STUDIUM DER TIERMEDIZIN PUERTO MONTT BESTIMMUNG VON NEOSPORA CANINUM MITTELS IMMUNCHROMATOGRAPHIE IN HUNDEN AUS ZWEI MILCHVIEHBETRIEBEN DER PROVINZ LLANQUIHUE, CHILE. Studienbericht als Teil der Anforderungen, um den Grad eines TIERARZTES zu erlangen RAÚL ANDRÉS LATORRE TAMPIER Puerto Montt, Juli 2013 BETREUENDER PROFESSOR: FRANK VERA OTAROLA TIERARZT AKADEMIKER IN DER TIERMEDIZIN 1. EINLEITUNG 1.1 BEDEUTUNG Seit Anfang 1944 wurde Neospora caninum weltweit als Verursacher von Aborten in Milchkühen nachgewiesen (Márquez, 2003). In Hunden wurde N. caninum als Auslöser parasitärer Erkrankungen nachgewiesen, so auch in abortierten, mumifizierten Rinderföten und Kälbern mit neonataler Paralyse. Seither wurde die Krankheit in Rindern weltweit an verschiedenen Orten nachgewiesen, und es ist jetzt bewiesen, dass sich Hunde und Rinder mit dem gleichen Mikroorganismus infizieren. Aborte im ersten Trächtigkeitsdrittel sind die bei Rindern mehrheitlich beobachteten klinischen Anzeichen, wobei sie sich zwischen dem vierten und sechsten Monat häufen. Außerdem verursacht N. caninum den Tod neugeborener Kälber und die Geburt kranker Tiere mit nervöser Symptomatik, jedoch sind auch Geburten ohne erkennbare Infektion möglich. Diese subklinischen Kälber sind mögliche Multiplikatoren der Erkrankung innerhalb der Herde oder persistent infiziert (Silva, 2002). Das Protozoon kann über Bullensperma ausgeschieden werden, und seine Desoxyribonukleinsäure (DNS) konnte auch schon in gefrorenem Sperma nachgewiesen werden (Moore et al., 2005). 1.2 TAXONOMIE N. caninum ist ein Protozoon der Klasse Coccidia, der Familie Sarcocystidae, zusammen mit Toxoplasma, Sarcocystis, Hammondia, Besnoitia und Frenkelia (Patitucci, 2001). 1.3 EPIDEMIOLOGIE Studien in Brasilien zeigten eine Seroprävalenz von 21,6% in Hunden, welche in der Umgebung von Milchkuh-Weiden lebten, während in Argentinien nachgewiesen wurde, dass 73,3% der Hunde in Kontakt mit milchwirtschaftlichen Betrieben den Parasit beherbergten. Aus Chile ist eine wesentliche Anzahl innerhalb der Milchherde bekannt, die Anzahl an Aborten wurde in letzter Zeit jedoch nicht quantifiziert. Allerdings ist bekannt, dass daraus relevante Wirtschaftsverluste entstehen. Zum Beispiel hat Chile ein nationales Kontrolllabor für Brucella sp. sowie andere infektiöse Erreger wie Leptospirose und Bovine Virrusdiarrhoe eingerichtet. Diese haben jedoch nicht dieselbe Relevanz wie Neospora caninum (Patitucci, 1999). In England wird berücksichtigt, dass jährlich 6000 Aborte durch N. caninum auftreten, denen für jede Abtreibung Verluste von 800 USD zugewiesen werden (Moore et al., 2005). 1.4 BIOLOGISCHER ZYKLUS Der Hund ist sowohl Zwischen- als auch Endwirt und scheidet die Oozysten mit dem Kot in die Umwelt aus. Er belastet so Wiesen und Trinkwasser der Produktionstiere, die Zwischenwirte, die letztendlich Symptome der Neosporose wie Aborte aufweisen (Del Campo, 2003). Andererseits kann ein Hund, der als Zwischenwirt wirkt, seropositiv sein und die Infektion vertikal auf seine Welpen übertragen, wobei diese bis zu 24 Stunden nach der Geburt infektiös sind (Moore et al., 2005). 