Transkription 3. Teil

Transkription 3. Teil
Posttranskriptionale
Modifikationen
Gliederung des Vortrags
Reifung der t-RNA
Modifikationen der Prä-mRNA
1.
2.
„
„
„
„
„
5‘Capping
3‘Schwanzbildung
RNA-Editing
Spleißen
Alternatives Spleißen
Reifung der t-RNA
„
„
„
„
„
Abspaltung einer 5‘ Leader-Sequenz
Entfernung von Introns durch Spleißen
Substitution am 3‘ Ende (von UU zu CCA)
Modifikation mehrerer weiterer Basen
Zur Entstehung des Endproduktes benötigt
man mehrere Enzyme
Prozessierung eines Vorläufers der
Transfer-RNA
Anheftungsstelle
für Aminosäure
Leader
Prozessierung
Reife tRNA
Frühes Transkript
Herstellung eukaryoter mRNA
„
Ein Käppchen für das 5‘-Ende
„
Ein Schwänzchen für das 3‘-Ende
„
Entfernen der Introns und spleißen der
Exons
Einführung eines 5‘ Caps
I
„
Reaktionsablauf:
-Esterspaltung durch Hydrolyse am 5‘ Ende
- Abspaltung eines Phosphat-Restes
- Diphosphat greift α-Phosphoratom eines GTP
an
Es entsteht eine sehr ungewöhnliche 5‘,5‘Triphosphatbindung, das 5‘Cap
Einführung eines 5‘ Caps
II
„
Weitere Reaktionen:
-Methylierung vom N-Stickstoff des Guanins
durch s-Adenosylmethionin
- Methylierung an den benachbarten Riboseuntereinheiten
Caps am 5‘-Ende
In Cap 0,1 und 2
methyliert
Base
In Cap 1 und 2
methyliert
Base
In Cap 2 methyliert
Funktion der 5‘-Kappe
„
„
„
Erhöht die Stabilität der mRNA durch
Schutz vor Nukleasen und
Phosphatasen
Beteiligung an Initiation der Translation
Unterstützt den Spleißvorgang der
hnRNA
3‘Poly-(A)-Schwanz
I
„
„
„
Am 3‘ Ende
Nach Beendigung der Transkription
- Nicht in der DNA codiert
Poly-A-Ende besteht aus bis zu 250
Adenylateinheiten
3‘Poly-(A)-Schwanz
II
„
„
„
„
Reaktionsablauf:
Erkennung des spezifischen Signals AAUAAA
für die Anheftung durch Endonukleasen
meist nicht das Ende des primären Transkript
Anfügen des Poly-(A)-Schwanzes
„
Durch Polyadenylatpolymerase unter Verbrauch
von ATP
Polyadenylierung eines
Primärtranskripts
DNA-Matrize
Entstehende RNA
Spaltungssignal
Spaltung durch
spezifische Endonuklease
Anfügen des Schwanzes
durch Poly-(A)-Polymerase
Polyadenylierter mRNA-Vorläufer
Funktion des 3‘Poly-(A)Schwanzes
„
„
„
„
Funktion noch nicht abschließend
geklärt
Stabilisierung der mRNA
Unterstützung des
nukleozytoplasmatischen Transports
Steigerung der Effizienz der Translation
Versuche zur Funktion des
3‘Poly-(A)-Schwanzes
„
Durch Hemmung der Poly-A-Polymerase
mit 3‘-Desoxyadenosin
„
„
„
Synthese des Primärtranskripts wird nicht
beeinträchtigt
problemloser Transport der mRNA aus
dem Zellkern
weniger effiziente Translation
mRNA-Editing
„
Änderungen in der mRNA, die nicht
durch Spleißen zustande kommen,
sondern durch Veränderungen der
Nukleotidsequenz nach ihrer Synthese
Die DNA ist nicht das einzige für die
Proteinbiosynthese determinierende Element
mRNA-Editing am Beispiel des
Apolipoprotein B (ApoB)
„
„
Verhüllt zu transportierende
Lipoproteinpartikel
Es existieren zwei verschiedene Typen:
„
Typ 1: ApoB-100
„
„
4536 Reste
Transportiert in der Leber endogen gebildete Lipide
Typ 2: ApoB-48
„
512 kd
240 kd
2152 Reste
Transportiert im Dünndarm Lipide aus der Nahrung
Ablauf der mRNA-Editierung
„
Ein spezielles Cytidin der mRNA wird
zum Uridin desaminiert
das Codon für den Rest 2153 wird von
CAA (GLN) zu UAA, einem Stoppsignal,
verändert
„
Diese Desaminase befindet sich im
Dünndarm, jedoch nicht in der Leber
RNA-Editing
Zusammenbau des
Lipoproteins
Bindung an LDLRezeptor
Unedidierte mRNA
RNA-Editing durch
Desaminierung
Editierte mRNA
Das Spleißen
„
„
„
Spleißen beschreibt das Verbinden der
Exons miteinander, nachdem die
Introns (50-10000 Nukleotide)
herausgeschnitten wurden
Sehr hohe Genauigkeit erforderlich
Findet nur bei Eukaryoten statt
Spleißsignale für präzises
Spleißen
„
„
Die Basensequenz eines Introns beginnt
mit GU und endet mit AG
Zusätzlich existiert eine wichtige interne
Stelle, die zwischen 20 und 50
Nucleotide stromaufwärts von der
Verzweigungsstelle
3‘Spleißstelle liegt
5‘-Spleißstelle
Verzweigungsstelle
3‘-Spleißstelle
Spleißdefekte
„
Mutationsbedingte Veränderungen von
Spleißstellen sind die Ursache für ca. 15%
aller genetisch bedingten Krankheiten
„
„
„
z.B. Formen der Thalassämie (erbliche
Blutkrankheiten) mit Defekten in der
Hämoglobinsynthese
Ursache ist die Mutation einer einzigen Base von A
zu G
Erzeugung einer neuen 3‘-Spleißstelle
Chemischer Ablauf des Spleißens
I
„
„
„
Spaltung der Phosphordiesterbindung
zwischen 3‘Ende des Exons 1 und 5‘Spleißstelle des Introns
Angriff durch 2‘OH-gruppe eines
Adenylatrestes der Verzweigungsstelle
Entstehung einer 2‘,5‘Phosphordiesterbindung zwischen 2‘Adenylat-Rest und 5‘-Ende des Intron
„
Charakteristische intermediäre Lassostruktur
Entstehung der intermediären
Lassostruktur
3‘Spleißstelle
5‘-Spleißstelle
Vorläufer
Intermediäre
Lassostruktur
Chemischer Ablauf des Spleißens
II
„
„
„
„
Die freigewordene OH-Gruppe am 3‘-Ende
des Exons 1 greift nun die
Phosphordiesterbindung zw. Exon 2 und
Intron an
Exon 1 und 2 verbinden sich
Das Intron wird in Lassostruktur freigesetzt
Die Anzahl der Phosphordiesterbindungen
bleibt während dieser Schritte gleich
kein Verbrauch von ATP oder GTP
Der Spleißmechanismus von intermediären
Lassostruktur
Intermediäre
Lassostruktur
Gespleißtes Lassostruktur des
Introns
Produkt
Zusammenfassung hinsichtlich
der Chemie
Es handelt sich um zwei
Umesterungen:
„
1.
