Liquid Biopsy CTC: Auf der Suche nach den schwarzen Schafen

RUBRIKTITEL
Liquid Biopsy – eine
interdisziplinäre Aufgabe
Prof. Dr. Barbara Dockhorn-Dworniczak
Zirkulierende Tumorzellen
Hochempfindliche Analyseverfahren
erlauben inzwischen die Untersuchung
einzelner Tumorzellen und zellfreier
DNA aus Blutproben. Diese sogenannte
liquid biopsy gewinnt zunehmend an
Bedeutung, denn sie ist nicht-invasiv
Auf der Suche nach den
schwarzen Schafen
und erlaubt die Detektion tumortypischer Genmutationen mit hoher
analytischer Sensitivität und Spezifität.
Dies dient vor allem der Therapieüberwachung, erlaubt Rückschlüsse
auf die Tumorprogression und kann das
Auftreten eines Rezidivs anzeigen, bevor dieses klinisch erkennbar wird. Die
Lange Zeit wurden die im Blut zirkulierenden Tumorzellen als Ausgangspunkt der Metastasierung diagnostisch und therapeutisch
vernachlässigt. Verbesserte Verfahren zur molekularen Charakterisierung sollen helfen, die Pathomechanismen der hämatogenen
Streuung aufzuklären und gezielte Therapien zu entwickeln.
frühzeitige Detektion von Resistenzmutationen gibt zudem Hinweise für
Der australische Arzt Thomas Ashworth
stellen, dass die Medizin trotz dringenden
eine rechtzeitige Therapieumstellung.
staunte nicht schlecht, als er 1869 das Blut
Bedarfs auch 150 Jahre nach Ashworths
Ob Untersuchungen von zellfreier
aus der Beinvene eines Krebspatienten unter
Entdeckung noch kaum in der Lage ist,
DNA zum Nachweis okkulter Tumor-
dem Mikroskop betrachtete. Darin fand er
CTC sicher zu quantifizieren, molekular-
erkrankungen im Rahmen einer Früh-
Zellen mit großen Kernen, die mit denen
biologisch zu charakterisieren und gezielt
erkennung herangezogen werden
im Primärtumor verwandt zu sein schienen.
zu bekämpfen.
können, ist dagegen noch umstritten.
Er notierte damals:„Eines ist sicher, wenn
Ein wichtiger Grund für die Diskrepanz
Technisch ist es denkbar, setzt aber die
diese Zellen aus einer existierenden Krebs-
zwischen medizinischem Wollen und Kön-
Etablierung valider und stabiler Biomar-
struktur stammen, dann müssen sie einen
nen liegt in der verschwindend geringen
ker voraus. Hier steht noch viel Arbeit
Großteil des Kreislaufs passiert haben, ehe
Zahl von Tumorzellen: Eine einzige CTC
an, die nicht von uns Pathologen allein
sie in der Vena saphena des gesunden Beins
pro Milliliter wird bereits als prognostisch
geleistet werden kann.
ankamen.“
ungünstiges Zeichen gewertet, und die zir-
Die parallele Untersuchung von Ge-
Ashworth ahnte damals bereits, dass
weben aus Primärtumoren und Metasta-
er etwas Wegweisendes entdeckt haben
sen sowie von Blutproben im Rahmen
könnte – wohlgemerkt zu einer Zeit, als
der liquid biopsy erfordert noch stärkere
viele Ärzte Krebs noch für einen eigenstän-
Interdisziplinarität in der Behandlung
digen Parasiten hielten. Er schrieb, die von
Als Richtwert bei einem metastasierenden
onkologischer Patienten, als dies bis-
ihm entdeckten Zellen könnten „Licht auf
Karzinom schätzt man das Verhältnis von
her der Fall ist. Die Pathologie hat im
die Entstehung multipler Tumoren in ein
CTC zu allen anderen kernhaltigen Zellen
Konzert der beteiligten Ärzte dann nicht
und derselben Person werfen“.
im peripheren Blut auf 1:106 bis 1:107.
kuliert im Blut gemeinsam mit Millionen
weißer und Milliarden roter Blutzellen.