1.5 PATHOGENESE Der protozoische Erreger Neospora caninum wird über infiziertes Gewebe (horizontale Übertragung) oder durch die Plazenta aufgenommen. Die Zystenwand wird durch den Magensaft abgebaut und die parasitären Formen, mit dem enteroepithelialen Stadium beginnend, freigegeben. Nachdem eine sexuelle und asexuelle Vermehrung im Darm stattgefunden hat, werden die Oozysten von den Endwirten ausgeschieden (Moore et al., 2005). Oozysten werden maximal 3 Wochen lang mit dem Kot ausgeschieden. Erst nachdem die Sporenbildung in der Umwelt stattgefunden hat, werden sie für die Rinder infektiös (Silva, 2002). Die spezifischen Symptome sind bei älteren Hunden nicht sichtbar. In Welpen oder jungen Hunden (jünger als 1 Jahr) können klinische Symptome wie Paralyse, Myokarditiden, Dermatitiden, Pneumonien oder Enzephalitis beobachtet werden. Bei einer Neospora caninum-Infektion in Welpen mit Schwäche der Gliedmaßen konnte der Parasit nach post mortem-Entnahme in Hirn- und Muskelgewebe nachgewiesen werden (Płoneczka und Mazurkiewicz, 2008). 1.6 GEOGRAFISCHE ANALYSE Im Jahr 1998 wurde N. caninum im Zusammenhang mit einem Ausbruch von Aborten im Rind in der Region Araukanien, Chile, diagnostiziert. In nachfolgenden Untersuchungen der Kühe mit Abortgeschichte wurde der Parasit serologisch nachgewiesen. Eine Studie der Seroprävalenz dieses Protozoons in einer Gruppe Milchkühe von vier Feldern der Region von Los Lagos erwies Prävalenzen von 20,5% und 50% und bestätigte damit das Vorhandensein von Antikörpern gegen Neospora caninum in der chilenischen Region (Patitucci et al., 1999). 1.7 AKTUELLE SITUATION Die nach Beschwerden an das Landwirtschaft- und Viehzucht-Service diagnostizierten Neosporosefälle 2011 haben gezeigt, dass die Zahl der Infektionen mit Neospora caninum angestiegen ist. Dagegen sind andere Krankheiten wie die Rinderbrucellose und die Leptospirose tendenziell rückläufig (SAG, 2012). Unter den Krankheiten, die bei Rindern beobachtet wurden, besteht weiterhin ein Trend des Abortgeschehens ohne Beteiligung von IBR, BVD und Neospora, was sich – vor dem Hintergrund, was in den vergangenen Jahren schon geschah – besorgniserregend auf die Produktionsstärke dieser Betriebe auswirken könnte (Del Campo, 2003). Die Hauptdiagnosen bei Rindern unter den im Jahr 2011 eingegangenen Beschwerden waren unter anderem Neosporose mit 117 Betroffenen aus einer Gesamtzahl von 6.968 und einer Benachrichtigung von 55 Betroffenen (SAG, 2012). Andererseits zeigen die Ergebnisse der serologischen Tests für Neospora in Abortfällen zwischen 2006 und 2011, dass im Durchschnitt 37,4% der Fälle gegen Neospora und andere Erreger, wie IBR und BVD-Virus oder Leptospira reagieren (Tabelle 1, Anhang; SAG, 2012). Der Anteil an Abortbeschwerden zwischen den Jahren 2006 und 2011 erhöhte sich im Laufe der Jahre, beginnend bei 4% nur Neospora positiv bis zu 24,54% im 2011. Die Anzahl der Beschwerden erhöhte sich ebenfalls, mit 100 Beschwerden im Jahr 2006 bis hin zu 216 Beschwerden im Jahr 2011 (Tabelle 2, Anhang) (SAG, 2012). 1.8 DIAGNOSE Von Hunden gibt es keine relevanten Studien über die Prävalenz in den Regionen Los Lagos und Los Ríos in Chile. Die Diagnose wird in diesem Fall durch die Verwendung immunhistochemischer Techniken und immundiagnostischer Tests gestellt, wie direkter Agglutination, ELISA, indirekter Immunfluoreszenz, Koproskopie, Agglutinationstests und Immunchromatographie, die eine sichere, effektive und schnelle Technik ist (Silva et al., 2010). Die Immunchromatographie wird für eine schnelle Diagnose in Blut-, Urin-, Speichelproben etc. verwendet. Für