2.
Erzeugung der freien 3‘-OH-Gruppe am Exon 1
Verbindung dieser Gruppe mit dem 5‘-Phosphat
von Exon 2
„
Bildung einer intermediären
Lassostruktur
…
Kein Bedarf an Energiezufuhr
Katalyse des Spleißens
„
„
Das katalysierende Enzym ist ein
Multienzymkomplex
Das Spleißosom
Bestandteile des Spleißosoms:
1.
2.
3.
snRNA‘s (small nuclear RNA)
Spleißfaktoren (z.B. Proteine)
Vorläufer der mRNA
Vollständiges
Spleißosom
snRNA‘s
„
Kleine Zell-RNA‘s
„
„
„
„
Aufgebaut aus kleinen Nukleotidketten, nicht
größer als 300 Bp
In ihrer Sekundärstruktur sehr einheitlich
Unterteilung in Untereinheiten (U1; U2; U4; U5;
U6)
Assimiliert mit bestimmten Proteinen zu Snurps (=
small nuclear ribonucleoprotein particles)
Initiation des Spleißosoms
I
„
„
Erkennung der 5‘-Spleißstelle durch U1-snRNP
Bindung an die 5‘-Spleißstelle durch U1snRNP
„
„
Bindung über Basenpaarung
Initiation für den Aufbau des Spleißosoms
mRNA-Vorläufer
Initiation des Spleißosoms
II
„
Anlagerung der U2-snRNP‘s an die
Verzweigungsstelle in dem Intron
„
„
„
Basenpaarung zwischen der stark konservierten
Sequenz der U2-snRNA und der prä-mRNA
Anlagerung unter Verbrauch von ATP
Addition einer zuvor gebildeten Komplex aus
U4, U5 und U6
„
Verbrauch von ATP
Das Spleißosom ist fertig
Zusammenbau des Spleißosoms
Verzweigungsstelle
Vorläufer-mRNA
Vollständiges Spleißosom
Funktion des Spleißosoms
I
„
„
U5-Einheit tritt mit beiden Exonsequenzen
(sowohl 3‘ als auch 5‘) in Wechselwirkung
U6 löst sich von U4 mit anschließender
intramolekularer Umlagerung von U6
„
„
Dies ermöglicht Basenpaarung mit U2
Anlagerung an U2
„
„
U1 wird verdrängt
Helix aus U6 und U2 ist unentbehrlich und bildet
wahrscheinlich das katalytische Zentrum
Das katalytische Zentrum beim
Spleißen
Vorläufer-mRNA
Funktion des Spleißosoms
II
„
„
Diese Umordnungen führen zur ersten
Umesterungsreaktion (Lassostruktur; 5‘Exon))
Das U4-snRNP dient als Inhibitor der
U6-snRNP:
„
es bindet U6 solange bis die spezifischen
Spleißstellen richtig angeordnet sind
Funktion des Spleißosoms
III
„
„
„
„
Die zweite Umesterung wird durch weitere
Umordnung der RNA im Spleißosom
begünstigt
Das freie 5‘-Ende des Exon 1 wird so
zurechtgelegt, dass es neben dem 3‘-Ende
des Exon 2 zu liegen kommt
Es kommt zum nucleophilen Angriff und
Vereinigung von Exon 1 und 2
Nach Abspaltung der restlichen snRNA‘s ist
das Spleißen abgeschlossen
Kurzer Rückblick
„
Viele Schritte verbrauchen ATP
„
„
z.B. die Umlagerungen, weil durch ATPabhängige RNA-Helicasen die RNA erst
entwunden werden muss
RNA-Moleküle spielen eine wichtige
Schlüsselrolle beim richtigen Anordnen
und bei der Katalyse
Alternatives Spleißen
I
„
„
Weitere Möglichkeit, um aus einen
hnRNA-Transkript unterschiedliche
Proteine herzustellen
Herausschneiden von Introns und
Exons
Alternatives Spleißen mit 2 Exonalternativen
2A und 2B
Prä-mRNA
Ende