BPZ - Immunolab GmbH

Arbeitsanleitung
Masern IgA ELISA
Enzymimmunoassay auf Mikrotiterbasis
zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung
von humanen IgA-Antikörpern gegen Masern-Virus
in Serum und Plasma
Kat.-Nr.:
ILE-MAS02
Lagerung: 2-8°C
Nur für in-vitro Diagnostik
Mai 2013
IMMUNOLAB GmbH, Otto-Hahn-Str. 16, D-34123 Kassel
Tel: +561 491742-0, Fax: +561 491742-20, E-Mail: [email protected]
Inhaltsverzeichnis
Seite
1. Verwendungszweck
2. Klinische Bedeutung
3. Testprinzip
4. Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen
5. Inhalt des Testbestecks
6. Erforderliche Geräte und Hilfsmittel
7. Gewinnung, Vorbereitung und Aufbewahrung der Proben
8. Testdurchführung
9. Auswertung
10. Testcharakteristika
11. Literatur
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6
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8
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Symbole und Übersetzungen /
Symbols and Translations
Symbol
English
French
German
Italian
Spanish
Greek
CAL
Calibrator
Etalon
Kalibrator
Calibratore
Calibrador
Conjugate
Conjugué
Konjugat
Coniugato
Conjugado
Πρότυπο
Διάλυμα
Διάλυμα
Συμπλόκου
CONC
Concentrate
(<n>-fold)
Concentré
(<n> fois)
Konzentrat
(<n>-fach)
Concentrato
(<n>-volte)
Concentrado
(<n>-veces)
SAMP DIL
Sample
Diluent
Diluant
échantillon
Probenverdünner
Diluente del
campione
Diluyente de
muestra
Stop
Solution
Solution
d’arrêt
Stopp-Lösung
STOP
Soluzione
d’arresto
Solución de
parada
Substrate
Substrat
Substrat
Substrato
Sustrato
Microtiter
plate
Microplaque
Mikrotiterplatte
Piastre
Placa
microtiter
Wash buffer
Tampon de
lavage
Waschpuffer
Soluzione
di lavaggio
Tampón de
lavado
CONJ
SUBS
MT PLATE
WASH BUF
-2-
Συμπύκνωσ
η (<n>
φορές)
Διάλυμα
Αραίωσης
Δειγμάτων
Διάλυμα
Αναστολής
Διάλυμα
Υποστρώ
ματος
Μικρόπλακα
Πλυστικό
Διάλυμα
ILE-MAS02_de
1. Verwendungszweck
Der Masern-IgA-ELISA dient dem Nachweis und der quantitativen Bestimmung von humanen IgAAntikörpern gegen Masern im Serum oder Plasma ohne vorhergehende Extraktion. Weitere
Anwendungen in anderen Körperflüssigkeiten sind möglich und können beim Technischen Service
von IMMUNOLAB erfragt werden.
Laborergebnisse können nie allein die Grundlage eines medizinischen Befundes bilden. Es
müssen immer das klinische Bild sowie weitere Untersuchungen mit berücksichtigt werden.
2. Klinische Bedeutung
Masern stellen eine stark ansteckende Viruserkrankung dar, die klinisch durch ein ausgeprägtes
prodromales Fieber, Schnupfen, Konjunktivitis, Husten und ein pathognomisches Exanthem
(Koplik`sche Flecken) gekennzeichnet ist. Die Krankheit entsteht durch eine Infektion mit dem
Masernvirus, das zu dem Genus Morbillivirus und der Familie Paramyxoviridae gehört.
