9783937231891_Leseprobe

Ein neues stärke-relevantes Enzym in Arabidopsis thaliana:
Die Phosphoglukan-Wasser-Dikinase
RHOMBOS-VERLAG
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Oliver Kötting
Ein neues stärke-relevantes Enzym in Arabidopsis thaliana:
Die Phosphoglukan-Wasser-Dikinase
Diese Arbeit wurde als Dissertation
in der Wissenschaftsdisziplin
Molekulare Pflanzenphysiologie
von Februar 2002 bis Juni 2005
an der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Universität Potsdam
angefertigt.
Gutachter:
Prof. Dr. M. Steup
(Universität Potsdam)
Prof. Dr. U.-I. Flügge
(Universität Köln)
Prof. Dr. N. Amrhein
(Eidgenössisch Technische Hochschule Zürich)
Datum der mündlichen Prüfung: 18.08.2005
RHOMBOS-VERLAG
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ...................................................................................5
1 Einleitung ..........................................................................................11
1.1 Struktur der Stärke.......................................................................11
1.2 Metabolismus der Stärke .............................................................13
1.2.1 Stärkesynthese.......................................................................13
1.2.2 Stärkeabbau...........................................................................16
1.3 Stärke-Phosphorylierung .............................................................22
1.4 Regulation des Stärkemetabolismus............................................24
1.5 Zielsetzung der Arbeit .................................................................26
2 Material und Methoden ...................................................................29
2.1 Chemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterial ..........................29
2.2 Geräte ..........................................................................................33
2.3 Medien.........................................................................................34
2.4 Bakterienstämme .........................................................................34
2.4.1 E. coli-Stämme......................................................................34
2.4.2 Agrobacterium tumefaciens-Stamm......................................35
2.5 Antikörper ...................................................................................35
2.5.1 Primäre Antikörper ...............................................................35
2.5.2 Sekundäre Antikörperkonjugate............................................36
2.6 Plasmide ......................................................................................36
2.7 Oligonukleotid-Primer.................................................................36
2.8 Pflanzenmaterial und Anzuchtbedingungen ................................37
2.8.1 Pflanzenmaterial....................................................................37
2.8.2 Anzucht von Arabidopsis thaliana auf Erde .........................37
2.8.3 Oberflächensterilisierung von Samen ...................................38
2.8.4 Anzucht von Arabidopsis thaliana in Sterilkultur ................39
2.9 Molekularbiologische Standardmethoden ...................................39
2.9.1 Anzucht von Bakterien..........................................................39
2.9.1.1 Anzucht von Escherichia coli ..........................................39
2.9.1.2 Anzucht von Agrobacterium tumefaciens ........................40
2.9.2 Herstellung von kompetenten Bakterien ...............................40
2.9.2.1 Herstellung von kompetenten E. coli ...............................40
2.9.2.2 Herstellung von kompetenten
Agrobacterium tumefaciens..............................................40
2.9.3 Transformation von Bakterien ..............................................41
5
INHALTSVERZEICHNIS
2.9.3.1 Transformation von E. coli .............................................. 41
2.9.3.2 Transformation von Agrobacterium tumefaciens ............ 41
2.9.4 Lagerung von Bakterien ....................................................... 42
2.9.5 Isolierung von genomischer DNA aus Blättern .................... 42
2.9.6 Isolierung von RNA aus Blättern.......................................... 43
2.9.7 Transformation von Arabidopsis thaliana ............................ 44
2.9.8 „Screening“ nach homozygoten T-DNA-Insertionslinien .... 45
2.10 Klonierungen............................................................................... 46
2.10.1 Klonierung der OK1-cDNA.................................................. 46
2.10.2 Der OK1-Expressionsvektor................................................. 48
2.10.2.1 Die Gateway-Technologie ............................................... 48
2.10.2.2 Die Konstruktion des Expressionsvektors
OK1-pDEST17 ................................................................ 49
2.10.3 RNAi-Pflanzen ..................................................................... 50
2.10.3.1 Klonierung von OK1-R1-pHANNIBAL ......................... 51
2.10.3.2 Klonierung von OK1-R1-pART27 .................................. 52
2.11 Biochemische Standardmethoden ............................................... 52
2.11.1 Herstellung von Proteinextrakten aus pflanzlichem Gewebe 52
2.11.2 Proteinbestimmung ............................................................... 53
2.11.3 Denaturierende diskontinuierliche SDS-PAGE.................... 53
2.11.4 Coomassie-Färbung von Proteinen im Gel ........................... 54
2.11.5 Transfer von Proteinen aus dem Gel auf Nitrocellulose
(Western-Blot) und immunchemischer
Nachweis (Immunoblot) ....................................................... 54
2.11.6 Trocknung von Polyacrylamidgelen ..................................... 55
2.11.7 Autoradiographie .................................................................. 55
2.11.8 Nicht-wässrige Fraktionierung von Pflanzenmaterial........... 56
2.11.8.1 Herstellung von nicht-wässrigen Fraktionen ................... 56
2.11.8.2 Native PAGE und Aktivitätsfärbung ............................... 57
2.12 Heterologe Expression von OK1/ PWD
in E. coli und Reinigung ............................................................. 57
2.13 Heterologe Expression von R1/ GWD
in E. coli und Reinigung ............................................................. 59
2.14 Isolierung von Stärkegranula aus Blättern
von Arabidopsis thaliana ............................................................ 59
2.14.1 Isolierung von Stärkegranula mit gebundenen Proteinen ..... 59
2.14.2 Isolierung von Stärkegranula für Aktivitäts-/ Bindungstests
sowie zur Analyse des gebundenen Phosphates ................... 60
6
INHALTSVERZEICHNIS
2.14.3 Photometrische Bestimmung des Stärkegehaltes
in Stärkesuspensionen ...........................................................61
2.15 Semiquantitative Stärkebestimmung ...........................................61
2.16 Quantitative Bestimmung der Stärkegehalte von
Arabidopsis-Blättern....................................................................62
2.17 Saure Hydrolyse von Stärke ........................................................63
2.18 Herstellung einer Mischung aus [E-33P]ATP und
[J-33P]ATP (Randomisierung) .....................................................63
2.19 In vitro-Phosphorylierung von Stärkegranula durch GWD.........64
2.20 Bindung von Proteinen an Stärkegranula ....................................65
2.21 Massenspektrometrische Analyse von Peptiden..........................65
2.22 Präparation und Analyse von Protoplasten- und
Chloroplasten-Extrakten..............................................................67
2.23 Herstellung eines polyklonalen anti-OK1-/ PWD-Antikörpers...68
2.24 Reinigung von OK1/ PWD aus Blättern der
Arabidopsis sex1-3-Mutante........................................................68
2.25 Radioaktiver Stärkephosphorylierungstest ..................................69
2.26 Autokatalytische Phosphorylierung von OK1/ PWD ..................71
2.27 Chromatographische Analyse von Glukosephosphaten
durch HPAEC-PAD ....................................................................72
2.27.1 Trennung von Monosacchariden...........................................72
2.27.2 Bestimmung der Radioaktivität in den
aufgefangenen Fraktionen.....................................................72
2.28 Bestimmung von [32P]- und [33P]-Orthophosphat .......................73
2.29 Glukanketten-Abspaltung von in vitro phosphorylierter
Arabidopsis-Stärke ......................................................................74
2.30 Isolierung von Phosphoglukanen mittels
Anionenaustauschchromatographie.............................................75
3 Ergebnisse .........................................................................................77
3.1 Identifizierung von Phosphoglukan-bindenden Proteinen...........77
3.1.1 Bindung von Proteinen an phosphorylierte und
nicht-phosphorylierte Stärkegranula .....................................77
3.1.2 OK1, ein bisher unbekanntes Protein, das bevorzugt
an phosphorylierte Stärke bindet...........................................81
3.2 Funktionelle Charakterisierung des rekombinanten
OK1-Proteins...............................................................................85
3.2.1 Klonierung und heterologe Expression von OK1 in E. coli..85
3.2.2 Lokalisierung von OK1.........................................................87
7
INHALTSVERZEICHNIS
3.2.2.1 Intrazelluläre Lokalisierung von OK1 ............................. 87
3.2.2.2 Organspezifische Expression von OK1 ........................... 90
3.2.3 In vitro-Phosphorylierung von Phosphoglukanen
durch OK1 ............................................................................ 90
3.2.4 Ein autophosphoryliertes Protein ist Zwischenprodukt
der OK1-Reaktion................................................................. 96
3.2.5 OK1 ist eine Phosphoglukan-Wasser-Dikinase .................... 98
3.2.6 Simultane Phosphorylierung von Stärkegranula durch
PWD und GWD.................................................................... 99
3.3 Charakterisierung der Phosphoglukansubstrate nach
in vitro-Phosphorylierung durch PWD ..................................... 101
3.3.1 PWD phosphoryliert Glukosyleinheiten in
Phosphoglukanen bevorzugt an der C-3-Position............... 102
3.3.2 Anionenaustauschchromatographie von
Phospho-Oligosacchariden ................................................. 105
3.4 In vitro-Charakterisierung der Aktivität von aus
Arabidopsis-Blättern angereichertem PWD-Protein ................. 108
3.5 Transgene Arabidopsis-Pflanzen mit verminderter
PWD-Proteinmenge .................................................................. 111
3.5.1 Eine PWD-Knockout-Mutante ........................................... 112
3.5.2 RNAi-Pflanzen mit vermindertem PWD-Proteingehalt ..... 114
3.5.3 Stärkegehalte der transgenen Pflanzen mit verringerter
PWD-Proteinmenge............................................................ 115
3.5.3.1 Semiquantitative Analyse des Stärkegehaltes von
Arabidopsis WT und pwd mittels Iodfärbung................ 116
3.5.3.2 Stärkegehalte von Arabidopsis WT- und
pwd-Pflanzen im Tagesverlauf ...................................... 118
3.5.3.3 Stärkegehalte von Arabidopsis WT- und PWD-RNAiPflanzen am Ende von Licht- und Dunkelphase............ 119
3.5.3.4 Direkter Vergleich der Stärkegehalte von
Arabidopsis WT-, PWD-RNAi- und pwd-Pflanzen....... 121
3.5.4 Stärkephosphatgehalte der transgenen Pflanzen mit
vermindertem PWD-Proteingehalt ..................................... 122
3.6 PWD bindet an Blattstärkegranula während des
Netto-Abbaus der Stärke im Dunkeln ....................................... 125
4 Diskussion ....................................................................................... 127
4.1 Bindung von Proteinen an phosphorylierte Stärke.................... 127
4.2 Charakterisierung der PWD-Aktivität....................................... 129
8
INHALTSVERZEICHNIS
4.3 Physiologische Bedeutung von PWD........................................ 132
5 Zusammenfassung .......................................................................... 137
6 Summary ......................................................................................... 139
7 Abkürzungsverzeichnis .................................................................. 141
8 Literaturverzeichnis ....................................................................... 147
9 Anhang ............................................................................................ 161
9.1 Struktur des PWD-Lokus (At5g26570)..................................... 161
9.2 Abgeleitete Aminosäuresequenz des PWD-Proteins................. 162
9.3 Aminosäuresequenz des rekombinanten PWD-Proteins ........... 164
9.4 Vergleich der Aminosäuresequenzen von PWD und GWD aus
Arabidopsis thaliana und GWD aus Solanum tuberosum........ 166
9.5 Organspezifische Expression von PWD und GWD .................. 168
9.6 Entwicklungsspezifische Expression von PWD und GWD ...... 170
9
10
1 Einleitung
Alles Leben auf der Erde ist abhängig von der Energie der Sonne. Die
Photosynthese ist der einzige Prozess von biologischer Relevanz, bei
dem diese Energie in biochemische Prozesse umgesetzt werden kann.
Photosynthetische Organismen sind in der Lage, die Sonnenenergie zu
nutzen, um Kohlenhydrate aus CO2 und Wasser herzustellen.
In Höheren Pflanzen werden die energiereichen Kohlenhydrate hauptsächlich in Form von osmotisch inaktiver Stärke gespeichert, einem weit
verbreiteten Biopolymer. Dabei wird unterschieden zwischen zwei Formen von Stärke. Transitorische oder Assimilationsstärke wird während
des Tages in Chloroplasten synthetisiert und in der folgenden Nacht zumeist vollständig wieder abgebaut (Smith et al., 2005). Bei einigen
Pflanzen, wie beispielsweise Arabidopsis thaliana (Arabidopsis), wird
etwa die Hälfte des am Tage photosynthetisch assimilierten Kohlenstoffs
in Assimilationsstärke eingebaut (Smith et al., 2005). Die Abbauprodukte dienen innerhalb der Blattzelle zur Bereitstellung von Kohlenstoffgerüsten, Energie- und Reduktionsäquivalenten oder werden in
Form von Saccharose oder anderen Transport-Metaboliten in heterotrophe, so genannte „sink“ Gewebe transportiert (Frommer und Sonnewald, 1995), in denen Reserve- oder Speicherstärke synthetisiert wird.
Reservestärke dient als langfristiger Speicher und wird in der Regel erst
mit Beginn der Keimung wieder abgebaut.
