Kudlinzki Denis Diplomarbei - Institut für Mikrobiologie und Genetik

Klonierung, Aufreinigung und
Kristallisation von 2-Thiouridinsynthetase
aus Thermotoga maritima
Diplomarbeit
vorgelegt von
Denis Kudlinzki
aus
Mühlhausen/Thüringen
angefertigt
im Institut für Mikrobiologie und Genetik an der biologischen Fakultät
der Georg-August-Universität zu Göttingen
2004
Referent:
Prof. Dr. Ralf Ficner
Korreferent:
Prof. Dr. Oliver Einsle
Tag der Abgabe der Diplomarbeit:
27. August 2004
Letzter Tag der mündlichen Diplomprüfung:
13. November 2003
Danksagungen
Achim Dickmanns
für seine Hilfestellungen bei methodischen Problemen
Ralf Ficner
für die gute Betreuung und seine Kompetenz bei fachlichen Fragen
Oliver Einsle
für sein offenes Ohr bei wissenschaftlichen Problemen
Winfried Lendeckel für sein Organisationstalent in kritischen Situationen
Marion Kutscher
eigentlich für alles
gewidmet meinen Eltern Monika und Jürgen Kudlinzki.
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1.
Einleitung
1
1.1
Die Transfer-RNA - Struktur und Funktion
1
1.2
Modifikationen von Transfer-RNAs
5
1.2.1
Verschiedene Klassen von tRNA-Modifikationen
6
1.2.2
Thionukleoside - Exklusive tRNA-Modifikationen
8
1.3
Die 2-Thiouridinsynthetase MnmA
9
1.3.1
Strukturelle Daten
9
1.3.2
Reaktionszyklus des Schwefeleinbaus
10
1.3.3
2-Thiouridin, Zwischenprodukt in einem komplexerem Syntheseweg
13
1.3.4
Lokalisation und Funktion der 2-Thio-Modifikation
14
1.4
Aufgabenstellung und Zielsetzung
17
2.
Material und Methoden
18
2.1
Materialien
18
2.1.1
Feinchemikalien
18
2.1.2
Enzyme und Inhibitoren
19
2.1.3
Größenstandards
20
2.1.4
Verwendete Organismen
20
2.1.5
Plasmide und Vektoren
21
2.1.6
Primer
21
2.1.7
Reaktionskits
22
2.1.8
Chromatographiesäulen und Säulenmaterial
22
2.1.9
Antibiotika
22
2.1.10
Kristallisationsscreens
22
2.1.11
sonstige Materialien
23
2.1.12
Geräte
23
2.2
Methoden
25
2.2.1
Allgemeine Methoden
25
2.2.1.1
Konzentrationsbestimmung von Proteinproben
25
2.2.1.2
Ankonzentrieren von Proteinlösungen durch Zentrifugation
25
2.2.1.3
Gelelektrophoresen
25
2.2.1.3.1
Diskontinuierliche Polyacrylamid-Gelelektrophorese von Proteinen
(SDS-PAGE)
25
I
Inhaltsverzeichnis
2.2.1.3.2
Agarose-Gelelektrophorese von Nukleinsäuren
28
2.2.1.4
Detektion von Proteinen und Nukleinsäuren
28
2.2.1.4.1
Anfärben von Proteinen mit Coomassie Brilliant Blue
28
2.2.1.4.2
Anfärben von Nukleinsäuren mit Ethidiumbromid
29
2.2.1.4.3
Proteindetektion durch Western-Blot
29
2.2.1.5
DNA-Extraktion aus Agarosegelen
31
2.2.1.6
Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
31
2.2.1.7
Trocknen von Polyacrylamidgelen
32
2.2.2
Molekularbiologische Methoden
32
2.2.2.1
Klonierung von Proteinen in Expressionsvektoren
32
2.2.2.1.1
DNA-Amplifizierung durch die Polymerasekettenreaktion (PCR)
33
2.2.2.1.2
Spaltung von DNA durch Restriktionsendonukleasen
35
2.2.2.1.3
Ligation eines verdauten DNA-Fragments in einen Zielvektor
durch DNA-Ligasen
35
2.2.2.2
Sequenzierung von DNA-Fragmenten
36
2.2.2.3
Plasmidpräparationen
37
2.2.2.3.1
Plasmidpräparation im kleinen Maßstab
37
2.2.2.3.2
Plasmidpräparation im mittleren Maßstab
37
2.2.3
Zellbiologische Methoden
37
2.2.3.1
Expression von rekombinanten Proteinen in E. coli
37
2.2.3.2
Medien zur Aufzucht von E. coli
38
2.2.3.3
Transformationen in Bakterienstämme
38
2.2.3.3.1
Herstellung chemisch kompetenter E. coli-Zellen
38
2.2.3.3.2
Transformation chemisch kompetenter E. coli-Zellen
39
2.2.3.4
Überexpression von rekombinanten Proteinen in E. coli
40
2.2.3.4.1
Anzucht einer Vorkultur
40
2.2.3.4.2
Anzucht einer Expressionskultur
40
2.2.3.5
Ernten und Aufschließen von E. coli-Zellen
41
2.2.4
Biochemische Methoden
42
2.2.4.1
Chromatographische Trennmethoden
42
2.2.4.1.1
Affinitätschromatographische Aufreinigung von MBPFusionsproteinen über Amylose-Harz
2.2.4.1.2
43
Affinitätschromatographische Aufreinigung von Proteinen
mit Strep-tag II über Strep-Tactin-Sepharose
44
II
Inhaltsverzeichnis
2.2.4.1.3
Anionenaustauschchromatographie über DEAE-Sepharose oder
ResourceQ zur Trennung geladener Proteine
2.2.4.1.4
Kationenaustauschchromatographie über CM-Sepharose,
Source 30S oder ResourceS zur Trennung geladener Proteine
2.2.4.1.5
45
46
Präparative Ausschlusschromatographie zur weiteren
Aufreinigung von Proteinen
47
2.2.4.2
Umpufferung und Entsalzung von Proteinlösungen
47
2.2.4.3
Proteinverdau mit Proteasen
48
2.2.5
Kristallisation von Proteinen
49
2.2.5.1
Kristallisationsansätze
49
2.2.5.2
„Macro-Seeding“ und „Micro-Seeding“ zur Verbesserung
2.2.5.3
Kristallwachstum und Kristallordnung
50
Röntgenbeugungsexperimente
51
3. Ergebnisse
52
3.1
Um- und Neuklonierung von MnmA
52
3.1.1
Umklonierung von MnmA aus pMal-c2x und pET-28a
52
3.1.1.1
Umklonierung von MnmA in pET-28a
52
3.1.1.2
Umklonierung von MnmA in pETM-30
53
3.1.2
Neuklonierung von MnmA aus genomischer DNA von
Thermotoga maritima
54
3.1.2.1
Klonierung von MnmA in pGex-6P1 und pET-28a
54
3.1.2.2
Klonierung von MnmA in pASK-IBA3 und pASK-IBA5
56
3.2
Verschiedene Strategien der Expression und Aufreinigung von MnmA
56
3.2.1
Expression und Aufreinigung von MnmA ohne Affinitätssequenz
58
3.2.1.1
Überexpression in E. coli
58
3.2.1.2
Zellernte und Aufschluss
60
3.2.2
Expression und Aufreinigung des MBP-MnmA-Fusionsproteins
61
3.2.2.1
Überexpression in E. coli
61
3.2.2.2
Zellernte und Aufschluss
62
3.2.2.3
Affinitätschromatographische Aufreinigung über Amylose-Harz
62
3.2.2.4
Ausschlusschromatographische Aufreinigung des Pools
64
3.2.2.5
PreScission Protease-Verdau des MBP-MnmA-Fusionsproteins
65
3.2.2.6
Ionenaustauschchromatographische Aufreinigung des geschnittenen
Fusionsproteins über An- und Kationentauscher
67
III
Inhaltsverzeichnis
3.2.2.7
Ausschlusschromatographische Aufreinigung des geschnittenen
Fusionsproteins
69
3.2.3
Expression und Aufreinigung von MnmA mit Strep-tag II
71
3.2.3.1
Überexpression in E. coli
71
3.2.3.2
Zellernte und Aufschluss
72
3.2.3.3
Affinitätschromatographische Aufreinigung über Strep-Tactin
72
3.2.3.4
Ausschlusschromatographische Aufreinigung
76
3.3
Kristallisation von MnmA
78
3.3.1
Kristallisation des MBP-MnmA-Fusionsproteins
78
3.3.2
Kristallisation von MnmA mit Strep-tag II
81
4. Diskussion
83
4.1
Klonierung von MnmA in Expressionsvektoren
83
4.1.1
Umklonierung von MnmA aus pMal-c2x und pET-28a
84
4.1.2
Neuklonierung von MnmA aus genomischer DNA von T. maritima
85
4.2
Expression und Aufreinigung von MnmA
86
4.2.1
Expression und Aufreinigung von MnmA ohne Affinitätssequenz
86
4.2.2
Expression und Aufreinigung des MBP-MnmA-Fusionsproteins
87
4.2.3
Expression und Aufreinigung von MnmA mit Strep-tag II
89
4.3
Kristallisation von MnmA
90
5. Zusammenfassung
95
6. Literaturverzeichnis
97
Abkürzungsverzeichnis
106
IV
Einleitung
1.
Einleitung
Die Proteinbiosynthese ist der zentrale Stoffwechselweg aller Organismen. Durch sie
wird die genetische Information realisiert. Bei der Transkription von Genen der DNA
wird mRNA gebildet, die die Informationen zur Synthese von Proteinen enthält. Die
Basensequenz der mRNA wird an den Ribosomen durch tRNAs in eine Aminosäuresequenz übersetzt. Diese Translation an den Ribosomen
führt zur Synthese von
Proteinen.
1.1 Die Transfer-RNA - Struktur und Funktion
Die Transfer-RNA (tRNA) ist die Schnittstelle zwischen Nukleinsäure- und Proteinwelt
(Hoagland et al., 1958). In dieser Eigenschaft muss sie so gestaltet sein, dass den
Bedürfnissen
beider
Welten
gerecht
wird.
Die
tRNA
muss
mit
anderen
Ribonukleinsäuren (RNAs) interagieren und auch Aminosäuren binden können (Berg et
al., 2003; Campbell, 1997; Nelson et al., 2001).
Die tRNAs sind kurze RNAs von 73-93 Basen Länge (ca. 25-30 kDa). Ihre
Primärstruktur (Madison, 1968) stellt sich, analog zu anderen RNA-Typen, als ein
einzelsträngiges, unverzweigtes Polymer von Ribosen, die über Phosphodiesterbrücken
zwischen dem dritten und fünften Kohlenstoff kovalent miteinander verknüpft sind, dar.
Am 2. Kohlenstoff der Ribose ist je eine Purin- (Adenin [A] und Guanin [G]) oder
Pyrimidinbase (Uracil [U] und Cytosin [C]) -N-glykosidisch verknüpft (Chargaff et
al., 1955). Zusätzlich enthält die tRNA viele ungewöhnliche Basen, in der Regel
zwischen 7 und 20 je Molekül. Diese modifizierten Basen können methylierte
Basenderivate, z.B. Dihydrouracil (D) (Madison et al., 1965) oder anderweitig
abgewandelte Basen z.B. Pseudouracil (ψ) sein (Cohn, 1958). Die Modifikationen
haben einen Einfluss auf die Interaktion mit Proteinen und anderen RNAs (mRNA,
rRNA), die an der Proteinbiosynthese beteiligt sind.
Heute sind Nukleotidsequenzen von mehr als 1000 verschiedenen tRNAs aus allen drei
Domänen der belebten Welt (Archaea, Bacteria und Eucarya) bekannt. Trotz
Variationen in der Nukleotidsequenz sind verschiedene Regionen, sowie die
Sekundärstruktur bei allen tRNAs konserviert. Die Hälfte der Nukleotide ist durch
Watson-Crick-Basenpaarungen zu Doppelhelices (Stämme) verbunden (Watson et al.,
1953a/b), während die restlichen Nukleotide vier nicht-gepaarte Schleifen bilden.
1
Einleitung
Die möglichen Basenpaarungen falten die t-RNA so, dass eine kleeblattähnliche
Sekundärstruktur (Holley et al., 1965) entsteht (Abbildung 1).
Die gepaarte Duplex-Region am 3'-Ende der tRNA wird als Akzeptorstamm bezeichnet.
Alle tRNAs tragen am 3'-Ende die Nukleotidsequenz CCA-3'OH. Eine Aminosäure
wird durch die Aminoacyl-tRNA-Synthetase immer an das 3'-Ende des Adenosins
angefügt. Die TψC-Schleife setzt sich aus 7 ungepaarten Nukleotiden zusammen und
enthält stets die Nukleotidsequenz TψCG. Diese Schleife tritt durch Interaktion mit der
ribosomalen RNA (rRNA) mit dem Ribosom in Wechselwirkung (Yusopov et al.,
2001). Die Größe der variablen Schleife kann zwischen verschiedenen tRNAs enorm
variieren. Sie spielt bei der Bildung der Tertiärstruktur eine wichtige Rolle. Die
Anticodon-Schleife, die ungefähr in der Mitte der tRNA-Sequenz liegt, besteht aus 7
ungepaarten Nukleotiden, die die drei Basen des Anticodons beinhalten, welches mit
dem Codon der mRNA paart. Die D-Schleife enthält 8 - 12 ungepaarte Nukleotide.
Charakteristisch für diese Schleife ist die modifizierte Base Dihydrouracil. Es ist
bemerkenswert, dass fast alle modifizierten Nukleotide in den Schleifen vorkommen.
Das 5'-Ende der tRNA ist stets einfach phosphoryliert. Das endständige Nukleotid ist
meist ein pG.
Abbildung 1: Kleeblattstruktur (Sekundärstruktur) von tRNAs mit konservierten Nukleotiden
Linear aufgebaute Makromoleküle (Biopolymere) können durch die spezifische
dreidimensionale Faltung zu übergeordneten, räumlichen Strukturen angeordnet
werden, wobei die Primär- und Sekundärstruktur (Konformation) erhalten bleiben.
Besonders gut sind die Tertiärstrukturen einzelner Proteine (Chymotrypsin, Lysozym,
Hämoglobin, Myoglobulin), aber auch von RNA-Molekülen (tRNAs, rRNAs)
2
Einleitung
beschrieben. Die Ausbildung der Tertiärstrukturen erfolgt spontan (Selbstorganisation)
aufgrund
zahlreicher
Brückenbindungen,
intramolekularer
hydrophobe
oder
Wechselwirkungen
ionische
(Wasserstoff-
Wechselwirkungen,
kovalente
Disulfidbrücken). Es kann zu einer Konformationsänderungen bei Allosterie durch
Bindung von Liganden, Substraten oder Rezeptoren kommen.
Die räumliche Anordnung (Tertiärstruktur) der tRNA wurde durch Röntgen-StrukturAnalyse ermittelt (Suddath et al., 1974; Robertus et al., 1974). Durch Verfeinerung der
räumlichen Struktur (Sussman et al., 1978) erkannte man, dass sich durch die Bildung
tertiärer Wasserstoff-Brückenbindungen und andere atomare Wechselwirkungen sich
die L-förmige Tertiärstruktur der tRNA ergibt (Abbildung 2). Es sind zwei
Doppelhelixabschnitte erkennbar, die in der A-Form, wie es für eine RNA-Helix
erwartet wird, vorliegen.
Die Helix mit den beiden RNA-Enden (5'-P & 3'-OH) liegt oberhalb der Helix, die in
der TψC-Schleife endet, sodass sie einen Arm des L bilden. Der D-Stamm, der
Anticodonstamm und die variable Schleife bilden Helices und formen so den anderen
Arm. Auch den nicht-helikalen Abschnitten sind die Basen an WasserstoffBrückenbindungen beteiligt, die allerdings nicht den Watson-Crick-Basenpaarungen
(Abbildung 3) entsprechen. Der Akzeptorstamm und das CCA-Ende mit der
Aminosäurebindungsstelle befinden sich an einem Ende der L-Form. Die 3'Hydroxylgruppe ragt aus der Struktur heraus und kann so leichter mit einer Aminosäure
verknüpft werden. Dieser einzelsträngige Abschnitt kann seine Konformation während
der Aktivierung der Aminosäure und der Proteinsynthese ändern. Die AnticodonSchleife befindet sich am anderen Ende der L-Struktur, so dass die drei Basen des
Anticodons gut zugänglich sind.
Abbildung 2: Bildung der Tertiärstruktur der tRNA: (A) Kleeblattstruktur, (B) Bildung tertiärer
Bindungen zwischen D-Arm und T C-Arm resultiert in der L-Struktur (C). Die Farbmarkierungen zeigen
die Orientierung der verschiedenen Stämme in Sekundär- und Tertiärstruktur (Ishitani et al., 2003).
3
Einleitung
Im Zuge der Translation der genetischen Information fungiert die tRNA als
Aminosäure-Adapter (Hoagland et al., 1958; Chapeville et al., 1962). Es ist somit kein
Zufall, dass dieser Adapter selbst eine RNA ist, da er mit der Boten-RNA (mRNA) in
einer bestimmten sequenziellen Weise in Wechselwirkung treten muss. Dies wird durch
eine komplementäre Region erreicht, bei der Wasserstoff-Brückenbindungen zwischen
Matrize (Codon der mRNA) und Adapter (Anticodon der tRNA) zusammengehalten
werden. Eine Purinbase paart idealerweise mit einer Pyrimidinbase (Elson et al., 1955).
Bei der Paarung von A und U werden zwei und bei G und C werden drei WasserstoffBrückenbindungen ausgebildet (Abbildung 3). Diese Paarungen (A=U und G≡C)
werden auch Watson-Crick-Basenpaarungen genannt (Watson et al., 1953b).
Abbildung 3: Watson-Crick-Basenpaarungen. Zwischen A und U werden 2 und zwischen G und C
werden drei Wasserstoff-Brückenbindungen ausgebildet (Watson et al., 1953b).
C kann nur mit G und A kann nur mit U paaren. Es gibt jedoch auch Ausnahmen von
der Regelung der Watson-Crick-Basenpaarung zwischen Nukleotiden. U kann mit A
oder G und G kann mit U oder C paaren. Der Genetische Code (Abbildung 4) zeigt, dass
drei Nukleotide für eine Aminosäure codieren und ein Codon bilden. Am Ribosom
werden die Codons der mRNA von den komplementären Anticodons der tRNAs
erkannt. Folglich besteht das Anticodon der tRNA aus drei Nukleotiden. Diese drei
Nukleotide haben in der tRNA-Sequenz die Positionen 34, 35 und 36. Der Genetische
Code ist degeneriert, d.h. mehrere Codons codieren für dieselbe Aminosäure. Codons
einer Box (Abbildung 4, weiße Boxen), die für dieselbe Aminosäure codieren und sich
nur durch das letzte Nukleotid unterscheiden, werden meist von isoakzeptierenden
tRNAs abgelesen. Diese tRNAs haben am 5'-Ende des Anticodons (Wobble-Position
34) meist ein desaminiertes Adenin, das Inosin (I). Inosin hat die Fähigkeit mit U, C
oder A über Wasserstoff-Brückenbindungen zu paaren. Dieses Phänomen wird als
Wobble-Hypothese bezeichnet (Crick, 1966). Dadurch muss nicht für jedes einzelne
Codon eine spezielle tRNA synthetisiert werden.
Für jede Aminosäure gibt es mindestens eine tRNA, so dass eine hohe Spezifität bei der
Translation gewährleistet werden kann. Jedem Codon muss die passende Aminosäure
zugeordnet werden, denn falsche Zuordnungen führen zu einem fehlerhaften Protein,
4
Einleitung
dass u.U. keine Aktivität besitzt. Bei einem so energieintensiven Prozess wie der
Translation wäre es für jeden Organismus fatal, sich dabei Fehler zu leisten.
Auch das Beladen der tRNAs mit einer Aminosäure ist ein energieverbrauchender
Prozess. Aminoacyl-tRNA-Synthetasen katalysieren die zwei Reaktionen zum Beladen
einer tRNA. Sie aktivieren die Aminosäure mit ATP, d.h. die Carboxylgruppe der
Aminosäure wird über eine energiereiche Bindung mit dem
-Phosphat von ATP
verknüpft, Pyrophosphat wird freigesetzt und die so aktivierte AS bleibt fest an der
Synthetase gebunden. Bindet eine entsprechende tRNA an die Synthetase, so wird die
aktivierte Aminosäure mit dem 3'-Ende der tRNA verestert. Die Aminoacyl-tRNASynthetase erkennt ihre passende tRNA sehr spezifisch am Anticodon (Fehlerquote
1:10.000) und anderen Strukturmerkmalen (Akzeptorstamm oder variable Schleife). Es
ist sozusagen das Protein. das den genetischen Code kennt.
Abbildung 4: Der Genetische Code. Die Codons der weißen Boxen codieren exklusiv für eine
Aminosäure, während die der grauen Boxen für unterschiedliche Aminosäuren codieren.
1.2 Modifikationen von Transfer-RNAs
Die meisten RNA-Typen weisen unterschiedlichste Modifikationen auf (Limbach et al.,
1994). Die tRNAs besitzen, neben ihrer Struktur, als weiteres charakteristisches
Merkmal eine hohe Bandbreite unterschiedlich modifizierter Nukleotide, die teilweise
ausschließlich in tRNAs vorkommen. Die RNA Modification Database (Rozenski et al.,
1999) weist 86 verschiedene tRNA-Modifikationen aus. Dabei kann sowohl die Ribose
als auch die Base des Nukleotids substituiert oder verändert sein. Jedes einzelne tRNAMolekül kann bis zu 20 modifizierte Nukleotide beinhalten. Einige dieser
5
Einleitung
Modifikationen sind bei allen Spezies konserviert (T C, D), während andere
Modifikationen für einzelne tRNAs höchst spezifisch sind.
Alle tRNAs werden posttranskriptional modifiziert (Johnson et al., 1970; Söll et al.,
1955). Spezielle Enzyme, die einen Anteil von 1% des E. coli-Genoms ausmachen
(Björk et al., 1987), katalysieren diese Veränderungen. Da tRNAs mit einer Vielzahl
von
Proteinen
und
RNAs
wechselwirken,
haben
die
Modifikationen
sehr
unterschiedliche Funktionen.
Sie haben direkten Einfluss auf die Proteinbiosynthese und können z.B. die
Translationseffizienz steigern, die Wahl des richtigen Codons verbessern, den Verlauf
des Leserahmens stabilisieren oder die Erkennung der tRNA durch ihre AminoacyltRNA-Synthetase erleichtern.
1.2.1 Verschiedene Klassen von tRNA-Modifikationen
Wie angesprochen verfügen tRNAs über ein breites Spektrum verschiedenster
Modifikationen. Das reicht von einfachen Methylierungen, über eine Desaminierung bis
hin zum kompletten Basenaustausch. Modifikationsgrad und -komplexität erhöhen sich
mit aufsteigender Entwicklung und Differenzierung der Organismen von Archaea über
Prokaryoten (Bakterien) bis zu den Eukaryoten (Abbildung 5). Dies macht auch Sinn, da
Größe und Informationsgehalt des Genoms ebenfalls ansteigen. Bei höher
differenzierten Organismen muss die Expression in verschieden Zellkompartimenten
gesteuert werden. Beispielsweise besitzen Mitochondrien eigene tRNAs mit
Modifikationen, die auf die Proteinbiosynthese mitochondrialer Proteine abgestimmt
sind (Kaneko et al., 2003).
Methylierungen von Basen oder Ribosen sind die häufigste Art der tRNA-Modifikation.
Aber auch mehrfach substituerte Nukleotide oder völlig neue Basenderivate (Lysidin,
Wybutosin, Wyosin, Inosin, Queuosine, Archaeosin, Pseudouridine) sind beschrieben
worden. Die Bezeichnung der Modifikationen folgt einer eigenen Nomenklatur
(Schimmel, 1979). Substituenten werden wie folgt abgekürzt: m-, c-, n-, o-, t-, i- und sstehen für Methyl, Carbon-, Amino-, Oxy-, Threonin-, Isopentenyl- und Thiogruppen.
Die Positionszahl des Substituenten wird hochgestellt und die Anzahl wird tiefgestellt
angegeben. Zum Beispiel beschreibt die Abkürzung s2U 2-Thiouridin, wobei „s“ für den
Schwefelsubstituenten, „2“ für die Position des Substituenten an der Base und U für die
Base selbst steht.
6
Einleitung
Abbildung 5: Vergleich von Modifikationsgrad und -komplexität zwischen Archaea, Prokaryoten
(Bacteria) und Eukaryoten (Eucarya) (Sprinzl et al., 1985).
Die meisten und vielfältigsten Modifikationen sind für das Nukleotid in der WobblePosition (34) und für das Nukleotid (37) in 3'-Richtung neben dem Anticodon
beschrieben (Abbildung 5). Diese Modifikationen beeinflussen direkt die Auswahl des
richtigen Codons und erhöhen die Genauigkeit der Translation. Modifizierte Nukleotide
im direkten Umfeld des Anticodons erhöhen ebenfalls die Leistungsfähigkeit und
Genauigkeit der Translation, während Modifikationen außerhalb der Anticodon-Schleife
vorwiegend die Tertiärstruktur stabilisieren (Björk et al., 1987).
Der Modifikationsgrad von tRNAs hat auch eine regulatorische Rolle. So beeinflusst
das Verhältnis von modifizierter und unmodifizierter tRNA die Expression
verschiedener Operons oder Gene.
Basenveränderungen
beeinflussen
die
Wechselwirkung
zwischen
Codon
und
Anticodon. Es gibt Codon-Boxen (Abbildung 4), die für zwei unterschiedliche
Aminosäuren codieren. Diese Codons unterscheiden sich aber nur im dritten Nukleotid.
Für die richtige Auswahl der Aminosäure muss die Wobble-Position spezifisch
abgelesen werden. Eine Modifikation der Wobble-Base erhöht häufig die Affinität zu
einem einzigen der vier Codons (Lustig et al., 1981; Osawa et al., 1988). Beinhaltet ein
Gen oder ein komplettes Operon eine Vielzahl solcher favorisierter Codons, wird die
Sequenz schneller und effizienter abgelesen (Agris, 2004).
7
Einleitung
1.2.2 Thionukleoside - Exklusive tRNA-Modifikationen
Derzeit sind 15 verschiedene Schwefelmodifikationen von Basen in tRNAs bekannt
Symbol
ms2m6A
ms2i6A
ms2io6A
ms2t6A
ms2hn6A
vollständiger Name
2-Methylthio-N6methyladenosin
2-Methylthio-N6isopentenyladenosin
2-Methylthio-N6-(cishydroxyisopentenyl)-adenosin
2-Methylthio-N6-threonylcarbamoyladenosin
2-Methylthio-N6-hydroxynorvalyl-carbamoyladenosin
s2 C
2-Thiocytidin
s2 U
2-Thiouridin
s4 U
4-Thiouridin
m5s2U
5-Methyl-2-thiouridin
s2Um
2-Thio-2'-O-methyluridin
mcm5s2U
5-Methoxycarbonylmethyl-2thiouridin
nm5s2U
5-Aminomethyl-2-thiouridin
5-Methylaminomethyl-2thiouridin
5-Carboxymethylaminomethylcmnm5s2U
2-thiouridin
mnm5s2U
m5s2U
5-Taurinomethyl-2-thiouridin
Strukturbeschreibung
Crain et al., 1991
Burrows et al., 1968
Hecht et al., 1969
Yamaizumi et al.,
1979
Reddy et al., 1992
Carbon et al., 1968
Chackalaparampil et
al., 1981
Lipsett, 1965
Kimura-Harada et al.,
1971
Edmonds et al., 1987
Baczynskyj et al.,
1968
Hagervall et al., 1987
Carbon et al., 1968
Yamada et al., 1981
Suzuki et al., 2001
Phylogenetische
Quelle
Bac
Bac
Eu
Ar, Bac, Eu
Ar, Bac
Ar, Bac
Ar, Bac, Eu
Ar, Bac
Ar, Bac, Eu
Ar
Eu
Bac
Ar, Bac, Eu
Bac
Eu
Tabelle 1: Auflistung aller bekannten Schwefelmodifikationen in tRNAs inklusive Autor der
Strukturbeschreibung und Phylogenetischer Quelle (Ar = Archaea, Bac = Bacteria, Eu = Eucarya).
Thionukleoside wurden bisher nur in tRNAs gefunden. Sie sind aber präsent in allen
Organismenklassen. Thiomodifikationen von Adenosin, Cytidin und Uridin sind
beschrieben (Tabelle 1), während Thio-Guanosin noch nicht entdeckt wurde. Schwefel
kann auf zwei verschiedene Arten an die Basen gebunden sein. Bei Pyrimidinen (C, U)
wird der Schwefel über eine Doppelbindung mit dem Ring verknüpft (>C=S) und bei
Purinen (A) findet die Verknüpfung über eine Methylthio-Gruppe statt (-S-CH3). So
werden die Pyrimidinnukleoside 2-Thiouridin (s2U), 4-Thiouridin (s4U) und 2Thiocytidin (s2C), bzw. das Purinnukleosid 2-Methylthioadenosin (ms2A) gebildet
(Ajitkumar et al., 1988).
8
Einleitung
Die Summenformel der beiden Thiouridine ist identisch, doch die Strukturformeln
(Abbildung 6) zeigen, dass bei 2-Thiouridin das Schwefelatom am zweiten Kohlenstoff
des Pyrimidinrings gebunden ist und so in Richtung der Ribose ragt, während er bei 4Thiouridin am vierten Kohlenstoff gebunden ist, wo er keinesfalls mir der Ribose
wechselwirken kann.
A
B
C
Abbildung 6: Position der Schwefelmodifikation (rote Markierungen) von 2-Thiouridin (A) und 4Thiouridin (B) im Vergleich zu unmodifiziertem Uridin (C).
Schwefelmodifikationen gehen oft mit weiteren Basenmodifikationen einher. So ist bei
2-Thiouridin der Kohlenstoff an Position fünf meist ebenfalls modifiziert. Diese
Modifikation reicht von einer einfachen Methylierung (m5s2U) bis hin zu einer
Carboxymethylaminomethylierung
(cmnm5s2U).
2-Methylthioadenosin
trägt
am
Stickstoff an Position sechs immer einen weiteren Substituenten (Tabelle 1).
Thionukleoside befinden sich meist Anticodon der tRNA und beeinflussen dort die
Translation. Sie können aber an anderen Positionen gefunden. Das am häufigsten
vorkommende Thionukleosid 4-Thiouridin (s4U) ist bei vielen tRNAs an 8. Position
zwischen Akzeptorstamm und D-Stamm zu finden und beeinflusst die Tertiärstruktur
bzw. die Interaktion mit der Aminoacyl-tRNA-Synthetase.
1.3 Die 2-Thiouridinsynthetase MnmA
1.3.1 Strukturelle Daten
MnmA aus Thermotoga maritima MSB8 (accession number: Q9WYZ0, TM0520) ist
eine 2-Thiouridinsynthetase von 358 Aminosäuren Länge und einem Molekulargewicht
von 40,67 kDa. Der berechnete isoelektrische Punkt liegt bei pH 7,57.
