Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit Das Bayerische Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit Zur Bewertung von PCV2Nachweisen K.-H. Bogner M. Müller J: Ehrlein T. Ewringmann LGL Erlangen 1 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit Häufige Meinung: Circoviren sind sehr weit verbreitet Circoviren werden immer nachgewiesen klinische Relevanz nicht erkennbar, Virusnachweise auch bei gesunden Tieren andere Krankheitsursachen auch vorhanden Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit Probleme im Labor: Circoviren kommen in hohen Mengen vor, hohe Tenazität Große Gefahr der Kontamination und Verschleppung Hauptursache Primärgefäße aus der Pathologie 2 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit Problembehebung: Probenentnahme durch 2 Personen (Primärgefäß / Sekundärgefäß) Desinfektion / Dekontamination Kritische Überprüfung der Arbeitsschritte Wasserkontrollen mit aufbereiten In Verdachtsfällen Wiederholung der Aufbereitung, insbesondere die Umgebung von stark positiven Proben Probenaufbereitung nach Material getrennt, Organe am Ende und in kleinen Chargen mit Wasseraufbereitung am Anfang und Ende jeder Charge Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit PCR-Durchführung: Primer nach Nieper (unveröffentlicht) Probenaufbereitung (Organe und Blut) mit High Pure Template Preparation Kit ® (Roche), Einsatzverdünnung 1:10 bei Organmaterial, unverdünnt bei Plasma / Serum 3 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit PCR-Durchführung: Real-Time- PCR i-Cycler® (BioRad) QuantiTect SYBR Green PCR Kit ® (Qiagen) Primerkonz. 1 µM ; Ansatzvolumen 22 ul (2 ul Template), nach Hot Start bei 95°: 40 x 60°/72°/94° für je 40 Sekunden, anschließend Schmelzkurve Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 4 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit Ergebnisse: ct-Werte zwischen 8 und 37 (Nachweisgrenze), d.h. Höchstmengen, die mit einem Faktor von 109 über der Nachweisgrenze liegen! Versuch einer Klassifizierung: ct <= 13: 13< ct <= 23: 23< ct <= 33 : ct > 33: +++ ++ + (+) 5 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit Retrospektive Auswertung von Ergebnissen aus diagnostischem Material, von der Pathologie zur Untersuchung auf PCV2 übersandt: Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit PCV2-Nachweise in versch. Altersgruppen Altersgruppe Anzah Anzahl l mit PCV2 % ctWert Bewertun g Feten 25 3 12 > 28 + bis (+) Saugferkel bis 2 Wochen 19 2 11 > 26 + bis (+) Ferkel ab 3 Wochen, Läufer 104 71 68 834 +++ bis (+) Mastschweine 4 4 2129 ++ bis + Mutterschwein 1 1 34 (+) 153 81 8-37 +++ bis (+) gesamt 53 6 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit Häufigkeit von ct-Werten bei 103 PCV2Untersuchungen ohne Feten und Saugferkel 35 30 Anzahl der Proben 25 20 Häufigkeit 15 10 5 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 39 und größer 38 37 36 35 34 33 32 31 30 29 28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15 8 14 7 7 13 6 6 12 5 5 9 4 4 11 3 3 10 2 2 8 1 0 40 ct-Wert Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit Halbur, P. und Tanja Opriessnig: Pathogenese und Kontrolle von PCV2-assoziierten Krankheiten Nutztierpraxis Aktuell - Ausgabe 9 - Juni 2004 Trends bei PCV2-assoziierten Erkrankungen in den USA 2002: PCV2-assoziierte Pneumonie PMWS Systemische Infektion (nicht ganz eindeutige PMWS, meist fehlende Lymphozytendepletion) (Enteritis, Abort, PDNS) 7 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit Segales,J. M. Calsamiglia, M. Domingo: How we diagnose Postweaning Multisystemic Wasting syndrome 4th International Symposium on Emerging and Re-emerging Pig Diseases - Rome - June 29th - July 2nd, 2003 Zur Diagnose von PMWS sind erforderlich: klinische Anzeichen mit reduziertem Wachstum, oft mit Vergrößerung der Inguinallymphknoten charakteristische histologische Veränderungen in Lymphknoten (Lymphozytendepletion, granulomatöse Veränderungen, vereinzelt Einschlusskörperchen) PCV2-Nachweis in den veränderten Lymphknoten Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit PCV2-Krankheitverlauf bei PMWS: Infektion mit PCV2 Immunstimulation Lymphozytendepletion in den Lymphknoten Einwandern von Histiozyten granulomatöse Entzündung Einschlusskörperchen 8 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit Beeinflussung des PCV2-Krankheitsgeschehens durch: Koinfektionen (PRRS; M. hyopneumoniae; APP; PPV; SIV; Chlamydien) Impfungen Adjuvantien (Öl in Wasser) Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit Kriterien zur histologischen Bewertung in der vorliegenden retrospektiven Studie: Lymphozytendepletion Mehrkernige Riesenzellen Einschlußkörperchen 9 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit Lymphozyten-Depletion im Lymphknoten Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit Lymphozyten-Depletion im Lymphknoten 10 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit Riesenzelle im Lymphknoten Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit PCV2-Einschlusskörperchen 11 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit Bewertung von 67 Fällen mit Lymphknotenhistologie bei Ferkeln und Läufern (> 3 Wochen) ct-Wert Anzahl Typ. Lymphkn.- % Veränderungen Bemerkungen - 21 - 31 24 bis 36 9 + bis (+) - 14 14 bis 23 27 ++ 16 (59 %) 40 15 x PMWS; 1 x PDNS; Pneumonie; (Colitis); ((1x Magenulcus, Dematitis)) 8 bis 13 +++ 10 9 (90 %) 15 9 x PMWS; 1 x Pneumonie gesamt 67 25 (37 %) 100 24 x PMWS; 1x PDNS Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit PDNS-Fälle (meist ohne Histologie): 4 mit ct = 18 -23 1 ohne PCV2-Nachweis 12 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit Schlussfolgerungenaus den Erhebungen an Schweinen aus dem Sektionsgut im Haus: Hohe PCV2-Werte ab 3 Wochen Lebensalter Mit steigenden PCV2-Mengen nimmt die Anzahl der histologischen Befunde zu, die auf PMWS hinweisen Kaum PCV2-Nachweise bei Feten und Saugferkeln Quantitative Angaben sind wichtig Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit Danksagung an: Hr. Neuss Fr. Prütting Fr. Schels PCR-Labor Hr. Huber Fr. Krisch Fr. Noras Fr. Ostermann Hr. Puchta Fr. Zetzmann Pathologie-Labor 13