Reservestärke in Systemen wie Knollen oder Getreidesamen ist die
wichtigste Kohlenhydrat-Quelle in der menschlichen Ernährung. Zudem
findet sie eine industrielle Verwendung, beispielsweise als Sirup in der
Süßwarenindustrie, als Verdickungsmittel in Nahrungs-, kosmetischer
und pharmazeutischer Industrie, als Tapetenkleister oder als Zusatz in
Waschmitteln, Klebstoff und Papier.
1.1 Struktur der Stärke
Der Begriff Stärke bezeichnet kein Molekül, sondern semikristalline
Partikel, die so genannten Stärkekörner oder Granula. Sie bestehen
hauptsächlich aus den Glukosepolymeren Amylose und Amylopektin
und können in geringem Umfang zusätzlich Lipide, Proteine und Phosphat enthalten (Buléon et al., 1998).
11
EINLEITUNG
Die Hauptkomponente der Stärkekörner ist Amylopektin. Jedes Amylopektinmolekül besteht aus linearen, durch D-1,4-glykosidische Bindungen verknüpften Glukoseketten, in die in unregelmäßigen Abständen
D-1,6-Verzweigungen eingefügt sind. Diese D-1,6-Verzweigungen
machen typischerweise etwa 4-6 % aller glykosidischen Bindungen aus,
sodass ein stark verzweigtes Molekül entsteht. Amylopektin hat eine
molekulare Masse von 107-108 und gehört mit einem Polymerisierungsgrad (DP) von 103-104 zu den größten natürlichen Polymeren. Die Länge
der Seitenketten liegt typischerweise zwischen 3 und 50 Glukoseeinheiten (Ball et al., 1998).
Amylose ist im Vergleich zu Amylopektin ein kleineres Molekül aus
hauptsächlich D-1,4-verknüpften Glukosemolekülen mit einer molekularen Masse von 104 bis 105 und einem DP von 102-103. Die D-1,6-Verbindungen machen weniger als 1 % aus, und die Seitenketten sind mit 3 bis
1.000 Glukoseeinheiten deutlich länger als bei Amylopektin (Ball et al.,
1998).
Reservestärke besteht zu 65-85 % seiner Masse aus Amylopektin und
zu etwa 15-35 % aus Amylose. Die Anteile von Amylopektin und Amylose variieren je nach Organismus, Gewebeart und Entwicklungszustand
(Ball et al., 1998). Es gibt Hinweise darauf, dass der Amylosegehalt in
transitorischer Stärke geringer ist als in Reservestärke (Tomlinson et al.,
1997). Zeeman et al. (2002) haben ermittelt, dass der Amylosegehalt von
Assimilationsstärke in Blättern von Arabidopsis am Ende des Tages bei
etwa 6 % liegt. Außerdem konnten sie zeigen, dass der Amylosegehalt
der Stärke ansteigt, wenn die Pflanzen in einer verlängerten Lichtphase
mehr Assimilationsstärke ansammeln. Von den übrigen Bestandteilen
der Stärke machen die Lipide den größten Anteil aus, der bei Reservestärke von Getreide mit 0,6-1,2 % besonders hoch ist (Buléon et al.,
1998).
Amylopektinmoleküle sind in Stärkekörnern radial angeordnet. Das
reduzierende Ende ist zur Mitte und die nicht-reduzierenden Enden sind
zur Oberfläche des Granulums gerichtet. Die D-1,6-Verzweigungen
liegen zum Großteil in so genannten amorphen Lamellen, die etwa 3 nm
breit und in annähernd konzentrischer Weise angeordnet sind. Auf eine
amorphe Lamelle folgt ein etwa 6 nm breiter kristalliner Bereich hoher
Ordnung, eine sogenannte kristalline Lamelle, in der unverzweigte Abschnitte der Amylopektinmoleküle zu Doppelhelices aneinandergelagert
sind (Smith, 1999). Mehrere amorphe und kristalline Lamellen folgen
12
EINLEITUNG
abwechselnd aufeinander und bilden eine semikristalline Zone. Auf eine
semikristalline folgt eine amorphe Zone, und beide zusammen bilden einen Wachstumsring. Amylose formt einzelne helikale Strukturen und ist
vermutlich hauptsächlich in den amorphen Zonen lokalisiert. Die Orientierung von Amylopektinmolekülen in diesen Bereichen ist nicht bekannt
(Denyer et al., 2001; Martin und Smith, 1995).
Stärkekörner variieren in ihrer Größe je nach Pflanzenspezies und
Organ von weniger als 1 μm bis mehr als 100 μm im Durchmesser, und
Granula aus Blättern sind in der Regel kleiner als Granula aus Speichergeweben (Martin und Smith, 1995; Zeeman et al., 2002).
Granula aus Speicherorganen von allen bisher untersuchten Höheren
Pflanzen besitzen Wachstumsringe (Pilling und Smith, 2003). Da die
meisten Untersuchungen zu Struktur und Komposition von Stärkegranula an Reservestärke durchgeführt wurden, ist Assimilationsstärke
weniger gut charakterisiert. Zeeman et al. (2002) konnten jedoch zeigen,
dass transiente Stärke von Arabidopsis sehr ähnliche Strukturen aufweist
wie Reservestärke. Die Glukanketten hatten ebenfalls eine radiale Anordung, und es wurden alternierende kristalline und semikristalline Lamellen gefunden. Fehlende Wachstumsringe führen die Autoren auf die
geringe Größe transienter Granula zurück (1-2 μm x 0,2-0,5 μm). Arabidopsis sex4-Mutanten, denen die Aktivität einer plastidären D-Amylase
fehlt, synthetisieren deutlich größere Granula als Wildtyp-Pflanzen. Die
sex4-Granula weisen Wachstumsringe mit einer Periodizität von 0,20,3 μm auf, die etwa dem Durchmesser der Wildtyp-Granula entspricht.
1.2 Metabolismus der Stärke
1.2.1
Stärkesynthese
In allen Plastiden, die zur Stärkesynthese befähigt sind, ist ADP-Glukose (ADP-Glc) das Substrat für die Synthese von Amylopektin und
Amylose. Das Enzym ADP-Glukose-Pyrophosphorylase (AGPase;
EC 2.7.7.27) katalysiert die Synthese von ADP-Glc aus Glukose-1Phosphat und ATP. Die AGPase von Höheren Pflanzen ist ein Heterotetramer aus zwei großen und zwei kleinen Untereinheiten (Ballicora et
al., 1995). Pflanzen besitzen mehrere Gene, die für die große oder kleine
Untereinheit kodieren, und diese Gene werden differentiell in verschiedenen pflanzlichen Geweben exprimiert (Tetlow et al., 2004a). Neben
der plastidär lokalisierten AGPase, die in allen Stärke-synthetisierenden
13
EINLEITUNG
Geweben vorkommt, gibt es biochemische Evidenzen für mindestens
zwei distinkte AGPase Enzyme im Endosperm von Mais, Gerste, Reis
und Weizen, die auf plastidäre und cytosolische Isoformen zurückzuführen sind (Tetlow et al., 2004a). Die extraplastidären Isoformen der
AGPase sind jedoch wahrscheinlich ausschließlich im Endosperm von
Gramineae vorhanden (Beckles et al., 2001).
Amylopektin und Amylose werden synthetisiert von Stärkesynthasen
(EC 2.4.1.21), die die Übertragung eines Glukoserestes von ADP-Glc
auf das nicht-reduzierende Ende einer bereits vorhandenen D-1,4verknüpften Glukankette katalysieren. Stärkesynthase-Gene werden grob
in zwei Gruppen unterteilt. Zum einem die Granula-gebundenen Stärkesynthasen (GBSS), die beinahe ausschließlich innerhalb der GranulaMatrix gefunden werden und die beiden Isoformen GBSSI und GBSSII
beinhalten. Die Mitglieder der zweiten Gruppe werden einfach als
Stärkesynthasen (SS) bezeichnet und beinhalten vier Isoformen, die als
SSI bis SSIV bezeichnet werden. Ihre Verteilung zwischen Stroma und
Granula kann je nach Art, Gewebe und Entwicklungszustand der Pflanze
variieren (Ball und Morell, 2003). SSI bis SSIV sind ausschließlich in
die Synthese von Amylopektin involviert. Es wird vermutet, dass jede
Isoform dabei eine spezifische Funktion hat (Tetlow et al., 2004a).
GBSSI kommt vorwiegend in Speichergeweben vor und ist essentiell
für die Synthese von Amylose (Tetlow et al., 2004a), kann aber zusätzlich sowohl in vitro als auch in vivo lange Glukanketten innerhalb
der Amylopektin-Fraktion verlängern (Delrue et al., 1992; Maddelein et
al., 1994). Maltooligosaccharide (MOS) stimulieren die Aktivität von
GBSSI während der Amylose-Synthese (Denyer et al., 1996). Einer
Hypothese von Denyer et al. (2001) folgend diffundieren MOS in die
Granula und dienen dort GBSSI als Primer für die Synthese von
Amylose. GBSSII ist vermutlich verantwortlich für die AmyloseSynthese in Blättern und anderen Geweben, die transiente Stärke
akkumulieren (Vrinten und Nakamura, 2000). Waxy-Mutanten von Zea
mays, die defizient für GBSSI sind, synthetisieren ähnliche Stärkemengen wie der Wildtyp. Allerdings ist diese Stärke Amylose-frei
(Nelson und Rines, 1962). Die Amylose-Synthese ist somit nicht für die
Bildung von semikristallinen Granula notwendig und findet vermutlich
innerhalb einer bereits existierenden Amylopektin-Matrix statt (Denyer
et al., 1999).
14
EINLEITUNG
Die D-1,6-Verknüpfungen in Stärke werden durch Verzweigungsenzyme („starch branching enzymes“, SBEs; EC 2.4.1.18) eingefügt.
SBEs spalten D-1,4-Bindungen in Glukanketten und knüpfen eine neue
D-1,6-glykosidische Bindung zwischen dem frei werdenden reduzierenden Ende und einer Hydroxylgruppe an Position C-6 eines Glukoserestes
innerhalb von Amylopektin oder Amylose. Pflanzen besitzen mehrere
Isoformen von SBEs, die zum Teil abhängig von dem Gewebe und/oder
dem Entwicklungszustand unterschiedlich exprimiert werden (Tetlow et
al., 2004a). Sie werden unterteilt in zwei Hauptklassen, SBEI und SBEII,
die sich hinsichtlich der Substratspezifität und der Länge der transferierten Glukanketten unterscheiden. SBEI transferiert vorwiegend längere
Ketten und hat eine höhere Affinität zu Amylose. SBEII zeigt eine
höhere Aktivität mit Amylopektin und transferiert hauptsächlich kürzere
Ketten (Tetlow et al., 2004a).
Pflanzliche „debranching enzymes“ (DBEs) sind Hydrolasen, die D1,6-glykosidische Bindungen spalten, und somit im Gegensatz zu
tierischen oder bakteriellen DBEs einen direkten „debranching“-Mechanismus katalysieren. Man unterteilt DBEs aus Pflanzen anhand ihrer
Substratspezifität in zwei Klassen, Isoamylasen (EC 3.2.1.68) und LimitDextrinasen (Pullulanasen; EC 3.2.1.142). Der entscheidende Unterschied ist, dass Limit-Dextrinasen Pullulan spalten können, ein von
Hefen sezerniertes Polysaccharid, bestehend aus D-1,6-verknüpften
Maltotrioseeinheiten (Zeeman et al., 2004a). Im Genom von Arabidopsis
werden drei Isoformen der Isoamylasen (ISA1-3) und eine Limit Dextrinase (LDA1) kodiert, die alle plastidär lokalisiert sind (Lloyd et al.,
2005). In Solanum tuberosum (Kartoffel) sind Stisa1 und Stisa2, die
orthologen Proteine von ISA1 und ISA2, als Untereinheiten eines multimeren Komplexes identifiziert worden (Hussain et al., 2003), der eine
wichtige Funktion in der Kontrolle der Initiation der Granula-Synthese
hat (Bustos et al., 2004). Arabidopsis-Mutanten, denen ISA1 oder ISA2
(DBE1) fehlt, sind durch eine abnormale Stärkesynthese gekennzeichnet
(Delatte et al., 2005). Diese Pflanzen akkumulieren neben, im Vergleich
zum Wildtyp, geringeren Stärkemengen zusätzlich Phytoglykogen, ein
lösliches D-1,4- und D-1,6-verknüpftes Polyglukan (Smith et al., 2005).
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass Isoamylasen eine wichtige
Funktion bei der Stärkesynthese einnehmen. Der genaue Mechanismus
ist nicht bekannt, aber es werden zwei Modelle vorgeschlagen. Nach
dem „Glucan-Trimming“- oder „Pre-Amylopectin-Trimming“-Modell ist
15
EINLEITUNG
die Isoamylase Aktivität verantwortlich für das Entfernen von inkorrekt
verzweigten Glukanen an der Oberfläche von wachsenden Granula. Dies
ermöglicht die Aggregation von Amylopektin zu der unlöslichen semikristallinen Struktur des Granulums (Ball et al., 1996; Myers et al.,
2000). Ein alternatives Modell postuliert einen so genannten „clearing“Mechanismus von DBEs (Tetlow et al., 2004a). Demnach spalten DBEs
lösliche verzweigte Glukane. Dies führt zu einer Abnahme von Substraten für die Amylopektin-synthetisierenden Enzyme (SS und SBE)
und verhindert damit eine zufällige Synthese von Glukan-Polymeren.
