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Mikroarrayanalyse – neue Perspektive für die Diagnostik und Prognoseeinschätzung maligner Erkrankungen Wolf-Karsten Hofmann er d z n re e f n o rk gen o o l m o k u T On 05 n 0 e 2 n . e 0 ass lin, 11.1 l e g r Ber Niede Medizinische Klinik III Hämatologie, Onkologie, Transfusionsmedizin Leukämiediagnostik •Klinik •Morphologie -Peripheres Blut -Knochenmark-Zytologie -Knochenmark-Histologie ? Klassifikation (FAB, WHO) •Immunphänotypisierung •Zytogenetik/Molekularbiologie -Klassische Chromosomenanalyse -Nachweis leukämiespezifischer Translokationen (FISH, PCR) ? Risikostratifizierung WKH 09/2005 Diagnostik gastrointestinaler Tumoren •Klinik •Bildgebung -Sonographie -CT -„funktionelle“ Radiologie •Labor (Blut, Stuhl, Urin) •Endoskopie -Makroskopie -Histologie/Immunhistologie -Molekulargenetik •Invasive Diagnostik (OP) WKH 09/2005 Mikroarray-Technik Mögliche Anwendungen der GenexpressionsAnalyse mit Mikroarrays Mikroarray-Analyse für die Diagnostik und Therapieplanung bei gastrointestinalen Tumoren WKH 09/2005 Messung von Genexpression •Northern-Blot -1 Gen in 24 h (1 Gen/24 h) •Real-Time PCR -32 Gene in 2 h (384 Gene/24 h) •Oligonukleotid-Mikroarray -33.000 Gene in 72 h (11.000 Gene/24 h) WKH 09/2005 Reinheit der Tumorzellen Kolon-Karzinom MAMD MAMD ... Microscopy Assisted Manual Dissection Croner et al., J Lab Clin Med (2004) 143, 344-351 WKH 09/2005 Quality of RNA ? WKH 09/2005 Mikroarrays Mikroarrays = „DNA Chips“ = „Genom Chips“ •Array: geordnete Zusammenstellung von Sequenzen auf einer soliden Matrix (Glas, Kunststoffmembran) •Methode basiert auf der Fähigkeit von Nukleinsäuren, zu hybridisieren •Analyse eines gesamten Genoms auf nur einem Array (ca. 2 cm²), in einem einzelnen Experiment, möglich WKH 09/2005 Prinzip der Oligonukleotide Mikroarrays •Markierung der RNA mit Fluoreszenzfarbstoff •Hybridisierung der markierten RNA mit dem Oligonukleotide-Mikroarray •Messung der Fluoreszenzintensität für jedes Oligo (20 Oligo´s pro Gen) WKH 09/2005 Technik der Oligonukleotide Mikroarrays Biotin Biotin RT IVT Hybridize Biotin Scan Biotin Biotin ? Gen-Name, GeneBank Bezeichnung ? Fluoreszenzintensität ? Qualitätsmerkmal („Flag“) WKH 09/2005 Mikroarray-Technik Mögliche Anwendungen der GenexpressionsAnalyse mit Mikroarrays Mikroarray-Analyse für die Diagnostik und Therapieplanung bei gastrointestinalen Tumoren WKH 09/2005 Data-Analysis: Strategies Gene Expression Data (20,000 - 35,000 genes) • Specific gene expression profiles • Diagnosis: New subgroups? • Prediction of disease risk • Prediction of response to treatment or drug sensitivity „Clinical Use“ • Differentially expressed genes (normal versus tumor) • Analysis of biological pathways • Mechanisms of disease „Pathophysiology“ WKH 01/2004 Datenanalyse: Differentielle Genexpression •Direkter Vergleich der Genexpression zwischen gepaarten Proben (z. B. Tumor versus normales Gewebe) ? Listen differentiell exprimierter Gene („up“ und „down“) •Analyse dieser Genlisten nach zellulären Signalwegen, einzelnen „Hot Spots“ •Suche nach „Target-Genen“ „Pathwayanalyse“ WKH 01/2004 Gene Lists (Cellular Pathways) Subgroup Adapter proteins Caspases/Caspase substrates Cell cycle proteins Cell surface markers Clusters of differentiation Coactivators/HAT´s Corepressors Cytokines/Cytokine receptors Cytoskeletal proteins Death domain adapters DNA damage repair proteins Enhancer binding proteins Extracellular matrix proteins Glutamate receptors G-protein regulators G-proteins No. 19 12 95 88 44 13 8 65 61 10 32 69 45 4 17 33 Subgroup Growth factors and their receptors Histones Ion channels Kinases (PI3, Ser-Thr) MAPK´s/SAP´sK/JAK´s Mitochondrial proteins NOS´s Nuclear receptors PDZ adapters Phosphatases Signaling effectors SMAD´s/STAT´s Synaptic vesicles TGF/TNF Transcription factors Tyrosine kinases No. 98 15 49 22 64 33 2 24 7 56 65 10 17 31 23 18 WKH 09/2003 „Pathwayanalyse“ MCL-HL Histology ()*SCommon D90359 TAF2A U75308 TAF2C1 Y09321 TAF2C2 X95525 TAF2D U21858 TAF2G U51334 TAF2N U75276 TAF3C X84003 TAFII18 X84002 TAFII20 U13991 tafII30 U18062 TAFII55 L25444 TAFII70 X54993 TBP M61156 TFAP2A Y09912 TFAP2B U85658 TFAP2C S73885 TFAP4 X91504 TFCOUP2 U18422 TFDP2 D14533 XPA D21089 XPC U05321 XPCT U64315 XPF U89012 DMP1 L23959 DP1 M73547 DP1 L40386 DP-2 U47677 E2F1 D38550 E2F3 S75174 E2F4 U15642 E2F5 L06895 MAD U33822 MAD1L1 U65410 MAD2L1 X66867 MAX M92424 MDM2 U33202 mdm2 U33203 mdm2 AF007111 MDM4 MCL1-HL Gene, die beim MCL im Vergleich zu normalem Lymphknoten niedrig exprimiert sind 0.1 1.0 1.0 1.0 0.6 1.2 0.0 1.0 3.3 0.8 1.9 0.5 5.6 1.0 1.0 0.6 0.0 6.5 0.1 0.0 0.5 1.0 2.1 1.0 1.0 1.3 151.7 1.0 0.6 1.0 355.9 1.0 0.0 0.0 3.4 2.7 30.7 77.8 0.9 MCL2-HL MCL3-HL MCL4-HL MCL5-HL 0.1 0.1 0.1 0.1 1.0 1.0 77.2 38.7 1.0 1.0 36.4 1.0 13.5 97.1 28.3 43.2 0.6 1.0 0.7 0.8 0.4 1.3 1.4 0.9 1.9 0.0 0.0 0.0 40.4 37.8 1.0 31.5 55.3 1.0 25.2 110.3 0.9 0.6 0.5 0.9 2.4 3.1 2.8 3.0 0.7 1.8 0.3 1.5 2.4 10.3 5.2 7.2 22.5 1.0 39.5 10.3 1.0 1.0 1.0 1.0 0.0 0.3 1.9 1.4 0.2 1.3 0.4 1.1 2.8 5.3 4.9 3.4 0.1 0.1 0.1 0.1 0.0 0.0 0.0 0.0 0.7 0.6 0.6 0.6 8.5 1.0 1.0 1.0 2.0 3.1 2.7 1.8 1.0 1.0 19.5 65.5 1.0 1.0 1.0 1.0 0.7 1.2 1.1 0.8 61.8 97.8 146.7 65.2 1.0 1.0 83.3 1.0 0.8 1.0 0.7 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 226.1 317.7 198.5 206.5 1.0 1.0 1.0 1.0 0.3 0.0 0.7 0.3 0.2 0.0 0.2 0.0 2.8 2.3 2.1 2.9 1.5 2.6 1.2 1.0 1.0 84.0 1.0 2.1 1.0 19.9 1.0 11.9 1.8 1.6 1.3 0.0 492 8 Description TATA box binding protein (TBP)-associated factor, RNA polymerase II, A, 250kD TATA box binding protein (TBP)-associated factor, RNA polymerase II, C1, 130kD TATA box binding protein (TBP)-associated factor, RNA polymerase II, C2, 105kD 100 kDa subunit of Pol II transcription factor TATA box binding protein (TBP)-associated factor, RNA polymerase II, G, 32kD TATA box binding protein (TBP)-associated factor, RNA polymerase II, N, 68kD (RNA-binding protein 56) TATA box binding protein (TBP)-associated factor, RNA polymerase III, C, 90kD H.sapiens TAFII18 mRNA for transcription factor TFIID H.sapiens TAFII20 mRNA for transcription factor TFIID ApoptoseGene