MnmA wird in den Datenbanken auch unter den (alten) Bezeichnungen TrmU, asuE,
B1133 oder ycfb geführt. Der aktuelle Name des Proteins leitet sich von der
Bezeichnung des Genclusters ab (Grosjean et al., 1998). Das Gen selbst ist 1077
Basenpaare lang und hat einen GC-Gehalt von 47%.
9
Einleitung
Thermotoga maritima (Abbildung 7) ist ein hyperthermophiler, organotropher
Mikroorganismus, der aus den vulkanischen Sedimenten des Mittelmeers isoliert wurde,
wo er bei ca. 80oC lebt.
Die phylogenetische Klassifizierung lautet wie folgt: Zellorganismen, Bacteria,
Thermotogae, Thermotogae (class), Thermotogales, Thermotogaceae, Thermotoga,
Thermotoga maritima (Taxonomy ID: 243274).
Abbildung 7: Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von Thermotoga maritima
(Bilder zur Verfügung gestellt von P.T. Naumann).
Bioinformatische Recherchen (3D-PSSM und Expasy) über das Protein ergaben, dass
MnmA aus -Helices und -Faltblättern aufgebaut ist ( / Protein). Das Protein verfügt
über eine ATP-Pyrophosphatase-Domäne (PP-ATPase), eine Nukleotid-Binde-Domäne
und über eine Sulfurtransferase-ähnliche Domäne (Rhodanese-ähnlich). Dadurch sollte
es MnmA möglich sein, den Austausch des Sauerstoffatoms an Position zwei des
Uracil-Rings gegen ein Schwefelatom zu katalysieren.
1.3.2 Reaktionszyklus des Schwefeleinbaus
Die 2-Thiouridinsynthetase katalysiert den Einbau des Schwefels ausschließlich bei den
tRNAs von Lysin (tRNALys), Glutamin (tRNAGln) und Glutaminsäure (tRNAGlu). Dabei
wird nur das Uridin in der Wobble-Position modifiziert (s2U34). Weitere enzymatische
Aktivitäten des Proteins sind bisher nicht bekannt.
Um den Schwefeleinbau zu realisieren, werden zahlreiche Komponenten benötigt
(Abbildung 8). L-Cystein wurde als Schwefeldonor der Reaktion identifiziert
(Ajitkumar et al., 1988). MnmA kann die Desulfurierung von L-Cystein zu L-Alanin
aber nicht selbst katalysieren. Es wird ein Hilfsenzym (Sulfurtransferase) benötigt,
welches den Schwefel auf MnmA übertragen kann. Diese Sulfurtransferase ist IscS, ein
Schwefeltransporter, der ebenfalls an der Synthese von Eisen-Schwefel-Proteinen
(Schwartz et al., 2000) und anderer schwefelhaltiger Verbindungen, wie z.B. Thiamin
oder NAD, beteiligt ist (Lauhon et al., 2000). Publikationen belegen, dass IscS für die
10
Einleitung
Synthese von Thionukleosiden in E. coli (Lauhon, 2002) und Salmonella enterica
(Nilsson et al., 2002) erforderlich ist. Das eukaryotische Homolog von IscS, NifS, stellt
bei Saccharomyces cerevisiae den Schwefel für die Thiomodifikation von tRNAs zur
Verfügung (Nakai et al., 2004). Es wurde in vitro nachgewiesen, dass IscS für die
Biosynthese von 2-Thiouridin notwendig ist (Kambampati et al., 2003).
Abbildung 8: Reaktionszyklus der Synthese von 2-Thiouridin durch MnmA (L-Cys = L-Cystein, L-Ala =
L-Alanin, PLP = Pyridoxalphosphat, S2U34 = 2-Thiouridin an 34. Position der tRNA).
(Kambampati et al., 2003).
Man stellt sich den Reaktionszyklus der 2-Thiouridinsynthese wie folgt vor (Abbildung
8): IscS enthält Pyridoxalphosphat (PLP) als prosthetische Gruppe und desulfuriert LCystein (Zheng et al., 1994). Die Sulfhydrylgruppe (-SH) des L-Cysteins wird an einem
aktiven Cysteinrest des IscS als Persulfid (-S-SH) kovalent gebunden (Kato et al., 2002)
und von dort auf einen aktiven Cysteinrest des MnmA übertragen. MnmA bindet nach
der Sulfurierung die tRNA mit U34 und Mg2+-ATP. Das ATP wird dann zu AMP und
Pyrophosphat hydrolysiert, während der Schwefel auf den Kohlenstoff an der zweiten
Position des Uracilrings übertragen wird. Das Pyrophosphat wird hydrolysiert, der
Sauerstoff zu H2O protoniert und abgespaltet. Es wird eine Disulfidbrücke zwischen
dem aktiven Cysteinrest und einem weiteren Cystein des MnmA gebildet. Wird diese
Disulfidbrücke durch DTT oder andere freie Sulfhydrylgruppen (z.B. Thioredoxin)
wieder reduziert, kann das Enzym erneut ein Schwefelatom binden.
Der Reaktionsschritt der Schwefelübertragung durch MnmA auf das Uridin ist noch
nicht im Detail aufgeklärt worden. Man geht davon aus, dass in MnmA ein reaktives
Persulfid gebildet wird. Dann wird der Sauerstoff am zweiten Kohlenstoff adenyliert
und der reaktive Schwefel des Persulfids kann den nun elektrophilen Kohlenstoff direkt
angreifen (Fontecave et al., 2003).
Mutationsstudien (Kato et al., 2002) und die Aufklärung der Struktur von IscS (CuppVickery, et al., 2003) haben gezeigt, wie IscS die Sulfhydrylgruppe binden kann. Das
11
Einleitung
Pyridoxalphosphat ist in das Protein integriert (prosthetische Gruppe) und bewirkt die
Desulfurierung des L-Cysteins. Die Sulfhydrylgruppe wird dann als Persulfid am
aktiven Cystein 328 gebunden. IscS kann den Schwefel aber nicht direkt auf Nukleotide
der tRNA übertragen, da es keine RNA-Bindedomäne besitzt (Kambampati et al.,
2000). Dieser Mechanismus der Desulfurierung ist jedoch nicht auf MnmA übertragbar,
da es kein Pyridoxalphosphat enthält. MnmA nimmt ein bereits aktiviertes
Schwefelatom aus einem Persulfid des IscS auf.
In vitro Biosynthesestudien zeigten, dass sowohl die 2-Thiouridinsynthetase (MnmA),
als auch die 4-Thiouridinsynthetase (ThiI), die die Übertragung eines Schwefelatoms
auf den vierten Kohlenstoff des Uracils katalysiert, IscS zur Katalyse ihrer Produkte
benötigen (Kambampati et al., 1999 & 2003). Vergleicht man den Reaktionszyklus der
2-Thiouridinsynthese (Abbildung 8) mit dem der 4-Thiouridinsynthese (Abbildung 9),
stellt man fest, dass sie fast identisch sind, mit der Ausnahme, dass MnmA die Synthese
von 2-Thiouridin katalysiert, während ThiI 4-Thiouridin synthetisiert. ThiI ist ebenfalls
an der Thiaminsynthese beteiligt (Webb et al., 1997).
Abbildung 9: Reaktionszyklus der Synthese von 4-Thiouridin durch ThiI (PLP = Pyridoxalphosphat, LCys = L-Cystein, L-Ala = L-Alanin, S4U8 = 4-Thiouridin an 8. Position der tRNA). (Lauhon, 2002).
Da auch ThiI den Schwefel über eine intramolekulare, persulfidische Bindung überträgt
(Palenchar et al., 2000), kann man davon ausgehen, dass ThiI und MnmA gewisse
strukturelle Gemeinsamkeiten aufweisen müssen. Der Sequenzvergleich der beiden
Proteine zeigt aber nur wenige Strukturähnlichkeiten. Speziell im Bereich der
Pyrophosphat-ATPase-Domäne am N-Terminus von MnmA und der Sulfurtransferaseähnlichen Domäne im Zentrum der MnmA-Sequenz sind Sequenzhomologien
erkennbar. Eine THUMP-Domäne (engl. THUMP = thiouridine synthases, methylases
and predicted pseudouridine synthases - vermutlich eine RNA-Bindedomäne), wie sie
bei ThiI beschrieben wird (Aravind et al., 2001), ist in der Sequenz von MnmA nicht
nachweisbar.
Studien zeigten, dass ein tRNA-Oligonukleotid (Abbildung 10), dass mit einer
Minimalsequenz die Struktur des Anticodon-Arms simuliert, genauso effizient
12
Einleitung
modifiziert wurde, wie tRNA in Volllänge (Kambampati et al., 1999 & 2003). Daraus
wurde gefolgert, dass MnmA nicht die vollständige tRNA erkennt, sondern nur die
Anticodonschleifen von tRNALys, tRNAGlu und tRNAGln.
Abbildung 10: Beispiel einer minimalen tRNA-Erkennungssequenz von MnmA (tRNA-Oligo).
Mutationsstudien zeigten, dass ein Ausfall des Proteins für E. coli nicht tödlich ist,
dennoch sind das Wachstum und die Teilungsrate stark verringert.
1.3.3 2-Thiouridin, Zwischenprodukt in einem komplexerem
Syntheseweg
Mit der 2-Thiomodifikation des Uridins gehen immer weitere Modifikationen
(Hypermodifikationen) am fünften Kohlenstoff des Uracil-Rings einher (Abbildung 11).
Mutationsstudien (Elseviers et al., 1984; Hagervall et al., 1987) führten zur teilweisen
Aufklärung des Synthesewegs von hypermodifiziertem Uridin (5-Methylaminomethyl2-thiouridin, mnm5s2U). Das 2-Thiouridin wird durch verschiedene MethylSubstituenten ((x)m5) hypermodifiziert. So ist bei E. coli eine MethylaminomethylGruppe (mnm5) und beim Menschen eine Methoxycarbonylmethyl-Gruppe (mcm5) am
C-5 substituiert. In Abbildung 11 ist der Syntheseweg des mnm5s2U kurz dargestellt.
Einige Reaktionen zur Substitution des C-5 sind jedoch noch nicht bekannt.
Speziell die Enzyme, welche die Startmodifikation katalysieren, sind noch nicht
identifiziert. Es wird vermutet, dass GidA and MnmE, zwei verschiedene Methylasen,
die ersten Schritte der C-5-Modifikation katalysieren (Bregeon et al., 2001). Solche
Hypermodifikationen des Uridins wurden in verschiedenen Organismen charakterisiert.
In zahlreichen Organismen fehlen einige der Enzyme, die die Substitution des C-5
katalysieren. So wurde in Candida tropicalis ein 5-Methyl-2-thiouridin charakterisiert
(Patwardhan et al., 1985). Es zeigt sich, dass der Substituent am fünften Kohlenstoff
nicht überall voll bis zum Methylaminomethyl differenziert ist.
13
Einleitung
Abbildung 11: Bildung eines hypermodifizierten Uridins durch weitere Substitutionen am 5. Kohlenstoff
des Uracil-Rings (Adomet = S-Adenosylmethionin). (Kambampati et al., 2003).
Die Modifikationen am fünften Kohlenstoff sind unabhängig von der Synthese des 2Thiouridins (Elseviers et. al., 1984). MnmE und MnmC, die Enzyme, die die
Hypermodifikation katalysieren, sind auch ohne MnmA aktiv und katalysieren die
Substitution des C-5. Dennoch begünstigt das Vorhandensein einer 2-Thiomodifikation
weitere Substitutionen. 2-Thiouridin ohne eine weiter Substitution
Bei 4-Thiouridin sind keine weiteren Substitutionen bekannt. Das modifizierte
Nukleosid Methylthio-Adenosin trägt am Stickstoff der freien Aminogruppe (N6) stets
einen weiteren Substituenten.
Einige Organismen können 2-Thiouridin auch auf einem anderen Weg weiter
modifizieren. Ein Enzym (selD) aus Salmonella typhimurium kann den Schwefel von
(mnm5)s2U gegen ein Selenatom austauschen (Veres et al., 1994a/b) und so
Selenouridin synthetisieren. Dieser Syntheseweg ist ebenfalls IscS-abhängig (Mihara et.
al. 2002).
1.3.4 Lokalisation und Funktion der 2-Thio-Modifikation
Die Schwefelmodifikation von Nukleosiden wurde bisher nur in tRNAs charakterisiert.
Das Uridin an der Wobble-Position in den tRNAs, die Lysin, Glutamin und
Glutaminsäure binden, enthalten Schwefel an der zweiten Position des Pyrimidinrings.
Durch die Sulfurierung bekommt das Nukleosid einen hydrophoberen Charakter,
unabhängig vom Aussehen des Substituenten an der fünften Position.
14
Einleitung
Das Schwefelatom an der zweiten Position des Uridins induziert bei der Ribose eine
Konformationsbeschränkung. Die eher hydrophobe C(3’)-endo, gauche plus, antiKonformation wird begünstigt
(Sierzputowska-Gracz et al., 1987). Durch diese
eingeschränkte Konformation wird die Base in eine festere Position gebracht und kann
durch hydrophobe Wechselwirkungen mit benachbarten Basen (base stacking) die
Anticodonstruktur verändern (Bähr et al., 1973; Mazumdar et al., 1974).
Thiomodifikationen
in
Wobble-Position
verringern
somit
die
molekulare
Bewegungsdynamik der Anticodon-Schleife. Die Wechselwirkungen zwischen den
benachbarten Basen sind so stark, dass das Dinukleotid mcm5s2UpUp durch den Verdau
mit RNase A nicht gespaltet wird (Koyabashi et al., 1974).
Durch ihre starre Konformation werden die Bindung am Ribosom und die Interaktion
mit dem Codon erleichtert (Ashraf et al., 1999). Weiterhin belegen in vitro NMRStudien, dass die Wobble-Basenpaarung zwischen 2-Thiouridin und Guanosin an der
dritten Position des Codons energetisch ungünstig ist, da eine der beiden möglichen
Wasserstoff-Brückenbindungen deformiert wird (Yokoyama et al, 1985). Eine
Basenpaarung mit Adenosin wird dadurch stärker begünstigt (Lim, 1994). In vivoStudien zeigten, dass E. coli tRNAGlu mit 2-Thiouridin in Wobble-Position die
Translationsrate von GAA Codons erhöhte (Krüger et al., 1998). Dies weist auf eine
stärkere Bindung von s2U und A hin.
Es gab weitere Untersuchungen auf den Einfluss der 2-Thiomodifikation auf die CodonAnticodon-Basenpaarung. RNA-Duplexmolekule, die Codon (AAA) und Anticodon
(UUU) der tRNALys simulieren, haben mit einem 2-Thiouridin eine deutlich höhere
Schmelztemperatur (Kumar et al., 1997). Eine 4-Thiomodifikation wirkt dem entgegen
und senkt die Schmelztemperatur noch unter das Niveau von unmodifiziertem Uridin.
Die Bindungsenergie zwischen Codon und Anticodon mit s2U wird erhöht. Dies hat
einen positiven Einfluss auf die Erkennung des richtigen Codons.
Nukleotidmodifikationen des Typs (x)m5s2U findet man in tRNAs, die Codons einer
Box lesen, die für zwei verschiedene Aminosäuren codieren und sich nur im letzten
Nukleotid unterscheiden (Abbildung 4). Sie beschränken die Wobble-Kapazität von
Uridin und verhindern Lesefehler in der dritten Position des Codons (Söll et al., 1995).
So wird selbst in der Wobble-Position eine spezifische Basenpaarung erreicht.
Modifikationen des (x)o5U-Typs wurden in tRNAs gefunden, die Codons aus Boxen
lesen, die für gleiche Aminosäure codieren.
Die dritte Position des Codons ist
unwichtig für eine korrekte Dekodierung (z. B. bei Val, Ala und Ser). Die Modifikation
15
Einleitung
vergrößert die Wobble-Kapazität von Uridin. (Yokoyama et al., 1985). Ferner wurden
ungewöhnliche Strukturen von Anticodon-Schleifen in tRNAs von Lysin gefunden
(Watanabe et al.; 1994, Agris et al., 1997). Dabei interagiert s2U34 mit dem
hypermodifziertem A37 und stabilisiert den Anticodonarm. Dabei stellte man fest, dass
nur noch zwei der drei Nukleotide des Anticodons für Basenpaarungen zur Verfügung
standen. Dies führt bei der Translation häufig zu einer Rasterverschiebung in 5'Richtung (-1), was bei der Synthese einiger Proteine notwendig ist. Bei retroviraler
RNA kann ein Gen häufig für zwei Proteine codieren, weil durch einen gelegentlichen
ribosomalen Rasterschub um -1 an definierter Position beide Proteine translatiert
werden. Ein Beispiel dafür ist die Translation der gag-pol-Sequenzen vom
Sarcomavirus (Jacks et al., 1988). Einige Studien haben gezeigt, dass unmodifiziertes
Uridin in Wobble-Position einen signifikanten Anstieg von Rasterschüben zur Folge hat
(Urbonavicius et al., 2001 & 2003). Auf der anderen Seite scheinen Anticodons mit 2Thiouridinderivaten durch Falschinterpretation bestimmter mRNA-Sequenzen selbst
einen Rasterschub auszulösen (Hagervall et al., 1998; Licznar et al., 2003). Die 2Thiomodifikation reduziert die Wobble-Kapazität von U und G so stark, dass bei der
Sequenz CGA AAG nicht das Lysin-Codon AAG, sondern das alternative Codon AAA
(codiert auch für Lysin) abgelesen werden kann. Es kommt zu einem Rasterschub. Um
diesen Effekt zu begrenzen, liegen nicht alle U34 in den tRNA-Molekülen von Lysin,
Glutamin und Glutamat sulfuriert vor, sondern nur ein Teil.
Die 2-Thiomodifikation des Uridins hat ebenfalls einen Einfluss auf den
Elongationsprozess der Translation. Mit nicht-modifizierter tRNALys bindet der
Elongationsfaktor T (EFT) schlechter am Ribosom, als mit modifizierter tRNALys (Sen,
et al., 1976). Der Grad der Sulfurierung der tRNAs ist somit auch eine Art
Translationskontrolle.
Beim Beladen der tRNA mit einer Aminosäure erhöht die Schwefelmodifikation von
Uridin die Erkennungsrate durch die Aminoacyl-tRNA-Synthetase. In der tRNAGlu von
E. coli ist 2-Thiouridin ein Erkennungselement für die Glutamyl-tRNA-Synthetase
(Sylvers et al., 1993). Die Lysyl-tRNA-Synthetase erkennt ihre tRNA zudem zusätzlich
am C-5 Substituenten des s2U34 (Ashraf et al., 1999).
Hyperthermophile Organismen können 2-Thio-Nukleoside auch an anderen Positionen
ihrer tRNAs besitzen. Bei Thermus thermophilus HB8 ist die zweite Position des
Ribothymidins einer Isoleucin tRNA sulfuriert und stabilisiert so die Tertiärstruktur.
Die Thermostabilität der tRNA nimmt dadurch zu (Horie et al., 1985).
16
Einleitung
Aktuelle medizinische Forschungen haben gezeigt, dass die 2-Thiomodifikation von
Uridin eine Bedeutung bei einigen menschlichen Erkrankungen hat. Die Modifikation
ist z.B. ein Erkennungselement für die effektive Nutzung humaner tRNALys3 als ein
Primer für HIV Reverse Transkriptase (Isel et al., 1993). Des Weiteren führt eine
Punktmutation im mitochondrialen tRNALys-Gen (A8344G) zu einem Verlust der 2Thiomodifikation des hypermodifizierten Wobble-Nukleotids. Die Codon-AnticodonWechselwirkung wird gestört, so dass die tRNALys eine mRNA an der 30S
Ribosomenuntereinheit kaum noch bindet (Yasukawa et al. 2001). Die Folge dieser
Mutation ist die MERRF-Krankheit (myoclonus epilepsy associated with ragged-red
fibers), eine mitochondriale Gehirn- und Muskelerkrankung. (Yasukawa et al., 2000;
Suzuki et al., 2002).
1.4 Aufgabenstellung und Zielsetzung
Die Aufgabenstellung dieser Diplomarbeit bestand zum einen in der Entwicklung von
geeigneten Expressions- und Aufreinigungsstrategien für die 2-Thiouridinsynthetase
MnmA. Hierzu musste das Gen für MnmA aus genomischer DNA von Thermotoga
maritima amplifiziert und in einen geeigneten Expressionsvektor kloniert werden. Die
Expressions- und Aufreinigungsstrategien sollten so weit optimiert werden, dass das
Protein frei von Kontaminationen durch Fremdprotein oder RNA war und die für die
Kristallographie
nötigen
Ausbeuten
erreicht
wurden.
Anschließend
sollten
Kristallisationsversuche von MnmA ohne Bindungspartner durchgeführt werden, um
später mittels Röntgenbeugungsexperimenten die Struktur aufklären zu können.
17
Material und Methoden
2. Material und Methoden
2.1 Materialien
2.1.1 Feinchemikalien
Produkt
Hersteller
Acrylamid/Bisacrylamid-Rotiphorese Gel 30
Roth, Karlsruhe
Agar-Agar
Roth, Karlsruhe
Agarose NEEO-Ultra
Roth, Karlsruhe
Ammoniumchlorid
Roth, Karlsruhe
Ammoniumperoxodisulphat
Merck, Darmstadt
Anhydrotetracyclin (AHTC)
IBA, Göttingen
Borsäure
AppliChem, Darmstadt
5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Phosphat
(BCIP)
Sigma-Aldrich, Steinheim
Bromphenolblau
Roth, Karlsruhe
Cadmiumchlorid
Sigma-Aldrich, Steinheim
Casein
Sigma-Aldrich, Steinheim
Coomassie Brillant Blue G250 / R250
Roth, Karlsruhe
D-Desthiobiotin
Sigma-Aldrich, Steinheim
Dimethyformamid
Sigma-Aldrich, Steinheim
Dimethylsulfoxid (DMSO)
Merck, Darmstadt
1,4-Dithiothreitol (DTT)
Roth, Karlsruhe
Essigsäure
Roth, Karlsruhe
Ethanol
Uni Göttingen
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
Sigma-Aldrich, Steinheim
D(+)-Glucose-Monohydrat
AppliChem, Darmstadt
Glycin
Roth, Karlsruhe
Glycerin
Sigma-Aldrich, Steinheim
Hydroxy-Azophenyl-Benzoesäure (HABA)
Sigma-Aldrich, Steinheim
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid
(IPTG) dioxanfrei
Lithiumchlorid
Roth, Karlsruhe
AppliChem, Darmstadt
18
Material und Methoden
Maltose
AppliChem, Darmstadt
-Mercaptoethanol
Merck, Darmstadt
Methanol
Roth, Karlsruhe
2-Morpholinoethansulfonsäure (MES)
AppliChem, Darmstadt
Natriumchlorid
Roth, Karlsruhe
Natriumdodecylsulfat (SDS) Ultrapure
Roth, Karlsruhe
Natriumhydroxid
Roth, Karlsruhe
Nitroblau-Tetrazolium (NBT)
Sigma-Aldrich, Steinheim
N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin
(TEMED)
Polyethylenglykol (PEG) 200, 300, 400, 600,
1000, 3000, 6000, 10000
Polyethylenglykol (PEG) 1500, 2000, 4000,
5000, 8000, 20000
Roth, Karlsruhe
Merck, Darmstadt
Fluka, Buchs
Polyethylenglykol (PEG) 3350
Sigma-Aldrich, Steinheim
pH-Pufferlösungen pH 4,01, 7,0, 9,21
Mettler-Toledo, Steinbach
Protein Assay Bradford Reagens
BioRad, München
Rinderserumalbumin (BSA)
Sigma-Aldrich, Steinheim
Salzsäure 37 %
Roth, Karlsruhe
Skim milk powder
Fluka, Buchs
Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris)
Roth, Karlsruhe
Triton X-100
Roth, Karlsruhe
Trypton/Pepton
Roth, Karlsruhe
Tween-20
Roth, Karlsruhe
Yeast-Extract
Oxoid, Basingstoke, Hampshire, GB
2.1.2 Enzyme und Inhibitoren
BamH I
[G↓GATCC]
New England Biolabs, Frankfurt/M.
Hind III
[A↓AGCTT]
New England Biolabs, Frankfurt/M.
Nco I
[C↓CATGG]
New England Biolabs, Frankfurt/M.
Sac II
[CCGC↓GG]
New England Biolabs, Frankfurt/M.
Xho I
[C↓TCGAG]
New England Biolabs, Frankfurt/M.
Taq-DNA-Polymerase
Uni Göttingen (Eigenproduktion)
19
Material und Methoden
Pfu-DNA-Polymerase
New England Biolabs, Frankfurt
Pfu-DNA-Polymerase Turbo
Stratagene, USA
Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP)
New England Biolabs, Frankfurt
T4-DNA-Ligase
Protease Inhibitor Cocktail Tablets Complete
EDTA-free
New England Biolabs, Frankfurt
Fermentas, St. Leon - Rot
Roche, Mannheim
PreScission Protease
Uni Göttingen (Eigenproduktion)
Benzonase
Merck, Darmstadt
dNTP Set
Fermentas, St. Leon - Rot
2.1.3 Größenstandards
BR(Broad range)-Protein-Standard
New England Biolabs, Frankfurt
Eigener Proteinstandard
Annette Berndt, Göttingen
PageRuler Prestained Proteinladder
Fermentas, St. Leon - Rot
Proteinladder
Fermentas, St. Leon - Rot
Gefärbter Proteinstandard
Anamed, Darmstadt
ProteMix SDS-Marker
Anamed, Darmstadt
DNA-Standard „1kb-ladder”
Promega, Mannheim
New England Biolabs, Frankfurt
2.1.4 Verwendete Organismen
E. coli BL21
E. coli BL21(DE3)
E. coli BL21(DE3) LysE
E. coli BL21(DE3) LysS
E. coli BL21(DE3) RIL
E. coli BL21(DE3) Rosetta 2
E. coli ER 2507
Stammsammlung der
AG Ficner
E. coli ER 2508
E. coli DH 5
E. coli XL1-Blue
E. coli XL10-Gold
20
Material und Methoden
2.1.5 Plasmide und Vektoren
pET-28-a
Novagen, USA
pMAL-c2xb (modifiziert)
New England Biolabs, Frankfurt/M.
pGEX-6-P-1
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
pETM-30
Gunther Stier, EMBL Heidelberg
pASK-IBA3
IBA, Göttingen
pASK-IBA5
IBA, Göttingen
2.1.6 Primer
pET-28a_NcoI_for: 5'-CCC CAT GGA AGT
AGG GGT AGC ACT CAG TGG A-3'
MWG-Biotech, Ebersberg
pET-28a_HindIIIstop_rev: 5'-CCA AGC
TTT CAT CGA ATT CCC TGC TTT ATA
MWG-Biotech, Ebersberg
AT-3'
pMal_BamHI_for: 5'-CCG GAT CCA AAG
TAG GGG TAG CAC TCA GTG-3'
pMal_HindIIIstop_rev: 5'-CCA AGC TTT
CAT CGA ATT CCC TGC TTT ATA AT-3'
pGEX_BamHI_for: 5'-CCG GAT CCA AAG
TAG GGG TAG CAC TCA GTG -3'
pGEX_XhoIstop_rev: 5'-CCG CTC GAG
TCA TCG AAT TCC CTC CTT TAT-3'
pASK_IBA3_SacII_for: 5'-CAT ACC GCG
GTA AAG TAG GGG TAG CAC TCA-3'
MWG-Biotech, Ebersberg
MWG-Biotech, Ebersberg
MWG-Biotech, Ebersberg
MWG-Biotech, Ebersberg
MWG-Biotech, Ebersberg
pASK_IBA3_NcoI_rev: 5'-CAT GCC ATG
GCC TCG AAT TCC CAC CTT TAT AAT
MWG-Biotech, Ebersberg
C -3'
pASK_IBA5_SacII_for: 5'-CAT ACC GCG
GTT AAA GTA GGG GTA GCA CTC A -3'
MWG-Biotech, Ebersberg
pASK_IBA5_NcoIstop_rev: 5'-CGC TCC
ATG GCT TAT CGA ATT CCC TCC TTT
MWG-Biotech, Ebersberg
ATA A -3'
21
Material und Methoden
2.1.7 Reaktionskits
NucleoSpin Plasmid
Macherey-Nagel, Düren
Qiagen Gel Extraction Kit
Qiagen, Hilden
Qiagen PCR Purification Kit
Qiagen, Hilden
Qiagen Plasmid Midi Kit
Qiagen, Hilden
Sequence Mix Big Dye Terminator v1.1
sequencing kit
Applied Biosystems, Darmstadt
2.1.8 Chromatographiesäulen und Säulenmaterial
Strep-Tactin
IBA, Göttingen
Amylose-Harz
New England Biolabs, Frankfurt/M.
Einweg-Leersäulen
BioRad, München
HiPrep 26/10 Desalting
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
Column PD-10
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
Superdex 75 & 200
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
DEAE-Sepharose FF
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
CM-Sepharose FF
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
Source 30S
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
Resource Q (1 ml & 6 ml)
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
Resource S (1 ml)
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
XK 16/20
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
XK 26/60
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
2.1.9 Antibiotika
Ampicillin
Roche, Mannheim
Chloramphenicol
Roth, Karlsruhe
Kanamycin
Roth, Karlsruhe
Streptomycin
Roth, Karlsruhe
2.1.10 Kristallisationsscreens
Crystal Screens 1 & 2
Hampton Research, USA
Crystal Screen Lite
Hampton Research, USA
22
Material und Methoden
Crystal Screen Cryo
Hampton Research, USA
Crystal Screen PEG/Ion
Hampton Research, USA
Crystal Screen Natrix
Hampton Research, USA
JB Screens 1-10
Jena Bioscience, Jena
Magic Screens 1-4
Dr. Susana Andrade, Göttingen
Footprint Screens 1-3
Dr. Markus Rudolph, Göttingen
Structure Screens 1-3
Dr. Markus Rudolph, Göttingen
2.1.11 sonstige Materialien
24 Well Kristallisationsschalen sitting drop
Hampton Research, USA
Crystal Clear Tape
Henkel, Aachen
Einmal-Mikrotiterplatten
Schütt, Göttingen
Glasgeräte
Merck, Darmstadt
JA30-Zentrifugenröhrchen
Beckman Coulter, Krefeld
Parafilm
American National Can, USA
Pipetten (verstellbar), Dispensor
Eppendorf, Hamburg
Pipettenspitzen
Sarstedt, Nümbrecht
PVDF-Membran
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
Reaktionsgefäße (0.5 ml, 1.5 ml, 2.0 ml)
Eppendorf, Hamburg
Reaktionsgefäße (15 ml, 50 ml)
Sarstedt, Nümbrecht
Sterilfilter 0,2 m / 0,4 m
Vivascience, Hannover
Vivaspin Konzentratoren (MW 3,10,30,50)
Vivascience, Hannover
Whatman-Papier
BioRad, München
Zentrifugenbecher ( 1 l, 500 ml)
Beckman Coulter, Krefeld
2.1.12 Geräte
AbiPrism 3100 DNA Sequencer
Applied Biosystems, Darmstadt
Agarose-Gelelektrophoresekammer
BioRad, München
Äkta Prime, Äkta Purifier
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
Binokulare
Carl Zeiss, Jena
Brutschrank Mytron
Schütt, Göttingen
GelDoc Geldokumentationsgerät
BioRad, München
Gelelektrophorese- & Blotkammer
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
23
Material und Methoden
SDS-Gelelektrophoresekammer
Biometra, Göttingen
Gelschüttler Promax 1020
Heidolph, Schwabach
Geltrockner Gel Air Dryer
BioRad, München
Heizbad
IKA, Staufen
Heizblock Dri-Block CB-2A
Techne, Minneapolis, USA
Innova 4230 Schüttelinkubator
New Brunswick Scientific, Nürtingen
Magnetrührer IKAMAG REO
IKA, Staufen
Microfluidizer 110 S
Microfluidics, USA
Microtip 102 C
Branson, USA
PCR-Geräte
Biometra, Göttingen
Peristaltic pump P-1
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
pH-Meter
Beckman Coulter, Krefeld
Photometer
Biometra, Göttingen
Pipettierhilfe Accu-Jet
Brand, Wertheim
Röntgendiffraktometer RU-H3R
Rigaku, Japan
Rotationsschüttler
Karl Hecht, Staufen
Rotor JA-20 / JA-30.50 Ti
Beckman Coulter, Krefeld
Rotor JLA 8.1000
Beckman Coulter, Krefeld
Rotor S4180
Beckman Coulter, Krefeld
Semi-Dry Blotkammer
BioRad, München
Sonifier 250
Branson, USA
Speedvak Concentrator 5301
Eppendorf, Hamburg
Spektralphotometer
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
Superloops (10 ml, 50 ml, 150 ml)
Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg
Taumelrollenmischer RM5
Schütt, Göttingen
Thermomixer comfort
Eppendorf, Hamburg
Tischzentrifuge 5417 R
Eppendorf, Hamburg
Tischzentrifuge Micro centrifuge II
Sylvania, Ohio, USA
Ultraschallbad Sonorex Super RK 510
Bandelin, Berlin
Unitron Schüttelinkubatoren
Infors, Einsbach
Vortex
Schütt, Göttingen
Zentrifuge Allegra 21R
Beckman Coulter, Krefeld
Zentrifuge Avanti J-20 XPI / J-30 I / JA-20
Beckman Coulter, Krefeld
24
Material und Methoden
2.2 Methoden
2.2.1 Allgemeine Methoden
2.2.1.1 Konzentrationsbestimmung von Proteinproben
Die quantitative Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen erfolgt über einen
Bradford-Assay (Bradford, 1976) nach der Methode von Bearden (1978). In
phosphosaurer Lösung lassen sich Proteine mit dem Farbstoff Coomassie Brilliant Blue
anfärben. Die Proteinkonzentration kann mittels Absorption bei 595 nm photometrisch
bestimmt werden, da sich das Absorptionsspektrum des Farbstoffes in einem Bereich
von OD595 0,1 – 0,9 proportional zur Proteinkonzentration ändert.