Glukan-Phosphorylasen (GP; EC 2.4.1.1) katalysieren den reversiblen
Transfer der Glukosyl-Einheit von Glukose-1-Phosphat (Glc-1-P) auf
das nicht-reduzierende Ende eines D-1,4-verknüpften Glukans unter
Freisetzung von Orthophosphat (Pi). Diese Reaktion kann abhängig von
der relativen Konzentration der Substrate Glc-1-P und Pi sowohl in die
synthetische als auch in die degradative Richtung ablaufen (Tetlow et al.,
2004a). Eine kinetische Analyse zeigte, dass die phosphorolytische
Reaktion der plastidären Isoform von GP (PHO1) in Anwesenheit von
MOS gegenüber der synthetischen Reaktion bevorzugt wird (Mu et al.,
2001). Eine Hypothese zur Funktion von GP bei der Stärkesynthese ist,
dass PHO1 die von DBEs während des „Glucan-Trimming“ frei
gesetzten MOS phosphorolytisch zu Glc-1-P abbaut, welches dann für
die Synthese von ADP-Glc und Stärke zur Verfügung steht (Takaha et
al., 1998).
1.2.2
Stärkeabbau
In der letzten Zeit sind einige Untersuchungen zum Abbau von transitorischer Stärke, vor allem in Arabidopsis, durchgeführt worden, die viel
zum Verständnis des Prozesses beigetragen haben. Allerdings sind einige
der beteiligten Reaktionen weiterhin spekulativ. Ein Grund dafür ist, dass
viele Enzyme, die D-1,4- oder D-1,6-Verbindungen von Glukanen
spalten, in mehreren Isoformen vorkommen. Einige dieser Isoformen
sind in Plastiden lokalisiert, andere kommen extraplastidär vor. Ein Beitrag von extraplastidären Enzymen am Stärkeabbau ist jedoch nur in
Fällen denkbar, bei denen es zur Desintegration der Plastidenmembran
kommt, wie es im Endosperm von reifen Getreidesamen oder in den
Speicherkotyledonen der Leguminosen der Fall ist (Steup, 1988).
16
EINLEITUNG
Im Folgenden werden die Reaktionen, die an dem Abbau von Stärkegranula in Chloroplasten und den nachgeschalteten cytosolischen
Prozessen beteiligt sind, anhand eines in Abb. 1.1 dargestellten Modells
beschrieben.
Der initiale Schritt beim Abbau von Stärkegranula ist dadurch gekennzeichnet, dass die involvierten Enzyme ein unlösliches Substrat umsetzen
müssen. Bei der Initiation des Abbaus von Granula im Endosperm von
Getreide wurde den D-Amylasen (EC 3.2.1.1) eine wichtige Funktion
zugeschrieben (Beck und Ziegler, 1989). D-Amylasen sind Endoamylasen und katalysieren die Hydrolyse von D-1,4-glykosidischen
Bindungen innerhalb eines Glukans (Steup, 1988). In dem Genom von
Arabidopsis werden drei Isoformen der D-Amylase kodiert (AMY1-3),
von denen nur eine (AMY3) ein putatives Transitpeptid besitzt (Lloyd et
al., 2005). Transgene Arabidopsis-Pflanzen, denen die drei D-Amylasen
fehlen, zeigen normale Stärkeabbau-Raten (Yu et al., 2005). Die
fehlende D-Amylase-Aktivität kann entweder von anderen Enzymen
kompensiert werden oder ist nicht an der Stärke-Degradation beteiligt
(Smith et al., 2005; Yu et al., 2005). Vermutlich haben D-Amylasen
daher in Arabidopsis Pflanzen keine essentielle Funktion beim Stärkeabbau.
Neben D-Amylasen sind nur wenige Enzyme bekannt, die lösliche
Glukane aus Granula freisetzen können, unter anderem zwei plastidäre
Proteine in Blättern von Kartoffelpflanzen, eine Isoform der E-Amylase
(Scheidig et al., 2002) und Isoamylase 3 (Stisa3; Hussain et al., 2003). EAmylasen (EC 3.2.1.2) sind Exoamylasen und setzen sukzessive,
beginnend vom nicht-reduzierenden Ende einer Glukankette, bis zu einer
D-1,6-Verzweigung, hydrolytisch Maltose frei (Steup, 1988). Das
Arabidopsis Genom enthält neun Gene, die für E-Amylasen kodieren
(BAM1-9), von denen vier ein putatives Transitpeptid besitzen (Smith et
al., 2005). Transgene Arabidopsis-Pflanzen, denen eine der plastidären
Isoformen fehlt, zeigen verringerte Stärkeabbau-Raten (Scheidig et al.,
2002; Smith et al., 2005). Zudem akkumulieren Pflanzen, denen für den
Maltose-Stoffwechsel benötigte Enzyme fehlen, große Mengen Maltose
und bauen Stärke langsamer ab (Chia et al., 2004; Lu und Sharkey, 2004;
Smith et al., 2005). Einige Studien demonstrieren, dass der MaltoseGehalt in Blättern von Arabidopsis in der Nacht ansteigt (Critchley et al.,
2001; Niittylä et al., 2004; Weise et al., 2004). In einer weiteren Arbeit
wurde kürzlich gezeigt, dass E-Maltose das metabolisch aktive Anomer
17
EINLEITUNG
der Maltose während des Abbaus von transitorischer Stärke ist (Weise et
al., 2005). E-Amylasen sind invertierende Enzyme, sie setzen also ausschließlich E-Maltose aus D-1,4-verknüpften Glukanen frei. Der
E-Maltose-Gehalt in Blättern von Arabidopsis Wildtyp-Pflanzen war
tagsüber niedrig und in der Nacht deutlich erhöht. In Blättern von
Arabidopsis-Pflanzen, die aufgrund eines Knockouts der Phosphoglukoisomerase (PGI) keine Stärke produzieren, und von Arabidopsis dpe2-1
Pflanzen, denen ein Maltose-metabolisierendes Enzym fehlt (Transglukosidase, DPE2; s. u.), wurden am Tag und in der Nacht keine Unterschiede imE-Maltose-Gehalt gefunden. Diese Daten deuten an, dass EAmylasen essentiell für den Katabolismus von transitorischer Stärke in
Arabidopsis Blättern sind (Lloyd et al., 2005; Smith et al., 2005).
Die einzigen Enzyme, die D-1,6-glykosidische Bindungen innerhalb
eines Glukans spalten können, sind DBEs (1.2.1; Smith et al., 2005).
Daher wurde angenommen, dass sie eine essentielle Funktion im Katabolismus von Stärke haben. Bei Arabidopsis Pflanzen, denen entweder
ISA1 (Delatte et al., 2005), ISA2 (Delatte et al., 2005; Zeeman et al.,
1998) oder LDA1 (Smith et al., 2005) fehlen, wurden jedoch keine Veränderungen im Stärkeabbau nachgewiesen. Die Funktion von ISA3 in
Arabidopsis ist noch nicht bekannt, allerdings geben vorläufige Analysen
einer Knockout-Mutante Hinweise auf eine Beteiligung am Stärkeabbau
(Smith et al., 2005). Zudem kann Stisa3, das Ortholog von ISA3 in
Kartoffeln, in vitro Glukane aus Granula freisetzen (s. o.; Hussain et al.,
2003).
Es ist noch unklar, welche der bisher beschriebenen Enzyme in vivo an
der Initiation des Abbaus von granulärer Stärke beteiligt sind. Eventuell
sind auch bislang unbekannte Proteine involviert (Smith et al., 2005).
Durch die postulierten initialen Reaktionen werden in jedem Fall lösliche
Glukane in das Stroma der Chloroplasten freigesetzt. Die D-1,4-glykosidischen Bindungen dieser Glukane könnten sowohl hydrolytisch als
auch phosphorolytisch gespalten werden. Die Phosphorolyse wird katalysiert von den bereits beschriebenen GP (1.2.1), von denen in Arabidopsis neben einer cytosolischen (PHO2) auch eine plastidäre (PHO1)
Isoform existiert (Zeeman et al., 2004b). Es gibt jedoch keine Evidenzen
für eine essentielle Funktion von PHO1 beim Abbau von Stärke. In
Blättern von transgenen Kartoffel und Arabidopsis-Pflanzen, denen die
PHO1-Aktivität fehlte, war der Kohlenhydrat-Stoffwechsel unverändert
(Sonnewald et al., 1995; Zeeman et al., 2004b). Zeeman et al. (2004b)
18
EINLEITUNG
vermuten vielmehr, dass PHO1 eine Funktion bei der pflanzlichen
Antwort auf abiotischen Stress hat.
Der größte Teil der löslichen Glukane im Stroma wird vermutlich von
E-Amylasen wie oben beschrieben zu Maltose abgebaut (Lloyd et al.,
2005; Smith et al., 2005). Es gibt deutliche Hinweise darauf, dass
Maltose über einen kürzlich identifizierten Maltose-Transporter
(„Maltose excess 1“, MEX1) in das Cytosol befördert wird (Niittylä et
al., 2004). Arabidopsis mex1-Mutanten, denen der Transporter fehlt,
akkumulieren hohe Mengen Maltose und Stärke in Blättern und sind in
ihrem Wachstum stark gestört. Die bedeutende Rolle der Maltose wird
durch in vitro-Versuche belegt, die zeigen, dass Maltose das HauptExportprodukt von Stärke-abbauenden Chloroplasten verschiedener
Spezies ist (Weise et al., 2004).
Einen zusätzlichen Hinweis auf die Bedeutung von Maltose im Stärkeabbau geben Arabidopsis Knockout-Pflanzen, denen ein Disproportionierungs-Enzym (DPE1) fehlt. Die Pflanzen weisen im Vergleich zum
Wildtyp höhere Stärkegehalte auf und akkumulieren in der Nacht mehr
Maltotriose (Critchley et al., 2001). Neben Maltose werden durch den
Eamylolytischen Abbau von linearen Glukanen auch geringe Mengen
Maltotriose produziert, da E-Amylasen keine Ketten spalten können, die
kürzer als vier Glukosyl-Reste sind (Lizotte et al., 1990; Smith et al.,
2005). Das einzige bekannte Maltotriose-metabolisierende Enzym mit
vorhergesagter plastidärer Lokalisierung ist das DisproportionierungsEnzym (D-Enzym, D-1,4-Glucanotransferase, DPE1; EC 2.4.1.25).
DPE1 kann zwei Maltotriose-Moleküle zu Maltopentaose und Glukose
umsetzen (Smith et al., 2005), und die Glukose kann von einem in der
Chloroplastenmembran lokalisierten Glukose-Transporter ins Cytosol
befördert werden (Weber et al., 2000). Weise et al. (2004) konnten
zudem zeigen, dass Glukose neben Maltose (s. o.) ein weiteres wichtiges
Exportprodukt von Stärke-abbauenden Chloroplasten ist.
Die beiden Hauptprodukte des Abbaus von Stärke in Chloroplasten,
Maltose und Glukose, werden nach dem Transport ins Cytosol auf unterschiedliche Weise dem Hexosephosphat-Metabolismus oder der
Synthese von Saccharose zugeführt. Glukose wird vermutlich direkt nach
dem Transport von einer an der cytosolischen Seite der Chloroplastenmembran mit dem Glukose-Transporter assoziierten Hexokinase zu
Glukose-6-Phosphat (Glc-6-P) phosphoryliert (Lloyd et al., 2005). Durch
diese Phosphorylierung wird ein Konzentrations-Gradient aufrecht19
EINLEITUNG
erhalten, der den Export von Glukose ins Cytosol begünstigt (Weber et
al., 2000). Der Abbau von Maltose wurde bisher den D-Glukosidasen
(Maltasen) zugeschrieben, die Maltose hydrolytisch spalten. Es sind
jedoch keine Arbeiten bekannt, die eine Funktion von D-Glukosidasen
im Maltose-Katabolismus während des Stärkeabbaus belegen (Lloyd et
al., 2005). Jüngste Studien belegen, dass Maltose durch ein neuartiges
Enzym gespalten wird, dessen Aminosäuresequenz eine hohe Ähnlichkeit zu der Sequenz des D-Enzyms hat, und das daher DPE2 genannt
wurde (Chia et al., 2004; Lu und Sharkey, 2004). DPE2 ist jedoch kein
D-Enzym, sondern eine Transglukosidase, die die Übertragung einer
Glukose-Einheit von Maltose auf ein Polysaccharid unter Freisetzung
eines Moleküls Glukose katalysiert (Chia et al., 2004; Lloyd et al.,
2004). Die essentielle Bedeutung von DPE2 für den Stärkestoffwechsel
wird an Arabidopsis-Pflanzen ersichtlich, denen DPE2 fehlt (dpe2).
Diese Pflanzen zeigen einen ähnlichen Phänotyp wie mex1-Mutanten,
das heißt sie akkumulieren hohe Mengen Stärke und Maltose und haben
niedrige Wachstumsraten (Chia et al., 2004; Lu und Sharkey, 2004). Da
DPE2 in Arabidopsis im Cytosol lokalisiert ist, muss als endogener
Akzeptor für den zu übertragenden Glukosyl-Rest ein cytosolisches
Polysaccharid postuliert werden. Ein möglicher Kandidat ist lösliches
Heteroglykan, das hauptsächlich aus Galaktose, Arabinose und Glukose
aufgebaut ist (Fettke et al., 2004; Yang und Steup, 1990). Die Funktion
des Heteroglykans im Stärkeabbau ist noch weitgehend spekulativ. Eine
Hypothese ist, dass PHO2 Glc-1-P aus dem Heteroglykan frei setzt
(Lloyd et al., 2005; Smith et al., 2005). Glc-1-P würde zusammen mit
Glukose, die bei der DPE2-Reaktion entsteht, für die SaccharoseSynthese zur Verfügung stehen.