Zehn bis zwölf Tage nach der Infektion erscheinen die sehr deutlichen und charakteristischen prodromalen Symptome: Schnupfen, persistierender „bellender“ Husten, Keratokonjunktivitis, oft
verbunden mit Photophobie und Fieber. Im allgemeinen treten auch Lymphadenopathie und
Splenomegalie auf. Während dieser Phase erscheinen Koplik`sche Flecken auf der
Wangenschleimhaut, die sich schnell ausbreiten. Diese Flecken sind in der Regel verschwunden,
wenn die Hautrötung ihren Höhepunkt erreicht. Die Hautrötung tritt nach einem 3 - 5 tägigen
Prodromalstadium auf, etwa 14 Tage nach der Ansteckung. Der Ausschlag entwickelt sich
makulopapulär und breitet sich innerhalb der nächsten 3 Tage schnell über Gesicht, Hals, Rumpf
und Extremitäten aus. Auf dem Höhepunkt zeigt sich eine tiefrote Farbe, die mit einem Ödem der
Haut assoziiert werden kann. Komplikationen bei Masern können eine Folge der Virusreplikation
oder von sekundären bakteriellen Infektionen sein. Die häufigsten Komplikationen sind: Otitis
media, Pneumonie und Enzephalitis. Masern sind bei jüngeren oder unterernährten Kindern
ausgeprägter; hier treten auch hämorrhagische Bilder mit 5 % bis 10 % an letalen Fällen auf.
Bei Menschen, die mit dem inaktivierten Virus geimpft wurden (vor 1968), können die Infektionen
die folgenden schweren Folgen haben: Pneumonie, periphere Ödeme, Pleuralerguss und
atypische Rötung. Masern sind eine der ansteckendsten Infektionskrankheiten. Das Virus breitet
sich über Tröpfchen aus dem Respirationstrakt von infizierten Personen oder durch direkten
Kontakt aus. Das Vorkommen von Masern hat seit der Einführung von Impfprogrammen
abgenommen.
Der Vorteil der ELISA Methode beruht auf der Möglichkeit, die verschiedenen
Immunglobulinklassen IgG, IgA und IgM getrennt nachzuweisen, womit eine eindeutige Zuordnung
zu einer frischen oder einer abgelaufenen Infektion möglich wird.
3. Testprinzip
Der IMMUNOLAB Masern-IgA-Antikörper-Test basiert auf dem Prinzip des Enzymimmunoassays
(EIA). Auf der Oberfläche der Mikrotiterstreifen ist Masern-Antigen gebunden. Verdünntes
Patientenserum bzw. gebrauchsfertige Standards werden in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte
gegeben. Es findet eine Bindung zwischen den IgA-Antikörpern aus dem Serum und dem
immobilisierten Masern-Antigen statt. Nach einer einstündigen Inkubation bei Raumtemperatur
wird die Platte mit verdünnter Waschlösung gewaschen, um nichtgebundenes Material zu
entfernen. Danach wird gebrauchsfertiges Anti-human-IgA-Peroxidase Konjugat zugegeben und
30 Minuten inkubiert. Nach einem weiteren Waschschritt wird eine Substratlösung (TMB) pipettiert
und 20 Minuten inkubiert, wodurch in den Vertiefungen ein blauer Farbstoff entsteht. Die
Farbentwicklung wird durch Zugabe einer Stopp-Lösung beendet, wobei ein Farbumschlag von
blau nach gelb stattfindet. Die resultierende Farbe wird spektrophotometrisch bei 450 nm
gemessen. Die Konzentration der IgA-Antikörper ist der Intensität der Färbung direkt proportional.
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4. Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen
 Nur für in-vitro Anwendung! Nicht schlucken oder einnehmen! Die laborüblichen Sicherheitsvorschriften sowie die Verbote von Essen, Trinken und Rauchen im Labor sind zu beachten.
 Alle Seren oder Plasmen oder darauf basierenden Puffer wurden nach anerkannten Methoden
auf HBsAg, HIV und HCV getestet und dabei als negativ befunden. Trotzdem sollten
Vorsichtsmaßnahmen wie die Benutzung von Latexhandschuhen ergriffen werden.
 Serum- und Reagenzienreste sollten mit einer desinfizierenden Lösung (z.B. Natriumhypochlorit, 5 %) aufgewischt und vorschriftsgemäß entsorgt werden.
 Alle Reagenzien müssen vor der Testdurchführung auf Raumtemperatur (18 - 25°C) gebracht
werden.
