Hydrolyse Proteinen, Trennung Aminosäuren
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Hydrolyse eines Proteins und Trennung von Aminosäuren Prinzip: Proteine sind aus bis zu 20 verschiedenen Aminosäuren aufgebaut. Enzyme spalten die Proteine in kleinere Peptide. Mit Säuren dagegen können Proteine hydrolytisch in die einzelnen Aminosäuren aufgespalten werden. Durch Dünnschichtchromatographie wird das Aminosäuregemisch aufgetrennt. Die Aminosäuren können mit Hilfe von Ninhydrin sichtbar gemacht werden. O O COOH O H + H2N CH NH2 R O Ninhydrin Aminosäure OH Aminoketon O Ninhydrin CO2 Aldehyd O O + N – NH2 + O + R OH Aminoketon O erhitzen O O C + O + H2O + H O Ruhemanns Purpur blauvioletter Farbstoff Chemikalien: Eiweiss 6 M HCl Alanin Leucin Methionin Valin Laufmittelgemisch: Propan-1-ol : Ameisensäure : Wasser Ninhydrin-Reagens 78 : 4 : 18 Material: DC-Folie Cellulose Chromatographiekammer Glaskapillaren Pinzette Reagenzglas Lötbrenner Fön 10 ml-Pipette Porzellanschale 5 Gläschen mit Deckel Arbeitsanleitung: Hydrolyse - Das Reagenzglas wird im oberen Drittel mit einem Lötbrenner bis zum Erweichen erhitzt und durch Längsziehen weitgehend eingeschnürt. - Nach dem Abkühlen wägt man etwa 250 mg Eiweiss (ein Spatel voll) ein. - Man fügt 4 ml 6 M HCl hinzu. - Das Reagenzglas wird nun an der eingeschnürten Stelle zugeschmolzen. - Diese Ampulle legt man 24 Stunden bei 105° C in den Trockenschrank. Trennung der Aminosäuren - Zunächst gibt man 10 ml Laufmittelgemisch in die Chromatographiekammer. - Man verschliesst die Kammer und schüttelt bis zur Sättigung des Gasraumes durch. - Die Ampulle mit dem Hydrolysat wird geöffnet und das schwarz gefärbte Hydrolysat in eine Porzellanschale gegossen. - Diese wird zum Eindampfen bis zur Trockene in den Trockenschrank bei 105 ° C gestellt (ca. ½ Stunde). - In der Zwischenzeit stellt man die 2.5 %-igen Lösungen der Vergleichsaminosäuren her. Jeweils 50 mg der Aminosäure werden in 20 ml 0.1 M HCl in einem Gläschen gelöst. - Das zur Trockene eingedampfte Hydrolysat wird mit 10 ml destilliertem Wasser versetzt. - Mit Glaskapillaren werden die Aminosäurelösungen und das Hydrolysat auf die DCFolie aufgetragen. Dabei wird mehrmals kurz getupft und dazwischen mit dem Fön getrocknet, damit der Fleck möglichst klein bleibt. Vor dem Einstellen müssen die Flecke völlig trocken sein. 1 2 3 4 1 ¼ Kapillare Leucin 2 ½ Kapillare Valin 3 1 4 ½ Kapillare Methionin 5 ¼ Kapillare Alanin Kapillare Hydrolysat 5 1 cm - Man stellt die Folie in die vorbereitete Trennkammer und verschliesst diese gut. Oft werden bessere Trennergebnisse erreicht, wenn man die DC-Folie vor dem Chromatographieren 20 Minuten in den Fliessmitteldampf der Kammer einhängt. - Die Fliessmittelfront wird bis kurz unter den oberen Rand steigen gelassen. - Folie herausnehmen, Fliessmittelfront markieren, Fliessmittel verdunsten lassen und die Folie mit Ninhydrin besprühen. - Die Flecke werden nach dem Einlegen in den Trockenschrank (5 Minuten bei 105° C) sichtbar. Das Trennergebnis kann auch im UV-Licht von 366 nm beobachtet werden. Die Flecke werden mit Bleistift umrahmt. Aufgaben: 1. Geben Sie an, welche Aminosäuren Sie in Ihrem Hydrolysat nachgewiesen haben. 2. Berechnen Sie die R f -Werte der Aminosäuren. Rf = Laufstrecke der Aminosäure Laufstrecke des Fliessmittels Die Laufstrecke wird von der Mitte der Auftragungsflecke bis zur Mitte der gelaufenen Flecke gemessen. 3. Erklären Sie, wieso die einen Aminosäuren schneller als die anderen laufen. 4. Erläuteren Sie die Ninhydrin-Reaktion. Welcher Teil der Aminosäure findet Eingang in den Farbstoff? Was bleibt von der Aminosäure übrig? Stieger, Gymnasium Solothurn