20
EINLEITUNG
Stärkegranulum
?
GWD, ISA3,
D-Amylase?
E-Amylase
?
E-Amylase
verzweigte
lineare
Glukane „debranching Glukane
Chloroplast
(Stroma)
enzyme“
(ISA3)
Maltotriose
D-Enzym
(DPE1)
Glukose
Cytosol
Maltose
GlukoseTransporter
MaltoseTransporter
(MEX1)
Hexokinase
?
Glukose
Maltose
Transglukosidase
(DPE2)
Glukose-6-Phosphat
Heteroglykan?
Glukan-Phosphorylase
(PHO2)
Glukose-1-Phosphat?
?
Hexosephosphat-Metabolismus
und Saccharose-Synthese
Abb. 1.1:
Schematische Darstellung des Abbaus von transitorischer
Stärke in Arabidopsis Blättern in der Nacht
Fragezeichen kennzeichnen ungewisse Schritte. Breite Pfeile charakterisieren den
Weg der Haupt-Abbauprodukte. Der genaue Mechanismus der Freisetzung von
verzweigten und linearen Glukanen ist nicht bekannt. Auch der Glukosyl-Akzeptor
von DPE2 ist spekulativ. GWD, Glukan-Wasser-Dikinase; ISA3, Isoamylase 3.
Modifiziert nach Lloyd et al. (2005) und Smith et al. (2005).
21
EINLEITUNG
Transgene Kartoffelpflanzen, bei denen die DPE2 Menge durch RNAInterferenz reduziert ist, akkumulieren, ähnlich wie Arabidopsis dpe2Pflanzen (s. o.), hohe Stärke- und Maltose-Mengen (Lloyd et al., 2004).
Eine Immunoblot-Analyse von isolierten Chloroplasten aus Kartoffelpflanzen deutet allerdings darauf hin, dass DPE2 in Kartoffelblättern
plastidär lokalisiert ist (Lloyd et al., 2004). Möglicherweise unterscheidet
sich der Mechanismus des Stärkeabbaus in Blättern von Arabidopsis und
Kartoffeln (Lloyd et al., 2005; Smith et al., 2005).
1.3 Stärke-Phosphorylierung
Die Initiation des Abbaus von Stärkegranula ist, wie oben dargestellt
(1.2.2), noch nicht komplett verstanden. Untersuchungen in den letzten
Jahren haben jedoch gezeigt, dass kovalent an Stärke gebundene
Phosphatreste eine wichtige Bedeutung für diesen Prozess haben.
Das einzige bisher bekannte Stärke-phosphorylierende Enzym ist die
Glukan-Wasser-Dikinase (GWD; EC 2.7.9.4). GWD katalysiert den
Transfer des E-P von ATP zunächst auf einen Histidinrest des GWDProteins und von dort auf die C-6- und/oder C-3-Position von GlukosylEinheiten in Amylopektin (Ritte et al., 2002). Das J-P von ATP wird auf
Wasser übertragen (Ritte et al., 2002). Mikkelsen et al. (2004) haben
durch ortsspezifische Mutagenese das phosphorylierte Histidin identifiziert. Ein rekombinantes GWD Protein aus Kartoffel, bei dem der
Histindinrest an Position 992 (His992) der Aminosäuresequenz gegen
Alanin ausgetauscht wurde, hatte keine Aktivität mehr. Dieses His992 ist
in einer so genannten Phosphohistidin-Domäne lokalisiert, die in vielen
Dikinasen aus unterschiedlichen Spezies hoch konserviert ist (Mikkelsen
et al., 2004). Yu et al. (2001) haben zudem gezeigt, dass der C-Terminus
von GWD Homologie zu den N-terminalen Nukleotidbindedomänen der
Pyruvat-Phosphat-Dikinasen (PPDK; EC 2.7.9.1) aus Höheren Pflanzen
und Bakterien und der Pyruvat-Wasser-Dikinase (PhosphoenolpyruvatSynthase, PPS; EC 2.7.9.2) aus Bakterien aufweist.
GWD phosphoryliert in vitro die C-6- und C-3-Positionen von Glukosyleinheiten in Amylopektin in einem ähnlichen Verhältnis, wie es auch
in nativer Kartoffelstärke vorkommt (Ritte et al., 2002). Etwa Ҁ des
Phosphates in Kartoffelstärke ist an C-6-Positionen und ѿ an C-3Positionen von Glukosyleinheiten verestert (Tabata und Hizukuri, 1971).
Zusätzlich ist eventuell noch ca. 1 % des Phosphates an C-2-Position
22
EINLEITUNG
gebunden (Tabata und Hizukuri, 1971). Stärke-Phosphatester werden in
vivo ausschließlich in Amylopektin gefunden (Hizukuri et al., 1970), und
in vitro ist die Aktivität von GWD sehr gering, wenn Amylose als
Substrat verwendet wird (Ritte et al., 2002). Auch die Häufigkeit der
Amylopektin-Phosphorylierung in vivo ist generell niedrig. In Kartoffelstärke, die eine besonders hohe Menge an kovalent gebundenem
Phosphat enthält, ist nur etwa 1 von 200-500 Glukosyleinheiten
phosphoryliert (Nielsen et al., 1994; Tabata und Hizukuri, 1971), in Arabidopsis-Blattstärke ist es nur ca. 1 von 1.000 (Yu et al., 2001).
Die Amylopektin-Phosphorylierung durch GWD findet sowohl
während der Netto-Stärkesynthese (Nielsen et al., 1994) als auch
während des Abbaus (Ritte et al., 2004) statt. In Chloroplasten ist die
Phosphorylierungsrate jedoch während des Stärkeabbaus wesentlich
höher als während der Synthese (Ritte et al., 2004). Zudem steigt die
Menge der an Granula gebundenen GWD während des Netto-Abbaus in
der Dunkelheit stark an (Ritte et al., 2000b); GWD ist daher vermutlich
in dieser Zeit aktiver (Zeeman et al., 2004a).
Evidenzen für eine essentielle Funktion von GWD im Stärkestoffwechsel wurden bei der Analyse von transgenen Kartoffelpflanzen
(Lorberth et al., 1998) und Arabidopsis „starch excess 1“- (sex1-)
Mutanten (Yu et al., 2001) gefunden, in denen die GWD-Proteinmenge
reduziert war. Der Phosphatgehalt in der Stärke der transgenen Kartoffelpflanzen war gegenüber dem Wildtyp um 50-90 % vermindert; der
Stärkegehalt von Blättern war am Ende der Lichtperiode etwa vierfach
erhöht (Lorberth et al., 1998). In Arabidopsis sex1-1-Pflanzen wird ein
GWD-Protein mit einem Aminosäureaustausch in der Nukleotidbindedomäne (Gly1268ĺGlu) in ähnlicher Menge synthetisiert wie GWD in
Wildtyp-Pflanzen (Yu et al., 2001). Der Phosphatgehalt der Stärke von
sex1-1-Pflanzen entspricht jedoch nur etwa ѿ des Gehaltes von WildtypPflanzen, und die Mutanten haben am Ende des Tages etwa dreimal
mehr Stärke akkumuliert als der Wildtyp. In sex1-3-Mutanten war kein
GWD-Protein mehr nachweisbar, und der Phosphatgehalt der Stärke
dieser Pflanzen lag unter der Nachweisgrenze. Die Stärkemenge am
Ende der Lichtperiode war fünffach erhöht gegenüber dem Wildtyp.
Zudem hatten die verschiedenen sex1-Mutanten umso niedrigere
Wachstumsraten je niedriger der Stärke-Phosphatgehalt war.
Mit Hilfe eines gegen GWD aus Kartoffel gerichteten Antikörpers
wurden GWD-Homologe in einer Reihe von Pflanzen gefunden, u. a. in
23
EINLEITUNG
Früchten von Bananen (Musa spp.), Knollen von Süßkartoffeln (Ipomea
batatas) und Yamswurzel (Dioscorea batatas) und Samen von Mais
(Zea mays) und Gerste (Hordeum vulgare) (Ritte et al., 2000a). Zudem
enthalten Stärken aus beinahe allen bisher untersuchten Pflanzen
kovalent gebundenes Phosphat (Blennow et al., 2000b; Lim et al., 1994;
Ritte et al., 2000a). Die weite Verbreitung von GWD und Stärkegebundenem Phosphat deutet auf einen generellen Mechanismus im
Pflanzenreich hin. Interessanterweise enthält Stärke aus GetreideEndosperm nur wenig oder gar kein kovalent gebundenes Phosphat
(Blennow et al., 2000b; Lim et al., 1994; Ritte et al., 2000a), sodass über
einen unterschiedlichen Mechanismus der Initiation des Stärkeabbaus in
Plastiden von lebenden Zellen und nicht-lebenden Pflanzengeweben
spekuliert werden kann (Zeeman et al., 2004a).
Die inverse Korrelation von Phosphatgehalt und Akkumulation von
Stärke in transgenen Kartoffelpflanzen und Arabidopsis sex1-Mutanten
(s. o.) hat zu der Annahme geführt, dass kovalent an Stärke gebundenes
Phosphat notwendig für den Abbau von Stärke ist. Eine mögliche
Erklärung ist, dass die negativ geladenen Phosphatgruppen die dichte
Packung der Amylopektin-Doppelhelices unterbrechen und somit
hydrophile Bereiche in den semikristallinen Lamellen entstehen könnten.
Dadurch würde die Zugänglichkeit für Stärke-abbauende Enzyme
verbessert (Blennow et al., 2002; Ritte et al., 2002). Alternativ könnten
die Phosphatester als spezifische Bindungsstellen oder Targets für
Stärke-abbauende Enzyme oder andere Stärke-relevante Proteine dienen
(Zeeman et al., 2004a).
1.4 Regulation des Stärkemetabolismus
In den vorangegangenen Abschnitten wurden kurz die wichtigsten
Komponenten beschrieben, die an Synthese und Abbau von Stärke in
Plastiden von Höheren Pflanzen beteiligt sind. Aufgrund der unterschiedlichen physiologischen Gegebenheiten in den jeweiligen Stärkemetabolisierenden Zellen und Geweben erfordert der Stoffwechsel von
Assimilations- und Reservestärke unterschiedliche Regulationsmechanismen. Die Kontrolle des Metabolismus von transitorischer Stärke ist
aufgrund der wiederholt aufeinander folgenden Phasen von NettoSynthese und Netto-Abbau von besonderem Interesse. Daher
24
EINLEITUNG
konzentrieren sich die folgenden Betrachtungen auf die Regulation des
Stärkemetabolismus in Chloroplasten.
Die Aktivität einiger Stärke-metabolisierenden Enzyme wird allosterisch durch Stoffwechsel-Intermediate moduliert (Tetlow et al.,
2004a). Das am besten charakterisierte Beispiel für allosterische Regulation ist die AGPase, das Schlüsselenzym der Stärkesynthese (1.2.1). Die
chloroplastidäre AGPase wird bereits durch mikromolare Mengen von
3-Phosphoglycerat (3-PGA) aktiviert und durch anorganisches Phosphat
(Pi) inhibiert (Ghosh und Preiss, 1966). Das Verhältnis 3-PGA:Pi hat vermutlich eine generelle Funktion bei der Regulation des Stärkemetabolismus (Preiss, 1991). 3-PGA ist eines der ersten Indermediate bei der
photosynthetischen CO2-Fixierung und wird nachfolgend zu Triosephosphat (TP) umgesetzt. Im Austausch mit Pi können 3-PGA und TP
über den Triosephosphat/ Phosphat-Translokator (Flügge, 1998) ins
Cytosol transportiert werden und stehen dort für die Synthese von
Saccharose zur Verfügung. Bleibt die Geschwindigkeit der Saccharosesynthese hinter der photosynthetischen Kohlenhydratproduktion zurück,
kommt es zu einem Anstieg des 3-PGA:Pi-Verhältnisses im Chloroplasten und über allosterische Aktivierung der AGPase zur Stimulierung
der Stärkesynthese. Im Dunkeln sinkt die 3-PGA-Konzentration aufgrund der fehlenden photosynthetischen Kohlenhydratproduktion, sodass
die AGPase allosterisch inaktiviert wird und keine Stärkesynthese stattfindet. In Abhängigkeit vom Gewebe, der Art der Plastiden und der subzellulären Lokalisation sind die AGPasen jedoch unterschiedlich sensitiv
für die allosterische Modulation durch 3-PGA und Pi (Tetlow et al.,
2004a). Neben dem 3-PGA:Pi-Verhältnis wird die AGPase zusätzlich
allosterisch durch die Konzentration von einigen Intermediaten der
Glykolyse, Hexosephosphaten und ATP reguliert (Ball und Morell,
2003).