 Vor dem Pipettieren sollten alle Reagenzien durch leichtes Kippen oder Schwenken gemischt
werden. Heftiges Schütteln mit Schaumbildung sollte vermieden werden.
 Wichtig ist die Einhaltung des Zeittaktes beim Pipettieren, so dass alle Ansätze in den
Vertiefungen der Mikrotiterplatte den gleichen Bedingungen unterliegen.
 Bei der Entnahme der Reagenzien aus den Flaschen ist darauf zu achten, dass die Stopfen
nicht kontaminiert werden. Außerdem ist auf eine mögliche Verwechslung zu achten. Der Inhalt
der Fläschchen ist in der Regel oxidationsempfindlich, so dass sie nur für kurze Zeit geöffnet
werden sollten.
 Zur Vermeidung einer Verschleppung oder Kreuzkontamination müssen separate EinmalPipettenspitzen verwendet werden.
 Alle Reagenzien sind innerhalb der Verfallszeit zu benutzen.
 In Übereinstimmung mit einer guten Laborpraxis (GLP) bzw. nach ISO9001 sollten regelmäßig
alle verwendeten Laborgeräte auf Richtigkeit und Präzision überprüft werden. Dies betrifft u.a.
Mikroliterpipetten sowie Wasch- und Messgeräte (ELISA-Reader).
 Der Kontakt vor allem der Stopp-Lösung und des Substrats mit Haut, Auge und Schleimhäuten
ist zu vermeiden, da mögliche Reizungen, Verätzungen oder Vergiftungsgefahr bestehen.
5. Inhalt des Testbestecks
Komponenten
Masern-Antigen beschichtete Mikrotiterstreifen
Kalibrator A (Negative Kontrolle)
Kalibrator B (Cut-Off Standard)
Kalibrator C (Schwach Positive Kontrolle)
Kalibrator D (Positive Kontrolle)
Anti-human-IgA-Enzymkonjugat
Substratlösung
Stopp-Lösung
Probenverdünner
Waschpuffer (10)
Plastikfolien
Plastikbeutel
Volumen / Menge
12
2 mL
2 mL
2 mL
2 mL
15 mL
15 mL
15 mL
60 mL
60 mL
2
1
Lagerung und Aufbrauchsfristen (Angabe der Verfallsdaten auf den Etiketten)
Lagern Sie die Komponenten des Kits bei 2-8C. Nach dem Gebrauch sollten die Platten verpackt,
die Flaschen mit den zugehörigen Deckeln verschlossen und das Kit wieder bei 2-8C gelagert
werden. Der angebrochene Kit sollte innerhalb von drei Monaten verbraucht werden.
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Produktübergreifende Reagenzien
Waschpuffer, Substrat und Stopp-Lösung sind für alle infektionsserologischen Testkits von
IMMUNOLAB mit Peroxidase als Nachweisenzym identisch und können zwischen Produkten und
Chargen ausgetauscht werden. Alle weiteren Reagenzien sind einer bestimmten Kitcharge
zugeordnet und dürfen nicht miteinander vermischt werden.
5.1. Mikrotiterstreifen
12 Streifen mit je 8 abbrechbaren Vertiefungen, beschichtet mit Masern-Antigen (Stamm
Edmonston (ATCC VR-24)). Gebrauchsfertig.
5.2. Kalibrator A (Negative Kontrolle)
2 mL, menschliches mit PBS verdünntes Serum, enthält keine Antikörper gegen Masern. Zusatz
von 0,01 % Methylisothiazolon und 0,01 % Bromonitrodioxan. Gebrauchsfertig.
5.3. Kalibrator B (Cut-Off-Standard)
2 mL, menschliches mit PBS verdünntes Serum, mit niedriger Konzentration an IgA-Antikörpern
gegen Masern. Zusatz von 0,01 % Methylisothiazolon und 0,01 % Bromonitrodioxan. Gebrauchsfertig.
