Methoden-Wahl für den BVDV-Nachweis aus Ohrgewebeproben
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Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit Methoden-Wahl für den BVDV-Nachweis aus Ohrgewebeproben und Konsequenzen für die Praxis Christian, J., Kupča, A., Drdlicek, J., Bogner, K. H. Ohrstanzen-Workshop Stendal 17. Juni 2010 Welche Methoden stehen für die Massendiagnostik zur Verfügung? ERNS-ELISA-Tests Schnell-Lyse - RT- PCR – Methoden (in unserer Studie: BoVir-SL BVDV TaqMan RT-PCR Kit, Fa. Andiatec) Realtime RT- PCR- Methoden mit Aufreinigung (in unserer Studie als "Goldstandard": modifizierte Methode nach Hoffmann et al., 2006) Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 2 Allgemeines ELISA PCR-Methoden ¾ Geräte für den Massendurchsatz meist vorhanden ¾ für den Massendurchsatz evtl. Neuanschaffung nötig ¾ robuste, lang etablierte Methode ¾ gilt als kontaminationsanfälliger (v. a. Methoden mit Aufreinigung) ¾ Über-Nacht-Inkubation (12 - 24 Stunden) der Ohrgewebeproben mit Puffer nötig Æ bei normalen Arbeitszeiten nur 4 Ansatz-Tage pro Woche! ¾ keine über-Nacht-Inkubation Æ bei normalen Arbeitszeiten 5 AnsatzTage pro Woche! ¾ nur Einzelansätze möglich ¾ Pooluntersuchungen möglich Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 3 Zusammenhang Prävalenz und Poolgröße Für 1.000 Tiere benötigt man bei einer… Prävalenz von 1 % (10 Virämiker auf 1.000 Tiere): Î Bei 10er Pool: 100 + (10 x 10) = 200 Î Bei 25er Pool: 40 + (10 x 25) = 290 Untersuchungen Untersuchungen Prävalenz von 0,5 % (5 Virämiker auf 1.000 Tiere): Î Bei 10er Pool: 100 + (5 x 10) = 150 Î Bei 25er Pool: 40 + (5 x 25) = 165 Untersuchungen Untersuchungen Prävalenz von 0,4 % (4 Virämiker auf 1.000 Tiere): Î Bei 10er Pool: 100 + (4 x 10) = 140 Î Bei 25er Pool: 40 + (4 x 25) = 140 Untersuchungen Untersuchungen Erst ab einer Prävalenz von 0,4 % "lohnt" sich ein 25er Pool! Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 4 Nachuntersuchungen ELISA ¾ bei Blut diagnostische Lücke beachten! Æ Nachuntersuchung frühestens ab 61. Lebenstag möglich ¾ bei Hautbioptaten keine Einschränkung (frühestens 21 Tage nach ErstUntersuchung) PCR-Methoden ¾ keine diagnostische Lücke bei Einzelansatz von Blutproben ¾ bei Hautbioptaten keine Einschränkung ¾ Nachuntersuchung frühestens 42 Tage nach Erst-Untersuchung PI-Tiere stehen lange im Bestand und scheiden ständig Virus aus Î als Abhilfe bietet sich hier die Bewertung als PI-Tier anhand der RNA-Kopienzahl an (Schirrmeier, 2010) Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 5 Wieviele NPI-Tiere werden detektiert? Untersuchungsmethode Lyse + Aufreinigung, PCR Summe der positiv detektierten Tiere detektierte PI-Tiere detektierte NPI-Tiere Anteil NPI-Tiere an positiv detektierten Tieren 254 159 95 37,4 % Datenstand 31.05.2010, 29.478 Tiere vergleichend untersucht Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 6 Sensitivste Methode: PCR mit Aufreinigung Nachteil (aus Sicht des abgebenden Betriebes) : viele NPI-Tiere, die bis zur Nachuntersuchung nicht gehandelt werden dürfen Vorteil (aus Sicht des aufnehmenden Betriebes): Risiko der BVDV-Einschleppung wird minimiert weiterer Vorteil: eventuell wird Neueinschleppung eher erkannt Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 7 Beispielbetrieb aus unserer Studie positive Tiere im Bestand A, n=99 (davon 21 im "Ohr" positiv) 7 6 5 Anzahl positiver 4 Tiere nach Ohrgewebe 3 ohne Nachuntersuchung NPI-Tiere PI-Tiere 2 1 0 Sep Nov Jan Mrz Mai 08 08 09 09 09 Jul Sep Nov Jan Mrz 09 09 09 10 10 Monat Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 8 Wieviele NPI-Tiere werden detektiert? Summe der positiv detektierten Tiere detektierte PI-Tiere detektierte NPI-Tiere Anteil NPI-Tiere an positiv detektierten Tieren Lyse + Aufreinigung, PCR 254 159 95 37,4 % Schnelllyse, PCR 183 159 24 13,1 % Untersuchungsmethode Datenstand 31.05.2010, 29.478 Tiere vergleichend untersucht Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 9 Zweitbeste Sensitivität: Schnell-Lyse RT-PCR relativ niedriger Prozentsatz von NPI-Tieren bisher kein PI-Tier "übersehen" (in unserer Studie: Allflex-Ohrmarken) aber: Î Vorsicht bei Kombination mit Caisley-Ohrmarken (verminderte Sensitivität) (genaueres hierzu im Vortrag Dr. Bogner) Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 10 Wieviele NPI-Tiere werden detektiert? Summe der positiv detektierten Tiere detektierte PI-Tiere detektierte NPI-Tiere Anteil NPI-Tiere an positiv detektierten Tieren Lyse + Aufreinigung, PCR 254 159 95 37,4 % Schnelllyse, PCR 183 159 24 13,1 % Untersuchungsmethode Datenstand 31.05.2010, 29.478 Tiere vergleichend untersucht Vergleichsdaten aus vorhergehender Studie (LMU, LGL) mit 12.549 Ohrmarkenpaaren (Hellwig et al. 2009): ELISA 250 225 25 10,0 % Aber: ELISA hat 8 PI-Tiere nicht erkannt Æ Sensitivität 97 % Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 11 Im ELISA falsch negatives Tier Vergleichsuntersuchung an beiden Ohrgewebestanzen eines Tieres mit PCR (mit Aufreinigung) und ERNS-ELISA: Î PCR positiv mit Ct-Wert 26,7 ELISA negativ (OD 0,14) Î Wiederholungsuntersuchung im ELISA: negativ (OD 0,12) Nachuntersuchung (Blut): Î PCR positiv mit Ct-Wert 35,2 (ELISA positiv! OD 3,4) Î Antikörper-ELISA stark positiv asserviertes ELISA-Lysat in Antikörper-ELISA: positiv Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 12 Im ELISA falsch negatives Tier – Amplification Plots Original PCR-Eluat PCR-Probe, neu extrahiert Origin. ELISA-Lysat, aufger. ELISA-Probe, neu extrahiert Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 13 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit! Unser Dank gilt: Frau Doris Göbel, Frau Monika Lindner, Frau Christine Müller-Boushaba Amt für Landwirtschaft und Forsten Ansbach Bayerisches Staatsministerium für Umwelt und Gesundheit Bayerische Tierseuchenkasse Landeskuratorium der Erzeugerringe für tierische Veredelung in Bayern e. V. Rinderzuchtverband Mittelfranken Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 14
