kojoten ( GONDIM et. al., 2004) sind als Endwirte von N. caninum bekannt, d.h. diese Tierarten können nach Verzehr von Körpergeweben infizierter Zwischenwirte einige Tage lang Oozysten im Kot ausscheiden. In Europa gilt bislang nur eine von Hunden ausgehende Futter - bzw. Trinkwasserkontamination mit Oozysten als wichtige Quelle für postnatale Infektionen bei Rindern (BLUMRÖDER et.al., 2006). Als ein Risikofaktor für das Auftreten von N. caninum -Infektionen in Rinderbeständen scheint z.B. das Verhalten von Hofhunden zu sein, die ihren Kot auf den Futtergang im Bestand absetzen (SCHARES, CONRATHS, 2007). . Experimente zur Überprüfung, ob auch Katzen oder Rotfüchse als Endwirte von N. caninum fungieren könnten, verliefen negativ (MC ALLISTER MM. et.al., 1998; SCHARES et.al.,2002). Dagegen weist der Nachweis von Zysten im Gehirn von Füchsen in Spanien auf das Vorkommen einer natürlichen Infektion der Füchse als Zwischenwirte hin (ALMERIA S. et al., 2002). Nach derzeitigem Kenntnisstand soll der Hund nicht nur Endwirt sondern auch Zwischenwirt sein können (Rommel et al., 2000). Die Vermutung liegt daher nahe, dass auch der Fuchs als Canide, wie Hund und Kojote als Endwirt fungieren und Oozysten ausscheiden kann. Dies könnte die bislang experimentell nachgewiesene Infektion von Nagern mit Zysten von N. caninum erklären (Rommel et al., 2000). Analog zu den Untersuchungen in Kanada (HADDAD et al., 2005), sollten unsere Untersuchungen zeigen, ob es möglicherweise einen eigenen sylvatischen (Wildtierzyklus) zu dem bereits bekannten Haustierzyklus gibt und es die Möglichkeit des sich kreuzenden Zyklus gibt. Das Zwischenwirtsspektrum von N. caninum ist sehr breit. Verschiedene Wildwiederkäuer (Rotwild, Reh, Gemse) und Kleinsäuger (experimentell: Mäuse, Kaninchen) sind als Zwischenwirte bekannt (BOCH und SUPPERER, 2000; CONRATHS und SCHARES Homepage FLI 2007). Derzeit ist aber noch unklar, ob es in Mitteleuropa tatsächlich einen Wildtierzyklus von N. caninum gibt (ALMERIA et al., 2002; MAYR, 2004). Bei Untersuchungen in Brandenburg konnte kein eindeutiger serologischer Nachweis von Neospora-Infektionen in Hirschen und Rehwild erbracht werden (MAYR, 2004). Serologische Befunde müssen jedoch mit aller Vorsicht interpretiert werden, da die Spezifität der nicht validierten serologischen Verfahren nicht bekannt ist und Kreuzreaktionen mit anderen verwandten Protozoen nicht ausgeschlossen werden können. Zudem reagieren z. B. Hunde nach experimenteller N. caninum Infektion nicht immer serologisch positiv (SCHARES, 2002). Daher stellte sich die Frage, ob und welche Rolle der Fuchs in einem vermeintlichen Wildtierzyklus als Endwirt und bei der Abortproblematik in Rinderbeständen spielt. Somit sollte in diesem Zusammenhang ebenfalls die Rolle der Wildmäuse als potentieller Zwischenwirt und Hauptnahrungsquelle von Füchsen beleuchtet werden (HUGHES et al., 2006). 5 Gegenwärtiger Kenntnisstand: In letzter Zeit hat sich wegen der Abortproblematik in Rinderhaltungsbetrieben eine kontroverse Diskussion zwischen Landwirten und Hundehaltern entwickelt. Dabei spielt die Frage des Infektionsrisikos durch Hunde- und auch Fuchskot eine wesentliche Rolle (ALBRECHT et al., 2004; BLUMRÖDER et al., 2006; CANADA et al., 2004; SCHARES et al., 1997). Der Fuchs kommt als möglicher Überträger ins Blickfeld und Wildwiederkäuer als Träger von Parasitenstadien unter fleischhygienischen Aspekten (GONDIM et al., 2004; HADDAD et al., 2005). Dabei ist die Frage eines Wildtierzyklus sowie der Rolle des Fuchses als möglichem Überträger nicht ausreichend geklärt. Neuere Arbeiten relativieren zumeist die Rolle des Hundes (SCHARES et al., 2005; BLUMRÖDER et al., 2006; SCHARES et al., Homepage FLI). Amerikanische