5.4. Kalibrator C (Schwach Positive Kontrolle)
2 mL, menschliches mit PBS verdünntes Serum, mit mittlerer Konzentration an IgA-Antikörpern
gegen Masern. Zusatz von 0,01 % Methylisothiazolon und 0,01 % Bromonitrodioxan. Gebrauchsfertig.
5.5. Kalibrator D (Positive Kontrolle)
2 mL, menschliches mit PBS verdünntes Serum, mit hoher Konzentration an IgA-Antikörpern
gegen Masern. Zusatz von 0,01 % Methylisothiazolon und 0,01 % Bromonitrodioxan. Gebrauchsfertig.
5.6. Anti-human-IgA-Enzymkonjugat
15 mL, Anti-human-IgA-POD (Kaninchen), in proteinhaltiger Pufferlösung. Zusatz von 0,01 %
Methylisothiazolon, 0,01 % Bromonitrodioxan und 5 mg/l ProclinTM. Gebrauchsfertig.
5.7. Substratlösung
15 mL, TMB (Tetramethylbenzidin). Gebrauchsfertig.
5.8. Stopp-Lösung
15 mL, 0,5 M Schwefelsäure. Gebrauchsfertig.
5.9. Probenverdünner
60 mL, PBS/BSA Puffer. Zusatz von 0,095 % Natriumazid. Gebrauchsfertig.
5.10. Waschpuffer
60 mL, PBS + Tween 20, als 10x Konzentrat. Gebrauchslösung: 1+9 mit dest. Wasser verdünnen.
Falls bei der gekühlten Lagerung Kristalle ausfallen sollten, das Konzentrat 15 Minuten im
Wasserbad (37°C) erwärmen.
5.11. Plastikfolien
2 Stück zur Abdeckung der Mikrotiterplatten während der Inkubation.
5.12. Plastikbeutel
Verschließbar, für die trockene Lagerung der nichtbenutzten Streifen.
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6. Erforderliche Geräte und Hilfsmittel
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
5 µL-, 100 µL- und 500 µL-Mikro- bzw. Mehrkanalpipetten
Mikrotiterplatten-Photometer (450 nm)
Mikrotiterplatten-Waschgerät
Reagenzgläser für die Serumverdünnung
Bidestilliertes Wasser
7. Gewinnung, Vorbereitung und Aufbewahrung der Proben
Grundsätzlich kann für die Bestimmung Serum oder Plasma (EDTA, Heparin) verwendet werden.
Aus dem aseptisch durch Venenpunktion gewonnenen Blut wird nach der Gerinnung das Serum
durch Zentrifugation abgetrennt. Die Serum- bzw. Plasma-Proben sind bis zu 7 Tagen gekühlt (28°C) haltbar; bei längerer Aufbewahrung sollten sie bei -20°C gelagert werden. Die Proben sollten
nicht mehrmals eingefroren und aufgetaut werden. Lipämische, hämolytische, oder bakteriell
kontaminierte Proben können zu falsch-positiven oder falsch-negativen Ergebnissen führen.
Für die Durchführung des Tests werden die Proben (nicht die Standards) mit gebrauchsfertigem
Probenverdünner 1:101 verdünnt (z.B. 5 µL Serum + 500 µL Probenverdünner).
8. Testdurchführung
8.1. Vorbereitung der Reagenzien
Waschlösung: vor der Benutzung 1:10 (1+9) mit bidest. Wasser verdünnen. Falls bei der
gekühlten Lagerung Kristalle ausfallen sollten, das Konzentrat 15 Minuten im Wasserbad (37°C)
erwärmen.

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

Die Reihenfolge der Pipettierschritte muss strikt eingehalten werden.
Vor dem Pipettieren müssen die Reagenzien auf Raumtemperatur gebracht werden.
Mit jedem Test muss eine Standardkurve erstellt werden.
Nicht benötigte Antigen-beschichtete Mikrotiterstreifen sofort nach Entnahme der erforderlichen
Menge wieder im verschließbaren Beutel mit Trockenmittel in den Kühlschrank stellen.
8.2. Einzelne Assay-Schritte
1. Für die Standards und die Proben sowie für einen Substratleerwert eine ausreichende Anzahl
an Mikrotitervertiefungen vorbereiten.