viele noch unbekannt, besteht dieser Test aus einem Kunststoffträger, auf dem eine Nitrozellulosemembran aufgebracht ist. Nach Zugabe der Probe wandert diese durch die Nitrozellulosemembran und reagiert zunächst mit dem konjugierten Antikörper (Álvaro G, 2010). Falls das Antigen vorhanden ist, bindet dieses mit dem Konjugat. Später wandert das Antigen weiter und zieht das Konjugat bis hin zu einer Stelle, an der ein Fänger-Antikörper gebunden ist (Álvaro G, 2010). In Bezug auf den Immunchromatographie-Test mit der Handelsbezeichnung FASTest® NEOSPORA caninum ist bemerkenswert, dass er ein spezifisches rekombinantes Chimärprotein mit hoher Affinität beinhaltet, bei dem die Wahrscheinlichkeit, dass ein negatives Ergebnis vorkommt, wenn der Bluttest keine Antikörper gegen Neospora caninum enthält, 98,8% beträgt, und die Wahrscheinlichkeit, dass ein positives Ergebnis vorkommt, wenn der Bluttest Antikörper gegen Neospora caninum enthält, 96,4% beträgt (A. Kern, 2011). 1.9 BEHANDLUNG Clindamycin und Toltrazuril sind die wirksamsten Medikamente, welche Hirnläsionen bei experimentell infizierten Kälbern vermindern. Eine geeignete Technik, um eine vertikale Übertragung der Krankheit zu verhindern, ist der Embryotransfer (ET). Um die postnatale Infektion von Rindern zu verhindern, wird empfohlen, Hunden den Zugang zu Wasserquellen, Weiden und Speicher mit Rinderfutter zu erschweren (Moore et al., 2005). 1.10 ZIELE 1.10.1.1 Gesamtziel - Nachweis von Neospora caninum durch Immunchromatographie in Hunden aus zwei Milchviehbetrieben in der Provinz Llanquihue, Chile. 1.10.1.2 Spezifische Ziele - Prozentuale Quantifizierung der Hunde mit und ohne Parasiten. Vergleich des Vorhandenseins von N. caninum zwischen den beiden Milchviehbetrieben. 1.11 HYPOTHESE In beiden Milchviehbetrieben im Bereich des Llanquihue, Chile, kommen Hunde vor, in denen Neospora caninum mittels Immunchromatographie-Test nachgewiesen werden kann. 2. MATERIAL UND METHODEN Die Studie wurde zwischen April und Mai 2013 an 30 Hunden aus zwei Milchviehbetrieben durchgeführt. Der Milchviehbetrieb A ist 8,5 Kilometer von Casma, camino cancha rallada, entfernt, mit einer Fläche von 400 Hektar und insgesamt 800 Rindern. Betrieb B, camino viejo, hat eine Fläche von 350 Hektar und insgesamt 670 Rinder. Beide gehören zur Gemeinde Frutillar, Provinz Llanquihue, zehnte Region, Chile. 2.1 MATERIAL Biologisch: - 30 Hunde: 11 Hunde aus Milchviehbetrieb A, 19 Hunde aus Betrieb B. Zusätzliche Materialien: - 30 Probenröhrchen für Serum ohne Gerinnungshemmer - 3 Kits FASTest® NEOSPORA caninum - Latexhandschuhe - Maulkorb - 3 Fläschchen mit 3 ml Pufferlösung (in den Kits enthalten) - 30 Einmal-Kunststoffpipetten - 5 ml-Spritze - Watte - Alkohol - 22G und 23G Nadeln - Wasserstoffperoxid 2.2 METHODEN Es wurden Hunde gesucht, die in Häusern auf dem Betriebsgelände lebten, mit dem Ziel, Neospora caninum nachzuweisen. Mit Zustimmung der Besitzer wurden Blutproben entnommen. Maulkörbe gewährleisteten die Sicherheit. Der Stress der Tiere während der Blutentnahme wurde durch Mithilfe der Besitzer vermieden. Ca. 2 ml Blut wurde mit einer sterilen Einweg-Spritze und Nadel 22G und 23G, in Abhängigkeit von der Größe des Tieres, aus der V. cephalica in ein Röhrchen mit EDTA gezogen, wobei bei jeder Blutentnahme die Keimfreiheit mittels Verwendung von OP-Handschuhen und Alkoholtupfern