Untersuchungen (GONDIM et.al.,2004) erklären die hohe Seroprävalenz bei Wildtieren mit einem eigenen Wildtierzyklus. Infizierte Zystenhaltige Wildwiederkäuer würden von Jägern in der freien Natur aufgebrochen und die Karkassen liegen gelassen, an denen sich dann durch Fressen der Überreste Wolf und Koyote infizieren würden. Bei Neospora caninum handelt es sich um einen einzelligen Parasiten (Protozoa), der erstmals Ende der 80er Jahre bei Hunden in den USA nachgewiesen wurde. Dieser Parasit gehört zum Stamm Apikomplexa, Klasse Sporozoea, Unterklasse Coccidia, Unterordnung Eimeriina und Gattung Isosporidae. In diese Gruppe gehören unter anderem Isospora, Toxoplasma und Hammondia. Die Ausbreitung des Parasiten erfolgt durch sogenannte Dauerstadien (Oozysten bzw. Sporozysten) die durch den Kot in die Umwelt gelangen. In der Zwischenzeit geht man von einer weltweiten Verbreitung aus (MAYR, 2004). Als Endwirt und Überträger fungieren Fleischfresser (Hund, Dingo, Kojote, Fuchs) die über ihren Kot infektiöse Stadien (Oozysten) ausscheiden. Pflanzenfresser (Rinder, Büffel, Schafe, Ziegen, Gemsen u.a.) können wiederum Zwischenwirte darstellen (Rommel et.al., 2000). Bei diesen kann es durch eine Infektion mit Neospora caninum zu Aborten sowie auch zur Geburt von lebensschwachen, lebenslang infizierten Jungtieren kommen (MAYR, 2004; GONDIM et al., 2004). Der Hund kann sowohl Endwirt als auch Zwischenwirt sein (Rommel et.al.2000). Derzeit sind Hunde die einzig bekannten Endwirte in Europa, die über ihren Kot N. caninum Oozysten ausscheiden können (SCHARES,CONRATHS 2007). Eine Arbeitsgruppe hat bereits experimentell überprüft, ob der Fuchs Endwirt von Neospora caninum sein kann, jedoch mit negativem Ausgang. In diesen Experimenten schieden nur Hunde, nicht aber Füchse Oozysten des Parasiten aus. Für den Infektionsversuch wurden serologisch negative Farmfüchse verwendet. Diese Experimente mit negativem Ausgang schließen jedoch nicht aus, dass z.B. andere als die dort verwendeten Neospora-Stämme doch zu einer Ausscheidung bei Füchsen führen könnten (SCHARES et al., 2002). Neospora caninum wird weltweit als einer der wichtigsten Abortverursacher beim Rind beschrieben (MAYR, 2004). Der Parasit wird während einer Trächtigkeit von der latent infizierten Mutter transplazentar auf den Feten übertragen. In den meisten Fällen wird ein gesundes, jedoch chronisch und lebenslang infiziertes Kalb geboren. Diese Tiere können bis zu 5 Trächtigkeiten immer wieder die Feten infizieren, indem die Gewebszysten des Muttertieres durch die veränderte Hormon -und Immunlage reaktiviert werden (endogene vertikale Infektion). Ohne Aufnahme von Oozysten/Sporozysten (exogene horizontale Infektion) hält sich so eine Infektion mit Neospora caninum über Jahre in einem Bestand. Man geht davon aus, dass in der Rinderpopulation die vertikale Übertragung endogenen 6 Ursprungs mehr als 90% des Infektionsgeschehens ausmacht. Dass es nach vertikaler Übertragung zum Neospora-induzierten Abort kommt, stellt jedoch eine Ausnahme dar. Horizontale Infektionen exogenen Ursprungs betreffen weniger als 10% der Fälle. In diesem Zusammenhang stellt sich die Frage, welche exogenen Infektionsquellen grundsätzlich in Betracht kommen (STAUBLI et al., 2006; HADDAD, 2005). 