2. Je 100 µL der verdünnten (1:101) Proben bzw. der gebrauchsfertigen Standards in die
Vertiefungen pipettieren. Eine Vertiefung für den Substrat-Leerwert freilassen.
3. Platte mit der beiliegenden Folie abdecken und bei Raumtemperatur 60 Minuten inkubieren.
4. Vertiefungen der Platte entleeren (auskippen oder absaugen) und 300 µL endverdünnte
Waschlösung dazugeben. Dieser Vorgang wird insgesamt dreimal durchgeführt.
Waschpufferreste werden anschließend durch leichtes Ausschlagen der Mikrotiterplatte auf
einem Zellstofftuch entfernt.
5. Je 100 µL des gebrauchsfertigen Konjugats in die Vertiefungen geben. Eine Vertiefung für den
Substrat-Leerwert freilassen.
6. Platte mit der beiliegenden Folie abdecken und bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubieren.
7. Vertiefungen der Platte entleeren (auskippen oder absaugen) und 300 µL endverdünnte
Waschlösung dazugeben. Dieser Vorgang wird insgesamt dreimal durchgeführt.
Waschpufferreste werden anschließend durch leichtes Ausschlagen der Mikrotiterplatte auf
einem Zellstofftuch entfernt.
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8. Je 100 µL des gebrauchsfertigen Substrats in die Vertiefungen geben. Diesmal auch den Substrat-Leerwert pipettieren.
9. Platte mit der beiliegenden Folie abdecken und bei Raumtemperatur im Dunkeln (z.B. Schublade) 20 Minuten inkubieren.
10. Zur Beendigung der Substratreaktion je 100 µL der gebrauchsfertigen Stopp-Lösung in die
Vertiefungen geben. Auch den Substrat-Leerwert pipettieren.
11. Nach sorgfältigem Mischen und Abwischen des Plattenbodens erfolgt die Messung der Extinktion bei 450 nm (evtl. Referenzwellenlänge 620 nm). Die Farbe ist maximal 60 Minuten stabil.
9. Auswertung
Beispiel
Substrat-Leerwert
Negativ-Kontrolle
Cut-Off Standard
schwach Positiv-Kontrolle
Positiv-Kontrolle
Messwerte (OD)
0,011
0,029
0,517
1,198
2,402
korr. Messwerte (OD)
0,018
0,506
1,187
2,391
Es handelt sich um ein Beispiel, das unter zufälligen Temperatur- und Umgebungsbedingungen
erstellt wurde. Die obige Tabelle enthält demnach keine Sollwerte, die in anderen Laboratorien
in gleicher Art wiedergefunden werden müssen.
9.1. Qualitative Auswertung
Die o.g. berechneten Extinktionen für die Patientenproben werden mit dem Wert für den Cut-Off
Standard verglichen. Liegt das Ergebnis der Probe höher, handelt es sich um ein positives
Resultat. Bei einem Wert unterhalb des Cut-Off Standards liegt ein negatives Resultat vor. Es hat
sich als sinnvoll erwiesen, einen Bereich von +/- 20% um den Wert des Cut-Offs als Grauzone zu
definieren. Liegt ein solcher Fall vor, ist eine Wiederholung des Tests mit dem gleichen Serum
oder mit einer nach 2-4 Wochen neu abgenommenen Probe des Patienten zu empfehlen. Beide
Proben sollten parallel in einem Testansatz gemessen werden.
Die positive Kontrolle muss mindestens die doppelte Extinktion verglichen mit dem Cut-Off
Standard zeigen.
9.2. Quantitative Auswertung
Die gebrauchsfertigen Standards und Kontrollen des Masern IgA Antikörper-Kits sind auf Units
(U/mL) eingestellt worden. Dies ermöglicht eine exakte und reproduzierbare quantitative Auswertung. Auch Verlaufskontrollen für einen gegebenen Patienten sind hiermit möglich. Die Werte für
Kontrollen und Standards sind auf den Etiketten der Fläschchen angegeben.