Ein weiterer Regulationsmechanismus wurde von Fu et al. (1998) entdeckt. Sie konnten zeigen, dass die AGPase durch die Bildung einer
Disulfid-Brücke zwischen den N-Termini der beiden kleinen Untereinheiten des heterotetrameren Komplexes inaktiviert wird. Durch
Reduktion der Disulfid-Brücke in dem rekombinanten Enzym mit Thioredoxin f oder m die wurde Aktivität der AGPase wiederhergestellt
(Ballicora et al., 2000). In Kartoffelknollen wurde die Redox-Aktivierung der AGPase als Antwort auf Faktoren beschrieben, die direkt oder
indirekt mit einem Anstieg der Saccharose-Konzentration korrelieren
25
EINLEITUNG
(Tiessen et al., 2002). Von Hendriks et al. (2003) wurde nachfolgend
gezeigt, dass die Stärke-Synthese in einer Reihe von Pflanzenspezies
durch die Redox-Modulierung der AGPase-Aktivität als Antwort auf
Licht und Zuckergehalte kontrolliert wird. Über die Redox-Regulation
von anderen am Stärkestoffwechsel beteiligten Enzymen ist wenig
bekannt. Es gibt jedoch Hinweise darauf, dass auch die Aktivität einiger
Pullulanasen und E-Amylasen über Redox-Modulation kontrolliert wird
(Tetlow et al., 2004a).
Eine kürzlich durchgeführte Studie lässt auf einen bisher unbekannten
Mechanismus der Regulation des Stärkestoffwechsels schließen. Tetlow
et al. (2004b) haben eine Reihe von Phosphoproteinen aus Amyloplasten
von Weizen-Endosperm isoliert, die in die Stärke-Synthese involviert
sind, zum Beispiel SBEII (1.2.1). Die Dephosphorylierung von SBEII in
vitro resultierte in einer Abnahme der Enzymaktivität. Dies führte zu der
Annahme, dass Protein-Phosphorylierung ein weiterer Mechanismus zur
Regulation des Stärkemetabolismus sein könnte.
Neben der bisher beschriebenen allosterischen Modulation und den
posttranslationalen Modifikationen wird der Stärkemetabolismus auch
auf transkriptionaler Ebene reguliert. In einer Studie wurde die Genexpression in Arabidopsis-Blättern während des diurnalen Zyklus mittels
Microarray-Analyse untersucht (Smith et al., 2004). Der Transkriptlevel
von Enzymen, die an der Stärkesynthese beteiligt sind, änderte sich
kaum innerhalb des untersuchten Zeitraums (12 h Licht/ 12 h Dunkel).
Eine Ausnahme bildeten GBSS und SSII, deren Transkriptmengen beim
Wechsel vom Dunkeln ins Licht stark anstiegen. Umgekehrt zeigten die
Transkripte vieler am Stärkeabbau beteiligter Enzyme eine koordinierte
Abnahme im Dunkeln, gefolgt von einer raschen Akkumulation im
Licht. Allerdings wurden bei einigen Enzymen, deren Transkripte
starken diurnalen Änderungen unterlagen, keine Unterschiede in der
Proteinmenge während der Licht- und Dunkelphase gefunden.
1.5 Zielsetzung der Arbeit
Der Stoffwechsel von Stärke ist in mancher Hinsicht noch nicht verstanden. Besonders bei der Initiation des Abbaus von transienten Stärkegranula in Chloroplasten sind noch Fragen offen. Einige der beteiligten
Enzyme sind vermutlich noch unbekannt. Untersuchungen aus der
letzten Zeit haben gezeigt, dass die Phosphorylierung der Stärke durch
26
EINLEITUNG
die Glukan-Wasser-Dikinase (GWD) essentiell für die Degradation der
Granula ist. Fraglich ist allerdings noch, auf welche Weise das kovalent
gebundene Phosphat den Abbau der Stärke beeinflusst. Zwei verschiedene Mechanismen sind denkbar. Zum einen könnten Phosphatreste die
doppelhelikale Struktur von Amylopektin unterbrechen und somit
hydrophile Bereiche in den semikristallinen Zonen der Granula schaffen.
Dadurch könnte die Zugänglichkeit für am Stärkeabbau beteiligte
Enzyme verbessert werden. Alternativ könnten die Phosphatester als
spezifische Bindungsstellen oder Targets für Enzyme dienen. In beiden
Fällen sollten Proteine daher eine hohe Affinität zu phosphorylierter
Stärke aufweisen und so zum schnelleren Abbau von phosphorylierter
Stärke im Vergleich zu nicht-phosphorylierter Stärke beitragen.
Ziel dieser Arbeit war daher Phosphoglukan-bindende Proteine zu
identifizieren, die potentiell am Abbau von transitorischer Stärke
beteiligt sind. Dazu wurde ein in vitro Test etabliert, in dem die Bindung
von Proteinen aus Arabidopsis-Blattextrakten an Phosphat-freie und
zuvor in vitro durch GWD phosphorylierte Stärkegranula verglichen
wurde. Die Proteine, die eine höhere Affinität zu phosphorylierter Stärke
im Vergleich zu nicht-phosphorylierter Stärke zeigen, sollten identifiziert, charakterisiert und auf eine mögliche Funktion im Stärkemetabolismus untersucht werden.
27
28
2 Material und Methoden
2.1 Chemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterial
Allgemeines:
Ammoniummolybdat
Ammoniummonovanadat
Ammoniumsulfat
Benzamidin
Bradford-Reagenz (Bio-Rad protein assay)
Butanol
CTAB (N-Cethyl-N,N,Ntrimethylammoniumbromid)
DTE (Dithioerythritol)
EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)
Glukose-3-Phosphat (Glc-3-P)
Glukose-6-Phosphat (Glc-6-P)
Glycerin
Glykogen (aus Austern)
Guanidiniumhydrochlorid
Imidazol
IPTG
Maltodextrin („Dextri maltose“)
Natriumhypochlorit (~13 %)
Percoll
Phenol („Aqua-Roti-Phenol“)
PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid)
Protease-Inhibitoren („Complete EDTA free“)
Saccharose
Sorbitol
Szintillationslösung „RotiSzint Mini“
Merck, Darmstadt
Merck, Darmstadt
Roth, Karlsruhe
Sigma-Aldrich,
Steinheim
Bio-Rad, München
Roth, Karlsruhe
Merck, Darmstadt
Roth, Karlsruhe
Merck, Darmstadt
Synthese beschrieben
von Ritte et al. (2002)
Sigma-Aldrich,
Steinheim
Roth, Karlsruhe
Sigma-Aldrich,
Steinheim
Sigma-Aldrich,
Steinheim
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
ICN, Eschwege
Fluka, Buchs, Schweiz
Amersham Biosciences,
Freiburg
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
Roche, Mannheim
Roth, Karlsruhe
Sigma-Aldrich,
Steinheim
Roth, Karlsruhe
29
MATERIAL UND METHODEN
Triton X-100
H-Aminocapronsäure
Antibiotika:
Ampicillin
Cefotaxim
Gentamycin, Kanamycin, Rifampicin,
Spectinomycin
Enzyme:
Cellulase Onozuka R-10 (EC 3.2.1.4) aus
Trichoderma viride
DNA-Polymerasen Taq und „Expand High
Fidelity“ (EC 2.7.7.7)
DNase , (EC 3.1.21.1) aus Schweinepankreas
Isoamylase (EC 3.2.1.68) aus Pseudomonas sp.
Sigma-Aldrich,
Steinheim
Sigma-Aldrich,
Steinheim
Roth, Karlsruhe
Duchefa, Haarlem,
Niederlande
Sigma-Aldrich,
Steinheim
Serva, Heidelberg
Roche, Mannheim
Roche, Mannheim
Megazyme, Wicklow,
Irland
Lysozym (EC 3.2.1.17)
Sigma-Aldrich,
Steinheim
Macerozym R-10 (EC 3.2.1.15) aus Rhizopus sp. Serva, Heidelberg
Myokinase (EC 2.7.4.3) aus Kaninchenmuskel
Sigma-Aldrich,
Steinheim
Pyruvatkinase (EC 2.7.1.40) aus Kaninchenmuskel Roche, Mannheim
Restriktionsenzyme
New England Biolabs,
Frankfurt a. M.
Reverse Transkriptase, SuperScript (EC 2.7.7.49) Invitrogen, Karlsruhe
T4 DNA-Ligase (EC 6.5.1.1)
Promega, Mannheim
Trypsin, „sequencing grade“ (EC 3.4.21.4) aus
Roche, Mannheim
Schweinepankreas
D-Amylase (EC 3.2.1.1) aus Bacillus
Roche, Mannheim
amyloliquefaciens
Gelelektrophorese:
Acrylamid (Rotiphorese Gel 30)
Agarose
APS (Ammoniumperoxodisulfat)
Bromphenolblau
Coomassie Brilliant Blue G-250
30
Roth, Karlsruhe
Roche, Mannheim
Roth, Karlsruhe
Merck, Darmstadt
Roth, Karlsruhe
MATERIAL UND METHODEN
Coomassie Brilliant Blue R-250
Roth, Karlsruhe
Ethidiumbromid
Roth, Karlsruhe
Molekulargewichtsstandard Proteingele (SDS-6H) Sigma-Aldrich,
Steinheim
Nukleinsäure-Längenstandard (1 kb-Ladder)
Invitrogen, Karlsruhe
SDS (Natriumdocecylsulfat)
Roth, Karlsruhe
Kits:
Plasmid-Preparation („Perfectprep Plasmid Midi“)
Reinigung von PCR-Produkten und DNAFragmenten aus Gelen („NucleoSpin Extract“)
Stärke-Bestimmung
„SuperScrip First-Strand Synthesis System
for RT-PCR”
Bestandteile von Medien:
6-Benzylaminopurin
Agar-Agar
Hefeextrakt
MS-Salze (Murashige und Skoog, 1962)
mit Vitaminen
Rindfleisch-Extrakt
Trypton/ Pepton aus Casein
Radioaktiv markierte Substanzen:
[32P]Phosphorsäure (54 mCi/mL, „carrier free”)
[E-33P]ATP (10 mCi/mL, 800 Ci/mmol)
[J-33P]ATP (10 mCi/mL, 3000 Ci/mmol)
Stärke:
Kartoffel, nativ (102954)
Kartoffel, löslich (S-2004)
Mais, nativ (S-4126)
Eppendorf, Hamburg
Macherey-Nagel, Düren
R-Biopharm, Darmstadt
Invitrogen, Karlsruhe
Sigma-Aldrich,
Steinheim
Roth, Karlsruhe
Roth, Karlsruhe
Duchefa, Haarlem,
Niederlande
Becton Dickinson,
Sparks, USA
Roth, Karlsruhe
Hartmann Analytic,
Braunschweig
Hartmann Analytic,
Braunschweig
Hartmann Analytic,
Braunschweig
ICN, Eschwege
Sigma-Aldrich,
Steinheim
Sigma-Aldrich,
Steinheim
31
MATERIAL UND METHODEN
Weizen, nativ (S-5127)
Sigma-Aldrich,
Steinheim
Verbrauchsmaterial:
Cellophan
Filme (Hyperfilm)
Roth, Karlsruhe
Amersham Biosciences,
Freiburg
Maltoheptaose (immobilisiert an „Agarose-beads“) Sigma-Aldrich,
Steinheim
Ni-NTA (Nickel-Nitriltriessigsäure)
Qiagen, Hilden
Agarose-Resin
Nitrocellulose-Membran (Protran, 0,2 μm)
Schleicher & Schuell
Bioscience, Dassel
Nylon-Membran (NytranN, 0,2 μm)
Schleicher & Schuell
Bioscience, Dassel
Plastikpetrischalen
Sarstedt, Nümbrecht
PVPP (Polyvinylpolypyrrolidon)
Sigma-Aldrich,
Steinheim
Q-Sepharose Fast Flow
Amersham Biosciences,
Freiburg
Sephadex G-25
Amersham Biosciences,
Freiburg
Spritzen-Filter (0,45 μm)
Roth, Karlsruhe
Ultrafiltrations-Membran 10 kD (Amicon YM-10) Millipore, Bedford,
USA
Ultrafiltrations-Membran 10 kD (Ultrafree MC)
Millipore, Bedford,
USA
Ultrafiltrations-Membran 30 kD
Millipore, Bedford,
(Amicon Diaflo PM30)
USA
Western-Blot:
BCIP (5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat)
CAPS (3-[Cyclohexamino]-1-Propansulfonsäure)
Chemilumineszenz-Substrat der Alkalischen
Phosphatase (CDP-Star)
NBT (Nitroblau-Tetrazolium)
Roth, Karlsruhe
Sigma-Aldrich,
Steinheim
Roche, Mannheim
Roth, Karlsruhe
In dieser Arbeit wurde, wenn nicht anders angegeben, Reinstwasser
verwendet, das mit einer MilliQ Synthesis A10 Anlage (Millipore)
bereitet wurde.