TATA box binding protein transcription factor AP-2 alpha (activating enhancer-binding protein 2 alpha) transcription factor AP-2 beta (activating enhancer-binding protein 2 beta) transcription factor AP-2 gamma (activating enhancer-binding protein 2 gamma) transcription factor AP-4 (activating enhancer-binding protein 4) transcription factor COUP 2 (chicken ovalbumin upstream promoter 2, apolipoprotein regulatory protein) transcription factor Dp-2 (E2F dimerization partner 2) xeroderma pigmentosum, complementation group A xeroderma pigmentosum, complementation group C 125 xeroderma pigmentosum, complementation group F dentin matrix acidic phosphoprotein Human DP-2 mRNA E2F transcription factor 3 E2F transcription factor 4, p107/p130-binding E2F transcription factor 5, p130-binding MAX dimerization protein MAD1 (mitotic arrest deficient, yeast, homolog)-like 1 MAD2 (mitotic arrest deficient, yeast, homolog)-like 1 MAX protein mouse double minute 2, human homolog of; p53-binding protein mdm2 alternatively spliced form (d) mdm2 alternatively spliced form (e) mouse double minute 4, human homolog of; p53-binding protein Ausgewählte Gene WKH 01/2004 Gestörte Apoptose in MCL-Zellen Blood, 98:787-794 (2001) BCLX CYC1 BCL2 CASP9 FAP CRADD Apoptosis FADD FAS CASP2 PDCD1 DAXX TRAIL WKH 01/2004 Wnt-Signalweg/Plakoglobin in AML 32D Zellen Induktion von Plakoglobin durch AML1/ETO, PML/RAR? , PLZF/RAR ? Mausmodell Aktivierter WntPathway in AML Müller-Tidow al, MCB (2004) 24, 2890-2904 WKH 07/2004 Searching for the „Key-Genes“ in Hematopoiesis Erythropoiesis d4 CD34+ d0 d7 d11 Granulopoiesis d4 d7 d11 Megakaryopoiesis d4 d7 d11 WKH 11/2004 Normal Hematopoiesis: In-vitro Differentiation Different stages of lineage-specific hematopoiesis d0 d4 d7 d11 Erythropoiesis Granulopoiesis Megakaryopoiesis WKH 09/2005 Sequential Gene Expression in Normal CD34+ CD71+ All genes (22283) CD61+ All genes (22283) WKH 09/2005 Normal Hematopiesis: Lineage Specific Genes Genes associated to normal Erythro-, Granulo- and Megakaryopoiesis Serine proteinase inhibitor HPS1 SLC7A11 FKBP1B SLC7A11 FLJ20185 FLJ20746 KREV-1 ANK MCP1 MARCO Z39IG RAB6B CD35 PSAT1 ABC14 ANK D9S57E KIAA0931 PP2A CTH CKRX NCC1 CD86 CALB1 FLJ21839 GEMIN4 ATF2 PBFE BCAT2 FLJ21172 FLJ10539 EST222309_AT KIAA0089 NMT2 PRKDC SPG7 KIAA0376 SLC25A12 CAD KIAA0683 EST 65472_AT SETDB1 ZNF268 KIAA0602 TCTA FLJ20596 RCC1 TARBP2 AHNAK HEMBA1 BLOV1 ZNF248 FAP48 FLJ22210 EST 204382_AT Mina53 HIBYL-COA-H LMN2 FLJ13949 MLC1 FKBP2 API5 FLJ21148 MGA HNRPA1 HSPC116 MGC5627 FLJ20244 PRO1412 CTK TMSNB SSBP1 FLNB GPR56 ZSG HYMAI PHF16 FKBP11 PTGS2 IGL IGLJ3 FLJ14054 Ankyrin 1 A DLK1 RAP1GA1 HBB HBB MYH10 PTGS2 CA2 HBA2 PBFE PLZF TMSNB PLS3 FLJ20244 KIAA1387 C21ORF108 FLJ12442 PKIG MUM1 POLE LLGL2 FLJ11168 Sprn FLJ12681 FLJ22210 SMARCAL1 HPN3 THOP1 JUN X25 MGC5528 FLJ10539 TAP1 NRP1 FCGR2B EPAS1 SLC7A11 FCGR2B PTAFR STAC DSC2 CIS IGSF2 FKBP63 KIAA0674 HSP70B EDG2 PGK1 IRC1 CD86 CLECSF6 KCNMA1 Z39IG GPR86 OGFR Leukocyte membrane antigen d0 TIP49 LOC51659 FLJ10719 BRCA1 MGC5528 SERPINB2 CC1QR