8. Ziel des Projektes: Das Projekt soll die Hypothese überprüfen, ob neben dem bekannten Haustierzyklus auch ein Wildtierzyklus bzw. ein „cross-over Zyklus“ zwischen beiden Typen existiert. Dafür soll zum Einen die Rolle des Fuchses als möglicher Endwirt und/oder Zwischenwirt und zum Zweiten die Rolle der Maus als möglicher Zwischenwirt bzw. Stapelwirt untersucht werden. • • • • • • • Durch die Untersuchung von Fuchskotproben aus Nordbaden und Nordwürttemberg mittels modifiziertem Flotationsverfahren auf Kokzidienoozysten und -sporozysten (Dauerstadien incl. N. caninum) beim Nachweis: Überprüfung mittels konventioneller PCR (Polymerase Kettenreaktion) auf N. caninum spezifische DNA Untersuchung von Fuchskotproben im Bereich des Echinokokkenprojektes "Römerstein" (Gemeinden Donnstetten, Zainingen und Böhringen) mittels modifiziertem Flotationsverfahren auf Kokzidienoozysten und -sporozysten beim Nachweis: Überprüfung mittels konventioneller PCR (Polymerase Kettenreaktion) auf N. caninum spezifische DNA Fang von Feldmäusen im Bereich des Echinokokkenprojektes "Römerstein" und Untersuchung von Organproben mittels Realtime-PCR auf N. caninum spezifische DNA Untersuchung von Organproben von Füchsen und anderen Wildtieren mittels Realtime-PCR auf N. caninum spezifische DNA beim Nachweis von N. caninum spezifische DNA in Wildtieren/Feldmäusen: Überprüfung regionaler Rinderhaltungsbetriebe ("Risikogebieten") hinsichtlich Abortgeschehen und Epidemiologie, sowie Entnahme von Blutproben werden Aussagen zu folgenden Punkten erwartet: Prävalenz (Befallsrate) beim Fuchs (in Kotproben und Organen) Prävalenz bei anderen Wildtieren (in Organen) Prävalenz bei Wildmäusen (in Organen) Prävalenz bei Rinderhaltungsbetrieben in "Risikogebieten" 9. Untersuchungsmethoden: Material: Mittels modifiziertem Flotationsverfahren wurden im CVUA Karlsruhe Außenstelle Heidelberg insgesamt 2104 Fuchskotproben auf Kokzidienoozysten untersucht. Dieses Probenmaterial stammt aus dem Tollwut-/Echinokokken-Kontrollprogramm; 329 aus 7 Nordbaden und 1775 aus Nordwürttemberg. Weiterhin wurden an der Universität Hohenheim mittels modifiziertem Flotationsverfahren 87 Fuchskotproben aus dem Bereich des Echinokokkenprojektes "Römerstein“ untersucht. Aus den insgesamt 2191 untersuchten Fuchskotproben wurden bei 65 Oozysten gefunden. Da es nicht möglich ist, die gefundenen Oozysten mikroskopisch (z. B. durch Ausmessen, Morphologie etc.) im Hinblick auf das Vorhandensein von N. caninum weiter zu differenzieren, wurden die positiven Fuchskotproben mittels konventioneller PCR auf N. caninum spezifischer DNA untersucht. In diesem Projekt sind Gehirnproben von 528 Füchsen, 16 Rehen/Hirschen und 1 Wildschwein mittels Realtime-PCR auf N. caninum spezifische DNA untersucht worden. Diese stammten ebenfalls aus dem Tollwut-/Echinokokken-Kontrollprogramm des Landes Baden-Württemberg. Im Bereich des Echinokokkenprojektes "Römerstein" der Universität Hohenheim wurden in Römerstein, Wiesensteig, Feldstetten und Westernheim insgesamt 224 Wildmäuse mit Fallen gefangen. Davon kamen 199 ganze Tiere zur Organuntersuchung und 25 Köpfe zur Untersuchung. Es handelte sich um 198 Feldmäuse ( Microtus arvalis), 11 Schermäuse (Arvicola terrestris), 2 Rötelmäuse (Myodes glareolus) 1 Gelbhalsmaus (Apodemus flavicollis), 12 Spitzmäuse (Sorex araneus). Die Untersuchung der Gehirnproben erfolgte mittels Realtime-PCR auf N. caninum spezifische DNA Methoden: Da mit einer geringen Häufigkeit positiver Kotproben zu rechnen ist, werden diese zunächst mit der modifizierten Flotationstechnik untersucht und nur im positiven Fall mittels PCR abgeklärt. Flotations-Standardverfahren zum Nachweis von N. caninum (mod. nach Kourenti et al., 2003): Die Fuchskotproben sind aus Sicherheitsgründen mindestens eine Woche bei -70°C eingefroren worden. Da ein Teil der Kotproben bereits im Echinococcus-ELISA aufbereitet wurde, lagen diese für das Projekt in ELISA-Puffer bei -20°C tiefgefroren vor. Für die Untersuchung der Fuchskotproben mittels Flotationsmethode wurde eine von KOURENTI et al. 2003 an der Universität Hohenheim etablierte und am CVUA Karlsruhe Außenstelle Heidelberg modifizierte Methode