In-vitro-Bioassays: Das Tier in der Flasche?

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Forschung
Medizin
Pharmaceutical Tribune • 2. Jahrgang • Nr. 14 • 23. August 2010
In-vitro-Bioassays: Das Tier in der Flasche?
Zellkulturen als moderne Laborratten
Hohe Reproduzierbarkeit
Vorteile der Verwendung von
Zellkulturen sind generell, dass
erstens die Zellen gut charakteri­
siert sind und dadurch eine hohe
Reproduzierbarkeit der Ergebnisse
erreicht wird; zweitens die Zel­
len tiefgekühlt über Jahre gelagert
werden und können und danach
wieder schnell verfügbar sind; und
drittens der Probendurchsatz groß
ist bzw. unterschiedlichste Kon­
zentrationen des Therapeutikums
in einem parallelen Versuchsan­
satz ausgetestet werden. Um Zell­
kultur-Testungen auf hohem
Niveau durchzuführen, bedarf es
der geeigneten Infrastruktur (Ste­
rilbedingungen, Zellkulturraum),
geschulten Personals und der Ex­
pertise, diese Tests so aufzusetzen,
dass sie den regulatorischen An­
forderungen entsprechen1,2.
In-vitro-Systeme mit mensch­
lichen Zellen – die aus Mate­rial
von klinisch notwendigen Operati­
onen, aus Bio­p­sien oder von Tumo­
ren stammen – erlauben es heutzu­
tage, viele klinische Indikationen
zu simulieren. Im Gegensatz zu
tierischen Zellen – wo sich im­
mer die Frage der Übertragbarkeit
der Resultate auf den Menschen
stellt – steht daher der Forschung
mit diesen Humanzellen das ideale
Material zur Verfügung. Kommer­
ziell betriebene Zellkulturdaten­
banken3 erlauben es Forschungs­
labors aus aller Welt diverse dort
hinterlegte Zelllinen zu bestellen.
Dieses System ermöglicht es, Da­
ten, die in unterschiedlichen La­
bors mit „denselben“ Zellen gene­
riert wurden, zu vergleichen.
Biologische Aktivität
von Proteinen
Häufige Fragestellungen be­
treffen die Bestimmung der bio­
logischen Aktivität von Proteinen
oder die Bestimmung des zytoto­
xischen Effekts von Antikörpern,
die zur Krebsbekämpfung einge­
setzt werden (Beispiele für Zell­
linien sowie deren Anwendung
siehe Tabelle rechts). Als Anwen­
dungsbeispiel sei hier ein Zytoto­
xizitätstest für MB311 angeführt,
in dem das Abtöten von Tumorzel­
len durch MB311 gemessen wird.
Tote/absterbende Zellen nehmen
80
70
unspezifischer
mAb
60
% Zytotoxizität
Zur Charakterisierung von bio­
logischen und chemischen Subs­
tanzen werden immer öfter Invitro-Testsysteme, die auf Zellkul­
turen beruhen, verwendet. Der
Begriff Zellkultur beinhaltet die
Lebenserhaltung und Züchtung von
Zellen unter Labor­bedingungen,
die aus eukaryontischer Lebewesen
(meistens aus Säugetieren oder Men­
schen) isoliert wurden. Zelllinien
sind Zellen einer Gewebeart (z.B.
Lunge), die sich mit der Zeit unbe­
grenzt fortpflanzen können – man
unterscheidet hierbei zwischen pri­
mären (z.B. aus Nabelschnur­epithel)
und unsterblichen, so genannten
immortalisierten Zell­linien.
Mit Hilfe von kultivierten Zel­
len können biomedizinische Un­
tersuchungen ohne Tierversuche
und unter standardisierten Be­
dingungen durchgeführt werden.
Durch die Anwendung dieser Me­
thoden können Tierversuche ver­
ringert werden, obwohl das gänz­
liche Abgehen von Tierversuchen
nicht möglich ist, da die regulato­
rischen Vorgaben Versuche am Tier
zwingend vorschreiben. Diese Tests
dienen in erster Linie zum Schutz
der Patienten, die mit dem entspre­
chenden Therapeutikum behandelt
werden sollen.
Zytotoxizität von MB311
ohne mAb
Fluoreszenzsignalstärke
WIEN – Humane Zelllinien sind in der modernen biomedizinischen Forschung unersetzbar geworden, da sie es ermöglichen,
bestimmte Abläufe im Organismus ex vivo darzustellen. Diese
Technologie ermöglicht es, ein therapeutisches Produkt bezüglich Wirksamkeit zu testen.