Zwei Wege zum selben Ziel
mehr unbedingt das letzte Wort – wohl
Mit seiner Vermutung hatte er Recht.
Wie aber soll man ein „schwarzes Schaf“
aber weiterhin das erste: Nach der mo-
Wir wissen heute, dass zirkulierende
in einer Herde von bis zu zehn Millionen
mentanen Datenlage sind Ergebnisse
Tumorzellen (CTC = circulating tumour
finden? Man kann sich dem Problem auf
aus zirkulierenden Tumorzellen und
cells) in Blut und Lymphe tatsächlich der
zwei grundsätzlich verschiedenen Wegen
zellfreier DNA ohne die Ausgangs-
Ausgangspunkt jener Metastasen sind, an
nähern: Der eine ist die Anreicherung der
befunde im primären Tumor und dessen
denen 90 Prozent aller Krebspatienten ster-
gesuchten Tumorzellen (siehe Tabelle), der
Metastasen nicht bewertbar.
ben. Und wir müssen umso erstaunter fest-
andere die Entfernung der unerwünsch-
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Food and Drug Administration (FDA) zum
Das Anreicherungsverfahren von Cell-
ersten Mal einem CTC-Test (CellSearch)
Search und anderen etablierten Kits basiert
zur Zellzählung und Verlaufsvorhersage
auf der immunologischen Erkennung des
Bild: © imago/CHROMORANGE
bei metastasierendem Brustkrebs die Zu-
Oberflächenmarkers EpCAM (epithelial
lassung. 2007/2008 wurde diese auch auf
cell adhesion molecule), kombiniert mit
Darm- und Prostatakrebs ausgeweitet.
einer Antikörpermixtur gegen intrazellu-
Ob die medizinische Aussage den Selbst-
läre Cytokeratine (CK 8, 18 und 19). Für
zahler-Preis von derzeit 460 € rechtfertigt,
Karzinomzellen ist dieser Cocktail gegen
müssen Arzt und Patient(in) allerdings sorg-
epitheliale Marker prinzipiell geeignet, aber
fältig abwägen: Wenn in einer 7,5-mL-Pro-
die Sache hat einen Haken: Um den sicheren
be fünf oder mehr Tumorzellen gefunden
Hafen des Muttergewebes verlassen und im
werden, verringert sich das progressions-
zirkulierenden Blut überleben zu können,
freie Intervall beim metastasierenden Mam-
müssen CTC nämlich neue molekulare
ten Blutzellen, etwa durch Ausfällung von
ma-CA im Mittel von 7,0 auf 2,7 Monate
Eigenschaften erwerben.
Leuko- und Erythrozyten (RossetteSep-
und die Gesamtüberlebenszeit von 18 auf
Test). Beide Wege führen zum selben
10 Monate [1].
Transition (EMT) kommt es zu bedeutenden
Änderungen der Genexpression und Zell-
Ziel, nämlich den CTC-Anteil so weit zu
erhöhen, dass er nicht im Grundrauschen
Bei dieser epithelial-mesenchymalen
Kostenerstattung
morphologie: Die von den Anreicherungs-
der Nachweisverfahren wie zum Beispiel
Die gesetzliche Krankenversicherung
verfahren erkannten Adhäsionsmoleküle
der Durchflusszytometrie untergeht. Aller-
übernimmt die Kosten für die CTC-Analyse
und Keratine nehmen ab und andere Marker,
dings schwanken die Ausbeuten der ver-
nicht, aber im Rahmen von Studien ist eine
etwa Vimentin und Matrixmetalloproteasen
schiedenen Techniken zwischen etwa 10
Erstattung möglich. Allein zum Mamma-
steigen an. Durch die Umwandlung des
und 90 Prozent, sodass die Interpretation
karzinom laufen am Nationalen Centrum
Phänotypen können folglich potenziell in-
quantitativer Resultate mit Vorsicht und
für Tumorerkrankungen Heidelberg (NCT)
teressante CTC übersehen werden.