20 μl Proteinprobe wurden mit 1 ml 1:5 in Wasser verdünnter Bradford-Reagens
(1
mg
/ml Coomassie Brilliant Blue G 250 in 85%iger H3PO4) versetzt und nach 10
Minuten die Absorption bei 595 nm gegen einen Leerwert gemessen. Aus dem
Vergleich zu einer durch verschiedene Konzentrationen an BSA erstellten
Standardkurve ließ sich die Proteinmenge der unbekannten Probe ermitteln. Höher
konzentrierte Proteinproben wurden 1:20 mit dem entsprechendem Puffer verdünnt, um
den linearen Messbereich (OD595 0,1 – 0,9) nicht zu verlassen.
2.2.1.2 Ankonzentrieren von Proteinlösungen durch Zentrifugation
Eine einfache Methode zum Ankonzentrieren von Proteinlösungen ist die Verwendung
von so genannten Centricons. Auf ein Zentrifugenröhrchen ist eine Hülse gesteckt, in
deren unterem Drittel eine Membran mit bestimmter Porengröße eingelassen ist. Diese
Membran ist durchlässig für Wasser, Ionen und kleine Moleküle, aber nicht für
Proteine, die größer als der Ausschluss der Membran sind. Durch Zentrifugation (3.0004.500 x g, 4°C, Zeit unterschiedlich), können Proteine auf diese Weise ankonzentriert
werden.
In dieser Arbeit wurden Vivaspin Konzentratoren der Firma Vivascience verwendet.
2.2.1.3 Gelelektrophoresen
2.2.1.3.1 Diskontinuierliche Polyacrylamid-Gelelektrophorese von Proteinen
(SDS-PAGE)
Die SDS-PAGE nach Laemmli et al. (1970) wird zur analytischen und präparativen
Auftrennung von Proteinen verwendet. SDS ist ein Detergens, das aus einer
25
Material und Methoden
aliphatischen Kette von 12 Kohlenstoffatomen besteht und eine hydrophile Sulfatgruppe
besitzt. SDS lagert sich gleichmäßig an Aminosäuren an und entfaltet (denaturiert)
dabei das Protein. Zusätzlich werden Disulfidbrücken durch -Mercaptoethanol, das im
Probenpuffer enthalten ist, reduziert und dadurch gespalten. Es entsteht ein SDSProtein-Komplex mit nach außen gerichteten negativen Ladungen. Die Eigenladungen
des Proteins sind jetzt vernachlässigbar und der entstandene Komplex besitzt ein
konstantes Masse/Ladungs-Verhältnis. Unter diesen Bedingungen sind Proteine
unabhängig von ihrer Faltung in einem Molekularsieb wie dem Polyacrylamidgel nach
ihrem Molekulargewicht separierbar.
Das Prinzip der diskontinuierlichen Gelelektrophorese beruht auf der Fokussierung von
Proteinen (Ornstein, 1964) durch einen pH-Sprung von zwei übereinander geschichteten
Polyacrylamidgelen. Das untere Trenngel enthält einen Puffer mit einem pH-Wert von
8,8 und einem Leition mit hoher Ionenbeweglichkeit. Der pH-Wert des darüber
geschichteten Sammelgels liegt deutlich tiefer bei 6,8. Das Leition des Sammelgels
besitzt eine geringere Ionenbeweglichkeit. Der Elektrodenpuffer enthält ein Folgeion
mit geringer Ionenbeweglichkeit, dessen Ladung allerdings pH-abhängig ist.
Durch das Einschalten des Stromes wandern die Leitionen des Laufpuffers mit hoher
Geschwindigkeit durch das elektrische Feld und überholen dabei die aufgetragenen
Proteine. Daraus resultiert hinter den Proteinen eine Zone geringerer Ionendichte und
erhöhter Feldstärke, aufgrund dessen die Proteine und Folgeionen beschleunigt werden.
Die Geschwindigkeit der Proteine ist dabei größer als die der Folgeionen, aber
langsamer als die der Leitionen. Es resultiert die Fokussierung der Proteine als scharfe
Bande an dem Feldstärkesprung. Beim Auftreffen auf das Trenngel ändern die
Folgeionen aufgrund des erhöhten pH-Wertes ihre Ladung und damit ihre
Ionenbeweglichkeit. Sie überholen die Proteine, die dann wieder in einem Gebiet
konstanter Feldstärke wandern. Die Folge ist eine normale Gelelektrophorese. Das
Trenngel wirkt als Molekularsieb, da die Proteine durch die weit engeren Poren des
Trenngels in Abhängigkeit ihrer Masse verlangsamt werden und so nach ihrem Gewicht
bzw. ihrer Größe aufgetrennt werden.
Für die Vorbereitung einer SDS-PAGE wurden zwei Glasplatten mit Ethanol gereinigt
und staubfrei trocken gerieben. Zwei 1 mm dicke Abstandshalter wurden an den
Rändern platziert und eine dünne, U-förmige Gummidichtung wurde zwischen den
Glasplatten fixiert. Die Glasplatten wurden dort, wo die Gummidichtung lag, mit einer
Klammer zusammengehalten.
26
Material und Methoden
Danach wurde das Trenngel zwischen die Glasplatten bis 2 cm unter den Rand gegossen
und für die Dauer der Polymerisation (ca. 30 min) mit Isopropanol überschichtet. Nach
dem Auspolymerisieren des Trenngels werde das Isopropanol abgegossen und mit
Wasser nachgespült. Das Sammelgel wurde in den verbliebenen Raum zwischen den
Glasplatten gegossen und der Probenkamm wurde zwischen die Glasplatten gesteckt.
Die Gummidichtung wurde nach Beendigung des Polymerisationsvorganges entfernt.
Das Gel wurde in eine vertikale Elektrophoresekammer gespannt und das obere und
untere Reservoir mit SDS-Laufpuffer gefüllt. Der Kamm wurde vorsichtig heraus
gezogen und die Probentaschen mit Puffer gespült, um Gelreste zu entfernen. Die
Proteinproben wurden 1:1 (v/v) mit Laemmli-Puffer versetzt, falls nötig bei 95°C für
drei bis fünf Minuten aufgekocht und mittels einer Pipette in die Taschen des Gels
geladen.
Für die Analyse von Zellsuspensionsproben mittels SDS-PAGE wurden 0,5 ml Kultur
abzentrifugiert, mit Laemmli-Puffer (OD600 x 0,1 ml) versetzt und anschließend 10 min
bei 95° C aufgekocht. Für den Größenvergleich wurde ein Proteingrößenstandard
(Marker) mit aufgetragen. Nach dem Auftragen auf das Gel ließ man die Proben bei
geringer Stromstärke (ca. 15 mA) und maximaler Spannung in das Sammelgel
einsinken. Nach 10-15 min wurde die Stromstärke auf 25-30 mA erhöht, um die
Proteine zu einer schmalen Bande zu fokussiert und dann zu trennen.
1 x SDS-Laufpuffer:
2 x SDS-Probenpuffer (Laemmli-Puffer):
192 mM Glycin
62,5 mM Tris/HCl pH 6,8
25 mM Tris/HCl pH 8,3 70 mM SDS
0,1 % (w/v) SDS
50 % (v/v) Glycerin
0,1 % (v/v) Bromphenolblau (1 % (v/v) in EtOH abs.)
5 % (v/v) β-Mercaptoethanol
Ansatz für ein Sammelgel, Volumen
2 ml
30% Acrylamid / 0,8% Bisacrylamid
0,33 ml
0,625 M Tris/HCl pH 6,8
0,4 ml
0,5% SDS-Lösung
0,4 ml
ddH2O
0,87 ml
TEMED
5 µl
10 % APS-Lösung
10 µl
27
Material und Methoden
Ansatz für ein Trenngel, Volumen
6 ml
Dichte des Trenngels
10 %
12,5 %
15 %
2 ml
2,5 ml
3 ml
0,625 M Tris/HCl pH 6,8
1,2 ml
1,2 ml
1,2 ml
0,5% SDS-Lösung
1,2 ml
1,2 ml
1,2 ml
ddH2O
1,6 ml
1,1 ml
0,6 ml
TEMED
30 µl
30 µl
30 µl
10 % APS-Lösung
30 µl
30 µl
30 µl
30% Acrylamid /
0,8% Bisacrylamid
2.2.1.3.2 Agarose-Gelelektrophorese von Nukleinsäuren
Zur Analyse und präparativen Reinigung von DNA wird die Agarose-Gelelektrophorese
verwendet. Je nach Größe der aufzutrennenden Fragmente wurden die Agarosegele mit
0,5 bis 2,0% Agaroseanteil in 1x TBE-Puffer hergestellt. Agarose wurde abgewogen,
mit TBE-Puffer versetzt und zum Lösen in der Mikrowelle zum Kochen gebracht. Für
das Gel wurde eine Flachbettkammer abgedichtet und die heiße Agaroselösung hinein
gegossen. Luftblasen wurden entfernt und ein Probenkamm in das Gel gesteckt. Das
Gel wurde dann gekühlt (bei 4oC), es erstarrte und wurde in eine mit 1x TBE gefüllte
Elektrophoresekammer gelegt. Zum Laden der DNA Proben wurden diese mit
Probenpuffer versetzt und in die Geltaschen pipettiert. Die elektrophoretische
Auftrennung erfolgte bei 12 mA/cm2 Gelfläche.
1 x TBE-Puffer:
10 x Agarosegel-Probenpuffer:
89 mM Tris
0,5% (w/v) Bromphenolblau
89 mM Borsäure
0,5 % (w/v) Xylencyanol FF
2 mM EDTA pH 8,0
60% (v/v) Glycerin
2.2.1.4 Detektion von Proteinen und Nukleinsäuren
2.2.1.4.1 Anfärben von Proteinen mit Coomassie Brilliant Blue
Elektrophoretisch aufgetrennte Proteine können mit Coomassie Brilliant Blue G 250
sichtbar gemacht werden, wobei die Nachweisgrenze bei 0,3 μg Protein je Bande liegt.
Das Gel wird nach der Elektrophorese im Coomassie-Färbebad mindestens 30 min
inkubiert, intensivere Banden können mit mehrmaliger Färbung und Entfärbung oder
einer Färbung über Nacht (12 - 16 h) erzielt werden. Anschließend wird das Gel unter
28
Material und Methoden
mehrfachem Erneuern des Entfärbebads mehrere Stunden entfärbt. Gestoppt wird der
Entfärbevorgang mit 5% Essigsäure oder Wasser.
Färbelösung:
Entfärbelösung:
0,2% (w/v) Coomassie Brilliant Blue R 250
45% (v/v) Ethanol
0,05 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue G 250
10% (v/v) Essigsäure
42,5% (v/v)Ethanol
5% (v/v)Methanol
10% (v/v)Essigsäure
Alternativ kann das SDS-Gel in einer Lösung von 10% Ethanol, 5% Essigsäure und
0,002% Coomassie Brilliant Blue G 250 über Nacht gefärbt werden.
2.2.1.4.2 Anfärben von Nukleinsäuren mit Ethidiumbromid
Elektrophoretisch aufgetrennte Nukleinsäuren können mit Ethidiumbromid im UVLicht
sichtbar
gemacht
Ethidiumbromidbad
werden.
inkubiert
und
Hierzu
wurde
anschließend
das
unter
Gel
15-20
UV-Licht
min
bei
im
254
beziehungsweise 365 nm detektiert. Ethidiumbromid interkaliert in die DNA und
fluoresziert dabei intensiv orange. Bei 365 nm wird vor allem DNA detektiert, die noch
für weitere Reaktionen zur Verfügung stehen soll, also z.B. durch Restriktionsverdau
gewonnene DNA-Fragmente. Durch längere Wellenlängen wird die Mutatiosrate
herabgesetzt.
2.2.1.4.3 Proteindetektion durch Western-Blot
Mit dem Western-Blot kann man geringe Konzentrationen eines bestimmten Proteins in
einer gemischten Proteinlösung nachweisen. Nach Auftrennung einer Proteinprobe
durch eine SDS-PAGE werden die Proteinbanden durch Elektrotransfer auf eine
Membran übertragen. Ein Primärantikörper gegen ein spezielles Protein kann nun an
das zugängliche Zielprotein binden. Durch einen Sekundärantikörper gegen den
Primärantikörper mit radioaktiver Markierung oder Phosphataseaktivität kann die
Proteinbande visualisiert werden. Diese Methode ist bei Verwendung von
monoklonalen Primärantikörpern höchst empfindlich und spezifisch.
In dieser Arbeit wurde der semi-dry Western-Blot mit einer BioRad-Blotkammer und
Sekundärantikörpern mit gekoppelter Alkalischer-Phosphatase verwendet (UmeshKumar, et al. 1994, Vatsala Maitin et al., 2001), um MBP spezifisch nachzuweisen.
29
Material und Methoden
10xBlot Transfer Puffer (BTB):
1 x Transfer/Fixier - Puffer (TF):
480 mM Tris
10% 10 x BTB
390 mM Glycin
20 % Methanol
0,375% SDS
Abbildung 12: Aufbau eines semi-dry Western-Blots
Ein frisches SDS-Gel wurde 30 min in TF fixiert. Zeitgleich wurden die zugeschnittene
PVDF-Membran und das Whatman-Papier (2 x 2 Stücke) 15 min in TF inkubiert.
Danach wurden Anode und Kathode der Blotkammer mit TF angefeuchtet und gemäß
Abbildung 12 wurden SDS-Gel, PVDF-Membran und Whatman-Papier blasenfrei
geschichtet. Anschließend wurden 60-90 min mit 25 V und 400 mA geblottet. Nach
dem Blot wurde die Membran mit Ponceau S angefärbt, die Protein- und Markerbanden
wurden mit Bleistift markiert und die Membran mit dH2O gewaschen. Das geblottete
Gel wurde mit Coomassie gefärbt, um den Proteintransfer zu dokumentieren.
TBS - Puffer:
TBS-Tween/Triton - Puffer (TBSTT):
20 mM
Tris/HCl pH 7,5
20 mM
Tris/HCl pH 7,5
150 mM
NaCl
500 mM
NaCl
0,05%
Tween 20
0,2%
Triton X-100
Die Membran wurde anschließend 2 x 10 min mit TBS gewaschen und danach 1-2 h bei
Raumtemperatur (RT) oder über Nacht bei 4oC in 3% BSA in TBS geblockt. Alternativ
wurde auch mit 1% alkali-löslichem Casein in TBS oder 10% Milch-Pulver in TBS
geblockt. Nach dem Blocken wurde die Membran 2 x 10 min mit TBSTT und 1 x 10
min mit TBS gewaschen. Der Primärantikörper (anti-MBP, verdünnt: 1:10.000) wurde
1-2 h bei RT (oder über Nacht bei 4oC) inkubiert. Anschließend wurde wieder 2 x 10
min mit TBSTT und 1 x 10 min mit TBS gewaschen. Danach wurde der
Sekundärantikörper (anti-rabbit, verdünnt: 1:25.000) 0,5-1 h bei RT (oder über Nacht
bei 4oC) inkubiert. Ein weiterer Waschschritt mit 2 x 10 min TBSTT und 1 x 10 min
TBS folgte.
30
Material und Methoden
Puffer A:
100 mM
Tris/HCl pH 9,5
100 mM
NaCl
5 mM
MgCl2
NBT-Stock:
5% NBT (Nitroblau-Tetrazolium) in 70% Dimethyformamid
BCIP-Stock:
5% BCIP (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphat) in 100%
Dimethyformamid
Die Farbreaktion wurde durch die mit dem Sekundärantikörper gekoppelte Alkaline
Phosphatase (AP) katalysiert. Die Membran musste dazu 2 x 10 min mit Puffer A
gewaschen werden. Direkt vor der Färbung wurden 66 µl NBT-Stock, 33 µl BCIPStock und 10 ml Puffer A vermischt. Die Membran wurde 2-5 min in die Färbelösung
gegeben bis es zur Farbreaktion kam. Als letzter Schritt wurde die Membran mit dH2O
gewaschen und getrocknet. Sie wurde dann dunkel gelagert, um ein Ausbleichen zu
verhindern.
In
dieser
Arbeit
wurde
versucht
mittels
Western-Blot
MBP-
Kontaminationen in aufgereinigten MnmA-Lösungen zu detektieren.
2.2.1.5 DNA-Extraktion aus Agarosegelen
Diese Methode eignet sich, um 70 bp bis 10 kb lange DNA-Fragmente aus niedrigschmelzenden Standard-Agarosegelen zu extrahieren und zu reinigen. In dieser Arbeit
wurde dazu das Gel Extraction Kit der Firma Qiagen benutzt. Die durch
Ethidiumbromid angefärbte DNA (vgl. 2.2.1.4.2) wurde aus dem Agarosegel
ausgeschnitten und aus der Agarose herausgelöst. Anschließend wurde sie an eine Säule
gebunden, gewaschen und von der Säule eluiert. Es wurde nach Angaben des
Herstellers verfahren.
Für die Klonierung von DNA-Fragmenten in Vektorsysteme ist diese Methode nützlich,
da elektrophoretisch aufgetrennte DNA aus den Agarosegelen ausgeschnitten und so
aufgereinigt werden kann. Bei den ausgeschnittenen DNA-Banden handelte es sich um
bereits mit Restriktionsenzymen geschnittene DNA-Fragmente und Vektoren, die von
ungeschnittener und einfach geschnittener DNA getrennt wurden.
2.2.1.6 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
Die Konzentration wässriger Nukleinsäurelösungen wird quantitativ im Photometer bei
260 nm gegen einen Leerwert bestimmt (Sambrook et al., 1989). Folgende
Umrechnungswerte werden hierbei herangezogen:
31
Material und Methoden
1 A (260) = 50 μg/ml doppelsträngige DNA
1 A (260) = 40 μg/ml einzelsträngige DNA
1 A (260) = 33 μg/ml Oligonukleotid
Die Reinheit der Nukleinsäurelösung wird über den Quotient der Extinktionen bei 260
nm und 280 nm ermittelt.
Während die aromatischen Basen der Nukleinsäuren ein Absorptionsmaximum von 260
nm und ein Halbmaximum bei 280 nm besitzen, absorbiert Tryptophan, eine
aromatische Aminosäure der Proteine, vor allem im Bereich von 280 nm. Reine DNA
liegt bei einem Quotienten von 1,8 bis 2,0 vor. Mit Proteinen verunreinigte DNALösungen besitzen einen kleineren A260/ A280 Quotienten.
2.2.1.7 Trocknen von Polyacrylamidgelen
Polyacrylamidgele
können
zu
Dokumentationszwecken
auch
zwischen
zwei
Cellophanfolien getrocknet werden. Dazu wurde zunächst eine in Wasser eingeweichte
Cellophanfolie, dann das Polyacrylamidgel und anschließend eine zweite in Wasser
eingeweichte Cellophanfolie auf einen Spannrahmen gelegt. Das Gel musste gut
entsalzt sein, da sonst Verfärbungen auftraten. Zwischen Gel und den Folien, sowie
zwischen beiden Folien, sollte sich keine Luftblase befinden, um ein Einreißen des Gels
zu vermeiden. Nun wurde ein zweiter Rahmen auf die Folien gelegt und mit Klammern
fixiert. Im Geltrockner bei etwa 70° C in heißer Umluft war das Gel nach zwei Stunden
getrocknet. Bei Raumtemperatur war das Gel nach 20 Stunden getrocknet und konnte
aus den Rahmen genommen und archiviert werden.
2.2.2 Molekularbiologische Methoden
2.2.2.1 Klonierung von Proteinen in Expressionsvektoren
Plasmide sind bei Bakterien natürlich vorkommende ringförmige DNA-Moleküle, die
zusätzliche Gene tragen (z.B. Antibiotikaresistenzen) und zwischen Bakterien
ausgetauscht werden können. Es ist auch möglich, solche Plasmide zu modifizieren und
in Bakterien zu einzuschleusen.
Bei Klonierungen wird das Zielgen zunächst amplifiziert und anschließend in einen
geeigneten Vektor gebracht. Das daraus resultierende Plasmid besitzt für die
nachfolgende Expression der eingebrachten Gene wichtige Eigenschaften, wie zum
Beispiel einen induzierbaren Promotor für eine gerichtete Expression, Gene für die
32
Material und Methoden
Inaktivierung von Antibiotika und schließlich das Zielprotein. Wichtig bei
Klonierungen ist, dass das Zielgen im Leseraster liegt.
Für die Proteinexpression beliebte Vektoren sind solche, die aufwärts (in 5'-Richtung)
oder abwärts (in 5'-Richtung) vom einklonierten Gen eine codierende Sequenz für ein
Peptid oder Protein besitzen (so genannte Affinitätssequenzen). Eine solche
Affinitätssequenz (engl. tag) erleichtert die spätere Proteinaufreinigung. Solche
Konstrukte sind z.B. N-terminale GST-Fusionsproteine in pGEX-Vektoren, N-terminale
MBP-Fusionsproteine in pMAL-Vektoren, N- oder C-terminale His-Sequenz-Proteine
in einigen pET-Vektoren und N- oder C-terminale Strep-Tags der pASK-IBA-Vektoren.
2.2.2.1.1 DNA-Amplifizierung durch die Polymerasekettenreaktion (PCR)
Die Polymerasekettenreaktion (engl. polymerase chain reaction, PCR) ist eine Methode,
um DNA-Sequenzen spezifisch zu amplifizieren (Mullis et al., 1986). Für die PCR
werden kurze, die gewünschte Sequenz flankierende 3„- und 5„-DNA-Oligonukleotide,
kurz: Oligos, von etwa 20 bis 30 Basenpaaren Länge benötigt, so genannte „primer“,
die den Anfangs- beziehungsweise Endpunkt der Sequenz definieren und als Startpunkt
für das Enzym DNA-Polymerase dienen. Zur Durchführung der PCR werden zu einer
DNA-Lösung, die die Zielsequenz besitzt, ein Paar von Primern, alle vier
Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs) und eine hitzestabile DNA-Polymerase, z.B.
aus Thermus aquaticus, gegeben.
Ein PCR-Zyklus besteht aus drei Schritten:
I. Spaltung der DNA-Doppelhelix: für die Hitzedenaturierung der DNA wird das
Reaktionsgemisch auf 95°C erhitzt. Die beiden komplementären DNA-Stränge
werden voneinander getrennt.
II. Hybridisierung der Primer mit der DNA („annealing“): der PCR-Ansatz wird auf
eine Temperatur gesenkt, die etwa 3° C unter den Schmelzpunkten der Primer
liegt, um ein optimales, weil hochspezifisches Hybridisieren der Primer mit der
DNA zu gewährleisten.
III. DNA-Synthese durch die DNA-Polymerase: die optimale Temperatur für die
verwendeten
Taq-
und
Pfu-DNA-Polymerasen
liegt
bei
68-72°C.
Die
Elongationszeit hängt von der Länge des zu amplifizierenden Fragments ab und
sollte bei etwa 1 min pro 1000 Basenpaaren liegen.
33
Material und Methoden
Diese drei Schritte laufen mehrmals hintereinander ab, um eine ausreichende Menge an
PCR-Produkt zu erhalten. Die bereits entstandenen DNA-Stränge dienen in den
Folgezyklen wiederum als Matrizen, so dass die Vermehrung der zu amplifizierenden
DNA-Sequenz exponentiell zunimmt.
Für die Klonierung in Vektoren enthalten die Primer normalerweise bereits die
Sequenzen für die 5' und 3' Restriktionsschnittstellen, mit deren Hilfe das korrekte
Einpassen der DNA-Sequenz in den Zielvektor gelingt. Bei der Umklonierung eines
Gens von einem Vektor in den anderen können diese Restriktionsschittstellen für den
Zielvektor entweder durch Primer in der PCR eingeführt werden oder sie werden durch
einen Zwischenklonierungsschritt aus einem weiteren Vektor in den Zielvektor
„eingeschleppt“.
Um den korrekten Einbau eines Inserts in einen Vektor nach einer erfolgreichen
Transformation eines Bakterienstammes mit diesem Vektor zu untersuchen, wird eine
Kolonie-PCR durchgeführt. Die einzelnen transformierten Kolonien auf einer
Selektionsplatte können so auf das richtige Insert untersucht werden.
Für einen typischen PCR-Ansatz (50 µl) für einen Kolonie-PCR wurde pipettiert:
1 µl
5´-Primer 10 mM
1 µl
3´-Primer 10 mM
1 µl
dNTPs 100 mM
5 µl
Taq-Polymerase-Puffer (10x)
1 µl
Taq-Polymerase 5 U/µl
41 µl
ddH2O
+
Kolonien auf einer Pipettenspitze
Die PCR zur Amplifizierung von MnmA aus genomischer DNA von T. maritima wurde
im Thermocycler mit folgendem Programm durchgeführt:
1. Denaturierung
94° C
10 min
2. Denaturierung
94° C
1s
3. Hybridisierung
65° C
45 s
4. Elongation
72° C
1:10 min
5. Elongation
72° C
10 min
6. Pause
4° C
Schritte 2-4 30x wiederholen
34
Material und Methoden
2.2.2.1.2 Spaltung von DNA durch Restriktionsendonukleasen
Restriktionsendonukleasen
erkennen
spezifische
Basensequenzen
in
DNA-
Doppelhelices und hydrolysieren die Phosphodiesterbindungen zwischen zwei
Nukleotiden. Man findet diese Enzyme in Prokaryoten, dort dienen sie dem Abbau von
Fremd-DNA, die eigene DNA bleibt aufgrund eines bestimmten Methylierungsmusters
ungespalten. Restriktionsendonukleasen haben für das Klonieren von DNA große
Bedeutung gewonnen. Ihre bemerkenswerteste Eigenschaft besteht darin, Sequenzen
mit zweifacher Rotationssymmetrie, so genannte Palindrome, zu erkennen und so zu
spalten, dass überhängende DNA-Enden, „sticky ends“ entstehen. Diese überhängenden
DNA-Enden hybridisieren leicht mit komplementären Enden und ermöglichen so das
gerichtete Einklonieren in mit den gleichen Enzymen ebenfalls zu „sticky ends“
geschnittene Vektoren. Die Restriktionsanalyse von Plasmiden aus „Mini-“ und „MidiPreps“ (vgl. 2.2.2.3) dient der Größenanalyse der vorhandenen Fremdgene.
Ein typischer Ansatz von 20 μl enthielt:
1 µg
DNA
2 µl
Restriktionsenzympuffer (10x)
0,5 µl (entspricht 1 U)
Restriktionsendonuklease für 3‟ Schnittstelle
0,5 µl (entspricht 1 U)
Restriktionsendonuklease für 5‟ Schnittstelle
2 µl
BSA (10x) (von einigen Enzymen benötigt)
ad 20
l
ddH2O
Der Ansatz wurde für 1 - 12 h (abhängig von den verwendeten Restriktionsenzymen)
bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die geschnittenen Fragmente mit einem
Agarosegel (vgl. 2.2.1.3.2) analysiert und gegebenenfalls für
anschließende
Klonierungen aus dem Gel ausgeschnitten und eluiert (vgl. 2.2.1.5).
2.2.2.1.3 Ligation eines verdauten DNA-Fragments in einen Zielvektor durch
DNA-Ligasen
Ligasen katalysieren die Phosphodiesterbildung benachbarter Nukleotide eines DNAStranges. In der Natur spielen sie deshalb bei der DNA-Replikation eine entscheidende
Rolle. Sie verknüpfen z.B. bei der DNA-Replikation die Okazaki-Fragmente eines zum
Mutterstrang
neu
gebildeten,
komplementären
Tochterstranges.
In
der
Molekularbiologie werden sie dazu benutzt, komplementäre sticky ends von DNAFragmenten nach der Hybridisierung der überhängenden Enden zu verknüpfen. Sie
ermöglichen auf diese Weise das Einklonieren von Genen in ein geschnittenes Plasmid.
35
Material und Methoden
Ein typischer Ligationsansatz setzte sich wie folgt zusammen:
0,2 µl
T4-DNA-Ligase (10 U/µl)
2 µl
geschnittener Vektor
6 µl
Insert (verdautes Gen)
2 µl
T4-DNA-Ligase-Puffer (10x)
ad 20 µl
ddH2O
Die Ligation wurde bei 4oC über Nacht oder bei 16oC über 3-6 Stunden durchgeführt.
