Robin Horst - von Sengbusch
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Einblicke in die Physiologie der Mais - Ustilago maydis Interaktion durch die Kombination von Metabolom- und Transkriptomanalysen R.J. 1 Horst , G. 2 Döhlemann , 2 Wahl , R. J. 2 Kämper , R. 2 Kahmann , U. 1 Sonnewald , L.M. 1 Voll 1Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg, Lehrstuhl für Biochemie, Staudtstr. 5, 91058 Erlangen 2Max-Planck-Institut für terrestrische Mikrobiologie, Karl-von-Frisch-Str., 35043 Marburg Einführung Ustilago maydis, der Erreger des Maisbeulenbrandes, infiziert nur meristematisches Gewebe oberirdischer Organe und induziert dort die Bildung von Gallen. Aktuelle Analysen konnten zeigen, dass die Infektion eine starke Abwehrreaktion hervorruft, diese jedoch früh im Infektionsverlauf durch das Pathogen unterdrückt wird (Döhlemann et al, eingereicht). Die hier präsentierten Daten stammen aus einer kombinierten Metabolom- und Transkriptomsanalyse, bei der U. maydis Gallen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion mit dem solopathogenen Stamm SG200 untersucht wurden. Unsere Arbeiten beleuchten insbesondere die Bedeutung des C- und N-Stoffwechsels für den Infektionsverlauf, da Aminosäuren und Kohlenhydrate in Gallen akkumulieren und vermutlich die Grundlage für die biotrophe Lebensweise von U. maydis darstellen. I. Die Entwicklung der C4-Photosynthese ist in infizierten Blättern gestört Initiale Steigung limitiert durch PEPC-Aktivität Amax limitiert durch RubisCO Aktivität • Kontrolle • SG200 1000 1400 CO2 [ppm] SG200 Gallen vs Kontrolle Galle grüner Blattbereich PEP OAA Cytosol unkontrollierte Dissipation von absorbierter Energie Y(NO) PEP PyruvatPhosphatDikinase OAA • Kontrolle • SG200 Malat MalatDH Malatenzym Pyruvat RuBP TrioseP Saccharose-6-PSynthase AGPase vakuoläre Invertase Plastid Schema des C4-Zyklus von Mais. Veränderungen der Metabolitgehalte und Transkriptmengen in Gallen 8 dpi gegenüber Kontrollblättern sind farblich markiert (siehe Legende). Die Gehalte N-reicher Aminosäuren in systemischen Blättern sind reduziert. Dies unterstützt die Hypothese, dass Aminosäuren aus systemischen Blättern in die Gallen transportiert werden. Schema des Saccharose- und Stärkestoffwechsels. Veränderungen der Transkriptmengen in Gallen 8 dpi gegenüber Kontrollblättern und tendenzielle Veränderungen der Metabolitgehalte sind farblich markiert (Rahmen der Graphen bei Metaboliten). Aspartate AspartatAminotransferase aminotransferase Asparagin Phosphoenolpyruvat a Erythrose-4-P b DAHP-Synthase DAHP Dehydrochinat-Synthase Dehydrochinat-Dehydratase Shikimat-Dehydrogenase Shikimat a b Shikimat-Kinase EPSP-Synthase Chorismat-Synthase Gallen vs Kontrolle infiziertes Blatt >10x 2-10x -2 - 2x -2-10x <-10x n.d. Asparagine AsparaginSynthetase synthetase systemisches Blatt Glutamate 2-oxoglutarat Glutamat 2-oxoglutarate Glutamat Galle • Kontrolle • SG200 GlutamatGlutamate Synthase synthase Glutamate Glutamat Glutamine Glutamin 4 Nitrit-Reduktase NO2NitratReduktase NO3- Chorismat-Mutase Prephenat a Phenylalanin a Zimtsäure a Hydroxyzimtsäurederivate und Anthocyane akkumulieren als Antwort auf Infektion mit U. maydis (siehe unten). Die Biosynthese von Phenylpropanen in Gallen ist transkriptionell ab 4 dpi induziert, Stoffwechselintermediate und Endprodukte akkumulieren und die Aktivität des Schlüsselenzyms der Phenylpropan-Biosynthese, Phenylalanin-Ammonium-Lyase (PAL), steigt 20fach. PAL Aktivität b Prephenat-Dehydratase Tyrosin Anthocyane Hydroxyzimtsäurederivate • Kontrolle • SG200 PAL b Coumarsäure b c PhenylpropanBiosynthese