Zur Auswertung werden die Extinktionen der Standards bzw. Kontrollen gegen ihre Konzentrationen Punkt-zu-Punkt graphisch aufgetragen. Aus der resultierenden Eichkurve kann dann für die
Extinktion jeder Patientenprobe das entsprechende Konzentrations-Ergebnis abgelesen werden.
Es können auch automatische Rechnerprogramme eingesetzt werden. Hierbei sollte als
Kurvenfitting Punkt-zu-Punkt eingestellt werden.
Kalibrator B mit einer Konzentration von 10 U/ml fungiert als Cut-Off Standard. Analog zur
qualitativen Auswertung wird ein Bereich von +/- 20% um den Wert des Cut-Offs als Grauzone
definiert. Folglich werden Resultate zwischen 8 und 12 U/ml als grenzwertig befundet.
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10. Testcharakteristika
Masern ELISA
IgG
IgA
IgM
Intra-Assay-Präzision
11,2 %
8,8 %
7,0 %
Inter-Assay-Präzision
13,6 %
9,3 %
8,7 %
6,9 – 15,8 %
2,7 – 12,2 %
5,5 – 13,4 %
Analytische Sensitivität
1,35 U/mL
1,15 U/mL
1,07 U/mL
Wiederfindung
85 – 94 %
94 – 117 %
117 – 135 %
100 – 106 %
75 – 129 %
95 – 136 %
Inter-Lot-Präzision
Linearität
Kreuzreaktivität
Keine Kreuzreaktivität gegen Mumps und Varizella zoster
Interferenzen
Keine Interferenzen mit Bilirubin bis zu 0,3 mg/mL, Hämoglobin bis zu
8,0 mg/mL und Triglyzeriden bis zu 5,0 mg/mL
Klinische Spezifität
100 %
100 %
100 %
Klinische Sensitivität
98 %
100 %
100 %
11. Literatur
1. Altintas DU et al: The modification in measles vaccination age as a consequence of the earlier
decline of transplacentally transferred anti-measles antibodies in Turkish infants. Eur J
Epidemiol 1996 Dec; 12(6):647-8.
2. Bayas JM et al.: Susceptibility to measles, rubella and parotitis in young adults. Med Clin (Barc)
1996 Apr 20; 106(15): 561-4.
3. Bouche F et al.: Immunosorbent assay based on recombinant hemagglutinin protein produced
in a high-efficiency mammalian expression system for surveillance of measles immunity. J Clin
Microbiol 1998 Mar; 36(3):721-6.
4. Chiu HH et al.: Seroepidemiological study of measles after the 1992 nationwide MMR
revaccination program in Taiwan. J Med Virol 1997 Jan; 51(1):32-5.
5. Dagan R et al.: Decay of maternally derived measles antibody in a highly vaccinated population
in southern Israel. Pediatr Infect Dis J 1995 Nov; 14(11): 965-9.
6. De Souza VA et. al.: Enzyme-linked immunosorbent assay-IgG antibody avidity test for single
sample serologic evaluation of measles vaccines. J Med Virol 1997 July; 52(3):275-9.
7. Duvdevani P et al.: Determination of immunity to measles virus in young adults: comparative
evaluation of a commercial enzyme immunoassay and the hemagglutination inhibition
techniques. Clin Diagn Virol 1996 Oct; 7(1):1-6.
8. Johnson CE et al.: Antibody persistence after primary measles-mumps-rubella vaccine and
response to a second dose given at four to six vs. eleven to thirteen years. Pediatr Infect Dis J
1996 Aug; 15(8):687-92.
9. King SM et al.: Response to measles, mumps and rubella vaccine in paediatric bone marrow
transplant recipients. Bone Marrow Transplant 1996 Apr; 17(4):633-6.
10. Matter L et al.: Age-stratified seroprevalence of measles, mumps and rubella (MMR) virus
infections in Switzerland after the introduction of MMR mass vaccination. Eur J Epidemiol 1997
Jan; 13(1):61-6.
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