2.2.2.2 Sequenzierung von DNA-Fragmenten
Die Sequenzierung von DNA wird mit der didesoxy-Methode nach Sanger (1977)
durchgeführt. Dabei werden bei der Amplifizierung der zu sequenzierenden DNA in
einer PCR Kettenabbrüche der Polymerase-Reaktion durch den zufälligen Einbau eines
ddNTPs (didesoxy-Ribonukleosidtriphosphat) erzeugt. Hierzu werden vier PCRAnsätze mit dNTPs versetzt. Eines der vier liegt jedoch nicht als dNTP, sondern als
ddNTP vor. Da hier die 3´-OH-Gruppe fehlt, kommt es zum Kettenabbruch. Der
Statistik folgend ist damit jedes mögliche auf das entsprechende ddNTP-endende
Fragment im jeweiligen Reaktionsansatz vorhanden. Durch einen Längenabgleich der
Fragmente aus den vier Reaktionsansätzen kann so die Sequenz abgeleitet werden. Mit
dem Seq-Mix BigDye Terminator v1.1 von Applied Biosystems kann die komplette
Reaktion in einem einzigen Ansatz durchgeführt werden.
Für eine typische Sequenzierungs-PCR wurde folgender Ansatz pipettiert:
200 ng
Template
8 pmol
Primer
1 µl
Seq-Mix
1 µl
Seq-Puffer
ad 10 µl
ddH2O
Das PCR-Programm für Sequenzierungsreaktionen ist dem unter 2.2.4.1.1 genannten
Programm analog. Die Annealing-Temperatur war abhängig von den verwendeten
Sequenzierprimern (ca. 50oC).
Nach der PCR wurden die Produkte für den Sequenzierungsautomaten aufgereinigt, um
störende Faktoren wie Primer und Polymerase zu entfernen.
Dem PCR-Ansatz wurden 1 µl 125 mM EDTA, 1 µl 3 M NaAc und 50 µl Ethanol
zugegeben. Dann wurde vorsichtig durch leichtes Antippen mit der Fingerspitze
36
Material und Methoden
durchmischt, für 5 min inkubiert und anschließend zentrifugiert (20.000 x g, 15 min, 4°
C). Der Überstand wurde abgenommen und das Pellet in 70 µl Ethanol 70 %
gewaschen. Es folgte eine weitere Zentrifugation (20.000 x g, 5 min, 4° C). Das Pellet
wurde 10 min an der Luft oder 2 min im Speedvak getrocknet und schließlich in 30 µl
HPLC-Wasser aufgenommen. Die gereinigten DNA-Fragmente wurden in dieser Arbeit
in einem Kapillarsequenzierer von Applied Biosystems analysiert.
2.2.2.3 Plasmidpräparationen
2.2.2.3.1 Plasmidpräparation im kleinen Maßstab
Bei Mini-Präparationen (kurz: „Mini-Preps“) werden Plasmide aus einer 10-50 ml
großen E. coli-Übernachtkultur isoliert. Für Mini-Preps wurde das NucleoSpin Plasmid
Kit von Macherey-Nagel verwendet. Dabei wurde nach den Angaben zur Isolation im
Benutzerhandbuch des Herstellers verfahren.
2.2.2.3.2 Plasmidpräparation im mittleren Maßstab
Für die Vermehrung und Isolierung von DNA in mittlerem Maßstab, um klonierte
Plasmide für Expressionsetablierungen zu erhalten, werden Midi-Präparationen (kurz:
„Midi-Preps“) durchgeführt. Dabei wurden 100-200 ml einer E. coli-Übernachtkultur
aufgeschlossen und die DNA präpariert. In dieser Arbeit wurde das Plasmid Midi Kit
von Qiagen benutzt und die DNA nach den Angaben des Herstellers isoliert.
2.2.3 Zellbiologische Methoden
2.2.3.1 Expression von rekombinanten Proteinen in E. coli
E. coli Zellen enthalten nach der Transformation einen Vektor, der ein einkloniertes
Fremdgen sowie ein oder mehrere Gene für Antibiotikaresistenzen enthält. Die
Antibiotikaresistenzen auf dem eingebrachten Plasmid ermöglichen das Wachstum der
plasmidtragenden Bakterien auf einem antibiotikahaltigem Medium, das gleichzeitig
wachstumshemmend oder letal auf andere Bakterien, die das Plasmid nicht enthalten,
wirkt. So können plasmidtragende Bakterien durch Antibiotika positiv selektiert und
Kontaminationen mit fremden Bakterien vermieden werden. Das einklonierte Fremdgen
ist bei den hier verwendeten Plasmiden so lokalisiert, dass die Expression unter der
Kontrolle eines IPTG-induzierbaren Lac-Promotors, z.B. T5 oder T7, oder eines
AHTC-induzierbaren TetA-Promotors liegt und gleichzeitig das Gen im offenen
37
Material und Methoden
Leserahmen zu liegen kommt. Das eingebrachte Plasmid erlaubt unter diesen
Bedingungen die selektive Expression des klonierten Fremdgens.
Einige der in dieser Arbeit verwendeten Bakterienstämme benötigten zusätzlich zu den
Selektionsantibiotika, die für die Expression benötigt wurden, Kanamycin für den
Erhalt des pREP4-Plasmides, das für einen Promotorrepressor codiert oder
Chloramphenicol für den Erhalt der RIL- bzw. pLys-Plasmide. Diese senken die
Basisexpression und verhindern so die Vermehrung von im Wachstum begünstigten
Deletionsmutanten.
2.2.3.2 Medien zur Aufzucht von E. coli
LB-Medium:
10 g
Bacto-Tryptone
5g
Bacto-Yeast extract
10 g
NaCl
ad 1 l H2O.
Die Sterilisation erfolgt durch Autoklavieren, die Lagerung bei Raumtemperatur.
(Bertani, 1951)
LB-Agar für Selektionsplatten:
250 ml
LB-Medium
3g
Agar-Agar
Der Agar wurde durch Erhitzen gelöst. Sobald der LB-Agar unter stetigem Rühren auf
etwa 40-45° C abgekühlt war, wurden 250
l Ampicillin (100mg/ml) und/oder
Chloramphenicol (100mg/ml) und/oder Kanamycin (50mg/ml) unter Rühren zugegeben.
Nun wurde der Agar in Platten gegossen. Sollten die Agar-Platten nicht selektiv sein, so
wurde auf den Zusatz von Antibiotika verzichtet. Die Lagerung erfolgte bei 4° C.
2.2.3.3 Transformationen in Bakterienstämme
2.2.3.3.1 Herstellung chemisch kompetenter E. coli-Zellen
Für die Transformation von E. coli mit einem gewünschten Vektor muss der
entsprechende Bakterienstamm zuerst kompetent für die Aufnahme von Plasmiden
gemacht werden. Dabei wird die Zellmembran des Bakteriums durch eine chemische
Behandlung perforiert. Durch diese poröse Membran können nun Plasmide in das
Bakterium eingeschleust werden.
Zunächst wurde ein Aliquot des Stammes, der kompetent gemacht werden soll, auf
einer antibiotikafreien LB-Agar-Platte ausgestrichen und über Nacht bei 37° C
38
Material und Methoden
inkubiert. Eine Kolonie wurde in 5 ml LB-Medium überimpft und über Nacht bei 37° C
inkubiert. Die 5 ml Vorkultur wurde 1:100 in 500 ml LB-Medium verdünnt und bei 37°
C bis zu einer OD600 von 0,6 wachsen gelassen. Die Ernte erfolgte durch Zentrifugation
(6.000 g, 10 min, 4° C). Das Pellet wurde in 150 ml eiskaltem TFB1-Puffer
resuspendiert und 5 min auf Eis inkubiert. Nach einer weiteren Zentrifugation (3.000 g,
10 min, 4° C) wurde das Pellet in 5 ml eiskaltem TFB2-Puffer vorsichtig resuspendiert.
Die kompetenten Zellen wurden nun unter Kühlung durch flüssigen Stickstoff
aliquotiert. Die Lagerung erfolgte bei -80° C.
TFB1-Puffer:
TFB2-Puffer:
30 mM
KAc pH 7,0
10 mM
NaMOPS pH 7,2
50 mM
MnCl2
75 mM
CaCl2
10 mM
CaCl2
10 mM
RbCl2
100 mM
RbCl2
15 % (v/v)
Glycerin
15 % (v/v)
Glycerin
Der pH wurde mit 0,2 M HAc auf 5,8 eingestellt. Der pH wurde mit 1 M NaOH auf
Es folgte Sterilfiltration.
6,5 eingestellt.
Es folgte Sterilfiltration.
2.2.3.3.2 Transformation chemisch kompetenter E. coli-Zellen
Unter Transformation versteht man das Einschleusen von Plasmid-DNA in
Bakterienzellen. Zu 50 μl kompetenter Zellen wurden 20 μl Ligationsansatz oder 100
ng bis 1 µg Plasmid-DNA pipettiert und gemischt. Die Zellen wurden dann 20 Minuten
auf Eis inkubiert. Für die DNA-Aufnahme wurden die Zellen bei 42°C für 45 Sekunden
inkubiert und anschließend 2 Minuten auf Eis gestellt. Nach Zugabe von 1 ml
antibiotikafreiem LB-Medium wurden die Zellen 60 Minuten bei 37°C unter Schütteln
inkubiert. 50 µl, 100 µl und 200µl des Transformationsansatzes wurden je auf einer
Selektionsplatte ausgestrichen, kurz an der Luft getrocknet und die Platten umgedreht
über Nacht bei 37°C inkubiert. Bei Transformationen von Ligationsansätzen wurde die
angewachsene 1 ml-Kultur scharf abzentrifugiert, das LB-Medium wurde vollständig
abgenommen und durch 100 ml frisches LB-Medium ersetzt. Die Zellen wurden dann
durch Pipettieren resuspendiert und der gesamte Ansatz wurde ausplattiert. Auf diese
Weise konnte man schon einen großen Teil der DNA (Vektor & Insert) abtrennen, die
nicht aufgenommen wurde und so die Anzahl falsch-positiver Kolonie-PCRs
verringern.
39
Material und Methoden
2.2.3.4 Überexpression von rekombinanten Proteinen in E. coli
2.2.3.4.1 Anzucht einer Vorkultur
Für eine Bakterienkultur, die zur Überexpression von rekombinanten Proteinen
herangezogen werden soll, wird zunächst eine Vorkultur angezogen. In einem Kolben
wurden 10-50 ml LB-Medium mit den Selektionsantibiotika versetzt und mit einem
Abstrich einer bewachsenen Agarplatte angeimpft. Bei 37°C wurde die Kultur
schüttelnd für 14 bis 16 Stunden inkubiert.
2.2.3.4.2 Anzucht einer Expressionskultur
Im Allgemeinen wurde LB-Medium im gewünschten Endvolumen, z.B. 1 Liter, mit den
entsprechenden Antibiotika versetzt und mit der vorbereiteten E. coli Vorkultur 1:30 bis
1:100 angeimpft. Im Inkubator wurden die Zellen bei 37°C, dem Temperaturoptimum
von E. coli, oder bei geringeren Temperaturen bis zu einer OD600 von etwa 0,5-0,7
wachsen gelassen.
Zur Induktion der Proteinexpression wurde die Zellsuspension mit IPTG in einer
Endkonzentration von 0,5 bis 1 mM oder mit 0,5
M AHTC versetzt (je nach
Promotor). Nun wurden die Zellen weiter schüttelnd inkubiert, bis eine OD600 von 1,52,0 erreicht ist. An diesem Punkt verlässt die Kultur den logarithmischen
Wachstumsbereich und geht in die stationäre Phase über. Die Zellen wurden 15 min bei
6000 x g und 4° C abzentrifugiert, anschließend einmal mit eiskaltem Lysispuffer (z.B.
PBS) gewaschen (vgl. 2.2.3.5) und das Pellet bis zur Proteinaufreinigung bei –20° C
gelagert.
Einige Proteine akkumulieren in E. coli in so genannten Proteineinschlusspartikeln
(engl. inclusion bodies). Es gibt mehrere Möglichkeiten, dies zu vermeiden. Zunächst
kann die Induktionstemperatur gesenkt werden, um eine niedrigere Expressionsrate zu
erreichen. Zusätzlich kann 1-2% Glucose zugegeben werden, um die Basisexpression
des Zielproteins zu reprimieren. Da nämlich das einklonierte Gen unter der Kontrolle
eines Lac-Promotors liegt, wirkt ein Abbauprodukt der Lactose, wie z.B. Glucose,
inhibierend auf die Repressorfreisetzung vom Promotor vor dem eigentlichen Gen.
Glucose reprimiert ebenfalls die Synthese anderer Proteine, die an Stoffwechselwegen
beteiligt sind. Schließlich können andere Expressionsstämme getestet werden.
40
Material und Methoden
Folgende Expressionsvektoren wurden in verschiedene Wirtsstämme transformiert:
exprimiertes Protein
Expressionsvektor
Antibiotikaresistenz
MBP-MnmA
pMal-c2x
Ampicillin
MnmA-Strep-tag II
pASK-IBA3
Ampicillin
MnmA ohne Affinitätssequenz
pET-28a
Kanamycin
2.2.3.5 Ernten und Aufschließen von E .coli-Zellen
Um rekombinante Proteine aus Bakterienzellen zu isolieren, müssen die Zellen geerntet
und aufgebrochen werden. Die Ernte erfolgte durch Zentrifugation (6.000 x g, 15 min,
4° C) und einmaligem Waschen in eiskaltem PBS-Puffer (140 mM NaCl, 10 mM
NaH2PO4/Na2HPO4 pH 7,4) mit anschließender Zentrifugation (4.800 g, 20 min, 4° C).
Der Zellaufschluss konnte mechanisch, durch pneumatische Zelldesintegration
(Fluidizer), durch Zusatz von Lysozym und Schockgefrieren oder physikalisch durch
Ultraschalldesintegration
(Sonifier)
erfolgen.
In
dieser
Arbeit
wurden
die
Bakterienzellen entweder im Fluidizer oder durch Ultraschallbehandlung im Sonifier
aufgeschlossen.
Ein Zellpellet aus 1 l Schüttelkultur (vgl. 2.2.3.4.2) wurde in 30 ml Lysispuffer
aufgetaut und resuspendiert. Die Zusammensetzung des Lysispuffers richtete sich nach
den Erfordernissen des ersten Aufreinigungsschrittes (vgl. 2.2.4.1). Um proteolytische
Enzyme zu inaktivieren, wurde vor dem Auftauen eine halbe Tablette Protease Inhibitor
Cocktail Complete EDTA-free im Lysispuffer gelöst. Der Zellaufschluss im Fluidizer
wurde bei 80-90 psi in 4-5 Zyklen durchgeführt. Beim Aufschluss im Sonifier wurde
die Zellsuspension auf Eiswasser fünfmal für 45 Sekunden sonifiziert. Dabei wurden
folgende Einstellungen verwendet: duty cycle 50%, output control 7.
Nach dem Aufschluss der Zellen wurde die Suspension in JA30-Zentrifugenröhrchen
überführt und ultrazentrifugiert (108.000 x g, 30 min, 4°C). Alternativ konnten die
Zelltrümmer auch durch 30 minütige Zentrifugation bei 40.000 x g (4°C) und
anschließender Sterilfiltration mit einen 0,2 µm Vorsatzfilter von Vivascience entfernt
werden. Nach der Trennung des Lysats in Zelltrümmer und Überstand wurde Proben
über SDS-PAGE analysiert und der Überstand wurde chromatographisch aufgetrennt.
41
Material und Methoden
2.2.4 Biochemische Methoden
2.2.4.1 Chromatographische Trennmethoden
Es gibt zahlreiche chromatographische Trennmethoden, wie z.B. Affinitäts-, Gel-,
Ionenaustausch- oder Gaschromatographie. Bei der nativen Trennung von Proteinen
wird meist auf Affinitäts-, Ionenaustausch- und Gelchromatographie zurückgegriffen.
Die Affinitätschromatographie beruht auf spezifischen und reversiblen Interaktionen
von Säulenmaterial und Molekül. Abhängig von der Beschaffenheit des Säulenmaterials
und der Probe adsorbieren Moleküle an die Matrix. Das Adsorbens kann von der Säule
durch kompetitive Verdrängung, Konformationswechsel durch Änderung des pHWertes oder durch Änderung der Ionenstärke eluiert werden. Die Affinitätschromatographie stellt eine sehr spezifische und selektive Trennmethode für
Biomoleküle dar.
Bei der Ionenaustauschchromatographie werden geladene Moleküle nach ihrer
Ionenstärke bei einem bestimmten pH-Wert aufgetrennt. Die Trägermatrix der
Chromatographiesäule bietet dabei
Gegenionen
als Bindungspartner für die
aufzutrennenden Moleküle an. Die Auftrennung erfolgt über kompetitive Verdrängung
der Probemoleküle durch stärkere Ionen im Elutionspuffer. Bei Kationentauschern
werden Kationen wie Na+ oder NH4+ verwendet, bei Anionentauschern Cl- oder SO42Schwach geladene Moleküle eluieren früher als stark geladene. Auf diese Weise können
Proteine nativ nach ihrem isoelektrischen Punkt (pI) getrennt werden.
Die Ausschlusschromatographie (Gelfiltration) trennt gelöste Moleküle nach ihrer
Größe auf. Die hierbei verwendeten Chromatographiesäulen bestehen aus einem
porösen Gelmaterial mit definierter Porengröße. Das Trennverhalten basiert auf den
unterschiedlichen hydrodynamischen Volumina der Probenmoleküle. Je nach
Molekülgröße, Molekülgestalt und gewählten Säuleneigenschaften dringen die
Moleküle unterschiedlich tief in die Gelmatrix ein. Kleineren und globulären Molekülen
steht mehr Raum zur Diffusion zur Verfügung als größeren und ungeordneteren. Daher
erfahren kleinere Moleküle durch das tiefere Eindringen in die Gelmatrix eine
Verzögerung und eluieren später von der Säule als größere. Der Elutionspuffer hat
ebenfalls einen Einfluss auf die Trennung der Moleküle. Entscheidend ist hierbei das
Löslichkeitsverhalten unterschiedlicher Moleküle bei der Salzkonzentration des Puffers.
Die Ausschlusschromatographie ist daher eine beliebte Methode, um Proteine nach den
ersten Aufreinigungsschritten von Verunreinigungen abzutrennen.
42
Material und Methoden
Die Auflösung ist abhängig von der Flussgeschwindigkeit und dem aufgetragenen
Probenvolumen, wobei kleine Volumina vorzuziehen sind.
2.2.4.1.1 Affinitätschromatographische Aufreinigung von MBP-Fusionsproteinen
über Amylose-Harz
Proteine, die mit N-terminalem Maltose-Bindeprotein exprimiert wurden (pMal-c2x),
lassen sich selektiv über eine Affinitätschromatographie mittels einer AmyloseGelmatrix aufreinigen (Maina et al., 1988). Hierbei wird die Amylose, ein MaltosePolymer, vom MBP-Anteil eines Fusionsproteins als Substrat erkannt und gebunden.
Da das Primärsubstrat (Maltose) des Maltose-Bindeproteins aber spezifischer als
Amylose gebunden wird (Kellerman et al., 1982), löst sich das Fusionsprotein durch
Zugabe gelöster Maltose (20 mM) und wird eluiert. Grosse Zielproteine (> 60 kDa) sind
mit diesem System nur schwer aufzureinigen, da die Interaktion von MBP und Amylose
gestört wird und das Fusionsprotein relativ schwer wird. MBP fördert mit seinen 43
kDa zwar die Löslichkeit, aber das Risiko, dass das Fusionsprotein in „inclusion
bodies“ verpackt wird und damit unlöslich ist, steigt. Ein weiterer Nachteil ist, dass ein
Maltose-Bindeprotein, welche bei der Expression durch Zugabe von Glucose etwas
reprimiert wurde, und andere zuckerbindende Proteine von E. coli ebenfalls an Amylose
binden können und so das Aufreinigungsergebnis verschlechtern. In dieser Arbeit wurde
für die Aufreinigung von MnmA mit MBP-Fusionsprotein Amylose-Säulenmaterial von
New England Biolabs, sowohl gepackt in einer XK 16/20-Säule (30 ml Gelmatrix) als
auch als lose Gelmatrix, verwendet. Alle Aufreinigungen wurden bei 4oC durchgeführt,
um einen Abbau der Amylose durch Amylasen aus E. coli zu verlangsamen.
Vor der Aufreinigung wurde die 30 ml Amylose-Säule (XK 16/20) an einer Äkta Prime
bei 4oC mit drei Säulenvolumina ddH2O gespült und mit drei Säulenvolumina Waschund Bindepuffer equilibriert. Dann wurde der ultrazentrifugierte Rohextrakt des
Zellaufschlusses in ein 50 ml großes Probenreservoir (engl. Superloop) überführt und
die Säule geladen. Anschließend wurde mit drei Säulenvolumina (ca. 90 ml)
Waschpuffer gewaschen, um nicht gebundene Proteine zu entfernen. Dann wurde durch
Zugabe von 20 mM Maltose das MBP-MnmA-Fusionsprotein eluiert. Das Eluat wurde
fraktioniert und die Fraktionen mittels SDS-PAGE analysiert. Die Proben, die das
Zielprotein enthielten, wurden vereinigt (gepoolt). Der Pool wurde für weitere
Aufreinigungsschritte bei 4° C gelagert. Die Amylose-Gelmatrix wurde anschließend
mit drei Säulenvolumina ddH2O gespült und einem Säulenvolumen 0,1%iger SDS-
43
Material und Methoden
Lösung gereinigt, um nicht eluiertes .Protein zu entfernen. Zum Schluss wurde noch
einmal mit drei Volumina ddH2O gewaschen und die Säule in 20% Ethanol überführt.
Wasch-/Bindepuffer:
Elutionspuffer:
50 mM
Tris/HCl pH 8
50 mM Tris/HCl pH 8
100 mM
NaCl
100 mM
NaCl
4 mM
DTT
4 mM
DTT
20 mM
Maltose
2.2.4.1.2 Affinitätschromatographische Aufreinigung von Proteinen mit Streptag II über Strep-Tactin-Sepharose
Für die Aufreinigung von Proteinen mit einer Strep-tag II-Affinitätssequenz (Skerra et
al., 2000) wurde dem Lysispuffer 800 mM NaCl zugesetzt, um gebundene RNA von
MnmA zu lösen. Die Strep-tag II-Affinitätssequenz besteht aus acht Aminosäuren, die
höchst spezifisch am Strep-Tactin-Säulenmaterial binden. Durch die Positionierung der
Affinitätssequenz am C-Terminus (pASK-IBA3) bindet nur vollständig exprimiertes
Zielprotein an der Säule. Es zeigte sich weiterhin ein positiver Effekt auf die Löslichkeit
des Proteins. Die Funktionsweise der Strep-Tactin-Sepharose (Schmidt et al., 1995) ist
vergleichbar mit der Aufreinigung über Amylose-Harz. Für die Aufreinigung von
MnmA mittels Strep-tag II wurde Strep-Tactin-Säulenmaterial von IBA in einer XK
16/20-Säule verwendet.
Vor der Benutzung musste die Säule mit zwei Volumina Wasch- und Bindepuffer
gespült werden, um den Regenerationspuffer zu entfernen. Hatte die Gelmatrix ihre rote
Färbung komplett verloren, war sie fertig äquilibriert. Der ultrazentrifugierte Überstand
des Zellaufschlusses wurde über einen 50 ml Superloop auf die Säule geladen. Nach
dem Beladen wurde mit drei Volumina Puffer gewaschen. Das gebundene Protein
wurde mit 10 ml Elutionspuffer eluiert und fraktioniert. Über ein SDS-Gel wurde die
Reinheit des Zielproteins überprüft. Anschließend wurde die Säule mit drei Volumina
Regenerationspuffer behandelt und bei 4oC gelagert.
Wasch-/Bindepuffer:
Elutionspuffer:
Regenerationspuffer:
100 mM Tris/HCl pH 8
100 mM Tris/HCl pH 8
100 mM Tris/HCl pH 8
800 mM NaCl
800 mM NaCl
150 mM NaCl
1 mM
EDTA
1 mM
EDTA
1 mM
EDTA
4 mM
DTT
4 mM
DTT
1 mM
HABA
2,5 mM D-Desthiobiotin
44
Material und Methoden
2.2.4.1.3 Anionenaustauschchromatographie über DEAE-Sepharose oder
ResourceQ zur Trennung geladener Proteine
Der Substituent der DEAE-Sepharose, eine Diethylaminoethylgruppe, besitzt relativ
schwache kationische Eigenschaften, da der positiv geladene Stickstoff von positivinduktiven Effekten seiner Ethylgruppen profitiert. Die Bindung von Anionen ist
deshalb eher schwach und besonders selektiv. Daher eignet sich die DEAE-Sepharose
gut für den ersten Aufreinigungsschritt eines Proteins ohne Affinitätssequenz, wenn
noch sehr viele Verunreinigungen in der Probe sind. Schwach geladene Moleküle, d. h.
solche, deren pI knapp über dem Puffer-pH (zwischen 0 und 1 pH-Einheiten darüber)
liegt, eluieren früher, stärker geladene, d. h. jene, deren pI den Puffer-pH deutlich
übersteigt, eluieren später. Entscheidend für eine erfolgreiche Aufreinigung ist daher die
Wahl des pH-Wertes im Elutionspuffer, der etwa eine pH-Einheit über dem pI des
aufzureinigenden Proteins sein sollte. Die hier verwendete DEAE-Sepharose FF von
Amersham Pharmacia Biotech wurde in eine XK16/20-Säule gepackt.
Die ResourceQ-Säule (6 ml Fertigsäule von Amersham Pharmacia Biotech) besitzt
deutlich stärkere kationische Eigenschaften. Ihre Gelmatrix ist mit einem quartären
Amin verknüpft, das stark positiv geladen ist. Das Funktionsprinzip entspricht dem der
DEAE-Säule. Sie wurde verwendet, um MBP und MnmA nach dem proteolytischen
Verdau des MBP-MnmA-Fusionsproteins durch PreScission Protease zu trennen.
Vor der Benutzung der DEAE-Säule wurde mit drei Säulenvolumina ddH2O gespült
und mit drei Volumina Startpuffer äquilibriert. Dann wurde die Probe über einen
Superloop geladen, die Säulenmatrix mit mindestens drei Volumina Puffer gewaschen
und anschließend mit einem linear steigenden Salzgradienten eluiert. Es wurden 5 mlFraktionen gesammelt, die später via SDS-PAGE analysiert wurden. Die Fraktionen mit
dem Zielprotein wurden vereinigt und für weitere Aufreinigungsschritte bei 4° C
aufbewahrt.
Wasch-/Bindepuffer:
Elutionspuffer:
50 mM
Tris/HCl pH 8,8
50 mM
Tris/HCl pH 8,8
100 mM
NaCl
1M
NaCl
4 mM
DTT
4 mM
DTT
Bei Verwendung der ResourceQ wurde vergleichbar verfahren. Das Volumen der
gesammelten Fraktionen wurde jedoch reduziert. Die Säulen wurden nach Benutzung
mit 1 M NaOH gespült und wieder in 20% Ethanol überführt.
45
Material und Methoden
2.2.4.1.4 Kationenaustauschchromatographie über CM-Sepharose, Source 30S
oder ResourceS zur Trennung geladener Proteine
CM-Sepharose besitzt durch den Carboxymethyl-Substituenten eine relativ schwache
negative Ladung. Das Material eignet sich wie auch DEAE-Sepharose zur Trennung
von Molekülen ohne Affinitätssequenz aus Rohextrakten, mit dem Unterschied, dass
positiv geladene Moleküle statt negativ geladener binden können. Schwach geladene
Proteine binden kaum, während stark geladene gut binden können. Der pH-Wert des
Elutionspuffers sollte etwa eine Einheit unter dem pI des aufzureinigenden Proteins
sein, um das Protein positiv zu laden und gut zu binden.
Source 30S und ResourceS besitzen durch eine alkylsubstitierte Schwefelgruppe stark
anionische Eigenschaften. Sie eignen sich daher zur spezifischen Trennung einiger
weniger Proteine mit ähnlichen isoelektrischen Punkten.
CM-Sepharose FF und Source 30S von Amersham Pharmacia Biotech wurden in
XK16/20-Säulen gepackt und die 1ml ResourceS war eine Fertigsäule. Die
Durchführung der Kationenaustauschchromatographie entspricht auf Grund der
ähnlichen Funktionsweise daher der der Anionenaustauschchromatographie (vgl.
2.2.4.1.3). Nur die Wasch- und Elutionspuffer werden modifiziert.
Wasch-/Bindepuffer:
Elutionspuffer:
50 mM
MES/NaOH pH 6,4
50 mM
MES/NaOH pH 6,4
100 mM
NaCl
1M
NaCl
4 mM
DTT
4 mM
DTT
Die Kationenaustauschchromatographie kann auch zu einer Art isoelektrischen
Fokussierung genutzt werden. Proteine werden bei einem niedrigem pH-Wert
protoniert. Ist der pH-Wert dabei niedriger als der isoelektrische Punkt eines Proteins,
so ist es positiv geladen und kann an einen starken Kationentauscher gebunden werden.
Mithilfe eines Breitbandpuffers kann man den pH-Wert durch Zugabe einer Base
nahezu linear erhöhen Die Proteine werden so sukzessive deprotoniert und entladen.
Erreicht der pH-Wert den isoelektrischen Punkt eines Proteins, löst es sich von der
negativ geladenen Säulenmatrix. Die Trennung erfolgt mit aufsteigendem pI.
Wasch-/Bindepuffer:
Titrationspuffer:
50 mM
MES/Tris pH 6
100 mM
100 mM
NaCl
4 mM
DTT
NaOH
46
Material und Methoden
2.2.4.1.5 Präparative Ausschlusschromatographie zur weiteren Aufreinigung von
Proteinen
Die HiPrep 26/60 Superdex 200 Säule von Amersham Pharmacia Biotech eignet sich
zur Trennung von Proteinen mit einer Molekülmasse von weniger als 600 kDa und die
HiPrep 26/60 Superdex 75 Säule trennt Proteine bis 200 kDa Größe. Ihre Gelmatrix
besteht aus Allyldextran, das kovalent zu N,N‟-Methylenbisacrylamid verknüpft ist.
Nach Äquilibrierung der jeweiligen Säule mit 1,5 Säulenvolumina Elutionspuffer wurde
die Probe über einen 2ml- oder 5ml-Loop injiziert. Die Proteinprobe wurde von der
Säule mit Puffer eluiert, 5 ml große Fraktionen wurden aufgefangen und die Fraktionen
anschließend mit SDS-PAGE analysiert.
Elutionspuffer:
20 mM
Tris/HCl pH 7,5
100 mM
NaCl
4 mM
DTT
2.2.4.2 Umpufferung und Entsalzung von Proteinlösungen
In vielen Fällen ist es notwendig, Proteinlösungen für weitere Aufreinigungsschritte
umzupuffern und so zu entsalzen. Proteine mit geringer Löslichkeit werden häufig in
hoher Salzkonzentration aufgeschlossen und einige Affinitätschromatographien sind auf
ein schmales pH-Optimum abgestimmt. Für Ionenaustauschchromatographien ist es
jedoch essentiell, dass der pH-Wert und die Salzkonzentration des Puffers auf den pI
des aufzureinigenden Proteins abgestimmt sind. Durch Dialyse oder die Verwendung
von Entsalzungssäulen können Proteinlösungen entsalzt werden. Mittels der Dialyse
durch eine semipermeable Membran können Proteine von kleineren Molekülen
(Salzionen) getrennt werden. Die Ionen diffundieren in die umgebende Lösung
geringerer Salzkonzentration bis zur Einstellung des Konzentrationsgleichgewichts.