angewendet. Der in ELISA-Puffer befindliche oder aufgetaute (mindestens eine Woche bei -70°C gelagerte) Fuchskot wird mit ca. 10ml Leitungswasser aufgefüllt und gut durchgemischt (Vortex 15 min). Das Kot/Wasser/(ELISA-Puffer)-Gemisch wird, um grobe Partikel abzufiltern durch ein Sieb gegossen. Parallel dazu wird in ein 50ml FalconZentrifugenröhrchen 15ml Lösung A (1:4) vorsichtig über 15ml Lösung B (1:2) geschichtet (Dichtegradient). Dann wird das gefilterte Gemisch vorsichtig auf den Dichtegradienten aufgebracht. Die Proben werden bei 1.200g mit Ausschwingrotor (Auslauf ohne Bremse) 30min zentrifugiert. Die Oozysten (siehe Abb. 1und 2) befinden sich im Überstand. Die organischen Reste sind im Pellet (am Boden des Röhrchens), das verworfen wird. Der gesamte Überstand (ca. 40ml) wird mit einer Pipette abgenommen und mit 10ml entionisiertem Wasser in einem 50ml Falkon-Zentrifugenröhrchen gemischt. Dieses Gemisch wird bei 1.000g mit Ausschwingrotor (Auslauf ohne Bremse) 10min zentrifugiert. Die Oozysten befinden sich nun im Pellet am Boden des Röhrchens. Der Überstand wird vorsichtig mit einer Pipette oder Wasserstrahlpumpe abgenommen und verworfen. Das 8 Restvolumen sollte ca. 1ml betragen. Der Pellet wird im Restvolumen (ca. 1ml) aufgelöst (gut schütteln oder vortexen). Aus der Flüssigkeit des Restvolumens wird ein Präparat (1x10 l) angefertigt und mit einem Deckgläschen unter dem Mikroskop bei 400facher Vergrößerung im Phasenkontrast (PHAKO) durchgemustert. Dabei werden die Oozysten ausgezählt (Methode siehe Punkt 3 im Anhang 2 zum Projekt). Bei einem positiven Ergebnis wird das verbliebene Restvolumen (ca. 1ml) bei -20°C für die nachfolgende PCR eingefroren. Die Positivkontrolle die zur Modifizierung der Methode und für die mikroskopische Untersuchung herangezogen wurde, stammte vom FLI (Dr. Schares) und enthielt 1,5x105 Oozysten des Isolats „Hammondia sp. FOX 2000/1“ in Leitungswasser. Abbildung 1: Unsporulierte N. caninum-Oozyste (a) und unsporulierte H. heydorni-Oozyste (b) in konzentrierter Saccharose-Lösung stark vergrößert (SCHARES, FLI) Abbildung 2: Sporulierte von N. caninum-Oozyste stark vergrößert (SCHARES, FLI) Nachweis von Apicomplexa-DNA mittels PCR (mod. nach Ho et al., 1996; Magnino et al., 1998) Da bei der üblichen parasitologischen Untersuchungstechnik (modifizierte Flotation) die Oocysten von N. caninum morphologisch nicht sicher von anderen, hier nicht relevanten Parasiten (z. B. Hammondia, andere Sarcosporidien) zu unterscheiden sind, kam dazu eine 9 am FLI etablierte konventionelle PCR zur weiteren Differenzierung zum Einsatz (SCHARES et al., 2005). Die bereits am FLI für die Matrix Hundekot etablierte Methode wurde modifiziert. Als Ausgangsmatrix für die PCR diente das Restvolumen (ca. 1ml) der in der Flotation Kokzidien-Oozysten positiven Fuchskotproben. Die Untersuchungen mittels PCR wurden am FLI (Beschreibung der Methode siehe Punkt 1 im Anhang 2 zum Projekt) durchgeführt. Diese Methode ist aufwändig und teuer. Nachweis von N. caninum spezifische-DNA mittels Realtime-PCR: Die Untersuchung von Organproben (Gehirn) bei Wildtieren und Wildmäusen erfolgte mittels Realtime-PCR (Beschreibung der Methode siehe Punkt 2 Anhang 2 zum Projekt). Die bereits für ein Sybergreen-Assay etablierte Realtime-PCR (COLLANTES-FERNANDEZ et al., 2002) wurde in der Außenstelle Heidelberg für Taqman®sonden modifiziert, in den Routinebetrieb eingesetzt und zur Untersuchung der Gehirnproben in diesem Projekt verwendet. 