Sachkenntnis erfolgen muss.
derzeit 13 klinische Evaluationen von zirku-
Abhilfe schaffen Methoden, die zusätz-
Gute Anregungen für eine kritische Be-
lierenden und disseminierten Tumorzellen
lich EMT-typische Marker erfassen oder
wertung auch seit langem etablierter Tests
aus Blut und Knochenmark (CTC, DTC),
physikalische Tumorzelleigenschaften wie
finden sich in einem aktuellen Review von
um den Nutzen für die Diagnostik und The-
Größe, Dichte, Plastizität und elektrische
Millner et al. [1]. Bereits 2004 erteilte die
rapieoptimierung zu prüfen.
Polarisierbarkeit nutzen. Große Hoffnungen
Kommerzielle Verfahren zur Anreicherung zirkulierender Tumorzellen
Tumorzellen aus EDTA-Blut zu gewinnen und zu analysieren,
ist eine anspruchsvolle Aufgabe, die bislang noch nicht zum
Standardangebot der Labordiagnostik gehört. Mit wachsendem Wissen über die Metastasenentstehung könnte sich dies
allerdings in den nächsten Jahren ändern.
Häufig eingesetzte Trennprinzipien
Welche Techniken sich auf Dauer durchsetzen, ist noch nicht
absehbar; jedes Trennprinzip hat Vor- und Nachteile. Die Tabelle führt einige im Markt erhältliche Produkte auf, die nach
häufig eingesetzten Trennprinzipien arbeiten. Eine ausführliche Übersicht ist in Vorbereitung.
Name
Hersteller
Prinzip
Internet
AdnaTest
Adnagen
magnetgekoppelte Antikörper adnagen.com
CellSearch
Veridex
magnetgekoppelte Antikörper cellsearchctc.com
ISET
RareCells
Größenseparation mit Filter
IsoFlux
Fluxion Biosciences magnetgekoppelte Antikörper fluxionbio.com
MACS
Miltenyi Biotec
magnetgekoppelte Antikörper miltenyibiotec.com
OncoQuick
Greiner Bio-One
Dichtegradient mit Filter
rarecells.com
greinerbioone.com
(nach Pantel, Brakenhoff, Brandt, Nature Reviews Cancer 2008; 8:329-340).
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setzt man auf Mikrofluidik-Chips, die im
200.000 Menschen, die allein in Deutsch-
die endotheliale Barriere der angrenzenden
Durchflussverfahren (continuous flow) be-
land jährlich an den Folgen der Metastasie-
Tumorgefäße zu durchbrechen. Die in der
trieben werden und verschiedene an- und
rung und keineswegs an ihrer eigentlichen
Blutbahn zirkulierenden Tumorzellen sind
abreichernde Trennverfahren kombinieren.
Krebsgeschwulst sterben, muss man sich
allerdings vielen Gefahren, darunter auch
Mit ihnen lassen sich hohe Ausbeuten in-
fragen, ob der Kampf an den richtigen
den Angriffen des Immunsystems, ausge-
takter Tumorzellen erzielen, die dann einer
Fronten geführt wurde. Die Prozesse der
setzt, sodass 99,9 Prozent innerhalb von 24
weiteren biochemischen und pharmakolo-
Krebsentstehung sind zwar inzwischen
Stunden absterben (sog. Anoikis).
gischen Charakterisierung zugänglich sind.