Entsalzungssäulen (HiPrep 26/10 Desalting oder PD-10) funktionieren grundsätzlich
wie Gelfiltrationssäulen. Die Poren des Säulenmaterials sind kleiner, um das Eindringen
von Proteinen in die Gelmatrix zu verhindern. Salzionen und andere niedermolekulare
Moleküle (Elutionssubstrate von Affinitätschromatographien) können in diese Poren
eindringen und ihre Elution wird dadurch verzögert.
Die Säule wurde mit dem Zielpuffer äquilibriert und die Proteinlösung aufgetragen.
Dann wurde mit dem Zielpuffer eluiert und das Eluat fraktioniert. Die HiPrep 26/10
Desalting-Säule von Amersham Pharmacia Biotech trennt 15 ml Proteinlösung von
überschüssigem Salz ab. Zwei dieser Säulen wurden in Reihe geschaltet, um 30 ml
47
Material und Methoden
Rohextrakt mit MnmA ohne Affintätsequenz in hoher Salzkonzentration (300 mM
NaCl) in geeignete Puffer für An- oder Kationenaustauschchromatographie (100 mM
NaCl) zu überführen. PD-10-Säulen können nur Proteinlösungen bis zu einem Volumen
von 2,5 ml entsalzen. Sie eignen sich daher, um hochkonzentriertes, aufgereinigtes
Protein von niedermolekularen Bindungspartnern zu entfernen. Sie wurde verwendet,
um aufgereinigtes MnmA mit Strep-tag II nach der Behandlung mit 800 mM NaCl und
Benzonase in Kristallisationspuffer (20 mM Tris/HCl pH 8, 100 mM NaCl, 2 mM DTT)
zu überführen und überschüssige Nukleotide abzutrennen.
2.2.4.3 Proteinverdau mit Proteasen
Das MBP-MnmA-Fusionsprotein besitzt eine PreScission Protease-Schnittstelle. So
können durch einen Proteaseverdau Affinitätssequenz und Zielprotein voneinander
getrennt werden. Es gibt nun zwei Alternativen, um den PreScission Protease Verdau zu
realisieren. Man schneidet das Fusionsprotein während der Affinitätschromatographie
auf dem Amylose-Säulenmaterial, wobei MBP an der Gelmatrix gebunden bleibt, oder
man schneidet nach der Elution von der Amylosesäule und trennt das MaltoseBindeprotein danach über eine Ionenaustauschchromatographie vom Zielprotein ab.
Bei der ersten Methode wurde der Rohextrakt über das Amylose-Harz in einer EinwegLeersäule (Tropfsäule) gegeben und mit fünf Säulenvolumina gewaschen. Das
Säulenmaterial wurde dann in ein Falcon-Röhrchen überführt. Dann wurden 200 µl
PreScission Protease zugegeben. Das Fusionsprotein wurde über Nacht bei 4oC oder für
drei Stunden bei RT bei stetiger Durchmischung auf einem Taumelrollenmischer
geschnitten. Nach dem Verdau wurde die Säule mit zwei Volumina Waschpuffer
gespült und so geschnittenes MnmA eluiert und fraktioniert. Um die Schnitteffizienz zu
prüfen, wurde dann mit Elutionspuffer gewaschen und so geschnittenes MBP und
ungeschnittenes Fusionsprotein eluiert. Fraktionen aus Wasch- und Elutionsschritten
wurden über SDS-PAGE analysiert. Die vereinigten Waschfraktionen wurden einer
Gelfiltration unterzogen (vgl. 2.2.4.1.6).
Eine Abwandlung dieser Methode, stellte das zyklische Schneiden mit einer
Peristaltikpumpe dar. Eine Amylose-Tropfsäule wurde wieder mit Rohextrakt geladen
und gewaschen. Dann wurde eine Peristaltikpumpe am Säulenausgang befestigt und 100
µl PreScission Protease wurde zugegeben. Der Ausgang der Peristaltikpumpe wurde am
Einfüllstutzen der Tropfsäule angebracht. Durch einen gleichmäßigen Fluss von 0,5
ml
/min wurde die PreScission Protease optimal im Gelbett verteilt. Verluste von
48
Material und Methoden
Säulenmaterial und Protein wurden so ausgeschlossen. Es wurde generell bei 4oC über
Nacht geschnitten und anschließend mit zwei Säulenvolumina gewaschen.
Bei der zweiten Methode wurde dem Fusionsprotein aus der Elution der Amylose-Säule
500 µl PreScission Protease zugegeben und analog zur ersten Methode verdaut. Zur
Trennung von MnmA, MBP, MBP-MnmA-Fusionsprotein und PreScission Protease
wurde das Proteingemisch umgepuffert und über einen Ionentauscher aufgereinigt (vgl.
2.2.4.1.3, 2.2.4.1.4, 2.2.4.1.5).
Alternativ zur Ionenaustauschchromatographie (vgl. 2.2.4.1.3, 2.2.4.1.4) wurde ein
Chymotrypsinverdau angesetzt, um MBP zu verdauen und so abzutrennen. ATP schützt
MnmA relativ gut vor dem Verdau durch Proteasen (Kambampati et al., 2003).
Anschließend wurde versucht, Fusionsprotein, MnmA und Fragmente von MBP durch
Gelfiltration voneinander zu trennen (vgl. 2.2.4.1.6).
2.2.5 Kristallisation von Proteinen
2.2.5.1 Kristallisationsansätze
Durch Salze, Puffer und Präzipitantien wird eine Proteinlösung bei der Kristallisation in
den übersättigten Zustand überführt. In diesem metastabilen Zustand gibt es zwei
Möglichkeiten, wie ein Protein sich verhalten kann:
I. Es fällt aus, die Konzentration an gelöstem Protein sinkt dadurch drastisch ab.
Dieser Vorgang ist stark exergonisch, da so der höchste Grad an Entropie erreicht
werden kann.
II. Das Protein bildet Kristallisationskeime aus, aus denen richtige Proteinkristalle
wachsen können. Dieser Prozess geschieht in der Regel deutlich langsamer als die
Präzipitation und ist auch nicht so energetisch günstig, da nicht die maximale
Entropie erreicht wird.
In der Kristallographie sucht man nach Bedingungen, die den zweiten Fall ermöglichen.
Dazu werden zu Beginn so genannte „Initial Screens“ durchgeführt, um erste
Kristallisationsbedingungen für ein Protein zu finden. Bei den Initial Screens handelt es
sich um eine Sammlung von Eingangsbedingungen, die relativ häufig zur Kristallisation
verschiedener Proteine geführt haben. Das aufgereinigte Protein wird dabei zu Anfang
meist in einer Konzentration von 10 mg/ml getestet.
49
Material und Methoden
Sobald Bedingungen ausgemacht sind, die für eine Kristallisation günstig sind, wird in
gezielt um die Bedingungen herum optimiert. Dabei können die Konzentrationen der
enthaltenen Salze, Puffer und Präzipitantien variiert werden, es können aber auch
Substitutionen getestet werden. Für die Kristallisation im so genannte sitzenden Tropfen
werden 24er-Ansatz-Kristallisationsplatten verwendet, deren einzelne Kammern eine
zentrale Säule mit darin liegender Vertiefung, dem so genannte „Well“, und ein darunter
liegendes Reservoir besitzen. In das Reservoir wird eine Bedingung vorgelegt, die dann
im Well mit dem Protein zu einem Tropfen vermischt wird. Es besteht also ein
Konzentrationsgradient an Salzen und Präzipitantien zwischen Tropfen und Reservoir,
da der Tropfen neben dem Protein nur 50 % der Salz- und Präzipitans-Konzentration
des Reservoirs enthält. Durch Diffusion des Wassers aus dem Tropfen in das Reservoir
wird der Tropfen im Well nun langsam eingeengt und das enthaltene Protein
ankonzentriert. Wird dabei der Punkt der Übersättigung überschritten. Es kann als
Ausweg aus diesem metastabilen Zustand spontan eine Proteinkristallisationskeimung
stattfinden.
Zunächst wurden 400 µl der zu testenden Kristallisationsbedingung in das Reservoir
pipettiert. Dann wurde 1 µl der Proteinlösung in den Well pipettiert und mit 1 µl der
Kristallisationsbedingung aus dem Reservoir gut vermischt. Schließlich wurde der Well
mit Klarsichtklebeband verschlossen, um einer Austrocknung vorzubeugen. Der
Tropfen wurde in der ersten Woche täglich kontrolliert. Danach wurde einmal pro
Woche bis einschließlich vier Wochen nach dem Pipettieren der Bedingung kontrolliert.
Später wurde der Tropfen einmal im Monat überprüft. Bilder der verschiedenen Tropfen
wurden mit einer Digitalkamera, die auf ein Binokular aufgesetzt wird, aufgenommen
und am PC bearbeitet (Kontrast, Helligkeit, Gamma).
2.2.5.2 „Macro-Seeding“ und „Micro-Seeding“ zur Verbesserung
Kristallwachstum und Kristallordnung
Haben sich erste, kleine Kristalle entwickelt, die aber wegen einer zwischenzeitlich zu
geringen Proteinkonzentration im Tropfen nicht mehr Weiterwachsen, so kann durch
„Macro-Seeding“ das Kristallwachstum fortgesetzt werden. Die Kristallisationskeime
aus dem ersten Tropfen werden in einen neuen Proteintropfen überführt, sie werden
„gesät“. Deren Inhalte sind analog zum ersten, mit einer Ausnahme: Entweder die
Präzipitans- oder die Proteinkonzentration müssen in diesen Tropfen gegenüber dem
ersten verringert sein, da es sonst zu einer sofortigen Präzipitation des Proteins in den
50
Material und Methoden
neuen Tropfen kommen kann. Kristalle mit ungünstiger innerer Ordnung, d.h. sie sind
z.B. von unregelmäßiger Gestalt oder sie haben eine geringe Auflösung im
Röntgendiffraktometer, können durch „Micro-Seeding“ verbessert werden. Bruchstücke
dieser Kristalle können in verdünnten Lösungen (z.B. 1:200 in einer frischen
Proteinlösung) Kristallisationskeime für Kristalle höherer Ordnung sein. Beim „MicroSeeding“ werden die Kristallisationskeime wie beim Macro-Seeding in neue Tropfen
überführt. Auch hier gilt, dass entweder Präzipitans- oder Proteinkonzentration
verringert sein sollten.
2.2.5.3 Röntgenbeugungsexperimente
Für die Durchführung eines Röntgenbeugungsexperimentes mit einem Proteinkristall
wird dieser in einem Röntgendiffraktometer mit Röntgenstrahlen beschossen, die durch
die Elektronen im Kristallgitter abgelenkt werden. Da im Kristallgitter sich jede
Struktur, die größer als die Einheitszelle ist, sich durch Translation oder Additionen
dieser Einheitszelle erzeugen lässt, und dadurch eine unendliche Periodizität entsteht,
werden die Röntgenstrahlen an theoretischen Ebenen durch den Kristall gebeugt. Das
aus einem Röntgenbeugungsexperiment resultierende Beugungsmuster stellt daher viele
einzelne
Punkte
dar,
die
durch
eine
reverse
Fourier-Transformation
die
Raumkoordinaten der theoretischen Ebenen, genauer die Schnittstellen dieser Ebenen
mit den drei Raumachsen, wiedergeben, an denen der Röntgenstrahl gebeugt wurde. So
kann aus einem Datensatz mit vielen solcher Röntgenbeugungsmuster eine so genannte
Elektronendichtekarte der Einheitszelle im Kristall erstellt werden. In dieses wird durch
PC-Analysemethoden die Aminosäuresequenz des Proteins eingebaut, so dass
schließlich eine dreidimensionale Struktur des untersuchten Proteins auf atomarer
Ebene dargestellt werden kann.
Die Röntgenbeugungsexperimente wurden wie folgt durchgeführt: Der Proteinkristall
wurde mit einer kleinen Schlinge aus dem Kristallisationstropfen entnommen und vor
den Strahlengangverschluss des Diffraktometers gespannt. Dabei wurde der Kristall in
einem Stickstoffgasstrahl gekühlt und anschließend der Röntgenstrahlung ausgesetzt.
Der Kristall rotierte dreidimensional um vorher definierte Gradzahlen, um so durch die
Drehung der theoretischen Ebenen durch den Kristall ein Beugungsspektrum zu
erhalten. Für Testzwecke, also um zu verifizieren, ob der Kristall aus Protein oder Salz
besteht, wurde er um 5 Grad binnen einer Minute gedreht. Das Beugungsmuster wurde
über einen strahlungssensitiven Schirm detektiert und am PC ausgewertet.
51
Ergebnisse
3. Ergebnisse
Der Ergebnisteil gliedert sich in drei Abschnitte:
Der erste Teil behandelt alle Klonierungen von MnmA aus genomischer DNA
von Thermotoga maritima MSB8, sowie die Umklonierungen von MnmA aus
pMal-c2x und pET-28a in andere Expressionsvektoren.
Im zweiten Teil werden die unterschiedlichen Expressions- und Aufreinigungsstrategien, um das Protein in ausreichender Reinheit und Menge für die
Kristallisation zu gewinnen, dargestellt.
Der dritte Teil behandelt schließlich die Kristallisationsversuche mit
rekombinantem
MBP-MnmA-Fusionsprotein
und
MnmA-Strep-tag
II-
Fusionsprotein.
3.1 Um- und Neuklonierung von MnmA
3.1.1 Umklonierung von MnmA aus pMal-c2x und pET-28a
Zu Beginn wurden vom Betreuer dieser Diplomarbeit, Peter Naumann, zwei
verschiedene Expressionssysteme zur Verfügung gestellt, die durch Midi-Präparationen
(vgl. 2.2.2.3.2) vermehrt wurden. Im pMal-System wurde das Gen für MnmA in einen
von Christos Gouloudis modifizierten pMal-c2x-Vektor (mit Xmn I - EcoR I
einklonierter PreScission Protease Schnittstelle) über die Restriktions-Schnittstellen
BamH I und Hind III mit Stopp-Codon einkloniert. Damit konnte ein Fusionsprotein mit
N-terminalem Maltose-Bindeprotein, C-terminalem Zielprotein und dazwischen
liegender PreScission Protease Schnittstelle exprimiert werden.
MnmA wurde außerdem über Nco I - Hind III mit Stopp-Codon in pET-28a einkloniert,
wodurch die N- und C-terminale His-Affinitätssequenzen deaktiviert wurden. Das
Protein konnte ohne Affinitätssequenz exprimiert werden.
Bei der Expression und Aufreinigung von MnmA mit diesen Systemen zeigten sich, wie
später dargestellt wird, einige Probleme (vgl. 3.2.1.2 , 3.2.2.7), so dass versucht wurde
das Gen (1,1 kb) mit den gegebenen Schnittstellen in einen anderen Expressionsvektor
(pETM-30, pET-28a) umzuklonieren. Parallel wurde MnmA aus genomischer DNA in
weitere Expressionsvektoren (pGEX-6P1, pET-28a, pASK-IBA3/5) kloniert, um
Aufreinigungen mittels anderer Affinitätssequenzen zu testen.
52
Ergebnisse
3.1.1.2 Umklonierung von MnmA in pET-28a
Das Gen für MnmA wurde mit BamH I und Hind III, wie unter 2.2.2.1.2 angegeben, aus
dem Vektor pMal-c2x-MnmA geschnitten. Parallel wurde pET-28a (5,4 kb) mit den
gleichen Restriktionsendonukleasen verdaut. Durch den Verdau mit BamH I und Hind
III blieb die N-terminale His6-Affinitätssequenz für die Aufreinigung erhalten, was bei
einer Klonierung mit Nco I und Hind III nicht möglich ist. Anschließend wurden die
Phosphorylgruppen der geschnittenen Enden des Vektors durch Zugabe einer
Phosphatase (CIP) und einstündiger Inkubation bei 37°C entfernt, um einer Religation
des Plasmids entgegenzuwirken. Der Restriktionsverdau wurde auf ein Agarosegel
aufgetragen und die Banden mit verdautem Insert und verdautem Zielvektor
ausgeschnitten (vgl. 2.2.1.5).
Nun wurde versucht das Insert in pET-28a durch eine Ligation in pET-28a
einzuklonieren (vgl. 2.2.2.1.3). Der Ligationsansatz wurde in XL1-Blue transformiert
und die transformierten Zellen auf einer Kanamycin-Selektionsplatte ausgestrichen. Die
Umklonierung wurde durch eine Kolonie-PCR zahlreicher Klone verifiziert (vgl.
2.2.2.1.1). Dabei zeigte das Gel kein Signal. Auch ein weiterer Versuch das Insert mit
längerem Verdau und Ligation bei 4oC umzuklonieren schlug fehl.
3.1.1.1 Umklonierung von MnmA in pETM-30
In einem weiteren Versuch das Gen für MnmA mit den gegebenen Mitteln
umzuklonieren, wurde das Insert mit Nco I und Hind III aus pET-28a-MnmA
ausgeschnitten (vgl. 2.2.2.1.2). Gleichzeitig wurde pETM-30 (6,3 kb) verdaut und
dephosphoryliert. Der Verdau wurde wieder über ein Agarosegel und Gelextraktion
aufgereinigt (vgl. 2.2.1.5).
Nach der Ligation wurde der Ansatz in XL1-Blue transformiert und ausplattiert. Die
Kolonie-PCR einiger Klone zeigte ein positives Signal (Abbildung 13), so dass der
ligierte Vektor pETM-30-MnmA in einer Mini-Präparation (vgl. 2.2.2.3.1) vermehrt
und isoliert wurde. Anschließend wurde das eingefügte Gen durch einen Kontrollverdau
mit Nco I und Hind III, der auf ein 1%iges Agarosegel aufgetragen wurde,
nachgewiesen (Abbildung 13).
53
Ergebnisse
A
pETM-30
Kolonie-PCR mit 6 verschiedenen Klonen
Marker +
++
+
+
B
10 kb
10 kb
5 kb
4 kb
3 kb
5 kb
4 kb
3 kb
2 kb
Marker
pETM-30MnmA
verdaut
geschnittener
Vektor
2 kb
1 kb
1 kb
ausgeschnittenes
Insert
Abbildung 13: (A) Kolonie PCR selektierte Klone
(B) Kontrollverdau von pETM-30-MnmA
(1%ige Agarosegele)
Das Insert wurde anschließend sequenziert (vgl. 2.2.4.2), um Fehlerfreiheit des
Konstrukts zu bestätigen. Dieses Expressionssystem wurde aus Zeitgründen jedoch
nicht für die Aufreinigung von MnmA herangezogen.
3.1.2 Neuklonierung von MnmA aus genomischer DNA von
Thermotoga maritima
3.1.2.1 Klonierung von MnmA in pGex-6P1 und pET-28a
Zur Klonierung von MnmA in pGex-6P1 (4,9 kb) und pET-28a (5,4 kb) musste das Gen
mit neuen Primern aus genomischer DNA von Thermotoga maritima amplifiziert
werden (vgl. 2.2.2.1.1). Diese fand parallel zu den Umklonierungen statt. Da die
Polylinker (multiple cloning site - MCS) der beiden Zielvektoren ähnlich gestaltet sind,
konnte das Insert über BamH I und Xho I in beide Vektoren einkloniert werden. Die
Primerschmelztemperaturen lagen bei 73,8oC für den Bam HI Vorwärtsprimer (pGEX_
BamHI_for), bzw. bei 68,2oC für den Xho I Rückwärtsprimer (pGEX_XhoIstop_rev),
der mit einem Stopp-Codon versehen wurde, um die Transkription am Ende des Gens
zu beenden.
Alle PCR-Ansätze (50 µl) für Neuklonierungen setzten sich wie folgt zusammen:
2 µl genomische DNA von
5 µl
Pfu-Polymerase-Puffer (10x)
1 µl 5´-Primer (50 mM)
1 µl
Pfu-Polymerase 5 U/µl
1 µl 3´-Primer (50 mM)
5 µl
DMSO
1 µl dNTPs (Nukleotidmix) (100mM)
34 µl ddH2O
Thermotoga maritima (50 ng)
54
Ergebnisse
Die Pfu-Polymerase besitzt eine Fehlerlesefunktion und stellt so die korrekte Synthese
des Fragments sicher. Sie benötigt jedoch im Vergleich zur Taq-Polymerase DMSO.
Das PCR-Programm wurde analog zu 2.2.2.1.1 durchgeführt. Das amplifizierte
Fragment wurde anfangs auf ein Agarosegel aufgetragen (Abbildung 14) und über
Gelextraktion aufgereinigt (vgl. 2.2.1.5). Später wurden amplifizierte Fragmente mit
dem PCR-Purification Kit von Qiagen von Enzymen, Primern und Nukleotiden befreit.
Fragment und Vektoren wurden eine Stunde bei 37oC mit BamH I und Xho I verdaut
(vgl. 2.2.2.1.2). Zur Kontrolle wurde ein anderes Plasmid, dessen Insert über die
gleichen Restriktionsschnittstellen einkloniert wurde, pGex-6P1-GGA1 (Dank an Dirk
Röser), mit verdaut. Die verdauten Produkte und unverdaute Vektoren wurden auf ein
Agarosegel aufgetragen (Abbildung 15). Die geschnittenen Plasmide und das verdaute
Fragment wurden extrahiert (vgl. 2.2.1.5).
Marker
amplifiziertes
Fragment
10 kb
5 kb
2 kb
1,5 kb
1 kb
Abbildung 14: PCR von MnmA aus genomischer DNA (1%iges Agarosegel).
.
pET-28a
Marker
pGex-6P1
Fragment pGex-6P1GGA1
verdaut unverdaut verdaut unverdaut verdaut verdaut
10 kb
7 kb
6 kb
5 kb
4 kb
3 kb
2 kb
1 kb
Abbildung 15: Kontrolle der Schnitteffizienz von Bam HI und Xho I (1%iges Agarosegel).
55
Ergebnisse
Anschließend wurde das Fragment in pGex-6P1 und pET-28a ligiert (vgl. 2.2.2.1.3).
Die Ligationen von pGex-6P1 wurden in XL10-Gold und die von pET-28a in DH 5
transformiert (vgl. 2.2.3.3.2).
Kolonie-PCRs selektierter Klone zeigten auf Agarosegelen amplifizierte Fragmente der
richtigen Länge, jedoch wurde bei keinem Kontrollverdau der präparierten Vektoren das
Insert heraus geschnitten. Die Sequenzierungen präparierter Vektoren verschiedener
Klone brachten die Gewissheit, dass die Ligation fehlgeschlagen war. Eine Optimierung
der Klonierung führte zu keiner positiven Ligation. Eine Ligation des Fragments in den
verdauten pGex-6P1-GGA1 Vektor blieb ebenfalls erfolglos.
3.1.2.2 Klonierung von MnmA in pASK-IBA3 und pASK-IBA5
Nach dem Scheitern der Neuklonierung von MnmA in pGex-6P1 und pET-28a wurde
das Fragment in zwei pASK-IBA-Vektoren mit Strep-tag II kloniert. Trotz eines sehr
breiten Polylinkers mit zahlreichen Restriktionsschnittstellen konnten die pGex-, pETund pMal-Primer nicht verwendet werden, da das klonierte Fragment mit den
gegebenen Schnittstellen nicht im korrekten Leserahmen gelegen hätte.
Es wurden neue Primer mit den Schnittstellen Sac II und Nco I entworfen
(pASK_IBA3_SacII_for, pASK_IBA3_NcoI_rev, pASK_IBA5_SacII_for, pASK_
IBA5_NcoIstop_rev). Dabei wurde darauf geachtet, dass alle Primer die gleiche
Schmelztemperatur hatten (69,5oC), um das Fragment mit demselben PCR-Programm
gleichmäßig amplifizieren zu können. Die beiden pASK-IBA-Vektoren benötigten
unterschiedliche Primer, da sie über unterschiedliche Leserahmen verfügen. Der
Rückwärtsprimer von pASK-IBA3 (3,3 kb) durfte kein Stopp-Codon enthalten, da die
Affinitätssequenz C-terminal orientiert ist und durch ein Stopp-Signal ausgeschaltet
wird. Bei pASK-IBA5 (3,2 kb) mit N-terminaler Strep-tag II-Affinitätssequenz wurde
der Rückwärtsprimer mit einem Stopp-Codon versehen.
Das MnmA DNA-Fragment wurde wie unter 3.1.2.1 amplifiziert. Dabei wurden
verschiedene DMSO-Konzentrationen (0-15%) eingesetzt und so das DMSO-Optimum
der Pfu-Polymerase ermittelt. Auf 0,8%igen Agarosegelen wurde das PCR-Produkt
detektiert. Das durch pASK-IBA3-Primer amplifizierte DNA-Fragment wurde bei
DMSO-Konzentrationen von 4 - 10% synthetisiert (Abbildung 16), während das pASKIBA5-Fragment nur bei PCRs mit 10%iger DMSO-Konzentration detektiert werden
konnte (Abbildung 17). Alle nachfolgenden PCRs zur Amplifizierung des Fragments
wurden mit 10%iger DMSO-Konzentration durchgeführt.
56
Ergebnisse
M R
0
1
DMSO-Konzentration [%]
2
3
4
5
10
15
10 kb
4 kb
3 kb
2 kb
1 kb
Abbildung 16: Optimierung der DMSO-Konzentration der PCR mit pASK-IBA3-Primern. Der grüne
Pfeil markiert das amplifizierte Fragment (M = Marker, R = Referenzfragment, 0,8%iges Agarosegel).
M
R
0
DMSO-Konzentration [%]
1
2
3
4
5 10
15
10 kb
4 kb
3 kb
2 kb
1 kb
Abbildung 17: Optimierung der DMSO-Konzentration der PCR mit pASK-IBA5-Primern. Der grüne
Pfeil markiert das amplifizierte Fragment (M = Marker, R = Referenzfragment, 0,8%iges Agarosegel).
Die Fragmente und Vektoren wurden dann parallel mit Sac II und Nco I verdaut (vgl.
2.2.2.1.2) und anschließend über ein PCR-Purification Kit aufgereinigt. Danach wurden
die jeweiligen Fragmente mit den entsprechenden Vektoren über Nacht bei 4oC ligiert
(vgl. 2.2.2.1.3). Die Ligationen wurden in XL1-Blue transformiert und die Zellen auf
LB-Agar-Ampicillin-Platten ausgestrichen (vgl. 2.2.3.3.2). Mit den angewachsenen,
selektierten Klonen wurde dann eine Kolonie-PCR angesetzt (vgl. 2.2.2.1.1), die auf ein
0,8%iges Agarosegel aufgetragen wurde (Abbildung 18A). Dann wurden je zwei
positive Klone (2,3 bzw. 2',3') vermehrt und ihre Plasmid-DNA im kleinen Maßstab
präpariert (vgl. 2.2.2.3.1). Diese DNA wurde mit Sac II und Nco I kontrollverdaut und
über ein 0,8%iges Agarosegel analysiert (Abbildung 18B). Es wurden die erwarteten
Fragmente von 1,1 kb Länge aus den Vektoren herausgeschnitten. Die Vektoren wurden
sequenziert und pASK-IBA3 wurde für die Aufreinigung von MnmA verwendet.
A
10 kb
4 kb
3 kb
M
Kolonie-PCR
IBA3
IBA5
1 2 3
1' 2' 3'
B
M
Kontrollverdau
IBA3
IBA5
2
3
2'
3'
10 kb
4 kb
3 kb
2 kb
2 kb
1 kb
1 kb
Abbildung 18: (A) Kolonie-PCR selektierter Klone
(B) Kontrollverdau präparierter Plasmide
Der grüne Pfeil markiert die MnmA-Fragmente (M = Marker, 0,8%ige Agarosegele).
57
Ergebnisse
3.2 Verschiedene Strategien der Expression und Aufreinigung
von MnmA
Für die Kristallisation von MnmA ist eine zuverlässige Expressions- und
Aufreinigungsstrategie unerlässlich. Die Methodik muss so weit optimiert werden, dass
die für die Kristallisation nötigen Proteinmengen erreicht werden, also mehrere
Milligramm pro Aufreinigung. In dieser Diplomarbeit wurden drei verschiedene
Expressionsstrategien getestet, um MnmA aufzureinigen.
Als erstes wurde versucht das Protein ohne Affinitätssequenz (engl. tag)
ionenaustauschchromatographisch
Expressionsvektor
verwendet.
aufzureinigen.
MnmA
ohne
Dabei
wurde
Affinitätssequenz
pET-28a
als
besitzt
ein
Molekulargewicht von etwa 41 kDa und ist 358 Aminosäuren lang.
Im zweiten Versuch wurde MnmA mit N-terminal fusioniertem Maltose-Bindeprotein
(MBP) affinitätschromatographisch über Amylose-Säulenmaterial aufgereinigt. Als
Expressionsvektor diente pMal-c2x. Das MBP-MnmA-Fusionsprotein hat ein
Molekulargewicht von ca. 84 kDa. Da das Fusionsprotein eine PreScission ProteaseSchnittstelle besitzt, konnten MBP und MnmA voneinander zu getrennt werden. Da
MBP und MnmA aber nahezu gleich groß sind, konnte eine Trennung der beiden
Proteine über eine Gelfiltration ausgeschlossen werden. Es wurde daher versucht sie
ionenaustauschchromatographisch zu trennen.
Bei der dritten Strategie wurde MnmA mit C-terminalem Strep-tag II über Strep-TactinSäulenmaterial aufgereinigt. Als Expressionsvektor diente pASK-IBA3. Da die Streptag-Affinitätssequenz nur aus acht Aminosäuren besteht, brauchte sie nicht entfernt zu
werden. MnmA mit Strep-tag II hat ein Molekulargewicht von etwa 42 kDa.
3.2.1 Expression und Aufreinigung von MnmA ohne Affinitätssequenz
3.2.1.1 Überexpression in E. coli
Das für MnmA codierende Gen war bereits in den Vektor pET-28a kloniert (vgl. 3.1.1).
Der Vektor wurde in DH5
vermehrt und durch eine Midi-Präparation isoliert (vgl.
2.2.2.3.2).
Für die Expression von MnmA in E. coli wurde zunächst ein geeigneter
Expressionsstamm gesucht. Dazu wurden mehrere Stämme (BL21, BL21 (DE3), BL21
(DE3) LysE, BL21 (DE3) LysS, BL21 (DE3) RIL, BL21 (DE3) Rosetta 2, ER 2508)
58
Ergebnisse
mit dem Vektor transformiert und auf Selektionsplatten ausgestrichen (vgl. 2.2.3.3).
Von den Platten wurden kleine Kulturen in 10 ml LB-Medium (vgl. 2.2.3.4.1) in
Reagenzgläsern angeimpft und für jeden Stamm im kleinen Maßstab mehrere
Expressionsbedingungen (Temperatur und Induktionszeit) getestet. Induziert wurde mit
1 mM IPTG, sobald die Kulturen eine OD600 von 0,6 erreicht hatten. Die
Induktionsdauer betrug 3-8 Stunden. Die Kulturen hatten in dieser Zeit in der Regel
eine OD600 von 1,2 (nach 3 h) bis 2,5 (nach 8 h) erreicht. Es wurden jeweils
Zellsuspensionsproben unmittelbar vor der Induktion (vI) und vor der Ernte (nI)
genommen und durch SDS-PAGE auf die Expression von MnmA untersucht (vgl.