MGC10993 LIG1 KPNB3 POLD STK18 TCFL4 EST 222250_S_AT STK18 GOLPH4 MGC861 RBL1 FLJ10842 KIAA1090 MRE11BA FLJ13386 R30923_1 FLJ13848 MKI67 DPH2 ETF-QO FLJ10206 C6orf210 FLJ13912 GMD CDC46 IR1B4 CHAF1A MSH5 C M G-1 JM1 BRRN1 HTRA ADORA2B NT5M KIAA0427 HEPH GALNT10 TNFAIP1 CD116 DLK1 GABRE SERPINE1 SLC22A17 RIS1 PHS1 APOE PLA2G4C TA-LRRP TIMP3 H2BFG FLJ13769 EPS8 BG1 PRKCA BOMB THBD SMO EST 215306_AT GDF15 HTT H3/B H2BFL SLC10A3 MSR1 HSPC159 HGD AWAL PDGF1 KIAA0626 PRO2116 ABC31 CML2 ITGB5 D11S833E ST7 PP1057 KIAA1985 CD42C MYOM1 VRP PARD3 EMS1 THBS1 HGD SLC7A11 CAV1 TIMP3 SLC16A3 EST 204436_AT FLJ10847 KIAA0923 KIAA0792 CD130 EMS1 GPR88 ST1C1 LOC284106 KIAA0700 ITSN1 CAV2 SNM1 IRS1 KIFC3 PDGF2 TIP-1 FLJ11280 CD86 IGF1 BHLHB3 C3 PBX1 ABC31 PTGIR FCGR2C MaxiK KIAA1053 HTKL CD49B POLDS KIAA0303 DOC2 DHRS10 CCCKR5 CKB EST d04 d07 d11 d0 d4 d7 d11 Erythropoiesis GPR86 d0 B d04 d07 d11 d0 d4 d7 d11 Granulopoiesis d0 C d04 d07 d11 d0 d4 d7 d11 Megakaryopoiesis WKH 09/2005 Altered Gene Expression in MDS Genes with opposite expression in MDS versus normal differentiation 15 Normalized Intensity 5 Normalized Intensity Normalized Intensity 4 4 10 3 2 2 5 1 day 0 0 4 7 11 0 4 H 4 7 11 0 4 7 L day 0 0 11 4 7 11 0 4 H N Normalized Intensity 5 7 11 0 4 7 L day 0 11 0 4 N 7 11 0 4 H 10 Normalized Intensity 7 11 0 4 7 L 11 N Normalized Intensity 4 3 5 2 2 1 day 0 0 4 7 H 11 0 4 7 11 0 4 7 L Erythropoiesis 11 N day 0 0 4 7 H 11 0 4 7 11 0 4 7 L Granulopoiesis 11 N 0 day 0 4 7 H 11 0 4 7 L 11 0 4 7 11 N Megakaryopoiesis WKH 09/2005 Datenanalyse: Genexpressionsprofile •Analyse der globalen Genexpression von Tumorproben von Patienten mit gesicherter Diagnose/Prognose („Trainings-Set“) •Erstellen eines Genexpressionsprofils, welches spezifisch für diese bestimmte Krankheits- oder Prognosegruppe ist •Analyse von Tumorproben von Patienten mit unbekannter Diagnose/Prognose, Prädiktion der Diagnose bzw. des Risikos („Test-Set“) „Class Membership Prediction“ WKH 07/2004 Genexpressionsprofile - Diagnose Yeoh et al, Cancer Cell (2002) 1, 133-143 WKH 07/2004 Genexpressionsprofile - Prognose Bullinger et al, NEJM (2004) 350, 1605-1616 WKH 07/2004 Genexpressionsprofile - Therapieplanung The Lancet, 359:481-486 (2002) •Ph+ ALL: ungünstige Prognose - Chemotherapie: 10 % - Stammzell-Tx: 30 % - STI571: 60 % (bei chemo-refraktären) •Mikroarrayanalyse - vor Behandlung mit STI571 - Spezifisches Genexpressionsprofil für STI571resistente Patienten ? Vorhersage, ob Patient auf STI571 anspricht oder resistent ist ALL KM-Proben (25) Prädiktive Gene (95) •Resistenzentwicklung unter STI571 - mediane Zeit bis zum Rezidiv: 8 Wochen Resistant Sensitive WKH 07/2004 Drug Resistance in Childhood ALL Analysis of gene expression of BM/PB cells obtained at the initial diagnosis. Genes that discriminate between drug-resistant and drug-sensitive Blineage ALL with respect to prednisolone, vincristine, asparaginase, and daunorubicin. Hollemann et al, NEJM (2004) 351, 533-542 WKH 10/2004 Mikroarray-Technik Mögliche Anwendungen der GenexpressionsAnalyse mit