Arabidopsis thaliana
Werbung
Tutorium: Bitte Terminwünsche an Marcel Tillmann mailen: mtillmann(et)gmx.net oder Nacharbeiten der Themen mit Mitgliedern der Arbeitsgruppe: Mo, 18:00 Uhr, ab dem 7.1.2008, großer Seminarraum Modellorganismen • Mikroorganismen: – Escherichia coli – Hefe • Tiere – Drosophila melanogaster – Caenorhabditis elegans – Maus • Pflanze – Arabidopsis thaliana The Arabidopsis 2010 Project • International abgestimmtes Projekt – „ A blueprint for understanding how plants are built and how to improve them“ – Genaues Verständnis von Entwicklungs- und Stoffwechselvorgängen, Anwendung in der Landwirtschaft – Aufklärung des Zusammenspiels aller Proteine • Wann werden sie wo gebildet? • Welche Funktion haben sie? • Wie üben sie diese Funktion aus? Arabidopsis thaliana • Familie der Brassicaceen • Vorkommen in Europa, Afrika, Zentralasien, China, Korea, und Japan. In die USA und Australien sind die Populationen später eingeführt worden. • Verschiedene „Ökotypen“ sind an die verschiedensten klimatischen Bedingungen (Wasserverfügbarkeit, Temperaturen) angepasst. Vorteile (1) • Eines der kleinsten Genome im Pflanzenreich: – 115,409,949 (1,15 x 108) bp auf 5 Chromosomen verteilt (2n = 10). – Wenig „nicht-kodierende“ DNA, die meisten Bereich kodieren für die 25,498 Gene • Das Mais Genom enthält 20mal mehr DNA (2.4 x 109 bp), hat aber keinen Bedarf für 20x mehr Gene. 50% des Genoms besteht aus Retrotransposons. • Der Großteil der 2.5 x 1011 bp des Genoms von Psilotum nudum ist "junk" DNA. wurde vollständig sequenziert Vorteile (2) • Kurze Generationszeit (6 Wochen) • Geringe Größe • Viele Samen • Selbstbestäubend Vorteil für genetische Arbeiten: Auffinden von Mutanten Kartierung von Mutanten Forward genetics Erhöhung der Mutationsrate durch chemische Behandlung oder Bestrahlung der Samen. Vom Phänotyp zum Genotyp Wildtyp Mutante • Welches Gen (welches Protein) ist für den Phänotyp verantwortlich? • Durch Kreuzungsexperimente kann kartiert werden, ob die Mutation in der Nähe eines bekannten Genorts liegt (KoSegregation). Kartierung mit molekularen Markern Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus Ökotyp: Columbia 6 000 bp 4 000 bp Ökotyp: Landsberg 10 000 bp Kartierung mit molekularen Markern Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus Gen, das zur Resistenz beiträgt Columbia 6 000 bp 4 000 bp Landsberg 10 000 bp Mutagenese: Auffinden suszeptibler Pflanzen Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus Genlocus in Mutanten defekt, homozygote Pflanzen sind suszeptibel. Columbia/Mutante X 6 000 bp 4 000 bp Landsberg 10 000 bp Kreuzungen zwischen der Mutante und Landsberg: wie häufig bekommt man Nachkommen, in denen die Resistenz mit dem Auftreten des 10 000 bp Fragments vorkommt? Nachweis des Polymorphismus Col 6 000 bp 4 000 bp 2 Fragmente Ler 10 000 bp Cleaved amplified polymorphic sequences CAPS 1 Fragment Mut. Ler. Col. F1 E (6000 + 4000) r x Crossover in der Meiose e (10 000) R x Häufig, Kombination der Resistenz mit dem 10 000 bp Fragment bleibt in den meisten Nachkommen erhalten x Seltener, Neukombination der Resistenz mit den Fragmenten (6000 bp und 4000 bp). Vorteile (2) • Kurze Generationszeit (6 Wochen) • Geringe Größe • Viele Samen • Selbstbestäubend Gentransfer möglich • z.B. Wichtig z.B. für Komplementationsexperimente Lebenszyklus von Agrobacterium tumefaciens Infektionen mit Agrobacterium tumefaciens führen zu Tumoren • • Tumoren wachsen auch in Abwesenheit der Bakterien weiter Tumorzellen enthalten einen Teil der Agrobacterium tumefaciens DNA. Gentransfer in der Natur Agrobacterium tumefaciens Infektionen führen zur Synthese von Pflanzenhormonen in den infizierten Zellen Cytokinin Auxin Die T-DNA kodiert für Onkogene Tumor mit Sprossen Tumor mit Wurzeln Das Ti-Plasmid • Ti-Plasmid: – Tumour inducing plasmid • T-DNA – Transferred DNA • Border-Sequenzen (Left Border LB, Right Border RB) • Onkogene stimulieren die Zellteilung durch Biosynthese von Auxin und Cytokinin • Gene für Opin Biosynthese • Virulenzregion – Gene, die für den DNA Transfer wichtig sind Ca 80 000 bp Opine • Konjugate aus Aminosäuren und α-Ketosäuren • Werden von dem Pflanzentumor gebildet und von den Agrobakterien als C- und N-Quelle genutzt. Transfer der T-DNA • Einzelstrangbruch an der „right border“ durch VirD • Reparatur durch DNASynthese • Verpackung des Einzelstrangs durch VirE • Transfer des T-Stranges Veränderte Ti-Plasmide für Gentransferexperimente • Trennung der beiden Funktionen des Ti-Plasmids: – Ti-Plasmid ohne T-DNA – Zweites Plasmid mit „right and left border“ – Deletion der Onkogene – Insertion des zu transferierendes Gen zwischen die beiden Bordersequenzen. Transformation von Arabidopsis Transformation von Arabidopsis (Floral Dip) Selektion der