2.2.1.3.1). Die SDS-Gele der Testinduktion zeigten eine starke Expression von MnmA
in BL21 (DE3) bei 25oC (schwarzer Pfeil), während bei BL21 (DE3) RIL keine
Induktion erkennbar war (Abbildung 19). Die anderen Stämme zeigten ein schwaches
Expressionsniveau.
Daraufhin wurde eine Expression von MnmA in BL21 (DE3) im größeren Maßstab
angesetzt (vgl. 2.2.3.4.2). Einem Liter LB-Medium mit 2% (w/v) Glucose, die die
Basisexpression durch Promotorrepression senken sollte, wurden 20 ml Vorkultur
zugegeben (vgl. 2.2.3.4.1). Die Expressionskultur wurde dann bei 37oC unter stetigem
Schütteln inkubiert. Als die Zellen eine OD600 von 0,6 erreicht hatten (nach 1,5 - 2h),
wurden sie mit 0,5 mM IPTG induziert und bei 25oC weiter geschüttelt. Nach erreichen
einer OD600 von 1,8 - 2 wurden die Zellen geerntet.
M
vI
BL21 (DE3) RIL
1h nI 2h nI 3h nI
vI
BL21 (DE3)
1h nI 2h nI 3h nI
102 kDa
97 kDa
66 kDa
45 kDa
27 kDa
Abbildung 19: SDS-PAGE der Expressionstests von MnmA ohne Affinitätssequenz mit BL21 (DE3) RIL
und BL21 (DE3). Der schwarze Pfeil markiert die Induktionsbande von MnmA bei BL21 (DE3)
(M = Marker, vI = vor Induktion, nI = nach Induktion, 10%iges SDS-Gel).
Der Zellaufschluss zeigte jedoch, dass das Protein kaum löslich war (vgl. 3.2.1.2) und
von den Zellen in so genannte „inclusion bodies“ eingelagert wurde. Um dieses
Problem zu lösen wurde die Expressionstemperatur auf 22oC gesenkt. Jedoch zeigte
diese Veränderung der Expressionsbedingung nur einen geringen Effekt. Bei tieferen
Temperaturen und Zugabe von 5% Ethanol starben die Zellen nach der Induktion ab.
Bei Löslichkeitstests mit anderen Stämmen zeigte sich ein ähnliches Verhalten.
59
Ergebnisse
3.2.1.2 Zellernte und Aufschluss
Die Schüttelkultur wurde durch Zentrifugation geerntet und die Zellen wurden im
Fluidizer aufgeschlossen, wie unter 2.2.3.5 beschrieben. Die für die jeweilige
Aufreinigung optimierten Aufschlussbedingungen, die sich im Laufe der Arbeit
ergaben, sind in den jeweiligen Kapiteln angeführt.
Lysispuffer:
50 mM
Tris/HCl pH 7,5
100 mM
NaCl
2 mM
EDTA
4 mM
DTT
1 Tablette
Protease Inhibitor
Nach der Ultrazentrifugation wurden Proben von Überstand und Pellet (Sediment)
zusammen mit Induktionsproben über ein SDS-Gel auf Induktion und Löslichkeit von
MnmA ohne Affinitätssequenz untersucht (Abbildung 20). Es zeigte sich, dass der
überwiegende Teil des synthetisierten Proteins unlöslich war (schwarzer Pfeil).
M
vI
BL21 (DE3)
nI
U
P
102 kDa
97 kDa
66 kDa
45 kDa
Abbildung 20: SDS-PAGE eines Löslichkeitstests von MnmA ohne Affinitätssequenz in BL21 (DE3) bei
25oC. Der schwarze Pfeil markiert unlösliches MnmA (M = Marker, vI = vor Induktion,
nI = nach Induktion, U = Überstand, P = Pellet, 10%iges SDS-Gel).
Expressionen bei 22oC und die Erhöhung der Salzkonzentration im Lysispuffer auf 300
mM NaCl zeigte ein wenig Erfolg. Dennoch blieben ca. 80% des Proteins unlöslich.
Durch die hohe Expressionsrate des Proteins (ca. 50 mg MnmA pro Liter
Expressionskultur) schien es dennoch lohnenswert den Rohextrakt ionenaustauschchromatographisch aufzutrennen. Sowohl Anionenaustauschchromatographie über
DEAE-Sepharose (vgl. 2.2.4.1.3), als auch Kationenaustauschchromatographie über
CM-Sepharose oder Source 30S (vgl. 2.2.4.1.4) zeigten keine klaren Resultate. Es
gelang nicht MnmA ohne Affinitätssequenz aufzureinigen.
60
Ergebnisse
3.2.2 Expression und Aufreinigung des MBP-MnmA-Fusionsproteins
3.2.2.1 Überexpression in E. coli
Auch für diese Aufreinigungsstrategie wurde ein fertig klonierter Expressionsvektor zur
Verfügung gestellt. In diesem System war das für MnmA codierende Gen bereits in den
Vektor pMal-c2x kloniert (vgl. 3.1.1). Der Vektor wurde wieder in DH5 vermehrt und
durch eine Midi-Präparation isoliert (vgl. 2.2.2.3.2).
Für die Expression in E. coli wurde zunächst analog zu 3.2.1.1 ein geeigneter
Expressionsstamm gesucht. Es wurden die für das pMal-System optimierten Stämme
ER 2507 und ER 2508 getestet, aber auch BL21 (DE3), BL21 (DE3) LysE, BL21 (DE3)
LysS und BL21 (DE3) RIL wurden mit dem Vektor transformiert und selektiert.
Wiederum wurden 10 ml Testkulturen mit LB-Medium angesetzt, um im kleinen
Maßstab mehrere Expressionsbedingungen (Temperatur und Induktionszeit) zu
ermitteln. Nach erreichen einer OD600 von 0,6 wurde mit 1 mM IPTG induziert (3 - 6 h).
Es wurden Zellproben vor Induktion und Ernte genommen und auf ein SDS-Gel
aufgetragen. Es zeigte sich, dass alle getesteten Stämme das MBP-MnmAFusionsprotein (ca. 83 kDa) exprimierten. Die Expressionsstärken waren bei ER 2507,
BL21 (DE3) RIL, BL21 (DE3) LysE und BL21 (DE3) LysS auf dem gleichen, hohen
Niveau (Abbildung 21). Andere Stämme zeigten ähnliche Expressionsniveaus.
ER2507
M
vI
BL21(DE3) BL21(DE3) BL21(DE3)
RIL
LysE
LysS
nI
vI
nI
vI nI
vI
nI
102 kDa
97 kDa
66 kDa
45 kDa
Abbildung 21: SDS-PAGE der Expressionstests von MBP-MnmA mit verschiedenen E. coli-Stämmen bei
30oC. Der schwarze Pfeil markiert die Laufhöhe des induzierten MBP-MnmA-Fusionsproteins
(M = Marker, vI = vor Induktion, nI = nach Induktion, 10%iges SDS-Gel).
Für die Expression des Fusionsprotein in BL21 (DE3) LysE wurden Literkulturen mit
LB-Medium angesetzt und 2% (w/v) Glucose zugegeben. Glucose senkt die Basisexpression und reprimiert die Expression von Amylasen, die das AmyloseSäulenmaterial abbauen können. Die Expressionskultur wurde 1:500 mit der Vorkultur
angeimpft und dann bei 37oC geschüttelt. Nach Erreichen einer OD600 von 0,6 (nach 1 1,5h) wurde sie mit 0,5 mM IPTG induziert und bei 30oC weiter vermehrt.
61
Ergebnisse
3.2.2.2 Zellernte und Aufschluss
Die Zellen der Expressionskultur wurden bei einer OD600 von 1,8 - 2, wie unter 2.2.3.5
angegeben, geerntet. Der Aufschluss erfolgte durch Ultraschall mit dem Sonifier.
Lysispuffer:
50 mM
Tris/HCl pH 7,5
300 mM
NaCl
2 mM
EDTA
4 mM
DTT
1 Tablette
Protease Inhibitor
Nach der Ultrazentrifugation wurde die Löslichkeit des MBP-MnmA-Fusionsproteins
durch ein SDS-Gel untersucht (Abbildung 22). Etwas weniger als die Hälfte des
synthetisierten Proteins war löslich. Die Expressionsrate war aber so hoch, dass pro
Liter Kultur immer noch 50 - 100 mg MBP-MnmA-Fusionsprotein löslich war.
M
BL21 (DE3) Lys E
P
Ü
102 kDa
97 kDa
66 kDa
45 kDa
Abbildung 22: Löslichkeitstest (pMal-c2x) von MBP-MnmA in BL21 (DE3) LysE bei 30oC.
Der schwarze Pfeil markiert die Laufhöhe von MBP-MnmA
(M = Marker, U = Überstand, P = Pellet, 10%iges SDS-Gel).
3.2.2.3 Affinitätschromatographische Aufreinigung über Amylose-Harz
Die Aufreinigung von Proteinen mit N-terminal fusioniertem Maltose-Bindeprotein
über ein Amylose-Harz ist eine selektive Art der Affinitätschromatographie. Der MBPAnteil des MBP-MnmA-Fusionsproteins bindet an die Amylose, während andere
Proteine von E. coli das Säulenmaterial passieren.
Die Aufreinigung über die Amylose-Säule erfolgte nach der in Kapitel 2.2.4.1.1
beschriebenen Methode. Die Abbildung 23 zeigt ein typisches Chromatogramm einer
solchen Aufreinigung. Die blaue Kurve zeigt die UV-Absorption (280 nm) in
Korrelation zum Volumen der eluierten Probe und die rote Kurve verdeutlicht die
jeweilige Leitfähigkeit. Nachdem der Proteinrohextrakt geladen war, brauchte es ca. 8
62
Ergebnisse
ml bis die Absorption anstieg. dies entspricht dem Flüssigkeitsvolumen der Säule. Das
erste Maximum von ca. 350 mAu (Milliabsorptionseinheiten) wurde durch nichtbindende Proteine hervorgerufen, die die Amylose-Gelmatrix ungehindert passierten.
Der Anstieg der Leitfähigkeit begründet sich durch die höhere Salzkonzentration des
Lysispuffers. Nach Beendigung der Probeninjektion ging die Absorption durch das
Waschen der Säule auf null zurück. Nach Zugabe des Elutionspuffers stieg die
Absorption auf ca. 250 mAu. Das gebundene MBP-MnmA-Fusionsprotein wurde
eluiert. Vom Durchfluss wurden 10 ml-Fraktionen und vom Eluat 5 ml-Fraktionen
gesammelt. Fraktionsproben wurden über SDS-PAGE analysiert (Abbildung 24).
Elution
Abbildung 23: Chromatogramm der Affinitätschromatographie von MBP-MnmA-Fusionsprotein über
eine Amylose-Säule. Der schwarze Pfeil markiert den Zeitpunkt der Zugabe des Elutionspuffers
(Blau: UV-Absorption bei 280 nm, Rot: Leitfähigkeit).
M R
P
Ü 1
Durchfluss
Eluat
2 3 5 7 18 19 20 21 22 23 24
102 kDa
97 kDa
66 kDa
45 kDa
Abbildung 24: SDS-PAGE der Affinitätschromatographie von MBP-MnmA über eine Amylose-Säule.
Die Zahlen bezeichnen die Fraktionen. Der Pfeil markiert die Laufhöhe des Fusionsproteins
(M = Marker, R = Rohextrakt, P = Pellet, U = Überstand, 10%iges SDS-Gel).
Auf dem SDS-Gel erkennt man, dass die Aufreinigung mit Amylose-Säulenmaterial
zufrieden stellend funktioniert hat. Der größte Teil der E. coli-Proteine wurde
abgetrennt (Durchfluss). Das MBP-MnmA-Fusionsprotein ist in den Fraktionen des
Eluats als breite Bande bei 80-90 kDa sichtbar.
63
Ergebnisse
Dennoch sind die Elutionsfraktionen durch unspezifisch gebundenes Fremdprotein
verunreinigt. Weiterhin ist ersichtlich, dass ein Teil des Fusionsproteins nicht gebunden
hat und als Bande im Durchfluss erscheint. Die Proteinbestimmung ergab aber, dass bei
dieser Art der Aufreinigung 50-80 mg Fusionsprotein pro Liter Expressionskultur
gewonnen wurden. Die Elutionsfraktionen wurden vereinigt und für die anschließende
Gelfiltration auf 2 mg/ml ankonzentriert (vgl. 2.2.1.2).
3.2.2.4 Ausschlusschromatographische Aufreinigung
Für die präparative, ausschlusschromatographische Aufreinigung des MBP-MnmAFusionsproteins aus der Affinitätschromatographie wurde wie unter 2.2.4.1.5 verfahren.
Das Chromatogramm der Gelfiltration mit der Superdex 200 ist in Abbildung 25
dargestellt. Es ist nur ein Absorptionsmaximum (750 mAu) bei 115 ml zu erkennen.
Dies entspricht dem Ausschussvolumen der Säule. Eine Berechnung des tatsächlichen
Elutionsvolumens ergab, dass monomeres MBP-MnmA-Fusionsprotein mit 83 kDa bei
ca. 160 ml zu erwartet war. Das Eluat wurde durch SDS-PAGE (Abbildung 26)
untersucht.
Abbildung 25: Chromatogramm der Ausschlusschromatographie von MBP-MnmA-Fusionsprotein über
eine Superdex 200. (blau: UV-Absorption bei 280 nm, rot: Leitfähigkeit).
M
21
22 23
24
25
26
27
28
33
34
102 kDa
97 kDa
66 kDa
45 kDa
Abbildung 26: SDS-PAGE der Ausschlusschromatographie von MBP-MnmA-Fusionsprotein über eine
Superdex 200. Die Zahlen bezeichnen die Fraktionen (M = Marker, 10%iges SDS-Gel).
64
Ergebnisse
Auf dem SDS-Gel erscheint das Fusionsprotein in den Fraktionen des Maximums. Dies
lässt auf die Bildung von unspezifischen Aggregationen aus Protein und RNA
schließen. Alle proteinhaltigen Fraktionen waren zudem gleichmäßig mit Spuren
kleinerer Proteine kontaminiert. Die Fraktionen aus dem Bereich in dem man das
Fusionsprotein erwartete (Fraktion 33 & 34) waren leer. Eine Erhöhung der
Salzkonzentration auf 200 mM NaCl zeigte keine Trennwirkung. Auch durch Zugabe
von 6 mM DTT ließ sich das Oligomer nicht auflösen, aber die Kontaminationen
verschwanden. Dennoch wurden die Fraktionen 22-25 vereinigt, auf eine Proteinkonzentration von 10 mg/ml ( 120 µM) ankonzentriert (vgl. 2.2.1.1 und 2.2.1.2) und in
Kristallisationsansätze pipettiert. Die Ausbeute an Fusionsprotein sank nach den
Gelfiltrationen auf 15-30 mg MnmA pro Liter Expressionskultur.
3.2.2.5 PreScission Protease-Verdau des MBP-MnmA-Fusionsproteins
Im MBP-MnmA-Fusionsprotein liegt eine PreScission Protease-Schnittstelle, die die
beiden Enzyme trennt. Diese kurze Aminosäuresequenz muss zugänglich sein. Sie wird
spezifisch durch die PreScission Protease erkannt und geschnitten.
Der Proteaseverdau wurde gemäß Kapitel 2.2.4.3 durchgeführt. Zur Kontrolle wurde die
Schnittkinetik der PreScission Protease untersucht. Zwei 1 ml Proben mit 1
mg
/ml MBP-
MnmA-Fusionsprotein wurden mit 50 µl PreScission Protease versetzt und bei 4oC bzw.
bei RT inkubiert. Nach unterschiedlichen Abständen (0 - 24 h) wurden Proben
entnommen, die dann über SDS-PAGE analysiert wurden (Abbildung 27).
M
0h
0,5 h
1h
2h
5h
24 h
102 kDa
97 kDa
66 kDa
45 kDa
Abbildung 27: SDS-PAGE der Schnittkinetik von MBP-MnmA-Fusionsprotein vom Verdau bei 4oC.
Der Pfeil markiert die Laufhöhe von geschnittenem MnmA und MBP (M = Marker, 10%iges SDS-Gel).
Das SDS-Gel zeigt, dass mit zunehmender Dauer des PreScission Protease-Verdaus die
Konzentration der geschnittenen Produkte (MBP und MnmA) zunimmt. Da beide
Proteine ungefähr gleich groß sind, konnten sie nicht über SDS-PAGE getrennt werden.
Fusionsprotein und MBP mussten auf einem anderen Weg aus der Proteinlösung
entfernt werden.
65
Ergebnisse
Auf dem Gel erkennt man aber auch, dass selbst nach einem Tag nur etwa die Hälfte
des Fusionsproteins geschnitten wurde. Der Verdau funktioniert relativ schlecht. Eine
längere Inkubation und die Zugabe von mehr PreScission Protease änderte an diesem
Sachverhalt nichts.
Bei 25oC wurde das Fusionsprotein schneller, aber nicht besser geschnitten. Man konnte
jedoch beobachten, dass die geschnittenen Proteine präzipierten, was beim Verdau bei
4oC nicht passierte.
Diese Erkenntnisse trugen zur Entwicklung einer optimierten Aufreinigungmethode bei.
Dabei wurde Amylose-Harz in eine Leersäule von BioRad gegeben und wie unter
2.2.4.1.1 angegeben verfahren. Nach dem Binden des MBP-MnmA-Fusionsproteins und
dem Waschen der Säule, wurden 100 µl PreScission Protease zugegeben (vgl. 2.2.4.3).
Eine Peristaltikpumpe wurde angeschlossen und pumpte den protease-haltigen Puffer
langsam (0,5 ml/min) und zyklisch durch das Gelbett (12 - 16 h bei 4oC). Auf diese Weise
wurde die Protease gleichmäßig verteilt. Nach dem Verdau wurde der Säulenpuffer mit
abgeschnittenem MnmA durch Zugabe von frischem Puffer aus dem Gelbett gewaschen
und gesammelt. Dann wurde die Säule mit Elutionspuffer gewaschen und so
gebundenes MBP entfernt. Proben von Wasch- und Elutionsfraktion wurden über SDSPAGE analysiert (Abbildung 28).
M
D
W
E
102 kDa
97 kDa
66 kDa
45 kDa
Abbildung 28: SDS-PAGE der affinitätschromatographischen Aufreinigung mit PreScission ProteaseVerdau von MBP-MnmA über eine Amylose-Harz. Der Pfeil markiert die Laufhöhe der geschnittenen
Proteine (M = Marker, D = Durchfluss, W = Waschfraktion, E = Elutionsfraktion, 10%iges SDS-Gel).
Auf dem SDS-Gel erkennte man, dass das ungeschnittene Fusionsprotein erfolgreich
abgetrennt wurde. Die Waschfraktion enthielt ausschließlich Protein mit einem Gewicht
von ca. 45 kDa. In der Elutionsfraktion erschien dann MBP bei ca. 45 kDa und das
Fusionsprotein bei ca. 80 kDa. Zwischen den beiden 45 kDa-Banden von Wasch- und
Elutionsfraktionen war ein leichter Laufunterschied erkennbar, was auf den geringen
Größenunterschied von MBP und MnmA (2 kDa) hinweist. Jedoch ließ die Auflösung
des Gels keine weitere Interpretation zu. Da sich MBP u.U. von der Amylose löst
66
Ergebnisse
(C. Gouloudis, persönliche Mitteilung), konnte die vollständige Reinheit von MnmA
noch nicht bewiesen werden. Um vermutete MBP-Kontaminationen spezifisch
nachzuweisen wurde ein Western-Blot durchgeführt (vgl. 2.2.1.4.3). Doch der
Primärantikörper war polyklonal und kreuzreagierte sogar mit der Negativkontrolle. Die
Ergebnisse hatten keinerlei Aussagekraft. Um MBP nachzuweisen wurde anschließend
versucht die Waschfraktion durch Ionenaustauschchromatographie aufzutrennen.
3.2.2.6 Ionenaustauschchromatographische Aufreinigung des geschnittenen
Fusionsproteins über An- und Kationentauscher
Die Waschfraktion des PreScission Protease-Verdaus auf dem Amylose-Harz wurde auf
ein Endvolumen 30 ml ankonzentriert (vgl. 2.2.1.2) und über eine HiPrep 26/10
Desalting-Säule umgepuffert (vgl. 2.2.4.2).
Die Anionenaustauschchromatographie mit einer DEAE-Sepharose-FF-Säule wurde
nach den Angaben in Kapitel 2.2.4.1.3 durchgeführt. Der theoretische isoelektrische
Punkt (pItheoret) von MnmA liegt bei 7,6. Die Puffer wurden etwas mehr als eine pHEinheit darüber eingestellt (pH 8,8). Der kalkulierte pI von MBP liegt bei 5,8. Das
Protein sollte an der DEAE-Sepharose binden und deutlich später als MnmA eluieren.
Das Elutionsprofil ist in Abbildung 29 dargestellt. Das Chromatogramm zeigt bei
Injektion der Waschfraktion einen Anstieg der UV-Absorption, die dem Durchfluss
entspricht. Das Eluat teilt sich in ein mittleres Maximum, ein kleines Maximum und ein
sehr großes Maximum. Proben einiger Fraktionen der Absorptions-Maxima wurden
durch SDS-PAGE analysiert (Abbildung 30).
Durchfluss
Eluat
Abbildung 29: Chromatogramm der Ionenaustauschschromatographie von MBP und MnmA nach dem
PreScission Protease-Verdau auf Amylose-Harz [Waschfraktion]
(blau: UV-Absorption bei 280 nm, rot: Leitfähigkeit, grün: Salzgradient).
67
Ergebnisse
M D W E 5 6 7 8 9 10 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
102 kDa
97 kDa
66 kDa
45 kDa
27 kDa
Abbildung 30: SDS-PAGE der Ionenaustauschchromatographie der Waschfraktion des PreScission
Protease-Verdaus auf Amylose-Harz. Die Zahlen bezeichnen die Fraktionen
(M = Marker, D = Durchfluss, W = Waschfraktion, E = Elutionsfraktion, 12,5%iges SDS-Gel).
Die Fraktionen 5-10 vom Durchfluss und die Fraktionen 23-32 vom Eluat wurden
untersucht. Es zeigte sich, dass ein großer Teil des Proteins nicht gebunden hatte. Dies
sollte theoretisch nicht passieren, da der pH-Wert des Puffers weit über den
isoelektrischen Punkten der Proteine lag. Das restliche Protein wurde zwar eluiert, war
auf dem Gel aber als Doppelbande zu erkennen. Dabei handelt es sich nicht um
Abbauprodukte von MnmA, da solche Erscheinungen nie beobachtet wurden.
Die Salzkonzentration bei der Elution am ersten (mittleren) Maximum betrug ungefähr
140 mM NaCl. Bei einer solchen Konzentration eluieren schwächer geladene Proteine
mit einem höheren pI (z.B. MnmA). Das zweite (kleine) Maximum der Elution
korrelierte mit einer NaCl-Konzentration von 240 mM. Bei dieser Salzkonzentration
eluieren stärker geladene Proteine mit niedrigem pI (z.B. MBP). Durch das SDS-Gel
konnte keinem der beiden Proteine ein definiertes Maximum zugeordnet werden. Die
Doppelbanden und die schlechte Auflösung machten die genaue Zuordnung der
Proteine unmöglich. Es konnte nicht ermittelt werden, welches Protein bei der
jeweiligen Salzkonzentration eluiert wurde. Die Salzkonzentration am dritten, sehr
hohen Maximum lag bei 410 mM NaCl. Dort eluieren stark negativ geladene
Makromoleküle, wie z.B. Nukleinsäuren. Diese Annahme korreliert mit den
Beobachtungen. Auf dem SDS-Gel erkennt man, das diese Fraktionen mit der höchsten
Absorption kein Protein enthalten. Mit Coomassie kann man Nukleinsäuren nicht
anfärben. Deshalb sind die Spuren 30-32 leer.
Eine detaillierte Auflösung des Elutionsbereichs zwischen 100 und 250 mM NaCl
mittels einer ResourceQ und eine Erhöhung des pH-Wertes auf pH 9 brachte keine
Veränderung mit sich. Die Anionenaustauschchromatographie brachte keine Gewissheit
über den Reinheitsgrad von MnmA.
Die Kationenaustauschchromatographien über CM-Sepharose und Source 30s (vgl.
2.2.4.1.4) brachten keine verwertbaren Ergebnisse.
68
Ergebnisse
Auch ein pH-Gradient über die ResourceS führte zu keinem Ergebnis. Das Protein fiel
bei einem pH-Wert unter pH 6 aus.
Dennoch wurden die Fraktionen 23-28 des Eluats aus dem DEAE-Aufreinigung zur
weiteren Präparation vereinigt und auf ein Volumen von 5 ml ankonzentriert.
3.2.2.7 Ausschlusschromatographische Aufreinigung des geschnittenen
Fusionsproteins
Als nächster und letzter Aufreinigungsschritt wurde eine präparative Gelfiltration mit
einer Superdex 75-Säule, wie unter 2.2.4.1.5 beschrieben, durchgeführt. Das
Chromatogramm der Gelfiltration wird in Abbildung 31 dargestellt. Es sind vier
Absorptionsmaxima erkennbar. Das erste kleine Maximum ist bei 100 ml, also im
Ausschlussvolumen der Säule. Das zweite und höchste Maximum wird bei 142 ml
erreicht. Dies entspricht einem Molekulargewicht von 72 kDa. Bei 166 ml folgt der
dritte und zweithöchste Gipfelpunkt der UV-Absorption, der für Moleküle mit einem
Gewicht von 42 kDa steht. Der letzte Höchstwert folgt bei 300 ml und stellt kleine, UVabsorbierende Moleküle dar (z.B. oxidiertes DTT).
Anhand dieser Beobachtungen konnte spekuliert werden, dass das zweite, höchste
Maximum dem MnmA (41 kDa) mit einer gebunden tRNA (30 kDa) entspricht. Das
Molekulargewicht dieses Komplexes liegt bei ca. 70 kDa. Das dritte Maximum würde
mit MBP korrelieren. Die Fraktionen der Maxima wurden mittels SDS-PAGE analysiert
(Abbildung 32).
Abbildung 31: Chromatogramm der Ausschlusschromatographie von MnmA und MBP nach der
Anionenaustauschchromatographie (Fraktionen 23-28) über eine Superdex 75.
(blau: UV-Absorption bei 280 nm, rot: Leitfähigkeit).
69
Ergebnisse
M
25
26
27
28 29
30
31 32
33
34 35
70 kDa
60 kDa
50 kDa
40 kDa
30 kDa
Abbildung 32: SDS-PAGE der Ausschlusschromatographie von MBP und MnmA über eine Superdex 75.
Die Zahlen bezeichnen die Fraktionen (M = Marker, 12,5%iges SDS-Gel).
Die SDS-PAGE der Ausschlusschromatographie wurde in einer Höfer-Gelkammer von
Amersham Pharmacia Biotech durchgeführt, die eine deutlich höhere Auflösung bietet.
Man erkennt auf dem Gel einen Laufunterschied zwischen den Proben des zweiten und
dritten Maximums. Die Fraktionen des ersten und vierten Maximums wurden auf einem
separaten Gel untersucht. Es zeigten sich aber keine Proteinbanden. Aggregationen oder
Doppelbanden, wie sie bei der Anionenaustauschchromatographie auftraten, sind nicht
zu erkennen. Das zweite Maximum ist MnmA und das dritte ist MBP.
Um diese Behauptung zu unterstützen, wurde die Fraktionen 27-30 (Peak 1) und die
Fraktionen 32-34 (Peak 2) separat vereinigt und ankonzentriert (5 µM). Die Proteine in
den beiden Proben wurden dann im Labor von Bernhard Schmidt N-terminal
ansequenziert.
Dabei wurden folgende Sequenzen ermittelt:
Peak 1:
(M) P (G) S K V G A L
Peak 2:
M K I E (E) G K L V I
Vergleicht man die Sequenz von Peak 1 mit der Anfangssequenz von MnmA, so stellt
man Gemeinsamkeiten fest. Mit der Sequenz von Peak 2 gibt es keine Ähnlichkeiten.
MnmA:
MKVGVALSG
Die Vermutung, die bei der Auswertung des Chromatogramms getroffen wurde,
bestätigte sich. MnmA hat eine tRNA gebunden und eluiert im zweiten Maximum
(Peak 1). Dies verdeutlicht die hohe Affinität von MnmA zu tRNA. Während der
ganzen komplexen Aufreinigungsprozedur hat sich die tRNA nicht gelöst.
Mit dieser Art der Aufreinigung ist es offenbar nicht möglich, MnmA ohne gebundenes
Substrat zu gewinnen. Das gewonnene Protein wurde auch nicht zur Kristallisation
verwendet.
70
Ergebnisse
3.2.3 Expression und Aufreinigung von MnmA mit Strep-tag II
3.2.3.1 Überexpression in E. coli
Der pASK-IBA3-Vektor bietet eine Reihe von Vorteilen. Dieses Plasmid besitzt einen
tetA-Promotor, der von E. coli nicht erkannt wird. Das Gen sollte vor der Induktion mit
Anhydrotetracyclin (AHTC) nicht abgelesen werden. Des Weiteren ist die
Affinitätssequenz sehr kurz (8 Aminosäuren) und behindert so die Faltung des
exprimierten Zielproteins kaum. Er muss für die Kristallisation nicht durch einen
Proteaseverdau entfernt werden. Zudem ist die Affinitätssequenz mit dem C-Terminus
des Zielproteins fusioniert, so dass bei der Aufreinigung nur vollständig exprimiertes
Protein
am
Strep-Tactin-Säulenmaterial
binden
kann.
Säulenmaterial
und
Affinitätssequenz sind so auf einander abgestimmt, dass andere Proteine von E. coli
nicht binden können.
Nach der Präparation des neu klonierten Vektors pASK-IBA3-MnmA (vgl. 3.1.2.2)
wurde ein geeigneter Expressionsstamm gesucht (vgl. 3.2.1.1). Dabei wurden die
Empfehlungen von IBA berücksichtigt. Es wurden die E. coli-Stämme XL1-Blue,
XL10-Gold, BL21, BL21 (DE3), BL21 (DE3) Rosetta 2 und ER 2507 getestet. Dabei
wurde analog zu 3.2.2.1 verfahren. Die Induktion erfolgte hingegen nicht mit IPTG,
sondern durch Zugabe von AHTC. Proben der Testkulturen vor und nach Induktion
wurden mittels SDS-PAGE analysiert (Abbildung 33).
XL1- XL10- BL21 BL21 BL21 ER
Blue Gold
(DE3) (DE3) 2507
Rosetta 2
M vI nI vI nI vI nI vI nI vI nI vI nI
102 kDa
97 kDa
66 kDa
45 kDa
27 kDa
Abbildung 33: SDS-PAGE der Expressionstests von MnmA mit Strep-tag II mit verschiedenen E. coliStämmen bei 30oC. Der Pfeil markiert die stärkste Induktionsbande des Proteins bei BL21 (DE3).
(M = Marker, vI = vor Induktion, nI = nach Induktion, 15%iges SDS-Gel).
Eine Induktion der Proteinexpression war bei den meisten der getesteten Stämme zu
erkennen. Es zeigte sich aber, dass das Protein schon vor der Induktion exprimiert
wurde. In allen Proben, die vor der Induktion entnommen wurden, sind starke Banden
bei ca. 45 kDa sichtbar.