MB311
50
40
30
MB311
MB311 Variante
20
Zellgröße
10
Abb. A: Absterbende Zellen werden mit
einem Fluoreszenzfarbstoff markiert und
mit einem so genannten Durchflusszytometer (FACS) gemessen. Je mehr
Farbstoff aufgenommen wurde, desto
mehr Zellen sind im Absterben.
vermehrt einen fluoreszierenden
Farbstoff auf, dessen Signal­stärke
photometrisch bestimmt wird
(siehe Abb. A).
Als Indikatorzellen wurde eine
Brustkrebszellline (SK-BR3) ver­
wendet, die die Zuckerstruktur
an der Oberfläche trägt, die von
MB311 erkannt wird. Die Bindung
von MB311 an die Tumorzellen
führt einerseits zur Hemmung des
Wachstums als auch zur Induzie­
rung von zytotoxischen Effektor­
funktionen durch das körpereige­
ne Immunsystem. SKBR3-Zellen
werden dabei in Mikrotiterplat­
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
log Ab Konz. [μg/mg]
Abb. B: Direkter Vergleich zweier Antikörper (MB311) in einem Zytotoxizitäts-Test.
Die An­zahl der toten Zellen werden mathematisch berechnet und als %-Zytotoxi­
zität im Vergleich zur eingesetzten Konzentration angegeben.
ten mit unterschiedlichen Konzen­
trationen des zu untersuchenden
Stoffes inkubiert. Als Resultat er­
hält man einen Dosis-WirkungsVerlauf, der es ermöglicht, Aus­
sagen über die Wirksamkeit des
Produkts zu machen.
Methode eignet sich
auch für Screenings
Die gezeigte Methode ist auch
empfindlich genug, um verbesserte
Varianten zu identifizieren, d.h. die­
se Testsysteme werden auch verwen­
det, um so genannte „Screenings“
durchzuführen. Dabei werden aus
Übersicht über die gängigsten Zelllinien
zur Testung von Antikörpern
Zelllinie Herkunft
Testung von Zielstruktur Test
WIL2-S
B-Zell-Lymphom
Rituximab
SKBR-3
Brustkrebs
Trastuzumab Her2/neu
Zytotoxizitäts-Test
OVCAR3 Eierstockkrebs
MB311
Zytotoxizitäts-Test
H460
Lungenkrebs
Bevacizumab VEGF
Signal-Inhibierung
DAOY
Hirntumor
Bevacizumab VEGF
Signal-Inhibierung
CD20
Lewis Y
Zytotoxizitäts-Test
hunderten von modifizierten Pro­
teinen jene selektioniert, die eine
unterschiedliche Wirksamkeit zei­
gen als das Referenzprodukt (siehe
Abb. B). Mit MB311 sollen in ers­
ter Linie die für den Krankheitsver­
lauf bedrohlichen Metastasen, Mi­
krometastasen und zirkulierenden
Tumorzellen bekämpft werden.
Der Antikörper erkennt spezi­
fisch das auf epithelialen Tumo­
ren prominent vertretene Tumorassoziierte Antigen Lewis Y, das
bei einer Reihe von Tumoren wie
Lungen-, Brust-, Magen-, Darm­
krebs sowie Pankreaskarzinom an
der Oberfläche von Tumorzellen
gefunden wird.
Andreas Nechansky,
Markus Roucka
Referenzen:
1
Guideline on Strategies to identify and miti­
gate risks for first-in-human clinical trials with
investigational medicinal product (EMEA/
CHMP/SWP/28367/2007)
2
‘Note for guidance on repeated dose toxicity’
(EMEA/CPMP/SWP/1042/99)
3
American Tissue and Cell culture collection;
www.atcc.com
4
Nechansky et al. (2009), J. Pharm. Biomed.
Anak.