10. Ergebnisse: Es wurden 2191 Fuchskotproben mittels modifizierter Flotationstechnik untersucht. Davon waren 65 positiv. Diese wurden mit Hilfe der konventionellen PCR auf N. caninum spezifischen DNA untersucht. Die molekularbiologische Untersuchung verlief mit negativem Ergebnis. Die 769 mittels Realtime-PCR untersuchten Gehirnproben wurden auf N. caninum spezifischen DNA mit ebenfalls negativem Ergebnis getestet. Die Ergebnisse zu den untersuchten Proben sind in Tabelle1 (siehe Anhang 1) dargestellt. 11. Konsequenzen für die Praxis: Ziel dieses Projektes war es, mit Hilfe der oben genannten Untersuchungsmethoden Aussagen zur Prävalenz (Befallsrate) für N. caninum beim Fuchs (in Kotproben und Organen), bei anderen Wildtieren (in Organen) und der Feldmaus (in Organen) zu treffen. Beim positiven Nachweis von Oozysten beziehungsweise N. caninum spezifische DNA in Fuchskotproben und Organproben sollten die Rinderhaltungsbetriebe in den sogenannten "Risikogebieten" im Zusammenhang mit der Abortproblematik in den Beständen blutserologisch auf N. caninum-spezifischen Antikörper untersucht werden. Mit Hilfe dieses Projektes sollten Erkenntnisse zur Rolle des Fuchses als Endwirt, sowie das Vorhandensein eines möglichen Wildtierzyklus bei N. caninum gewonnen werden und die Rolle der Wildmäuse als potentieller Zwischenwirt beleuchtet werden. I In den vorliegenden Untersuchungen konnten in den mittels Flotation und PCR untersuchten Fuchskotproben keine N. caninum-Oozysten isoliert beziehungsweise kein Nachweis von N. caninum spezifische DNA geführt werden. Die vorliegenden Ergebnisse legen die Vermutung nahe, dass der Fuchs kein Endwirt ist und somit nicht als potentieller Überträger von N. caninum in Frage Kommt. 10 Da die modifizierte Flotationsmethode für Fuchskotproben in der Durchführung sehr aufwändig ist und vom Betrachter eine sehr genaue Kenntnis und Übung in der morphologischen Erkennung der Oozysten erfordert, eignet sich diese Methode nicht für den Routinebetrieb. Hinzu kommt, dass die Fuchskotproben vor der Bearbeitung aus Seuchenhygienischen- und Arbeitssicherheitsgründen mindestens eine Woche bei -70°C eingefroren werden müssen. Somit wird durch morphologische Veränderungen das Auffinden und Identifizieren der Oozysten erschwert. Eine falsch negative Befundung der Proben nach dem Einfrierprozess wurde von den Autoren diskutiert, jedoch nach bisher vorliegenden Erfahrungen verworfen. Es scheint unwahrscheinlich, dass der Einfrierprozess die Stadien so stark schädigen kann, dass die Oozystenwand zerstört wird. Die bisherigen Erfahrungen der Universität Hohenheim belegen, dass nach dem Einfrierprozess bei - 70 Grad C zwar eine Abtötung der parasitären Stadien erfolgt, die DNA ist über die PCR jedoch noch nachweisbar. Die Durchführung der konventionellen PCR aus dem Restvolumen der bearbeiteten Kotproben ist sehr kosten- und arbeitsintensiv. Demzufolge wird ein Screening der Kotproben durch das Flotationsverfahren notwendig. Daher ist die Etablierung dieser Methode und die Aufnahme in den Routinebetrieb derzeit nicht praktikabel. Dagegen wird die Durchführung der Realtime-PCR zur Untersuchung von Organmaterial (überwiegend Gehirn) bereits in der Außenstelle HD im Routinebetrieb angeboten. Fazit: Da die molekularbiologischen Untersuchungen der Gehirne von Wildtieren (inklusive Fuchs) und Wildmäusen mit negativem Ergebnis verliefen, konnte die Hypothese der Existenz eines Wildtierzyklus und die Rolle der Wildmaus als potentieller Zwischenwirt, sowie die Rolle des Fuchses als möglicher Überträger (Endwirt oder Zwischenwirt) von N. caninum durch die vorliegenden Untersuchungen nicht abschließend bestätigt werden. Eine weiterführende Untersuchung, wie von Almeria et. al., 2002 beschrieben, mit dem Hauptaugenmerk des Zystennachweises beim Fuchs, könnte jedoch nochmals die Rolle des Fuchses als Zwischenwirt beleuchten. Diese Fragestellung könnte in einem gesonderten Projekt untersucht werden. Dr. Hartmann 11