32
MATERIAL UND METHODEN
2.2 Geräte
Digital Kamera und Image Reader
„LAS-1000“
Elektrophorese-System für Agarosegele
(horizontal) 140 x 140 mm
Elektroporationsgerät „EasyJecT Basic“
FPLC-Anlage „Pharmacia LKB"
Geltrocknungsrahmen
Gefriertrocknungsanlage
HPAEC-PAD Anlage „DX-600“
Hybridisierungsofen „Hybridizer
HB-1000“
MALDI-TOF Massenspektrometer
„Reflex II“
Mikroskop „Nikon Eclipse E600“
„Mini Protean III“ Elektrophorese-Zelle
(vertikal)
84 x 73 x 1,5 mm
Nylon-Netze
pH-Meter „Microprozessor pH 537“
Reaktionsgefäß-Mixer „Vortex Genie 2“
Rührwerk „RZR 2051“
Scanner „HP ScanJet 7400C“
Schüttelinkubator „Innova 4000“
Szintillationszähler „LS 6500“
Spektralphotometer „DU 7400“
Spektralphotometer „U 2000“
Sterilbank „UVF 6.15 S“
Thermocycler „PCR Sprint“
Thermomixer „compact“
Über-Kopf-Schüttler
Ultrafiltrationszelle Amicon
Ultraschall-Homogenisator „Sonoplus“
„Ultra-Turrax T25 basic“
Fuji, Düsseldorf
Biometra, Göttingen
Peqlab, Erlangen
Amersham Biosciences, Freiburg
Roth, Karlsruhe
Schrader, Friedland
DIONEX, Idstein
UVP Inc., Upland, USA
Bruker Daltonik, Bremen
Nikon, Düsseldorf
Bio-Rad, München
neoLab, Heidelberg
WTW, Weilheim
Scientific Industries, Bohemia,
USA
Heidolph, Schwabach
Hewlett-Packard, Palo Alto, USA
New Brunswick Scientific,
Nürtingen
Beckman Coulter, Fullerton,
USA
Beckman, München
Hitachi, Tokyo, Japan
BDK Luft- und Reinraumtechnik,
Sonnenbühl-Genkingen
Thermo Electron Corp.,
Waltham, USA
Eppendorf, Hamburg
Labinco, Breda, Niederlande
Millipore, Bedford, USA
Baudelin Electronic, Berlin
IKA-Werke, Staufen
33
MATERIAL UND METHODEN
Vakuumzentrifuge „Speed-Vac Plus SC
110 A“
Waagen „Sartorius Basic“
„Waring Blender 32BL80“
Wasserbad „GFL 1083“
Zentrifuge „Sigma 3K 30“ (Rotor 12156)
Zentrifuge „Sorvall RC 5B Plus“
(Rotoren GS-3 und HB-6)
Zentrifugen „Universal 30 RF“,
„EBA12“ und „EBA12R“
Savant, Farmingdale, USA
Sartorius, Göttingen
Waring, New Hartford, USA
GFL, Burgwedel
Sigma, Osterode
Beckman, München
Hettich, Tuttlingen
2.3 Medien
Alle Medien für die Anzucht von Escherichia coli (E. coli) wurden
hergestellt wie bei Sambrook et al. (1989) beschrieben. MS-Medium für
die Anzucht von Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) in Sterilkultur
(2.8.4) wurde angefertigt nach Murashige und Skoog (1962).
MS-Medium (1 L):
2,96 g MS-Salze
0,45 g MES
8 g Agar-Agar
pH 5,7 (mit KOH einstellen)
in 900 mL Wasser lösen, autoklavieren,
nach Abkühlen auf ca. 60 °C Zugabe von
100 mL 20 % Saccharose (steril)
2.4 Bakterienstämme
2.4.1
E. coli-Stämme
Library Efficiency Dh5D (Invitrogen)
Dieser Stamm wurde für Klonierungen und Subklonierungen sowie zur
Vektorvermehrung verwendet (Genotyp: F- )80dlacZ'M15 '[lacZYAargF] U169 recA1 endA1 hsdR17[rk-, mk+] phoA supE44 O- thi-1
gyrA96 relA1).
TOP 10 (Invitrogen)
Dieser Stamm wurde ebenfalls für Klonierungen und Subklonierungen
sowie zur Vektorvermehrung verwendet (Genotyp: F- mcrA '[mrr34
MATERIAL UND METHODEN
hsdRMS-mcrBC] )80lacZ'M15 'lacX74 deoR recA1 araD139 '[araleu]7697 galU galK rpsL [StrR] endA1 nupG).
BL21 Star (DE3) (Invitrogen)
Dieser Stamm wurde zur Expression rekombinanter Proteine verwendet
(Genotyp: F- ompT hsdSB [rB-mB-] gal dcm rne131 [DE3]).
2.4.2
Agrobacterium tumefaciens-Stamm
Agrobacterium tumefaciens GV3101 mit Helferplasmid pMP90 (Koncz
und Schell, 1986).
2.5 Antikörper
2.5.1
Primäre Antikörper
anti-GWD-Antikörper
Polyklonaler Antikörper aus Kaninchen, gerichtet gegen die gereinigte
GWD aus Solanum tuberosum (Kartoffel; Ritte et al., 2000b)
anti-AGPase-Antikörper:
Polyklonaler Antikörper aus Kaninchen, gerichtet gegen die gereinigte
rekombinante ADP-Glukose-Pyrophosphorylase (AGPase) aus Kartoffel
(Tiessen et al., 2002)
anti-PEPCase-Antikörper
Polyklonaler Antikörper aus Kaninchen, gerichtet gegen die gereinigte
Phosphoenolpyruvat-Carboxylase (PEPCase) aus Mohrenhirse (Sorghum
vulgare; Vidal et al., 1983)
anti-OK1-/ PWD-Antikörper
Polyklonaler Antikörper aus Kaninchen, gerichtet gegen das gereinigte
rekombinante OK1-/ PWD-Protein aus Arabidopsis (2.23)
35
MATERIAL UND METHODEN
2.5.2
Sekundäre Antikörperkonjugate
Anti-Kaninchen IgG-AP Anti-Kaninchen IgG-Alkalische Phosphatase
(AP)-Konjugat aus Ziege (Promega, Mannheim).
2.6 Plasmide
pART27
pDEST17
pET21d R1-tp
pGEM-T
pHANNIBAL
pSPECTRE
pSRN
(Gleave, 1992)
(Invitrogen)
(Ritte et al., 2000b)
(Promega)
(Wesley et al., 2001)
wurde von Ben Trevaskis (Commonwealth Scientific
and Industrial Research Organisation, Canberra,
Australien) bereitgestellt. In pSPECTRE wurde das
Pvu,/ Nru,-Fragment des Kanamycin-Resistenzgens von
pDONR201 (Invitrogen) durch das SpectinomycinResistenzgen ersetzt.
(Caddick et al., 1998; Salter et al., 1998)
2.7 Oligonukleotid-Primer
Alle Oligonukleotide wurden von der Firma Metabion (Martinsried)
angefertigt und waren von HPLC-Reinheit. Unten sind die
Nukleotidsequenzen sowie, wenn vorhanden, Restriktionsschnittstellen
oder attB-Rekombinationsstellen (2.10.2.1) als unterstrichene
Sequenzbereiche angegeben. Die Namen der Restriktionsendonukleasen
(RE), die spezifisch für die unterstrichenen Bereiche sind, und die
Bezeichnung der attB-Bereiche sind ebenfalls aufgeführt. Die relative
Lage der Oligonukleotid-Primer auf dem OK1-Genlokus At5g26570
beziehungsweise auf der T-DNA einer später beschriebenen
Insertionslinie (2.9.8, 3.5.1) ist im Anhang dargestellt (9.1).
36
MATERIAL UND METHODEN
Name des
Primers
OK1-rev1
OK1-rev2
OK1-fdw2
OK1-Entry-B1
Nukleotidsequenz (5’ĺ3’)
GACTCAACCACATAACACACAAAGATC
TGGTAACGAGGCAAATGCAGA
ATCTCTTATCACACCACCTCCAATG
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCGA
GAGCATTGGCAGCCATTG
OK1-Entry-B2 GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTAC
AGAGGTTGTGGCCTTGAC
OK1-R1a-fw
TCCGATGGATCCAGCAACTTCTGGTGGTCCTAT
OK1-R1a-re
TTGCGCATCGATGGTCGCACTGGATTTGGAAG
OK1-R1b-fw TCCGATCTCGAGACTAGTCCAGCAACTTCTGGT
GGTCCT
OK1-R1b-re
TTGCGCGGTACCGGTCGCACTGGATTTGGAA
OK1-ko-LP
CGCCACAAAAGGAGAAATGTTG
OK1-ko-RP
TGCGTGCTCGATCAAGAGTTG
LB-pROK2
GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT
RE/
attB
-
attB1
attB2
BamHΙ
ClaΙ
XhoΙ/
SpeΙ
KpnΙ
-
2.8 Pflanzenmaterial und Anzuchtbedingungen
2.8.1
Pflanzenmaterial
Es wurden Samen des Arabidopsis thaliana-Ökotyps Columbia (Col-0)
verwendet. Dieser Ökotyp wird in der vorliegenden Arbeit als Wildtyp
(WT) oder Col-0 bezeichnet. Ferner wurden Samen der T-DNAInsertionsmutante SALK 110814 verwendet, die vom Nottingham
Arabidopsis Stock Centre (NASC, Nottingham, England) zur Verfügung
gestellt wurden. Die Arabidopsis-Mutanten sex1-1 und sex1-3 (Yu et al.,
2001) wurden freundlicherweise von Dr. Samuel C. Zeeman (Universität
Bern, Schweiz) zur Verfügung gestellt.
2.8.2
Anzucht von Arabidopsis thaliana auf Erde
Die Anzucht von Arabidopsis-Pflanzen erfolgte, wenn nicht anders
angegeben, in einer Klimakammer mit einer Lichtperiode von 12 h (ca.
150 μmol Lichtquanten·m-2·s-1) und einer Dunkelperiode von 12 h. Die
Temperatur betrug 20 °C in der Licht- und 16 °C in der Dunkelphase,
mit einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 % am Tag und 70 % in der
Nacht. Als Substrat diente GS 90 Erde (Einheitserde Werksverband,
Sinntal-Jossa), die gesiebt und mit etwa ¼ Gewichtsanteil Vermiculite
37
MATERIAL UND METHODEN
(Vermiculite Dämmstoffe, Sprockhövel) gemischt wurde. Etwa zwei
Wochen nach Auslegen der Samen wurden die Keimlinge pikiert und
entweder einzeln in Töpfen mit 6 cm Durchmesser oder zu vier Pflanzen
in einem Topf mit 12 cm Durchmesser weiter kultiviert.
Transformierte Arabidopsis-Pflanzen wurden in einem Gewächshaus
mit 16 h Licht und 8 h Dunkelheit kultiviert. Die relative
Luftfeuchtigkeit bzw. Temperatur betrug 50 % beziehungsweise 20 °C
am Tag und 80 % beziehungsweise 18 °C in der Nacht. Nach der
Infiltration wurden die Pflanzen noch etwa zwei Wochen normal
gegossen. Danach wurden die Blütenstände in Papiertüten gesteckt und
die Pflanzen noch für zwei Wochen feucht gehalten. Nach etwa zwei
weiteren Wochen ohne Gießen konnten die Samen geerntet werden.
2.8.3
Oberflächensterilisierung von Samen
Um Arabidopsis-Keimlinge in Sterilkultur anziehen zu können, musste
die Oberfläche der Samen zuvor sterilisiert werden. Dazu wurden etwa
400 mg Samen von transformierten Pflanzen (T0) zunächst 3 min in
10 mL 70 % [v/v] Ethanol in einem 15 mL-Schraubdeckelgefäß im
Über-Kopf-Schüttler inkubiert. Die nachfolgenden Schritte wurden unter
der Sterilbank durchgeführt. Die Samen wurden 20 min in 10 mL 2,6 %
[w/v] Natriumhypochlorit (1:5-Verdünnung einer 13 % [w/v] NaHypochlorit-Lösung mit Wasser) mit 10 Tropfen Triton X-100 aus einer
1 mL-Pipettenspitze ebenfalls im Über-Kopf-Schüttler sterilisiert. Nach
drei bis vier Waschschritten mit sterilem Wasser, jeweils etwa 5 min,
wurden die Samen auf sterilem Filterpapier ausgelegt und getrocknet.
Die Samen wurden nach dem Trocknen entweder sofort für die
Sterilkultur verwendet oder bei 4 °C bis zu einer Woche gelagert.
Diese Bedingungen wurden für die Oberflächensterilisation von Samen
ab der T1-Generation wie folgt geändert: etwa 10 mg Samen in 1 mL
Ethanol, 1 mL 2,6 % [w/v] Na-Hypochlorit mit 1 Tropfen Triton X-100
aus einer 1 mL Pipettenspitze, drei- bis viermal 1 mL Wasser.
38
MATERIAL UND METHODEN
2.8.4
Anzucht von Arabidopsis thaliana in Sterilkultur
Die Selektion von transgenen Arabidopsis-Pflanzen erfolgte in
Sterilkultur. Dazu wurden die sterilisierten Samen (2.8.3) auf sterilem
MS-Medium ausgelegt, das das für die Selektion erforderliche
Antibiotikum enthielt. Wenn T0-Samen in Sterilkultur angezogen werden
sollten, enthielt das Medium zusätzlich Cefotaxim (250 μg/mL) um das
Wachstum der Agrobakterien zu verhindern. Zur Stratifizierung wurden
die Platten drei Tage lang nachts zu 4 °C ins Dunkel und tagsüber in die
Klimakammer gestellt. Resistente, das heißt grüne Keimlinge wurden
nach etwa zwei Wochen in Töpfe auf Erde umgesetzt und in
Abwesenheit des Antibiotikums weiter kultiviert.
