Hydrolyse Proteinen, Trennung Aminosäuren

Hydrolyse eines Proteins und Trennung von Aminosäuren
Prinzip:
Proteine sind aus bis zu 20 verschiedenen Aminosäuren aufgebaut.
Enzyme spalten die Proteine in kleinere Peptide. Mit Säuren dagegen
können Proteine hydrolytisch in die einzelnen Aminosäuren aufgespalten
werden. Durch Dünnschichtchromatographie wird das
Aminosäuregemisch aufgetrennt. Die Aminosäuren können mit Hilfe von
Ninhydrin sichtbar gemacht werden.
O
O
COOH
O
H
+ H2N CH
NH2
R
O
Ninhydrin
Aminosäure
OH
Aminoketon
O
Ninhydrin
CO2
Aldehyd
O
O
+
N
–
NH2 + O
+
R
OH
Aminoketon
O erhitzen
O
O
C
+
O
+ H2O + H
O
Ruhemanns Purpur
blauvioletter Farbstoff
Chemikalien: Eiweiss
6 M HCl
Alanin
Leucin
Methionin
Valin
Laufmittelgemisch: Propan-1-ol : Ameisensäure : Wasser
Ninhydrin-Reagens
78 : 4 : 18
Material:
DC-Folie Cellulose
Chromatographiekammer
Glaskapillaren
Pinzette
Reagenzglas
Lötbrenner
Fön
10 ml-Pipette
Porzellanschale
5 Gläschen mit Deckel
Arbeitsanleitung:
Hydrolyse
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Das Reagenzglas wird im oberen Drittel mit einem Lötbrenner bis zum Erweichen
erhitzt und durch Längsziehen weitgehend eingeschnürt.
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Nach dem Abkühlen wägt man etwa 250 mg Eiweiss (ein Spatel voll) ein.
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Man fügt 4 ml 6 M HCl hinzu.
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Das Reagenzglas wird nun an der eingeschnürten Stelle zugeschmolzen.
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Diese Ampulle legt man 24 Stunden bei 105° C in den Trockenschrank.
Trennung der Aminosäuren
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Zunächst gibt man 10 ml Laufmittelgemisch in die Chromatographiekammer.
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Man verschliesst die Kammer und schüttelt bis zur Sättigung des Gasraumes durch.
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Die Ampulle mit dem Hydrolysat wird geöffnet und das schwarz gefärbte Hydrolysat
in eine Porzellanschale gegossen.
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Diese wird zum Eindampfen bis zur Trockene in den Trockenschrank bei 105 ° C
gestellt (ca. ½ Stunde).
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In der Zwischenzeit stellt man die 2.5 %-igen Lösungen der Vergleichsaminosäuren
her. Jeweils 50 mg der Aminosäure werden in 20 ml 0.1 M HCl in einem Gläschen
gelöst.
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Das zur Trockene eingedampfte Hydrolysat wird mit 10 ml destilliertem Wasser
versetzt.
-
Mit Glaskapillaren werden die Aminosäurelösungen und das Hydrolysat auf die DCFolie aufgetragen. Dabei wird mehrmals kurz getupft und dazwischen mit dem Fön
getrocknet, damit der Fleck möglichst klein bleibt. Vor dem Einstellen müssen die
Flecke völlig trocken sein.
1
2
3
4
1
¼
Kapillare Leucin
2
½ Kapillare Valin
3
1
4
½ Kapillare Methionin
5
¼ Kapillare Alanin
Kapillare Hydrolysat
5
1 cm
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Man stellt die Folie in die vorbereitete Trennkammer und verschliesst diese gut. Oft
werden bessere Trennergebnisse erreicht, wenn man die DC-Folie vor dem
Chromatographieren 20 Minuten in den Fliessmitteldampf der Kammer einhängt.
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Die Fliessmittelfront wird bis kurz unter den oberen Rand steigen gelassen.
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Folie herausnehmen, Fliessmittelfront markieren, Fliessmittel verdunsten lassen und
die Folie mit Ninhydrin besprühen.
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Die Flecke werden nach dem Einlegen in den Trockenschrank (5 Minuten bei 105°
C) sichtbar. Das Trennergebnis kann auch im UV-Licht von 366 nm beobachtet
werden. Die Flecke werden mit Bleistift umrahmt.
Aufgaben:
1. Geben Sie an, welche Aminosäuren Sie in Ihrem Hydrolysat nachgewiesen haben.
2. Berechnen Sie die R f -Werte der Aminosäuren.
Rf =
Laufstrecke der Aminosäure
Laufstrecke des Fliessmittels
Die Laufstrecke wird von der Mitte der Auftragungsflecke bis zur Mitte der
gelaufenen Flecke gemessen.
3. Erklären Sie, wieso die einen Aminosäuren schneller als die anderen laufen.
4. Erläuteren Sie die Ninhydrin-Reaktion. Welcher Teil der Aminosäure findet Eingang
in den Farbstoff? Was bleibt von der Aminosäure übrig?
Stieger, Gymnasium Solothurn