recht gut verstanden, aber bei der Bio-
Von den überlebenden 0,1 Prozent hat
chemie der Metastasierung gibt es noch
nur etwa jede zehnte das Potenzial, die Ge-
viele Fragezeichen. Dank der Fortschritte
fäßwand in umgekehrter Richtung erneut
Auch wenn die CTC-Isolierung noch eine
bei der CTC-Isolierung und -Charakteri-
zu durchdringen, sich in einen epithelia-
große Herausforderung darstellt, winken als
sierung scheinen sich die Wissenslücken
len Krebszelltyp zurückzuverwandeln und
Lohn für die Mühe wesentlich spannendere
aber allmählich zu schließen.
in fremder Umgebung anzusiedeln. Dass
Spannende Fragestellungen
Fragestellungen als die oben erwähnten,
Offenbar fördert Sauerstoffmangel im
es trotz dieser verschwindend geringen
rein statistischen Aussagen zum meist de-
Primärtumor die Auswanderungsbereit-
Erfolgsrate zu massiver Metastasierung
primierenden Outcome metastasierender
schaft einzelner Zellen. Schon 2004 konnte
kommen kann, liegt an der unglaublichen
Karzinome. Entscheidend ist ja letztlich,
gezeigt werden, dass die Aktivierung des
Zahl von einer Million Tumorzellen pro
ob es über die molekulare Charakterisie-
Hypoxie-induzierbaren Faktors (HIF) ein
Tag, die ein Gramm Krebsgewebe aus-
rung gelingt, den verhängnisvollen Prozess
Auslöser der verminderten Zelladhäsion ist.
schütten kann.
der hämatogenen Streuung zu verhindern.
Zudem macht die oben beschriebene
Eine schlechte Nachricht?
Lange – womöglich zu lange – kon-
endothelial-mesenchymale Transition die
zentrierten sich die meisten Forschungs-
„Auswanderer“ aggressiver und versetzt sie
Offen bleibt die Frage, welche besonde-
anstrengungen auf die Bekämpfung von
in die Lage, die extrazelluläre Matrix ihrer
ren Fähigkeiten eine Tumorzelle besitzen
Primärtumoren, doch angesichts von über
unmittelbaren Umgebung aufzulösen und
muss, um zu den erfolgreichen 0,01 Prozent
zu gehören. Seit etwa drei Jahren mehren
sich die Anzeichen, dass zu den mesenchymalen Merkmalen auch noch Stammzelleigenschaften hinzukommen müssen; diese
können entweder von vornherein vorhanden
sein (sog. Tumorstammzellen) oder beim
EMT-Prozess erworben werden.
Für die Entwickler von CTC-Tests ist
dies eine eher schlechte Nachricht, denn
die ohnehin schon extrem geringe Zahl
„schwarzer Schafe“ in der Herde verringert sich dadurch womöglich nochmals um
einige Zehnerpotenzen.
Vereinfachte Darstellung der hämatogenen Metastasierung, adaptiert nach [2].Vor dem Verlassen des
Tumorzellverbands ändern einige Krebszellen ihren Phänotypen von „epithelial“ in „mesenchymal“
(EMT). Nach Überwindung der Epithelbarriere (Intravasation) gelangen sie über die tumoreigene
[1] Millner L et al, Circulating Tumor Cells: A
Review of Present Methods and the Need to
Identify Heterogeneous Phenotypes.
Ann Clin Lab Sci 2013; 43:295-304
[2] Esmaeilsabzali H et al, Detection and isolation of circulating tumor cells: Principles and
methods. Biotechnol Adv 2013;
dx.doi.org/10.1016/j.biotechadv.2013.08.016
Gefäßversorgung in den Blutkreislauf. Ein Großteil der zirkulierenden Tumorzellen stirbt ab und wird
phagozytiert. Einige – und zwar möglicherweise solche mit Stammzelleigenschaften – überleben
jedoch, verlassen die Blutbahn und bilden in ganz bestimmten Organen Metastasen.
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Prof. Dr. Georg Hoffmann
Dr. Hans-Jürgen Kolde