sichergestellt wurde. Der Nachweis von Neospora caninum-Antikörpern in den Hunden wurde mittels FASTest® NEOSPORA caninum, einem immunchromatographischen Schnelltest zum Nachweis von Antikörpern gegen Neospora caninum erbracht. Sobald die Blutproben gezogen waren, wurden sie auf einem zuvor mit Chlor desinfizierten Tisch abgelegt und die Testkit-Materialien vorbereitet. Mit einer Mikropipette wurde aus den Probenröhrchen ein Tropfen Probe und anschließend zwei Tropfen Pufferlösung aus dem Testkit ins Fenster „S“ der Testkassetten gegeben. Diese waren vorher mit der Patientennummer beschriftet worden und wurden, der Gebrauchsanweisung folgend, auf einer glatten Oberfläche abgelegt. Nach 15 Minuten wurde das Ergebnis jeder Kassette abgelesen. Negatives Ergebnis: Die Testkassette weist nach 15 Minuten eine vertikale rote Kontrolllinie unter „C“ auf, jedoch keine rote Testlinie „T“. Dieses Ergebnis weist auf ein Neosporose-negatives Tier. Positives Ergebnis: Als positiv wurden die Testkassetten bewertet, welche nach 15 Minuten zwei vertikale Linien aufwiesen: eine rote Kontrolllinie „C“ und eine rote Testlinie „T“, wo die Neospora-Antikörper gebunden worden waren. Beide Linien waren scharf abgegrenzt (Abbildung 2, Anhang). Ungültiges Ergebnis: Im Fall, dass nur eine rote Testlinie oder keine Linie nach 15 Minuten erschien, wurde die Probe wurde als ungültig betrachtet. Der Test musste erneut durchführt werden. Für die ordnungsgemäße Verwendung der Kits sollten diese vor der Verwendung nicht geöffnet werden, nicht in Berührung mit der Haut kommen, das verwendete Material kann potentiell infektiös sein und sollte daher vorzugsweise verbrannt werden. Die Daten wurden zur weiteren Analyse in eine Tabelle (Tabelle 3, s. Anhang) eingetragen. 3. STATISTISCHE ANALYSE - Um die Anwesenheit von Antikörpern gegen Neospora caninum zu beurteilen, wurde eine deskriptive Statistik erstellt. Die in dieser Studie erhaltenen Ergebnisse wurden in Prozentzahlen (%) angegeben. 4. ERGEBNISSE Nach der Datensammlung wurden alle Ergebnisse der Hunde zweier Milchviehbetriebe in der Stadt Casma in einer Excel-Tabelle eingetragen, um die Werte interpretieren zu können. Die Grafik 1 (Abb. 1) zeigt, dass 5 von 30 Hunden der Gemeinde Frutillar; Provinz Llanquihue, zehnte Region, Chile (17%) im Schnelltest Neospora caninum-Antikörper aufwiesen, während 25 von 30 Hunden (83%) negativ waren. Gesamtübersicht Neospora caninum in den getesteten Hunden 17% Positiv Negativ 83% Abbildung 1. Prozentuale Verteilung von Neospora caninum aus allen getesteten Hunden in beiden Milchviehbetrieben. Die Grafik 2 (Abb. 2), zeigt, dass 3 von 19 Hunden (16%) aus Milchviehbetrieb A Neospora caninum positiv sind, während 16 (84%) negativ sind. Betrieb A 16% Positiv Negativ 84% Abbildung 2: Prozentuale Verteilung der Neospora caninum-positiven und -negativen Hunde aus Milchviehbetrieb A. Die Grafik 3 (Abb. 3) zeigt, dass 2 von 11 Hunden (18%) aus Milchviehbetrieb B Neospora caninum-positiv sind, während 9 (82%) negativ sind. Betrieb B 18% Positiv Negativ 82% Abbildung 3: Prozentsatz von Neospora caninum-positiv und -negativ getesteten Hunden aus Milchviehbetrieb B. 5. DISKUSSION Laut Cornejo et al. (2004) beträgt die Antikörperprävalenz gegen N. caninum in Chile zwischen 19 und 22%. Ähnliche Studien mit Hunden anderer geografischer Zonen zeigten, dass Neospora