Bionect® – Creme. ATC – Code: D03AX05. Qualitative und quantitative Zusammensetzung: 1g Creme enthält 2 mg Hyaluronsäure-Natriumsalz; Anwendungsgebiete: Zur Förderung der Wundheilung bei Hautveränderungen, wie z.B. Hautgeschwüren, Fisteln, Fissuren, Rhagaden, Altersatrophie der Haut, Hautatrophie nach Corticoid-Langzeitbehandlung, Verbrennungen, Verbrühungen, Verletzungswunden (wie Schnitt-und Schürfwunden) sowie Operationswunden; Gegenanzeigen: Bekannte Überempfindlichkeit gegen Bestandteile des Präparates, Paragruppenallergie; Hilfsstoffe: Konservierungsstoffe: Natriumdehydroacetat, p-Hydroxybenzoesäuremethylester, p-Hydroxybenzoesäurepropylester Cremegrundlage: Polyäthylenglycol-400-stearat, Cera Liquida, Emulsifying wax, Glycerol, Sorbitol,
gereinigtes Wasser; Name und Anschrift des pharmazeutischen Unternehmers: CSC Pharmaceuticals Handels GmbH; 2102 Bisamberg; Abgabe: Apothekenpflichtig. Weitere Angaben zu Nebenwirkungen, Wechselwirkungen mit anderen Medikamenten oder sonstige Wechselwirkungen, Warnhinweise und Vorsichtsmaßnahmen für die Anwendung, Schwangerschaft und Stillzeit sowie
Gewöhnungseffekte sind der veröffentlichten Fachinformation zu entnehmen.
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Warnhinweisen und Vorsichtsmaßnahmen für die Anwendung, Wechselwirkungen mit anderen Arzneimitteln und sonstigen Wechselwirkungen, Schwangerschaft und Stillzeit, Nebenwirkungen und Gewöhnungseffekten sind der veröffentlichten Fachinformation zu entnehmen. [0409]
Losartan-HCT 1A Pharma 50 mg/12,5 mg – Filmtabletten, Losartan-HCT 1A Pharma 100 mg/25 mg Filmtabletten. Zusammensetzung: Losartan-HCT 1A Pharma 50 mg/12,5 mg – Filmtabletten: Jede Tablette enthält als Wirkstoffe 50 mg Losartan (als Kaliumsalz) und 12,5 mg Hydrochlorothiazid. Losartan-HCT 1A Pharma 100 mg/25 mg – Filmtabletten: Jede Tablette enthält als Wirkstoffe 100 mg Losartan (als Kaliumsalz) und 25 mg Hydrochlorothiazid. Sonstige Bestandteile: Jede Losartan-HCT 1A Pharma 50 mg/12,5 mg – Filmtablette enthält 26,9 mg Lactose-Monohydrat. Jede Losartan-HCT 1A Pharma 100 mg/25 mg – Filmtablette enthält 53,8 mg Lactose-Monohydrat. Tablettenkern: mikrokristalline Cellulose, Lactose-Monohydrat, vorverkleisterte Stärke, hochdisperses wasserfreies Siliciumdioxid,
Magnesiumstearat. Filmüberzug: Hypromellose, Hydroxypropylcellulose, Eisen(III)-oxid,gelb (E 172), Titandioxid (E 171). Wirkstoffgruppe: Kombination aus einem Angiotensin II-Rezeptor(Typ AT1)-Antagonist und einem Thiazid-Diuretikum, Antihypertonikum. ATC-Code: C09DA01. Anwendungsgebiete: Losartan-HCT 1A Pharma ist zur Behandlung von essenziellem Bluthochdruck indiziert bei Patienten,
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und Vorsichtsmaßnahmen für die Verwendung, Wechselwirkungen mit anderen Arzneimitteln oder sonstige Wechselwirkungen und Nebenwirkungen sowie Angaben zu Schwangerschaft und Stillzeit sind der veröffentlichten Fachinformation zu entnehmen.