71
Ergebnisse
Die Probe von E. coli BL21 (DE3) zeigte eine starke Induktionsbande bei ca. 45 kDa
(schwarzer Pfeil). Dieser Stamm wurde für die Expression im großen Maßstab gewählt.
Parallel wurde die Induktion der Proteinexpression von pASK-IBA5 getestet (Daten
nicht gezeigt). Dort wurden vergleichbare Resultate erzielt.
Für die Expression von MnmA-Strep-tag II in BL21 (DE3) wurden Literkulturen mit
LB-Medium und 1% (w/v) Glucose (Senkung der Basisexpression) angesetzt. Die
Expressionskultur wurde 1:500 mit der vorbereiteten Vorkultur (vgl. 2.2.3.4.1)
angeimpft und dann bei 37oC vermehrt. Nach dem Erreichen einer OD600 von 0,6
wurden sie mit 0,5 M induziert und die Expression wurde bei 25oC inkubiert. Später
wurde auch bei 20oC über Nacht induziert, um die Löslichkeit zu erhöhen. Bei einer
OD600 von 1,6 - 1,8 wurden die Zellen geerntet (vgl. 2.2.3.5).
3.2.3.2 Zellernte und Aufschluss
Nach der Ernte wurden die Zellen im Lysispuffer resuspendiert und im Fluidizer
aufgeschlossen (vgl. 2.2.3.5). In den ersten Aufreinigungen hatte der Lysispuffer eine
Salzkonzentration von 300 mM NaCl. Durch spätere Erkenntnisse (vgl. 3.2.3.3) wurde
er noch etwas modifiziert. Er enthielt dann 800 mM NaCl, um RNA vom MnmA
abzulösen.
Lysispuffer:
100 mM
Tris/HCl pH 8
800 mM
NaCl
2 mM
EDTA
4 mM
DTT
1 Tablette
Protease Inhibitor
Nach der Ultrazentrifugation wurde die Löslichkeit des MnmA durch ein SDS-Gel
untersucht (Abbildung 35). Es zeigte sich, dass viel MnmA unlöslich war und bei der
Ultrazentrifugation sedimentiert wurde (Pellet). Eine langsamere Expression bei 20oC
verbesserte die Löslichkeit (Daten nicht gezeigt).
3.2.3.3 Affinitätschromatographische Aufreinigung über Strep-Tactin
Die Aufreinigung über die Strep-Tactin-Säule erfolgte gemäß der im Kapitel 2.2.4.1.2
beschriebenen Methode. Die Abbildung 34 zeigt das Chromatogramm der ersten
Aufreinigung. Dabei enthielten noch alle Puffer eine geringere Salzkonzentration von
150 mM. Die dunkelblaue Kurve zeigt die UV-Absorption bei 280 nm, die hellblaue
Kurve zeigt die UV-Absorption bei 254 nm und die rote Kurve zeigt die Leitfähigkeit.
72
Ergebnisse
Nach der Probeninjektion über einen Superloop, dem Waschen der Säule und der
Zugabe von 5 ml Elutionspuffer wurde MnmA in einem schmalen Maximum eluiert. Es
wurde ein zweites Mal mit 5 ml Elutionspuffer gewaschen, um sicherzustellen, dass
kein Protein mehr am Strep-Tactin gebunden war. Es wurde nur noch ein zweites,
kleines Maximum erreicht. Proben vom Durchfluss (Fraktionen 1-7), vom ersten
Elutionsschritt (Fraktionen 11-18) und vom zweiten Elutionsschritt (Fraktionen 21-23)
wurden via SDS-PAGE analysiert (Abbildung 35).
Elution
Abbildung 34: Chromatogramm der Affinitätschromatographie von MnmA mit Strep-tag II über eine
Strep-Tactin-Säule mit 150 mM NaCl. Der schwarze Pfeil markiert die Zugabe des Elutionspuffers
(dunkelblau: UV-Absorption bei 280 nm, hellblau: UV-Absorption bei 254 nm, rot: Leitfähigkeit).
M vI nI P
Ü
2
6 12 13 14 15 16 17 22 23
100 kDa
60 kDa
50 kDa
40 kDa
30 kDa
20 kDa
Abbildung 35: SDS-PAGE der Affinitätschromatographie von MnmA mit Strep-tag II über eine StrepTactin-Säule. Des Weiteren sind Induktions- und Löslichkeitsproben mit aufgetragen (M = Marker, vI =
vor Induktion, nI = nach Induktion, P = Pellet, U = Überstand, 12,5%iges SDS-Gel).
Das SDS-Gel zeigt, dass MnmA sauber (geringe Kontaminationen durch Fremdprotein)
und konzentriert im ersten Maximum (Fraktionen 11-18) eluiert. In der zweiten Elution
ist kaum noch Protein enthalten. Dennoch wurde bei allen folgenden Aufreinigungen
mit Strep-Tactin mit 10 ml Puffer eluiert. In den Fraktionen des Durchflusses erkennt
man noch eine starke MnmA-Bande bei 45 kDa. Die Kapazität der Säule war aber nicht
überschritten. Es handelt sich dabei wahrscheinlich um Protein ohne voll synthetisierten
Strep-tag. Die Ausbeute lag im Durchschnitt bei 10 - 15 mg MnmA pro Liter
Expressionskultur.
73
Ergebnisse
Durch die Messung der UV-Absorption bei 280 nm und 254 nm konnte man
Rückschlüsse auf die Kontamination des Proteins durch Nukleinsäuren ziehen. Proteine
absorbieren ultraviolettes Licht bei einer Wellenlänge von ca. 280 nm, während die
Nukleinsäuren Licht bei ca. 260 nm absorbieren. Die Kurven in Abbildung 34 sind auf
die gleiche Höhe genormt, so dass man auf das Verhältnis von Nukleinsäuren zu Protein
schließen kann. Man erkennt, dass das UV280/UV254-Verhältnis des Eluats kleiner als
eins ist. Die Absorption des Eluats bei 254 nm (Nukleinsäuren) ist höher als die
Absorption bei 280 nm (Protein).
Die Vermutung lag nah, dass MnmA tRNAs gebunden hatte. Um dies zu bestätigen
wurde eine 1:100 verdünnte Probe des Eluats im Spektralphotometer gegen
Elutionspuffer vermessen. Ein Spektrum von 200 - 900 nm wurde aufgezeichnet. Bei
einer Vergrößerung des UV-Bereichs (Abbildung 36) zeigte sich, dass das
Absorptionsmaximum
der
Probe
bei
259
nm
lag,
was
ungefähr
dem
bestätigt.
Absorption
Absorptionsmaximum von Nukleinsäuren entspricht. Die Vermutung wurde dadurch
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
240
260
280
300
320
340
360
Wellenlänge [nm]
Abbildung 36: UV-Spektrum für affinitätschromatographisch aufgereinigtes MnmA mit Strep-tag II vor
der Behandlung mit 800 mM NaCl. Das Absorptionsmaximum liegt bei 259 nm.
Für die Kristallisation wurde aber MnmA ohne gebundene tRNA benötigt. Das Substrat
musste auf eine schonende Weise entfernt werden. So wurde anfänglich versucht das
aggregierte Protein aus der Ausschlusschromatographie (3.2.3.4) durch Zugabe von
Benzonase (RNase) von der tRNA abzutrennen. Das Protein wurde nach Zugabe der
Benzonase 16 h bei 4oC inkubiert. Dann wurden die freigesetzten Nukleotide über eine
PD-10 Entsalzungssäule von Amersham Pharmacia Biotech abgetrennt. Ein Spektrum
dieser Probe zeigte wieder ein Maximum bei 260 nm.
In einem weiteren Versuch die tRNA zu entfernen, wurde das Protein zusätzlich mit 800
mM NaCl versetzt. Nach der Entsalzung zeigte das Spektrum ein Maximum bei 280
nm. Die RNA wurde größtenteils entfernt.
74
Ergebnisse
Diese Erkenntnisse wurden bei weiteren Aufreinigungen mit Strep-Tactin umgesetzt.
Dem Lysispuffer wurde 800 mM NaCl zugegeben, um die RNA gleich zu Beginn der
Aufreinigung abzulösen. Auch Wasch- und Elutionspuffer wurden mit 800 mM NaCl
versetzt. Dann wurde wieder nach 2.2.4.1.2 verfahren. Das Chromatogramm der
Aufreinigung mit 800 mM NaCl ist in Abbildung 37 dargestellt. Das UV280/UV254Verhältnis ist gegenüber dem Chromatogramm in Abbildung 34 deutlich höher. Man
kann davon ausgehen, dass die tRNA größtenteils entfernt wurde. Eine SDS-PAGE der
Fraktionen stellte sich, wie in Abbildung 35 gezeigt, dar. Das Protein wurde sehr sauber
von der Säule eluiert.
Elution
Abbildung 37: Chromatogramm der Affinitätschromatographie von MnmA mit Strep-tag II über eine
Strep-Tactin-Säule mit 800 mM NaCl. Der schwarze Pfeil markiert die Zugabe des Elutionspuffers
(dunkelblau: UV-Absorption bei 280 nm, hellblau: UV-Absorption bei 254 nm, rot: Leitfähigkeit).
Ein Spektrum des Eluats (Abbildung 38) zeigte ein Absorptionsmaximum bei 277 nm,
wie es für Proteine erwartet wird. Aufgrund der Breite des Maximums ließ sich jedoch
Absorption
nicht sagen, ob die RNA vollständig entfernt wurde.
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
240
260
280
300
320
340
360
Wellenlänge [nm]
Abbildung 38: UV-Spektrum für affinitätschromatographisch aufgereinigtes MnmA mit Strep-tag II nach
der Behandlung mit 800 mM NaCl. Das Absorptionsmaximum liegt bei 277 nm.
75
Ergebnisse
3.2.3.4 Ausschlusschromatographische Aufreinigung
Der letzte Aufreinigungsschritt, eine präparative Gelfiltration mit einer Superdex 75Säule, wurde vorwiegend genutzt um Aggregationen von MnmA zu detektieren.
Weiterhin wurde durch die Gelfiltration das D-Desthiobiotin entfernt, entsalzt und
umgepuffert. Diese wurde, wie unter 2.2.4.1.5 beschrieben, durchgeführt.
Die Abbildung 39 stellt das Chromatogramm der Gelfiltration nach der ersten
Aufreinigung mit Strep-Tactin dar. Man erkennt eine starke Aggregation von MnmA.
Der größte Teil des Proteins eluiert im Ausschlussvolumen der Säule. Bei 160 ml (42
kDa), dort wo man das Protein erwartet zeigt sich kein Maximum. Eine Vermessung des
Spektrums ergab ein Absorptionsmaximum bei ca. 260 nm.
Alle Fraktionen mit UV-Absorption wurden durch SDS-PAGE analysiert (nicht
dargestellt). Das Gel zeigte durch alle Fraktionen Banden auf gleicher Höhe, bei
ungefähr 45 kDa.
Abbildung 39: Chromatogramm der Ausschlusschromatographie von MnmA mit Strep-tag II vor
Entfernung der RNA über eine Superdex 75 bei pH 8 und 100 mM NaCl
(blau: UV-Absorption bei 280 nm, rot: Leitfähigkeit).
Nach der Modifikation der Aufreinigungsbedingungen über Strep-Tactin wurden
wiederum Gelfiltrationen mittels unterschiedlicher Superdex 75-Säulen durchgeführt.
Dabei wurden die Effekte einer Erhöhung der Salzkonzentration auf 200 mM NaCl
(Abbildung 40) und des pH-Wertes auf pH 9 (Abbildung 41) getestet. In beiden Fällen
zeigte sich, dass monomeres, substratfreies MnmA gewonnen werden konnte. Es wird
zwar immer noch viel Protein in aggregierter Form eluiert, jedoch liegt das höchste
Maximum bei ca. 160 ml (pH8: Fraktionen 32-35, pH9: Fraktionen 30-34), d.h. bei 42
kDa.
76
Ergebnisse
Bei der Spektralmessung lag das Absorptionsmaximum der vereinigten Fraktionen (3235 bzw. 30-34) jeweils bei 280 nm. Das SDS-Gel bestätigte (Abbildung 42), das die
zwei höchsten Maxima nur das MnmA enthielten.
Die Ausbeuten der Gelfiltrationen waren unterschiedlich. Es wurden jeweils 10 mg
Protein aus dem Eluat der Strep-Tactin-Säule geladen. Die Gelfiltration bei pH 8 und
200 mM lieferte 6 mg monomeres MnmA (vereinigte Fraktionen 33-35). Bei pH 9 und
100 mM NaCl waren es 4 mg (vereinigte Fraktionen 30-33). Die höhere
Salzkonzentration stabilisiert offenbar das Monomer.
Das Protein war aufgereinigt und konnte kristallisiert werden.
Monomeres MnmA
Abbildung 40: Chromatogramm der Ausschlusschromatographie von MnmA mit Strep-tag II nach
Entfernung der RNA über eine Superdex 75 bei pH 8 und 200 mM NaCl
(blau: UV-Absorption bei 280 nm, rot: Leitfähigkeit).
Monomeres MnmA
Abbildung 41: Chromatogramm der Ausschlusschromatographie von MnmA mit Strep-tag II nach
Entfernung der RNA über eine Superdex 75 bei pH 9 und 100 mM NaCl
(blau: UV-Absorption bei 280 nm, rot: Leitfähigkeit).
77
Ergebnisse
pH 8
pH 9
200 mM NaCl
100 mM NaCl
24 28 32 33 34 35 M 20 21 24 26 30 31 32 33
102 kDa
97 kDa
66 kDa
45 kDa
Abbildung 42: SDS-PAGE der Ausschlusschromatographie von MnmA mit Strep-tag II nach Entfernung
der RNA über eine Superdex 75 mit 200 mM NaCl pH 8 bzw. 100 mM NaCl pH 9.
Die Zahlen bezeichnen die Fraktionen (M = Marker, 15%iges SDS-Gel).
Trotz ähnlicher Höhen der Maxima von aggregiertem Protein (100 - 120 ml) und
monomerem Protein (160 ml) enthielten die Monomer-Fraktionen 33 und 34 (pH 8)
bzw. 31 und 32 (pH 9) viel mehr Protein als die Oligomer-Fraktionen 24 bzw. 20. Die
Höhe der UV-Absorption bei 280 nm wird also auch von Nukleinsäuren beeinflusst.
Die Fraktionen 33-35 aus der Gelfiltration bei pH 8 wurden auf 10
mg
/ml ( 240 µM)
ankonzentriert und zur Kristallisation verwendet. Das SDS-Gel zeigt keine
Kontamination dieser Fraktionen durch andere Proteine.
3.3 Kristallisation von MnmA
Die Kristallisation der 2-Thiouridinsynthestase MnmA soll eine Strukturaufklärung des
Enzyms ermöglichen. Beim Vergleich mit Strukturen von substratgebundenem MnmA
könnte der Mechanismus der Katalyse aufgeklärt werden. Des Weiteren könnte eine CoKristallisation mit der Sulfurtransferase IscS die Übertragung der Sulfhydrylgruppe
sichtbar machen.
Für die Kristallisationsansätze wurde das in dieser Arbeit aufgereinigte MBP-MnmAFusionsprotein (vgl. 3.2.2.4), sowie MnmA mit Strep-tag II-Affinitätssequenz aus
Thermotoga maritima verwendet (vgl. 3.2.3.4). Die Ansätze wurden mit 2 mM DTT
pipettiert, um den reduzierten Zustand der aktiven Cysteine zu gewährleisten. Auf die
Zugabe von Substraten oder Bindungspartnern wurde verzichtet.
3.3.1 Kristallisation des MBP-MnmA-Fusionsproteins
Durch die Aufreinigung wurde MBP-MnmA-Fusionsprotein in ausreichender Reinheit
gewonnen. Trotz der aggregierten Form (vgl. 3.2.2.4) wurden die ersten
Kristallisationstests durchgeführt.
78
Ergebnisse
MBP-MnmA-Fusionsprotein wurde im sitzenden Tropfen mit einer Proteinkonzentration von 10
mg
/ml ( 120 µM) bei 20° C pipettiert (vgl. 2.2.5.1). Dazu wurden
folgende Eingangsbedingungen (engl. initial screens) verwendet:
Crystal Screen 1 (CS1)
Crystal Screen 2 (CS2)
Crystal Screen Lite (CSL)
Crystal Screen Cryo (CSC)
Crystal Screen PEG/Ion (CSP)
JB Screens 1-10 (JB 1-10)
Footprint Screens 1-3 (FP 1-3)
Structure Screen (STS)
Die Bilder der Kristalle wurden mit einer Digitalkamera aufgenommen. Ihre Größe
wurde durch ein Messraster im Binokular bestimmt.
Nach einem Tag war in 50% aller Bedingungen braunes Präzipitat (denaturiertes
Protein) erkennbar.
Sieben Tagen später waren im Structure Screen in der Bedingung 33 (Abbildung 43)
kleine, nadelförmige Kristalle erkennbar, die sternförmig gewachsen sind. Sie sind auf
amorphem Präzipitat gewachsen. Im Well gab es teilweise Phasentrennungen durch
PEG. Die Kristalle waren zu klein für eine Vermessung im Diffraktometer. Aufgrund
ihrer geringen Größe konnten sie auch nicht über SDS-PAGE analysiert werden.
Es wurde versucht die Kristalle zu reproduzieren. In der Originalbedingung gelang das
nicht. Durch ein systematisches Raster von Bedingungen, die sich geringfügig in ihren
Salz- und Präzipitanskonzentrationen unterschieden, wurde versucht eine Bedingung zu
finden bei der sich die Kristalle reproduzieren oder sogar vergrößern ließen. Es wurde
aber keine Bedingung gefunden, in der Kristalle gewachsen sind. Als letztes wurde
versucht durch „Macro-Seeding“ (vgl. 2.2.5.2) die Kristalle zu vergrößern, doch auch
das zeigte keinen Effekt.
Abbildung 43: Sternförmiger Proteinkristall
Structure Screen - 33
10 mg/ml (120 µM) MBP-MnmA
0,2 M Li2SO4 pH5,5
10 % PEG 1500
30 % Isopropanol
Größe: 20 µm
79
Ergebnisse
Ebenfalls nach einer Woche waren in der 12. Bedingung des Crystal Screens 2
kristallartige, braune Strukturen erkennbar (Abbildung 44), die scheinbar direkt im
Präzipitat wuchsen. Sie waren relativ ungleichförmig und nicht durchsichtig.
Auch diese Kristalle waren zu klein für Röntgenstrukturanalyse und SDS-PAGE.
Deshalb wurden die Kristalle reproduziert und die Kristallisationsbedingung optimiert
(Abbildung 45). Jedoch zeigte sich, dass bei Abwesenheit von DTT keine Kristalle
wuchsen. Dennoch wurden sie im Diffraktometer vermessen. Dies brachte keine
Ergebnisse, da keine Reflexe auf dem Detektor erkennbar waren.
Abbildung 44: Braune, kristalline Strukturen
Crystal Screen 2 - 12
10 mg/ml (120 µM) MBP-MnmA
0,1 M NaAc pH 4,6
0,1 M CdCl2
30 % PEG 400
Größe: 20 - 40 µm
.
Abbildung 45: Optimierung der Kristallisationsbedingung von Crystal Screen 2 - 12
Cadmium-Screen - C5
7 mg/ml (86 µM) MBP-MnmA
0,1 M NaAc pH 5
0,1 M CdCl2
20 % PEG 400
Größe: 50 - 80 µm
Nach drei Monaten wuchsen in der Bedingung 21 Footprint Screens 3 kubische
kristallähnliche Strukturen ohne glatte Flächen (Abbildung 46). Diese Kristalle waren
ebenfalls zu klein für eine Vermessung im Röntgendiffraktometer. Eine Reproduktion
der Kristalle gelang jedoch nicht.
Abbildung 46: Kubische Kristallstrukturen
Footprint Screen 3 - 21
10 mg/ml (120 µM) MBP-MnmA
0,2 M NH4Ac pH 4,5
9 % PEG 10.000
Größe: 50 µm
Da ähnliche Kristalle im Structure Screen in der Bedingung 37 gefunden wurden
(Abbildung 47), wurde auf die Optimierung der Kristallisationsbedingung verzichtet.
80
Ergebnisse
Die Kristalle der 37. Bedingung des Structure Screens (Abbildung 47) waren, wie die
des Footprint Screens 3, teilweise kubisch und mit rauen Oberflächen. Ihre
Kristallstruktur scheint relativ ungeordnet zu sein. Einer der Kristalle wurde im
Diffraktometer vermessen, streute den Röntgenstrahl aber nicht. Zur Verbesserung der
Kristallordnung wurde ein „Micro-Seeding“ (vgl. 2.2.5.2) durchgeführt. Bisher zeigte
sich aber kein Kristallwachstum.
Abbildung 47: Kubische Kristalle
Structure Screen - 37
10 mg/ml (120 µM) MBP-MnmA
20 % PEG 8000
40 % PEG 400 pH 4,5
Größe: 100 - 150 µm
Die
Kristallisation
des
MBP-MnmA-Fusionsproteins
brachte
bislang
keine
verwertbaren Ergebnisse. Es konnten während der Diplomarbeit keine Kristalle
produziert werden, die eine Röntgenstrukturanalyse ermöglicht hätten.
3.3.2 Kristallisation von MnmA mit Strep-tag II
Die Kristallisation von MnmA mit Strep-tag II sollte ebenfalls ohne Bindungspartner
und Substrate durchgeführt werden. Das Protein wurde in einer Endkonzentration von
10
mg
/ml ( 240 µM) bei Raumtemperatur pipettiert. Die Kristallisationsansätze wurden
bei 20°C gelagert.
Folgende Initial Screens wurden verwendet:
Crystal Screen 1 (CS1)
Crystal Screen 2 (CS2)
Crystal Screen Lite (CSL)
Crystal Screen Cryo (CSC)
Crystal Screen PEG/Ion (CSP)
Crystal Screen Natrix (CSN)
JB Screens 1-10 (JB 1-10)
Magic Screen (MS)
Footprint Screen (FP 1-3)
Structure Screen (STS)
81
Ergebnisse
Nach einem Tag war in über 75% aller Wells nahezu alles Protein ausgefallen. Es fand
sich in über 50% aller Bedingungen dunkelbraunes, denaturiertes Präzipitat. In 25% der
Ansätze war das Präzipitat grau. Die anderen Wells blieben klar.
Eine Woche später bot sich das gleiche Bild. Eine Kristallbildung war in keiner
Bedingung zu erkennen. Entweder war das Protein in den Wells vollständig präzipitiert
oder die Wells waren völlig klar. Dies wurde bei vielen Bedingungen mit Isopropanol
beobachtet. Dennoch wurden amorphe, klare Proteinaggregationen oder andere
ungewöhnliche Strukturen, die zur Kristallbildung führen könnten, bisher nicht
gefunden.
Durch die begrenzte Zeit dieser Diplomarbeit konnten die Ansätze nicht weiter
beobachtet werden.
82
Diskussion
4. Diskussion
Das
Ziel
dieser
Diplomarbeit
war,
unterschiedliche
Expressions-
und
Aufreinigungsstrategien für die 2-Thiouridinsynthetase MnmA aus Thermotoga
maritima zu testen und zu etablieren, um hochreines, lösliches Protein ohne gebundene
tRNA
zu
gewinnen.
Zu
Beginn
der
Arbeit
standen
zwei
verschiedene
Expressionssysteme zur Verfügung (pMal-c2x, pET-28a), auf denen aufgebaut wurde.
Diese Systeme erwiesen sich aber im Laufe der Arbeit als ungeeignet (vgl. 3.2.1, 3.2.2),
um das Protein aufzureinigen, so dass eine alternative Strategie der Aufreinigung
etabliert werden musste.
Hierzu musste das Gen, das für MnmA codiert (mnmA), in einen andern
Expressionsvektor kloniert werden. Dies geschah zum einen durch Umklonierung des
Gens und zum andern durch eine Neuklonierung des Gens aus genomischer DNA von
Thermotoga maritima in alternative Expressionsvektoren. Die dabei auftretenden
Probleme wurden, wie im Folgenden beschrieben, unterschiedlich gelöst. Nach der
Klonierung wurde eine neue Expressions- und Aufreinigungsstrategie etabliert, um
monomeres, substratfreies MnmA in großen Mengen zu gewinnen.
Nach der Aufreinigung sollte das Protein kristallisiert werden. Die Kristalle sollten
durch röntgenkristallographische Analysen untersucht werden, um die Aufklärung der
Struktur des Proteins ermöglichen. Obwohl es im Rahmen dieser Diplomarbeit nicht
gelungen war, MnmA für die Röntgenkristallographie in einer Form zu kristallisieren,
die Röntgenbeugungsexperimente ermöglichte, konnten erste Bedingungen ermittelt
werden, bei denen eine Kristallbildung erkennbar war. Die Kristalle, die sich gebildet
hatten, streuten bei Beugungsexperimenten den Röntgenstrahl jedoch nicht. Eine
Optimierung der Kristallisationsbedingungen gelang nur in einem kleinen Rahmen.
4.1 Klonierung von MnmA in Expressionsvektoren
Da die Aufreinigung von MnmA mit den gegebenen Expressionssystemen nicht
funktionierte (vgl. 3.2.1, 3.2.2), wurde versucht das Gen auf einem schnellen Weg in
andere Expressionsvektoren umzuklonieren. Dazu wurde nach Vektoren mit
alternativen
Affinitätssequenzen
gesucht,
die
Polylinker
mit
geeigneten
Restriktionsschnittstellen besaßen. Parallel wurde das Gen neu amplifiziert und über
andere Restriktionsschnittstellen in alternative Vektoren kloniert.
83
Diskussion
4.1.1 Umklonierung von MnmA aus pMal-c2x und pET-28a
Die Umklonierung ist der schnellste Weg ein Gen von einem Expressionsvektor in
einen anderen zu übertragen. Diese Umklonierung von MnmA gestaltete sich sehr
schwierig.
In den gegebenen Vektoren war das Gen für MnmA wie folgt einkloniert:
pMal-c2x über BamH I und Hind III mit Stopp-Codon
pET-28a über Nco I - Hind III mit Stopp-Codon
Bei der ersten Umklonierung wurde versucht das Insert aus pMal-c2x in pET-28a zu
übertragen. Der Restriktionsverdau der beiden Plasmide war stets vollständig (Daten
nicht gezeigt). Das ausgeschnittene Fragment war klar auf dem Agarosegel zu erkennen
und wurde extrahiert. Die Ligation in den Zielvektor (pET-28a) glückte jedoch nicht.
Eine Senkung der Ligationstemperatur, eine Verlängerung der Inkubationszeit der
DNA-Ligase und der Austausch des Ligasepuffers führten nicht zum gewünschten
Ergebnis. Es wuchsen zwar Klone auf dem Selektionsmedium und die Kolonie-PCRs
einiger dieser Klone war positiv, aber Kontrollverdaus und Sequenzierungen der
präparierten Plasmide zeigten, dass sich das Fragment nicht im Vektor befand. Es kam
offenbar, trotz Dephosphorylierung des Zielvektors, zu Religationen. Die Fehlersuche
gestaltete sich ziemlich schwierig. Das Fragment ließ sich in den Ursprungsvektor
ligieren, aber nicht in den Zielvektor. Der getrennte Verdau von pET-28a mit je einem
Restriktionsenzym zeigte, dass die Schnittstellen intakt waren. Die Ligation sollte somit
möglich sein. Es konnte nicht ermittelt werden, weshalb die Ligation misslang. Die
Umklonierung in pET-28a wurde nach einigen ergebnislosen Versuchen eingestellt.
Nach der ersten, erfolglosen Umklonierung wurde das Fragment von pET-28a-MnmA
in pETM-30 kloniert. Dieses Plasmid gehört zu einer ganzen Serie von
Expressionsvektoren, die unterschiedlichste Affinitätssequenzen, aber identische
Polylinker aufweisen. Der gewählte Zielvektor besitzt vor dem Polylinker Gene für
GST (Glutathion-S-transferase) und DCOH (DNA-Bindeprotein), zwischen denen sich
eine Nco I-Restriktionsschnittstelle befindet. Beim Verdau mit Nco I und Hind III
wurde DCOH ausgeschnitten und lief auf dem Agarosegel bei 300 bp (Daten nicht
gezeigt). Dabei wurde automatisch die Intaktheit der Restriktionsschnittstellen
überprüft. Die Ligation des Fragments funktionierte gut. Der Kontrollverdau (Abbildung
13) zeigte auf dem Agarosegel zwar nur eine schwache Fragment-Bande, doch die
Sequenzierung des Vektors bestätigten die erfolgreiche Ligation. Aus Zeitgründen
84
Diskussion
wurde auf die Aufreinigung von GST-MnmA-Fusionsprotein verzichtet und dieser
Vektor diente nur als Absicherung falls die Aufreinigung mit Strep-tag IIAffinitätssequenz nicht funktionierte.
4.1.2 Neuklonierung von MnmA aus genomischer DNA von
Thermotoga maritima
Die Neuklonierung von MnmA fand parallel zu den Umklonierungen statt.
Vergleichbare
Polylinker
der
beiden
Zielvektoren,
pGex-6P1 und pET-28a,
ermöglichten die Verwendung identischer Primer und eines einheitlichen PCRProgramms.
Die Amplifizierung des Gens mit den pGex- und den pET-28a-Primern aus
genomischer DNA von Thermotoga maritima funktionierte stets ohne Probleme,
unabhängig von der verwendeten DNA-Polymerase. Das Produkt war immer sauber und
als einzelne Bande auf den Agarosegelen aufgetrennt (Abbildung 14). Die Vektoren
wurden durch einstündigen Restriktionsverdau mit BamH I und Xho I bei 37oC stets
vollständig geschnitten. Banden ungeschnittener Plasmide waren auf den Agarosegelen
nie zu erkennen (Abbildung 15). Durch einen Verdau mit jeweils einem
Restriktionsenzym wurde bestätigt, dass beide Schnittstellen intakt waren (Daten nicht
gezeigt). Es ließ sich jedoch nicht ermitteln, ob das amplifizierte Fragment richtig
geschnitten wurde, da nur 10 Nukleotide des 1,1 kb langen Gens durch den
Restriktionsverdau entfernt wurden. Auf einem 2 %igen Agarosegel konnte kein
Laufunterschied zwischen verdautem und unverdautem Fragment beobachtet werden.
Trotz dieser nahezu optimalen Vorraussetzungen scheiterten die Ligationen des
Fragments in die Zielvektoren. Nach den Kontrollverdaus präparierter Vektoren
verschiedener Klone konnte nie ein Fragment mit 1,1 kb Länge detektiert werden. Die
Sequenzierungen der Vektoren bestätigten diese Beobachtungen. Es wurde eine
systematische Fehleranalyse durchgeführt. Die Ligationen wurden bei unterschiedlichen
Temperaturen durchgeführt, es wurden DNA-Ligasen verschiedener Hersteller
verwendet und der Ligationspuffer wurde erneuert. Diese Bemühungen endeten aber
erfolglos. Als letztes wurde eine gestaffelte Ligation durchgeführt, wobei das Fragment
und die Vektoren mit je nur einem Restriktionsenzym geschnitten wurden. Es zeigte
sich, dass eine Ligation an der BamH I-Schnittstelle nicht möglich war. Die Ligation an
der Xho I-Schnittstelle funktionierte. Die BamH I-Schnittstelle des Fragments war
vermutlich nicht mehr intakt.