caninum in der Umgebung von Lima und in der Provinz Chachapoyas jeweils 33 und 29% betragen (Del Campo et al., 2003; Horna et al., 2003). In anderen Ländern sind die in solchen Studien erhaltenen Prävalenzen unterschiedlich; so hat man in Hunden von Viehzüchtern aus Uruguay Prävalenzen 20% erhalten (Barber et al., 1998), die dieser Studie vergleichbar sind, während in anderen Breiten die Ergebnisse höher waren: jeweils 31, 36 und 73% in Hunde aus Molkereien in Japan (Sawada et al., 1998), Brasilien (Belo et al., 1999) und Argentinien (Basso et al., 1999); wobei es jedoch wichtig ist zu beachten, dass die Ergebnisse der Hunde in diesen Studien nicht mit Prävalenzen bei Rindern korreliert wurden. In der vorliegenden Studie zeigen die Ergebnisse eine Prävalenz von 17%, der Wert ist vergleichbar mit der Prävalenz in anderen Ländern südlicher Breite. Diese Daten weisen auf horizontale Übertragung zwischen Rind und Hund hin. Diese beruht auf den Merkmalen der Milchviehhaltung in der Gegend: halb extensive Einrichtungen, Ernährung basierend auf Weidenfutter, Konzentrat und Gärfutter, für Hunde leicht zugängliche Felder. Unter den getesteten Hunden zeigte sich, dass es auf den Milchviehbetrieben mehr Männchen als Weibchen gibt. Weibchen sind schwieriger zu halten. Sie müssen sterilisiert werden müssen, da die Besitzer der Betriebe Wert darauf legen, keine Welpen zu haben, so dass deren Überwachung von großer Bedeutung für die Milchviehbetriebe ist (Patitucci, 2000). Offenbar gibt es eine Korrelation zwischen der Seroprävalenz von N. caninum und der Infektion von Rindern durch Hunde. Dies wird durch die Ergebnisse von Silva et al. (2002) bestätigt. Ebenso bestätigt die Literatur, dass es keinen Einfluss des Alters der Hunde auf die Infektion durch N. caninum gibt (Pereira-Bueno et al., 1999; Del Campo et al., 2003; Horna et al., 2003). In Chile wurden bereits einige Untersuchungen auf den Molkereien in der Metropolregion und der Region Araukanien durchgeführt, mit alarmierenden Neosporose-positiven Ergebnissen der Versuchstiere. In den meisten serologischen Hundestudien (Björkman und Uggla, 1999) wurde ein IFA-Test für den Nachweis von Antikörpern gegen N. caninum verwendet. Eine Studie mittels eines immunchromatographischen Tests gibt es in Chile nicht. Dieser kann nur aus Österreich eingekauft werden, so dass es zwar teurer, jedoch viel schneller und einfacher ist, die Protozoen zu nachzuweisen. Diese Studie basiert auf der Sammlung von Proben auf Milchviehbetrieben in der Nähe des Dorfes Casma. Die Ergebnisse bestätigen jene aus Japan, Chile und Peru (Sawada et al., 1998; Patitucci et al., 2001; Horna et al., 2003); möglicherweise, weil die Hunde in den Ställen in ständigem Kontakt mit dem Vieh sind und ein größeres Risiko besteht, die Rinder zu infizieren im Vergleich zu Hunden der Umgebung. Darüber hinaus werden diese Hunde als Hirten und Viehhüter in der Nacht eingesetzt. Es wurde jedoch kein Zusammenhang zwischen diesen Eigenschaften und der Infektionsrate festgestellt, sodass die Unterschiede in der N. caninum-Infektion nur auf der engeren Wechselwirkung der Hunde mit den Rindern beruht. Kein getestetes Tier hatte klinische Anzeichen von Neosporose. Das Ergebnis im Testkit beweist nur Infektion, aber nicht Krankheit (Dubey, 2003). Die durch Dubey und Lappin (2000) durchgeführten Studien zur Seroprävalenz