Mikroarrays Mikroarray-Analyse für die Diagnostik und Therapieplanung bei gastrointestinalen Tumoren WKH 09/2005 Bedeutung der Mikroarraytechnik •Pathophysiologie •Diagnose •Prognose •Therapieplanung WKH 09/2005 Hepatozelluläres Karzinom IGF2 als Marker-Gen für hochproliferative HCC? •43 HCC-Proben •cDNA-Mikroarrays (21632 Gene) - Gruppe A: Induktion von IFNregulierten Genen - Gruppe B: Downregulation von Apoptosegenen und IFNregulierten Genen •15 B-Proben - B1: IGF2 hoch exprimiert - B2: niedrige IGF2-Expression Breuhahn et al, Cancer Res (2004) 64, 6058-6064 WKH 09/2005 Magen-Karzinom Magen-Ca n=22 RBP4 OCT2 IGF2 PFN2 FN1 PCOLCE FN1 MUC4 LYZ n se a t tas e M Oct-2 + Ke ine Me tas tas en Kontrolle n=8 Oct-2 - Hippo et al, Cancer Res (2002) 62, 233-240 WKH 09/2005 Ca •22 Patienten - 14 Barrett Metaplasien (BM) - 8 Ösophagus-Ca BM Ösophagus-Karzinom Xu et al, Cancer Res (2002) 62, 3493-3497 BM •Supervised (160 Gene) - Cluster: Misklassifikation von 2 BM - ANN (12+10): korrekte Unterscheidung von BM und Ca Ca •Unsupervised (8064 Gene) - Misklassifikation von 6 BM WKH 09/2005 Pankreas-Karzinom •18 Pankreas-Ca Proben (Laser-Microdissection) •Kontrolle: 7 Proben normales Pankreasgewebe •cDNA-Analyse (23040 Gene) •Selektion von 84 prädiktiven Genen deren Expression signifikant mit der mediane Zeit bis zum Rezidiv (cutoff: 12 Monate) korreliert •Überlebenszeitspezifische Gene-Cluster Nakamura et al, Oncogene (2004) 23, 2385-2400 WKH 09/2005 Kolon-Karzinom Normal Colon-Ca Bertucci et al, Oncogene (2004) 23, 1377-1391 No MTS MTS WKH 09/2005 Zusammenfassung Mikroarrayanalyse bei gastrointestinalen Tumoren •Definition neuer Pathomechanismen •Identifikation neuer Subtypen •Risikostratifizierung •Prädiktion des Metastaserisikos •Therapieplanung durch Vorhersage von Resistenzen •Selektion von Target-Genen und Design von therapeutischen, target-spezifischen Molekülen (z. B. siRNA) WKH 09/2005 Gene Expression Profiling in Oncology Melanoma Low-Grade NHL Breast Cancer WKH 09/2005 Conclusion – Gene Expression Analysis First microarray experiment 1994 Analysis of clinical samples 1998 Microarrays in clinical routine 2000 Selection of predictive genes 2000 Confirmation of predictive genes 2002 Prospective validation of predictive genes New prognostic factors 2006 Clinical validation of prognostic factors 2008 New prognostic systems 2010 CAD GI AML ALL NHL WKH 09/2005 Medizinische Klinik III Hämatologie, Onkologie, Transfusionsmedizin Campus Benjamin Franklin Charité – Universitätsmedizin Berlin C. Baldus A. Bittroff-Leben O. Hopfer V. Serbent A. Bohne I. Köhler D. Nowak J. Ortiz Tanchez E. Thiel Medizinische Klinik III – Hämatologie und Onkologie Universität Frankfurt/Main M. Komor O.G. Ottmann D. Hoelzer University of California Los Angeles H.P. Koeffler (Hematology) J.W. Said (Pathology) Deutsche MDS-Studiengruppe A. Ganser N. Gattermann WKH 09/2005 MDS: Center of Excellence Medizinische Klinik III Hämatologie, Onkologie, Transfusionsmedizin Kontakt: Prof. Dr. Wolf-K. Hofmann 030-8445-3421 [email protected] WKH 29.04.2005