Chalcon-Synthase FlavonoidBiosynthese Flavonoide und Anthocyane Syntheseweg aromatischer Sekundärmetabolite. Veränderungen der Metabolitgeehalte und Transkriptmengen in Gallen 8 dpi gegenüber Kontrollblättern sind farblich markiert. Isoformen gleicher Enzyme sind mit Buchstaben gekennzeichnet. Glutamine Glutamin+Synthetase synthetase NHNiR 4 -+ NO 2 NH Saccharosetransporter SUT1 IV. Die Biosynthese phenolischer Sekundärmetabolite wird durch die Infektion induziert Pheneylpropanund FlavonoidBiosynthese Aspartat U. maydis sekretierte Invertase CO2 Chorismat Oxalacetat SaccharoseSynthase Malat III. Asparagin und Glutamin spielen eine zentrale Rolle im N-Metabolismus von Gallen Die N-reichen Aminosäuren Asparagin und Glutamin akkumulieren in Gallen 8 dpi, obwohl kein Mangel an CGerüsten besteht (siehe Box II.). Mikroarrayanalysen zeigen, dass die Gene der primären N-Assimilierung herunterreguliert sind, jedoch die Verwertung der direkten Produkte dieses Stoffwechselweges (i.e. Glutamat) transkriptionell induziert ist. >10x 2-10x -2 - 2x -2-10x <-10x n.d. Plastid PPi-Phosphofructokinase Die Infektion von Blattmeristemen durch U. maydis bewirkt eine Retention des sinkStatus während des Blattwachstums. Dies spiegelt sich in erhöhten Gehalten an löslichen Zuckern, sowie in erhöhter Expression von Enzymen des Saccharoseabbaus in sich entwickelnden Gallen wider. Intermediate des Stärke- und Saccharosestoffwechsels akkumulieren als Folge des gestörten Kohlenstoffexports ebenfalls. CO2 StärkeSynthasen Bündelscheide Fv/Fm plast. Fruktose-1,6bisphosphatase Gallen vs Kontrolle PEPCarboxylase Pyruvat Energiekopplung in PSII geschädigt CalvinZyklus Carboanydrase HCO3CO2 Absorptivität verringert durch Chlorose Absorptivität Saccharosesynthese Cytosol Triose-P/PhosphatTranslokator Metabolom und Transkriptom spiegeln die Störung des C4Stoffwechsels wider >10x 2-10x -2 - 2x -2-10x <-10x n.d. Durch Imaging-PAM Fluorometrie lassen sich lokale Störungen der Photosynthese analysieren Kontrolle Über die Kombination aus Gaswechselund Imaging-PAM Analysen wurde die Phothosynthese nach Infektion mit U. maydis analysiert. Die Entwicklung des C4 Syndroms ist stark beeinträchtigt (siehe links, Horst et al, 2008). Dieser physiologische Befund wird durch Änderungen im Metabolom und Transkriptom untermauert (siehe unten). Mesophyll 600 200 Stärkesynthese Plastid Shikimatweg Gaswechselanalysen zeigen eine Reduktion in apparenter RubisCO und PEPC Aktivität II. Ustilago maydis bewirkt die Retention des sinkStatus in infizierten Blättern Gallen vs Kontrolle >10x 2-10x -2 - 2x -2-10x <-10x n.d. Schema der primären NAssimilation (links). Veränderungen der Metabolitgehalte und Transkriptmengen in Gallen 8 dpi gegenüber Kontrollblättern sind farblich markiert (siehe Legende). Danksagung Wir danken dem Bioanalytikteam des Lehrstuhls für Biochemie für technische Hilfe bei der LC-MS Messung. Zusammenfassung • Übergang von C3- zu C4-Photosynthese wird unterbunden, obwohl Gallen im Infektionsverlauf lange Zeit photosynthetisch aktiv bleiben • Infektion mit U. maydis bewirkt eine Reduktion der photosynthetischen Saccharosesynthese und Retention des sink-Status durch die gesamte Blatt- / Gallenentwicklung hinweg. Saccharose wird dabei durch Pilz- und Pflanzeninvertasen bzw. Saccharose-Synthase gespalten und verarbeitet • Gallen stellen ebenfalls ein sink für Stickstoff dar, welcher wahrscheinlich in organischer Form aus anderen oberirdischen Pflanzenteilen importiert wird • Biosynthesewege von phenolischen sekundären Pflanzenstoffen sind massiv induziert - Produktion von Abwehrsubstanzen?