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Veregen 10 % ist kontraindiziert bei bekannter Überempfindlichkeit gegen den Extrakt aus Grünteeblättern oder gegen einen der sonstigen Bestandteile. Zulassungsinhaber: MediGene AG, 82152 Planegg/Martinsried, Deutschland; Vertrieb in Österreich: Solvay Pharma Ges.m.b.H., 1200 Wien; Verschreibungspflicht / Apothekenpflicht: Rezept- und apothekenpflichtig; Weitere Angaben zu Nebenwirkungen,
Wechselwirkungen und zu den besonderen Warnhinweisen zur sicheren Anwendung entnehmen Sie bitte der veröffentlichten Fachinformation. (Stand der Information: 02/2010)
Sab® Simplex - Tropfen. Zusammensetzung: 1 ml (25 Tropfen) enthält 69,19 mg Simeticon (Dimeticon 350-Siliciumdioxid 92,5 : 7,5). Liste der sonstigen Bestandteile: Ceto-Macrogol, Sorbinsäure, Hypromellose, Natriumcitrat, Zitronensäure, Vanillearoma (H&R [60388]), Carbomer, Natriumcyclamat, Himbeeraroma (H&R [60373]), Natriumbenzoat, Saccharin-Natrium, gereinigtes Wasser. Anwendungsgebiete: bei übermäßiger Gasbildung und Gasansammlung im Magen-Darm-Bereich (z. B. durch Aerophagie) mit gastrointestinalen Beschwerden wie Blähungen, Völlegefühl und Spannungsgefühl im Oberbauch (auch Roemheld-Syndrom); bei verstärkter Gasbildung nach Operationen; zur Vorbereitung diagnostischer Untersuchungen im Bauchbereich zur Reduzierung von Gasschatten (Röntgen, Sonographie)
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Pantoprazol „Nycomed“ 20 mg – magensaftresistente Tabletten: Qualitative und Quantitative Zusammensetzung: 1 magensaftresistente Tablette enthält: 22,55 mg Pantoprazol-Natrium Sesquihydrat entsprechend 20 mg Pantoprazol. Sonstige Bestandteile: Kern: Natriumcarbonat wasserfrei, Mannitol, Crospovidon, Povidon K90, Calciumstearat. Überzug: Hypromellose, Povidon K25, Titandioxid
(E171), Eisenoxid gelb (E172), Propylenglycol, Methacrylsäure Ethylacrylat Copolymer (1:1), Polysorbat 80, Natriumdodecylsulfat, Triethylcitrat. Drucktinte braun: Schellack, Eisenoxid rot, schwarz und gelb (E172), Sojalecithin, Titandioxid (E171), Dimeticon-Emulsion. Anwendungsgebiete: Zur Behandlung der milden Refluxkrankheit und damit verbundener Symptome (z. B: Sodbrennen, Säureregurgitation,
Schmerzen beim Schlucken). Langzeittherapie und Rezidivprävention der Refluxösophagitis. Prävention von gastrointestinalen Ulcera, die durch nichtselektive, nichtsteroidale antiinflammatorisch wirksame Arzneimittel (NSAID) induziert werden, bei Risikopatienten, die eine andauernde NSAID-Therapie benötigen. Gegenanzeigen: Überempfindlichkeit gegen den Wirkstoff, gegen Soja oder einen der sonstigen
Bestandteile von Pantoprazol „Nycomed“ 20 mg. Pantoprazol sollte, wie andere Protonenpumpenhemmer, nicht zusammen mit Atazanavir verabreicht werden.
Pantoprazol „Nycomed“ 40 mg - magensaftresistente Tabletten: Qualitative und Quantitative Zusammensetzung: 1 magensaftresistente Tablette enthält 45,10 mg Pantoprazol-Natrium Sesquihydrat entsprechend 40 mg Pantoprazol. Sonstige Bestandteile: Kern: Natriumcarbonat wasserfrei, Mannitol, Crospovidon, Povidon K90, Calciumstearat. Überzug: Hypromellose, Povidon K25, Titandioxid (E171),
Eisenoxid gelb (E172), Propylenglycol, Methacrylsäure Ethylacrylat Copolymer (1:1), Polysorbat 80, Natriumdodecylsulfat, Triethylcitrat. Drucktinte braun: Schellack, Eisenoxid rot, schwarz und gelb (E172), Sojalecithin, Titandioxid (E171), Dimeticon-Emulsion. Anwendungsgebiete: Moderate und schwere Refluxösophagitis. Zur Kombinationstherapie für die Eradikation von Helicobacter pylori mit zwei
geeigneten Antibiotika bei Patienten mit peptischem Ulkus mit dem Ziel der Verringerung der Häufigkeit eines durch diesen Erreger bedingten Wiederauftretens von Zwölffingerdarmgeschwüren und Magengeschwüren. Ulcus duodeni. Ulcus ventriculi. Zollinger-Ellison Syndrom und andere pathologisch hypersekretorische Zustände. Gegenanzeigen: Überempfindlichkeit gegen den Wirkstoff, gegen Soja oder
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dafür vorliegen. Pantoprazol sollte, wie andere Protonenpumpenhemmer, nicht zusammen mit Atazanavir verabreicht werden.
Pharmakotherapeutische Gruppe: Protonenpumpenhemmer. ATC-Code: A02BC02. Inhaber der Zulassung: Nycomed Pharma GmbH, 1120 Wien. Verschreibungspflicht/Apothekenpflicht: Rezept- und apothekenpflichtig. Informationen zu Besonderen Warnhinweisen und Vorsichtsmaßnahmen für die Anwendung, Wechselwirkungen mit anderen Arzneimitteln und sonstigen Wechselwirkungen, Schwangerschaft und Stillzeit, Nebenwirkungen und Gewöhnungseffekten sind der veröffentlichten Fachinformation zu entnehmen. [1209]