2.9 Molekularbiologische Standardmethoden
Methoden, wie die Isolierung von Plasmid-DNA in kleinem Maßstab
(Miniprep), Restriktionsverdaus, Auftrennen von DNA- und RNAFragmenten in Agarosegelen und Ligationen von DNA-Fragmenten in
Vektoren wurden wie bei Sambrook et al. (1989) beschrieben
durchgeführt. Für die Isolierung größerer Mengen Plasmid-DNA
(Midiprep) wurde ein Kit verwendet (PerfectPrep Plasmid Midi,
Eppendorf, Hamburg). Das „NucleoSpin Extract“-Kit (Macherey &
Nagel) wurde für die Elution von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
und zur Reinigung von PCR-Fragmenten benutzt. DNASequenzierungen wurden von der Firma AGOWA (Berlin) durchgeführt;
es wurde sowohl der Sense- als auch der Antisense-Strang sequenziert.
2.9.1
2.9.1.1
Anzucht von Bakterien
Anzucht von Escherichia coli
E. coli-Zellen wurden auf LB-Agar-Platten mit dem für das Plasmid
selektiven Antibiotikum ausplattiert und bei 37 °C über Nacht inkubiert.
Die Platten konnten anschließend für zwei bis drei Wochen bei 4 °C
aufbewahrt werden. Zum Erstellen von über-Nacht-Kulturen
transformierter E. coli wurden 3 mL LB-Flüssigmedium mit dem
entsprechenden Antibiotikum mit einer Einzelkolonie beimpft und über
Nacht bei 37 °C unter Schütteln inkubiert (350 U/min).
39
MATERIAL UND METHODEN
2.9.1.2
Anzucht von Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens GV3101 (pMP90)-Zellen wurden auf
YEB-Agar-Platten mit den Antibiotika Rifampicin (100 μg/mL) und
Gentamycin (25 μg/mL) ausgestrichen und drei bis vier Tage bei 28 °C
inkubiert. Enthielten die Agrobakterien zur Pflanzentransformation einen
binären Vektor wurde das entsprechende Antibiotikum zur Selektion
zugesetzt.
Agrobakterien-Flüssigkulturen
wurden
in
YEBFlüssigmedium mit denselben Antibiotika wie in den Agar-Platten
angelegt und bei 28 °C unter Schütteln (190 U/min) inkubiert.
2.9.2
2.9.2.1
Herstellung von kompetenten Bakterien
Herstellung von kompetenten E. coli
Auf 37 °C vorgewärmtes 2x YT-Flüssigmedium (1 L) wurde mit 2 mL
einer frischen E. coli-Kultur beimpft. Dieser Ansatz wurde bei 37 °C im
Schüttelinkubator (350 U/min) inkubiert, bis eine optische Dichte bei
600 nm (OD600) von 0,5 bis 0,6 erreicht war. Die Kultur wurde 30 min
auf Eis abgekühlt. Die Zellen wurden anschließend durch Zentrifugation
bei 3.500 U/min und 4 °C pelletiert (Sorvall RC 5B Plus, Rotor: GS-3).
Alle weiteren Schritte fanden auf Eis statt. Der Überstand wurde
dekantiert und das Pellet zweimal mit insgesamt 1,5 L eisgekühltem
Wasser gewaschen. Anschließend wurde das Pellet in 40 mL 10 % [v/v]
Glycerin gewaschen (Zentrifugation: 15 min, 5.800 U/min, 4 °C). Die
Bakterien wurden in 2 mL 10 % [v/v] Glycerin resuspendiert und in
Aliquots von 50 μL aufgeteilt. Diese wurden sofort entweder zur
Transformation eingesetzt oder in flüssigem Stickstoff schockgefroren
und bei –80 °C gelagert.
2.9.2.2
Herstellung von kompetenten
Agrobacterium tumefaciens
Zur Herstellung von kompetenten Zellen von Agrobacterium
tumefaciens (A. tumefaciens) wurde das für E. coli beschriebene
Protokoll leicht modifiziert. A. tumefaciens-Zellen wurden in YEBFlüssigmedium angezogen; die Temperatur lag bei 28 °C, und es wurde
weniger intensiv geschüttelt (190 U/min). Ausplattiert wurden die Zellen
auf YEB-Agar-Platten. Die Medien enthielten sowohl das entsprechende
Antibiotikum zur Selektion des binären Vektors als auch die für die
40
MATERIAL UND METHODEN
Erhaltung von A. tumefaciens GV3101 (pMP90) benötigten Antibiotika
Rifampicin (100 μg/mL) und Gentamycin (25 μg/mL).
2.9.3
2.9.3.1
Transformation von Bakterien
Transformation von E. coli
Ein 50 μL-Aliquot kompetenter Zellen wurde entweder frisch
verwendet oder auf Eis aufgetaut. Den Zellen wurde 0,4 μL eines
Ligationsansatzes (bzw. ca. 1 ng Plasmid-DNA) zugegeben und mit der
Pipettenspitze gemischt. Der Ansatz wurde in eine vorgekühlte
Elektroporationsküvette überführt. Die Aufnahme von Plasmid-DNA
erfolgte in einem Elektroporator (EasyJecT Basic, Peqlab) durch
Anlegen eines elektrischen Feldes an der Küvette nach Angaben des
Herstellers. Anschließend wurden die Zellen sofort in 1 mL SOCFlüssigmedium ohne Antibiotika aufgenommen und für 1 h bei 37 °C
inkubiert. Danach wurden verschiedene Verdünnungen der
Zellsuspension auf LB-Agar-Platten mit den entsprechenden Antibiotika
ausgestrichen, unter der Sterilbank angetrocknet und über Nacht bei
37 °C inkubiert.
2.9.3.2
Transformation von Agrobacterium tumefaciens
Die Elektroporation von Agrobacterium tumefaciens erfolgte wie für
E. coli. Die Zellen wurden jedoch nach der Elektroporation in 1 mL
YEB-Flüssigmedium ohne Antibiotika aufgenommen und 3 h bei 28 °C
inkubiert (190 U/min). Anschließend wurden die Zellen pelletiert und in
200 μL YEB-Flüssigmedium ohne Antibiotika resuspendiert.
Unterschiedliche Volumina (10-200 μL) der Supension wurden
ausgestrichen auf YEB-Agar-Platten mit den entsprechenden Antibiotika
für den binären Vektor sowie Rifampicin (100 μg/mL) und Gentamycin
(25 μg/mL). Nach drei bis vier Tagen Inkubation bei 28 °C konnten
einzelne Kolonien großflächig auf neue YEB-Agar-Platten mit den
entsprechenden Antibiotika ausgestrichen werden, die dann nach
weiteren drei Tagen Inkubation (28 °C) einige Tage bei 4 °C gelagert
werden konnten.
41
MATERIAL UND METHODEN
2.9.4
Lagerung von Bakterien
Agar-Platten mit Bakterien-Kulturen wurden bis zu vier Tage
(Agrobacterium tumefaciens), bzw. bis zu drei Wochen (E. coli) bei 4 °C
gelagert.
Zur langfristigen Lagerung von Bakterienstämmen und transformierten
Bakterien wurden Glycerin-Langzeitkulturen angelegt. Hierzu wurden
500 μL einer Bakterien-Kultur im gleichen Volumen 50 % [v/v]
Glycerin aufgenommen, gemischt und in flüssigem Stickstoff
schockgefroren. Die Kulturen konnten bei –80 °C über mehrere Jahre
gelagert werden.
2.9.5
Isolierung von genomischer DNA aus Blättern
CTAB-Puffer:
0,8 % [v/v]
0,14 M
0,22 M
22 mM
0,8 M
1 % [w/v]
frisch zusetzen: 0,4 % [v/v]
CTAB
Sorbitol
Tris-HCl, pH 8,0
EDTA
NaCl
N-Lauroylsarcosin
2-Mercaptoethanol
Die Isolierung von genomischer DNA aus Blättern wurde modifiziert
nach Rogers und Bendich (1988) durchgeführt. Arabidopsis-Blattmaterial wurde direkt nach der Ernte in flüssigem Stickstoff eingefroren
und in einem Mörser homogenisiert. Ca. 50 mg des homogenisierten
Materials wurden in 1,5 mL Reaktionsgefäße gegeben. Nach Zugabe von
0,2 mL CTAB-Puffer wurde die Suspension gemischt und 30 min bei
65 °C inkubiert. Anschließend wurden 0,4 mL mit TE-Puffer (Sambrook
et al., 1989) gesättigtes Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Gemisch
(25:24:1; Roth) zugegeben, gemischt und 5 min in der Tischzentrifuge
bei 12.000 U/min zentrifugiert. Danach wurde die obere Phase, die die
genomische DNA enthält, in ein neues Reaktionsgefäß überführt und mit
1/10 Volumenanteil 3 M Natriumacetat und 0,7 Volumenanteilen Isopropanol versetzt. Es wurde vorsichtig gemischt und 30 min auf Eis
inkubiert. Die DNA wurde durch zehnminütige Zentrifugation (12.000
U/min) sedimentiert, zweimal mit 70 % [v/v] Ethanol gewaschen und bei
Raumtemperatur getrocknet. Anschließend wurde die DNA in 20-50 μL
Wasser aufgenommen, das 4 U RNase A/mL enthielt.
42
MATERIAL UND METHODEN
2.9.6
Isolierung von RNA aus Blättern
Guanidinium-Puffer:
8 M Guanidiniumhydrochlorid
20 mM MES
20 mM EDTA
pH 7,0 (mit KOH einstellen)
frisch zusetzen:
1/100 Vol. 2-Mercaptoethanol
DEPC-Wasser:
1 mg Diethylpyrocarbonat (DEPC)
1 L Wasser
12-16 h bei Raumtemperatur inkubieren, danach
autoklavieren
Die Isolierung von RNA aus Blattmaterial erfolgte nach der Guanidiniumchlorid-Methode von Logemann et al. (1987). Zunächst wurden
die in flüssigem Stickstoff gefrorenen Blattproben im Mörser homogenisiert und ca. 200 mg des Homogenats in 1,5 mL Reaktionsgefäße gegeben. Das gefrorene Blattmaterial wurde weitere 20 s homogenisiert mit
einem konischen, genau in das Reaktionsgefäß passenden Mikrohomogenisator, der an ein mechanisches Rührwerk (Heidolph) angeschlossen
ist. Nach Zugabe von 400 μL Guanidinium-Puffer wurde gemischt und
noch einmal 20 s mit dem Mikrohomogenisator behandelt. Danach
wurde 600 μL eiskaltes wassergesättigtes Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol-Gemisch (25:24:1; Roth) zugegeben, gründlich gemischt und
45 min bei 13.000 U/min in einer EBA12R-Tischzentrifuge bei 4 °C
zentrifugiert. Die obere, wässrige Phase wurde danach abgenommen und
in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Nach Zugabe von 0,7 Volumen
Ethanol und 0,2 Volumen 1 M Essigsäure wurde gemischt und die RNA
1 h bei -20 °C präzipitiert. Das nach Zentrifugation (15 min, 4 °C,
13.000 U/min) erhaltene Pellet wurde zweimal mit 200 μL 3 M Natriumacetat und zweimal mit 500 μL 70 % [v/v] Ethanol gewaschen (Zentrifugation wie oben). Nach Trocknung in der Vakuumzentrifuge wurde die
RNA in 30 μL DEPC-Wasser aufgenommen.
Falls die RNA-Präparation anschließend für eine RT-PCR verwendet
werden sollte, schloss sich eine DNase-Behandlung an. Dazu wurden
50 μg RNA mit 5 μL 10x DNase-Puffer und 1 μL DNase , (Roche)
versetzt, mit DEPC-Wasser auf 50 μL gebracht und 1 h bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde 2 μL Reagenz zur Inaktivierung der DNase ,
(Roche) zugegeben, gemischt, 2 min bei Raumtemperatur inkubiert,
43
MATERIAL UND METHODEN
1 min zentrifugiert und der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß
gegeben. Die DNA-freie RNA wurde sofort für RT-PCR eingesetzt.
2.9.7
Transformation von Arabidopsis thaliana
Die Agrobakterien vermittelte Transformation von ArabidopsisInfloreszenzen erfolgte nach der “Floral-Dip” Methode von Clough und
Bent (1998). Der Vektor, mit dem die Pflanze transformiert werden
sollte, wurde durch Elektroporation in Agrobacterium tumefaciens
GV3101 (pMP90) gebracht. Eine 1 L-Hauptkultur wurde beimpft mit
10 mL einer Vorkultur der Agrobakterien, die das Plasmid enthielten und
über Nacht inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation
sedimentiert und in 1 L Infiltrationsmedium resuspendiert.
Infiltrationsmedium:
50 g/L
2,2 g/L
0,5 g/L
10 μL/L
Saccharose
MS-Salze
MES
6-Benzylaminopurin (1 % [w/v] in
H2O)
pH 5,7 – 5,8 (mit 1M KOH einstellen)
Das Medium wurde frisch angesetzt und nicht
autoklaviert
Für die Transformation von Pflanzen wurden je neun Keimlinge in
einen Topf mit 12 cm Durchmesser pikiert und bis zur Blüte angezogen.