in Hunden zeigten, dass es eine größere Anzahl subklinisch infizierter Tiere als erkrankter Tiere gibt. Trotzdem muss Neosporose als Differentialdiagnose bei Hunden mit nervösen Symptomen berücksichtigt werden. Ebenfalls sollte man berücksichtigen, dass laut Lértora (2004) immunhistochemische und immunchromatographische Techniken die koprologischen und histopathologischen Analysen bestätigen, da in 90% der als positiv diagnostizierten nachgewiesen wurden. Fälle diese durch immunologische Methoden 6. SCHLUSSFOLGERUNGEN Es zeigte sich, dass 17% der Hunde Neospora caninum-positiv waren. Dies bedeutet, dass 4 von 30 Hunden zur Zeit die Krankheit haben oder hatten, weil die Antikörper den Zeitpunkt der Neospora-Infektion nicht angeben können. Diese Werte zeigen, dass ein Teil der Aborte in Rindern in der Provinz Llanquihue durch in Hunden präsentes Neospora verursacht sein könnte. Obwohl es bisher keine Berichte über klinische Fälle gibt, sollte die Krankheit bei der Differentialdiagnose bei Hunden mit neuromuskulären Symptomen berücksichtigt werden. Unter Berücksichtigung der begrenzten Studie wird in dieser Arbeit auch dargestellt, dass diejenigen Tiere, welche in ländlicher Umgebung oder in der Nähe von Ställen leben und/oder sich von Plazentaresten oder rohem Fleisch ernähren, ein größeres Infektionsrisiko besitzen. Der Unterschied der beiden Betriebe war nicht von prozentualer Bedeutung, da im Betrieb A ein Wert von 16% und im Betrieb B ein Wert von 18% gefunden wurde, was zu der Schlussfolgerung führt, dass die Prävalenz in den ländlichen Gebieten der Provinz Llanquihue ähnlich ist. Wichtig sind Präventions- und Kontrollmaßnahmen: Die serologische Untersuchung jeden Tieres, das in den Betrieb eingebracht wird, die Separation der Kühe während der Geburt, um die Hunde daran zu hindern, Plazenta und Wochenfluss zu fressen, und die Testung neuer Hunde, die in die Rindergebiete eingeführt werden. Bisher gibt es kein zugelassenes Produkt für die Behandlung von Neosporose. Die Impfung ist damit die einzige Möglichkeit für Landwirte, um den Rückgang der durch Neospora caninum verursachten Aborte zu erreichen. Diese wird in Chile vertrieben, der Impfstoff ist der einzige in den USA zugelassene Impfstoff zur Bekämpfung dieser parasitären Erkrankung. 7. BIBLIOGRAPHIE Barber, S. Trees, A. (1998). 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Verfügbar unter http://www.sag.gob.cl, abgerufen am 28 November 2012. Tabelle 2: Aborte - Beschwerdenanzahl und keine Reaktion auf Neospora zwischen den Jahren 2006 und 2011. Jahr Anzahl der Beschwerden Anzahl an Labor gesendet Nr (+) Neospora Nr (+) nur Neospora % (+) /Analyse Neospora % nur N.c. positiv 2006 2007 2008 2009 2010 2011 Total 100 115 106 90 157 216 784 88 81 88 63 134 145 599 28 26 23 10 69 68 224 4 6 17 9 56 53 145 31,82 32,1 26,14 15,87 51,49 46,9 37,4 4 5,22 16,04 10 20,67 24,54 18,5 SAG. 2012. Agrarstatistik. Verfügbar unter http://www.sag.gob.cl, abgerufen am 28. November 2012. Abbildung 3: Formular, mit dem die Studie durchgeführt wurde und nachfolgende Ergebnisse analysiert wurden. Name des Betriebs Alter Hundes Name des Besitzers Geschlecht des Hundes Name Hundes Rasse Hundes des positiv Formular (Persönliche Mitteilung). negativ des des Abbildung 4: Schnelltest für Neospora caninum Abbildung 5: Positive und negative Testergebnisse Negativ Positiv