Transformanten • Resistenz gegen Antibiotika oder Herbizide Selektion von Transformanten T-DNA-Insertionen können Mutanten erzeugen T-DNA-Mutagenese • Ähnlich zur bakteriellen T-DNA Mutagenese T-DNA-Mutagenese • Sammlung von über 20 000 Samen mit T-DNA-Insertionen in verschiedenen Orten des Genoms • Flankierende Sequenzen wurden sequenziert und in einer Datenbank abgelegt. • Der Phänotyp dieser Mutanten wird untersucht. • Einschränkung. – Manche Gene sind mehrfach im Genom vorhanden (Redundanz) – Manche Phänotypen sind nur unter bestimmten Bedingungen zu erkennen. Forward and reverse genetics • Forward genetics – Vom Phänotyp zum Genotyp • Reverse genetics – Vom Genotyp zum Phänotyp Fragestellung: wo in der Pflanze wird ein Gen exprimiert? Transkriptionsfaktoren Genprodukt Promotor Kodierregion Polyadenylierungssignal Fragestellung: wo in der Pflanze wird ein Gen exprimiert? Transkriptionsfaktoren Genprodukt Promotor Kodierregion Polyadenylierungssignal Genprodukt: Enzym, fluoreszierendes Protein, Biolumeneszenz Promotor Reportergen Polyadenylierungssignal 1. ß-Glucuronidase Reporterlinien • Der Promotor dieses Gens ist im sich differenzierenden Leitgewebe der Wurzel aktiv. Samenanlagen werden transformiert • Bei der Floral-Dip Methode werden primär die Samenanlagen transformiert. 2. Firefly Luciferase Das Enzym Luciferase aus dem nordamerikanischen Leuchtkäfer Photinus pyralis katalysiert in Gegenwart von ATP und Mg2+ die oxidative Decarboxylierung von Luciferin. Dabei entstehen Lichtblitze, die sich zum Leuchten dieser Tiere aufaddieren. 2. Firefly luciferase • Das Reportergen wurde unter die Kontrolle eines Promotors gebracht, der nach Infektion der Pflanze mit dem Pilz V. longisporum infiziert wurde. • V. longisporum infiziert die Wurzel der Pflanze und gelangt durch das Xylem in die oberirdischen Bereiche. 3. Green Fluorescent Protein aus der Qualle Aequorea victoria Fragestellung: wo in der Zelle ist ein Genprodukt lokalisiert? Transkriptionsfaktoren Genprodukt Polyadenylierungssignal Promotor Genprodukt: Fusion aus Genprodukt und GFP Promotor Kodierregion ohne StopCodon Reportergen Polyadenylierungssignal Subzellulläre Lokalisation • GFP ohne Fusion mit einem pflanzlichen Protein findet man im Kern und im Cytoplasma Subzellulläre Lokalisation • Fusion eines GFP mit einem extrazellulären Protein (Expansin) Subzellulläre Lokalisation • Fusion von GFP mit einem Protein, das in der äußeren Membran der Chloroplasten lokalisiert ist. • Man erkennt ein Verbindungen zwischen den Chloroplasten (Stromuli). Subzellulläre Lokalisation Subzellulläre Lokalisation • Durch die Mutagenese des Proteins können die Wellenlängen der Exzitation und der Emission verändert werden und man kann zwei Proteine gleichzeitig nachweisen: – GFP im Kern – CFP in der Zellwand Methodik zur Erfassung des Expressionsmusters aller Gene Direkte Markierung der RNA Reverse Trankriptase Reaktion CCAACCUAUGG cDNA GGTTGGATACC RNA AAAAAAA TTTTTTTT-T7-Promotor In vitro Trankription der cDNA in Gegenwart von CCAACCUAUGG U Cy3-dUTP Expressiondatenbanken Expressionsdatenbanken The Arabidopsis 2010 Project • International abgestimmtes Projekt – „ A blueprint for understanding how plants are built and how to improve them“ – Genaues Verständnis von Entwicklungs- und Stoffwechselvorgängen, Anwendung in der Landwirtschaft – Aufklärung des Zusammenspiels aller Proteine • Wann werden sie wo gebildet? • Welche Funktion haben sie? • Wie üben sie diese Funktion aus? Fragen 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. Nennen Sie 5 Gründe, die für Arabidopsis thaliana als Modellpflanze für molekulargenetische Analysen sprechen. Was versteht man unter „Forward genetics“? Was versteht man unter „Reverse genetics“? Was versteht man unter einem „molekularen Marker“? Inwieweit ist es für genetische Analysen wichtig, dass eine Pflanze viele Nachkommen produziert? Was versteht man unter Komplementation? Wofür kodieren die Onkogene der T-DNA von Agrobacterium tumefaciens? Welchen Vorteil bietet die Induktion von Tumoren für das Überleben von Agrobacterium tumefaciens? Welche Funktionen haben die Proteine VirD aund VirE von Agrobacterium tumefaciens? Welche funktionellen Sequenzen der T-DNA sind essentiell für den Prozess des DNATransfers? Mit welchen Genen kann man die Pflanzen selektieren, die die T-DNA enthalten? Nennen Sie drei Reportergene, die in Pflanzen verwendet werden, um zu analysieren, in welchen Geweben ein Promotor aktiv ist? Wie können Sie die subzelluläre Lokalisation eines Proteins nachweisen? Was für Moleküle findet man auf einem Gen-Chip (Microarray), der zur Analyse der Expression aller Gene einer Zelle eingesetzt wird. Wie kann man die RNA einer Zelle markieren, so dass sie auf dem Microarray detektierbar ist?