85
Diskussion
Es schien aussichtslos dieses Problem schnell zu beseitigen, so dass das Fragment mit
neuen Primern amplifiziert und in pASK-IBA-Vektoren kloniert wurde. Die PCR mit
Pfu-Polymerase wurde durch Zugabe von 10% DMSO optimiert (Abbildungen 16 & 17)
und die mit Sac II und Nco I verdauten Fragmente wurden problemlos in pASK-IBA3
und pASK-IBA5 kloniert. Der Kontrollverdau und die Sequenzierung bestätigten die
korrekte Ligation von mnmA in die Zielvektoren. Für die anschließende Expression und
Aufreinigung wurde pASK-IBA3 verwendet. Auf die Expression mit pASK-IBA5
wurde verzichtet.
4.2 Expression und Aufreinigung von MnmA
Für die Kristallisation von MnmA aus Thermotoga maritima wurden große Mengen
rekombinanten Proteins benötigt. Hierzu sollten Protokolle entwickelt werden, die es
ermöglichten, MnmA in E. coli zu exprimieren und anschließend aufzureinigen. Dies
sollte möglichst zeitsparend und mit möglichst großen Ausbeuten durchführbar sein.
Die Methodik musste so weit optimiert werden, dass die für die Kristallisation nötigen
Proteinmengen erreicht wurden, also mehrere Milligramm pro Aufreinigung. In dieser
Diplomarbeit wurden drei verschiedene Expressions- und Aufreinigungsstrategien
getestet, um MnmA aufzureinigen.
Es versucht das Protein ohne Affinitätssequenz ionenaustauschchromatographisch
aufzureinigen. Dabei wurde pET-28a als Expressionsvektor verwendet. Weiterhin
wurde versucht MnmA mit N-terminal fusioniertem Maltose-Bindeprotein (MBP)
affinitätschromatographisch über Amylose-Harz aufzureinigen. Als Expressionsvektor
diente pMal-c2x. In der dritten Strategie wurde MnmA mit C-terminaler Strep-tag IIAffinitätssequenz über Strep-Tactin-Säulenmaterial aufgereinigt. Der Expressionsvektor
war pASK-IBA3.
4.2.1 Expression und Aufreinigung von MnmA ohne Affinitätssequenz
Viele der getesteten E. coli-Stämme (BL21, BL21 (DE3) LysE, BL21 (DE3) LysS,
BL21 (DE3) RIL, BL21 (DE3) Rosetta 2, ER 2508) exprimierten MnmA ohne
Affinitätssequenz nicht oder nur in geringen Mengen. Einzig BL21 (DE3) konnte das
Protein in größeren Mengen synthetisieren. Nach dem Aufschluss und der
Ultrazentrifugation zeigte sich, dass MnmA ohne Affinitätssequenz kaum löslich war
(Abbildung 20). Als Konsequenz dieser Erkenntnis wurde die Expressiontemperatur auf
22oC gesenkt und die Zellen länger induziert. Diese Maßnahme brachte aber nicht den
86
Diskussion
gewünschten Erfolg. Die Löslichkeit steigerte sich kaum. Es waren über 80% des
Gesamtproteins unlöslich. Der Versuch die Expressionstemperatur weiter abzusenken
und 5% Ethanol zuzugeben, mündete in einem vorzeitigen Zellexitus. Andere Stämme
konnten
MnmA
ebenfalls
nicht
löslich
exprimieren.
Die
Erhöhung
der
Salzkonzentration im Lysispuffer auf 300 mM NaCl und die Zugabe von 10 mM DTT
zeigten kaum Wirkung. Das Protein wurde fest in den „inclusion bodies“
eingeschlossen.
Dennoch wurde versucht das wenige lösliche Protein ionenaustauschchromatographisch
aufzureinigen. Die Anionenaustauschchromatographie über DEAE-Sepharose bei pH
8,8 trennte zwar zahlreiche Proteine auf, doch konnte keine Bande auf dem SDS-Gel
MnmA zugewiesen werden. Die Kationenaustauschchromatographien bei pH 6,4 über
CM-Sepharose oder Source 30S zeigten keine Resultate. Die Aufreinigung von MnmA
ohne Affinitätssequenz wurde ergebnislos eingestellt.
4.2.2 Expression und Aufreinigung des MBP-MnmA-Fusionsproteins
Eine günstige Art der Affinitätschromatographie stellt die Aufreinigung von Proteinen
mit einem N-terminal fusioniertem Maltose-Bindeprotein über ein Amylose-Harz dar.
Das MBP-Fusionsprotein bindet an die Gelmatrix und wird so von anderen Proteinen
abgetrennt. Dieses System wurde zur Aufreinigung von MnmA verwendet.
Bei der Expression des MBP-MnmA-Fusionsproteins zeigte sich, dass BL21 (DE3)
LysE bei 37oC die höchsten Expressionsraten aufwies. Nach dem Aufschluss im
Sonifier und der Ultrazentrifugation waren ca. 50% des Fusionsproteins löslich
(Abbildung 22). Eine Verringerung der Expressionstemperatur wurde nicht in Betracht
gezogen, da aus einem Liter Expressionskultur 50 - 80 mg Fusionsprotein gewonnen
werden konnte. Es wurde 2% Glucose zugegeben, um die Expression von Amylasen
und andern zuckerabbauenden Enzymen zu reprimieren. Die Amylose-Gelmatrix wird
durch Amylasen abgebaut, so dass sich die Kapazität der Säule verringert.
Die Aufreinigung des MBP-MnmA-Fusionsproteins über Amylose-Harz war nicht so
sauber wie erwartet (Abbildung 24). Unspezifisch gebundenes Fremdprotein reduzierte
den Reinheitsgrad des Eluats. Durch eine Erhöhung der DTT-Konzentration auf 6 mM
verbesserte das Aufreinigungsergebnis. Nach der Elution wurde das Fusionsprotein
durch
einen
PreScission
Protease-Verdau
geschnitten
oder
ausschluss-
chromatographisch weiterverarbeitet.
87
Diskussion
Das Elutionsprofil der Gelfiltration des MBP-MnmA-Fusionsproteins mit einer
Superdex
200
(Abbildung
25)
zeigte
nur
ein
Absorptionsmaximum
im
Ausschussvolumen der Säule. Da das monomere Fusionsprotein ein Molekulargewicht
von 83 kDa hatte, war eine Auftrennung zu erwarten. Es kam zu unspezifischen
Aggregationen aus Protein und RNA. Alle proteinhaltigen Fraktionen waren zudem
gleichmäßig mit Spuren kleinerer Proteine kontaminiert. Es wurde versucht durch eine
Erhöhung der Salzkonzentration auf 200 mM NaCl und durch Zugabe von 6 mM DTT
diese
Aggregationen
aufzulösen.
Dies
gelang
nicht,
einzig
die
geringen
Kontaminationen verschwanden. Die Ausbeute an MBP-MnmA-Fusionsprotein nach
der Gelfiltration lag bei 15-30 mg pro Liter Expressionskultur. Trotz des heterogenen
Zustands des MBP-MnmA-Fusionsproteins wurde es kristallisiert.
Alternativ wurde das MBP-MnmA-Fusionsprotein durch die PreScission Protease
geschnitten. Dieser Protease-Verdau funktionierte, wie die Schnittkinetik beweist
(Abbildung 27), nur zu weniger als 50%, unabhängig von der Temperatur, der
Proteasekonzentration oder der Länge des Verdaus. Da die PreScission ProteaseSchnittstelle zwischen den großen, globulären Strukturen von MBP und MnmA lag, war
sie nicht bei allen Fusionsproteinen zugänglich. Wechselwirkungen zwischen den
beiden Proteinen schirmten die kurze Erkennungssequenz ab. Die Protease konnte nicht
binden und die Spaltung der Peptidbindung nicht katalysieren. Dies war mit einer
geringen Ausbeute an geschnittenem MnmA verbunden. Die Effizienz des Verdaus
konnte mit keiner Maßnahme verbessert werden.
Beim Protease-Verdau über Nacht bei 4oC auf dem Amylose-Harz konnten die
Schnittprodukte vom Fusionsprotein abgetrennt werden. Jetzt zeigte sich das Problem
des Aufreinigungssystems. Die Auflösung der SDS-Gele war so gering, dass MBP und
MnmA trotz eines Gewichtsunterschiedes von 2 kDa nicht getrennt wurden. Aussagen
über die Reinheit von MnmA konnten nicht getroffen werden. Es wurde versucht die
Waschfraktion
des
Protease-Verdaus
durch
Ionenaustauschchromatographie
aufzutrennen. Dies führte zu keiner weiteren Aufreinigung von MnmA. Die
Anionenaustauschchromatographie war nicht zu interpretieren, da die Maxima des
Säulenlaufs durch das SDS-Gel keinem der beiden Proteine zugeordnet werden konnte.
Die Doppelbanden und die schlechte Auflösung machten die Zuordnung unmöglich.
Auch
die
durchgeführten
Kationenaustauschchromatographien
brachten
keine
verwertbaren Ergebnisse. Einzig das Verhalten des MnmA bei unterschiedlichen pHWerten konnte dokumentiert werden. Das Protein fiel bei einem pH-Wert unter pH 6
88
Diskussion
aus und das Bindeverhalten an der DEAE-Säule ließ darauf schließen, dass der
isoelektrische Punkt von MnmA niedriger liegt, als der berechnete pI von 7,6.
Eine präparative Gelfiltration der Schnittprodukte mit einer Superdex 75-Säule führte zu
zwei großen Absorptionsmaxima (Abbildung 31), deren Fraktionen erstmals einen
Laufunterschied auf einem SDS-Gel aufwiesen (Abbildung 32). Die Proteine der beiden
Maxima wurden N-terminal ansequenziert. Es zeigte sich, dass das erste große
Maximum bei 70 kDa MnmA mit gebundener tRNA darstellt und dass das zweite große
Maximum MBP ist. Trotz der langwierigen Aufreinigungsprozedur hat sich die tRNA
nicht von MnmA gelöst. Aufgrund Zeitaufwandes und der Komplexität wurde diese Art
der Aufreinigung eingestellt.
4.2.3 Expression und Aufreinigung von MnmA mit Strep-tag II
Die Expression und Aufreinigung mit Strep-tag II-Affinitätssequenz war eine schnelle
und saubere Methode um MnmA aufzureinigen. Es wurde pASK-IBA3-MnmA mit Cterminaler Affinitätssequenz verwendet.
Die Expression war bei den meisten der getesteten Stämme gut (Abbildung 33). Das
Protein wurde in BL21 (DE3) bei 25oC exprimiert. Allerdings wurde der Vektor schon
vor der Induktion abgelesen, so dass die Zellen selten eine OD600 von mehr als 1,5
erreichten. Ab einer gewissen Konzentration wirkte sich die Expression von MnmA
negativ auf die Teilungsrate der Zellen aus. Die Löslichkeit des Proteins lag bei
ungefähr 30%. Durch eine Senkung der Expressionstemperatur auf 20oC und einer
Verlängerung der Induktionszeit auf 12 - 16 h wurde die Löslichkeit auf 50% erhöht.
Die ersten Aufreinigungen erfolgten mit einer Salzkonzentration von 150 mM NaCl.
Dies war jedoch zu wenig um die am MnmA gebundene tRNA zu entfernen. Ein
Spektrum des aufgereinigten Proteins zeigte ein Maximum bei 260 nm (Abbildung 36),
was dem Absorptionsmaximum von Nukleinsäuren entspricht. Bei der Gelfiltration
eluierte MnmA größtenteils im Ausschlussvolumen. Es aggregierte zu einem RNAProtein-Komplex unspezifischer Größe. Für die Kristallisation wurde jedoch
monomeres, substratfreies MnmA benötigt. Um die Aggregationen aufzulösen und die
tRNA auf eine schonende Weise zu entfernen, wurde das aufgereinigte Protein mit 800
mM NaCl und Benzonase behandelt. Dabei zeigte sich, dass MnmA hohe
Salzkonzentrationen toleriert und auch ohne gebundene tRNA stabil ist. Nach einer
Inkubation über Nacht wurde das Protein entsalzt und im Spektralphotometer
89
Diskussion
vermessen. Das Absorptionsmaximum der Probe lag nach der Hochsalzbehandlung bei
280 nm (Abbildung 38). Dies entspricht dem Absorptionsmaximum von Proteinen.
Alle folgenden Zellaufschlüsse und Affinitätschromatographien wurden mit 800 mM
Salzkonzentration durchgeführt, um die RNA effektiv zu entfernen. Die hohe
Salkonzentration beeinflusste die Aufreinigung von MnmA-Strep-tag II nicht. Das
Protein eluierte sehr sauber und konzentriert von der Strep-Tactin-Säule (Abbildung
35). In den anschließenden präparativen Gelfiltrationen zeigte sich, dass MnmA
teilweise beim erwarteten Volumen eluierte (Abbildungen 40 & 41). An den
Elutionsprofilen ist erkennbar, dass eine höhere Salzkonzentration bei der Gelfiltration
den monomeren Zustand des Proteins besser stabilisiert, als eine Erhöhung des pHWertes. Die Ausbeute der Gelfiltration mit 200 mM NaCl war ein Drittel höher als die
Ausschlusschromatographie bei pH 9. Es ist aber nicht gelungen alle MnmA-Moleküle
vollständig von ihrem Substrat zu lösen. Die Bindungsstärke zu tRNAs ist anscheinend
sehr hoch. Eine noch höhere Salzkonzentration könnte die gebundene tRNA komplett
entfernen.
Es wurden 6 mg monomeres, substratfreies MnmA aufgereinigt. Das Protein wurde im
Spektralphotometer vermessen, wobei das Absorptionsmaximum bei 280 nm lag und
anschließend zur Kristallisation eingesetzt.
4.3 Kristallisation von MnmA
Vorangegangene Kristallisationsversuche des MnmA aus E. coli führten zu keinem
Ergebnis. Es ist daher ein probates Mittel orthologe Proteine aus andern Organismen zu
kristallisieren und dessen Strukturen aufzuklären (Grimm et al., 2000), da die
Tertiärstrukturen dieser Proteine meistens identisch sind. Deshalb wurde das orthologe
MnmA aus Thermotoga maritima für die Kristallisation aufgereinigt. Da dieser
Organismus hyperthermophil ist, sollte das Protein auch thermostabil sein. Das zeigte
sich jedoch beim Umgang mit MnmA nicht. Bei einem Test der Thermostabilität durch
die Erwärmung auf 65oC fiel das Protein
aus. Selbst bei der Lagerung bei 4oC
präzipitierte das MnmA. Dennoch eignen sich thermostabile Proteine zur Kristallisation.
Sie sind meist kürzer und haben eine kompaktere Faltung, um ihre Aktivität bei höheren
Temperaturen zu gewährleisten. Durch intramolekulare Stabilisierungseffekte sinkt die
Anzahl der möglichen Konformationen und eine Kristallisation wird wahrscheinlicher.
Diese Kristallisation soll eine Strukturaufklärung des Enzyms ermöglichen. Der
Mechanismus der katalysierten Reaktion könnte durch Co-Kristallisation mit den
90
Diskussion
Substraten (ADPNP, tRNALys) oder Bindungspartnern von MnmA (IscS) aufgeklärt
werden.
In dieser Arbeit wurde sowohl das aufgereinigte MBP-MnmA-Fusionsprotein, als auch
MnmA mit Strep-tag II für die Kristallisation verwendet. Es gelang zwar
unterschiedliche Proteinkristalle vom Fusionsprotein zu erzeugen (Abbildungen 43-47),
jedoch eigneten sie sich nicht für die Röntgenstrukturanalyse. Entweder waren sie zu
nicht groß genug für Röntgenbeugungsexperimente im zur Verfügung stehenden
Diffraktometer oder sie streuten den Röntgenstrahl nicht.
Die kleinen, sternförmigen Kristalle des Fusionsproteins aus der 33. Bedingung des
Structure Screens ließen sich bislang weder reproduzieren, noch durch „MacroSeeding“ vergrößern. Die Kombination aus niedermolekularem PEG und Isopropanol
stellte aber einen guten Ansatz zur Weiterentwicklung dar. Die letzten Kristallisationen
mit PEG 400 und 20% Isopropanol zeigten Ansätze von Kristallbildungen. Die braunen
Kristalle aus dem Präzipitat der 12. Bedingung des Crystal Screens 2, konnten
verlässlich reproduziert werden. Jedoch streuten sie bei Röntgenbeugungsexperimenten
nicht. Diese Kristalle wuchsen nur unter Anwesenheit von DTT. Dies nährte die
Befürchtung, dass das ungeordnete, kristalline Präzipitat nur durch die Reaktion von
DTT
und
Cadmiumionen
entstand.
Solche
Strukturen
sind
für
Röntgenkristallographische Untersuchungen untauglich. Die ähnlichen kubischen
Kristalle mit rauer Oberfläche in der Bedingung 21 des Footprint Screens 3 und in der
37. Bedingung des Structure Screens waren bisher nicht reproduzierbar. Die großen
Kristalle aus dem Structure Screen wurden im Diffraktometer vermessen, streuten den
Röntgenstrahl aber nicht. Dies war durch die Betrachtung der Kristallform schon fast
abzusehen. Die Kristalle sind nicht homogen aufgebaut. Sie haben keine kristalltypische
Form, mit scharfen Kanten oder glatten Flächen. Diese heterogene Anordnung könnte
eine Folge des aggregierten Fusionsproteins sein, an dem noch tRNA gebunden ist. Ein
„Micro-Seeding“ mit Bruchstücken dieser Kristalle führte bislang nicht zum Erfolg. Es
konnten während der Diplomarbeit keine Kristalle produziert werden, die eine
Röntgenstrukturanalyse ermöglichten.
Die Kristallisation von MnmA mit Strep-tag II ohne Bindungspartner oder Substrate
zeigte bislang keinen Erfolg. Bei der Interpretation der Bedingung zeigte sich, dass das
Protein bei geringen pH-Werten unter pH 5 häufig präzipitiert. Auch hochmolekulares
PEG und Ammoniumsulfat sind ungünstige Präzipitantien. Andererseits stabilisieren
10-20% Isopropanol, niedermolekulares PEG und höhere Salzkonzentrationen mit
91
Diskussion
einwertigen Kationen das Protein. Kristallisationsbedingungen mit diesen Konditionen
blieben zumeist klar. Die Ansätze durch das Ende der Diplomarbeit nicht weiter
beobachtet werden. Jedoch könnte eine Co-Kristallisation mit einem tRNAOligonukleotid, welches den Anticodonarm der tRNALys repräsentiert, oder mit nichthydrolysierbarem ATP (ADPNP) eine Stabilisierung der Tertiärstruktur bewirken und
so eine Kristallisation des Proteins wahrscheinlicher machen.
Trotz der fehlenden wissenschaftlichen Erkenntnisse in der Strukturanalyse kann man
sich
mithilfe
bioinformatischer
Thiouridinsynthetase
machen.
Methoden
Ein
ein
Vergleich
Bild
der
vom
Aufbau
der
Aminosäuresequenzen
2100
verschiedener Orthologe von MnmA bei NCBI deckte die Positionierung der
konservierten Aminosäurereste in der Primärstruktur auf (Abbildung 48). Diese
Aminosäuren sind in nahezu allen Orthologen identisch angeordnet. Da das aktive
Zentrum des Proteins wahrscheinlich aus zwei aktiven Cysteinen besteht, von denen
eins das Persulfid ausbildet (Kambampati et al., 2003), konnten diese über den
Sequenzvergleich ermittelt werden. MnmA enthält sieben Cysteine, von denen aber nur
zwei in allen Orthologen vollständig konserviert sind. Vermutlich sind die Cysteine an
Position 103 und 201 im aktiven Zentrum des Proteins lokalisiert. Die benachbarten
Aminosäuren sind ebenfalls sehr konserviert. Ein Sequenzvergleich mit der 4Thiouridinsynthease (ThiI) zeigte keine großen Homologien mit MnmA. Nur der NTerminus von MnmA zeigte Ähnlichkeiten mit der zentralen Sequenz von ThiI. In
diesen Bereichen ist bei beiden Enzymen die Pyrophosphatase-Domäne lokalisiert.
1
51
101
151
201
251
301
351
MKVGVALSGG
CSPSDTADAM
AHCNRFVKFG
KDQSYFLARI
CFIPDGSIEN
IEKFGRRYYV
VCRVRKKSEE
AIIKEGIR
VDSAVALYLL
RIAHFLGVEI
YLMDYVLNQG
EPWRIERLIF
FLKDEGITLK
RGKIPEKNVV
APAVVKVKDN
LKEGHEVKAF
EIVDVKEIFR
FDAFASGHYA
PNGIYTKEEI
DGDIITPEGE
VVSDLEDVFF
EVEVSFEKKV
HMKTKEDEFF
EKVIEPFKRD
RIEFSEKYGR
RKIAEEAGIH
VVGRHFGYPL
SGLIAEDPVW
FAVTPGQIAA
IKKEIKKKVC
LLKGLTPNPC
KVIKKGVDLK
VAKKQESQDV
YTIGQRKGFK
HVEVPEEFRC
FYDGDTLLGG
50
100
150
200
250
300
350
358
Abbildung 48: Aminosäuresequenz von MnmA aus Thermotoga maritima. Die konservierten Reste der
Primärstruktur sind rot eingefärbt. Die beiden vermutlich aktiven Cysteine sind blau.
Neben der Suche nach konservierten Aminosäuren, wurde auch eine Vorhersage der
Sekundärstruktur durch PSIpredict getroffen. In Abbildung 49 erkennt man, dass
MnmA ein
Protein ist. Es hat 7
-Helices (grüne Balken) und 21 -Faltblättern
(gelbe Pfeile). Die Helices sind am N-Terminus und im Zentrum des Proteins
lokalisiert, während die Faltblätter die ganze Sekundärstruktur durchziehen und sich am
C-Terminus konzentrieren. Das Cystein 103 liegt zwischen zwei Helices, so dass man
92
Diskussion
induktive Effekte auf die Ladung der Aminosäure erwarten kann. Das andere Cystein
liegt in einem kurzen Faltblatt.
Abbildung 49: Sekundärstrukturvorhersage für MnmA aus Thermotoga maritima. Die Vorhersage durch
PSIpredict zeigt, dass es sich um ein / Protein handelt, mit 7 -Helices (grüne Balken) und 21 Faltblättern (gelbe Pfeile) in der Sekundärstruktur. Die roten Pfeile markieren die hochkonservierten
Cysteinreste 103 und 201. (Die Höhe der türkis gefärbten Sockel über den einzelnen Aminosäuren gibt
die Konfidenz der Vorhersage wider. C = Loop, E = -Faltblatt, H = -Helix).
Ähnlichkeiten von MnmA mit bekannten Strukturen verschiedener Proteine können
durch den 3D-PSSM Fold Recognition Server ermittelt werden. Er vergleicht die
Aminosäuresequenz
des
Zielproteins
mit
denen
bekannter
Proteine,
deren
Tertiärstruktur aufgeklärt wurde und ermittelt über verschiedene Parameter die
Ähnlichkeit mit bekannten Proteindomänen.
E-value
2.29e-03
Proteinklasse
/ Protein
3.59e-01
/ Protein
2.54e+01
/ Protein
3.04e+01
/ Protein
3.13e+01
/ Protein
Domäne
Adenin Nukleotid
-Hydrolase-Domäne
Adenin Nukleotid
-Hydrolase-Domäne
NAD(P)-Bindedomäne
Rossmann-fold
Thioredoxin- Domäne
Superfamilie
Adenin Nukleotid
-Hydrolase
Adenin Nukleotid
-Hydrolase
NAD(P)Bindeprotein
Thioredoxin-ähnliche
Nukleotid-BindeDomäne
Nukleotid-BindeProteine
Familie
ATP-Pyrophosphatase
Phosphoadenylyl-Sulfate
6-Phosphogluconat-DH
Glutathione Peroxidaseähnliche
D-Aminoacidoxidase, NTerminus
Tabelle 2: Vorhersage von Domänen der Tertiärstruktur von MnmA anhand von Sequenzähnlichkeiten
mit bekannten Proteinstrukturen durch den 3D-PSSM Fold Recognition Server (E-value =
Ahnlichkeitskoeffizient, je kleiner der E-value desto größer die Übereinstimmung mit der Tertiärstruktur).
Es zeigte sich, dass der N-terminale Bereich von MnmA der ATP-Pyrophosphatase
ähnelt. Danach kommt eine Sequenz die Homologien zu Nukleotid-Binde-Domänen
93
Diskussion
aufweist. Eine andere Tertiärstrukturvorhersage bei Expasy wies dem C-Terminus von
MnmA Ähnlichkeiten zu einer Sulfurtransferasedomäne zu. Diese Vorhersagen
korrelieren mit der Funktion des Proteins, ein Schwefelatom unter ATP-Verbrauch auf
ein Uridin einer tRNA zu übertragen.
94
5. Zusammenfassung
Die 2-Thiouridinsynthetase MnmA ist ein tRNA-modifizierendes Enzym, dessen
Homologe in einer Vielzahl von Organismen nachgewiesen wurden. MnmA zeigt eine
hohe Substratspezifität gegenüber den tRNAs, die Lysin, Glutamin und Glutaminsäure
binden und ein Uridin in der Wobble-Position ihres Anticodons besitzen. Das Protein
katalysiert die Übertragung eines Schwefelatoms auf den Pyrimidinring dieses Uridins.
Dabei wird das Sauerstoffatom am zweiten Kohlenstoff des Uracils unter ATPVerbrauch abgespaltet und durch das Schwefelatom ersetzt. Die katalysierte Reaktion
erfolgt dabei über die Bildung eines intramolekularen Persulfids. MnmA kann den
Schwefel nicht direkt aus L-Cystein gewinnen. Das Protein ist auf eine
Schwefelübertragung
durch
eine
Sulfurtransferase
(IscS)
angewiesen.
Diese
unbekannten Mechanismen der Schwefelübertragung vom IscS zum MnmA und vom
MnmA zum Uridin könnten durch die Röntgenstrukturanalyse aufgeklärt werden.
In dieser Arbeit wurden Aufreinigungsstrategien getestet und etabliert, um reines
MnmA von Thermotoga maritima aus der Expression in Escherichia coli zu gewinnen.
Das Gen wurde in einen geeigneten Expressionsvektor kloniert und eine Methode
etabliert, um monomeres, reduziertes MnmA ohne gebundene tRNA in großen Mengen
zu gewinnen. Das aufgereinigte Protein wurde dann zur Kristallisation verwendet.
Dabei wurde vorerst auf die Zugabe von Substraten des Enzyms verzichtet. Es wurden
erste Kristallisationsbedingungen gefunden, die durch Optimierung zukünftige
Röntgenstrukturanalysen erlauben könnten.
Die durch MnmA katalysierte Thio-Modifikation von Uridin steht im Mittelpunkt
aktueller Forschungen. Die Modifikation beeinflusst die Konformation der AnticodonSchleife. Dadurch verbessert sich die Erkennung spezieller Codons durch die tRNA und
die Proteinbiosynthese wird, bei gleichzeitiger Reduktion der Fehlerrate, beschleunigt.
Auch aus medizinischer Sicht spielt 2-Thiouridin auch eine wichtige Rolle. Es ist ein
Erkennungselement für die effektive Nutzung menschlicher tRNA als Primer der
Reversen Trankriptase von HIV. Weiterhin ist die Abwesenheit dieser Modifikation bei
mitochondrialer tRNA, die für Lysin codiert, Auslöser einer Gehirn- und
Muskelerkrankung (MERRF).
95
5. Summary
The 2-thiouridinesynthetase MnmA is a tRNA-modifying enzyme, of which
homologues were found in a number of organisms. MnmA is highly specific for tRNAs,
which bind lysine, glutamine and glutamic acid and which have an uridine in the
wobble position of their anticodons. The protein catalyzes the transfer of a sulfur atom
to the pyrimidine ring of this uridine. Thus, the oxygen at the second carbon of the
uracil is split off and replaced by the sulfur. The catalyzed reaction occurs under
building an intramolecular persulfide. MnmA is not able to obtain the sulfur directly
from L-cysteine. The protein is dependent on the transfer of sulfur by a sulfurtransferase
(IscS). These unknown mechanisms of the sulfur transfer from IscS to MnmA and from
MnmA to uridine would possibly be clarified via X-ray structur analysis.
In this work purification strategies were tested and established in order to obtain
purified MnmA from Thermotoga maritima expressed in Escherichia coli. The gene
was cloned into a suitable expression vector and a method was established to produce
monomeric, reduced MnmA in vast amounts without tRNA bound to it. The purified
protein was used for crystallization, which was done without adding substrates of the
enzyme. First crystallization conditions could be spotted, which might allow X-ray
structure analysis in future after optimizing.
The thio-modification of uridine catalyzed by MnmA is the focus of latest research. The
modification influences the conformation of the anticodon-loop. Thereby the
recognition of certain codons by tRNA is enhaced and protein biosynthesis is
accelerated with simultanous reduction of the error rate. Even from a medical point of
view 2-thiouridine is a major player. It is a recognition element for the efficient use of
human tRNA as a primer for the reverse transcriptase of HIV. Furthermore the absence
of this modification in mitochondrial tRNA, which encodes for lysine, is the trigger for
a serious brain- and muscle-disease (MERRF).
96
Literaturverzeichnis
6. Literaturverzeichnis
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105
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis

alpha
A
Adenosin
Å
Ångstrøm
Ac
Acetat
AHTC
Anhydroxy-Tetracyclin
ATP
Adenosintriphosphat

beta
bidest.
bidestilliert
BSA
Rinderserumalbumin
C
Cytosin
°C
Grad Celsius
ca.
circa
cm
Zentimeter
dH2O
destilliertes Wasser
ddH2O
bidestilliertes Wasser
Da
Dalton
d.h.
das heißt
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonukleinsäure
DTT
1,4-Dithiothreitol
EDTA
Ethylendiamintetracetat
et al.
et altera (lat. und andere)
EtOH
Ethanol
E. coli
Escherichia coli
G
Guanosin
g
Gramm
h
Stunde
I
Inosin
IPTG
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranosid
k
kilo (als Präfix)
l
Liter
M
molar
m
milli (als Präfix)
106
Abkürzungsverzeichnis
mA
Milliampere
MBP
Maltose-Bindeprotein
MCS
multiple cloning site
µ
mikro (als Präfix)
min
Minute
mRNA
Boten RNA (engl. messenger RNA)
n
nano (als Präfix)
OD
Optische Dichte
PAGE
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PBS
Phosphate Buffered Saline
PCR
Polymerase Chain Reaction
PLP
Pyridoxalphosphat
RNA
Ribonukleinsäure
rpm
rounds per minute
rRNA
ribosomale RNA
RT
Raumtemperatur (ca. 25oC)
s
Sekunde
s.u.
siehe unten
SDS
Natrium-Dodecylsulfat
TBE
Tris-Borat-EDTA-Lösung
TEMED
N,N,N',N'Tetra-methylethylendiamin
Tris/HCl
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Hydrochlorid
tRNA
Transfer RNA
U
Uridin
u.U.
unter umständen
UV
Ultraviolett
V
Volt
vgl.
vergleiche
v/v
volume per volume
w/v
weight per volume
z.B.
zum Beispiel
107