Die ersten Infloreszenzen wurden entfernt, um das Wachstum von
mehreren sekundären Blütenstielen zu induzieren. Etwa eine Woche
später konnten die Pflanzen dann zur Infiltration eingesetzt werden. Für
jedes zu transformierende Konstrukt wurden 4 Töpfe zu neun Pflanzen
benötigt.
Die Agrobakterien-Suspension wurde direkt vor der Infiltration noch
einmal mit frischem Infiltrationsmedium verdünnt (300 mL Suspension
+ 150 mL Medium) und in ein Weckglas gefüllt. Diese 450 mL waren
ausreichend für die Transformation von zwei Töpfen zu neun Pflanzen.
Zur Infiltration wurden die Infloreszenzen kurz in die AgrobakterienSuspension eingetaucht, dann über Nacht unter einer Haube in der
Klimakammer aufbewahrt und am nächsten Tag in das Gewächshaus
überführt. Nach 14 Tagen wurden den Pflanzen Tüten zum Auffangen
der Samen übergestülpt, nach weiteren 14 Tagen wurde das Gießen
eingestellt und etwa weitere zwei Wochen später wurden die Samen
44
MATERIAL UND METHODEN
geerntet. Abgesehen von der Anzucht der Agrobakterien wurden alle
folgenden Arbeitsschritte bis zur Ernte der Samen von den Gärtnern des
Max-Planck-Institutes für Molekulare Pflanzenphysiologie in Golm
(MPI Golm) durchgeführt.
Die Selektion der transgenen Arabidopsis-Pflanzen auf die durch die
Agrobakterien vermittelte Transformation eingebrachte AntibiotikumsResistenz erfolgte nach Oberfächensterilisierung der Samen (2.8.3) in
Sterilkultur (2.8.4).
2.9.8
„Screening“ nach homozygoten
T-DNA-Insertionslinien
PCR-Ansatz (20 μL):
PCR-Programm:
1 μL genomische DNA
2 μL 10x Expand High Fidelity Taq-Puffer
(Roche)
2 μL dNTP-Mix (2,5 mM)
0,5 μL 5’-Primer OK1-ko-LP (10 μM)
0,5 μL 3’-Primer OK1-ko-RP (10 μM)
0,5 μL Primer LB-pROK2 (10 μM)
1 μL Taq-Polymerase (Roche)
12,5 μL Wasser
Dauer
Schritt Temperatur
95 °C
5 min
1)
94 °C
30 s
2)
62 °C
30 s
3)
72 °C
30 s
4)
2) - 4) wurden 9x wiederholt und dabei in 3) die
Temperatur jeweils um 0,67 °C erniedrigt
94 °C
30 s
5)
56 °C
30 s
6)
72 °C
30 s
7)
5)-7) wurden 19x wiederholt
4 °C
halten
8)
Das „Screening“ nach Pflanzen, die bezüglich der T-DNA-Insertion
homozygot waren, erfolgte nach einem auf der SIGnAL-Homepage
(http://signal.salk.edu/tdnaprimers.html) angegebenen Protokoll. Aus
Blättern von Pflanzen mit einer T-DNA-Insertion (SALK 110814) wurde
nach 2.9.5 die genomische DNA extrahiert. 1 μL davon wurde als
45
MATERIAL UND METHODEN
Template für eine PCR eingesetzt (Ansatz und Programm s. oben). Die
Primer wurden mit dem auf der SIGnAL-Homepage (s. o.) zugänglichen
„SALK T-DNA verification primer design“ Programm ausgewählt. Die
relative Lage der Primer auf dem OK1-Genlokus At5g26570 beziehungsweise der inserierten T-DNA ist im Anhang dargestellt (9.1).
Die Ansätze wurden nach der PCR über eine Agarosegelelektrophorese
(2.9) getrennt. Homozygote Linien zeigten eine einzige Bande von etwa
500 bp. Bei WT-DNA war eine Bande von 900 bp zu sehen und Proben
von heterozygoten Linien zeigten beide Banden.
2.10 Klonierungen
2.10.1 Klonierung der OK1-cDNA
Für die Klonierung der OK1-cDNA (At5g26570) wurde zunächst
Gesamt-RNA aus Arabidopsis Col-0 Blättern isoliert (2.9.5). Das Blattmaterial wurde am Ende der Lichtperiode geerntet; die Pflanzen waren
im Stadium der beginnenden Blüte. Mehrere Rosettenblätter wurden
sofort nach der Ernte in flüssigem Stickstoff eingefroren und im Mörser
homogenisiert.
Zur Synthese des cDNA-Erststranges wurde das SuperScript FirstStrand Synthesis System von Invitrogen verwendet. Als Primer diente
OK1-rev1, der 248 bp hinter dem Stop-Codon in der 3’-untranslatierten
Region von OK1 bindet. Das Protokoll des Herstellers wurde wie folgt
geändert:
Synthese des cDNA-Erststranges:
3 μL RNA (DNA-frei); 1 μg/μL
1 μL 3’-Primer OK1-rev1 (5 μM)
1 μL dNTP-Mix (10 mM)
7 μL DEPC-Wasser
ĺ 5 min 75 °C, dann kurz auf Eis
+ 4 μL 5x First-Strand Buffer
+ 1 μL RNase Inhibitor
+ 2 μL 0,1 M DTT
ĺ 2 min 42 °C
+ 1 μL SuperScript Reverse Transkriptase
ĺ 50 min 42 °C, dann auf Eis
46
MATERIAL UND METHODEN
Für die nachfolgende PCR zur cDNA-Synthese wurde 1/20 dieses
Ansatzes als Matrize verwendet, der Rest wurde bei -20 °C gelagert.
PCR-Ansatz (50 μL):
1 μL cDNA-Erststrang
5 μL 10x Expand High Fidelity Taq-Puffer (Roche)
4 μL dNTP-Mix (2,5 mM)
1,25 μL 5’-Primer OK1fwd2 (10 μM)
1,25 μL 3’-Primer OK1-rev2 (10 μM)
1 μL Expand High Fidelity Taq-Polymerase (Roche)
36,5 μL Wasser
PCR-Programm:
Schritt Temperatur Dauer
1)
95 °C
2 min
2)
94 °C
20 s
3)
62 °C
30 s
4)
68 °C
4 min
2)-4) wurden 9 mal wiederholt und dabei in 3) die Temperatur jeweils um
0,67 °C erniedrigt
5)
94 °C
20 s
6)
56 °C
30 s
7)
68 °C
4 min
5)-7) wurden 24 mal wiederholt und dabei in 7) die Zeit jeweils um 5 s
verlängert
8)
68 °C
10 min
9)
4 °C
halten
Die Primer OK1-fwd2 und OK1-rev2 wurden so gewählt, dass die
komplette kodierende Sequenz von OK1 inklusive 22 bp des untranslatierten 5’-Bereiches vor dem Start-Codon und 69 bp des untranslatierten
3’-Bereiches nach dem Stop-Codon mit amplifiziert wurden. Das resultierende 3.682 bp große PCR Fragment wurde nach einer Agarose-Gelelektrophorese aus dem Gel eluiert (2.9) und in den T/A-Klonierungsvektor pGEM-T (Promega) ligiert. Der so erhaltene Vektor mit der OK1
cDNA wurde OK1-pGEM-T-1 genannt.
Die Sequenzierung von OK1-pGEM-T-1 ergab eine 777 bp große
Insertionssequenz (IS1) von E. coli im 5’-Bereich der OK1 cDNA
(540 bp). Daher wurde eine weitere PCR mit dem cDNA-Erststrang als
Matrize durchgeführt. Das Produkt wurde wie oben beschrieben in den
47
MATERIAL UND METHODEN
Vektor pGEM-T ligiert, wodurch OK1-pGEM-T-2 erhalten wurde. Die
Sequenzierung ergab, dass OK1-pGEM-T-2 verglichen mit der
genomischen Sequenz von At5g26570 vier Basensubstitutionen aufwies
(G207ĺA, C1116ĺG, A2352ĺG, T2561ĺG). Drei dieser
Substitutionen (G207ĺA, C1116ĺG, A2352ĺG) haben keine
Auswirkungen auf die abgeleitete Aminosäure-Sequenz. Eine dieser
Substitutionen (T2561ĺG) ergibt jedoch in der abgeleiteten
Aminosäure-Sequenz einen Aminosäure-Austausch (Leu854ĺArg).
Um diesen Aminosäure-Austausch zu vermeiden, wurde ein 1.081 bp
großes EcoR,BamH,-Fragment (Basen 1.956-3.037 der OK1-cDNA)
von OK1-pGEM-T-2 durch das korrespondierende Fragment aus OK1pGEM-T-1 ersetzt, welches keinen Basenaustausch enthielt. Durch
Sequenzierung wurde bestätigt, dass der resultierende Vektor OK1pGEM-T lediglich die beiden Substitutionen G207ĺA und C1.116ĺG
besitzt, die auf die abgeleitete Aminosäure-Sequenz keinen Einfluss
haben.
2.10.2 Der OK1-Expressionsvektor
2.10.2.1 Die Gateway-Technologie
Der OK1 Expressionsvektor OK1-pDEST17 wurde mit Hilfe der
Gateway-Technologie (Invitrogen) konstruiert. Die Gateway-Technologie beruht auf dem ortsspezifischen Rekombinationssystem des Bakteriophagen O (Bushman et al., 1985; Landy, 1989; Ptashne, 1992). Dieses
Rekombinationssystem wird dazu genutzt, den Transfer von heterologen
Nukleotid-Sequenzen, die von modifizierten attB-DNA-Bereichen
flankiert sind, zwischen Vektoren zu erleichtern (Hartley et al., 2000).
Zwei Reaktionen finden in der Gateway-Technologie Anwendung, die
als BP und LR bezeichnet werden. In der BP-Reaktion erfolgt eine
homologe Rekombination zwischen attB-DNA-Segmenten, die in einer
PCR an die 5’- und 3’-Enden des gewünschten Gens angefügt werden,
und attP-DNA-Bereichen in dem so genannten Donor-Plasmid. So
entsteht der „Entry Clone“, bei dem die heterologe DNA von attLRekombinationsstellen flankiert ist. Der Expressionsvektor wird dann
aus der LR-Reaktion durch homologe Rekombination zwischen den
attL-Rekombinationsstellen des „Entry Clones“ und den attR-DNASegmenten des Zielvektors erhalten. Katalysiert werden beide Reaktionen durch die vom Hersteller mitgelieferten Enzymmischungen BP48
MATERIAL UND METHODEN
und LR-Clonase. BP-Clonase enthält die Bakteriophage O Integrase (Int)
und den E. coli Integration Host Factor (IHF). LR-Clonase beinhaltet
neben Int und IHF noch die Bakteriophage O Excisionase T.
Die Selektion auf erfolgreiche homologe Rekombination erfolgt sowohl
positiv als auch negativ. Das ccdB-Gen, welches in Donor- und Zielvektor von att-Rekombinationsstellen umgeben ist, erlaubt negative
Selektion dieser Vektoren in E. coli nach Rekombination und Transformation. Das CcdB-Protein interagiert mit der E. coli DNA-Gyrase
(Bernard und Couturier, 1992) und inhibiert so das Wachstum der
meisten E. coli-Stämme (zum Beispiel TOP 10 und Library Efficiency
Dh5D). Da bei erfolgreicher homologer Rekombination das ccdB-Gen
durch das erwünschte Gen (zum Beispiel OK1) ersetzt wird, können nur
die Zellen wachsen, die nach der Transformation das gewünschte Gen
enthalten. Zusätzlich besitzen die beiden Vektoren pSPECTRE und
pDEST17 jeweils die Nukleotidsequenz für ein Protein, das eine Antibiotikumsresistenz verleiht. Die E-Lactamase von pDEST17 erlaubt
Wachstum auf Nährmedium mit Ampicillin. Das aadA-Gen von
pSPECTRE kodiert für eine Aminoglykosid-Adenylyltransferase, die
Resistenz gegenüber Spectinomycin und Streptomycin verleiht. Somit ist
durch positive Selektion die Anwesenheit der Plasmide gewährleistet.
2.10.2.2 Die Konstruktion des Expressionsvektors
OK1-pDEST17
Für die heterologe Expression des rekombinanten OK1-Proteins in E.
coli wurde die OK1-cDNA mit Hilfe des Gateway-Systems in das Zielplasmid pDEST17 (Invitrogen) überführt. Der entstandene Expressionsvektor OK1-pDEST17 erlaubt die Expression von rekombinantem OK1Protein unter der Kontrolle des T7-Promotors des Bakteriophagen T7.
Zur Erleichterung der Reinigung des rekombinanten OK1-Proteins
enthält der Vektor die kodierende Basensequenz für ein N-terminales
6xHis-Tag.
Zunächst wurden der OK1-cDNA in einer PCR die attB-Rekombinationsstellen an 5’- und 3’-Ende angefügt. Die Reaktionsbedingungen
entsprachen dabei den unter 2.10.1 angegebenen mit der Änderung, dass
die Schritte fünf bis sieben nur 19x wiederholt wurden. Der Reaktionsansatz ist unten dargestellt. Das PCR-Produkt wurde elektrophoretisch
über ein Agarosegel aufgetrennt und daraus eluiert (2.9).
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